Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экологические аспекты ферментативного гидролиза древесины ивы (Salix caprea) предобработанной паровым взрывом

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Приставка, Алексей Александрович, Иркутск

А

Министерство высшего и профессионального образования РСФСР

!

Иркутский Государственный Университет

На правах рукописи

ПРИСТАВКА Алексей Александрович

УДК 547.458.81:547.992.3 +577.15:581.19+579.22

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АКСПЕКТЫ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ДРЕВЕСИНЫ ИВЫ (Salix caprea), ПРЕДОБРАБОТАННОЙ ПАРОВЫМ ВЗРЫВОМ.

Специальность 03.00.16 - экология 03.00.04 - биохимия

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

к.т.н., доцент Саловарова Валентина Петровна д.х.н., профессор Рабинович Михаил Львович Научный консультант: д.б.н., профессор Козлов Юрий Павлович

Иркутск, 1999

Оглавление

Введение.......................................................................................5

1. Литературный обзор....................................................................11

1.1. Целлюлазы и механизм ферментативного гидролиза целлюлозы.........11

1.1.1 Источники получения целлюлолитических ферментов..................11

1.1.2. Классификация целлюлолитических ферментов и структура целлюлазного комплекса......................................................13

1.1.3. Молекулярные механизмы действия целлюлаз...........................16

1.1.4. Нейтральные и щелочные эндоглюканазы.................................29

1.2. Лигниназный комплекс и роль лакказ в разложении лигнина..............30

1.3. Предобработка лигноцеллюлозного субстрата паровым взрывом.........38

2. Материалы и методы...................................................................43

2.1. Характеристика субстрата и ферментных препаратов........................43

2.2. Ферментативный гидролиз субстрата............................................44

2.2.1. Определение оптимального соотношения ферментных препаратов «целловиридин ГЗх» и «пектофоетидин ГЗх» для достижения синергизма при ферментативном

гидролизе субстрата..............................................................44

2.2.2. Определение оптимальных условий проведения ферментатитивного гидролиза.........................................................................44

2.2.3. Методы определения степени ингибирования и инактивации фермента продуктами реакции................................................46

2.2.4. Методы гидролиза с подпиткой свежим субстратом: регенерация адсорбированного фермента..................................47

2.2.5. Регенерация ферментативной активности из гидролизата и выделение компонентов с пониженной степенью адсорбции..........49

2.3. Биохимические методы исследования............................................51

2.3.1. Анализ состава ферментных комплексов, отличающихся по

степени адсорбции на лигноцеллюлозе, с помощью

электрофореза.....................................................................51

2.3.2. Методы определения активности ферментов...............................52

2.3.3. Определение концентрации и состава Сахаров.............................55

2.4. Культивирование микроорганизмов на гидролизатах ивы...................56

2.5. Скрининг микроорганизмов - продуцентов нейтральных

и щелочных ферментов: эндоглюканаз и лакказ..............................57

2.6. Исследование термо- и рН-стабильности неочищенных

эндоглюканаз из различных природных источников........................58

2.7. Ионообменная хроматография культуральной жидкости

РешсШшт зр. штамм 4-6............................................................59

2.8. Статистическая обработка экспериментальных данных......................60

3. Результаты и обсуждение..............................................................62

3.1. Ферментативный гидролиз древесины ивы, предобработанной паровым взрывом: требования к составу целлюлазного комплекса.......62

3.1.1. Гидролиз без предварительной водной отмывки субстрата в условиях высокой плотности субстрата и при отсутствии перемешивания.....62

3.1.2. Снижение затрат фермента на единицу веса субстрата -

регенерация фермента.........................................................80

3.1.2.1. Регенерация прочно связывающейся части ферментного комплекса путем периодической подгрузки предобработанной древесины в реактор без перемешивания, с высокой плотностью субстрата.....................................................82

3.1.2.2.Многократное использование слабосорбирующихся целлюлолитических ферментов.........................................89

3.2. Рост микроорганизмов на гидролизатах и динамика потребления

глюкозы..............................................................................96

3.3. Нейтральные и щелочные эндоглюканазы.....................................99

3.3.1. Скрининг микроорганизмов - продуцентов нейтральных и

щелочных эндоглюканаз.....................................................99

3.3.2. Хроматографическое фракционирование белков культуральной жидкости Pénicillium sp. 4-6 на

