Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эхинококкоз животных Центрального Черноземья России (особенности эпизоотологии и пути оздоровления)

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Эхинококкоз животных Центрального Черноземья России (особенности эпизоотологии и пути оздоровления)"

РГ6 Ой

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

БЕСПАЛОВА Надежда Сергеевна

УДК 619:616—002.951.21(470.32)

эхинококкоз животных

ЦЕНТРАЛЬНОГО ЧЕРНОЗЕМЬЯ РОССИИ (ОСОБЕННОСТИ ЭПИЗООТОЛОГИИ) И ПУТИ ОЗДОРОВЛЕНИЯ

Специальность: 03.00.19— Паразитология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ - 1993

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕЩОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ТЕРИНАРНОЙ ЭНТШ0Л01Ш И АРАХНОЛОГИИ

■ЗУБКОВ ВАДШ СПАРТАКОВИЧ

могаю и протвшвньш свойства

специфических ашшш ери эстрозе шщ • 03.00.19 - Паразитология

Автореферат

диссертаций на соискание ученой стемяя кандидата ветеринарных наук

и

/ ПОП ШЗ

На правах рукописи УДК: 6X9.616? 995.7:632,95.

Тюмень, 1993 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной энтомологии и арахнологии

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук,

Г.С.Сивков.

Научный консультант: доктор биологических наук,

академик РАСХН В.З.Ямов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор А.Г.Гиновкер

кандидат ветеринарных наук В.Д.Кузнецов

Ведущее учреждение: Омский институт ветеринарной медицины.644099, г.0мск-99, ул.Добровольского, а/я 3740

"Защита диссертации состоитоя "с^-б " и^се^а» 1993 г. в / У часов на заседании Диссертационного совета К 020.86.01 при Всероссийской научно-исследовательском институте ветеринарной энтомологии и арахнологии по ■ адресу: 625041, г.Тшень-41,' ул.Институтская,2, ВЕИИВЭй...

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан " ° 0^<гг.

Ученый секретарь \

Диссертационного совета, СшМУу _ ✓Н.В.Сояопов кандидат биологических наук Ч^р

- а _

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Эстроз - болезнь овец, вызываемая личин-каш овечьего овода паразитирующими в носовой полости, лобных пазухах и подроговых пространствах. Заболевание цроквлявтся ката-рально-гнойнш воспалением слизистых оболочек верхних дыхательных путей и функциональны!!.®! нарушения?,и органов дыхания и пищеварения, обуславливающими истощение, а иногда и гибель животных.

Овечий овод причиняет значительный ущерб. Установлено, что овцевода недополучают в среднем на одно энное эстрозом яи-вотное до 1,5 кг мясной и 0,2-0,5 кг се; иродукщи в год. / H.v.Uep6aHb, IS7I (б), Л. м. ¡¿тунов, IÍ '', Г.С.Савков, 1979 /. Кроме того, пораженные эстрозом животные более восприимчивы к другим заболеваниям различной этиологии / HWartie, E.Suten, 2.

Trica , 1966 /.

Ущерб, причиняемый оводом, побуждает ветеринарных специалистов овцеводческих хозяйств проводить ежегодные противоэстрозные обработки животных. В основе применяемых ныне мер, лежит использование системных инсектицидов. В тоже время известно, что производство и применение их представляет реальную угрозу здоровью людей а животных, способствует нарушению экологического баланса в природе. Это ориентирует исследователей на поиск новых, высокоэффективных, безопасных средств и методов ограничения численности овода.

В последние годы значительно возрос интерес к изучению возможности иммунопрофилактики паразитарных заболеваний, в том. числе энтомозов. Работы в этом направлении ведутся, в различных научно-исследовательских лабораториях России, США, Канада, Франции. Успешному решению проблемы при эотрозе препятствует слабое знание закономерностей наразит-хозяинных взаимоотношений и сеязь их с иммунной системой.

-.-.бота выполнялась в соответствии с планом НИР проблемы Ü.CX.07.Ü2.0I.

Щдь_д задачи исследований. Цель работы - изучение возможности применения специфической иммунопрофилактики эстроза овец.

В задачи исследовашШ входило: определить возрастной и приобретенный иммунитет при эстрозе; исследовать некоторые закоао-ко^.остз течения иммунных реакций при этом заболевании; разработать методы получения противоэстрозных антигенов, способы их

.очистки и метода! контроля качества; определить влияние адьюван-гов на ищунореактивные изменения в организме животных; проверить активность протлвоэегрозной вакцины и ее кошонентов.

