Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение физико-химических свойств вируса везикулярной болезни свиней, штамм Т-75

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение физико-химических свойств вируса везикулярной болезни свиней, штамм Т-75"



I W*

л - ~-Дяя-олужебного пользования ^^

_ Ä » 12сп о* 11.01 .вЗг~.экэЖ УХ

^штстврствШкльскогохозяйстмссср

ВСЙССНОЗНЫЙ ЙАУЧИО-аССЛВДОВАТЕЛЬСКИИ ШИШЙ ИНСТИТУТ

На правах и копией АНУФПИКВА Тамара Анагоиьема

изученив «изик0-1ии!чесш свойств вируса везикулярной бошни свиней, щхаш т-75 .

08.00.06 -мруоологмя

■ ' ■ \

А по р « ф в р в t

диосергацийна обискаияв >Чевок степени кавдидт биологических каук

г.Владимир, 1963г.

1

, -щ

Работа выполнена во Всес оюзноичко-иссла дюраль-оком ящурном института МСХ СССР.

Научные руководители: доктор ветеринарных наук,

профессор Уэдаоь В.А.,

кандидат ветеринарных наук ; Бондаренко А.Ф.

Официальные оппоненты:

' - доктор ветеринарныг наук» старший научный сотрудник Колосов И.К.,

- кандидат биологических наук, старой)! научный сотрудник Рыбаков С.С.

Ведуцее учреждение: Казанский ветеринарный инстит$1В .

Защита диссертации состоится 1983 года

■

в 13 часов на заседании специализированного совета К 120.60.01 во Всесоюзном нвучно-исследоэательокоы ящурном институте Циниетерства вельского хозяйства СССР.": (600901, г*Владимир, п/о Юрьевец, Ш1Ш).

С диссертацией.можноознакомиться в библиотеке Все-сосэного.научно-исследовательского ящурного института Министерства сельского хозяйстве СССР. .

Автореферат разослан

^^Ш&Я'ЖЯ-1983 года.

Ученый секретарь специализированного совета Л.Н.Соколов

: - s - ■ ■ -Л .

:'.- Актуальность теыр: Разработке средств диагностики к 4 специфической; профилактики вирусных заболеваний сельскохозяйственных животных является важнейшей проблемой ссе-■ ременной ветеринарной видосологии.

• Однако в настоящее время против ряда вирусных заболеваний' отсутствуют эффективные средства профилактики ií , диагностики. К таким заболеваниям относится везикуляр-' ная оодезнь свиней (ВЕС), обнаруженная впервые.г Италии в-1966 году (Нэрделди о соавг.). В году подобную болезнь зарегистрировали^ Гонконге. В 1972 году очаги данной инфекции обнаружили в Одесской области, В I97S-. 'году инфекция появилась в Англии, Польше« .Австрии и 4ран-ша. В197Ь году в Тамбовской .области был обнаружен вирус, вызывающий подобное заболевание, но серологически отличающийся от ранее'выделенного в-Одесской области, а хакве от вирусов, выделенных в других странах* Этот втаим-вируса был зарегистрирован как везикулярная болезнь свиней,. штамм,М5. Из анах?« ч—-«рун"" п1,рдзег,

что многие вопросы биологии и физико-химические свойства данного Eiífiíüs изучены- недостаточно. Не разработаны доотуп ные методы очистки, коаценгрировзгшя и хранения вируса ВВС Т-75, - , - .у:' " '

Одновременное появлениеэтой инфекции в разных о гренах» а таксе отсутствие методов специфической диагностики, лечения и профилактики дают основание считать,.что разработка .высокоэффективных диагностик и оз и вакцин против везикулярной болезни свиней является зк^альной задачей.

Цель работы. Целью данных исследований являлзсь разработка-способов очистки, концентрирования и хранения-вируса ВЕС Т-75 для получения диагностически препаратов .. и инэктивиргованнис вакцин на основе изучения йязико-хяви-ческах свойств вируса. ' ■ •

■ Задачи'исследована: ■ - ;' ;■

- изучить .основные 4изико-хишческие свойства зарзсэ . JjillrTl'jITnpIflti.' ""ll1"''" J"?~

ЦЕНТРАЛЬНАЯ. НАУЧ VM СИЗ л: ПОТЕКА

Моск. сельпо коз анадемни _ 1

. - разработать метод очистки я концентрирования вируса ВВС Т-75, пригодный для попечения диагностических препаратов и инактивированных вакцин;

- изучить изменения антигенных свойств вируса ВЕС '■;. Т-75 при инактивации теплой и действия других физико-химических факторов;

- отработать метод консервирования и хранения вируса ВЕС Т-75.

