Эффективность серологических, молекулярных и индикаторных методов диагностики вирусов косточковых культур

Походенко, Павел Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Эффективность серологических, молекулярных и индикаторных методов диагностики вирусов косточковых культур
ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Эффективность серологических, молекулярных и индикаторных методов диагностики вирусов косточковых культур"

На правах рукописи

ПОХОДЕНКО ПАВЕЛ АЛЕКСЕЕВИЧ

ЭФФЕКТИВНОСТЬ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ, МОЛЕКУЛЯРНЫХ И ИНДИКАТОРНЫХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСОВ КОСТОЧКОВЫХ КУЛЬТУР

Специальность 06.01.11 - защита растений

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук

Москва-2009

003461809

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский се лекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Россель хозакадемии (ГНУ ВСТИСП)

Научный руководитель: кандидат сельскохозяйственных наук,

старший научный сотрудник Упадышев Михаил Тарьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Балашова Ирина Тимофеевна

Всероссийский научно-исследовательский институт

селекции и семеноводства овощных культур

РАСХН

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент Заец Владимир Григорьевич Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов»

Ведущая организация: Российский государственный аграрный университет -Московская сельскохозяйственная академия имени К. А. Тимирязева

Защита диссертации состоится "5 " марта 2009 года в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 006.035.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Россельхозакадемии по адресу: 115598, Москва, Загорье, ул. Загорьевская, 4, конференц-зал, факс 8 (495) 329 31 66.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного учреждения Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Россельхозакадемии, с авторефератом - на официальном сайте ГНУ ВСТИСП http://vstisp.org

Автореферат разослан "3" февраля 2009 г.

Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах, заверенные и скрепленные гербовой печатью, просим направлять ученому секретарю диссертационного совета.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор сельскохозяйственных наук

Л. Принёва

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Вирусы являются опаснейшими внутриклеточными патогенами косточковых культур. Из-за латентного характера паразитирования вирусы широко распространяются с зараженным посадочным материалом, с инструментом при выполнении агротехнических работ, с семенами и пыльцой. Наиболее вредоносными вирусами косточковых культур являются вирусы шар-ки сливы, хлоротической пятнистости листьев яблони, некротической кольцевой пятнистости косточковых, карликовости сливы, скручивания листьев черешни (Вердеревская, Маринеску, 1985).

Для корректной оценки распространенности вирусов важна отработка методик диагностики применительно к биологическим особенностям культуры и виду вируса. Выявление сокопереносимых вирусов осуществляется на основе внешней симптоматики вирозов, с помощью инфекционных тестов на индикаторных растениях, электронной микроскопии, иммуноферментного анализа (ИФА) и метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).

В зависимости от факторов, определяющих взаимоотношения вирусов и растений-хозяев, происходят изменения в концентрации вирусов, транслокации их по растению и накоплению в том или ином органе (Балашова, 1997). Без знания этих закономерностей сложно получить объективные результаты даже при использовании таких высокочувствительных методов, какими являются ИФА и ПЦР. На плодовых культурах выявление вирусов в особенности затруднено.

Среди параметров ОТ-ПЦР (ЯТ-РСЯ), которые необходимо оптимизировать для успешной амплификации специфической последовательности генома вирусов, наибольшее значение имеет подбор праймеров. Они должны обеспечивать исключение как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов (Белошапкина, 2006).

Наличие в соке плодовых культур фенольных соединений, полисахаридов и других ингибирующих веществ часто затрудняет проведение тестов из-за блокирования ферментов, используемых в ЯТ-РСЯ, что препятствует получению

препаратов нуклеиновых кислот (КомЛаш е1 а1., 1995; НаЫН е1 а1., 2003). Это обуславливает необходимость разработки специальных экстрагирующих буферов, позволяющих в максимальной степени удалять ингибиторы ферментов из растительных экстрактов.

При ОТ-ПЦР существует опасность перекрестной контаминации образцов, что может привести к получению ложноположительных результатов по зараженности образцов вирусами, в связи с чем более точным и безопасным в плане контаминации является диагностика вирусной инфекции с помощью ПЦР в реальном времени. Однако и этот метод нуждается в совершенствовании, особенно на этапе выделения вирусной РНК из тканей растений, что показывает актуальность исследований в данной области.

Цель исследований: совершенствование и сравнительная оценка серологических, молекулярных и индикаторных методов диагностики вирусных болезней косточковых культур.

Задачи исследований:

¡.Изучить распространенность вирусных болезней в условиях Московской области;

2.Усовершенствовать методику полимеразной цепной реакции для диагностики основных вирусов косточковых культур;

3.Дать сравнительную оценку эффективности различных модификаций ПЦР-теста при выявлении вирусов косточковых культур;

4.0ценить эффективность серологических, молекулярных и индикаторных методов диагностики вирусов косточковых культур для ускоренного выделения свободных от основных вирусов клонов.

Методология исследований заключается в поиске и разработке оптимальных методов диагностики в зависимости от поставленных вирусологических задач по мониторингу фитосанитарного состояния насаждений и получению свободного от вредоносных вирусов посадочного материала косточковых культур.

Научная новизна результатов исследований

Впервые в условиях Нечерноземной зоны обнаружено опасное заболевание косточковых культур - псевдошарка, вызываемая триховирусом хлоротиче-ской пятнистости листьев яблони и приводящая к появлению на плодах симптомов деформации и вдавленных пятен. Наличие данного вируса в тканях растений доказано методами ИФА и ОТ-ПЦР.

Разработан способ экстракции РНК вируса из растительных образцов различного происхождения с добавлением в лизирующий буфер гидроксипроиз-водного бензойной кислоты. На разработанный способ подана заявка на патент №2008152268 от 30.12.2008 г.

Определены оптимальные параметры выполнения ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени. Установлена высокая чувствительность молекулярных методов при тестировании тканей растений в состоянии покоя и растений in vitro.

При тестировании на древесных индикаторах предложен способ инокуляции щитком с древесиной, не уступающий по эффективности стандартному способу.

Практическая значимость и реализация результатов исследований

Предложен новый высокоэффективный способ экстракции РНК вирусов из тканей косточковых культур для последующей диагностики методом поли-меразной цепной реакции, обеспечивающий надежную диагностику вирусной инфекции.

Разработанный способ диагностики используется в лаборатории вирусологии ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии и прошел успешные испытания в фирме «Агродиагностика». Использование разработанного способа позволило повысить эффективность выявления вирусов на 25 %.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Подтверждение наличия в насаждениях косточковых культур в условиях Московской области вредоносного заболевания - псевдошарки;

2.Совершенствование молекулярных методов диагностики (ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени)'вирусов на косточковых культурах;

3.Сравнительная оценка эффективности диагностики вирусов косточковых культур методами ИФА, ПЦР и на древесных индикаторах.

Предмет исследований

Предметом исследований является определение эффективности диагностики вредоносных вирусов косточковых культур в зависимости от используемого метода, а также закономерности транслокации вирусов в различных органах и частях растения.

Апробация работы

Основные материалы диссертации доложены на VII молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» в РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (4 апреля 2007 г.), Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые - садоводству России в XXI веке» (г. Москва, 11-12 октября 2007 г.) и конференции «Инновационные подходы к обеспечению стабильной продуктивности косточковых культур» (г. Москва, 17-18 июля 2008 г.).

Публикации. Основные результаты исследований по диссертации изложены в 7 научных статьях, в том числе 5 - в рецензируемых научных журналах.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах, состоит из введения, 4 глав, выводов, рекомендаций по практическому использованию, списка литературы из 205 источников, в том числе 187 - на иностранных языках; содержит 23 таблицы, 12 рисунков и 5 приложений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении и обзоре литературы обоснована актуальность работы, сформулированы основные направления исследований, дана общая характеристика работы.

1. Материалы, методика и объекты исследований

Исследования проводили в 2006-2008 г.г. на базе лаборатории вирусологии отдела защиты растений от вредителей и болезней ГНУ ВСТИСП Россель-хозакадемии.

Объектами исследований являлись вирусы: потивирус шарки сливы (Plum рох potyvirus - PPV), иларвирусы некротической кольцевой пятнистости косточковых (Prunus necrotic ring spot ilarvirus - PNRSV) и карликовости сливы (Prunus dwarf ilarvirus - PDV), неповирус скручивания листьев черешни (Cherry leaf roll nepovirus - CLRV), триховирус хлоротической пятнистости листьев яблони {Apple chlorotic leaf spot trichovirus - ACLSV). Также объектами исследований служили различные косточковые культуры: слива, алыча, вишня, вишня войлочная, персик.

Изучение распространенности вирусов осуществляли в коллекционных и промышленных насаждениях косточковых культур в условиях Московской области в соответствии с «Методическими указаниями по экспресс-диагностике вирусов на ягодных культурах» (2002) и «Диагностикой вирусов семечковых и косточковых культур методами ИФА и ПЦР» (2008). В серологических тестах применялся сэндвич- вариант иммуноферментного анализа (DAS-ELISA) по методике M.Clark, A.Adams (1977). Для анализов использовались диагностические наборы на основе поликлональных антител из НИИ садоводства Молдовы, фирм Bio-Rad (США) и Loewe (Германия). Регистрацию результатов проводили на автоматическом анализаторе «Stat Fax 2100». Всего тестировали 380 образцов, по-вторность анализа каждого образца - 2-кратная. В качестве образцов для ИФА отбирали листья.

Тесты на древесных индикаторах в теплице проводили по методике, разработанной во ВСТИСП и изложенной в методических указаниях "Технологический процесс получения безвирусного посадочного материала плодовых и ягодных культур" (2001). В качестве древесных индикаторов использовали растения вишни войлочной (Prunus tomentosa). Каждый вариант включал по 5 растений-индикаторов, на которые прививали по 2 щитка с древесиной или без нее.

ПЦР-тесты проводили с праймерами и реакционными смесями, разработанными в ООО "Агродиагностика", а также с праймерами, синтезированными в компании "СибЭнзим", наборами для ОТ-ПЦР компании "Биоком" и наборами из РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева.

В опытах по ПЦР использовали следующие праймеры:

ACLSV F 5'-СAG АСС СТТ ATT GAA GTC GAA-3' ACLSV R 5 '-GGC ААС ССТ GGA АСА GA-3 ' PPV F 5'-АСС GAG АСС ACT АСА СТС СС-3' PPV R 5'-CAG ACT АСА GCC TCG CCA GA-3' PPVD F 5 '-ACC GAG АСС ACT АСА СТС СС-3 ' PPVD R 5'-СТТ CAA CGA САС CCG TAC GG-3' PPVM F 5 '-АСС GAG АСС ACT АСА СТС СС-3 ' PPVM R 5'- СТТ CAA CAA CGC TGT CGT- 3'.

Экстракцию вирусной РНК осуществляли с готовыми наборами ООО «Агродиагностика» и методом сорбции на препарате силика (по Menzel et al., 2002; Al Rwahnih, 2004), модифицированным нами. На этапе экстракции вирусной РНК к лизирующему буферу добавляли по 10-40 мг/образец гидроксипроиз-водного бензойной кислоты (ГПБК), повторность - 5-кратная.

Амплификацию выполняли на программируемом термостате «Терцик», а регистрацию результатов - на трансиллюминаторе Vilber Lourmat ТСР-20.МС с выводом изображений электрофореграмм ПЦР-продуктов на компьютер.

Для проведения ПЦР в реальном времени использовали систему «Мини-Оптикон» (США) с выводом результатов амплификации в виде графиков флуоресценции на монитор компьютера и последующей обработки данных в программе Opticon Monitor 3.1.