Теоретическая и практическая ценность. Впервые усганоатенс участие клеточных факторов в иммунном ответе а изучена кинетика Т-и В-лимфодатов крови овец при экспериментальном эстрозе; определено, что переболевание овец эстрозом обеспечивает их часшч-, цуго невосприимчивость при повторном заражении; получены активный противоэстрозный антиген и вакцина, обладающая протектавныш свойствами цротив возбудителя эстроза; показана принципиальная возможность получения антшдаоташческих антител при эстрозе,что легло в основу концепции к обоснованию Гос.задания НИР на 19932000 гг. подпроект 02. "Биотехнология в ветеринария." задание 02.06.М. '

Апробация работы и публикации, ¿¡атеряалы диссертации доложены на ПУ-й научной конференции молодых ученых гельминтологов (Москва, 1990), областной научной конференция "Химические проблемы отраслей народного хозяйства Тюменского региона и пути их решения" (Тюмень, 1991), конференции "Научные достижения молодых . ученых и специалистов - дивотноводству" (Семипалатинск, 1991), заседания Ученого совета ВНЙИВЭА (Тюкень, 1990-1992). По теш диссертации опубликовано две работы, получено авторское свидетельство на изобретение № 1777264.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на странах, иллюстрирована 23 таблицами и 18 рисунками. Она состоит из введения» обзора литературы, ееш глав собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, списка литературы, вклшавдего 156 наименований, в том числе 38 зарубежных авторов.

содержание рабош Материалы и штоды исследований

Работа выполнена в лаборатории энтомозов зшвотннх ВНИИ ветеринарной эатойолохЕй и арахнологии, мясокомбинатах Тюменской, Курганской, Омской, Оренбургской областей, а танне хозяйствах, расположенных, в степной зоне Северного Зауралья. Часть лабораторных исследований проведены во ВНИИ гельминтологии им. К.И,

Скрябина и институте иммунологии Í.13 России.

В экспериментах использовали 5529 овец тонкорунных пород в возрасте от 6 месяцев до 4-х лет, 53 кролика, 57 морских свинок, I6Ú белых мышей.

Имаго овода отлавливали на приотарннх постройках, вблизи мест выпаса. Долоьую принадлежность насекомых определяли по методике К.Я. Гранина (1953), отбирая самок, tic его отловлено 229 особей, собрано 2896Q личинок 1-го возрастх, которые служили материалом для искусственного заражения овец.

Лигшнок II a ki-ro возрастов использовала для приготовления антигенов. Сбор личинок проводили в основном на мясокомбинатах, после наталогоанатомнческого вскрытая п обследования голов овец.. Всего проведено 4323 обследования, при этом собрано 9'¿b? личинок. Антигены готовили по методике п.Г.г&линнной.Г.С.Сивкова (1977), а также использовали разработанный наш способ изготовления антигена, залщщенный авторским свидетельством на изобретение ¡¿ 1777264. .Общий белок в антигенах определяли по о.».Lowry (I951). Титр и идентичность антигенов определяли в реакции преципитации по Ухтерлони в модификации Л.П.Гусева, и.С.цветкова (1961). При тестировании антигенов на иммунологическую идентичность учитывали расположение линий прециплтанди относительно друг друга ( .йримель, .Брок, 19Й6). '

Часть антигена очищали с помощью адсорбционно-распредели-тельной хроматографии на модифицированном пористом стекле марки МПС. Хроматографическую колонку заполняли носителем и уравновешивала фосфатно-солевым буфером pii 7,В в течеиие G-6 часов. Элшрующий буфер подавали с помощью перистальтического насоса со скоростью 25 мл/час. Аликвоты собирали коллектором фракции. Молекулярную массу белков определяли по методу Г.мстермол

кроликов гипериммунизировали по. методу дуе-йшг-^на (¡¡.Г. Калинина, 1975). Морских свинок иммунизировали кролпчъцй антп-сывороткой по разработанной нами методике. Препараты стерилизовали фильтрованием через бактериальные фильтры или добавляли антибиотики. Отсутствие бактериального пли грибкового загрязнения контролировали культивированием проб антигенов на бактериальных средах (iúíIA, ¡»ДБ, ;ЛПШ под вазелиновым маслом) при 37°С и (..Ж, Сабуро), при 22°С. Безвредность препаратов проверяли на лабораторных животных и овцах. Безвредаыми считали антигены",не вызывающие гибель япвотных в течение десяти суток посла пнъек-