ионообменнике DEAE-сферон.............................................104

3.4. Зависимость ингибирования лакказ из различных источников

ионами Cl " от условий рН. Эффект активации.............................107

Выводы......................................................................................112

Список литературы........................................................................115

ВВЕДЕНИЕ

Практически любая деятельность человека приводит к образованию и накоплению большого количества твердых, жидких и газообразных отходов, приводящих к загрязнению воды, атмосферы и почвы. Значительную долю составляют лигноцеллюлозные отходы, источником которых являются деревоперерабатывающая, лесная промышленность, сельское хозяйство и городские отходы. Растущий уровень загрязнения окружающей среды стимулирует поиск альтернативного и экологически безопасного способа переработки отходов, в первую очередь - лигноцеллюлозных, являющихся важнейшим компонентом сырьевых ежегодно возобновляемых ресурсов биосферы.

Лигноцеллюлозные субстраты могут компенсировать дефицит невосполнимых природных ископаемых, путем их конверсии ферментами микроорганизмов в сахара и последующего или одновременного сбраживания Сахаров в этанол.

Эффективность конверсии лигноцеллюлозного сырья зависит от потребления трех основных компонентов: целлюлозы, гемицеллюлозы, лигнина.

Наиболее доступным компонентом, составляющим основную часть растительных материалов, является целлюлоза - ее ежегодный прирост составляет 10^1/тонн. В ферментативном разрушении целлюлозы участвует комплекс целлюлолитических ферментов, таких, как целлобиогидролазы и эндоглюканазы, которые могут быть выделены из различных грибных и бактериальных источников. Эти ферменты могут использоваться не только для получения из целлюлозы глюкозы, которая, в свою очередь, может быть сырьем для микробиологического синтеза различных ценных продуктов, но и для

выделения лекарственных веществ (стероидов) из растений; для улучшения качества растительных масел; как добавка в комбикорма для животных (Лобанок и др., 1988; Тиунова, 1981); для "каменной отмывки" тканей а так же для производства стиральных порошков. Последние две точки приложения особенно бурно развиваются в последние годы. Это связано с тем, что были обнаружены новые термостабильные эндоглюканазы, способные работать в более щелочных условиях, чем ферменты из традиционного продуцента Trichodeima reesei. Повышенный интерес к нейтральным эндоглюканазам связан с возможностью их использования для создания pH-совместимых ферментных комплексов для одновременного сбраживания гидролизных Сахаров (Lange, 1993).

Хотя промышленное получение целлюлаз было начато еще в 60-х годах, до сих пор проблема получения глюкозы ферментативным гидролизом целлюлозы не решена. Это связано с тем, что целлюлоза представляет собой водонерастворимый полимер со сложной надмолекулярной структурой, которая трудно поддается действию фермента. Биохимические механизмы действия как отдельных целлюлаз, так и целлюлазного комплекса в целом также недостаточно полно изучены.

Для повышения реакционной способности субстрата обычно предусматривают его предварительную обработку. Наиболее перспективным способом является использование парового взрыва, который представляет собой кратковременную обработку древесных опилок или щепы нагретым водяным паром при повышенном давлении с последующим мгновенным снижением давления до одной атмосферы (Гравитис, 1987). В процессе предварительной обработки происходит дезацетилирование гемицеллюлоз с высвобождением уксусной кислоты, гидролизом гемицеллюлоз до мономеров и частичным разрушением лигноуглеводных связей, выплавление лигнина из срединной пластинки. В результате увеличивается удельная поверхность

целлюлозы, доступная для ферментативного воздействия, что повышает степень конверсии субстрата.

Однако, ферментативное разложение лигнина является процессом еще более трудным, чем гидролиз целлюлозы. В разрушении лигнина принимают участие такие ферменты, как лигниназа, Mn-пероксидаза (Kaushik & Bisaria, 1989; Wariishi et al. 1991; Perie & Gold 1991) и лакказа (Shimada et al. 1980; Munoz et al., 1997) которая в последнее время находят множество применений в иммуноанализах, в изготовлении биосенсоров и очистке промышленных сточных вод, хотя низкий рН-оптимум активности промышленных ферментов затрудняет их использование (Crecchio et al. 1995; Zouari et al. 1994; Yaropolov et al. 1994; Cliffe et al. 1994; Gardiol et al. 1996).