Статистическую обработку опытных данных осуществляли методом дисперсионного анализа по Доспехову (1985).

Расчёт экономической эффективности выполняли в соответствии с «Методическими рекомендациями по определению экономической эффективности научных достижений в садоводстве» (2005).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Изучение распространенности и вредоносности вирусов на косточковых культурах

Проведенные в Московской области в 2006 г. обследования коллекционных насаждений сливы показали зараженность их комплексом вирусов. В насаждениях было заражено вирусом РМЯБУ 42 %, РБУ - 27 %, СЬЮ/ - 46 %, РРУ - 32 % деревьев (таблица 1).

Таблица 1 - Зараженность коллекционных насаждений сливы различными видами вирусов по годам исследований, %__

Вирусы 2006 г. 2007 г. X

РЖБУ 41,7 60,9 51,3

РБУ 26,7 21,7 24,2

СЬ11У 45,8 47,8 46,8

РРУ 31,7 30,4 31,0

АСЬ8У - 21,7 21,7

Наиболее распространенным в 2007 г. вирусом оказался иларвирус некротической кольцевой пятнистости косточковых, который диагностирован у 61 % деревьев. Неповирус скручивания листьев черешни идентифицирован почти у половины растений сливы (48 %), а потивирус шарки сливы - у 30 %. Вирусы РБУ и АСЬБУ имели меньшее распространение.

В среднем за 2 года исследований вирусы РЫИБУ и СЬЯУ характеризовались наибольшим распространением (45 % и более). Вирус шарки сливы диагностирован у 31 % деревьев сливы, вирус РОУ - у 24 % .

На плодах сливы и алычи были обнаружены симптомы деформации и локальной вдавленности, характерные для псевдошарки (рзеиёорох), вызывамой вирусом АСЬвУ. Растения с этими симптомами ранее были протестированы методом ИФА на вирусы РРУ, РМ^БУ и РОУ: результат был сероотрицательным. Микологическая экспертиза показала отсутствие на плодах грибной инфекции, способной вызывать аналогичные симптомы. На пораженных плодах диагностировался вирус АСЬБУ, причем его концентрация была значительно выше, чем в листьях этих растений (таблица 2).

Таблица 2 - Результаты диагностики вируса хлоротической пятнистости листьев яблони методом ИФА в плодах и листьях сливы и алычи

Тест образец (сорт, клон) Симптомы плоды листья

Ао/Ак* HB** Ао/Ак HB

Ренклод китайский вдавленные пятна, деформации 4,1 + 2,0 +

Десертная урожайная отсутствуют 7,5 + 3,0 +

БД 5-37 вдавленные пятна, деформации 9,6 + 2,3 +

Ракета вдавленные пятна, деформации 5,7 + 3,1 +

Здесь и далее: * Ао/Ак - отношение экстинкции тест-образца к сероотрица-тельному контролю; ** HB - наличие вируса.

Весной 2008 г. образцы листьев сортов и форм сливы и алычи были про-

тестированы методом ОТ-ПЦР. Анализ подтвердил наличие вируса в образцах сливы сорта Валерик, формы БД 5-37 и алычи сорта Ракета (рисунок 1).

188 п. н.

(внутренний контроль) 358 п. н. (ACLSV)

Рисунок 1 - Электрофореграмма продуктов амплификации при ПЦР -диагностике вируса АСЬБУ в листьях сливы и алычи: 1 - Валерик; 2 - Татарская десертная; 3 - Ракета; 4 - форма БД 5-37; (К+) - положительный контроль; (К-) - отрицательный контроль.

В 2008 г. на сливе сорта Татарская десертная при тестировании плодов с признаками деформации и вдавленных пятен методом ПЦР выявлен вирус РРУ в высокой концентрации, в то время как вирус АСЬБУ не обнаружен. Следовательно, схожие симптомы способны вызывать оба вируса, в связи с чем важное значение имеет их диагностика.

2. Сравнительная оценка эффективности выявления вируса шарки сливы с применением методов ИФА и ПЦР

2.1. Особенности диагностики в зависимости от тестируемого органа

В наших экспериментах при тестировании методом ИФА различных органов растения (листьев, почек, коры, древесины) в осенний период сероположи-тельный результат наблюдался в листьях изолята вишни войлочной (таблица 3). Таблица 3 - Сравнительная оценка эффективности тестирования изолятов

сливы и вишни войлочной методами ИФА и ПЦР в осенний период (28.11.07)

Изоляты Листья Почки Кора Древесина

ИФА ПЦР ИФА ПЦР ИФА ПЦР ИФА ПЦР

Слива - + - - - + - +

Вишня войлочная + + — + — — +

При тестировании коры вишни войлочной и сливы результат был сероот-рицательным. Низкий титр вируса и локальное распределение его по тканям являлось основной причиной отрицательных результатов ИФА на этих образцах. С помощью ПЦР удалось выделить вирус и диагностировать его на листьях вишни войлочной и сливы, в почках вишни войлочной, в коре сливы, в древесине войлочной вишни и сливы. Вирус не диагностировался в почках сливы и в коре вишни войлочной, что, вероятно, связано с недостаточно совершенным методом выделения РНК из этих тканей. В целом вирус РРУ выделялся и диагностировался методом ПЦР наиболее успешно в древесине и в листьях обеих культур.

При детекции вируса РРУ методом ПЦР в реальном времени в образцах коры, древесины, смешанных образцах (кора + древесина) изолятов сливы выделение вируса РРУ было успешным во всех трех случаях (рисунок 2).

Рисунок 2 - Интенсивность флуоресценции образцов при тестировании растений в период покоя методом Real-Time RT-PCR на вирус шарки Слива: 1 - древесина, 2 - кора, 3 - кора + древесина; Войлочная вишня: 4 - древесина, 5 - кора, 6 - кора + древесина; 7 - (К+).

Вирус PPV в смешанном образце вишни войлочной детектировался на более высоком уровне по сравнению с древесиной. Вирус в коре вишни войлочной не детектировался, что связано с его отсутствием или очень низкой концентрацией: кривая флуоресценции незначительно превышала пороговый уровень. Полученные результаты отчасти могут быть связаны с особенностями анатомического строения побега изучаемых культур: кора сливы отделялась от побега с небольшим количеством камбия, а у вишни войлочной - без него.

При проведении стандартного ОТ-ПЦР также не удалось детектировать вирус в тканях коры вишни войлочной.

Следовательно, показана возможность успешного тестирования косточковых культур в период покоя с применением метода ПЦР, причем предпочтительней для этих целей использовать древесину побега или смешанные образцы из коры и древесины.

2.2. Эффективность тестирования в зависимости от длительности хранения образцов листьев и вирусной РНК

Часто вследствие отсутствия возможности оперативного выполнения анализа растительные образцы для ПЦР приходится хранить при отрицательных

температурах. В связи с этим должен быть уточнен предельно возможный срок хранения образцов, позволяющий выявлять вирусы.

Вирус шарки сливы диагностировался методом ОТ-ПЦР в изолятах персика, вишни войлочной и сливы в свежих листьях и в листьях после хранения при -20° С в течение 1 месяца, а при хранении в течение 2 и 6 месяцев вирус был диагностирован только в листьях персика (таблица 4).

Таблица 4 - Эффективность выявления вируса шарки сливы методом ОТ-ПЦР в зависимости от длительности хранения образцов листьев при -20° С

Культура (№ изолята) Свежие листья Длительность хранения, мес.

1 2 6

Персик(№ 3) + + + +

Вишня войлочная (№ 3-2) + + - -

Слива (№ 64) + + - -

Следовательно, срок хранения при -20° С образцов листьев, равный 1-му месяцу, можно рассматривать как вполне допустимый.

Считается, что выделенную вирусную РНК следует хранить при температуре -80°С, однако нашими экспериментами показана возможность хранения РНК при температуре -20 °С в течение 2 месяцев с последующим тестированием методом ПЦР в реальном времени. Даже после хранения РНК в течение 2 месяцев и ее разведении в 10 раз флуоресценция была выше положительного контроля на 0,020 ед., а экспоненциальная стадия начиналась с 14 цикла (у положительного контроля - с 22 цикла), что связано с высокой очисткой РНК и хорошей ее сохранностью.

2.3. Диагностика вируса PPV в пробирочных растениях сливы

При оздоровлении растений от вирусов с использованием метода культуры тканей важное значение имеет чувствительность метода диагностики.

Часто метод ИФА не позволяет выявлять вирусы в пробирочных растениях, поскольку концентрация вирусов в них, как правило, низкая. Поэтому нами проведен сравнительный анализ эффективности выявления вирусов в растениях in vitro и растениях после адаптации методами ИФА и ПЦР. При тестировании

пробирочных растений методом ИФА вирус шарки сливы не выявлялся, что

связано с его низкой концентрацией в тканях растений (таблица 5).

Таблица 5 - Сравнительная оценка эффективности тестирования растений сливы (in vitro и после адаптации) методами ИФА и ОТ-ПЦР на вирус шарки

Сорт, клон Пробирочные растения Растения после адаптации

ИФА ПЦР ИФА ПЦР

Фиолетовая 1 - + - +

Фиолетовая 2 - + + +

Утро - + + +

Ренклод тамбовский - + + +

Вместе с тем в растениях после адаптации вирус методом ИФА диагностировался в клонах сортов: Фиолетовая 2, Утро, Ренклод тамбовский. С применением ПЦР-анализа удалось диагностировать вирус шарки сливы как в растениях in vitro, так и в растениях после адаптации. Следовательно, метод ПЦР при тестировании растений in vitro оказался более пригодным, чем ИФА.

Полученные методом ОТ-ПЦР результаты при тестировании растений in vitro были подтверждены методом ПЦР в реальном времени. Наибольшая флуоресценция отмечена у клонов Ренклод тамбовский и Фиолетовая 1: соответственно 0,110 и 0,094 ед. На образцах вишни флуоресценция была ниже (0,060 и меньше), что свидетельствует о более низкой концентрации вируса шарки сливы в растениях вишни in vitro по сравнению со сливой. Следовательно, показана перспективность использования метода ПЦР в реальном времени при тестировании микрорастений.

3. Совершенствование метода экстракции РНК из растительных образцов

На результаты ПЦР определенное влияние оказывают такие факторы, как масса навески растительного образца, соотношение ее к объему буфера, состав лизирующих и экстрагирующих буферов, температуры отжига праймеров и некоторые другие.

Нами установлена оптимальная масса навески растительного образца косточковых культур для выделения вируса PPV и последующей его детекции ме-

тодом ПЦР в реальном времени, которая составила 100 мг вместо рекомендуемых зарубежными исследователями (Menzel et al., 2002) 200 мг (рисунок 3).

Рисунок 3 - Интенсивность флуоресценции образцов при тестировании методом Real-Time RT-PCR на вирус шарки сливы в зависимости от массы навески листьев сливы: 1-100 мг; 2-150 мг; 3-50 мг; 4 - 200 мг; 5 - положительный контроль; 6 - отрицательный контроль.

Наименьшее значение флуоресценции отмечено в варианте с навеской образца 200 мг, поскольку гомогенизация навески 200 мг менее эффективна и длительна по времени, чем навески 100 мг, что приводит к частичной элиминации вирусов и удлинению технологического процесса. С применением навески 100 мг уменьшается объем многокомпонентного лизирующего буфера, что способствует экономии реактивов.