- О -

um в дозах близких к максимально переносимым. Лабораторные исследования крови включали определение общего белка сыворотки, подсчет количества лейкоцитов и эритроцитов по общепринятым методикам (А.А.Кудрявцев, ¿.А.Кудрявцева, 1974). Иммунологические исследования включали определение Т-и ü-лимфоцитов крови и селезенки мышей (Д.д.Новиков, ß.К.Новикова, 1979) и крови овец (В.Л. Солодовников, 1963). Протективные свойства иммунопрепаратов оценивали по интенс (ИЭ) и экстенс '(33) эффективности (А.А.Непоклонов, Т.А.Таланов, Í966). lio мере необходимости цифровые материалы исследований подвергали обработке методами математической статистики (А.Т.Усавич, Л.Т.Лебедев, 1У70).

/

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗРАСТНОГО И ПРИОБРЕТЕННОГО /ШШТЕТА

Определение возрастного ищунитета провели на спонтанно ин-вазировашшх овцах. При ежегодном, осеннем обследовании разновозрастных групп на мясокомбинатах и хозяйствах Курганской области установлено,-что интенсивность инвазии (ИИ) взрослых овец составила 24,IÍ4,3 , молодняка - 32,8¿3,I. Вместе с тем, различив статистически недостоверно.

Влияние кратности циклов паразитирования личинок овода на интенсивность инвазии овец изучали в виварии ВНИИВЭА с мая 1989 г. по октябрь 1991 г. Весной по принципу аналогов подобрали 18 ягнят. В июле девять из них заразили по 50 личинок на ядвотное. Заражение регистрировали по активации Т-и В-димфоцитов крови. В октябре трех овец убили, по результатам паталогоанатомического вскрытия определили Ш. За оставшимися животными продолжили наблюдение. В марте-мае следующего года животных с од ерзали в изо- . лированных клетках с поддоном, ежедневно клетки просматривали, на ночь изолированном овцам одевали на голову капроновые мешочки, для сбора отходящих на окукливание личинок. В июле I99D года заражали шесть оставшихся, переболевших эстрозом и столько же ранее неинвазироаашшх овец Тгого же возраста. Ход эксперимента и учет результатов проводила как описано выше. Опыт нродол-жили в 1991 году, В результате сформировала три группы. Овцы первой группы (однократный цикл паразитирования), второй (двукратный цикл паразитирования), третьей (трехкратный цикл пара-

зит;;ровашя).

У овец, однократно перенесших полный цикл ларазитирования, ИИ составила 29,1*2,5 личинок (среднее за три года), двукратно - 16,5*1,5 личинок (среднее за два года), трехкратно - 9,0*2,9 личинок. Различия статистически достоверны между собой..

Кроме того, просмаливается обратная зависимость между ан-

■ тепсивностью инвазии и возрастом овец. У ягнят текущего года .

■ рождения приживаемость личинок составила 71,6/2 , овец старше. года - 57,3$ , а овец старте двух лет - 46.7%. .

Таким образом, пораженность овец личк :ами овечьего овода находятся в обратной зависимости от возраста овец и кратности, их переболевания. Однако, представленнк результаты являются косвенный! свидетельством наличия защитных реакций организма на внедрение паразита. Окончательный ответ.возможно получить только с помощью иммунологических методов исследования."

КИНЕТИКА МОТОКаЩЕШТВЫХ КЛЕТОК КРОВИ ...

' ИНВАЗИРОВАНШХ ЛИВОТШХ'

В качестве теста для определения состояния иммунной систе-мн овец, пораженных личинками овода,использовала реакции розет-кообразовашш (РОК). Т-лимфоцати определяла с помощью спонтанного розеткообразованая (К—РОК, %), уровень В-лимроцатов находили с помощью комплиментарного розеткообразования (ЕАС-РОК, %).