Научная новизна результатов.Установлено, что натив-нзя вируссодержащая кулмуральная' суспензия ВВС Т-75 имеет в своей оостэве три вида частиц,'обладающих комлле-ментоъязижзщвй зктивнос!ьв u ииеваих коэффициента о едя- -иеитзаик: 150, 81 а 49 S .

Показано, что в концентрированны! и -очищенных пра- ,'■ пзратзх присутствуют только 150s частицы и конечный выход вирусного белка зависит от количества 150 s вирионов в исходном материале.

Новый является обнаружение у вируса ВЕС Т-75 двух' иэлэггкгричвслгах;ючакТ^соОтватствующих значениям рЙЛ.О и 10,0/.

Получены новые данные об изменении антигенных свойств вируса ВЕС Т-75 при действии высоких температур и различной концентрации водородныг ионов.

Показана'возможность применения методов гвльфильтра-ции и стерилизующей фильтрации для очистки и консервирования вируса' ВЕС.Т-75. На основании изучения физико-хими- ■■ чесздх свойств" разработан метод очистки и концентрирования вируса ВЕС Т-75 с пшощью отечественных реагентов^-геасаиота^ос^зтз натрия (ГИФ) и ао лиэ гяда аг яяко дя-115 (ПЭГ). Использование разработанных способов очистки и ■ концентрирования при изготовлении диагвостйнумов а вак-дан показало, что по срзваеаив с существовавший способом, данный катод дозволяет в 3-5 раз сэкономить количество исходного вируса за счет более высокого висом конечного

продукта. •

PaapaôoiaE способ консервирования концактрирозэиного вируса ВЕС Т-75 о целью длительного хранений при +4°.

, Практическое значение. Материалы диссергации исполъ-. зованы при разработке технологии изготовления инактиви-.ровавных вакцин против ВБС-и диагностических нэборов для дифференциации и идентификации вирусов, вызывающи: заболевания с ваэикулярным синдроиои* и вошли в "Рвглаыенг по изготовлению и контролю инактивированвой эмульгированной : вакцины против везикулярной болезни свиней, типов1-75 и 0-72", утвержденный ГУВ КСХ СССР X октября I9S2 рода л "Инструкцию по изготовлению и контролю диагностических сывороток везикулярной болезни свиней, везикулярной экзэв-темы свиней.,и везикулярного стоматита", утвержденную ГУВ . МСХ СССР Иноябрй I9BI годэ..

'Р8зраб01зна'и у1вер*денаяир0кторои института "Методика по концентрированию вируса везикулярной болезни • свиней гексаиета&осаятои надпия".--

; ¿пробадня работы. Ыатериалы 'диссертации долохэШГнэ;" : - заседаниях методической комиссии и Ученого совета ВВИЯЙ 1979, I960 и 1981 гг.

Иубликааия. До мзтвриадаи диссертации опубликовано три научные статьи;

.. Объем работы, Ыатериалы диссертации изложены на . 145 страницах ившиноаисного текста. Результаты собственных исследований представлены в 16 таблицах в 32 рисунках. Список литературы включает 212 источников, в том числе 60 отечественных и 152.иностранных. Приложение изложено нз II страницах машинописного текста.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Вируса. Эксперименты проводили о вирусом везикулярной болевне свиней, ягамм Т-75, адаптированным к монослоВноВ

кулыуре клеток ib-jis-2.

Для сравнительных опытов брили вирус недра типе А, вариант 550)» адаптированный^ организму

крольчат.

Культура клеток. £ работе использовали пьревивэеиыэ. линии влогок свиного происхождения - ib-hs-ü и первичнух) культуру клеток СП.-

Мотоды,оцопни биряагериалов. Для определения тигра инфекционноеш вируса использовали метод титрогания по Олншкам в первичной культуре"клоток почки поросенка (СП) и титрований вирусе-в формирующейся мошелое клеток ib-1ils-2 , Tuipu инфекционное im рассчитывали по методу Кербера в модификации Аишарива и в^ра^али в 1с ТЦД^д/мл.