Таким образом, все компоненты растительных отходов могут быть утилизированы с применением различного набора ферментов грибного и бактериального происхождения. В настоящее время проблема заключается в повышении эффективности и технологичности процесса до такой степени, чтобы он мог конкурировать с традиционными методами получения энергии из природных ископаемых.

Цели и задачи исследований

Целью настоящей работы являлось исследование ферментативного гидролиза древесины ивы, предобработанной паровым взрывом и изучение возможных путей повышения эффективности гидролиза.

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи: - подбор наиболее эффективных условий проведения ферментативного гидролиза взорванного субстрата с применением наиболее оптимальных соотношений ферментных препаратов целлюлолитического действия из Trichodeima reesei и Aspergillus foetidus;

- обоснование целесообразности проведения гидролиза в нетрадиционных условиях без предварительной отмывки и перемешивания реакционной среды в ходе процесса;

- определение ферментного состава целлюлазного комплекса, обладающего пониженной степенью адсорбции на субстрате по сравнению с исходным комплексом, и при этом сохраняющего высокую осахаривающую способность;

- изучение возможности выращивания микроорганизмов на полученных гидролизатах;

выявление перспективных штаммов микроорганизмов, способных продуцировать pH-устойчивые ферменты целлюлазного (эндоглюканазы) и лигниназного (лакказы) комплексов и изучение особенностей действия этих ферментов;

Научная новизна работы

Предложен новый нетрадиционный и экологически безопасный способ осахаривания целлюлозосодержащего материала (древесина ивы (Salix caprea), предобработанная паровым взрывом) ферментами микроорганизмов. Подобраны условия проведения гидролиза, которые отличаются от общепринятых отсутствием перемешивания реакционной среды. Это позволят достичь высокой исходной концентрации субстрата и получить высокую концентрацию продукта реакции.

Впервые показано, что причина быстрого прекращения гидролиза и слабого роста микроорганизмов на гидролизатах обусловлена низким значением pH неотмытого субстрата, а также отмечено незначительное влияние водорастворимых ингибиторов целлюлаз и роста микроорганизмов.

Современные представления о молекулярных механизмах деструкции кристаллической целлюлозы целлюлазным комплексом предусматривают

обязательное участие целлобиогидролазы I. Однако, в ходе работы установлено, что эффективный гидролиз взорванного материала может осуществляться целлюлазным комплексом, целлобиогидролазная компонента которого представлена преимущественно целлобиогидролазой II. Одновременно показано, что такой комплекс обладает низкой степенью адсорбции на субстрате и исследована возможность его многократного рецикла в сравнении с известной регенерацией ферментативной активности путем сдвига адсорбционного равновесия добавлением к лигнифицированному остатку новых порций субстрата.

Проведен результативный поиск продуцентов эндоглюканаз и лакказ, имеющих широкий рН-оптимум, среди микроорганизмов, обитающих в таких неблагоприятных условиях среды как засоленные почвы пустыни Гоби и Южно-Вьетнамские почвы, обработанные дефолиантами в годы войны с США. Обнаружен, ранее не описанный у известных ферментов, эффект активации в нейтральной области рН лакказы из штамма РешсШшт ер. 4-6 ионами СГ, что, по-видимому, является результатом качественных изменений в структуре фермента.

Практическая ценность работы

Промышленное использование технологического процесса в изученных условиях может привести к значительному удешевлению гидролизных Сахаров за счет отказа от постоянного перемешивания реакционной среды, гидролиза при высокой плотности субстрата, отсутствия его предварительной отмывки, и рецикла фермента, возможного при использования целлюлазных комплексов, слабо сорбирующихся на субстрате.

Нейтральные и щелочные эндоглзоканазы из отобранных микроорганизмов могут найти применение в текстильной промышленности и в производстве стиральных порошков, а так же для создания новых ферментных композиций.

Наконец, обнаруженный эффект активации лакказы из Penicillium sp. ионами С1 " может значительно повысить эффективность этих ферментов при деструкции лигнина, иммуноанализах, очистке промышленных сточных вод и др.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях:

■ The 9th European Bioenergy Conference on Biomass for energy and the environment, Denmark - 1996.