Ошт по изучению кинетики иммунокомпетентных клеток- от момента заражения до выпадания личинок на окукливание проведен на экспериментально инвазнрованных ягнятах. . В первые четырнадцать суток после заражения, проводили ежедневную оценку уровня Т-и в-ли/фоцитов. Нач'.шая со вторых суток происходит повышение относительного количества Т-дигфлдатов крови «шотных подопытной группы. Однако, статистически достоверное увеличение отмечено лишь чц четаертые-шестые сутки. На четвертые сутки, уровень Е-РОК подопытной группы составил 57,9*1,9/3, контрольной - 53,0 ±1,2%. На шестые сут^и, соответственно - 58,6*2,054 , 53,7*0, В последующие дни.регистрировали снижение относительного количества Т-ликфоцитов и уже на десятые сутки падение.достигает статистически достоверной отметки- (Е-РОК подопытной группы -50,9*0,3,^ , контрольной - 53,2*0,3£). '

Несколько отлична кинетика В-лимфоцитов. Уровень ЕАС-РОК подопытной группы в течение трех суток после заражения не изме-

нялся. На четвертые сутки регистрировали резкое повышение относительного количества В-лимфоцитов (опыт - 23,7+1,7%, контроль -17,9+2,3%). Высокий уровень их держался по шестые сутки (опыт -23,0+1,9$, контроль - 17,3+1,0$). Далее с пестых по десятые сут::г. наблвдали падение уроЕня РОК. В отличие от иммунологического профиля Т-лшлфоцитов, уровень В-лимфоцитов не снимается ниже показателей фона, а на 11-12 сутки вновь ловыиается.

С 14 по 35 сутки иммунологические исследования проводили еае-недельно. При этом, уровень Е-РОК оставался ниже показателей контрольной группы до 21 суток.-С третьей по четвёртую неделю происходила стабилизация уровня Т-лимфоцигов крови.

Напротив количество В-ламфоцатов до 28 суток находили на более высоком уровне нежели в контроле. Нормализацию уровня ЕАС-РОК регистрировали с четвёртой по пятую неделю.

С сентября по ишь, исследования проводили дважды в месяц. В целом за весь период развития личинок овечьего овода от момента зарачеиия до выпадения на окукливание установили три периода активации икмуноко?.шетентЕнх клеток с пиками в августе, январе,апреле.

При изучения кинетики лкауяономдегентннх клеток крова овец, дерзболзЕ-шх всгрозои (одпократпо,двукратно,трзхкрагяо) достоверное различие уровня лимфоцитов иегтог показатедяла первой я третьей груш установила на пятна сутет. Так, уровень Е-РОК однократно переболевших овец составил 55,6+0,3$, ЕАС-РОК - 22,3+0,6$,.-а ■spsx- ■ кратно -62,9+0,6$, 27,3+0,6$ соответственно.

При изучении влияния дозы инвазионного материала (10, 50, ICQ) ЖчВШй? ¿га? 'Ш&ЗШШг установили, что з группе овец, зараженных по Ш n/c¥w£Eli ойшчдмнй от контроля уровень якмуноаашегвн-

тшвС шходшш только до 2 суток эксперимента, тогда как у

овец зараженных по 100 личинок достоверно различимый уровень Т-а B-лшфоцнтов регистрировали на 35 сутки после начала эксперимента.

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ АШЖЕНОВ ИЗ ЛИЧИНОК ОВЕЧЬЕГО ОВОДА

Получение соматических _протиж?РЖОзшх_аятагвЕов

Используя в качестве прототипа антиген, предложенный для серологической диагностика эстроза (Калинина, Сивков, 1977), яаггз бяя йрэдлойея аов!й 6SGQ65 получения аятЕгаЕа запищзнЕнй

авторским свидетельством » 1777264. В процессе отработки методи-' ки изготовили 22 серии антигена. Был изменен состав буфера,режим экстрагирования и центрифугирования, допог ельно в регламент ввели низкочастотную ультразвуковую обработку гомогената. Применение новой технологии позволило увеличить объем готового продукта в 4,8 раза,'концентрацию белка и антигена в.2 раза, сократить затраты времени, необходимого на изготовление препарата в 3,3 раза. Минимальное количество нативного антигена, способного на взаимодействие со специфической антисывороткой в реакции иммунодиффузии в геле, находили в пределах 0,21-0,28 мг/мл.

Полученные по единой методике антигены из личинок Oes-trus ovio 1., Hypoderma bovis, G.irrfcestinalis, G.veterinua те-

стировали на иммунологическую,идентичность в реакции , двойной диффузии по Ухтерлони. Анализ результатов показал, что антигены иммунологически идентична только с соответствующими им гомологичными антисыворотками.

Очистка антигенов из личинок овечьего овода

Экстракты личинок объемом 1,0 мл с содержанием белка 1,6 мг вносили в верхнюю часть колонки (1,5x23 см), заполненную МПС --2000, При фракционировании антиген выходил четырьмя пиками.Средний объем, фракций составлял 8-10 мл. В тоже время концентрация белка во фракциях значительно варьирует в сторону снижения. В перЕ°:1 фракции содержание белка составило 50$, во второй -26$, в третьей - 16%, в четвертой - около 3% от общего выхода белка.