Проверь на стерильность осуществляли путем высева : проб на искусственные питательные среды Ш1А, ШБ,- СМПА ' и 1ШБ. Посевная доза составляла 0,2' ил. Содерхзние об-_ щего белка в исследуемых материалах определяли по методу .. Лоури с сотр. ' ; .

„__Коадчгсгмпкогтйрдейоние вирусного белка проводили

с помощью количестве иной реакции связывания коаплемента» предускацщвающей измерения концентрации эритроцитов, взятых в качестве индикаторной системы, турбидиметрией на слокгро$,оюм<ярсгпри длине ьолны 680 нм.и сопоставления полученных данных о калибровочной привой между концентрацией эритроцитов (вырэгенной в л Д) и количеством вирусного белка. ' •

Компонентный состав вирусной суспензии .определяли ■ путай разделения компонентов вируса в линейном 5-25^ сахарозном градиенте ультрацентрифугированием при 178000 s » последущеа выявлении комялацентсвягиващвй активности фракций (Д). и построении графика,

•ч "

Очистка и концентрирование вируса

Очистку вируса проводили с поьсойыо хлороформа, ¿реона-ПЗ и истодов гели^ииырицчи и стерилизующей ^илы-

Концентрирование вирусвше суспензий осуществляли • гексаметафосфатом натрия, полиэтиленгликолен с молекулярной массой 6000 (фирмы "Serva СРГ)) и полиэгилен-гликодам отечественного производства (партия 36, серия 115). ■

Физико-химические методы исследования

V Морфологию вируса определяли электронномикроскопи-часки в препаратах, очищенкьк и концеагрироваышйс методой дифференциального центрифугирования. Опыты проводила совместно с Пономаревым A.Q.

Для определения плавучей плотности вируса концентрированные и частично очищенные препараты подвергали центрифугированию в «реформированном градиента плотности хлористого цезия. '

Коэффициент седиментации определяли методом ультра-цантрифугировашя вирусной цуспонзии в зизлитической . центрифуге "Баклан", ыодолъ В- используя метод скоростной седиментации.. Опыты прово далисовыестий'С^Ййрегвзч'Д-— новым В.А. Для сравнения'результатов коэффициент седм- . ментации компонентов вируссодерхзцей сусдеазиой ВВС -Т-75 определяли по взрнеру в линейном сахарозном градиенте. В качеств? маркера 'использовали инфекционные частицы вируса щура, имеющие' коэффициент седиментации 140s

Диапазон устойчивости вируса к гисокойтемшзрзгуре и различным значениям рН определяли по общепринятой иаю-дике (Серия B.H.,IS6&).

йзоэлектрическую точку вируса ИБС т-75 выявляли с помощью техники преципитации, основанной на максимальном осаждении вируса.при том значении рН, которое соответствует его изоэлактричаской'точка.

Количественные данняа обрабатывали статистическими методами.

.: результаты исследований ■;■;','.

Получение счищенных - и концэагрировэнншг; : препаратов вируса ВЕС . Т-75 .

' Учитывая необходимость получения вируса для вакцин ' к диагностикумов, а" такхе получения высококонцвнгрирован--яого 'очиааяного'вируса для-, дальнейших исследований его ■' ¿изико-хииических свойств, сравнивали эффективность раз-, личных методов предварительного концентрирования, удобных для работы .с большими объемами исходного сырья. '- /.. .

С-этой целью испытывали.основные методы, существующие для концентрирования пикорна вирусов (ультра $илыра-цчя, освкденив а та нолей, содяыа, преципитация полиэтилен-глаколем и осаждение в изоэлектр'ической точке). Бкло установлено, что методы ультра^ильтрзции и'осаждения этанолом не сни«а»т. титров инфекционноеги вируса ВЕС Т-75. . ; ■ Но при всех прочих равных условиях- методы преципитации ■ ' ПЭГом и осаядения в изоэлеитрической точке оказались бо-' лее э^ективииги па технологичности, полноте осаядения / вируса и простоте исполнения.