Экспериментальным путем определено, что оптимальное соотношение навески образца к объему буфера варьирует от 1:10 на вишне войлочной до 1:20 на сливе. Это связано со свойствами сока: у сливы он густой и вязкий, у вишни -более жидкой консистенции.

С целью усовершенствования метода выделения вирусной РНК из различных образцов косточковых культур (коры, древесины, листьев, плодов) нами в на этапе гомогенизации образца в качестве антиоксиданта испытано гидрокси-производное бензойной кислоты (ГПБК), которое добавлялось в гуанидинтио-цианатный буфер. При анализе продуктов амплификации вируса шарки сливы в

BEEL

изоляте выявлено, что оптимальные навески ГПБК составили 20 и 30 мг (рису-

Рисунок 4 - Влияние концентрации антиоксиданта ГПБК на интенсивность флуоресценции при тестировании сливы на вирус шарки: 1 - ГПБК 20 мг/образец; 2 - ГПБК 30 мг; 3 - без ГПБК (контроль); 4 - ГПБК 10 мг; 5 и 6 -положительные контроли; 7 - отрицательный контроль.

Некоторые исследователи в качестве антиоксиданта при гомогенизации растительных тканей применяли метабисульфит натрия (НаЬШ ег а1., 2003). В наших экспериментах сравнительная оценка эффективности диагностики вируса шарки сливы показала преимущества использования ГПБК в сравнении с мета-бисульфитом натрия. При этом экспоненциальная стадия флуоресценции в варианте с ГПБК началась раньше (с 14 цикла амплификации), чем у образцов с использованием метабисульфита натрия (с 20 цикла амплификации).

4. Эффективность выявления вируса шарки сливы на древесных индикаторах вишни войлочной в зависимости от способа прививки

Наряду с молекулярными и серологическими методами диагностики вирусов биологический метод в виде тепличного теста на древесных индикаторах до сих пор рассматривается как основной тест.

Сравнительная оценка двух способов прививки на основании результатов ИФА в год инокуляции показала, что прививка щитком без древесины более эффективна, чем прививка щитком с древесиной, поскольку ИФА достоверно

выявлял вирус шарки сливы в 4 случаях из пяти при прививке щитком, а при прививке щитком с древесиной - в 1 из 5 (таблица 6). Вероятно, при прививке щитком без древесины срастание компонентов происходит быстрее и вирус активнее проникает в ткани индикатора.

Таблица 6 - Эффективность выявления вируса шарки сливы на древесных индикаторах вишни войлочной в зависимости от способа прививки по результатам ИФА через 42 дня после инокуляции

Способ прививки № индикатора Индекс Ао/Ак Наличие вируса

1 3,4 +

Щитком 2 2,0 +

без древесины 3 3,0 +

(контроль) 4 2,4 +

5 1,0 -

6 1,9 ±

Щитком с древесиной 7 1,6 -

8 1,7 ±

9 1,8 4-

10 3,9 +

Тестирование методом ИФА листьев у места прививки и верхушечных листьев показало неравномерность распределения вируса РРУ в тканях побега, что вполне согласуется с данными других исследователей (Билкей, 1992).

Симптомы заражения на индикаторах появились только на следующий год после инокуляции. Все инокулированные индикаторы независимо от способа прививки имели симптомы кольцевой пятнистости и морщинистости листьев, характерные для шарки сливы. Следовательно, заражение составило 100 % как при инокуляции щитком, так и щитком с древесиной. Однако количество листьев с симптомами на индикаторе в начале вегетации в условиях зимней теплицы было выше у растений, инокулированных щитком (таблица 7).

Таблица 7 - Количество листьев с симптомами вируса шарки сливы на индикаторах вишни войлочной в зависимости от способа инокуляции и срока учета, в % к общему числу листьев_

Способ инокуляции Срок учета

1 (14.04.08) 2 (25.04.08) 3 (07.05.08) 4 (20.05.08)

Щитком 23,06 21,06 15,0а 17,0а

Щитком с древесиной 8,0а* 14,0а 13,0а 13,0а

*Разные буквы означают существенность различий на 5 %-ом уровне значимости.

Существенную разницу по числу листьев с симптомами между растениями, инокулированными двумя способами, мы наблюдали в апреле. В мае разница между двумя способами инокуляции нивелировалась. Из этого следует, что при заражении древесных индикаторов вишни войлочной можно использовать оба способа инокуляции. К преимуществам заражения с использованием щитка с древесиной относится в 1,5 раза более высокая производительность выполнения этой операции по сравнению с прививкой щитком.

Проблемам локализации и транслокации вирусов в тканях травянистых растений посвящено много исследований, в то время как аналогичные вопросы, связанные с распространением вирусов по тканям древесных растений, изучены довольно слабо. Поэтому нами изучено влияние инокуляции вирусом шарки сливы на скорость распространения и степень накопления вируса в тканях древесных индикаторов. Образцы были протестированы через 10, 20 и 30 дней после заражения.

У образца растения вишни войлочной № 2, инокулированного щитком с древесиной, накопление вируса проходило постепенно. По результатам ПНР в реальном времени флуоресценция на 10-ый день после инокуляции составила 0,048, на 20 день она повысилась в 1,9 раза, на 30 день - в 3,4 раза (рисунок 5).

Рисунок 5 - Интенсивность флуоресценции на образцах растений вишни войлочной (клон № 2), инокулированных вирусом шарки сливы, в зависимости от числа дней после заражения: 1 - 10-ый день; 2 - 20-й день; 3 - 30-й день; 4 - положительный контроль; 5 - отрицательный контроль.

В другом индикаторе вишни, инокулированном хцитком, уже на 10-ый день флуоресценция достигла высокого значения - 0,95.

По данным Билкей (1992) вирус шарки удавалось диагностировать методом ИФА на древесных индикаторах только на 30-ый день после инокуляции, а метод ПЦР в этих целях не применялся. Данный эксперимент показал, что вирус детектировался в растении методом ПЦР уже на 10-ый день после инокуляции.

5. Экономическая оценка методов ИФА и ОТ-ПЦР

Нами проведена сравнительная экономическая оценка ИФА и 4 различных методик ПЦР-анализа. Материальные затраты на реактивы, необходимые для постановки 4 различных модификаций ПЦР при диагностике вирусов косточковых культур (на один образец, один вирус в рублях) представлены в таблице 8.

При выполнении ОТ-ПЦР расходы на реактивы с использованием предложенной технологии снижаются в 1,6 раза по сравнению с наборами фирмы «Агродиагностика». Для ОТ-ПЦР в реальном времени стоимость реактивов в обоих случаях была примерно одинаковой, но значительно (в среднем в 2 раза) превышала таковую по сравнению с ОТ-ПЦР.

Таблица 8 - Материальные затраты на реактивы, необходимые для постановки ПЦР при диагностике вирусов косточковых культур (на один образец, один вирус в рублях)

Этап диагностики ОТ-ПЦР ОТ-ПЦР в реальном времени

Готовые наборы («Агродиагностика») Разработанная технология Готовые Наборы («Агродиагностика») Разработанная технология

Экстракция РНК 12,0 20,2 12,0 20,2

Обратная транскрипция 17,2 17,2 17,2 17,2

Амплификация, электрофорез и детекция результатов 50,0 13,0 94,0 94,0

Всего 79,2 50,4 123,2 131,4

Суммарные подсчеты затрат показали, что стоимость тестирования одного образца на 1 вирус различными модификациями ПЦР составила: ОТ-ПЦР (готовые наборы «Агродиагностика) - 576,62 руб., ОТ-ПЦР с использованием разработанных нами наборов - 509,01 руб.; ОТ-ПЦР в реальном времени (готовые наборы «Агродиагностика») - 657,54 руб., ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием разработанного способа экстракции РНК - 679,64 руб. (таблица 9).

Себестоимость проведения одного анализа методом ОТ-ПЦР в реальном времени в среднем в 1,3 раза выше себестоимости анализа в ОТ-ПЦР. Себестоимость анализа одного образца методом ИФА составила 344,83 руб., что в 1,5 раза меньше стоимости стандартной ОТ-ПЦР.

Стоимость тестирования образца методом инокуляции древесных индикаторов составила 1402 руб. Себестоимость проведения данного анализа выше себестоимости ОТ-ПЦР в среднем в 2,3 раза и в 4,1 раза выше, чем ИФА.

Таблица 9 - Материальные затраты при тестировании одного образца на один вирус различными методами диагностики, руб

Статья расхода ИФА ОТ-ПЦР ОТ-ПЦР в реальном времени Метод древесных индикаторов

Готовые наборы «Агродиа-гностика» Разработанная технология Готовые наборы «Агродиа-гностика» Разработанная технология

Электроэнергия 22,20 0,85 0,85 0,78 0,78 -

Теплообеспечение 5,23 4,86 4,86 4,86 4,86 16,2

Водообеспечение 3,5 0,34 0,34 0,34 0,34 12,85

Амортизация оборудования 76,30 66,9 66,9 108,5 108,5 -

Амортизация помещений 1,20 1,08 1,08 1,08 1,08 26,03

Зарплата с начислениями 62,50 175,0 164,1 135,2 142,3 193,18

Расходные материалы 31,91 90,16 61,29 136,03 141,93 576,3

Сумма прямых затрат 202,84 339,19 299,42 386,79 399,79 824,56

Общепроизводственные затраты 141,99 237,43 209,59 270,75 279,85 577,19

Себестоимость одного теста 344,83 576,62 509,01 657,54 679,64 1401,75

выводы

1. Установлена распространенность основных вирусов на косточковых культурах в обследованных насаждениях Московской области: иларвирус некротической кольцевой пятнистости косточковых -51%, неповирус скручивания листьев черешни - 47 %, потивирус шарки сливы - 31%, иларвирус карликовости сливы - 24 %, триховирус хлоротической пятнистости листьев яблони - 22 % к общему числу деревьев сливы и алычи.

2. На деревьях сливы и алычи с симптомами деформации и вдавленных пятен на плодах впервые в условиях Московской области осуществлена идентификация триховируса хлоротической пятнистости листьев яблони, способного вызывать опасное заболевание косточковых культур - псевдошарку. Наличие данного патогена доказано методами ИФА и ОТ-ПЦР.

3. Усовершенствованы методы ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени для диагностики вирусов в различных частях и органах косточковых культур: листьях, плодах, коре и древесине побегов. Для различных культур рекомендованы оптимальные для тестирования на вирусы органы. При выполнении ПЦР в период покоя растений лучшие результаты обеспечивает использование в качестве тест-образцов древесины или смешанных образцов из коры и древесины.

4. В период покоя метод ПЦР позволяет с высокой степенью достоверности осуществлять тестирование косточковых культур на наличие вируса шарки сливы, тогда как метод ИФА в данный период не выявляет вирусную инфекцию.

5. Длительность хранения образцов листьев при низких температурах оказывает влияние на результат ПЦР. Срок хранения в течение одного месяца обеспечивает успешное получение электрофореграмм продуктов амплификации. Листья, хранящиеся при -20 °С более одного месяца, мало пригодны для тестирования методом ПЦР, поскольку у большинства образцов, за исключением персика, имеет место элиминация вируса шарки сливы. Выделенная РНК вируса хорошо сохраняет антигенные свойства при -20 °С в течение 2 месяцев.

6. Методы ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени при тестировании растений in vitro обеспечивают получение надежных результатов по диагностике вирусов в отличие от метода ИФА.