В ходе отработки параметров хроматографии антигена была предпринята попытка повышения производительности колонки за счет двукратного повышения дозы белка на старте (3,2 мг/мл). В результате антиген выходил только двумя фракциями, первая фракция объемом 16 мл, содержанием белка 0,137 мг/мл, общим выходом белка 2,2 ыг. Вторая фракция в объеме 14 мл, содержанием белка G,Ü2 мг/мл, общим выходом белка 0,3 мг. оначительное ( на 0,7 мг ) снижение концентрации белка после фракционирования' свидетельствует о сорбции полипептидов. Кроме того, рехромато-грайия фракций показала, что они, в своа очередь, разделяются на четыре. Результаты опытов показали, что повышение концентрации белка на старте до 3,2 ыг/ыл недопустимо, так как приводит

к засорению хроматографической колошей.

Для определения молекулярной -массы белков фракций их поочередно пропускали через хроматографическую колонку (2,5x65 см), заполненную гелем сефадекса -200, предварительно откалибро-ванную стандартными белками (пероксидаза хрена, овальбумин, бычий сывороточный альбумин, миозин) установлено, что молекулярная масса первой фракции составляет 750 тыс., второй - 139 тыс.,третьей - 66 тыс., четвертой - 40 тыс.

Антигенную активность фракций изучали в реакции диффузной преципитации с гомологичной антисывороткой. При содержании белка в препаратах 0,1 мг/мл, титр первой фракции составил 1:8,второй - 1:4, третья фракция взаимодействовала с антдсывороткой в концентрации 0,1 мг/мл. Четвертая фракция и нативный антиген проявляла активность после дополнительного концентрирования до содержания белка в них 0,3 мг/мл.

Изучение возможности получения антиидиотипических ■ антптел

Наш была предпринята попытка получения противоэстрозного антигена нетрадиционным путем. Исследования проведены на кроликах и морских свинках. Еипериммунизируя кроликов протизоэс.г^ ним антигеном, по'завершению цикла иммунизации, получали с:.-' фическую антисыворотку. Используя антисыворотку кролака ллл ■ першмунизации морской свинка получали анти-антисыворотку. -ласно теории, разработанной Нильсом Ерне в 1974 году, антц-он... -сыворотка (антпидиотипические антитела) является дво2е;:кс£л ант.:-гена и может его заменить. Тестирование антигена и актп-йкт'.юк-воротки на иммунологическую идентичность проводили б реакции двойной диффузии (трехлуночный вариант). В центральную лунку раскапывали антисыворотку в периферические антиген п анти-ант::-енворотку. При прочтении результатов реакции учитывали характер линий преципитации (Х.Фршлель, И.Брок, IS86). На границе ззал-модействия двух систем отсутствовали линии в виде торы, сл:-;;:-вательно антиген и антн-антисыворотка не вступают во ствде друг с другом. В toso время используя антпидпоглгьг-гзог..: . антитела в качестве антигена удалось выявить противоэстроз:--.;-. антитела в сыворотке крови "овцы, переболевшей эстрозом. Zsxz:: образом, полученные антавддотипическае антитела из личинок ее:-

чьего овода могут быть использованы в антителовыявлякэдей реакции преципитации.

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА

'аншгеыов

Методы стерилизации и_ контроля стерильности антигенов

При отработке методов стерилизации, полученные антигены разделили на три части. Первую оставляли без изменения, во вторую добавляли антибиотики, стрептомицин до концентрации 0,018-0,02 % г. пенициллин - 0,027-0,03 %, третью часть стерилизовали фильтрованием через мембранные фильтры, диаметром пор 0,2 шал» Пробы антн-геноЕ засевали на бактериальные среды ( МПА, МПБ, МППБ, Сабуро) и культивировали при двух температурных режимах 37° С и 22° С. В течение десятидневного срока наблюдения, рост микрофлоры отсутствовал только в пробирках, засеянных антигенами, подвергнутыми предварительно фильтрованию через мембранные фильтры.

1

Определение безвредности, антигенов

Опыты проводили в два этапа, на белых мышах массой 18-20 г и морских свинках - 350-400 г. Вначале определяли дозу антигена близкую к максимально переносимой, которая для мышей равна 5 ¿1г; а морских свинок 50 мг на швотное, при подкожной шьевдйй;

*" - гит- ттп

Введение мышам антигена в дозе 7,5 мг, а свинкам - 75' м£ тШШЗ&в гибель некоторых подопытных животных.