Перед концентрированием вируса проводили.обработку .клеточного детрита с цель» ликвидации потерь вируеспецафи чзского белка, связанного с клеткой. Суспензив-клеяок зеиорзнивзли яри -20°,' опаивали' при +37° и подвергали -низкоскоростнону центрифугированию. Осветленный лигах клеток, использовали в кэчастве срады для ресусдендчрова-пая осадков в процессе концентрирования вируса. Было • показано, что в результате обработки выход вирусного'белка в конечном концентрированно« материале увеличивался нз'Х7-£0%. ' . '. V

В работах Шмидта (1966), Егорова,П.А. (1968), Ивецо-вой Р.В. (1971) сообщалось о способнооти коиплеыевтевязы-вэюаего ацгигеыа аденовирусов, вирусов полиомиелита и ^ ящура осакдэться с помощью гексаыета$ос£ата натрия в-

и o. a tu t.iCDÍ S В В to

W О ■ ' ■ t»

О . И >1 о я

■ ■ и « ■ ю о

s о ч ц я

■ : я a« s я- to cl е> в

Si to ta и

a> « (-3 *< о

<j с te l £э

СЕ М О -Л . b" к

й в E: vi и о

■ Л'В - О) У а ■ м к о ч и и и о ш la os и sc я и а . (D is о о о tf' оса» rosos*

о и ч G и

■ е to w о ■

о. а р ы , to «с?

о ь -о ч ■

it ы m t: о

S С/ ÍJ »5

»■■в в . & а и в Ъ г в s s w о-

« fi ^ ^ S . ■' в Р — (3 я to ® .о

Í О. о ÎL О А О

.. а и о ».

.s g в в -

■ и ы и ti Ч и * о о •а » о -

и л м Ä .

■ .(з и к й о

и Й . _ .

ta ^ и it

а Р ж ы «

■ r> ut; ж to Р О fií s и м к w to

JS № S О О S (в я w ig- aa ш

I «к

■Q'

■ ■ Таблица I

Серийные опыты по концентрированию вирусе БЕС Т-75 . ПЭГои и ГЦФ

№ пп

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.'

8.

9.~

ПЭГ-6000

ГМФ

Количество Титр инфак- Количество Титр инфек-

вирусного ционности . вирусного ционности

белка ' ( ^-е ТДДсП/ил) .белкэ ( ^ ТиД^п/ил)

(икг/мл) ■ (мкг/мл) • V _

13,0

13.5 15,0 27,0 29,0 :

37.6

зад :

40,0 40,8 .

8,75

8,75

8,75

9,0

9,25

9,25.

;9,5 , 9,5

20,8 24-,О 24,8 28,4 34,0 39,2 '43,2 44,0 50,0

8,75

9,0

9,0

9,25

9,25

9,25

9,5

9,5 .

9,5

28,6+9,3 :9,14+а,25 34,2+9,1

.После очиагки концентрированного вируса 4реояом-ПЗ количество вирусного белка остается без изменений, однако, титр инфекционноети уменьшается на 0,5 ТЦД^о/ш! после однократной и на 2,75 15 ТЦД50/мл после двукратной обработки. При исследовании компонентного состава--проб, обработанных фреоном, наблюдалось:разрушение 150 3 до 81 з-частиц, и процент очистки по общему белку-был ниже на 10£ по сравнению с очисткой хлороформом. Учитывая результаты наших опытов'и данные литературы, мы отказались от использования фреонэ-ИЗ для очистки концентрированного вируса.

С целью дополнительной.очиот'ки концентрированного вируса использовали метод гельфилмрации на .сефздексе Г-50,. Опытами установлено,' что при применении данного ме-

года не сншается ни количество вирусного белка*..ни титр инфекционное г и вируса EEC Т-75, в то время Как содержание общего белка уменьшается в два раза. Следовательно, при этом процессе происходит не только удаление солей* но и очистка от низкомолекулярных белков.

Таким образом, в результате ароведенаых исследований разработана методика получения о помощью отечественные реагентов очищенных и концентрированных препаратов вируса LLC Т-75, приаоияемых для изготовления дивгностикумов и кнактивировзнлкх.вакцин. .

. Изучение физико-химических свойств вируса

ЛЕС Т—75 _ . i;

Исследование морфологии вируса ВЕС Т-75 о помощью элактронноа микроскопии показало, что влраоны представляют собой частицы.шарообразной.формы без наружной оболочки. Кроме того, в препаратах обнаружены "пустые" вирусные частицы^_вну?Ралкян~полость которых заполнена контрасти- . рукщшд веществом. Основная масса вирусных частиц-имеет размеры от 29 до 31 ни. Диаметр пустых капсад несколько. меньке-27-28 ем.