7. Определены наилучшие параметры процедуры выполнения ПЦР. Установлена оптимальная масса навески растительного образца (100 мг), соотношение навески к лизирующему буферу (от 1:10 до 1:20 в зависимости от видовых особенностей культуры), вид антиоксиданта. Использование в качестве антиок-сиданта шдроксипроизводного бензойной кислоты в количестве 20-30 мг/образец на этапе гомогенизации улучшает экстракцию вирусной РНК и повышает эффективность выявления вирусов.

8. Инокуляция древесных индикаторов вишни войлочной щитком и щитком с древесиной обеспечивает одинаковую эффективность выявления вируса шарки сливы (100 %-ое заражение) на основании визуальной оценки симптомов. Накопление вируса на начальном этапе заражения происходит быстрее при инокуляции щитком.

9. Подтверждена неравномерность распределения вируса PPV по тканям растений путем использования ИФА и ПЦР. С применением метода ПЦР в реальном времени установлено, что вирус шарки сливы спустя 10 дней после инокуляции распространяется в тканях древесных индикаторов и размножается в количестве, достаточном для его идентификации молекулярным методом.

10. Себестоимость тестирования одного образца на конкретный вид вируса зависит от метода диагностики. Затраты на тестирование образца методами ОТ-ПЦР составляют 509-577 руб, ПЦР в реальном времени - 658-680 руб, методом ИФА - 345 руб. Метод диагностики косточковых культур на индикаторах вишни войлочной является наиболее затратным (1402 руб/ образец). Из изученных методов наиболее надежным является ПЦР.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРАКТИЧЕСКОМУ ИСПОЛЬЗОВАНИЮ

1. Усовершенствованные методы ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени рекомендуется применять в лабораториях вирусологии при диагностике косточковых культур на вирусы в процессе фитосанитарного мониторинга насаждений и производства оздоровленного посадочного материала.

2. Методы ПЦР следует использовать при тестировании на вирусы частей и органов вегетирующих и находящихся в состоянии покоя растений, а также растений in vitro. При тестировании растений в состоянии покоя следует использовать древесину или смешанный образец из коры и древесины.

3. Выполнение экстракции РНК рекомендуется осуществлять по разработанной нами методике, основанной на модифицированном способе сорбции вирусных частиц на препарате силика, с добавлением в лизирующий буфер гидроксипроизводного бензойной кислоты в количестве 20-30 мг/образец. Для экстракции следует брать навеску растительного образца в количестве 100 мг и устанавливать соотношение массы навески к объему буфера от 1:10 для вишни до 1:20 для сливы.

4. Растительные образцы, предназначенные для тестирования методами ПЦР, допускается хранить при температуре -20°С в течение 1 месяца. Выделенную РНК можно хранить при той же температуре в течение 2 месяцев.

5. Тестирование косточковых культур на древесных индикаторах вишни войлочной можно осуществлять способами инокуляции щитком или щитком с древесиной.

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Походенко, П.А. Диагностика вируса шарки сливы методом полиме-разной цепной реакции / П.А. Походенко, М.Т. Упадышев // Матер. VII молод. науч. конф. «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии».-М., 2007-С. 30-31;

2. Походенко, П.А. Диагностика вирусов и бактерий на плодовых культурах методом полимеразной цепной реакции / П.А.Походенко, И.И. Кочетова, М.Т. Упадышев // Плодоводство и ягодоводство России,- М.: Изд. Дом МСП, 2008.-Т. XIX.-С. 112-116;

3. Походенко, П.А. Диагностика вируса шарки сливы на косточковых культурах/П.А. Походенко, М.Т. Упадышев// Защита и карантин растений-2008,-№7.-С. 25-26;

4. Походенко, П.А. Распространенность вирусов на косточковых культурах в Подмосковье / П.А. Походенко, М.Т. Упадышев, H.H. Мельникова // Плодоводство и ягодоводство России (по матер, конф. «Инновационные подходы к обеспечению стабильной продуктивности косточковых культур»).-М., 2008,- Т. XX,- С. 211-218;

5. Походенко, П.А. Псевдошарка на сливе и алыче - новое заболевание для Нечерноземья / П.А. Походенко, М.Т. Упадышев // Arpo XXI - 2008. - № 7-9.-С. 11-12;

6. Походенко, П.А. Вирусные болезни на сливе и их диагностика методами ИФА и ПЦР / П.А. Походенко, М.Т. Упадышев // Садоводство и виноградарство.- 2008 - № 5,- С. 22-24;

7. Упадышев, М.Т. Диагностика вирусов семечковых и косточковых культур методами ИФА и ПЦР / М.Т., H.H. Мельникова, А.Д. Петрова, К.В. Мет-лицкая, П.А. Походенко, И.И. Саунина. - М.: ГНУ ВСТИСП, 2008 - 35 с.

Подписано в печать: 30.01.2009

Заказ №1510 Тираж-110 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Походенко, Павел Алексеевич

ВВЕДЕНИЕ.

Цель и задачи исследований.

Научная новизна результатов исследований.

Практическая значимость и реализация результатов исследований.

Основные положения, выставляемые на защиту.

Предмет исследований.

Апробация работы.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Видовой состав вирусов косточковых культур в Европейской части России.

1.2. Основные вирусы, поражающие косточковые культуры.

1.3. Методы диагностики вирусов косточковых культур.

1.3.1. Иммуноферментный анализ.

1.3.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

1.3.2.1. Особенности метода полимеразной цепной реакции.

1.3.2.2. Применение ПЦР-теста для диагностики вирусов косточковых культур.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Время и место проведения исследований.

2.2. Объекты исследований и их характеристика.

2.3. Методика маршрутных обследований и тестирования растительных образцов на наличие вирусов.

2.3.1. Методика проведения ИФА.

2.3.2. Методика выполнения ПЦР.

2.3.2.1. ОТ-ПЦР.

2.3.2.2. ОТ-ПЦР в реальном времени.

2.3.3. Тестирование на древесных индикаторах.

2.4. Элементы учета и наблюдений.

2.5. Методы статистической обработки данных.

2.6. Расчет экономической эффективности.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Изучение распространенности и вредоносности вирусов на косточковых культурах.

3.2. Сравнительная оценка эффективности выявления вируса

PPV с использованием методов ИФА и ПЦР.

3.2.1. Эффективность выявления вируса PPV в зависимости от тестируемого органа растения.

3.2.2. Эффективность тестирования в зависимости от длительности хранения образцов листьев.

3.2.3. Диагностика вируса PPV в пробирочных и адаптированных к нестерильным условиям растениях сливы.

3.3. Совершенствование метода экстракции РЕК вируса из растительных образцов.

3.4. Эффективность выявления вируса шарки сливы на древесных индикаторах вишни войлочной в зависимости от способа прививки.

Глава 4. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА РАЗЛИЧНЫХ

МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ.

ВЫВОДЫ.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Эффективность серологических, молекулярных и индикаторных методов диагностики вирусов косточковых культур"

Вирусные и фитоплазменные заболевания вследствие хронического характера и высокой вредоносности считаются одним из лимитирующих факторов повышения урожайности косточковых культур. Наиболее вредоносным вирусом на этих культурах является потивирус шарки сливы (PPV), вызывающий существенное снижение урожая в результате преждевременного опадения плодов и снижения их вкусовых и товарных качеств. В середине прошлого века шарка едва не привела к вырождению культуры сливы в Югославии и Болгарии и вызвала необходимость вырубки сотен тысяч деревьев (Christoff, 1947; Jordovic, 1963). В условиях Молдовы потери урожая у восприимчивых к шарке сортов сливы составляют 70 % и более (Вердеревская, Маринеску, 1985). В бывшей Чехословакии заражение сливовых садов шаркой привело к снижению их продуктивности на 85 % (Blattny, Heger, 1965), а в Польше - на 50 % (Zawadzka, 1978). У больных деревьев от 20 до 100 % плодов преждевременно опадает, а вес оставшихся снижается в среднем на 20 % (Sutic et al., 1971; Zawadzka, Smolarz, 1978). Кроме того, в уцелевших плодах снижается содержание Сахаров (до 25 %), а кислотность повышается, что существенно снижает их вкусовые качества и пригодность для переработки (Jordovic et al., 1971).

В 80-е годы прошлого века в европейских странах были выведены устойчивые и толерантные к шарке сорта сливы, персика и абрикоса (Kegler et al., 1986), и внедрена система сертификации посадочного материала, что позволило снизить распространенность и вредоносность наиболее часто встречающегося серотипа D PPV. Однако повсеместно было констатировано быстрое распространение высокопатогенного серотипа М этого вируса (Nemeth, 1994; Roy, Smith, 1994; Topchiiska, 1997).

Высокой вредоносностью для косточковых культур характеризуются также иларвирусы некротической кольцевой пятнистости косточковых (PNRSV) и карликовости сливы (PDV), вызывающие разнообразные болезни. Вирус PNRSV вызывает такие болезни, как некротическая кольцевая пятнистость вишни и черешни, кольцевая пятнистость и розеточность персика, кольцевая пятнистость сливы и другие. Так, в Англии в результате заражения PNRSV снижение продуктивности деревьев сливы составляло 13-50 % в зависимости от чувствительности сорта и штамма вируса (Posnette et al., 1981). Во Франции этот вирус вызывал уменьшение диаметра скелетных ветвей сливы до 58 %, а урожайности - в среднем на 20 % (Desvignes, Воуе, 1989). В средиземноморском регионе распространенность вируса PNRSV на сливе составила 27,1 %, PDV - 15,1 %, PPV - 35,7 %, ACLSV - 9,4 %. Насаждения вишни были заражены PNRSV на 48,4 %,PDV-15,1 %,ACLSV-21 % (Myrta et al., 2003).

Вирус PDV вызывает высоковредоносную желтуху вишни, хлоротическую кольцевую пятнистость черешни, скручивание • листьев и карликовость сливы, гуммоз абрикоса, зеленую карликовость персика и другие болезни (Вердеревская, Маринеску, 1985).

Вирус PDV приводит к снижению урожайности черешни на 29-48 %, сливы — на 58-99 % в результате преждевременного опадения плодов (Kralikova, 1963), а вишни после поражения желтухой - на 50 % и более (Fulton et al., 1981).

Некоторые штаммы триховируса хлоротической пятнистости листьев яблони (ACLSV) вызывают на сливе и абрикосе растрескивание коры и псевдошарку (Kegler et al., 1964; Dunez, 1986). В первом случае развиваются глубокие и прогрессирующие трещины, что приводит к отмиранию ветвей. При поражении псевдошаркой плоды имеют неправильную форму, различные деформации и преждевременно опадают.

Основным направлением борьбы с этими заболеваниями является перевод питомниководства на безвирусную основу и введение системы сертификации посадочного материала, что уже осуществлено во всех странах с развитым садоводством.

В России в 70-80-е годы были достигнуты существенные успехи в получении и размножении безвирусного посадочного материала косточковых культур, но в настоящее время это направление питомниководства переживает существенный упадок. В немалой степени это обусловлено финансовыми проблемами и трудоемкостью технологии получения безвирусных клонов. В связи с разработкой программы по развитию питомниководства в РФ возникает необходимость увеличения выпуска оздоровленных растений.

Ключевым элементом любой технологии получения здоровых клонов является диагностика вирусной инфекции. В этом плане важным шагом стало внедрение метода иммуноферментного анализа - ИФА (Clark, Adams, 1977), который позволяет в краткие сроки (2-3 дня) в лабораторных условиях осуществлять тестирование нескольких сотен образцов. Внедрение данного метода позволило практически отказаться от использования травянистых растений-индикаторов.