На втором этапе антиген вводили в дозах близких к максимально переносимым ( 5 и 50 мг на животное). При наблвденш. за животными в течение десяти суток, гибель неустановлена. Общее состояние подопытных мышей неотличалось от контроля. У морских свинок, в первые часы после инъекции, отмечали возбундение, переходящее в угнетение. В это время свинки отказывались от корма й воды. К четвёртому дню указанные явления исчезали, но болезненность при надавливании места инъекции оставалась на протяжении десяти суток. Введение антигенов овцам в дозе 20 мл (100 мг/мл) на.жи-

вотнов такие не вызывало отклонений от общего клинического состояния.

Изучение иммуногенных свойств антигенов

Влияние антигенов на гуморальный иммунитет изучали на кроликах. Вначале определили минимальною дозу нативного антигена, вызывающую образование преципитирующх антител в крови при однократной. инъекции, которая составила 100 мкг на животное. -Кровь для иммунологических иccлeдoвáний брали из ушной вены еженедельно. Сыворотки крови, полученные от животных иммунизированных первой фракцией антигена, образовывали линии преципитации на седьмые и даже четырнадцатые сутки эксперимента. После инъекции второй фракции,' антитела к ней, находили только на седьмые сутки. Третья а четвертая фракции оказались неактивными.

Влияние иммунизации на клеточное звено иммунной системы изучали на белых, мышах. Исследования крови проводили на третьи сутки, после однократной-инъекции. Перед исследованием мышей убивалипосле декаштации собирали кровь, отцрепаровывали селезенку-, выделяли лимфоциты. Минимальная доза нативного антигена, вызывающая достоверное повышение относительного количества розет-кообразующих клеток определена на уровне 10 мкг, поэтому фракции вводили зевотным в этой дозе. Активностью обладает первая фракция антигена, вызывающая достоверное повышение уровня E-РОК в крова опытной группы до 63,9±0,9$, контроль - 59,4±1,0& ; в í; ,-лезенке - 35,6±1,1$, контроль - 30Д£0,3^. Кроме этого, установлено достоверное повышение уровня В-лимфоцитов селезенки (опыт - 28,6±0,5)í, контроль - 24,3±1,2$). После инъекции Фракции антигена достоверно повышался только уровень тов крови (опыт - 63,1±Г,ЗЯ, контроль 59,4ÍX,0/t). После инъекции третьей и четвертой фракций, изменений уровня Т- и В-лп:1 -..-цитов не регистрировали.

СПЕЦЙЙНЕСКМ 1ШУН0К0НЕКЦИЯ В ПРОФШАКШЕ 3CIP03A ОВЕЦ

Ьжшм1§_адьк1вантдв на имцунореактивные изменения э организме животных

Для сравнительного анализа эффективности неспецифическнз

иммуностимуляторов использовали полный адыовант Фрейнда, гидроокись алюминия, полиоксидоний. При изучении влияния на клеточный иммунитет растворы препаратов вводили белым мышам однократно, подкожно в дозе по 0,05 мл на животное. Определили, что только полиоксидоний стимулирует повышение уровня Т-лимфощтов в среднем на 8,9^ с третьих по девятые сутки, Б-лимфоцитов на 4,5% с третьих по шестые сутки. '

Влияние на ангителогенез комплексов антиген (первая, вторая фракции) и адыованты изучали на кроликах. Препараты вводили однократно в соотношении: адыованты -$ по 0,5 мл, антигены - по 100 мкг на животное, 1ф0вь исследовали еженедельно. По силе иммунного ответа, количеству животных, реагируйщих в максимальном титре, лучший 'результат получен после введения смеси первой фракции и поли оксид ония. Наличие цреципи тирующих-антител регистрировали до 49 суток, титр которых достигал 1:8. При использовании иных комбинаций препаратов, антитела регистрировали в лучшем случае только до 21-35 суток, а уитр антител при этом не превышал 1:4-(комплекс - П-я фракция+полиоксидоний).