Исследованиями с поыощью центрифугирования в гроди- -енте плотности хлористого цезия установлено, что наивысшая инфекционноеть вируса ВВС Т-75 сосредоточена в зоне с плотностью 1,338 г/мл. Ори электронной микроскопии препаратов основная массз вирусных чзстиц наблюдается а этой же зоне. На основании полученных результатов можно считать, что плавучая плотность вируса ВЕС Т-75 в:хлорис-том цезии равна 1,338+0,000 г/мл. ■

Опытами по определению компонентного состава вирусных суспензий ВЕС Т-75 выявлено, что нагивная вирусная суспензия имеет в своем состава три вида частиц, обладающих ¡сомплеиентсвязызощей активностью и ииэюких. даэ^ициенты седиментация: 150, Ы и 49 Ь качества маркера был взят i:ai;:bi-:«a заде яцу^э Д^ с кзвэстныаа коэ^и^иентоми седи-

'■"■ .: - и - \ * ■';."

иентации своих в яру с сл еци $и че ских частиц, равными 140» 75. И 1гЗ (рио.Х). ■ -л..;

... и -: В препаратах вируса ВВС Т-75, подвергнутого концентрированию и очистке имелись только одни 150 зчастицы (рис.2).- ; -

. . .. w

; «

ж ! 10

' . ■; ■■';■ ■. ■ I __10 It. » -А

, -—---~ "',■■* .1 * п й в * - 4 - ■

. Рис.2. Компонентный состав мруссодеркашей суспензии вируса ВЕС Т-75, подвергнутого концентрированию. ■. ■ ■■.;■■■■■ '-.-'."V"-- ':'--

; Эго можно абъясиить тем, что в процессе 'концентрирования и очистки "вируса происходит избирательное хонцент- ; рированяв 150s вирионов или разрушение других частиц.; -В исходном материале количестве специфического вирусного . белка обнаруживали в пределах'0,8-1,5 мкг/мл, а содергание 150s частиц (вирионов) - от 0,3.до 0,6 мкг/мл. После концентрирования вируса в 100 раз по объему, и его очиотки получали препараты с содержанием 25,0-50,0 мкг/мд'вирусного белка. Можно предположить^, что весь этот вирусный белок относится и ISO s частицам, так как другие компоненты не были обнаружены. .' - " " -■

.Тигр ин^екционности концентрированного вируса увеличивался на 2,0 Is ТЦДзд/мл по сравнению с исходным значением, чю пропорционально кратности концентрирования.

' Таким образом» результаты проведенных исследований показали,' что при концентрировании вируса ВЕС .Т-75 следует учитывать содержание 150 s частиц в исходном материале, которые являются основный иммуногонныи компонентом з инзк-тмвировонной вакцине. .'."'"'.■■■'".''."■''

Опытами по определенно константы седиментации вируса ВЕС Т-75. методом аналитического ультрацентрифугирования показано, что после приведения коэффициента седиментации ■'к стандартным условиямг температуре 20°С и вязкости воды, .получается результат, равный 148+2 S. Константа седимонга-ции полного гириона вируса.ВЕС Т-75определенная по маркеру, составила 150+2 S. ^--v-r-'S": - -. • С цолыо опродолеиия иаоэлентрической точки вируса ВЕС Т-75 использовали метод преципитации с последующий, ^титрованием инфекционной активности'или количественный

ппрятшппнияи ■пмрутпрп.ппяуя. l^jrr^wwtaafliiw, yf вируса

ВЕС Т-75.обнаруживаются две изоэлектрическио точки; соответствующе значениям рН 4,0 и 10,0. В литературе имеются сообщения о существовании двух форм вируса с одинаковой специфической инфекционноетью и различными изозлектричас- : 'кии и точками у вируса Менго (Chiumeca et al., 1975), | риновирусов С Korent et el. , 1^75 ) .и поииовирусов .. * (tendell, 1971)» .что, по-вид»шому, характерно я для вируса ВВС. ' . , . ' . ■■'■■ '

Влия нив концентрации'водородных ионов и высоких. тсиператур на вирус ВЕС Т-75

Результаты проведенных исследований подтвердили сооС-тония многих авторов о высокой устойчивости вируса ВЕС кдойстэм различных значений рН. Вирионы остаются целыми в течоние длительного промежутка времени в зоне значений рН 4,0-10,0 в условиях комнатной температуры* Об этом