Однако получение диагностических сывороток возможно далеко не ко всем вирусам и фитоплазмам плодовых культур, а сам метод ИФА имеет недостаточную чувствительность для выявления вирусов в конце вегетации и в состоянии покоя растений, в тканях коры и древесины, а также в культурах in vitro растений. Как правило, использование метода ИФА ограничивается двумя месяцами после начала вегетации растений.

Указанные недостатки позволяют преодолеть методы молекулярной диагностики с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), являющиеся наиболее современными технологиями диагностики патогенов (Wetzel et al., 1991). Преимуществами ПЦР-теста для выявления фитовирусов являются чрезвычайно высокие специфичность и чувствительность, что теоретически позволяет выявлять единичные молекулы-мишени из смеси многих других. Проведение анализа возможно в течение одного рабочего дня.

ПЦР-тесты для диагностики различных патогенов плодовых культур (вирусов, вироидов, фитоплазм, бактерий, грибов) активно разрабатываются и внедряются во всем мире. В России в этом плане было проведено крайне ограниченное число исследований по немногочисленным объектам (Филимонова и др., 2000; Добржанская и др., 2001), вследствие чего ПЦР-тесты по-прежнему слабо применяются в практике диагностической работы.

Цель и задачи исследований

Целью исследований является совершенствование и сравнительная оценка серологических, молекулярных и индикаторных методов диагностики вирусных болезней косточковых культур.

В конкретные задачи исследований входило следующее:

1. Изучить распространенность вирусных болезней в условиях Московской области.

2. Усовершенствовать методику полимеразной цепной реакции для диагностики основных вирусов косточковых культур.

3. Дать сравнительную оценку эффективности различных модификаций ПЦР-теста при выявлении вирусов косточковых культур.

4. Оценить эффективность серологических, молекулярных и индикаторных методов диагностики вирусов косточковых культур для ускоренного выделения свободных от основных вирусов клонов.

Методология исследований заключается в поиске и разработке оптимальных методов диагностики в зависимости от поставленных вирусологических задач по мониторингу фитосанитарного состояния насаждений и получению свободного от основных вирусов посадочного материала.

Научная новизна результатов исследований

Впервые в условиях Московской области обнаружено опасное заболевание косточковых культур — псевдошарка, вызываемая триховирусом хлоротической пятнистости листьев яблони и приводящая к появлению на плодах симптомов деформации и вдавленных пятен. Наличие данного вируса в тканях растений доказано методами ИФА и ОТ-ПЦР.

Разработан способ экстракции РНК вируса из растительных образцов различного происхождения с добавлением в лизирующий буфер гидроксипроизводного бензойной кислоты. На разработанный способ подана заявка на патент № 2008152268 от 30.12.2008 г.

Определены оптимальные параметры выполнения ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени. Установлена высокая чувствительность молекулярных методов при тестировании тканей покоящихся растений и растений in vitro.

Практическая значимость и реализация результатов исследований

Предложен новый высокоэффективный способ экстракции РНК вирусов из тканей косточковых культур для последующей диагностики методом полимеразной цепной реакции, обеспечивающий надежную диагностику вирусной инфекции.

Разработанный способ диагностики внедрен в условиях лаборатории вирусологии ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии и прошел успешные испытания в фирме «Агродиагностика», что позволило повысить эффективность выявления вирусов на 25 %.

Основные положения, выставляемые на защиту:

1. . Подтверждение наличия в насаждениях косточковых культур в условиях Московской области вредоносного заболевания -псевдошарки;

2. Совершенствование молекулярных методов диагностики (ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени) вирусов на косточковых культурах;

3. Сравнительная оценка эффективности диагностики вирусов косточковых культур методами ИФА, ПЦР и на древесных индикаторах.

Предмет исследований

Апробация работы

Основные материалы диссертации доложены на VII молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» в РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (4 апреля 2007 г.), Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые — садоводству России в XXI веке» (г. Москва, 11-12 октября 2007 г.) и конференции «Инновационные подходы к обеспечению стабильной продуктивности косточковых культур» (г. Москва, 17-18 июля 2008 г.).

Публикации

Основные результаты исследований по диссертации изложены в 7 научных статьях, в том числе 5 - в рецензируемых научных журналах.

Заключение Диссертация по теме "Защита растений", Походенко, Павел Алексеевич

выводы

1. Установлена распространенность основных вирусов на косточковых культурах в обследованных насаждениях Московской области: иларвирус некротической кольцевой пятнистости косточковых — 51 %, неповирус скручивания листьев черешни - 47 %, потивирус шарки сливы - 31%, иларвирус карликовости сливы - 24 %, триховирус хлоротической пятнистости листьев яблони - 22 % к общему числу деревьев сливы и алычи.

2. На деревьях сливы и алычи с симптомами деформации и вдавленных пятен на плодах впервые в условиях Московской области осуществлена идентификация триховируса хлоротической пятнистости листьев яблони, способного вызывать опасное заболевание косточковых культур — псевдошарку. Наличие данного патогена доказано методами ИФА и ОТ-ПЦР.

Выделенная РНК вируса хорошо сохраняет антигенные свойства при -20 °С в течение 2 месяцев.

7. Определены наилучшие параметры процедуры выполнения ПЦР. Установлена оптимальная масса навески растительного образца (100 мг), соотношение навески к лизирующему буферу (от 1:10 до 1:20 в зависимости от видовых особенностей культуры), вид антиоксиданта. Использование в качестве антиоксиданта гидроксипроизводного бензойной кислоты в количестве 20-30 мг/образец на этапе гомогенизации улучшает экстракцию вирусной РНК и повышает эффективность выявления вирусов.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Походенко, Павел Алексеевич, Москва

1. Абрамова, И.Т. Оспа слив в СССР и меры борьбы с ней / И.Т. Абрамова / Автореферат дис. канд. биол. наук. Л., 1970. - 22 с.

2. Билкей, Н.Д. Разработка современных иммунологических методов диагностики вируса шарки сливы / Н.Д. Билкей /Автореферат дис. канд. биол. наук. Прилуки, 1992. - 22 с.

3. Белошапкина, О.О. Система оздоровления земляники садовой от вирусов / О.О. Белошапкина// Дисс. докт. с.-х. наук. М., 2006. - 370 с.

4. Бунцевич, Л.Л. Изучение восприимчивости различных сортов сливы к вирусу шарки / Л.Л. Бунцевич // Плодоводство и ягодоводство России / Сб. науч. работ ВСТИСП. 2004. - Т. XI. - С. 361-364.

5. Вердеревская, Т.Д. Вирусные и микоплазменные заболевания плодовых культур и разработка мер борьбы с ними в Молдавской ССР / Т.Д. Вердеревская // Автореферат дис. доктора биол. наук. — Кишинев, 1973. -42 с.

6. Вердеревская, Т.Д. Вирусные и микоплазменные заболевания плодовых культур и винограда в Молдавии / Т.Д. Вердеревская, В.Т. Маринеску. -Кишинев: Штиинца, 1985. 311с.

7. Добржанская, Е.О. Диагностика вируса шарки сливы методом полимеразной цепной реакции / Е.О. Добржанская, Ю.Н. Приходько, С.Н. Чирков // Доклады РАСХН. 2001. - № 2. - С. 11-12.

8. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований) / Б.А. Доспехов // Изд. 5 дополненное и переработанное-М.: Агропромиздат, 1985.-351 с.

9. Калашян, Ю.А. Изучение вируса шарки в пораженных клетках растений-хозяев методом электронной микроскопии / Ю.А. Калашян // Вирусные болезни плодово-ягодных культур и винограда в Молдавии. Кишинев, 1973.-С. 17-21.

10. Ю.Калашян, Ю.А. Изучение вирусов шарки сливы и хлоротической пятнистости листьев яблони на ультратонких срезах и разработка быстрыхметодов их диагностики / Ю.А. Калашян / Автореферат дис. канд. с.-х. наук. Кишинев, 1978. - 19 с.

11. Келдыш, М.А. Вирусные и микоплазменные болезни древесных растений / М.А Келдыш, Ю.И. Помазков М.: Наука. 1985. - 133 с.

12. Колонцов, А.А. Таксономия и классификация вироидов / А.А. Колонцов, В.Г. Заец // Агро XXI. 2006. - № 1-3. - С. 30-31.

13. Колонцов, А.А. Вироиды, их признаки и вредоносность / А.А. Колонцов, В.Г. Заец // Агро XXI. 2006. - № 7-9. - С. 19-22.

14. М.Литвиненко, И.С. Электронная микроскопия возбудителя оспы сливы / И.С. Литвиненко, И.Т. Абрамова, Ю.Н. Помазков // VI Всесоюзное совещание по вирусным болезням растений. М., 1971 - 185 с.

15. Лахматова (Балашова), И.Т. Устойчивость сливы к вирусу шарки / И.Т. Лахматова (Балашова) // Автореф. дис. докт. биол. наук. М., 1997. - 48 с.

16. Метлицкая, К.В. Вирусные болезни косточковых пород в Европейской части России / К.В. Метлицкая // Плодоводство и ягодоводство России: Сб. науч. раб. ВСТИСП. Т. VII. - 2000. - С. 237-242.

17. Метлицкая, К.В. Диагностика и рапространение вирусных болезней косточковых пород в Европейской части России / К.В. Метлицкая, Н.А. Холод // Тезисы докладов ВИГИС. 2001. - С. 111-113.

18. Методические рекомендации по определению экономической эффективности научных достижений в садоводстве // Сост. А.С. Косякин и др.- М.: ВСТИСП, 2005.- 111 с.

19. Помазков, Ю.И. Вирусные болезни плодовых и ягодных культур в Нечерноземной зоне / И.Ю. Помазков / Автореферат дис. докт. с.-х. наук. М.,1975. - 34 с.

20. ПЦР 2002.- http://molbiol.ru.

21. Цуканова, Е.М. Состояние насаждений вишни и сливы в ЦЧР и выращивание безвирусного посадочного материала / Е.М. Цуканова / Автореферат дис. канд. с.-х. наук. — Мичуринск, 1998. — 25 с.

22. Acuna, R. Outbreaks of plum pox virus in Chile / R. Acuna // Abst. EPPO Conf. on Plum Pox. 1993. - P.5-8.

23. Adams, A.N. The detection of plum pox virus in Prunus species by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) / A.N. Adams // Ann. Appl. Biol. 1978. -V. 90.-P. 215-221.

24. Albrechtova, L. Purification of the sharka virus for production of antisera useful for the ELISA method / L. Albrechtova, L. Holubcova, M. Jokej // Ochrana Rostlin. 1986 — № 22. - P. 161-163.

25. Atanasoff, D. Plum pox: A new virus disease / D. Atanasoff // Yearbook Univ. Sofia. 1932.-V. 11.-P. 49-69.

26. Atanasoff, D. Virus diseases of plants: a bibliography / D. Atanasoff // Houdojnik Printing Co. Sofia. 1934. - 219 p.

27. Atanasoff, D. Mosaic of stone fruits / D. Atanasoff // Phytopath. Zeitschrift. -1935.-V. 8.-P. 259-284.

28. Baumann, G. Wichtige Viruskrankheiten des Kern- und Steinobstes /G. Baumann // Erwerbsobstbau. 1972. - № 14. - P. 177-198.

29. Blattny, C. Some remarks on the economical importance of sharka disease in Czechoslovakia / C. Blattny, M. Heger // Zastita Bilja. 1965. - V. 16. - P. 417418.