Исследование состояниягклеточного и гуморального иммунитета овец после имздуностимуляции

Исследование проведено в виварии ВНМВЭА на 15 ягнятах,по-, деленных на пять груш. Животных иммунизировали подкожно, двукратно с интервалом 14 суток. Первой группе животных вводили антиген (первая фракция) в дозе 400 мкг/кг м.ж., второй группе - полиоксидоний в дозе 400 мкг/кг мле., третьей группе - вакцину (первая фракция и полиоксидоний 1:1) - 400 мкг/кг м.£. Овцам четвертой и пятой- груш препараты не вводили. Через семь суток после окончания иммунизации животных первой — четвертой трупп заражали личинками овода, а пятой - оставила незара&енными (контроль).

При исследованиии клеточного иммунитета установили, что в крови животных первой группы уровень Т-лимфоцитов повышался на 5,052 (только 21 сутки эксперимента), второй - на (с 14 по ; 35 сутки), третьей - на 7,6% (с 21 по 35 сутки). При исследовании В-системы иммунитета установили, что уровень ЕАС-РОК крови животных первой группы повышался на 7,12 (28-е сутки эксперп-^ мента), второй - на 8,0$ (с 21 по 42 сутки), третьей - на 7,ей (с 21 по 35 сутки).

Кроме этого, при изучении гуморального иммунитета установили, что инъекция животным антигена и вакцины стимулирует постепенное наростание ответной реакции в виде повышения титров антител. При этом максимальный титр антител на введение антигена составил 1:8,. а вакцины - 1:32. После инъекции животным поли-оксидония, а также в контрольной группе (экспериментально инва-зированные овцы) появление антител регистрировали только после заражения овец личинками овода. При этом в группе, где животные получали неспецифический иммуностимулятор наблюдали резкий подъем титров антител и затем их постепенное понижение. Ъ крови животных, на получавших- препараты, но искусственно зараженных, регистрировали медленное повышение титров антител до 1:4 - 1:16.

Цротективныо свойства противоэстрозной вакцины и ее компонентов

ьротективныс свойства противоэстрозной вакцины и ее компонентов изучали на экспериментально ¡швазированных овцах (по 50 личинок на животное). ¿сни;ек?ивность учитывали через месяц после завершения цикла иммунизации и искусственного заражения животных но результатам вскрытия и осмотра голов овец. При этом ИЭ шкц;;ны составила 76.6..S, полиоксидония на 11,0%, а антигена на 43,4/0 ниже,

Лналигачнне эксперименты заложили на спонтанно швазированных овцах и совхозе "при-гобольный" Курганской области. Параллел:- -но изучали .-шшние сроков иммунизации на эффективность иммунс-проф1!.чактлки.'.при этом испытали три варианта сроков вакцинации. ;io первому варианту тонизацию овец заканчивали за 5-10 суток до начала активного лета самок озода; по второму - шядухшзипозя-ли во время лета; но третьему - иммунизацию начинали после r.;j..-чапия лета, 'Jpoi-:;i лета самок овода определяла по результатам синологических наблюдений. Установила, что эффективность антигена ' и полиоксидония в чистом виде несколько уступает вакцине. 'Та:-:,

антигена колебалась- от 8,4 до 3Ü,ö,i, полиоксидония - от 13,5 до 46,o-'j, вакцины - от 17,0 до 66,6%. Спнулальнке сроки ¡Lvj..yiui-зацаи за 5-10 дней до начала лета самок овода (ИЭ - 68,6%).

производственные испытания ваэдшы

Производственные опыты проведены на 1560 овцах в совхозе "Притоболышй" Курганской области. Эффективность вакцины изучали в сравнении с широко применяемыми инсектецидами химического (эстрозоль) и биологического (ивомек) синтеза.

Вакцину вводили подкожно, дву!фатно 27.06.93 и II.07.92 г в дозе 400 мкг/кг м.ж. Обработку овец эстрозолем проводили в конце сентября в соответствии с инструкцией, утверзденной ГУВ МС1 СССР (28.12.71.). Ивомек вводили подкожно по 0,2 мл/кг м.ж. Необработанных животных, содержавшихся в одинаковых условиях, использовали в качестве контроля. Учет эффективности проведен в октябре по результатам вскрытия 50 овец на мясокомбинате.

Уступая ивомеку (ИЭ - 92,5 %), вакцина показала сравнительно одинаковую эффективность с эстрозолем. Так,1 ЭЭ обработки, овец эст-розолем составила 37,5 %, а вакцины ,- 25,0 %, ИЭ - 78,0 % и 87.6? соответственно. Производственные испытания показали, .что изготовленная нами противоэстрозная вакцина обладает протективными свойствами. ■-"■-.'''••. -„'•■'/'

Таким образом, результаты проведенных нами исследований свидетельствуют о возможности использования специфической, иммунопрофилактики эстроза швец.