:-.. ; ■' - К - ■■

свидетельствует сохранение инфекционной и комплементсвязывающей активности' вируса ВЕС Т-75 в этом диапазоне рН. Однако отклонение-знэчоний рН в более кислую иди болов . щелочную сторону вызывало изменение свойств вируса. Так, при значении рН ниже 4,0 значительно снижалось комплемент-' связывающая активность вирусеодернащей суспензии1(в случае рН 2,0- на 73% ог исходного значения) при;сохранон«и титра ■ инфекционноети. Д то. аш врвия:при значении рН 11,0 набдю-дэди.снижениа титра инфекционноети вируса на 0,75 1с ТЦД50/МЛ без изменения .его кошланентевязыващей актив. а ости. ■'■■'. .■; "•.'. ■ '•'

Опытами по выяснению влияния рН на компонентный' состав концентрированных вирусеодаркащих суспензий показано, что в зонерй 3,0 и 11,0 компонентный:состав препаратов вируса ВЕС Т-75 не изменялся,"то есть пики 150э. частиц сохранялись.' V"1 ( ' 4 , ^ "

. С целью изучения влияния высокой температуры на вирус ВЕС Т-75 вируссодеркащий^шлернзл подвергали прогреванию * -в-мч8ЕЯ8*-йвух часов, отбирая пробы о интервалом в 10 минут; Опытами установлено, что при температуре 57-58° в первые-10 минут прогревания титр инфекционности снизился да 2,75-3,0 . ТЩ^'д/мл. Далее,, в течение 110 минут он уиенызилея лишь на 0,75-1,0; 1е ТЦДзр/ил.-Посла двух часов , прогревания при 58°.полной.'инактивации вируса но было . достигнуто. Кошюемантсвнзывающзя активность вируса ВЕС Т-75 текже: резко падала'в первые минуты прогрева'ния, но затем, в.отличие от.титре инфекциоиности, скислась по- . степенно в течение двух часов до нуля . -

. -Проведенные исследования показали, что терноиньктива-ция вируса ВЕС и вируса ящура приводит к различным' измене- ; ниям. Таи, у вируса ящура в первую очередь изменялись инфекционные свойства, а.комплементсвязываюние сохранялись. У вируса ВЕС параллельно со снижением инфекционных свойств ^ происходило' разрушение комплеиентсвязыващего антигена.

-г? ~

. [Тодучешшэ разу л маты позволяет сделать гаюшчение, чм термоинактивавдад вируса ББСТ-75 с: цальюлодучения а вирулентного, но комплеиентсвязыващего антигена ■ невозможна. ' - -''У'..-:'";/"::/ -л.-/.1 ;/ '.'■

; Консервирование и хранение вируса ВВС 1-75 •-

."■* Исследования пононеврвироаанио вируса ВЕС 1-75 показали, что для обеспечения сгарильностипрепарагов можно/ использовать как (физические, так и химические методы консервирования. Применение азида /натрия и стерилизующей "'. фильтрации не.вызывает изменения основных свойств исход- у ного и концентрированного вируса ВЕС Т-75. Но консервиро- ; гение вируссодвргащих суспензий азидом натрия является более . предпочтительным из-за технологичности ю. экономич-.-; ности; Этот препарат (в разведении 1:10000) , совершенно : - -в-} влиял на компонентный, состав концентрированных вирус-оодергацих суспензий" в.процессв.длительного хранения. V

Нативные витссодеовааиа.суспензии хранили пои •не/* -.более 10 суток'и подвергали концейрирШВ1Шг*К&нцеагри*--рованные материалы хранили.при .4°. с добавлениеи азида нзт-рия до их использования с цельп инактиьации-н изготовления вакцин,'э также для получения" диагностикумов.- Результаты экспериментов показали« что'концентрированный вирус ВБС. Т-75 относительно устойчив к>тшгусловиям хранения. В течение1трех месяцев он не иэмеиял-своих свойств..Через • ■■ год хранения в этих условиях.татр инфекционноети вируса . и количество вирусного антигена несколько снизились. ;, ■ : -

Интересные,.на наш взгляд, результаты были получены с-концентрированным вирусным материалом, хранившимся'при . '4° в течениетрех лет. Через трч года этот материал стал ..* полностью авируленгным, тогдд как количество вирусного- ' белка снизалось незначительно от исходного значения (на 1,2 мкг/кл), а компонентный состав остался без изменений* Таким образом, методом длительного хранения был получен

- is - .■.-/■; авирулентный, но серологически активный материал. 3 данном случае произошла как бы естественная инактивация вирусе ВЕС Т-75,

Выводы

.. I. Разработан физико-химический способ концентрирования вируса везикулярной болезни свиней, штамм Т-75, с использованием отечественных реагентов.