30. Breyel, E. Isolation of dsRNA from plum pox virus infected plant tissue / E. Breyel, E. Maiss, R. Casper, F. El Ouaghlidi // Acta Hort. № 193. - P. 167-172.

31. Cadman, C.H. Affinities of viruses infecting fruit trees and raspberry / C.H. Cadman // Plant Dis. Rep. 1963. - Vol. 47. - P. 459-463.

32. Cambra, M. Use of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for virus detection on stone fruit trees in Spain / M. Cambra, G. Llacer, C. Perez de Sanroman //Acta Hort.- 1983. № 130.-P. 145-150.

33. Cambra, M. Translocation of chlorotic leafspot and prunus necrotic ringspot viruses in apricot and peach seedlings / M.Cambra, J. Llacer, J. Aramburu, A. Lavina // Acta Hort. 1986. - № 193 - P. 233-240.

34. Cambra, M. Detection of plum pox potyvirus using monoclonal antibodies to structural and non-structural proteins / M. Cambra, M. Asensio, M.T. Gorris, E.

35. Perez, E. Camarasa, J. Garcia, J.J. Moya, D. Lopez-Abella, C. Vela, A. Sanz / Bulletin OEPP / EPPO Bulletin. 1994. - V. 24. - P. 569-577.

36. Cambra, M. Detection of Prunus viruses by print-capture PCR / M. Cambra, A. Olmos, T. Candresse, M.T. Corris // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. 1997. -V. 27.-№4.-P. 535-537.

37. Candresse, T Analysis of plum pox virus variability and development of strain specific PCR assays / T. Candresse, G. Macquaire, M. Lanneau, M. Bousalem, J. Dunez, L. Quiot-Douine, J.B. Quiot / Acta Hort. 1995. - № 386 - P. 357-369.

38. Candresse, T. Comparison of monoclonal antibodies and polymerase chain reaction assays for the typing of isolates belonging to the M and D serotypes of plum pox potyvirus / T.Candresse, M. Cambra, S. Dallot // Phytopath. 1998. -№88.-P. 198-204.

39. Candresse, T. PCR based techniques for the detection of plant viruses and viroids / M. Lanneau, F. Revers, S. Kofalvi and G. Macquaire // Acta Hort. 2000. -№530-P. 61-67.

40. Casper, R. Serodiagnosis of plum pox virus / R. Casper // Acta Hort. 1975. -№44.-P. 171-172.

41. Christoff, A. Virus diseases of the genus Prunus in Bulgaria / Phytopath. Z. -1938.-№ 11.-P. 360-422.

42. Christoff, A. Izv. na Kamarata na narodnata kultura /A.Christoff // Biologija, zemedelje I lesovodstvo. 1947. - № 1. - P. 261-296.

43. Clark, M.F. The detection of plum pox and other viruses in woody plants by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) / M.F. Clark, A.N. Adams, J.M. Thresh, R. Casper // Acta Hort. - 1976. - № 67. - P. 51-57.

44. Clark, M.F. Characterization of the microplate of enzyme linked immunosorbent assay for detection of plant viruses / M.F. Clark, A.N. Adams // J.Gen.Virol. -1977. - Vol. 34. - P. 475-483.

45. Coman, T. Transmission de la sharka par le pollen et par les graines / T. Coman, V. Cocin // Bull, d'Information Sharka. 1976. - № 2. - P. 15-21.

46. Crescenzi, A. Infenzioni di sharka su ciliegio doice in Italia meridionale / A. Crescenzi, M. Nuzzaci, L. Levy, P. Piazzolla, A. Hadidi // Inform. Agrar. 1994. -V. 34.-P. 73-75.

47. Crescenzi, A. Plum pox virus (PPV) on sweet cherry / A. Crescenzi, M. Nuzzaci, P. Piazzolla, A. Hadidi // Acta Hort. 1995. - № 386. - P. 219-225.

48. Crescenzi, A. Further characterization of the sweet cherry isolate of-plum pox potyvirus / A. Crescenzi, L. d'Aquino, S. Comes, M. Nuzzaci, P. Piazzolla, A. Hadidi // Proceedings of the Middle European Meeting on Plum Pox. Budapest, 1996.-P. 99- 103.

49. Cropley, К Further studies of Euro-pean rasp, leaf and leaf roll diseases of cherry trees / R. Cropley // Ann. Appl. Biol. 1964. - № 53. - P. 333-341.

50. Cropley, R. The identification of plum pox (sharka) virus in England / R. Cropley // Plant Pathology. 1968. - V. 17. - P. 66-70.

51. Demeke, Т. The effects of plant polysacharide and buffer additives on PCR / T. Demeke, R.P.Adams // Biotechniques. 1992. - Vol. 12. - P. 332 - 334.

52. Desvignes, J. C. Different diseases caused by the chlorotic leaf spot virus on the fruit trees / J.C. Desvignes, R. Boye // Acta Hort. 1989 - № 235. - P. 31-38.

53. Detienne, G. Use and versatility of the immunoenzymatic ELISA procedure in the detection of diffferent strains of apple chlorotic leaf spot virus / G. Detienne, R. Delibos, J. Dunes // Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 1980. - Vol. 15. -P. 39-45.

54. Dosba, F. Experimental transmission of plum pox virus (PPV) to Prunus mahaleb and Prunus avium / F. Dosba, P. Maison, M. Lansac, G. Massonie // J. Phytopathology. 1987. - Vol. 120. - P. 199-204.

55. Dulic-Marcovic, J. An experiment with plum pox virus transmission by apricot and peach seed / J. Dulic-Marcovic, M. Rancovic // Proceeding of the Midde European Metting on Plum Pox . Budapest, 1997. - P. 117-119.

56. Dulic, J. Outbreak of plum pox virus on peach in Yugoslavia / J. Dulic, A. Saric // Acta Hort. 1986. - № 193. - P. 161-165.

57. Dunez, J. Variability of symptoms induced by the apple chlorotic leaf spot (CLSV) A type of CLSV probably responsible for bark split disease of prune trees / J. Dunez, C.Marenaud, R. Delbos, M. Lansac // Plant Dis. Rep. 1972. - №> 56. -P. 293-295.

58. Dunez, J. Bark split disease of prune trees and its association with strains of Apple Chlorotic Leaf Spot / J. Dunez, C.Marenaud, and R. Delbos // Acta Hort. -1975. — № 44. P.81-92.

59. Dunez, J. Application des techniques enzymatiques a la detection de certains vims phytopathogenes des vegetaux. La methode ELISA / J. Dunez // Ann.Phytopath. 1977. - Vol. 9. - P. 219-221.

60. Dunez, J. Preliminary observation on virus and virus- like diseases of stone-fruit trees in the Mediterranean and Near East contries / J. Dunez // FAO Plant Protection Bulletin. 1986. - V. 34. - № 1. - P. 43-48.

61. Dunez, J. Plum pox: advances in research of the disease and its causal agents, possible means of control / J. Dunez, M. Ravelonandro, T. Candresse // Bulletin OEPP / EPPO Bulletin. 1994. - V. 24. - P. 537-542.

62. EPPO, 1968. Rapport de la Conference internationale sur la sharka du prunier // EPPO Bulletin. 1968. - № 44. - 50 s.

63. EPPO, 1974. Progres realises dans la connaissance de la sharka // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. 1974. - V. 4. - P. 1 - 125.

64. Eynard, A. Test for pollen and seed transmission of plum pox virus (sharka) in two apricot cultivars / A. Eynard, P. Roggero, R. Lenzi, M. Conti, R.G. Milne // Adv. Hort. Sci. 1991. - V. 5. - P. 96-98.

65. Festic, H. Prunus mahaleb novi domacini virusa sarka u prirody / H. Festic // Micribiologia. 1973. - № 1. - P. 7-30.

66. Festic, H. Inverstigstion of new sharka virus hosts / H. Festic // Acta Hort. -1977.-№74.-P. 233-237.

67. Flegg, C.The detection of apple chlorotic leaf spot virus by a modified procedure of enzyme, linked immunosorbent assay (ELISA) / C.Flegg, M.Clark // Ann. appl. Biol. 1979. - Vol. 91. - P. 61-65.

68. Fritzsche, R. Transmission of cherry leaf-roll virus by nematodes / R. Fritzsche, H. Kegler // Naturwissenschaft. 1964. - № 51. - P. 299.

69. Fulton, R.W. Ilarviruses. Handbook of Plant Virus Infections and Comparative Diagnosis. Elsevier, Amsterdam, The Netherlands. / R.W. Fulton. 1981. -P. 377-413.

70. Gilmer, R.M. Apple chlorotic leaf spot and tobacco mosaic viruses in cherry / R.M. Gilmer //PL. Dis.Report. 1967. - Vol. 51. - P. 823-825.

71. Gilmer, R.M. Virus diseases and noninfectious disorders of stone fruits in North America / R.M. Gilmer, J.D. Moore, G. Nyland, M.F. Welsh // U.S. Dep. Agric. Agric. Handb. 1976. - 437 p.

72. Gruntzig, M. Eine verbesserte Methode zur partiellen Reinigung des Scharka-virus der Pflaume (plum pox virus) und die Herstellung Hochtitriger Antiseren / M. Gruntzig //Arch. Phytopathol. Pflanzenschutz. 1981. - V. 16. - P. 279-282.

73. Gruntzig, M. Untersuchungen zum Nachweis des Scharka-Virus (plum pox virus) in Pflaumenbaumen / M. Gruntzig, E. Fuchs, H. Kegler // Arch. Phytopathol. Pflanzenschutz. 1986. - V. 22. - P. 441-449.

74. Habili, N. First detection of an ampelovirus, a maculavirus and two vitiviruses in Iranian table grapes / N. Habili, A. Afsharifar, R.H. Symons // 14th ICVG Conference, Locorotondo, 12-17th September. 2003. - P. 162-163.

75. Hansen, M. A. Plant disease diagnosis: present status and future prospects / M. A. Hansen, R. L. Wick // Adv. in Plant Path. 1993. - № 10. - P. 65-126.

76. Hamdorf, G. Untersuchungen uber den Wirtspflanzenkreis des scharka-virus / G. Hamdorf// Nachr. Deutch. Pflanzenschutzd. 1972. - V. 24. - P. 181-186.

77. Hamdorf, G. The detection of plum pox virus (PPV) by indicator plants and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) / G. Hamdorf // Acta Hort. 1983. -№ 130.-P. 151-160.

78. Henson, J.M. The polymerase chain reaction and plant disease diagnosis / J.M.Henson, R. French // Ann. Rev. Phytopath. 1993. - № 31. - P. 81-109.

79. ISHS 1982. Detection of virus and virus-like diseases of fruit trees. Indexing techniques, indicatior range. // Acta Hort. 1982. - № 130. - P. 319-330.

80. James, D. Prelimenary molecular characterization of Plum pox potyvirus isolate W3174: Evidence of a new strain / D. James, A. Varga // Acta Hort. 2004. -№657.-P. 177-182.

81. Jelkmann, W. Detection of virus and virus-like diseases of fruit trees / W. Jelkmann // Acta Hort. 2004. - № 657. - P. 575-591.

82. Jordovic, M. New indicator plants convenient for diagnosis of plum pox disease / -M. Jordovic // Zastita Bilja. 1961. - № 63-64. - P. 99-103.

83. Jordovic, M. Investigation of the spread and some factors spreading plum pox virus disease / M. Jordovic // Phytopath. Mediterranea. 1963. - Vol. 3. - P. 167170.

84. Jordovic, M. The rate of spread of sharka (plum pox) virus on some plum varieties in nature / M. Jordovic // Zastita Bilja. 1965. - V. 16. - P. 353-356.