выводы' 4 .

1. Пораженность овец личинками овечьего овода находится в обратной зависимости от возраста овец и кратности циклов паразита-рования, что свидетельствует .о наличии при зстрозе возрастного в приобретенного иммунитета.

2. Дичинки овода стимулируют развитие иммунных реакций у овец обеспечивающих защиту организма хозяина от внедрения царазита. Активация Т-лимфоцитов регистрируется со вторых, суток, В-лимфоцитов с третьих суток после инвазирования животных. Уровень розеткооб-разуыцих клеток в крови и продолжительность 'Иммунных реакции находится в прямой зависимости от кратности перебодевания и дозы инвазионного материала. В течение полного цикла паразитирования личинок установлено три периода активации имнунокомпвтентнык: клеток в крови овец с пиками в августе, январе, апреле.

......з. Разработаны параметры получения соматического цротиво-

эстрозного антигена, включающие гомогенизацию личинок Я и '¿-го возрастов, центрифугирование и очистку еупернатанта с помощью адсорбционно-расцределительной хроматографии. Наибольшей антигенной активностью обладают I и П-я фракции антигена с молекулярной массой 750 и 139 тыс.дальтон.

4. 3 качестве модели для получения антиидиотишческих антител при эстрозе овец возможно использование кроликов п морских свинок. Схема получения антиидаотапов включает последовательную гипериммунизацаю кроликов антигеном из'личинок овечьего озсда и морских свинок - кроличьей цротивозстрозной антисывороткой.

■ 5. Добавление антибиотиков (стрептомицин до концентрации 0,018-0,02% и пенициллин до концентрации 0,027-0,035) не освобождает антиген от микробного загрязнения. Стерильность его достигается фильтрацией через мембранные фильтры диаметром пор 0,2мкм. Парэнтеральное введение стерильного антигена мышам в дозе о мг и морским свинкам - 50 да не гызывает паталогических изменений в организме животных.

6. йщуногенныш свойствами обладают I и П-я фракции антигена. Однократная инъекция кроликам I фракции в дозе 100 мкг стимулирует образование сывороточных антител до 14-тп суток,

И фракции до 7-х суток. При сравнительном испыташш адковантоз (полный адьювант Фрейнда, гидроокись алюминия, полиоксидош:^) только полиоксидоний стимулирует повышение уровня I-лимфоцитов на 8,9% с 3 по 9 сутки, В-лимфоцитов на А,6% с 3 по 6 сутгл. Сыесь I фракции и полнокоидония (цротивоэстрозная Бакена) стимулирует образование сывороточных антител до 49 суток с максимальным титром 1:8. Использование иных комбинаций' адьюванта и антигена уступает по силе хуженного ответа.

7. Протективное действие вакцины выражается в снижешш приживаемости личинок и реализуется через ашнную систему. Двукратная инъекция вакцины с интервалом четырнадцать суток в

400 мкг/кг м.ж. за 5-10 дней до начала лета самок овода сосодв-чивает интенс эффективность до 68,6$.

"Этическое использование полученных результатов исследовании

I. В качестве средств профилактика, эстрозяой

логается использовать специфическую вакцину. Применение ее позволит снизить поразенность овец личинками овода без использования инсектицидов.

2. Результатами исследования Т- и B-лимфоцитов крова овец целесообразно пользоваться при планировании ветеринарно-санитар-ных мероприятий по лечению и профилактике эстроза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Зубков B.C. Хроматографический метод очистки противоэст-розных антигенов //Химические проблемы отраслей народного хозяйства Тюменского региона и пути Их решения /Тез.докл. Тюмень.1991,

- С.79. . . •

2. Зубков B.C. Динамика Т- и В-ошм£оцитов при эксперимен- . • тальном эстрозе овец //Научные достижения молодых' ученых и специалистов - животноводетву /Тез.докл. Семипалатинск. — 1991. -

С.II.

3. Способ получения антигена из личинок овода, вызывающего эстроз у овец: A.C. 177264 СССР А 01 К 39/02 /ДЧС.Савков, Э.Х. ; \

Даугалиева, В.З.Ямов, B.C.Зубков, ЕсГ.Швоварав

Подписано к печати 6.10.93, Формат 60x84 1/16 Объём 1,0 ус.взд.л. тарах Ш. Заказ 125 Перепечатано на ротапринте типографии ТСХИ