2. Отработан способ очистки исходных и концентрированных суспензий вируса ВЕС Т-75 от балластных белков. .

3. Вирус ВЕС, штамм Т-75, имеет следущие.'физико-Х1иические характеристики:

- сферическую форму и размер 29-31 ни;'"

- плавучую плотность в хлористом цезии 1,330+0,000"

г/мл;

-константу £едииентации"вириона 148+2 S;'

- ■ ■■ -"srycroйадвость в широком диапазоне значений рН,(ог

2,0 до 12,0). :

4.В кульгуральных вирусеодарвэщиг суспензиях при-сутсгвуют грИ Еирусспецинические частицы вирусе ВЕС Т-75

с коэффициентами седиментации 150, 81 я 49 s_, В концентрированных и очищенных хлороформом вирусных препаратах остаются только вирионьг с коэффициента седиментации 150 S, Конечный процент выхода вирусного белка зависит^от количества 150 s частиц в исходном материале.

5. Определено," что вирус ВЕС Т-75 имеет две*изоэлокт-рические точки, соответствующие.значениям рН-4,0 и.10,0.' .

6. Действие высоких температур, вероятно, выбывает -разрушение антигенных детерминант вируса.ВЕС Т-75, следовательно, термоинактивация с.целью получения авирулентцого. но кошлементсвязыващего-иикигииз иозоьиожйй. ■■'

; 7. Разработан способ консервирования вируса ВЕС Т-75

... _ и . ■ . . .. .. ■ с целью хранения концентрированных препаратов при +4° е. течение года (срок наблюдения). ' ■

. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛСШШ '

На основании изучения ^изийо-химичвских свойств розрвоогон способ очистки, концентрирования и хранения вируса ВЕС 1-75. - /

Внодрвк в производство.способ подготовки концентратов вируса везикулярной болезни свиней с целью изготовления. диагностических наборов для дифференциации и идентификации вирусов, вызывающих заболевания с везикулярным синдромом и для изготовления полуфабрикатов йноктиваровашжх ; вакцин против ВВС, который включен в "Инструкцию по изготовлению к контролю диагностических сывороток везикулярной болозни свиней, везикулярной экзантемы' свиной к везикулярного стоматита", утвержденную ГУВ.МСХ СССР II ноября 13Б1 года; "Регламент по изготовлению и контролю иноитиьированной зцульПГрсвбиипй вакциныпрогив. везикулярной болезни свиней,типов Т-75 и 0-72гГ7Т50№даШ1ПЯ: ГУВ ИСК СССР I,октября 1582 года, и "Методику по концаит-" рировани» вируса везикулярной болезни свиной гексамега-.фосфатом натрия", одобренную Ученым советом ВНИЯЛ 5 июня 1981 года и утвержденную директором института. -

Список работ, опубликованных по томе диссортации

; I. Ануфриева Т.Д., Еондаренко А.ф., Прохоров В,В., Лобедевз H.H., Швецов Ю.Ф. Очистка и концентрирование вируса везикулярной болезни свиней гексомэга^осфагом натрия.;- Научная статья, ВШЯИ; IS30, инв.к 313, 9с.

2. Ануфриева Т.А.,.Бондзренко A.C., Пономарев A.n. -Вляянио высоких температур на антигенные свойства вируса и"0зи1уля:>ао'.; болезни сзкка^:. - Научная статья, ЫМлЯ ,Х9Ь0 инь.¡о 312, Xto. '

.3, Бондарешсо А.ф., Завьялова Т.Н., Прохоров В. Б., Ануфриева Т.Д., Дудников С.А. и другие. Разработка гох-нояогш: изготовления и контроля эмульгированной вакцины против везикулярной болезни свиней. - Научный отчет ,ВНИЯ1 1980, ина.Кг 356, 13?с. ■ ■ ■ -

Отпечатано на ротапринте филиала Владимирской областной типографии» им. 50-летия Октября. Тираж 120. Заказ *