85. Jordovic, M. Ispitivanje Prunus spinosa L. kod domacina virus sarke / M. Jordovic, H. Festic., M. Rankovic // Zast. Bilja. 1969. - V. 105. - P. 253-259.

86. Jordovic, M. Prunus spinosa L. as host of sharka virus. Isolation and some properties of the virus / M. Jordovic, H. Festic., M. Rankovic // Ann. Phytopath. -1971.-№20.-P. 178-184.

87. Jordovic, M. Une viruse grave du prunier en Yougoslavie / M. Jordovic // Tidsskrift for Planteavl. 1956. - Vol. 62. - P. 56-59.

88. Kalashjan, Y.A. Plum pox virus in cherry / Y.A. Kalashjan, N.D. Bilkey, E.V. Rubina // Acta Hort. 1988. - № 193. - P. 42-43.

89. Kalashjan, Y.A. Plum pox virus in cherry / Y.A. Kalashjan, N.D. Bilkey // Conference of Chechoslovak Plant Pathologists. 1989. - P. 276-306.

90. Kalashjan, Y.A. Plum pox potyvirus on sour cherry in Moldova / Y.A. Kalashjan, N.D. Bilkey, T.D. Verderevskaya, E.V. Rubina // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. 1994. - Vol. 24.- № 3. - P. 645-649.

91. Kassanis, B. Some results of recent investigations on sharka (plum pox) virus disease / B. Kassanis, D. Sutic // Zastitja Bilja. 1965. - Vol. 16. - P. 335-340.

92. Kinard, G.R. Partial characterization of Pelargonium line pattern and Pelargonium ringspot viruses / G.R. Kinard, R.L. Jordan, S.H. Hurtt // Acta Hort. 1996. - № 432. - P. 148-155.

93. Kegler, H. Identifizierung, Nachweis und Eigenschaften des Scharkavirus der Pflaume / H. Kegler, H. Schmidt, D. Trifonov // Phytopathol. Zeitschrift. 1964. -V. 50.-№ 2.-P. 31-34.

94. Kegler, H. Plum pox virus / H. Kegler, C. Schade // CMI / AAB Description of Plant Viruses. 1971. - № 70. - 4 s.

95. Kegler, H. Different types of resistance to plum pox virus in plums / H. Kegler, E. Fuchs, M. Gruntzic, T.D. Verderevskaya // Acta Hort. 1986. — № 193. -P. 201-205.

96. Kegler, H. A glasshouse test for detecting resistance of plum genotypes to plum pox virus / H. Kegler, E. Bauer, M. Gruntzic, E. Fuchs // Acta Hort. 1994. -№359.-P. 128-152.

97. Kerlam, C. Some properties of plum pox virus and its nucleic acid and protein components / C. Kerlam, J. Dunez // Acta Hort. 1976. - № 67. -P. 185-192.

98. Kerlam, C. Obtention de souches attenues du virus de la sharka a partir d'une population naturelle fortement pathogene / C. Kerlam, P. Maison, M. Lansac, J. Dunez, R. Delbos, G. Masonie, C. Marenaud // Ann. Phytopath. 1978. - V. 10. -P. 303-315.

99. Kerlam, C. Differenciation biologique et serologique des souches du virus de la sharka / C. Kerlam, J. Dunez // Ann. Phytopath. 1979. - Vol. 11. - P. 241250.

100. Kerlam, C. Preliminary studies on the antagonism between strains of plum pox virus / C. Kerlam, P. Maison, M. Lansac, J. Dunez // Acta Phytopath. Acad.Sci.Hung. 1981. - Vol. 15. -P. 56-57.

101. Knapp, E. Improved virus detection in rosaceous fruit trees in vitro / E. Knapp, V. Hanzer, D. Mendonca, A. da Camara Machado, H. Katinger, M.L. da Camara Machado //Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1998. - V. 52. - № 1. - P. 3-6.

102. Kralikova, K. Research on some virus diseases of stone fruits in Czechoslovakia / K. Kralikova // Phytopath. Mediterranea. 1963. - Vol. 2. -P. 203-204.

103. Kummert, J. Development of routine RT-PCR tests for certification of fruit tree multiplication material / J. Kummert, M. Vendrame, S. Steyer, P. Lepoivre // Acta Hort. 2001. - № 550. - P. 45-52.

104. Kunze, L. Transmission of sharka virus by aphids / L. Kunze, H. Krczal // Ann. Phytopath. 1971. - № H.S. - P. 255-260.

105. Lain, S. The complete nucleotide sequence of plum pox potyvirus RNA / S. Lain, J.L. Riechmann, J.A. Garcia // Virus Research. 1989. - Vol. 13. - P. 157172.

106. Leclant, F. Aspect ecologique de la transmission dela sharka (plum pox) dans le seed-est de la France Mise en evidence de nouvelles especes d'aphides vectrices / F. Leclant // Ann.Phytop ath. -1973. Vol. 5. - P. 431-439.

107. Levy, L. Identification of plum pox potyvirus in the United States / L. Levy, V.

108. Damsteegt, V. Mavrodieva, E. Goley, R. Welliver, D. Luster //18 Int.Symp. Virus and Virus-like diseases of Temperate Fruit Crops. 2000. - P. 37.

109. Llacer, G. Suitable conditions for detecting Apple chlorotic leaf spot virus in apricot trees by ELISA / G.Llacer, M.Cambra, A. Lavina, J. Aramburu // Agronomie.- 1985.-№5.-P. 809-812.

110. Llacer, G. Viruses infecting stone fruit trees in Spain / G.Llacer, M.Cambra, A. Lavina, J. Aramburu // Acta Hort. 1986. - № 193. - P. 95-100.

111. Llacer, G. Epidemiology of plum pox (sharka) virus in Valencia (Spain) / G. Llacer, L. Avinent, A. Hermoso de Mendoza // Acta Hort. 1992. № 309. -P. 129-134.

112. Macovei, F. Results concerning influence of plum pox virus on plum pollen morphology and germination / F. Macovei // Studi si cercetari de Biologie. -1970.-Vol. 22.-P. 325-328.

113. MacKenzie, DJ. Improved RNA extraction from woody plants for the detection of viral pathogens by reverse transcription-polymerase chain reaction / DJ. MacKenzie, M.A. McLean, S. Mukerji, and M. Green // Plant Dis. 1997. -№81. -P. 222-226.

114. Maiss, E. The complete nucleotide sequence of plum pox virus RNA / E. Maiss, U. Timpe, A. Brisske, W. Jelkmann, R. Casper, G. Himmler, D. Mattanovitch, H.W. Katinger // J.Gen.Virol. 1989. - Vol. 70. - P. 513-524.

115. Marbot, S. Development of Real-Time PCR Assay for detection of Prunus Necrotic Ringspot Virus in fruit trees / S. Marbot, M. Salmon // Plant Dis. 2002. -V. 87.-№ 11.-P. 1344-1348.

116. Marenaud, C. Identification and comparison of different strains of apple chlorotic leaf spot virus and possibilities of cross protection / C. Marenaud, J. Dunez, R. Bernhard // Acta Hort. 1976. - Vol. 67. - P. 219-226.

117. Marenaud, C. Observations sur la diffusion et la detection du vurus de la sharka / Marenaud С., K. Mazy, M. Chauffurin // Phytoma. 1976. - № 280. - P. 20-24.

118. Marenaud, C. Etude comparative de differents isolats du virus de la sharka / C. Marenaud, G. Massonie // Ann. Phytopath. 1977. - Vol. 9. - P. 107-122.

119. Massone, G. Peach resistance to aphid vectors of plum pox virus / G. Massone, P. Maison // Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 1980. - Vol. 15. - P. 89-95.

120. Menzel, W. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays of plant mRNA as internal control / W. Menzel, W. Jelkmann, E. Maiss // J. Virol. Meth. 2002. - Vol. 99. - P. 81-92.

121. Mink, G. I. Preliminary evolution of some Russian apple varieties as indicators for apple / G.I. Mink, J.R. Shay // Supplement Plant Disease Reporter. 1959. -№ 254. - 13 p.

122. Minoiu, N. The vectors transmitting plum pox virus to plum / N. Minoiu //Ann.Inst.Cercetari Prot.Plant. 1973. - Vol. 9. - P. 49-56.

123. Minoiu, N. Neue Eltersuchungen iiber das scharka-virus / N. Minoiu // Arch. Phytopath.Pflanzensch. 1975. - Vol. 11. - P. 389-397.

124. Minoiu, N. Plum and myrobalan selections resistant to plum pox virus / N. Minoiu, K. Pattantyns // Protectia Plantelor. 1997. - Vol. 27. - P. 143-145.

125. Myrta, A. Virus and virus-like diseases of stone fruits, with particular reference to Mediterranean region / A. Myrta, B. Di Terlizzi, V. Savino // Options Mediterraneennes, Serie B. 2003. - № 45. - 172. p.

126. Nemchinov, I. Detection and partial characterization of plum pox virus isolate from infected sour cherry / I. Nemchinov, A. Hadidi, T. Verderevskaya // Acta Hort. v.1995. - № 386. - P. 226-236.

127. Nemchinov, L. Characterization of the sour cherry strain of plum pox virus / L. Nemchinov, A. Hadidi // Phytopathology. 1996. - Vol. 86. - P. 575-580.

128. Nemeth, M. Field and greenhouse experiments with plum pox virus / M. Nemeth // Phytopath. Mediterranea. 1963. - Vol. 2. - P. 162-166.

129. Nemeth, M. Plum pox virus on Prunus glandulosa / M. Nemeth, K. Schmelzer // Acta Phytopath. Acad. Sci.Hung. 1972. - Vol. 7. - P. 193-196.

130. Nemeth, M. GF31, a reliable myrobalan field indicator for rapid detection of plum pox virus / M. Nemeth, M. Kolber // Acta Hort. 1981. - № 94. - P. 204214.

131. Nemeth, M. Additional evidence on seed transmission of plum pox virus in apricot, peach and plum proved by ELISA / M. Nemeth, M. Kolber // Acta Hort. -1983. -№ 130.-P. 293-300.

132. Nemeth, M. Apricot chlorotic leaf roll. In: Virus, mycoplasma and rickettsia diseases of fruit trees / M. Nemeth // Ed. Akademiai Kiado, Budapest and Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, Boston, L&&ster. 1986. - 840 p.

133. Nemeth, M. History and importance of plum pox in stone-fruit production / M. Nemeth // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. 1994. - Vol. 24. - P. 525-536.

134. Olmos, A. Simultaneous and Co-operational amplification (Co-PCR) for detection of plant viruses / A. Olmos, E. Bertolini, M. Cambra // J. Virol. Methods. 2002. - № 106. - P. 51-59.

135. Olmos, A. Real-time assay for quantative detection of non-persistently transmitted Plum pox virus RNA targets in single aphids // A. Olmos, E. Bertolini, M. Gil, M. Cambra // J. Virol. Methods. 2005. - № 68. - P. 151-155.

136. Parakh, D.R. Detection of Prune Dwarf Virus from infected stone fruits using reverse transcription polymerase chain reaction / D.R. Parakh, A.M. Shamloul, A. Hadidi, H.E. Waterworth // Acta Hort. 1995. - Vol. 386. - P. 421-430.

137. Pasquini, G. Different RT PCR protocols applied to mass scale detection of fruit tree viruses covered by certification / G. Pasquini, F. Faggioli; M. Barba // Petria. - 1999. - Vol. 9. - P. 157-162.