■ 19th symposium on biotechnology for Fuels and Chemicals, Colorado Springs, Colorado, USA - 1997.

■ Third Biomass Conference of the Americas, Quebec, Canada - 1997.

■ International Conferens on Sustainable, Agriculture for Food, Energy and Industry, Braunshveig, Germany - 1997.

■ Конференция молодых ученых, посвященная 850-летию г. Москвы, Москва-1997.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

1. Литературный обзор

1.1. Целлюлазы и механизм ферментативного гидролиза целлюлозы

1.1.1. Источники получения целлюлолитических ферментов

Целлюлазы образуют многие микроорганизмы: грибы, бактерии, актиномицеты, некоторые беспозвоночные животные и растения. Микроорганизмам и беспозвоночным животным эти ферменты необходимы для расщепления целлюлозы до глюкозы, которая используется как источник энергии и углерода, а микроорганизмы-фитопатогены таким образом разрушают клеточную стенку растений для проникновения в цитоплазму. У растений целлюлазы участвуют в процессах роста и дифференциации растительных клеток - при росте клеток растяжением, опадании листьев, удлинении пыльцевой трубки, созревании плодов и дифференциации сосудов (Родионова, 1981; Тиунова, 1981). Ферменты обнаружены в системе пищеварения некоторых моллюсков, переваривающем соке улиток (Рабинович и др. 1988). У позвоночных животных нет собственных целлюлаз. Способность растительноядных животных усваивать целлюлозу связана с наличием в их органах пищеварения многочисленной целлюлолитической микрофлоры (Родионова, 1981).

Наиболее эффективными продуцентами целлюлаз являются грибы. На их долю приходится свыше 90% расщепляемой в природе целлюлозы. Грибы используются и в промышленности для получения препаратов внеклеточных целлюлаз (Грачева, 1987).

Было селекционировано несколько высокопродуктивных штаммов целлюлолитических грибов, которые относятся к видам Trichoderma reesei, Trichoderma koningii, Pénicillium funiculosum, Pénicillium iriensis, Pénicillium veruculosum, Fusarium solani, Aspergillus terreus, Phanerochaete chrisosporium, Poliporus adustus, Myrothecium verrucaria, Pellicularia filamentosa и Eupenicillium

javanicum (Родионова, 1981; Тиунова, 1981; Грачева, 1987; Лобанок и др., 1988; Coughlan, 1985).

Другим перспективным продуцентом целлюлаз являются бактерии. Хотя они производят значительно меньшее количество целлюлозы, зато гораздо быстрее растут и удобнее при генетических манипуляциях (Фогарти, 1986).

Бактериальные целлюлазы организованы иначе, чем грибные. Они действуют в составе сложных надмолекулярных ансамблей, определенным образом расположенных на клеточной поверхности, в то время как внеклеточные грибные целлюлазы могут действовать индивидуально и пространственно независимы друг от друга (Клесов, 1990).

Способностью разлагать целлюлозу обладают аэробные виды бактерий -миксобактерии, псевдомонады; факультативные анаэробы Bacillus, Cellulomonas и строгие анаэробы - Clostridium и Bacteroides (Тиунова, 1981; Наплекова, 1974; Лобанок и др., 1988).

Для решения ряда проблем, связанных с использованием известных целлюлаз (низкая удельная активность, низкая термостабильность, сильная катаболитная репрессия, несбалансированность различных ферментов в целлюлазном комплексе) продолжается поиск технологичных и дешевых целлюлаз (Рабинович и др., 1988).

В этом плане перспективным является использование термофильных микроорганизмов. Их ферменты действуют при высокой температуре и в более широком диапазоне рН и температур по сравнению с ферментами мезофилов. Кроме этого, у целлюлаз термофилов наблюдается большая устойчивость к ингибирующему действию глюкозы.

Из термофилов к целлюлозоразрушающим грибам относятся: Chrisosporium lignorum, Thermoascus aurontiacus, Mucor pussillus, Chetomium thermophile, Myceliophtora thermophilia и др. Все эти грибы имеют оптимальную температуру �