138. Patrakosol, P. Detection and Heat Therapy of Prunus Necrotic Ringspot Virus and Prune Dwarf Virus in Peach Tree / P. Patrakosol // Memoirs of the Tokyo University of Agriculture. 1985. - № 27. - P. 35-87.

139. Paulechova, K. Comparative study on plum sharka virus isolates from Slovakia /К. Paulechova// Biologia. 1981. - Vol. 36. - P. 225-229.

140. Paulechova, K. Studium virosovych chorob kostkovin, ceresne a vishe / K. Paulechova // VEDA Vydavatelstvo slovenskei Akademie veid Bratislava. -1984.-93 s.

141. Plant viruses online. 1999. - http://biology.anu.edu.au/Groups/VTS/vide/

142. Polak, J. Euonymus europea L. and Ligustrum vulgare L. new natural hosts of plum pox virus / J. Polak // 18th Int. Symp. Virus and Virus-like Diseases of Temperate Fruit Crops. — 2000. - P. 36.

143. Poul, F. Use of monoclonal antibodies for the identification of different antigenic domains in apple chlorotic leaf spot virus / F. Poul, J. Dunez // Arch, of Vir.- 1990.-№ 114.-P. 191-202.

144. Posnette, A.F. Leaf Roll : a Virus Disease of Cherry / A.F. Posnette, R. Cropley//Rep. E. Mailing Res. Stn. 1955. - № 1954. - P. 126-127.

145. Posnette, A.F. The line pattern virus disease of plums / A.F. Possnete, C.E. Ellenberger // Ann. Appl. Biol. 1957. - № 68. - P. 74-80.

146. Posnette, A.F. A revised standard minimum range of indicator varieties for fruit tree viruses in Europe / A.F. Posnette, R. Bovey, A. Canova, C.A.R. Meijneke, H.R. Kristinsen // Tidsskrift for Planteavl. 1961. - Vol. 65. - P. 250253.

147. Rankovic, M. A suitable method for purification of sharka virus / M. Rankovic, M. Jordovic // Zastita Bilja. 1970. - Vol. 21. - P. 195-199.

148. Rankovic, M. Suitability of some methods for the purification of plum pox virus strains / M. Rankovic // Zastita Bilja. 1978. - Vol. 29. - P. 179-195.

149. Rankovic, M. The degree of sensitivity of some plum cultivars and hybrids to sharka (plum pox) virus disease / M. Rankovic // Acta Hort. 1983. - № 130. -P. 93-98.

150. Rankovic, M. Investigation of the possibility of sharka virus strain differentiation by electrophoresis / M. Rankovic, O. Velikovic // Zastita Bilja. -1983.-Vol. 34.-P. 47-52.

151. Rankovic, M. Resistance of some peach cultivars and variable pathogenicity of the sharka (plum pox) virus / M. Rankovic, D. Sutic // Acta Hort. 1986. -№ 193.-P. 193-200.

152. Rankovic, M. Further studies on the resistance of plum to sharka (plum pox) virus / M. Rankovic, S. Paunovic // Acta Hort. 1989. - № 235. - P. 283-290.

153. Ravelonandro, M. Nycleotide sequence of the capsid protein gene of the plum pox potyvirus / M. Ravelonandro, C. Varveri, R. Delbos, J Dunez // J. Gen.Virol.- 1988. Vol. 69. - P. 1509-1516.

154. Real-Time PCR 2002., http://www.lytech.ru/Inform/pcrmethod.htm

155. Reihmann, J.L. Infectious in vitro transcripts from a plum pox potyvirus cDNA clone / J.L. Reihmann, S. Lain, J.A. Garcia // Virology. 1990. - Vol. 177. -P. 710-716.

156. Reverse, F. New advances in understanding the molecular biology of plant: potyvirus interactions // F. Reverse, O. Gall, T. Candresse, A.J. Maule // Molec. Plant-Micr. Interact. 1999. - № 12. - P. 367-376.

157. Rosner, A. Evaluating the use of immunocapture and sap-dilution PCR for the detection of Prunus necrotic ringspot virus / A. Rosner, Y. Shiboleth, S. Spiegel, L. Krisbai, M. Kolber // Acta Hort. 1998. - № 472. - P. 227-233.

158. Rowhani, A. Development of a detection system for viruses of woody plants based on PCR analysis of immobilized virions / A. Rowhani, M.A. Maningas, L.S. Lile, S.D. Daubert, D.A. Galino // Phytopath. 1995. - № 85. - P. 347-352.

159. Roy, A.S. Plum pox situation in Europe / A.S. Roy, J.M. Smith // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. -1994. Vol. 24. - P. 515-523.

160. Salmon, M. Detection of Apple chlorotic leaf spo t virus using a fluorgenic 3' minor groove binder-DNA probe / M. Salmon, M. Vendrame, J. Kummert, P. Lepoivre // Eur. J. Plant Path. 2002. - № 108. - P. 99-106.

161. Schade, C. Eigenschaften und Serologie des Scharka- Virus der Pflaume / C. Schade // Zentabl. Bacteriol. Parasit. Infekt. Bt.Hygg. 1969. - Vol. 123. -P. 299-303.

162. Schade, С. Der Nachweis des Virus der nekrotischen und der chlorotischen Ringleckenkrankheit in Kirschen mit dem Latextest als Schnellmethode / C. Schade // Arch. Pflanzenschutz. 1971. - Vol. 7. - P. 207-216.

163. Schade, C. Zur serologischen Verwandschaft des Scharka- Virus der Pflaume, mit dem Bohntngelbmosaik virus / C. Schade // Arch. Phytopath. Pflanzensch.,Berlin. 1975. - V. 11. - № 6. - P. 373-380.

164. Shay, J. R. Disease resistance in apple and pear / J. R. Shay, E. B. Williams, J. Janick. // Proc. Am. Soc. Hort. Sci. 1962. - № 80. - P. 97-104.

165. Schuch, K. Untersuchungen iiber die Pockenkrankheit der Zwetsche / K. Schuch // Z. Krankh Schutz. 1962. - Vol. 69. - P. 137-142.

166. Schuster, C.E. Adisorderof (English) walnuts, grafted on black-walnut stocks resulting in girdling / C.E. Schuster, P. W. Miller. Phytopath. - 1933. - № 23. -P. 408-409.

167. Spiegel, S. Improved detection of Prunuc necrotic ring spot virus by the polymerase chain reaction / S.Spiegel, S.W. Scott, V. Bowman-Vance, Y. Tam, N.N. Galiakparov, A. Rosner // Eur. J. Plant Path. 1996. - № 102. - P. 681-685.

168. Sutic, D. Assay of transmission of sharka virus disease by sap inoculation to herbaceous plants / D. Sutic // Tidssdrrifit for Planteavl. 1961. - Vol. 65. -P. 138-146.

169. Sutic, D. Vegetative effect of some plants on the curing of plum infected with sharka (plum pox) virus / D. Sutic // Zastita Bilja. 1965. - Vol. 16. - P. 85-88.

170. Sutic, D. Some properties of new virus isolate in naturally infected plum trees / D. Sutic, H. Festic, M. Babovic // Ann. Phytopath. 1971. - № 20. - P.97-107.

171. Sutic, D. Comparative studies of some sharka (plum pox) virus isolates / D.Sutic, M. Jordovic, M. Rankovic, H. Festic // Ann. Phytopath. 1971. -№20.-P. 185-192.

172. Sutic, D. Transmissibility of some sharka virus strains by Myzus persicae, depending on various infection sources / D. Sutic, M. Babovic, S. Markovic // Acta Hort. 1976.-№67.-P. 171-175.

173. Teycheney, P.Y. The complete nucleotide sequence of plum pox virus RNA (strain D) / P.Y. Teycheney, G. Tavert, R. Delbos, M. Ravelonandro, J. Dunez // Nucl. Acids Res. 1989.-Vol. 17. - P. 10115-10116.

174. Thomas, H. E. A virus disease of prunes / H. E. Thomas, E. M. Hildebrand // Phytopathology. 1936. - № 26. - P. 145-148.

175. Topchiiska, M. Virus and virus-like diseases of deciduous tree fruits and hops / M. Topchiiska // Newsletter. 1992. - Vol. 6. - P. 1-23.

176. Topchiiska, M. Sweet and sour cherries natural hosts of plum pox (sharka) vims / M. Topchiiska // Proceedings of the Middle European Meeting on Plum Pox. - Budapest, - 1997. - P. 91-93.

177. Topchiiska, M. Plum pox (sharka) on some Prunus spp. in Bulgaria / M. Topchiiska // Proceedings of the Middle European Meeting on Plum Pox. — Budapest, 1997a. P. 94-98.

178. Trifonov, D. Plum pox infection rate of some varieties of plums in the heavily contaminated region of Bulgaria / D. Trifonov // Zastita Bilja. 1965. - Vol. 16. -P. 375-378.

179. Trifonov, D. Susceptibility of Prunus instititia to sharka virus and to Polystigma leaf blight / D. Trifonov // Acta Hort. 1978. - № 74. - P. 229-232.

180. Vaclav, V. Investigation of sharka disease (Prunus vims 7) / V. Vaclav // Zastita Bilja. 1960. - Vol. 16. - P. 335-340.

181. Varga, A. Detection and differentiation of Plum pox vims using real-time PCR with SYBR Green and melting curve analysis: A rapid method of strain typing. / A. Varga, D. James // J. Virol. Methods. 2005. - № 123. - P. 213-220.

182. Varvery, C. Construction and use of a cloned cDNA probe for the detection of plum pox virus in plants / C. Varvery, M. Ravelonandro, J. Dunez // Phytopathology. 1987. - Vol. 77. - P. 1221-1224.

183. Varvery, C. Use of 32P-labeled transcribed RNA probe for dot hybridization of plum pox vims / C. Varvery, T. Candresse, M. Cuqusi, M. Ravelonandro, J. Dunez // Phytopathology. 1988. - Vol. 78. - P. 1280-1283.

184. Verderevskaya, T.D. Zur Bedeutung von Unkrautern als Reservoire des Scharka-Virus (Plum pox virus) / T.D. Verderevskaya, H. Kegler, M. Gruntzig, E. Bauer // Archiv Phytopath. Pflanzenschutz, Berlin. 1985. - V. 21. - № 5. -P. 409-410.

185. Wetzel, T. A polymerase chain reaction assay adapted to plum pox virus detection / T. Wetzel, T. Candresse, M. Ravelonandro, J. Dunez Л J. Virol. Methods. 1991a . - Vol. 33. - P. 355-365.

186. Wetzel, T. A highly sensitive immunocapture polymerase chain reaction method for plum pox potyvirus detection / T. Wetzel, T. Candresse, G. MacQuaire, M. Ravelonandro, J. Dunez // J. Virol. Methods. 1992. - Vol. 39. -P. 27-37.

187. Zawadzka, B. Observations and preliminary experiments on fruit tree virus diseases in Poland/В. Zawadzka //Zastita Bilja. 1982. - Vol. 16.-P. 513-516.

188. Zawadzka, B. Summer hosts of plum aphids as possible host plants of plum pox (sharka) virus / B. Zawadzka, S. Smolarz // Zesz. Prob. Post. Nauk Roln. -1978.-Vol.214.-P. 43-49.

Информация о работе

Походенко, Павел Алексеевич
кандидата сельскохозяйственных наук
Москва, 2009
ВАК 06.01.11

Диссертация

Эффективность серологических, молекулярных и индикаторных методов диагностики вирусов косточковых культур - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы