Действие тиреотропин-рилизинг гормона в широком диапазоне концентраций на структуру биологических мембран

Жерновков, Вадим Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Действие тиреотропин-рилизинг гормона в широком диапазоне концентраций на структуру биологических мембран
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Действие тиреотропин-рилизинг гормона в широком диапазоне концентраций на структуру биологических мембран"

На правах рукописи

ЖЕРНОВКОВ Вадим Евгеньевич

ДЕЙСТВИЕ ТИРЕОТРОПИН-РИЛИЗИНГ ГОРМОНА В ШИРОКОМ ДИАПАЗОНЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ НА СТРУКТУРУ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН

Специальность 03 00 02 - биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003060784

Работа выполнена в Институте биохимической физики им Н М Эмануэля Российской академии наук

Научный руководитель доктор биологических наук

Пальмина Надежда Павловна

Официальные оппоненты

Ведущая организация

доктор биологических наук, профессор Воейков Владимир Леонидович

доктор биологических наук Куроптева Зоя Вениаминовна

Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН

Защита состоится «27» июня 2007 г в 11 часов на заседании Диссертационного Совета Д 002 039 01 при Институте биохимической физики им НМ Эмануэля РАН по адресу 119334, г Москва, ул Косыгина, 4

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им Н Н Семенова РАН

Автореферат разослан « 25 » мая 2007 г

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 002 039 01 кандидат химических наук

МА Смотряева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Последние два десятилетия 20 века отмечены открытием «эффекта сверхмалых доз» биологически активных веществ (БАВ) - гормонов, пептидов, пестицидов, ядов, антиоксидантов и других агентов (Бурлакова, 1986, Benveniste,1988, Bonavida,1991, Doutrempuich,1991, Аш-марин,1992, Зайцев,1993, Ямсков,1999) При сверхмалых концентрациях БАВ (менее 10"13 М) их активность часто возрастает с пониженем концентрации, а общая кривая зависимости доза-эффект имеет нелинейную, полиэкстремальную форму Несмотря на лавинообразное увеличение количества разнообразных фактов о действии БАВ в сверхмалых дозах (СМД), механизм этого явления не установлен Анализ имеющихся данных позволяет выделить ряд общих особенностей, наблюдающихся при действии СМД БАВ, которые оказались независимыми как от природы действующего агента, так и от объекта исследования (Бурлакова, 1999,2003) немонотонная, нелинейная зависимость «доза — эффект», изменение чувствительности (как правило, увеличение) биообъекта к действию разнообразных агентов в СМД, как эндогенных, так и экзогенных, проявление кинетических парадоксов, а именно возможность уловить эффект в СМД биологически активных веществ, когда в клетке или организме имеется то же вещество в дозах на несколько порядков выше, влияние на рецептор вещества в дозах на порядки более низких, чем константы диссоциации комплекса лиганд-рецептор, зависимость «знака» эффекта от начальных характеристик объекта, «расслоение» свойств БАВ по мере уменьшения его концентраций, при котором еще сохраняется активность, но исчезают побочные эффекты,

Ни одна из сформулированных моделей не объясняет всего многообразия эффектов БАВ в СМД По мнению ряда авторов (Пальмина, 1992, 2004, Мальцева, 1992, 2003, Полезина, 1999, Молочкина, 1999) в качестве общих мишеней действия БАВ в СМД могут выступать клеточные и субклеточные мембраны, с которыми взаимодействует БАВ при попадании в клетку и организм Это взаимодействие определяет многие жизненно важные процессы на уровне всей клетки и, в конечном счете, определяет реакцию всего организма в целом В биомембранах локализованы важнейшие системы, регулирующие клеточный метаболизм системы пероксидного окисления липидов (ПОЛ) и вторичных посредников, обладающие свойствами каскадного усиления сигнала при проведении его в клетку (Бурлакова, 1967,1991, Владимиров, 1972, Nishizuka,1984, Yoshimasa, 1987, Taylor, 1986) Процесс ПОЛ, который является физиологическим способом модификации лшшдного бислоя биологических мембран, участвует в разборке мембранных структур и обновлении мембранных фосфоли-пидов, это универсальный механизм повреждения мембранных структур клетки при различных патологических состояниях (Бурлакова, 1967, Козлов, 1972) Система регуляции ПОЛ зависит от состава липидов, их свойств, вязкости и других структурно-динамических состояний (Burlakova, 1980, 1991, Мальцева, 1986), окисляемости и антиокислительной активности, содержания природных антиоксидантов, концентрации перекисных радикалов и гидроперекисей (Kagan, 1988, Бурлакова, 1975, 1991) Действие БАВ, которое изменяет непо-

средственно или опосредованно одну из характеристик липидов, приводит к модификации всех параметров системы ПОЛ Так как режим функционирования мембранных белков, как правило, зависит от каждого из этих параметров, то такие воздействия влекут за собой переход клетки из одного метаболического состояния в другое Так как между системами вторичных посредников и ПОЛ в связи с их общей локализацией в биомембранах существует тесная связь и взаимное влияние, то ряд веществ, осуществляющих свое физиологическое воздействие через лиганд-рецепторный путь, могут модифицировать и параметры системы регуляции ПОЛ К таким агентам относится, например тирео-тропин рилизинг гормон (ТРГ, тиролиберин), эндогенный регуляторный пептид, который выполняет функции нейрогормона (Ашмарин, 1989), принимает участие в регуляции ряда нервных и психических функций (уровень бодрствования, сон, эмоции, обучение, память) (Nillni, 1999) обладает способностью ослаблять неврологическую симптоматику при черепно-мозговых травмах и сотрясениях мозга (Ашмарин, 2003) Известно, что в физиологических концентрациях (10"4-10"6М) ТРГ может взаимодействовать с системой ПОЛ через изменение такого ее параметра, как структура липидного бислоя мембраны (Пальмина, 2004), и, соответственно, вызывать ответ всей клетки Вместе с тем ТРГ является одним из первых веществ, для которого была установлена возможность проявления эффекта в СМД ТРГ усиливает сократительную активность лимфатических сосудов (Ашмарин, 1992), модулирует противосудорож-ную защиту мозга при эпилептических припадках у животных и человека, эффективно применяется в клинике для лечения эпилепсии (Ашмарин, 1999,2003, Лелекова, 2004, Yoneda, 2001, Garcia, 2001)

В связи с вышесказанным, изучение взаимодействия ТРГ с различными областями липидного бислоя биологических мембран, отличающихся по своим биохимическим, физико-химическим и регуляторным свойствам, может нас приблизить к решению весьма актуального и важного вопроса о механизме действия БАВ в сверхнизких концентрациях

Цель настоящей работы состояла в изучении влияния тиролиберина в широком диапазоне концентраций, в том числе и СМД, на структурные характеристики различных областей липидного бислоя биологических мембран клеток печени и головного мозга в экспериментах m vitro, а также структуру воды, основной среды функционирования и передачи информации в биосистемах, ее статических и динамических характеристик

Выбор ТРГ обусловлен его хорошей изученностью как нейромедиатора, как лиганда при рецепторном взаимодействии, как агента, действующего в сверхмалых дозах и, главное, применяющегося в этих дозах в клинике

Объектами изучения явились 5 функционально различных типов биомембран, выделенных из тканей мышей мембраны эндоплазматического ретику-лума (ЭР) печени и мозга, которые являются традиционной моделью для исследования процессов ПОЛ и влияния на него анти- и про-оксидантов, плазматические мембраны (ПМ) печени и мозга, в которых локализованы системы вторичных посредников, синаптосомы, и растворы ТРГ в бидистиллированной воде (в экспериментах по ИК спектроскопии)

Основные задачи исследования:

1) исследовать влияние ТРГ в широком спектре концентраций (10"4 - 10"18М) на микровязкость и упорядоченность липидов эндоплазматического ретикулума (ЭР) и плазматических мембран (ПМ) методом ЭПР при использовании трех иминоксильных стабильных радикалов, нитроксильные фрагменты которых локализуются в приповерхностных (глубина погружения 4 Ä) - 2,2,6,6,-тетраметил-4-каприлоил-1-оксил (зонд С7), средних (8Ä) - 5-доксилстеариновая кислота (зонд С5) и глубоко лежащих гидрофобных слоях липидов (глубина 22Ä) - 16-доксилстеариновая кислота (зонд С16) при температуре 293 °К, получить зависимости доза-эффект

2) определить влияние ТРГ в максимально действующих концентрациях на до-зовой зависимости на термоиндуцированные структурные переходы в различных областях липидного бислоя изучаемых мембран и эффективную энергию их активации

3) конкретизировать механизмы действия различных концентраций ТРГ на исследуемые структурно-динамические параметры мембран ЭР и ПМ

4) исследовать степень влияния ТРГ в широком интервале концентраций ( 10"22 - 10"3 М) на динамическую и статическую структуру водных растворов

а) - на основе многомерного критерия Махаланобиса изучить различия флук-туаций показателей пропускания тонких слоев воды в 9 областях ИК-спектра 3500-3200СМ"1, 3085-2832СМ"1, 2120-1880см"\ 1710-1610СМ1, 1600-1535см"', 1543-1425см"1, 1430,1210см"1, 1127-1057CM"1, 1067-963см"' в водных растворах ТРГ по сравнению с соответствующими эталонами бистилированной воды,

б) - с использованием метода главных компонент (PCR анализ) изучить различия в показателях поглощения водных растворов ТРГ в широком диапазоне концентраций (10"2 - 1 (У20 М) в ближней области ИК спектра (5200-14000 см ') по сравнению с соответствующими водными эталонами

Научная новизна работы.

Впервые показано, что ТРГ в широком диапазоне концентраций ( 10"4-10 18М) существенно модифицирует структурно-динамические параметры различных липидных областей биологических мембран, выделенных из печени и головного мозга мышей При этом обнаружена полимодальность эффектов ТРГ в зависимости от вводимой дозы с классическим для СМД видом концентрационной кривой - экстремумами в областях больших и сверхмалых доз, разделенные «мертвыми зонами» с отсутствием эффекта

Впервые показано, что ТРГ, в концентрациях, вызывающих максимальные изменения в параметрах микровязкости и упорядоченности липидной компоненты, влияет на количественную и качественную картину термоиндуцирован-ных структурных переходов в липидном слое исследуемых мембран

Впервые установлено, что каждый из наблюдаемых максимумов на кривых доза-эффект обусловлен своим механизмом взаимодействия ТРГ с биомембранами в области концентраций (10"4-10~7М) - неспецифическим встраиванием в мембрану, в области (10"9-10"пМ) - образованием лиганд-рецепторного комплекса, причем впервые получены экспериментальные данные, косвенно свиде-

тельствующие о наличии рецептора ТРГ на ПМ печени, в интервале концентраций ТРГ (<10"15М) влияние на мембрану осуществляется опосредованно через изменение структурно-динамических свойств воды

Впервые экспериментально продемонстрировано влияние ТРГ в сверхмалых концентрациях на флуктуации коэффициентов поглощения воды в ближней (5200-14000 см"1) и средней (800-3500см-1) областях ИК-спектра

Впервые предложено объяснение механизмов наблюдаемых эффектов действия ТРГ в сверхмалых дозах на основе неравновесных систем Научно-прикладное значение работы.

Данная работа является составной частью комплекса научных исследований проблемы действия БАВ в сверхмалых дозах Полученные в работе выводы и используемые методологические подходы могут быть применены в решении данной задачи В частности, изменение структурно-динамических характеристик биологических мембран может быть использовано в качестве чувствительной модели для скрининга БАВ, действующих в ультранизких концентрациях

Полученные результаты обосновывают применение подхода минимизации дозы ТРГ вплоть до СМД при использовании в клинике для лечения заболеваний нервной системы

Апробация диссертационной работы.

Материалы работы докладывались на ежегодных молодежных конференциях ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, 2001, 2004, 2005), III Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002), XIV зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002), Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003), XLVII Научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» (Москва-Долгопрудный, 2004), First Dijon International Workshop on Lipids "Recent Advances m Lipid Metabolism and Related Disorders" (Dijon, France, 2005), конференции "European college of neu-ropsychopharmacology" (Москва, 2005), конференции «Нейрохимия Фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005) Публикации.

Основные положения диссертационной работы опубликованы в 21 печатных работах (8 журнальных статьях и 13 тезисах докладов) Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, 4 глав, основных выводов и списка литературы Работа изложена на 175 страницах, иллюстрирована 43 рисунками и 6 таблицами Библиография включает список из 353 работ

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

В первой главе «Анализ состояния проблемы и постановка задачи» дан

обзор литературы по теме диссертации рассмотрены физиологическое действие сверхмалых доз, влияние сверхмалых доз БАВ на растения, на изолированные органы, ткани, клеточные системы и отдельные макромолекулы, на биоло-

гические мембраны Рассмотрены общие закономерности и механизмы действия биологически активных веществ в СМД и роль воды в объяснении действия СМД БАВ Приводятся данные о структуре и свойствах ТРГ, его роли в физиологической регуляции организма и действие его в СМД

В 2-й главе «Основные материалы и методы» онисаны методология выделения биологических мембран, приготовления растворов, описаны методики применения спиновых зондов и исследования водных растворов методом ИК спектроскопии

Объектами изучения явились 5 функционально различных типов биомембран, выделенных из тканей мышей (мембраны ЭР, ПМ печени и мозга, синап-тосомы) Мембраны получали методом последовательного центрифугирования (Hostetier, 1979, Loten, 1986), выделяя из печени и мозга мышей линии Fl (С57 х DBA2) Содержание белка в полученном препарате оценивалось по методу Лоури (Lowry, 1951) В работе был использован ТРГ фирмы Sigma, растворы которого получали методом последовательного разведения через один порядок его исходного 104М раствора дистиллированной водой

Изменения в структуре липидного компонента мембран определяли методом спиновых зондов (рис 1) Зондами служили стабильные свободные радикалы 2,2,6,6,-тетраметил-4-каприлоилоксипиперидин-1-оксил (зонд С7), синтезированный в ИХФ РАН, и 5- и 16-доксилстеариновые кислоты (зонды С5 и С16) компании "Sigma" (США), локализующиеся в поверхностных (2-4Ä), средних (8Ä) и глубоко лежащих (20-22Ä) (Кузнецов, 1976,Бинюков, 1976,Curtis, 1984, Jost, 1971) областях мембраны соответственно Конечная концентрация зондов в мембране не превышала 5х10"5М Спектры регистрировали на ЭПР-спектрометре "BRUKER 200D" (модифицированном компьютерным интерфейсом) и Bruker ЕМХ

Схема типичного эксперимента была следующей (рис 2) в суспензию мембран объемом 200 мкл вводили 1,5 мкл раствора зонда После 30 мин инкубирования контрольной пробы при комнатной температуре определяли значения тс в течение 30-35 мин и, далее, добавляли в пробу 2 мкл раствора ТРГ заданной концентрации В течение последующих 20-30 мин происходили изменения тс с выходом на плато, после чего записывали спектры ЭПР в течение 3060 минут при постоянной температуре 20°С±0,05, которая поддерживалась термоприставкой фирмы Bruker Эффект характеризовался по отношению (тс опыта - тс контроля)/тс контроля (в процентах) Эксперименты по этой схеме проведены с использованием трех зондов для всего спектра концентраций ТРГ (Ю-18 - 10 4М)

Количество измерений спектров для каждой концентрации варьировало от 10 до 30 при 3-8 независимых экспериментах На представленных рисунках в этой работе даны средние значения исследуемых параметров с рассчитанным стандартным отклонением Для оценки достоверности различия контрольных данных и опыта использовались непараметрические методы - критерий Уил-коксона с применением пакета программ STATISTICA

При интерпретации полученных результатов для зондов С7 и С16 мы пользовались параметром времени вращательной корреляции, тс, как наиболее информативным, отражающим поведение зонда в изучаемой системе Для этих зондов ЭПР-спектры представляли собой хорошо разрешенный триплет (рис 1), характерный для быстровращающихся радикалов (Кузнецов, 1976) Из них рассчитывали контрольную величину времени вращательной корреляции тс, параметра, характеризующего микровязкость биомембраны (Кузнецов,

1976) т =6,65А// (I— -1)*Югде Но - ширина (Гс), а Li и 1(г интенсивность

0 VI-,

соответствующих компонентов спектра

Вращение зонда С5 в липидах мембран ЭР еще более анизотропно, чем зонда С16, что характерно и для других природных и искусственных мембран (Кузнецов, 1976, Jost Р, 1971) Поэтому для зонда С5 рассчитывали параметр упорядоченности S длинной оси радикала, отражающий подвижность жирно-кислотных цепей липидов мембран (Jost Р, 1971)

S= 1,66-^—,где 2Т| | и 2Tj_ - расстояние между внутренними и внешними

Т п + 2Г± экстремумами спектра ЭПР (рис 1)

Известно, что изменение тс и S - не единственные характеристики структурного состояния липидов в биомембранах Не менее важны такие показатели, как зависимость этих параметров от температуры и наличие термоиндуциро-ванных структурных переходов («переходы») Температурные зависимости изучаемых параметров записывались отдельно для контрольной пробы и пробы с ТРГ при последовательном нагревании на 2К в диапазоне температур 284-320К Термостатирование образца обеспечивалось термоприставкой фирмы "BRUCKER" (Германия) с точностью термостатирования ±0,05°С Переходы отображались точками излома между линеаризованными участками температурных зависимостей времени вращательной корреляции тс и параметра упорядоченности S, представленных в Аррениусовых координатах -Lgxc или -LgS от 1/Т (Chapman, 1975) (рис 3) Точками излома считали те точки, добавление которых к спрямленному участку графика выводило коэффициент корреляции за пределы статистической надежности 95% Эффективная энергия активации перехода АЕ^ вычислялась на основе тангенса угла наклона спрямленного участка температурной зависимости в Аррениусовых координатах (Shmitzky, 1976)

Для изменения флуктуаций показателей пропускания тонких слоев водных растворов ТРГ в девяти диапазонах средней ИК-области спектра 3500-3200, 3085-2832, 2120-1880, 1710-1610, 1600-1535, 1543-1425, 1430-1210, 1127-1057, 1067-963 см"1 использовали новый тип ИК-спектрометра - аппаратно-программный комплекс ИКАР, разработанный на кафедре общей и бионеорга-ничесой химии ТГМА Измерение осуществлялось в кюветах с толщиной водного слоя 20 мкм со скоростью 0,1 с Анализируемые образцы готовились непосредственно перед экспериментом, а также выдерживались в течение 30 и 60

дней Для оценки суммарного эффекта ТРГ на водную систему использовался многомерный дискриминантный анализ, а именно критерий Махаланобиса

Аналогичные эксперименты были проведены и в ближней ИК области спектра (5200-14000 см"1) совместно с лабораторией молекулярной спектроскопии Института элементоорганических соединений имени АН Несмеянова РАН Для выявления отличий в коэффициентах поглощения воды и водных растворов ТРГ были применены 2 подхода - сравнение коэффициентов поглощения на выделенных длинах волн и применение метода главных компонент (МГК) для оценки суммарного эффекта ТРГ, учитывая все точки спектра

Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием пакетов компьютерных программ STATISTIC А 6 0, Origin 7 5, MATLAB 6 5 и Un-scrambler 9 6

2,2,6,6,-тетраметил-4-каприлоил-1-оксила, Зонд С7

глубина локализации в мембране 2-4А Структурная формула

СН3-(СН2)/ Vo

5-доксилстеариновая кислота

Зонд С5, 5Б8А, С5,

глубина локализации в мембране 8А

Структурная формула

16-доксилстеариновая кислота

Зонд С16,16DSA, С16,

глубина локализации в мембране 20А

Структурная формула

он

Рис 1 Структурные формулы стабильных нитроксильных радикалов и примеры их спектров (в суспензии микросом печени, белок 3,4 мг/мл) 2,2,6,6,-тетраметил-4-каприлоил-1-оксила (С7), 5- и 16-доксилстеариновой кислоты (С5 и С16)

aja ss да и

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140

Рис 2 Схема типичного эксперимента на примере изменения во времени спинового зонда С16 при введении ТРГ в концентрации 10 ,0М в мик-росомальных мембранах печени Концентрация зонда 5x105 М, концентрация белка 3,4 мг/мл, t=293°K

tg«=-b

где R-8 31 Дж моль' к"'

ЗЗЙ

Рис 3 Изменение времени вращательной корреляции (тс) зонда С16 в зависимости от температуры (полулогарифмические координаты) в контрольных микросомах Концентрация зонда 5 х 105 М, концентрация белка 3 4 мг/мл, Т= 288-320 К

3. Результаты исследований и их обсуждение

Приводятся в третьей главе диссертации

Биологические мембраны могут представлять интерес для исследований действия БАВ в СМД, поскольку предполагается, что они являются одной из критических мишеней для этого процесса Вместе с тем, биологические мембраны, особенно ПМ и ЭР, и изменения в их биохимических и физико-химических параметрах чрезвычайно важны и для протекания ряда нейродеге-неративных процессов, таких, как эпилепсия, болезнь Альцгеймера и др В частности, ТРГ при введении в организм в первую очередь воздействует именно на эти мембранные системы в головном мозге, а затем сигнал об изменении его концентрации в этом органе распространяется по кроветворной системе и другим тканям С этой точки зрения их тоже можно разделить по первоочередности влияния ТРГ, и в этом ряду головной мозг, по-видимому, следует рассматривать как наиболее, а печень - как наименее чувствительные органы На основании такого подхода мы поставили перед собой задачу - исследовать влияние ТРГ в широком интервале концентраций на ЭР и ПМ, выделенные из обеих тканей

3.1 Модификация структуры мембран ЭР печени под действием тиролиберина при постоянной температуре 293°К.

Мембраны ЭР печени картировали in vitro тремя спиновыми зондами, локализующимися на различной глубине липидного бислоя, и исследовали влияние ТРГ в широком диапазоне концентраций (10 4-1СГ20М) на структурные характеристики этих липидных регионов микровязкость и параметр упорядоченности Эксперименты проводились при постоянной температуре 293°К с использованием термоприставки

Сравнивая изменения структурных характеристик липидов в различных областях мембраны под влиянием ТРГ (рис 4), можно отметить, что

А)-;ав'нд С 7

- в поверхностных областях все концентрации ТРГ (10" - 10" М) вызывают существенное статистически достоверное (р < 0,05) снижение тс по сравнению с контрольными значениями, увеличивая текучесть липидов мембран Причем на фоне среднего уменьшения данного параметра отмечено статистически достоверное по сравнению с соседними точками и среднестатистическим уровнем тс еще большее снижение тс (до 30-32%) при введении Ю"10 и 10"16 М ТРГ

- на глубине 8А (область локализации нитроксильного фрагмента зонда С5) ТРГ в концентрациях 10" 4-10"8 и 10"16М ТРГ статистически достоверно (р < 0 05) увеличивает Б и уменьшает этот параметр в ин-

•е

■а

10"9 -

10"

тервале концентрации М,

- в глубоко лежащих гидрофобных слоях ТРГ вызывает колебательные изменения текучести липидов со статистически достоверными (р < 0 05) отклонениями от контроля для трех концентраций ТРГ 10"4 и Ю"10М (уменьшение микровязкости на 12 и 20% соответственно), 10"16 М (увеличение до 30%)

Сопоставляя изменения для разных зондов, можно выделить 3

\Л

В•) адмд С 5

■а

J 12 14

Ш>ЗОНД С16

-LoglTPH

Рис 4 Изменение времени вращательной корреляции тс спиновых зондов С7 (А), С16 (В) и параметра упорядоченности S зоида С5 (Б) в мембранах ЭР печени в зависимости от концентрации ТРГ, концентр зонда 5x105 М, концентрация белка 3,4 мг/мл, t=293°K

концентрационные области высоких доз ТРГ, зона 10"8-10"9М, когда наблюдаются одинаковые изменения во всех липидныхрегионах, СМД с максимумом действия ТРГ при 10"1бМ Наибольший интерес вызывает аномально сильное действие ТРГ в сверхмалой концентрации где абсолютная величина эф-

фекта зондов С7 и С16 практически одинакова, но противоположна по знаку ТРГ в этой концентрации меняет текучесть приповерхностных и гидрофобных слоев липидов в противоположных направлениях Одним из физиологических свойств ТРГ является его противосудорожный и расслабляющий эффект на кровеносные сосуды всего организма, который во многом обеспечивается изменениями в ЭР органов и тканей Обнаруженные нами изменения в микровязкости приповерхностных слоев липидов хорошо коррелируют (коэффициент корреляции г равен -0,88 при р < 0,05) с воздействием 10"4-10"18 М ТРГ на сократительную активность сосудов в экспериментах in vitro (Ашмарин,1992) ТРГ в концентрации 10"16М значительно увеличивает сократительную активность сосудов, что может быть следствием изменения текучести поверхностных слоев липидов биологической мембраны

3.2. Модификация тиролиберином структуры ПМ печени при постоянной температуре 293°К.

Сравнивая ответную реакцию ПМ печени на воздействие ТРГ в различных концентрациях по критериям изменения жесткости (зонд С5) и микровязкости (зонд С16) различных липидных регионов (рис 5), можно сделать следующие заключения во-первых, влияние ТРГ на их структуру как в более близких к поверхности и фосфолипидным головкам районах, так и в глубоко лежащих областях липидов, где расположены жирнокислотные цепи фосфолипидов, препарат вызывает увеличение жесткости и микровязкости липидов в ПМ печени, во-вторых зависимости эффекта от концентрации ТРГ носят сложный нелинейный характер с хорошо (для зонда С16) и менее явно (для зонда С5) выраженными тремя экстремумами Наибольшее внимание привлекает центральный, наибольший по величине и узкий максимум в интервале концентраций 10" 8-Ю"10М Есть основания полагать, что этот максимум может быть связан с образованием лиганд-рецепторного комплекса рецептор для ТРГ в головном мозге, тимусе и некоторых других тканях, имеет константу связывания по- а>с5 рядка 10"9-Ю"10 М (Nillni,1999, Ya-mada 1995), конечная реализация процесса взаимодействия ТРГ с рецептором осуществляется в липид-ной области, расположенной на глубине 20Á (Gershengorn, 2001), то есть, в регионе локализации зонда С16, хотя рецептор ТРГ из ткани печени не выделен, обнаружена РНК, синтезирующая белок для этого рецептора (Cao, 1998) Кроме того, характер изменения величины т„ а именно резкое ее возрастание в узком концентрационном интервале, тоже типично для связывания вещества с рецептором (Варфоломеев 1999), и, наконец, подобные изменения параметра упорядоченности или микровязкости под действием БАВ, имеющих рецептор на ПМ, наблюдали авторы работ (Полезина, 1999, Рихирева, 2003) Таким образом, полученные данные, на наш взгляд, можно трактовать как косвенное свидетельство наличия рецептора ТРГ на ПМ клеток печени

Б)С16

иОй[ТРП

Рис 5 Изменение параметра упорядоченности Э зонда С5 (А) и времени вращательной корреляции тс (в процентах по отношению к контролю) спинового зонда С16 (В) в ПМ клеток печени в зависимости от концентрации ТРГ, концентрация зонда 5x105 М, концентрация белка 3,4 мг/мл, 1=293"К

3.3. Модификация структуры мембран головного мозга при постоянной

температуре 293°К.

Известно, что при введении ТРГ в организм животного и человека его первичный эффект проявляется в головном мозге, затем сигнал распространяется по сосудам других органов и тканей (Gershen-gorn, 2001) На рис 6 представлена концентрационная зависимость изменения параметра упорядоченности S областей липидов, расположенных на глубине 8А в мембранах ЭР мозга Видно, что кривая имеет бимодальный характер со статистически достоверным (р < 0 05) максимумом в области концентраций (10"4-10"6 М) и двумя достоверными минимумами (р < 0 05) в интервалах доз (10 9 — Ю"10 М) и 10" 1бМ Следует сказать, что полученные нами эффекты (максимальные и минимальные) находятся в пределах величин, полученных в тех немногочисленных исследованиях на естественных мембранах, о которых имеются сведения в литературе (Curtis, 1984, Азизова, 1986, Whetton 1983)

Для выяснения возможного влияния ТРГ на глубоколежащие, гидрофобные слои липидов такие же эксперименты были проведены на ЭР с использованием зонда С16 В данном случае, в отличие от предыдущего, мы не получили значимых изменений в показателе микровязкости На наш взгляд, это явление может быть объяснено на основании данных о биохимическом составе ЭР мозга Известно, что ЭР головного мозга содержит в 2 раза больше белка по отношению к липидам, чем ЭР печени и ПМ (Curtis, 1984, Whetton 1983, Foot 1982, Petrovich 1984), поэтому ТРГ, имеющий наибольшее сродство к белкам, не только сам не доходит до областей локализации зонда С16, но и не может оказать на них влияния

Рис 7 А дает представление об изменении параметра упорядоченности S в липидных зонах ПМ мозга, расположенных на глубине 8А Видно, что во всех концентрациях ТРГ увеличивает упорядоченность мембран, максимальные статистически достоверные (р < 0 05) отклонения от контроля обнаружены для 2-х концентрационных зон Ю"9-Ю"10М ТРГ и области СМД 10"16М

С целью выявления возможного эффекта ТРГ на глубоколежащие, гидрофобные слои липидов аналогичные эксперименты проведены с использованием зонда С16 На рис 7Б приведены кривые зависимости изменения величины тс от концентрации ТРГ Все изученные концентрации ТРГ вызывают общее снижение микровязкости ПМ мозга, статистически достоверные (р<0,05) отклоне-

-LOG[TPr]

Рис 6 Изменение параметра упорядоченности Э зонда С5 (в процентах по отношению к контролю) в мембранах ЭР клеток мозга в зависимости от концентрации ТРГ, концентрация зонда 5x105 М, концентрация белка 3,4 мг/мл 1=293°К

ния от контроля зафиксированы для трех интервалов концентраций в области высоких концентраций 10"4-10'6М (до 10%), максимальное уменьшение до 25% наблюдались для концентрации 10"9М ТРГ и третий интервал достоверной эффективности ТРГ - 10-14-10"16М (до 10%)

Для сравнения эффекта ТРГ на ПМ мозга и образованные из них замкнутые структуры мы провели дополнительно картирование синаптосом зондом С16 На рис 7В видно, что полученные изменения подобны тем, что мы зафиксировали в ПМ мозга все изученные концентрации ТРГ вызывают общее снижение микровязкости синаптосом и выделяются 3 аналогичные концентрационные области действия ТРГ Из рисунка видно, что, хотя характер дозовых зависимостей влияния ТРГ на ПМ и синаптосомы совершенно одинаков, количественные значения эффекта отличаются в 1,5 раза в областях высоких концентраций и СМД и в 2 раза для концентрации 10"9М, таким образом, наибольшие изменения наблюдаются все же при действии ТРГ на ПМ

Сопоставляя данные об изменениях параметра Б и тс в ЭР и ПМ мозга, можно видеть (рис 6 и 7), что все они имеют нелинейный характер с несколькими четко выраженными максимумами и минимумами и разделяющими их областями концентраций, при которых эффект не наблюдается, так называемые «мертвые зоны» В области относительно высоких концентрации по-видимому, изменения параметров обусловлены неспецифическим взаимодействием препарата с мембраной, здесь наибольший эффект отмечается для поверхностных областей ЭР Наиболее значительный и резкий всплеск влияния ТРГ на ПМ, синаптосомы и ЭР связан с применением ТРГ в концентрациях

что объясняется образованием лиганд-рецепторного комплекса, тем более именно из тканей мозга выделен рецептор ТРГ (Ы111п1 1999, Уатас1а, 1995) Наиболее четкие изменения для данной области концентраций получены при проведении экспериментов с ПМ головного мозга и зондом С16 (рис 7) Это опять-таки неудивительно, поскольку именно в области локализации нитроксильного фрагмента этого зонда происходит реализация взаимодействия ТРГ с его рецептором (ОегБИе^от, 1996)

-1-СЮ[ТРП

Рис 7 Изменение параметра упорядоченности Б зонда С5 (А) и времени вращат корреляции тс (в процентах по отношению к контролю) зонда С16 (Б) в ПМ клеток мозга и синаптосомах (В) в зависимости от концентрации ТРГ, концентрация зонда 5x105 М, концентрация белка 3,4 мг/мл,

3 4. Сравнительное изучение структурного состояния мембран головного мозга и печени мышей под действием тиролиберина in vitro.

Одна из задач настоящего исследования состояла в проведении сравнительного изучения эффекта ТРГ в широком диапазоне концентраций на ПМ и ЭР, выделенные из органа, являющегося мишенью для его действия (головного мозга) и ткани, для которой при введении m vivo влияние препарата является опосредованным (печени) Кроме того, биохимический состав и функциональные качества ПМ и ЭР также существенно отличаются и между собой, и для одного типа мембран, выделенных из разных органов В ПМ локализованы системы вторичных посредников и при введении препарата в организм животного и человека его первичный эффект проявляется именно на них, а ЭР занимает ключевые позиции в регуляции процессов ПОЛ и выброса Са+2 при развитии реакции окислительного стресса, начального этапа многих нейродегенератив-ных заболеваний Сравним их ответную реакцию на воздействие ТРГ в различных концентрациях

На рис 5А и 7А представлены концентрационные зависимости изменения параметра упорядоченности S областей липидов, расположенных на глубине 8А, в ПМ печени (5А) и головного мозга (7А) Видно, что практически все исследованные концентрации ТРГ, кроме Ю"10-10"ИМ статистически достоверно (р<0,05) увеличивали S в ПМ и печени, и мозга по сравнению с соответствующим контролем Качественный характер кривых аналогичен для ПМ, выделенных из обеих тканей высокие концентрации ТРГ (10"4-10"6 М) статистически достоверно увеличивают S, максимальные изменения этой величины отмечены при концентрациях (10"9- Ю"10)М, минимумы - при (10"u - 10"12 М) В области сверхмалых доз (10"12-10"1бМ) S вновь возрастает, достигая максимума при 10" 16М Необходимо отметить, что в ПМ головного мозга, являющегося мишенью для действия ТРГ, препарат обладает одинаковым модифицирующим мембрану эффектом при применении в концентрациях 10" и в ПМ печени четко

выделен один максимум - при (Ю"9-Ю"10М) ТРГ, величина эффекта на этих мембранах в 2-3 раза больше, чем на ПМ мозга

Не менее важную роль в действии ТРГ выполняют мембраны ЭР В ряде работ показано, что ТРГ вызывает выброс кальция в цитоплазму из ЭР, являющийся, в частности, кальциевым пулом клетки (Gershengorn, 1996) ТРГ не влияет на микровязкость глубоко лежащих областей липидов ЭР головного мозга, но существенно изменяет параметр их упорядоченности области локализации зонда С5 Обращает на себя внимание аналогичный характер изменения параметра S в мембранах ЭР мозга и печени (рис 4Б и 6) ТРГ вызывал увеличение параметра упорядоченности S при использовании в высоких концентрациях (10"4-10"5М), уменьшение при введении в Ю"9-10"10 М, но при СМД 10"16М проявился разнонаправленный эффект

Сравнив эти результаты с данными экспериментов m vivo при интрана-зальном введении ТРГ мышам (Ашмарин,Чепурнов, 2003), мы обнаружили, что препарат в дозах 109-10 10 М, значительно уменьшающих S, задерживал развитие судорожных припадков, вызванных введением пентилентетразола, в дозе 10~6М (незначительные изменения S) - не влиял, а в концентрации

10"-10"JM (S

увеличивается) - усиливал их Как уже указывалось выше, ЭР рассматривается в качестве первичной мишени при развитии дегенеративных процессов головного мозга (Paschen, 2003) Однотипность изменения параметра S в микросомах головного мозга и печени и наличие определенной корреляции с экспериментами m vivo позволяет полагать, что именно изменения в структуре данной области липидов ЭР являются одним из механизмов противосудорожного и антиэпилептического эффекта ТРГ

Аналогичным образом было проведено сопоставление действия ТРГ на ПМ печени, мозга и синаптосомы с использованием зонда С16, локализующегося в более глубоколежащих слоях липидов На рис 5Б и 7Б,В представлены зависимости изменения величины тс от концентрации ТРГ Обработка результатов выявила достоверные (р<0,05) отклонения от контроля для трех интервалов концентраций увеличение (уменьшение) в области высоких концентраций 10"4-10"6М для ПМ печени (головного мозга и синаптосом), второй максимум (минимум) при 10"9М и третий интервал достоверной эффективности ТРГ-10"14-10" 1бМ Интересно отметить практически полную симметрию изменения исследуемых показателей относительно контроля для ПМ клеток печени и головного мозга (рис 5Б и 7Б,В) Кроме того, на наш взгляд, является важным тот факт, что изменения тс в синаптосомах и ПМ мозга происходят однонаправлено и различаются лишь по величине эффекта, который существенно выше в ПМ мозга при действующей дозе ТРГ 10"9М почти в 2 раза

Таким образом, сравнивая ответную реакцию ПМ печени и мозга на воздействие ТРГ в различных концентрациях по критериям изменения жесткости (зонд С5) и микровязкости (зонд С16) различных липидных областей, можно сделать следующие заключения во-первых, практически все исследованные концентрации ТРГ вызывают изменения в изучаемых физико-химических параметрах липидов биомембран, причем зависимости эффекта от концентрации ТРГ носят сложный нелинейный характер с хорошо (для зонда С16) и менее явно (для зонда С5) выраженными тремя экстремумами Во-вторых, влияние ТРГ на структуру различных липидных областей неодинаково в более близких к поверхности и фосфолипидным головкам районах препарат вызывает увеличение жесткости и упорядоченности липидов как в ПМ печени, так и ПМ мозга В глубоко лежащих областях липидов, где расположены жирнокислотные цепи фосфолипидов, ТРГ индуцирует прямо противоположные изменения текучести липидов в ПМ печени и мозга Вероятно, такая ответная реакция связана с различным составом жирных кислот в фосфолипидах этих мембран (Spector, 1985) Контрольные значения для тс ПМ печени и головного мозга существенно различаются, они равны (1,7 х 10"9 с) и (2,1х10"9 с) соответственно, что совпадает с немногочисленными данными литературы о низкой текучести липидов в ПМ мозга (Foot, 1982, Wood, 1986) Поэтому образование лиганд-рецепторного комплекса может различным образом влиять на микровязкость данного липид-ного региона увеличивать ее в ПМ печени, где исходный уровень был относительно невысок, и делать липиды более текучими в ПМ мозга, где они были очень вязкими

Температурные зависимости и термоиндуцированные структурные

переходы.

Для максимально действующих концентраций ТРГ были получены температурные зависимости изменения параметров упорядоченности и микровязкости в интервале температур от 284 до 320°К Для выявления термоиндуциро-ванных переходов и эффективной энергии их активации полученные зависимости были представлены в Аррениусовых координатах тс или —от 1/Т На рис 8 в качестве примера приведены температурные зависимости т с зонда С16 в ПМ мозга, температуры переходов обозначены стрелками

Как видно из таблицы температур термоиндуцированных структурных переходов (рис 9) каждая мембрана характеризуется своим набором термоиндуцированных структурных переходов, в основном, фиксируются несколько, чаще два, которые разделяют липиды исследуемой мембраны на несколько фазовых (или суб-мезофазных) состояний

Рис 8 Изменение времен вращательной корреляции (тс) для С16 в полулогарифмических координатах в зависимости от температуры в контрольных (А) ПМ и при действии ТРГ в концентрациях 104 М (Б), 10 М (В) и 10 16 М (Г), концентрация зонда 5x105 М, концентрация белка 3,4 мг/мл, 1=288-320°К

Т 11 13 15 17 19 | 21 | 23 25 | 27 [ 29 31 33 35 37 | 39 41 43 45 47

печень 4

16 г г .

ЭР 0 nSfe" '

печень С5 10 _I^Utaí- I

ЭР печень 4 ■ mi ._

С1в 16 i I

Г1М 0

печень С5 9 Ifí IL ■ J Ss P

0 -н | ■ _

ПМ печень 4 5Ü í^fi -

С16 16 ¡rd ■Р hJ

ПМ 0

мозг C1S t> 9 16 Ш

I1 не. У. Тврмопндуцираванные структурн ate uepexe;;1. u области ;1окал[пации юндов CI, С5 и С16 и мембранах ЭР и П.VI клеток пенсии н моз! а (контроль и таб.тмце обозначен ríate 0) и пpií действии доз ТРГ Ю'\ 10"' ,10"" п lü""f' М (и таблице обозначены как 4,9.10 н 16 соответственно). Температура (Т) лапа в градусяN I U'.'Kchh.

ТРГ изменяет как качественную, так и количественную картину этих пере ходов. В физиологической концентрации 1 (У4М он не влияет на общее число переходов во всех, изученных типах мембран, сдвигая их на 2-4 градуса, Внеде-ни-ерецепторнбй концентрации 10"'-](Г|01Й оказывав*]' наибольшее влияние, ТРГ индуцирует появление до п ол нШелыш х переходов в ЭР п ГТМ печени в области локализации зонда С16 и приводит к сильному сдвшу переходов и мембранах ЭР печени и ПМ мозга. СМД ТРГ 10"|ЙМ сдвигает их в мембранах ЭР во всех изученных областях и приводит к исчезновению в пр к поверх н ост ной. Особенно следует подчеркнуть наличие изменении в области физиологических температур. когда ТРГ вызывает появления дополнительного перехода, либо сдвигает имеющиеся, что является важным для функционирования мембрано-с вязанных ферментов и рецепторов Рецеигорная концентрация в наибольшей степени оказывает влияние именно в физиологической области температур. Кроме того, ТРГ практически во всех концентрациях снижал эффективную энергию активации в физиологической области температур, что указывает на облегчений структурных перестроек в бис мембране после введения ТРГ.

Изменение числа структурных переходов, в принципе, соответствует изменению количества доменов с различным составом липидов и их физико-

химическим состоянием Фиксируемые нами структурные термоиндуцирован-ные изменения в мембранах, могут быть вызваны действием ТРГ на данные микродомены (рафты), которые в свою очередь модифицируют структуру мембраны, например, при распаде высвобождается значительная доля холестерина, который влияет на микровязкость и фазовые переходы в мембране (Simons, 2000)

3 5 Исследование влияния ТРГ на динамические и статические показатели состояния водных систем методом ИК спектроскопии

Для объяснения эффектов действия доз ТРГ в области СМД мы исследовали свойства растворителя, воды, так как именно в этой среде находятся мембраны и именно водные растворы ТРГ мы вводим в экспериментах Для проверки гипотезы влияния ТРГ на динамическую и статическую структуру воды, мы совместно с сотрудниками кафедры общей и биоорганической химии Тверской государственной медицинской академией (ТГМА) использовали ИК-спектрометр ИКАР, позволяющий с высокой скоростью количественно определять коэффициенты пропускания и их флуктуации в девяти диапазонах средней ИК-области спектра водных растворов тиролиберина 3500-3200, 3085-2832, 2120-1880, 1710-1610, 1600-1535, 1543-1425, 1430-1210, 1127-1057, 1067-963 см" 1 Измерение осуществлялось в кюветах с толщиной водного слоя 20 мкм со скоростью 0,1 сек, что дало нам возможность контролировать колебания коэффициентов пропускания тонкого слоя воды

Для оценки суммарного эффекта ТРГ на водную систему использовался многомерный дискриминантный анализ, а именно критерий Махаланобиса Оценив с его помощью степень влияния ТРГ на водную систему в концентрациях от 10~2 до Ю"20 М, мы получили полимодальную дозовую зависимость с максимумами при больших дозах ТРГ 10"2 М, 10"6 М и при СМД 10 16 М (рис 10) Дальнейший анализ дисперсий показателей пропускания ИК-спектра показал (рис 11), что высокие концентрации не вызывают сильных и специфических эффектов на флуктуации инфракрасного спектра, в то время как область сверхнизких концентрации ТРГ, а именно 10"1бМ, характеризуется сильными колебаниями флуктуации спектров водных растворов Наличие таких сильных изменений в дисперсии спектральных показателей в сверхмалой области свидетельствует, скорее всего, о влиянии ТРГ в СМД на динамические процессы, происходящие в воде, на динамику кластерообразования (Зубарева, 2003, Григорьев, 2003)

Данные измерения были проведены сразу же после приготовления растворов ТРГ, для проверки факта изменения свойств водных растворов ТРГ с течением времени аналогичные эксперименты были проведены для разных временных периодов инкубаций растворов - 30- и 60-ти дневных сроков Показано общее увеличение к 30-му дню и резкое снижение через 60 дней значений дисперсий водных растворов ТРГ относительно бидистиллированной воды для всех исследуемых концентраций ТРГ Таким образом, можно сделать вывод, что, если, действительно, изменение динамических параметров играет ключевую роль в действии ТРГ в СМД, то при исследовании и использовании в кли-

нике растворов со сверхмалыми разведениями ТРГ (а, возможно, и других БАВ) целесообразно использование растворов, приготовленных не позднее 30-ти дневного срока

2 0 % 4 6 8 10 12 14 15 IS 20 22 LOGfTPr)

/Ч

Г-

8 10 12 14 16 LOGfTPf]

Рис 10 Влияние растворов ТРГ на величину флуктуаций ИК-спектров воды Количественная оценка дана по величине критерия Махаланобиса

Рис 11 Изменение значений дисперсий в интервале частот 2120-1880см где ТРГ не поглощает

Так как тиролиберин изменял показатели средней ИК области спектра практически на всех частотах, то следующим шагом было изучение влияния ТРГ в тех же концентрациях (от 10"2 до Ю"20М) на изменение коэффициента поглощения воды в ближнем ИК диапазоне (5200-14000 см"1) Показано, что хотя ТРГ влияет на изменение коэффициента поглощения воды практически на всех частотах, наибольшие изменения наблюдаются на частоте 9500 см'1 (рис 12Г) высокие концентрации ТРГ уменьшают коэффициент поглощения, сверхмалая доза ТРГ 10"15М статистически достоверно увеличивает этот показатель

Для исключения предположения о том, что наблюдаемые изменения в ИК-спектре водных растворов ТРГ обусловлены присутствием самого вещества, мы сняли ИК-спектр сухого образца ТРГ в интервале от 5200 до 14000 см"1 Обнаружено, что ТРГ не поглощает в этих интервалах частот Таким образом, учитывая еще и нелинейный характер концентрационной зависимости, мы можем сделать вывод, что наблюдаемый эффект обусловлен изменениями именно в структуре воды под действием ТРГ

Для оценки суммарного эффекта ТРГ на водную систему был применен метод главных компонент, позволяющий в нашем случае оценить различие ИК-спектров растворов ТРГ На рис 12 представлены основные инструменты этого метода - графики счетов (Scores, рис 12А), нагрузок (Loadings, рис 12Б) и размах (Leverage, рис 12В) Исходя из данных, рассчитанных с помощью программного обеспечения Unscrambler, в нашем случае первая главная компонента описывает 99% общих изменений, поэтому рассматривали только ее В большей степени она повторяет поведение концентрационных кривых для частоты 9500 см"1 (рис 12Г) Такое совпадение можно объяснить, рассмотрев график нагрузок (рис 12Б) График нагрузок (рис 12Б), являющийся своеобразной "картой переменных", показывает какой вклад каждая из переменных (в нашем

случает длина волны) дает в главную компоненту Из рис 12Б видно, что максимальные величины приходятся на частоты от 9500 см"1 и выше

-LOGfTPn -LOGfTPr]

Рис 12 Анализ ИК спектров растворов ТРГ методом главных компонент Счета (А), нагрузки (Б) и размах (В) для 1 -й главной компоненты Изменение коэффициента поглощения в зависимости от концентрации ТРГ в водном растворе для частоты 9500 см 1 (Г)

Размах (рис 12В) представляет собой меру влияния образца на модель, которая определяется расстоянием образца до центра модели Из рис 12В видно, что максимальный эффект ТРГ проявляет в концентрации 10"6 - 10 9М, далее происходит общее снижение с последующим увеличением этого параметра в СМД 10"15М ТРГ Размах пропорционален расстоянию Махаланобиса, параметру, который мы использовали в работе по исследованию воздействия ТРГ на водные растворы в средней области ИК спектра (4000-500 см"1) Сравнивая Размах (Leverage) с расстоянием Махаланобиса и изменения коэффициентов поглощения, можно отметить аналогию во влиянии ТРГ на водные системы в разных областях ИК спектра применение ТРГ в больших дозах (более 10"9М) приводит к уменьшению поглощения водных растворов, а в СМД ТРГ проявляет активность в области 10"15 - 10"16М, где происходит резкое, разнонаправленное для разных диапазонов ИК спектра изменение поглощения водных растворов

Таким образом, различные концентрации гидрофильного пептида ТРГ в средней и ближней областях ИК спектра, то есть от 5200 до 14 000 см вызывают аналогичные изменения в коэффициенте поглощения исследуемых растворов, что говорит о влиянии ТРГ на структуру воды Отсутствие вклада в спектр самого вещества ТРГ подтверждает это предположение

Заключение

Приведено в четвертой главе диссертации, где кратко суммированы основные результаты предлагаемого исследования

В данной работе изучалось влияние ТРГ в широком диапазоне концентраций (от 10"4 до 10"18М) на структуру разных типов мембран, их липидных регионов, расположенных на различной глубине по отношении к поверхности мембраны, в экспериментах m vitro, а также структуру воды, основной среды функционирования и передачи информации в биосистемах, ее статических и динамических характеристик Объектами изучения явились 5 функционально различных типов биомембран, выделенных из тканей мышей и растворы ТРГ в бидистиллированной воде (в экспериментах ИК-спектроскопии)

Для каждого из изученных типов биомембран получены дозовые зависимости действия ТРГ в широком интервале концентраций (от 10"4 до 10 18М), оцененные по критериям параметров структурной упорядоченности и микровязкости липидных слоев при постоянной температуре 293°К Несмотря на разный липидный состав и функциональное назначение изученных мембран, полученные концентрационные кривые имеют ряд сходств во всех дозовых зависимостях наблюдается нелинейность и полимодальность ответных эффектов с несколькими экстремумами и «мертвыми зонами» между ними, что характерно для веществ, проявляющих активность в СМД Было обнаружено четкое, характерное для всех типов мембран, разделение на 3 концентрационные области, в каждой из которой преобладающий механизм действия ТРГ неодинаков Эффекты в области «физиологических» концентраций (10"4-10"7М) обусловлены, судя по всему, преимущественно неспецифическим встраиванием ТРГ в мембрану Далее, изменения в области концентраций (10"8-10"шМ) обусловлены образованием лиганд-рецепторного комплекса, что подтверждается характером наблюдаемых изменений и данными о наличии рецептора в тканях мозга (Gershengorn, 1996) с близкой константой связывания, реализующего свою активность именно в области локализации нитроксильного фрагмента зонда С16, а также факт обнаружения в печени м-РНК ТРГ (Cao, 1998) Для максимально действующих концентраций ТРГ были получены температурные зависимости изменения параметров упорядоченности и микровязкости в интервале температур от 284 до 320°К Тиролиберин изменяет как качественную, так и количественную картину этих переходов Введение рецепторной концентрации 10"9-10" 10М оказывает наибольшее влияние во всех типах мембран, особенно в физиологической области температур

Эффекты ТРГ в области СМД объясняются свойствами растворителя, воды, так как именно в этой среде находятся мембраны и именно водные растворы ТРГ вводятся в экспериментах Было обнаружено, что при введении ТРГ в СМД резко увеличиваются колебания флуктуаций спектров водных растворов, что свидетельствует о влиянии ТРГ в СМД на динамические процессы, происходящие в воде, на динамику кластерообразования (Зубарева 2003, Григорьев 2003) Зафиксировано затухание флуктуаций в зависимости от времени измерений растворов (от 1 до 60 дней) - флуктуации значительно уменьшаются после

60-ти дней инкубации водных растворов ТРГ Показаны изменения статических спектральных показателей двух диапазонов ИК излучения среднего (800-3500 см"1) и ближнего (5200-14000 см"1) в области больших и СМД ТРГ

Значительное увеличение флуктуаций спектральных параметров при введении ТРГ в СМД указывает на нестабильность, возможно, на неравновесную природу происходящих в воде процессов Вода - это активная, динамичная среда, чувствительная к внешним воздействиям Внешние факторы малой интенсивности - биологически активные вещества в СМД или малые физические воздействия могут, судя по всему, приводить водную систему к неравновесному состоянию А в этом случае каждая молекула уже может перестать быть независимой, могут наблюдаться процессы когеррентности, когда малые изменения в одной части отражаются на всей системе (Хакен, 1980, Пригожин, 2001) Такие изменения в структуре воды могут оказывать влияние на функционирование растворенных в ней веществ, в частности, белков, ферментов, и что особенно важно, на функциональное состояние клеточных мембран Характерными примерами таких систем являются реакция Белоусова-Жаботинского (Белоусов, 1959, Жаботинский, 1964) или конформационно неравновесное состояние белков, когда значительно сдвигается их константа диссоциации (Блюмен-фельд, 2002)

Таким образом, неравновесные системы могут быть ключевым звеном в понимании механизмов сверхмалых воздействий Немонотонная, нелинейная зависимость «доза — эффект», наличие «мертвой зоны», «расслоение» свойств биологически активного вещества по мере уменьшения его концентраций объясняется наличием разных механизмов взаимодействия, возможно, перекрывающихся между собой Введение БАВ в СМД может вызывать переход водной системы к неравновесному состоянию, увеличению флуктуации ее динамических показателей Молекулы воды в этом случае перестают быть независимыми, начинает проявляться их когеррентность поведения во всем объеме Изменения в структуре воды оказывают влияние на функционирование контактирующих с ней веществ, а именно, на липиды, белки и т д Водные молекулы, контактируя с поверхностью мембраны, могут изменять колебательные характеристики молекул липидов, а также оказывать влияние на многие молекуляр-но-динамические процессы, например на связывание лиганда с рецептором В заключение можно сказать, что в результате нашей работы мы получили экспериментальные данные, позволяющие на примере пептида ТРГ сделать определенные выводы о возможных механизмах действия БАВ в СМД, сведения об изменении физико-химических свойств биологических мембран и водной среды ставят новые вопросы и дают новый импульс для дальнейшего изучения этих сложных и во многом загадочных систем

ВЫВОДЫ

1 Впервые изучено действие ТРГ в широком интервале концентраций (от 10"4 до 10"18М) на структурные характеристики мембран ЭР и ПМ клеток печени и головного мозга мышей m vitro Установлено, что для ЭР и ПМ, несмотря на их

биохимические и функциональные различия, характерны полимодальные зависимости эффектов ТРГ на жесткость поверхностных (8А), микровязкость глу-боколежащих (20А) липидных регионов, типичные для БАВ, проявляющих эффект в широком диапазоне концентраций, включающем СМД

2 Обнаружено четкое, характерное для всех типов мембран, разделение на 3 концентрационные области, в каждой из которой преобладающим является один из механизмов действия ТРГ

а) в области традиционных «физиологических» концентраций (10"4-10"7М)- неспецифическое взаимодействие ТРГ с мембраной,

б) в области (Ю"8-Ю"10М) - специфическое взаимодействие тиролиберина со своим рецептором на мембране,

в) в области СМД - опосредованное влияние пептида на мембраны через изменение структурно-динамического состояния воды, выступающей в роли растворителя ТРГ и среды, окружающей мембраны

3 Для максимально действующих концентраций ТРГ получены температурные зависимости изменения параметров упорядоченности и микровязкости в интервале температур от 284 до 320°К Установлено, что ТРГ изменяет как качественную, так и количественную картину этих переходов ТРГ в различных мембранах вызывает появление дополнительного перехода области физиологических температур 310-314 К (37-41С) либо сдвигает уже имеющиеся, наибольшей способностью препарат обладал в СМД

4 Показано наличие корреляции в изменении структурных характеристик различных липидных областей ЭР головного мозга и печени под действием различных концентраций ТРГ в экспериментах m vitro и их физиологическом эффекте m vivo Обоснована правомерность использования СМД ТРГ в клинической практике

5 Впервые экспериментально показана роль водной среды в механизме действия ТРГ в СМД

а) с помощью ИК-спектрометра ИКАР - на основе критерия Махалонобиса обнаружены значительные изменения в структурно-динамическом состоянии водного растворителя при введении ТРГ как в высоких (10"4-10"бМ), так и СМД (10"15 М), в интервале которых ранее наблюдались изменения структурных характеристик ЭР и ПМ,

б) при использовании метода ИК-спектроскопии в ближней области (5 20014000 см-1) и проведении компьютерного анализа методом главных компонент зафиксированы существенные изменения в коэффициентах поглощения водных растворов ТРГ при частоте 9500 см"1, наиболее значительные для концентраций ТРГ (10"б-10"9М) и СМД - (10"15-10"16М), в диапазоне которых ранее наблюдались изменения структурных характеристик в ЭР и ПМ,

в) обнаружена качественная корреляция изменений флуктуаций коэффициентов поглощения ИК спектров водных растворов ТРГ в зависимости от длительности хранения

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Жерновков В Е , Богданова H Г , Лелекова Т В , Пальмина H П «Структурные изменения в мембранах эндоплазматического ретикулума при действии сверхмалых доз тиролиберина m vivo», Радиационная биология Радиоэкология 2003, т 43, №3, с 331 -333

2 Пальмина НП , Кледова Л В , Панкова Т В , Мальцева Е Л , Белов В В , Жерновков В Е , «Действие биологически активных веществ в сверхнизких концентрациях на физико-химические свойства мембран IN VITRO» // Вопросы биохимической, медицинской и фармацевтической химии, 2004, №4, стр 31-37

3 Жерновков В Е , Богданова H Г , Пальмина H П «Структурные изменения в мембранах эндоплазматического ретикулума при действии сверхмалых доз тиролиберина in vitro » // Биологические мембраны, 2005, Т 22, №5, с 388-395

4 Zhernovkov V Е , Pal'mina N Р The effect of ultra small doses of thyroliberin on structural changes of biological membranes m vitro The journal of the European College ofNeuropsychopharmacology Vol 15 (2005) Suppl 2, pageS194

5 Zhernovkov V E and Pal'mina N P Cell Membrane Structure and Thyroliberin Physiological Activity // Biochemical Physics Research Trends Sergei D Varfolomeev, Elena В Burlakova, Anatolii A Popov and Gennady E Zaikov , Nova Science Publishers, New York 2006

6 Жерновков В E , Пальмина H П «Сравнительное изучение структурного состояния плазматических мембран головного мозга и печени мышей под действием тиролиберина m vitro » Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2007 в печати

7 Жерновков В Е , Рощина И А , Зубарева Г M , Шматов Г П , Локшин Б В , Пальмина H П «Изучение влияния тиролиберина в широком спектре концентраций на водную систему методом ик-спектроскопии» Биофизика 2007 в печати

8 Жерновков В Е , Локшин Б В , Пальмина H П «Исследование влияния тиролиберина в широком спектре концентраций на водную систему методом ик-спектроскопии в ближней области спектра» Биофизика 2007 в печати

9 Белов В В , Жерновков В Е «Влияние тиротропин-рилизинг гормона в широком спектре концентраций на структурное состояние поверхностных слоев липидов мембран эндоплазматического ретикулума m vitro и u m vivo», I Ежегодная молодежная конференция ИБХФ РАН - ВУЗЫ «Биохимическая физика», 1-2 марта 2001 г, Москва, с 11-12

10 Торчинский А А , Жерновков В Е «Модификация структурного состояния глубоко лежащих слоев липидов мембран эндоплазматического ретикулума m vitro и m vivo ультранизкими концентрациями тиролиберина», I Ежегодная молодежная конференция ИБХФ РАН - ВУЗЫ «Биохимическая физика», 1-2 марта 2001г, Москва, с 12-13

11 Белов В В , Жерновков В Е , Мальцева Е Л , Пальмина H П «Влияние тиротропин-рилизинг гормона в широком спектре концентраций на структурное состояние поверхностных слоев липидов мембран эндоплазматического ретикулума m vitro и m vivo», XI Международная конференция «Магнитный резонанс в химии и биологии», 20-27 апреля 2001г, Звенигород, с 232-233

12 Торчинский А А , Жерновков В Е , Пальмина H П «Модификация структурного состояния глубоко лежащих слоев липидов мембран эндоплазматического ре-

тикулума in vitro и m vivo ультранизкими концентрациями тиролиберина», XI Международная конференция «Магнитный резонанс в химии и биологии», 20-27 апреля 2001 г, Звенигород, с 237-238

13 Торчинский А А , Жерновков В Е , Пальмина H П «Изменение структурного состояния глубоколежащих слоев липидов биологических мембран под действием тиролиберина m vitro и in vivo», XIV зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 11-15 февраля 2002г, Москва, с 77-78

14 Жерновков В Е , Богданова H Г , Лелекова Т В , Пальмина H П «Структурные изменения в мембранах эндоплазматического ретикулума при действии сверхмалых доз тиролиберина in vitro», III Международный симпозиум «Механизмы действия сверхмалых доз», 3-6 декабря 2002г, Москва, с 7

15 Жерновков В Е , Богданова H Г , Пальмина H П «Сравнительное изучение микровязкости липидной компоненты плазматических мембран и эндоплазматического ретикулума при действии трипептида тиролиберина m vitro» Российский симпозиум по химии и биологии пептидов, Москв17-19 ноября 2003, с 69

16 Жерновков В Е , Богданова H Г , Пальмина H П «Сравнительное изучение влияния тиротропин-релизинг гормона (ТРГ) на физико-химические характеристики липидной компоненты плазматических мембран и эндоплазматического ретикулума m vitro», XLVII Научная конференция МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук», 26 - 27 ноября 2004г, Москва - Долгопрудный, с 6

17 Жерновков BE, Богданова НГ, Пальмина НП «Влияние тиротропин-рилизинг гормона в широком спектре концентраций (10"I8-10"4 М) на физико-химические характеристики структурного состояния липидной компоненты биологических мембран m vitro», IV молодежная конференция ИБХФ РАН - ВУЗЫ «Биохимическая физика», 25 - 26 октября 2004г, Москва, с 25-26

18 Zhernovkov V Е, Pal'mma N Р The effect of thyroliberin on the structural changes in biological membranes m vitro // Abstract book of First Dijon International Workshop on Lipids "Recent Advances m Lipid Metabolism and Related Disorders", June 21-24th, 2005, Dijon, France, p 50

19 Жерновков В E, Пальмина H П «Модификация структуры биологических мембран и физиологическая активность тиролиберина», V Международная молодежная конференция ИБХФ РАН - ВУЗЫ «Биохимическая физика», 14-16 декабря 2005г, Москва, с 12-17

20 Пальмина H П , Жерновков В Е /'Модификация структуры биологических мембран как один из механизмов противосудорожного действия тиротропин-рилизинг гормона в низких концентрациях" Симпозиум "Современное состояние исследований, диагностики и терапии нейродегенеративных заболеваний" ИБХФ РАН Москва 17-18 ноября 2005

21 Жерновков В Е , Пальмина H П «Эффект ультра малых доз тиролиберина на структурные изменения биологических мембран m vitro» Нейрохимия Фундаментальные и прикладные аспекты, Москва, 14-16 марта 2005, с 96

Подписано в печать 23 05 2007 г Формат 60x84/16 Заказ №43 Тираж 100 экз Пл 1 Отпечатано в Редакционно-издательской и информационной службе Физического института им П Н Лебедева РАН с оригинал-макета заказчика 119991, Москва, Ленинский проспект, 53 тел 132 51 28

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жерновков, Вадим Евгеньевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Физиологическое действие сверхмалых доз.

1.2. Влияние сверхмалых доз БАВ на растения.

1.3. Влияние БАВ в СМД на изолированные органы, ткани, клеточные системы и отдельные макромолекулы.

1.4. Биологические мембраны как мишень действия ультранизких доз.

1.5. Общие закономерности и механизмы действия биологически активных веществ в СМД.

1.6. Роль воды в объяснении действия СМД БАВ.

1.7. Тиреотропин рилизинг гормон.

ГЛАВА II. ОСНОВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Выделение мембран.

2.2. Определение концентрации белка в мембранах.

2.3. Приготовление растворов ТРГ.

2.4. Изучение изменений микровязкости и параметра упорядоченности мембран при помощи метода спиновых зондов. Определение термоиндуцированный структурных переходов и их эффективной энергии активации.

2.5. Инфракрасная спектроскопия в средней области водных растворов ТРГ.

2.6. Инфракрасная спектроскопия в ближней области водных растворов ТРГ.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. МОДИФИКАЦИЯ СТРУКТУРЫ МЕМБРАН ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА ПЕЧЕНИ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ТИРОЛИБЕРИНА. л 1 о

3.1.1. Влияние ТРГ в широком спектре концентрациях (10 -10 М) на микровязкость и структурную упорядоченность липидной компоненты мембран эндоплазматического ретикулума.

3.1.2. Температурные зависимости и термоиндуцированные структурные переходы.

3.2. МОДИФИКАЦИЯ СТРУКТУРЫ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН ПЕЧЕНИ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ТИРОЛИБЕРИНА.

3.2.1. Влияние ТРГ в широком спектре концентрациях (10"4 -10"18 М) на параметр упорядоченности и микровязкость липидной компоненты плазматических мембран печени.

3.2.2. Температурные зависимости и термоиндуцированные структурные переходы.

3.3. МОДИФИКАЦИЯ СТРУКТУРЫ МЕМБРАН ГОЛОВНОГО МОЗГА ПОД ДЕЙСТВИЕМ ТИРОЛИБЕРИНА.

3.3.1. Влияние ТРГ в широком диапазоне концентраций (10*4 -10'18 М) на структурные параметры липидной компоненты эндоплазматического ретикулума, плазматических мембран мозга и синаптосом.

3.4. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНОГО СОСТОЯНИЯ МЕМБРАН ГОЛОВНОГО МОЗГА И ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ТИРОЛИБЕРИНА IN VITRO.

3.5. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ТРГ НА ДИНАМИЧЕСКИЕ И СТАТИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ СОСТОЯНИЯ ВОДНЫХ СИСТЕМ МЕТОДОМ ИК СПЕКТРОСКОПИИ.

3.5.1. Влияния ТРГ на динамические показатели тонких слоев водных растворов в средней ИК области.

3.5.2. Влияния ТРГ на показатель поглощения водных растворов в ближней ИК области.

ГЛАВА IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Действие тиреотропин-рилизинг гормона в широком диапазоне концентраций на структуру биологических мембран"

Актуальность исследования.

Последние два десятилетия 20 века отмечены открытием «эффекта сверхмалых доз» биологически активных веществ (БАВ) - гормонов, пептидов, пестицидов, ядов, антиоксидантов и других агентов [1,7,29,53,89, 112,343]. При сверхмалых концентрациях БАВ (менее 10'13 М) их активность часто возрастает с понижением концентрации, а общая кривая зависимости доза-эффект имеет нелинейную, полиэкстремальную форму. Несмотря на лавинообразное увеличение количества разнообразных фактов о действии БАВ в сверхмалых дозах (СМД), механизм этого явления не установлен. Анализ имеющихся данных позволяет выделить ряд общих особенностей, наблюдающихся при действии СМД БАВ, которые оказались независимыми как от природы действующего агента, так и от объекта исследования [216, 226]:

• немонотонная, нелинейная зависимость «доза — эффект». В большинстве случаев максимумы активности наблюдаются в определенных интервалах доз, разделенных между собой так называемой «мертвой зоной»;

• изменение чувствительности (как правило, увеличение) биообъекта к действию разнообразных агентов в СМД, как эндогенных, так и экзогенных (последние могут быть как той же, что в случае воздействия СМД, так и иной природы);

• проявление кинетических парадоксов, а именно возможность уловить эффект в СМД биологически активных веществ, когда в клетке или организме имеется то же вещество в дозах на несколько порядков выше. Влияние на рецептор вещества в дозах на порядки более низких, чем константы диссоциации комплекса лиганд-рецептор;

• Зависимость «знака» эффекта от начальных характеристик объекта;

• «расслоение» свойств биологически активного вещества по мере уменьшения его концентраций, при котором еще сохраняется активность, но исчезают побочные эффекты; • Для физических , факторов усиление эффекта с понижением его интенсивности в определенных пределах мощности и доз.

Ни одна из сформулированных моделей не объясняет всего многообразия эффектов БАВ в СМД. По мнению ряда авторов [98,229,226,215,210] в качестве общих мишеней действия БАВ в СМД могут выступать клеточные и субклеточные мембраны, с которыми взаимодействует БАВ при попадании в клетку и организм. Это взаимодействие определяет многие жизненно важные процессы на уровне всей клетки и, в конечном счете, определяет реакцию всего организма в целом. В биомембранах локализованы важнейшие системы, регулирующие клеточный метаболизм: системы пероксидного окисления липидов (ПОЛ) и вторичных посредников, обладающие свойствами каскадного усиления сигнала при проведении его в клетку [344,345,174,346,171,172]. Процесс ПОЛ, который является физиологическим способом модификации липидного бислоя биологических мембран, участвует в разборке мембранных структур и обновлении мембранных фосфолипидов, это универсальный механизм повреждения мембранных структур клетки при различных патологических состояниях [173,174]. Система регуляции ПОЛ зависит от состава липидов, их свойств, вязкости и других структурно-динамических состояний [303305], окисляемости и антиокислительной активности, содержания природных антиоксидантов, концентрации перекисных радикалов и гидроперекисей [176-179]. Действие БАВ, которое изменяет непосредственно или опосредованно одну из характеристик липидов, приводит к модификации всех параметров системы ПОЛ. Так как режим функционирования мембранных белков, как правило, зависит от каждого из этих параметров, то такие воздействия влекут за собой переход клетки из одного метаболического состояния в другое. Так как между системами вторичных посредников и ПОЛ в связи с их общей локализацией в биомембранах существует тесная связь и взаимное влияние, то ряд веществ, осуществляющих свое физиологическое воздействие через лиганд-рецепторный путь, могут модифицировать и параметры системы регуляции ПОЛ. К таким агентам относится, например Тиреотропин-рилизинг гормон (ТРГ), эндогенный регуляторный пептид, который выполняет функции нейрогормона [265], принимает участие в регуляции ряда нервных и психических функций (уровень бодрствования, сон, эмоции, обучение, память) [238], обладает способностью ослаблять неврологическую симптоматику при черепно-мозговых травмах и сотрясениях мозга [266]. Известно, что в физиологических концентрациях ТРГ может взаимодействовать с системой ПОЛ через изменение такого ее параметра, как структура липидного бислоя мембраны [229], и, соответственно, вызывать ответ всей клетки. Вместе с тем ТРГ является одним из первых веществ, для которого была установлена возможность проявления эффекта в СМД: ТРГ усиливает сократительную активность лимфатических сосудов [89]; модулирует противосудорожную защиту мозга при эпилептических припадках у животных и человека, эффективно применяется в клинике для лечения эпилепсии [265-285].

Цель настоящей работы состояла в изучении влияния тиролиберина в широком диапазоне концентраций, в том числе и СМД, на структурные характеристики различных областей липидного бислоя биологических мембран клеток печени и головного мозга в экспериментах in vitro; а также структуру воды, основной среды функционирования и передачи информации в биосистемах, ее статических и динамических характеристик.

Объектами изучения явились 5 функционально различных типов биомембран, выделенных из тканей мышей: мембраны эндоплазматического ретикулума (ЭР) печени и мозга, которые являются традиционной моделью для исследования процессов ПОЛ и влияния на него анти- и про-оксидантов; плазматические мембраны (ПМ) печени и мозга, в которых локализованы системы вторичных посредников; синаптосомы; и растворы ТРГ в бидистиллированной воде (в экспериментах по ИК спектроскопии). В задачи работы входило:

1) исследовать влияние ТРГ в широком спектре концентраций (10"4 - 10"18М) на микровязкость и упорядоченность липидов ЭР и ПМ методом спиновых зондов ЭПР при использовании трех иминоксильных стабильных радикалов, нитроксильные фрагменты которых локализуются в приповерхностных (глубина погружения 4 А0) - 2,2,6,6,-тетраметил-4-каприлоил-1-оксил (зонд С7), средних (8°А) - 5-доксилстеариновая кислота (зонд С5) и глубоко лежащих гидрофобных слоях липидов (глубина 22 А0) - 16-доксилстеариновая кислота (зонд С16) при температуре 293°К; получить зависимости доза-эффект.

2) определить влияние ТРГ в максимально действующих концентрациях на дозовой зависимости на термоиндуцированные структурные переходы в различных областях липидного бислоя изучаемых мембран и эффективную энергию их активации.

3) конкретизировать механизмы действия различных концентраций ТРГ на исследуемые структурно-динамические параметры мембран ЭР и ПМ.

4) исследовать степень влияния ТРГ в широком интервале концентраций (10" 22 -10'3 М) на динамическую и статическую структуру водных растворов: а) - на основе многомерного критерия Махаланобиса изучить различия флуктуаций показателей пропускания тонких слоев воды в 9 областях ИКспектра: 3500-3200см"\ 3085-2832см'\ 2120-1880см', 1710-1610СМ1, 1600-1535см-1, 1543-1425см"1, 1430,1210см-1, 1127-1057см'\ 1067-963СМ-1 в водных растворах ТРГ по сравнению с соответствующими эталонами бидистиллированной деионизованной воды; б) - с использованием метода главных компонент (PCR анализ) изучить различия в показателях поглощения водных растворов ТРГ в широком диапазоне концентрации (10"2 - Ю'20 М) в ближней области ИК спектра (5200-14000 см-1) по сравнению с соответствующими водными эталонами.

Научная новизна.

Впервые показано, что ТРГ в широком диапазоне концентраций (Ю^-Ю' 19М) существенно модифицирует структурно-динамические параметры различных липидных областей биологических мембран, выделенных из печени и головного мозга мышей. При этом обнаружена полимодальность эффектов ТРГ в зависимости от вводимой дозы с классическим для СМД видом концентрационной кривой - экстремумами в областях больших и сверхмалых доз, разделенные «мертвыми зонами» с отсутствием эффекта.

Впервые показано, что ТРГ, в концентрациях, вызывающих максимальные изменения в параметрах микровязкости и упорядоченности липидной компоненты, влияет на количественную и качественную картину термоиндуцированных структурных переходов в липидном слое исследуемых мембран.

Впервые установлено, что каждый из наблюдаемых максимумов на кривых доза-эффект обусловлен своим механизмом взаимодействия ТРГ с

4 7 биомембранами: в области концентраций (10' -10' М) - неспецифическим встраиванием в мембрану; в области СМД (10"9-10"пМ) - образованием лиганд-рецепторного комплекса, причем впервые получены экспериментальные данные, косвенно свидетельствующие о наличии рецептора ТРГ на ПМ печени; в интервале концентраций ТРГ (<10"15М) влияние на мембрану осуществляется опосредованно через изменение структурно-динамических свойств воды.

Впервые предложено объяснение механизмов наблюдаемых эффектов действия ТРГ в сверхмалых дозах на основе неравновесных систем.

Научно-прикладное значение работы.

Данная работа является составной частью комплекса научных исследований проблемы действия БАВ в сверхмалых дозах. Полученные в работе выводы и используемые методологические подходы могут быть применены в решении данной задачи. В частности, изменение структурно-динамических характеристик биологических мембран может быть использовано в качестве чувствительной модели для скрининга БАВ, действующих в ультранизких концентрациях.

Полученные результаты обосновывают применение подхода минимизации дозы ТРГ вплоть до СМД при использовании в клинике для лечения заболеваний нервной системы.

Апробация диссертационной работы.

Материалы работы докладывались на: ежегодных молодежных конференциях ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, 2001, 2002,2004), III Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002), XIV зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002), Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003), XLVII Научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» (Москва-Долгопрудный, 2004), First Dijon International Workshop on Lipids "Recent Advances in Lipid Metabolism and Related Disorders" (Dijon, France, 2005), конференции "European college of neuropsychopharmacology" (Москва, 2005), конференции «Нейрохимия: Фундаментальные и прикладные аспекты», (Москва, 2005), конкурсе научных работ ИБХФ (Москва, 2007).

Публикации.

Основные положения диссертационной работы опубликованы в 21 печатных работах (8 журнальных статьях и 13 тезисах докладов).

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, 4 глав, основных выводов и списка литературы. Работа изложена на 175 страницах, иллюстрирована 43 рисунком и 6 таблицами. Библиография включает список из 353 работ.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Жерновков, Вадим Евгеньевич

выводы.

1. Впервые изучено действие тиреотропин-рилизинг гормона (ТРГ) в широком интервале концентраций (от 10"4 до 10"18М) на структурные характеристики мембран ЭР и ПМ клеток печени и головного мозга мышей in vitro. Установлено, что для ЭР и ПМ, несмотря на их биохимические и функциональные различия, характерны полимодальные зависимости эффектов ТРГ на жесткость поверхностных (8А), микровязкость глубоколежащих (20А) липидных регионов, типичные для БАВ, проявляющих эффект в широком диапазоне концентраций, включающем СМД.

2. Обнаружено четкое, характерное для всех типов мембран, разделение на 3 концентрационные области, в каждой из которой преобладающим является один из механизмов действия ТРГ:

4 т а) в области традиционных «физиологических» концентраций (10 -10" М)-неспецифическое взаимодействие ТРГ с мембраной; б) в области (Ю"8-Ю'10М) - специфическое взаимодействие тиролиберина со своим рецептором на мембране; в) в области СМД - опосредованное влияние пептида на мембраны через изменение структурно-динамического состояния воды, выступающей в роли растворителя ТРГ и среды, окружающей мембраны.

3. Для максимально действующих концентраций ТРГ получены температурные зависимости изменения параметров упорядоченности и микровязкости в интервале температур от 284 до 320°К. Установлено, что ТРГ изменяет как качественную, так и количественную картину этих переходов. ТРГ в различных мембранах вызывает появление дополнительного перехода области физиологических температур 310-314 К (37-41 С) либо сдвигает уже имеющиеся; наибольшей способностью препарат обладал в СМД.

4. Показано наличие корреляции в изменении структурных характеристик различных липидных областей ЭР головного мозга и печени под действием различных концентраций ТРГ в экспериментах in vitro и их физиологическом эффекте in vivo. Обоснована правомерность использования СМД ТРГ в клинической практике.

5. Впервые экспериментально показана роль водной среды в механизме действия ТРГ в СМД: а) с помощью нового типа ИК-спектрометра-аппаратно-программного комплекса ИКАР - на основе критерия Махалонобиса обнаружены значительные изменения в структурно-динамическом состоянии водного растворителя при введении ТРГ как в высоких так и СМД (10" М), в интервале которых ранее наблюдались изменения структурных характеристик ЭР и ПМ; б) при использовании метода ИК-спектроскопии в ближней области (5 20014000 см-1) и проведении компьютерного анализа методом главных компонент зафиксированы существенные флуктуации в коэффициентах поглощения водных растворов ТРГ при частоте 9500 см"1, наиболее значительные для концентраций ТРГ (КГМО^М) и СМД - (10"15-10'16М), в диапазоне которых ранее наблюдались изменения структурных характеристик в ЭР и ПМ; в) обнаружена качественная корреляция изменений критерия Махалонобиса для флуктуаций коэффициента поглощения ИК спектров водных растворов ТРГ и их эффективности в зависимости от длительности хранения.

Таким образом, в заключение можно сказать, что в результате нашей работы мы получили экспериментальные данные, позволяющие на примере ТРГ сделать определенные выводы о возможных механизмах действия БАВ в СМД; сведения об изменении физико-химических свойств биологических мембран и водной среды ставят новые вопросы и дают новый импульс для дальнейшего изучения этих сложных и во многом загадочных систем.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жерновков, Вадим Евгеньевич, Москва

1. Бурлакова Е.Б., Терехова С.Ф., Греченко Т.Н., Соколов Е.Н. // Биофизика. 1986, т. 31. №5. с. 921.

2. КрутоваТ.В. //Биофизика. 1989, т. 34. вып. 6. с. 1063.

3. Фомина Н.Н., Островская Л.А., Корман Д.Б., Бурлакова К.Б. // Изв. АН. Сер. Биол. 1995. N 4. С. 430.

4. Островская Л.А., Блюхтерова Н.В., Фомина М.М., Рыкова В. ., Корман Д.Б., Бурлакова Е.Б. // Наука производству. 2000. N 3. С. 59-62

5. Крутова Т.В., Островская Л.А., Рыкова В.А., Корман Д.Б. // Изв. АН. Сер. биол. 1994. N5. С. 738.

6. Коновалова Н.И., Фрэнки Ф., Дьячковская Р.Ф., Волкова Л.М. // Известия РАН. Сер. биол. 1995, №6. с. 750 753.

7. Пальмина Н.П., Гаинцева В.Д., Бурлакова Е.Б. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, приложение № 4 2002, С 38

8. Montfort Н. // Br Homeopath J. 2000 Apr;89 (2): 78-83.

9. Lindemann A, Brossart P, Hoffken K, Flasshove M, Voliotis D, Diehl V, Hecker G, Wagner H, Mertelsmann R. // Cancer Immunol Immunother. 1993 0ct;37(5):307-15.

10. Lindemann A, Brossart P, Hoffken K, Flasshove M, Voliotis D, Diehl V, Kulmburg P, Wagner H, Mertelsmann R. // J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1994 Apr;15(3):225-30.

11. Молодавкин Г.М., Бурлакова Е.Б., Чернявская Л.И., Воронина Т.А., Хорсева Н.И., Середенин С.Б. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1996. т. 121. N 2. с. 164.

12. Н.Воронина Т.А., Молодавкин Г.М., Чернявская Л.И., Середенин С.Б., Бурлакова Е.Б. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1997. т. 124. N 9. с. 308.

13. Воронина Т.А., Молодавкин Г.М. // Российский химический журнал 1999. T.43.N5.C. 89.

14. Прагина Л.Л., Тушмалова Н.А., Иноземцев А.Н., Гумаргалиева К.З., Соловьев А.Г., Бурлакова Е. Б. // Материалы II Международного симпозиума: Механизмы действия сверхмалых доз. 23 26 мая 1995, Москва.17.Патент РФ № 2102986.

15. Духович Ф.С., Горбатова Е.Н., Курочкин В.К., Петрунин В.А. // Российйский химический журнал 1999 г, №5, Москва, с. 12-15.

16. Горбатова Е.Н., Духович Ф.С., Курочкин В.К. //Российйский химический журнал 1999 г, №5, Москва, с. 80-81.20.3олотая Р.Д., Миненкова У.А., Евсеенко Л.С. // Изв. АН СССР. Сер. Биол. 1990. Т.2. С.302

17. Medvedeva N.A., Shaffer R.A., Medvedev O.S., Lewis S.J. // Bui. Exp.Biol.Med. (Engl.) 1992. V.l 14. N 9. P. 1263.

18. Fortes ZB, Scivoletto R, Garcia-Leme J. Endothelin-1 induces potent constriction of lymphatic vessels in situ.//Eur J Pharmacol. 1989 Oct 24; 170(1-2):69-73.23 .Van der Neut R, Bar PR, Sodaar P, Gispen WH. //Peptides. 1988 Sep-Oct;9(5): 1015-20.

19. Wolterink G, van Ree JM, van Nispen JW, de Wied D. Structural modifications of the ACTH-(4-9) analog ORG 2766 yields peptides with high biological activity .//Life Sci. 1991;48(2):155-61.

20. Faith R.E., Liang H.J., Murgo A.G., Plotnicoff N.P. // Clin. Immunol.and Immunopathol. 1984. V.31. P.412.

21. Munn N.A., Lum L.G. // Ibid. 1989. V.52. N3. P. 376.

22. Zaitsev S.V., Khegai L.A., Kim B.B. e.a. // Immunol. Letters. 1992. V.32. P.27.

23. Dubinin K.V., Zakharova L.A., Khegai L.A., Zaitsev S.V. // Immunopharmacol. Immunotoxicol., 1994. V.l 6. P. 463.

24. Сазанов JI.A., Зайцев С.В. // Биохимия. 1992. Т. 57. N 10. С. 1443. 30.Sharp В.М., Keane W.F., Suh H.J. e.a. // Endocrinology. 1985. V.l 17. P.793.

25. Zaitsev S.V., Sazanov L.A., Koshkin A.A. e.a. // FEBS Lett. 1991 V. 291. P.84.

26. Efanov A.M., Koshkin A.A., Sazanov L.A. e.a. // Immunol. Letters. 1992. V.32. P. 114.

27. Efanov A.M., Koshkin A.A., Sazanov L.A. e.a. // FEBS Lett. 1994. V.335. P. 114.

28. Mathews P.M., Froelich С J., Sibbit W.L., Bankhurst A.D. // J. Immunology. 1983. V. 130. P.1658.

29. Williamson S.A., Knight R.A., Lightman S.L., Hobbs J.R. // Brain Beh. Immun. 1985. V.1.P.329.

30. Williamson S.A., Knight R.A., Lighman S.L., Hobbs J.R. // Immunology. 1989. V.65.N1.P. 47.37.3ахарова JLA., Белевская Р.Г., Михайлова A.A. // Бюл. Экспер. Биологии и Медицины. 1988. Т. 105. N1. С.50.

31. Zakharova L.A., Belevskaya R.G., Yanovskii O.G. // Biomed. Sci. 1990. V.l. N2. P.139.

32. Brown S.L., van Epps D.E. // J. Immunol. 1995. V.l34. P.3384.

33. Munn N.A., Lum L.G. // Ibid. 1989. V.52. N3. P. 376.

34. Gray D.A., Erasmus T. // Am. J. Physiol. 1988. V.120. P.231.

35. Baerwolff M., Bie P. // Ibid. 1988. V.255. N 6. Pt. 2. P. R 940.

36. Gick G.G., Zeytin F.N., Brazean P., e.a. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V.81.N5. P.1553.

37. Brain S.D., Williams T.J., Trippins J.R. e.a. // Nature. 1985. V.313. N 3. P.54.

38. Игнатьева И.Р., Чернух A.M., Гомазков O.A., Горизонтова М.П. // Патол. Физиол. и Экспер. Терапия. 1982. Т.2. С. 91.

39. Cernacec P., Mathier Е., Crawhall J.C., Levy М. // Am. J. Physiol. 1988. V.255. P. R929.

40. Kurz A., Bruna R.D., Pfeilschifter J. e.a. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986. V.83. P. 4769.

41. Струкова С.М., Киреева Е.Г., Спирова С.М. и др. // Биохимия. 1989. Т.З

42. Dugina T.N., Strukova S.M., Khalgatyan C.V., Ashmarin I.P. // Byull. Eksperim. Biologii i Med. 1992. V.l 14. N9. P.260.

43. Cawtrope D., Higgins A., Lukowiak K. // Can. J. Physiol, and Pharmacol. 1989. V.67.N5.P. 89.

44. Bondesson L., Norolind K., Liden S. e.a. //Acta Physiol. Scand. 1991. P. 477.

45. Гладышева Т.Б., Конрадов А.А., Лебедев К.A. // Биофизика. 1989. T.34. N 5. С. 833.

46. Tsuchiani Т., Zighelboim J., Berek J., Bonavida B. // J. Cell. Pharmacol. 1991. V.2. P.32.

47. Safit J.T., Bonavida B. // Cancer Res. 1992. V.52. P. 6630.

48. Safit J.T., Berek J.S., Bonavida B. // Gynecol. Oncol. 1992. V.48. P.214.

49. Safit J.T., Belldegrun A., Bonavida B. // Urology. 1993. V.149. P. 1202.

50. Morimoto H., Safit J.T., Bonavida B. // J. Immunol. 1991. V.147. P.2609.

51. Morimoto H„ Bonavida B. // Ibid. 1992. V.149. P.2089.

52. Morimoto H., Bonavida B. // Cell. Pharmacol. 1995. V.2. P. 147.

53. Frost P., Ng C.P., Belldegrun A., Bonavida B. // Cell. Immunol. 1997. V.l80. P. 70.

54. Бонавида Б. // Рос. хим. журнал. Т. XLIII. N 5. С. 100.

55. Dower S.K., Kronheim S.R., March C.J. // J. Exp. Med. 1985. V.l 65. P. 1366.

56. Klamet J.P, Kern D.E., Dower S.K. e.a. // J. Immunol. 1989. V.142. N 7. P.2187.

57. Reibman J., Meixler S., Lee T.C. e.a. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1991. V.88. N15. P. 6805.

58. SonenbergM. //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1971. V. 68. P. 1051.

59. Lelekova T.V., Sanzhieva L.Ts., Ashmarin LP. // Biomedical Science. 1990. V.I. P.99.

60. Gick G.C., Zeytin F.N., Brazey P. e.a. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1984. V.81.P. 1553.

61. Абакумова Д.А., Фхматуллина Н.Б., Абдукаримова К.А. // Тр. Ин-та микробиол. и вирусол. АН Каз. ССР. 1991. N 37. С. 17.

62. Crain S.M., Shen K.-F. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1995. V.92. P.10540.

63. Crain S.M., ShenK.-F. //Brain. Res. 1996. V.741. P.275. 71.Shen K.F., Crain S.M. // Brain Res. 1997. V.757. P. 176.

64. Faas M.M., Schuiling G.A, Bailer J.F e.a. // Am. J. Obstet Gynecol. 1994. V.171.P. 158.

65. Belougne-Malfatti E., Aguejouf O., Doutremepuich F. e.a. // Tromb. Res. 1998. V.90.P.215.

66. Doutremepuich C., Aguejouf O., Pintingy D. e.a. // Tromb. Res. 1994. V.76. P.225.

67. Hladovec J.// Tromb. Res. 1984. V.35. N3. P.347.

68. Махова E.B., Васильева C.B. // Изв. РАН. Сер. Биол. 1996. N 6. С.676.

69. Тушмалова Н.А., Прагина JI.JI., Иноземцев А.Н., Гумаргалиева К.З., Соловьев А.Г., Бурлакова Е.Б. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1995. Т. 120. С. 60.

70. Faith R.E., Liang H.J., Murgo A.G., Plotnicoff N.P. // Clin. Immunol.and Immunopathol. 1984. V.31. P.412.

71. Cagen S.Z., Waecheter J.M. Jr., Dimond S.S. // Toxicol. Sci. 1999. V.50. N1. P. 36.

72. Marotta D, Marini A, Banaudha K, Maharaj S, Ives J, Morrissette CR, Jonas WB. // Neurotoxicology. 2002 Sep;23(3):307-12.

73. Jonas W, Lin Y, Tortella F. //Neuroreport. 2001 Feb 12;12(2):335-9.

74. Голденков B.A., Дикий B.B., Лизунова Г.В. // Росс. хим. журнал, 2002, т.46, с.39-45.

75. Calabrese EJ, Baldwin LA., //Crit Rev Toxicol. 2003;33(3-4):355-405

76. Calabrese E.J. and Baldwin L.A. //Crit. Rev. Toxicol., 2001,31:471-624.

77. Calabrese E.J. and Baldwin L.A. //Toxicol. Sci., 2001,62:330-338.

78. Серова Р.Я., Зоз H.H., Морозова И.С., Ческис Т.А. Действие регуляторов роста растений в сверхмалых лозах в модельных опытах и полевыхусловиях. // Материалы II Международного симпозиума: Механизмы действия сверхмалых доз. 23 26 мая 1995, Москва.

79. Кукленко Е.А., Горбатенко И.Ю., Зоз Н.Н. Влияние сверхмалых доз аскорбиновой кислоты на регенерацию томата in vitro. // Материалы II Международного симпозиума: Механизмы действия сверхмалых доз. 23 26 мая 1995, Москва.

80. Е.Б.Бурлакова, ПЛ.Бойков, Р.И.Папина, В.Г.Карцев. // Изв. РАН, Серия биол. 1996, №1. С. 39-45.

81. И.П.Ашмарин., Т.В.Лелекова., Л.Ц.Санжиева. // Биохимия 1992, №4. с. 531 -536.

82. Mark T.Curtis, Donna Gilfor and John L. Farber , Archives of Biochem and Biophys 1984, v. 235 #2, pp 644-649.

83. Азизова O.A., Торховская Т.Н., Лопухин Ю.М. // Метод спиновых меток и зондов: проблемы и перспективы / Ред. Эмануэль Н.М., Жданов Р.И. М: Наука, 1986. С. 239-250.

84. Рууге Э.К., Герасимова Е.Н. // Метод спиновых меток и зондов: проблемы и перспективы / Ред. Эмануэль Н.М., Жданов Р.И. М: Наука, 1986. С. 225239.

85. Gilles R., Gilles S., Jaenicke L. // Z. NaturForsch. 1984, v. 39. N. 6. p. 584.

86. Doutremepuich C, Aguejouf O, Pintigny D, Sertillanges MN, De Seze O. // Thromb Res. 1994 Oct 15;76(2):225-9.

87. S.V.Zaitsev, L.A.Khegai, B.B.Kim, E.M.Gavrilova, O.G.Yanovsky and L.A.Zakharova. // Immunology Letters. 1992, v. 32. p. 27 30.

88. Богатыренко Т.Н., Редкозубова Г.П., Конрадов A.A. и др. // Биофизика. 1989, т. 34. №5. с. 921-923.

89. Пальмина Н.П., Пынзарь Е.И., Курнакова Н.В., Бурлакова Е.Б. // Биологические мембраны, 1997, v 11 №4 стр. 463-73

90. Пальмина Н.П., Богданова Н.Г., Мальцева Е.Л., Пынзарь Е.И. // Биол. мемб. 1992, т. 9. №8. с. 810 820.

91. Пальмина Н.П., Мальцева E.JL, Курнакова Н.В., Бурлакова Е.Б. // Биохимия. 1994. №59. с. 193 200 .

92. N.P. Palmina, V.V. Belov, E.L. Maltseva // Chemistry and Physics of Lipids, 2005, V. 136, №2, P. 141-142.

93. Н.П.Пальмина, Е.Л.Мальцева, Е.Б.Бурлакова. // Хим. физика. 1995, т.14. №11. с. 47-60.

94. Молочкина Е.М., Озерова И.Б. // Радиационная биология Радиоэкология, 2003 Т. 43. № 3. С. 301-305

95. Трещенкова Ю.А., Голощапов А.Н., Бурлакова Е.Б. // Радиационная биология Радиоэкология, 2003 Т. 43. № 3. С. 320-323.

96. Бурлакова Е.Б., Конрадов А.А., Худяков И.В. // Известия РАН. Сер. Биол. 1990, №2. с. 184-193.

97. Blumenfeld L.A., Grosberg A.Ju., Tikhonov A.N. // J. Chem. Phys. 1991, v. 95. N. 10. p. 7541-7544.

98. Zaitsev S.V., Sazanov L.A. // J. of Chem and Biochem. Kinetics. 1991, v. 1. N. 3. p. 21-26.

99. Зайцев C.B., Ефанов A.M., Сазанов JI.A. // Российский химический журнал 1999. Т.43. N 5. С. 28.

100. Блюменфельд Л.А. // Биофизика. 1993, № 1. с. 129-132.

101. Блюменфельд Л.А. Решаемые и нерешаемые проблемы биологической физики.//Москва: Едиториал УРСС, 2002.160 с.

102. Бурлакова Е.Б. // Вестник РАН. 1994, т. 64. №5. с. 425-431.

103. Ямскова В.П. Ямсков И.А.// Российский Химический Журн. (Журн. Российского хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 1999. т. 43. № 2. С. 74-79.

104. Ямсков И.А., соавт.// Российский Химический Журн. (Журн. Российского хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 1999. т. 43. № 5, С. 34-39.

105. Ямсков И.А., Бабиевский К.К., Березин Б.Б., Битко С.А., Боровская А.А., Виноградов А.А., Карельская Е.В., Тихонов В.Е. //Информационный бюллетень РФФИ, 1997 Т. 5 №3. С. 234

106. Зубарева Г.М., Каргаполов А.В., Ягужинский J1.C.// Биофизика, 2003. т. 48. №4. С. 581-584

107. Зубарева Г.М., Каргаполов А.В., Ягужинский J1.C.// Доклады Биохим. Физики, 2003. январь-февраль. 388. С. 43-45.

108. Зубарева Г.М., Каргаполов А.В., Ягужинский J1.C// Биофизика, 2003. т. 48. №2. С. 197-200.

109. Григорьев Е.И., Хавинсон В.Х., Малинин В.В., Григорьев А.Е., Кочнев И.Н., Кудрявцева Т.А. // Радиационная биология Радиоэкология, 2003 Т. 43. № 3. С. 358-362

110. Григорьев Е.И., Хавинсон В.Х., Малинин В.В. // Бюл. экспер. биол. мед. 2003,136 (8): 173-178

111. Воейков B.J1. // II Международный конгресс "Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине". Труды. С-Пб. 3-7.07.2000. СЛ.

112. Лобышев В.И., Рыжиков Б.Д., Шихлинская Р.Э., Мазурова Т.Н. // Биофизика. 1994. Т. 39. С. 557-565.

113. Lobyshev V.I, Shihlinskaya R.E. // Ргос. SPIE. 1997. V. 2982. P. 198-205.

114. Лобышев В.И., Рыжиков Б.Д., Шихлинская Р.Э. // Биофизика. 1998. Т. 43, вып. 4. С. 710-718.

115. Klepetkova L.N., Lobyshev V.I. // Biomarkers and Environment. 1998. V. 2, №2,3. P. 33.

116. Lobyshev V.I., Shikhlinskaya R.E., Ryzhikov B.D. // J. Molec. Liquids. 1999. V. 82. P. 73-81.

117. Лобышев В.И. // II Международный конгресс "Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине". Тезисы. С-Пб. 3-7.07.2000. С. 99.

118. Lobyshev V.I. // Ргос. SPIE. 1999. V. 3599. Р. 52-57.

119. Lobyshev V.I., Solovev А.В., Bulienkov N.A. // J. Molec. Liquids. 2003. V. 106, №2-3. P. 277-297.

120. Лобышев В.И., Соловей А.Б., Бульенков Н.А. // Биофизика. 2003. Т. 48, №6. С. 1011-1021.

121. Лобышев В.И., Томкевич М.С., Петрушанко И.Ю. // Биофизика, 2005, Т. 50. №3. С. 464-469

122. Эйзенберг Д, Кауцман В. Структура и свойства воды//пер. с англ. Л. 1975.280 с.

123. Наберухин Ю.И.// Соровский образовательный журнал, 1996, No 5, с. 41-48.

124. Вдовенко В.М. Исследования по применению двухструктурной модели к изучению состояния воды в водных растворах/ Вдовенко В.М., Гуриков Ю.В., Легин Е.К.// сборник «Структура и роль воды в живом организме». -Л, 1966. С.3-35

125. Немухин А.В. //Соровсовский образовательный журнал. 2001. Т.7. №1. С.39-44

126. Немухин А.В. //Соросовский образовательный журнал. 2000. Т.6. №6. С.27-31

127. Самойлов О .Я., Носова Т. А. // Журнал Структур. Химии. 1956. вып. 6. №5. С.798-808

128. Петренко В.Е. и др. //Журнал Физ.химии. 2002. Т.76. №2. С.271-277

129. Frank H.S. // Science 14 August 1970. Vol. 169. №3946, P. 635-641

130. Frank H.S., Fernandez-Moran H. //Ann N Y Acad Sci. 1965 Oct 13;125(2):730-53.

131. Hagler AT, Scheraga HA, Nemethy G. //Ann N Y Acad Sci. 1973 Mar 30 V.204P.51-78.

132. Frank H.S. //Fed Proc. 1965 Mar-Apr;24:Sl-l 1.

133. Shin JW, Hammer N1, Diken EG, Johnson MA, Walters RS, Jaeger TD, Duncan MA, Christie RA, Jordan KD. // Science. 2004 May 21;304(5674):1137-1140

134. Синюков В.В. Вода известная и неизвестная. М.: Знание, 1987

135. Пономарев О.А., Фесенко Е.Е. // Биофизика. 2000. Т.45. №3. С.389-398

136. Фесенко Е.Е. // Биофизика. 2002. Т.47. №3. С.389-394.

137. Фесенко Е.Е. // Биофизика 1999. Т.44. №1 С.5-9

138. Фесенко Е.Е., Агафонова Н.К., Азарсков Е.А., Казанцев А.П., Крассова Н.Е., Лисицын А.С., Новиков В.В., Швецов Ю.П., Яшин В.А. // Информационный бюллетень РФФИ, 1997. Т.5, №4. С.266

139. Miyazaki М, Fujii A, Ebata Т, Mikami N. // Science. 2004 May 21;304(5674):1134-1137

140. Зенин C.B. Механизм действия сверхмалых доз через изменение информационной системы воды. // Материалы II Международного симпозиума: Механизмы действия сверхмалых доз. 23 26 мая 1995, Москва.

141. Зенин С.В. // Традиционная медицина, 2004, №2, С. 52-55

142. Ostroverkhov V, Waychunas GA, Shen YR. // Phys Rev Lett. 2005 Feb 4;94(4):046102. Epub 2005 Feb 2.

143. Smith Ю, Cappa CD, Wilson KR, Cohen RC, Geissler PL, Saykally RJ. // Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Oct 4;102(40): 14171-4.

144. Jared D. Smith, Christopher D. Cappa, Benjamin M. Messer, Walter S. Drisdell, Ronald C. Cohen, and Richard J. Saykally; // J. Phys. Chem. В ASAP 2006

145. A.E. Miller, A.J. Fischer, T. Laurence, C.W. Hollars, R.J. Saykally, J.C. Lagarias, and T. Huser // PNAS 2006 103,11136-11141

146. Jia-Xiang Han, Lynelle K. Takahashi, Wei Lin, Eddy Lee, Frank N. Keutsch, and Richard J. Saykally // Chem. Phys. Lett. 2006 (423) 344

147. Yohann Scribano; Nir Goldman; Richard J. Saykally, and Claude Leforestier // J. Phys. Chem. A. 2006 110 (16) 5411

148. Christopher D. Cappa, Jared D. Smith, Benjamin M. Messer, Ronald C. Cohen, and Richard J. Saykally // J. Phys. Chem. B. 2006 110 (11) 5301

149. Nir Goldman, Claude Leforestier, and R.J. Saykally // Phil. Trans. R. Soc. A.; 2006 363,493-508

150. Messer, В. M.; Cappa, C. D.; Smith, J. D.; Wilson, K. R.; Gilles, M. K.; Cohen, R. C. and Saykally, R. J. // J. Phys. Chem. В.; 2005.109 (11), 5375-5382

151. Keutsch FN, Saykally RJ. // Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Sep 11;98(19): 10533-40

152. Bernal JD. // Symp Soc Exp Biol. 1965; 19:17-32

153. Аксенов С.И. // Биофизика 1977. T.22. C.923-924

154. Антонченко В.Я. Основы физики воды / Антонченко В .Я., Давыдов А.С., Ильин В.В. Киев. 1991.667 С.

155. Митчелл Дж. Акваметрия / Дж. Митчелл, Д.Смит: пер. с англ. М. 1980. 600 с.

156. Plumridge ТН, Waigh RD. // J Pharm Pharmacol. 2002 Sep;54(9):l 155-79.

157. Yoshimasa Т., Sibley D.R., Bouvier M., Lefcowitz R.J., Caron M.G., // Nature, 1987, v. 327, p. 67-70.

158. Taylor C.W., Merritt J.E. // Trends Pharmac. Sci. 1986, v. 7, p .238-242,

159. Козлов И.П., Данилов B.C., Каган B.E. Свободнорадикальное окисление липидов в биологических мембранах. М. 1972, с. 88.

160. Владимиров И.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М. Наука. 1972, с. 252.

161. Morini P., Casalino Е. // Bioch. et Bioph. Acta. 1990. V. 1046. N. 2. P. 207 -213.

162. Kagan V.E. // in Lipid Peroxidation in Biomembranes. / Boca Raton: CRC Press, 1988. p. 225.

163. Burlakova Ye.B., Palmina N.P., Maltseva Ye.L. // in Membrane Lipid Oxidation / Ed. Vigo Pelfrey C. Boca Raton: CRC Press, 1991. p. 209 - 237.

164. Kagan V.E., Bakalova R.A., Serbinova E.A., Koynova G.M., Baldenkov G.N., Tkachuk V.A., Stoytchev Ts. C. // in Free Radicals: Chemistry, Pathology and Medicine / Ed. Rice Evans K.L.: Richelien Press, 1988. P. 417 - 438.

165. Бурлакова Е.Б., Алесенко A.B., Молочкина E.M., и др. Биоантиоксиданты в лучевом поражении и злокачественном росте. М. Наука, 1975, -216 с.

166. Salesse R.,Gamier J. // Mol. and Cell. Biochem. 1984, v. 60. p. 17-30.

167. Gordon L., Sauerheler R., Esgate V., Dipple I., Marchmount R., Houslay M. // J. Biol. Chem. 1980, v. 255. p. 4519-4529.

168. Epand R.M., Epand R.F., Lean B.T.C., Menger F.M., Kuo J.F. // Biosci. Rep. 1991, v. 11. p. 59-64.

169. Payne A.N., Whittle B. // Eur.J. Pharmacol. 1988. V. 13. P.201.

170. Артемьев И.Ю., Даринский Ю.А., Сологуб М.И., Ложкина Т.К. // Бюл. Экспер. Биологии и Медицины. 1991. T.l 11. N 2. С. 115.

171. Deliconstantinos G., Kopeikina Tsiboukidou L., Villiotou V. // Biochem. Pharmacology. 1987, v. 36. N. 7. p. 1153.

172. Katz L.S., Marquis J.K. // Toxicol. Appl. Pharm. 1989. V. 101. P. 114.

173. Айропетян C.H., Карпентер Д.О., Азатян K.B. и др. // Клеточная сигнализация. 1992. С. 89.

174. Бурлакова Е.Б., Пальмина Н.П. // Вопр. Онкологии, 1990, т. 36. №10. с. 1155- 1162.

175. Palade G.E // J. Biophys. Biochem Cytol 2,417 422,1956.

176. BirbeckMS.C.,MercerE.H//Nature(Lond.) 189,558-560,1961.

177. Melchers F // Biochemistry 10,653 659,1971.

178. Ian F. Pryme. // Mol. and Cell. Biochem. 1986. v. 71. p. 3 -18.

179. Ian F.Pryme. // Mol. and Cell. Biochem. 1989. v. 87. p. 93 103.

180. Svardal A.M., Ptyme I.F. // Anal.Biochem. 1978, v. 89, p. 332-336.

181. Lowiy O., Rosenbrouch N., Barr A., Randall R. // J.Biol.Chem. 1951, 193, p. 265-275.

182. Бурлакова Е.Б., Голощапов A.H., "Метод спиновых зондов (проблемы и перспективы)", (ред.Жданов Р.И.) М. Наука, с. 212-225,1976.

183. Кузнецов А.Н. Метод спинового зонда. М. Наука, 1976.

184. Г.И. Лихтенштейн. Метод спиновых меток в молекулярной биологии. М. Наука, 1974.

185. М. Shinitzky and М. Inbar. // Biochimica et Biophysica Acta, 1976, p. 133 -149.

186. Stephen M. Mahler, Peter A. Wilce and Brian C. Shanley. // Int. J. Biochem. Vol. 20, No. 6, p. 613-619.

187. Кухлинг X. Справочник по физике. М.: Мир, 1983.

188. Chapman D. // Quart. Rev. Biophys, 1975, v. 8. p.185 -191,.

189. Burlakova E.B., Molochkina E.M., Palmina N.P. // Advances in Enzyme Regulations. 1980, v. 16. p. 163 175. Pergamon Press.- Ed. J. Weber.

190. E.L. Maltseva, N.P. Palmina, and I.F. Pryme. // J. of Cell. Biochem. 1991, v. 46. p. 260-265.

191. Шапот B.C. Биохимические аспекты опухолевого роста. М. Медицина, 1975,303 с.

192. Prescott D. // Cancer comprehensive treaties biology of tumours : cellular biology and growth. 1975, v.3, p. 262 271.

193. Пынзарь Е.И. // Автореф., дисс., на соискание ученой степени к.б.н. М., 1995.

194. Пальмина Н.П., Мальцева Е.Л., Пынзарь Е.И., Бурлакова Е.Б. // Российйский химический журнал 1999 г, №5, Москва, с. 55-63.

195. Молочкина Е.М., Озерова И.Б. Бурлакова Е.Б. // Российйский химический журнал 1999 г, №5, Москва, с 63-71.

196. Molochkina Е.М., Ozerova I.B., Burlakova Е.В. // In: Progress in Alzheimer's and Parkinson's diseases. Eds. A. Fisher, I. Hanin, M. Yoshida. Plenum Press. 1998. N 4. P. 183.

197. Мальцева Е.Л., Пальмина Н.П., Бурлакова Е.Б. // Биол. мембраны. 1998. Т. 15. N2. С. 199.

198. Штолько В.Н., Бурлакова Е.Б. // Тез. Междунар. Симп. «Мед. и Охрана Здоровья. Медтехн.и Аптека». Тюмень. 1997. С. 103.

199. Arad D., Moss К., Elias Y., Anbar J. // World Scientific. Eds. C. Faddei-Ferretti, P. Marotta. Singapore. New-Jersey. London. Hong-Kong. P. 313.

200. Полезина A.C., Аникиенко K.A., Курочкин B.K. // Российйский химический журнал 1999 г, №5, Москва, с. 72-79.

201. Бурлакова Е.Б. // Российский химический журнал 1999 г Т. 43. № 5. С. 3-11.

202. Гендель Л.Я. Яковлева Н.Е., Лелекова Т.В. и др. // Известия РАН. Серия биологическая, 1997, №1 с 103-106.

203. Roland J., Grouselle D., Gourdji D. Tixier-Vidal A. Cazenave P.A., // Mol Immunol 1992 apr v.29 № 4 p.463-469.

204. Конюхов A.H., исследование влияния сверхнизких концентраций форболового эфира на микровязкость мембран опухолевых клеток, Дипломная работа, МФТИ, 1996 год.

205. Hecker Е., Blagaviti R., Sorg В., Lotter Н // studia biopysuca, 1990, v. 138, p. 9-31

206. Loten EG, Redshaw-Loten JC. // Anal Biochem. 1986 Apr; 154(1): 183-5.

207. Jost P., Zibertini Z. J., Hebert V.C., Yriffith O.H., Molec. Biol., 1971, V59 p. 77-98.

208. Голощапов A.H., Бурлакова Е.Б., в «Метод спиновых меток и зондов», М. Наука, 1986,212.

209. Голощапов АН., Бурлакова Е.Б. // Биофизика. 1980. Т. 25. № 1. С. 97101.

210. Бурлакова Е.Б., Конрадов А.А., Мальцева E.JI. // Химическая физика, 2003. Т. 22. С. 21-40.

211. Гуревич К.Г. // Вестник Московского университета. Серия 2. Химия, 2001, Т. 42. №2. С.131-134

212. Жерновков В.Е., Лелекова Т.В., Пальмина Н.П.// Радиационная биология Радиоэкология, 2003 Т. 43. № 3. С. 331-333

213. Пальмина Н. П., Кледова Л. В., Панкова Т. В., Мальцева Е. Л., Белов В. В., Жерновков В. Е. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии 2004 №4 С.31-37

214. В.В. Белов, Е.Л. Мальцева, Н.П. Пальмина // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т.43. С.306-309.

215. Жерновков В.Е., Богданова Н.Г., Пальмина Н.П.// Биологические мембраны, 2005 Т. 22. № 5. С. 388-395.

216. Жерновков В. E., Богданова H. Г., Пальмина Н. П. // Биологические мембраны, 2006 Т. 23. №1. С. 52-59

217. Schally AV,Bowers CY,Redding TW,Barrett JF. // Biochem Biophys Res Commun. 1966 Oct 20;25(2): 165-9

218. Boler J, Enzmann F, Folkers K, Bowers CY, Schally AV. // Biochem Biophys Res Commun. 1969 Nov 6;37(4):705-10

219. Burgus R, Dunn TF, Desiderio D, Guillemin R. // С R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 1969 Nov 12;269(19): 1870-3

220. Scanlon MF, Toft AD 1996 Regulation of thyrotropin secretion. In:Braverman LE, Utiger RD (eds) Werner and Ingbar's The Thyroid: A Fundamental and Clinical Text, ed 7. Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia, pp 220-240

221. Eduardo A. Nillni and Kevin A. Sevarino // Endocrine Reviews 1999 20(5): 599-648

222. Burt D.R., Snyder S.H.//Brain Res. 1975. V.93: P.309-328.

223. Prasad C., Edwards R.M. // Brain Res. 1984. V.311: P. 1-6

224. Burt D.R., Taylor R.L. //Endocrinology. 1980. V.106: P.1416-1423.

225. Fukusumi S., Ogi K., Onda H., Hinuma S. // Regul. Pept. 1995. V.57: P.l 15121.243. de la Репа P, Delgado LM, del Camino D, Barros F. // Biochem J. 1992 Jun 15;284(Pt3):891-9.

226. Zhao D, Yang J, Jones KE, Gerald C, Suzuki Y, Hogan PG, Chin WW, Tashjian AH Jr. // Endocrinology. 1992 Jun;130(6):3529-36.

227. Sellar RE,Taylor PL,Lamb RF,Zabavnik J,Anderson L,Eidne KA. // J Mol Endocrinol. 1993 Apr; 10(2): 199-206.

228. Duthie SM, Taylor PL, Anderson L, Cook J, Eidne KA. // Mol Cell Endocrinol. 1993 Sep;95(l-2):Rll-5.

229. Matre V,Karlsen HE,Wright MS,Lundell I,Fjeldheim AK,Gabrielsen OS,Larhammar D,Gautvik KM. // Biochem Biophys Res Commun. 1993 Aug 31;195(l):179-85

230. Gershengorn M.C., Osman R. // Physiological Reviews 1996 76 P. 175-191.

231. Cao J, O'Donnell D, Vu H, Payza К, Pou C, Godbout C, Jakob A, Pelletier M, Lembo P, Ahmad S & Walker P. // Journal of Biological Chemistry 1998 273 32281-32287.

232. Itadani H, Nakamura T, Itoh J, Iwaasa H, Kanatani A, Borkowski J, Ihara M & Ohta M. // Biochemical and Biophysical Research Communications 1998 250 68-71.

233. O'Dowd BF, Lee DK, Huang W, Nguyen T, Cheng R, Liu Y, Wang B, Gershengorn MC & George SR. // MolecularEndocrinology 2000 14 183-193.

234. Harder S, Lu X, Wang W, Buck F, Gershengorn MC & Bruhn TO // Endocrinology 2001b 142 1188-1194.

235. HseihK, Martin T.//Mol Endocrinol 1992 6:1673-1681

236. Nelson E, Hinkle P. // J Biol Chem 1994 269:30854-30860

237. Kiley S, Parker P, Fabbro D, Jaken S. // J Biol Chem 1991 266:2376123768

238. Jefferson A, Travis S, Schulman H. // J Biol Chem 1991 266:1484-1490

239. Cui Z, Gorelick J, Dannies P. // Endocrinology 1994 134:2245-2250

240. Marvin C. Gershengorn, Roman Osman. // Endocrinology 142:2-10,2001

241. Han B,Tashjian AH Jr.//Mol Endocrinol. 1995 Dec;9(12):1708-19.

242. Colson AO, Perlman JH, Smolyar A, Gershengorn MC, Osman R.// Biophys J. 1998 Mar;74(3): 1087-100.

243. Feher VA, Baldwin EP, Dahlquist FW. // Nat Struct Biol. 1996 Jun;3(6):516-21.

244. Nemeroff CB, Prange AJ Jr, Bissette G, Breese GR, Lipton MA. // Psychopharmacol Commun. 1975;1(3):305-17.263. del Valle Nunez С J, Caraballo Perez A, Navarro Gonzalez J, Gomez de Terreros I. // An Esp Pediatr. 1975 Jan-Feb;8(l):72-7. Spanish.

245. KubekMJ, GargBP. //PediatrNeurol. 2002 Jan;26(l):9-17

246. Ашмарин И. П., Кулашев А. П., Чепурнов С. А. // Физиологический журнал СССР.- 1989- Т. 75, №5.-С. 627-632.

247. Ашмарин И.П., Асанова JI.M., Аббасова К.Р., Чепурнова Н.Е., Косова Г.В., Чепурнов С.А., Инюшкин А.Н., Гончаров О.Б. // Радиационная биология. Радиоэкология.- 2003-Т. 43, №3. С.324-327.

248. Yoneda М, Watanobe Н, Тегапо А. // J Gastroenterol. 2001 Jun;36(6):361-7

249. Garcia SI, Porto PI, Dieuzeide G, Landa MS, Kirszner T, Plotquin Y, Gonzalez C, Pirola CJ. // Hypertension. 2001 Sep;38(3 Pt 2):683-7.

250. Санжиева Л.Ц., Лелекова ТВ., Ашмарин И.П. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т. 43. № 3. С. 334-336.

251. Ашмарин И.П, Гаврюшов В.Ю., Иониди В.Ю., Ефимов М.С., Дуленков А.Б., Чепурнова Н.Е., Чепурнов С.А. // ДАН СССР. Т.312: С.241-244.1990.

252. Ашмарин И.П., Гусева А.А. и др. // Вестник РАМН, 1992. № 6. С.40-44.

253. Ашмарин И.П., Чепурнова Н.Е., Чепурнов С.А., Инюшкин А.Н., Гончаров О.Б. // 3-й Международный симпозиум «Механизмы действия сверхмалых доз». Москва. 3-5 декабря, 2002. М. 2002. С. 7.

254. Ашмарин И.П., Асанова Л.М., Чепурнова Н.Е., Аббасова К.Р., Коссова Г.В., Гончаров О.Б., Чепурнов С.А. // Научная конференция "Опыт интеграции научных исследований НИИ-ВУЗ-клиника". 21-22 ноября 2002г. НИИ НФ РАМН, Москва.

255. Ашмарин И.П., Чепурнова Н.Е., Аббасова К.Р., Лелекова Т.В., Гончаров О.Б., Чепурнов С.А. // Всероссийская конференция с международным участием "Нейроэндокринология 2003". Санкт-Петербург. 23-25 сентября 2003. С. 10-13.

256. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Стукалов П.В. // Нейрохимия. М. С.430-435.1996.

257. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Лелекова ТВ. // Рос. Хим. Журн. 1999. Т. 43. №5. С. 21-27.

258. Власова И.Г, Чепурнова Н.Е., Чепурнов С.А., Ашмарин И.П. // Физиология человека. 1994. Т.20. №6 С.118-123.

259. Инюшкин А.Н., Меркулова Н.А., Чепурнов С.А. // Росс. Физиол. Журн. 84: С.285-292.1998.

260. Кабанова Н.П., Чепурнова Н.Е. Изменение электрической проводимости кожи у крыс при однократном введении тиролиберина. Методы и технические средства рефлексотерапии и диагностики. // Тверь. 1991. С.64-68.

261. Лелекова Т.В., Романовский П.Я., Александров П.Н., Ашмарин И.П. // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1989 Т.108. № 7. С.8-10.

262. Лелекова Т.В., Санжиева Л.Ц. // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2004. Т. 90. №1. С. 32-39.

263. Чепурнов С.А., Чепурнова Н.Е., Ашмарин И.П. // Человек и лекарство. 1995. М. С. 108.

264. Чепурнов С.А., Чепурнова Н.Е., Аббасова К.Р., Гончаров О.Б. //Успехи физиол. наук. 2002. Т.ЗЗ. № 1. С.29-39.

265. Chepurnov S.A., Chepurnova N.E., Asanova L.M., Ashmarin I.P // Epileptologia (Warsaw). V.7 (Supp 1.): P.86-87.1999.

266. Chepurnov S.A., Chepurnova N.E., P.Chandra, Kumar, Abbasova K.R., Turbovskaya E.J., Ashmarin I.P. // 2nd Intern. Cong, on Ultra Low Doses. Bordeaux. France. P.34.1993.

267. Koenig M.L., Yourick D.L., Meyerhoff J.L. // Brain Res. 1996. V.730: P. 143-149.

268. Engler D., Chad D., Jackson I.M. //J. Clin. Invest. 1982. V.69: P.1310-1320.

269. Ogawa N., Mizuno S., Mori A. et. al. // Peptides. 1984. V.5: P.743-746.

270. Кузнецова Г.Д., Спиридонов A.M. //Журн. Высш. Нерв. деят. Т.48. С.664-670.1998.

271. Ikegami Н., Jikihara Н., Koike К. et al.//J. Endocrinol. 1992. V.133: Р.59-66.

272. HorstW.D., Spirt N.//Life Sci. 1974. V. 15: P. 1073-1082.

273. Oka M., Ochi Y., Furukawa K. et al. //Arzneim. Forsh. 1989. V.39: P.297-303.

274. Itoh Y., Sugimoto t., Ukai Y. et al. //Jpn. J. Pharmacol. 1995. V.67. Suppl.l: P.308.

275. Eells J.B., Clough R.W., Browning R.A., Jobe P.C. // Neurosci. Lett. V.233: P.21-24.1997.

276. Brunello N, Tagliamonte A, Cheney DL, Costa E. // Neuroscience. 1981;6(9): 1759-64

277. Alexandrova ML, Bochev PG. // Free Radic Biol Med. 2005 Aug 1;39(3):297-316. Review.

278. Frantseva MV, Velazquez JL, Hwang PA, Carlen PL. // Eur J Neurosci. 2000 Apr; 12(4): 1431-9.

279. Hernandez-Fonseca K, Massieu L. // J Neurosci Res. 2005 Oct 15;82(2): 196-205.

280. Sudha K, Rao AV, Rao A. // Clin Chim Acta. 2001 Jan;303(l-2):19-24.

281. Oztas B, Kilic S, Dural E, Ispir T. //J Neurosci Res. 2001 Nov 15;66(4):674-8.

282. Niu GM, Gu XJ, Su YL, Wan F, Su FZ, Xue DL. //Chin J Traumatol. 2003 Apr;6(2): 104-6.

283. Klyueva YA, Bashkatova VG, Vitskova GY, Narkevich VB, Mikoyan VD, Vanin AF, Chepurnov SA, Chepurnova NE.// Bull Exp Biol Med. 2001 Jan;131(l):47-9.

284. Burlakova Ye.B., Molochkina Ye.M., and Pal'mina N.P. Role of membrane lipids in control of enzymatic activity, in "Advances in Lipid Research", Ed.: J. Weber, Pergamon Press, New York, 1980,163.

285. Мальцева E.JI., Бурлакова Е.Б. // Биологические мембраны. 1986. Т.З. С.773.

286. Burlakova Е.В., Pal'mina N.P., Mal'tseva E.L. // Membrane Lipid Oxidation Vol.III / Eds. Carmen Vigo-Pelfrey. Boca Raton; Ann Arbor; Boston: CRC Press, 1991. P. 209-237.

287. Bashkatova VG, Mikoian VD, Kosacheva ES, Kubrina LN, Vanin AF, Raevskii KS. // Dokl Akad Nauk. 1996 May;348(l):l 19-21.

288. Stringer JL, Erden F. //Exp Brain Res. 1995;105(3):391-401.

289. Каргаполов A.B., Плигин A.M., Зубарева Г.М., Шматов Г.П. // Патент на изобр. N2137126 от 10.09.1999

290. Сошникова Л.А., Тамашевич В.Н., Уебе Г., Шефер М.// Многомерный статистический анализ. М. ЮНИТИ-ДАНА, 1999.

291. Maesschalck R. De, D. Jouan-Rimbaud, Massart D.L.// Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems 2000 V. 50 P. 1-18

292. Родионова O.E., Померанцев A.JI. Хемометрика в аналитической химии. Доступно наhttp://www.chemometrics.ru/articles/chemometricsreview.pdf январь 2006.

293. Эсбенсен К. Анализ многомерных данных: Сокр. Пер. с англ./ Под ред. О.Родионовой Издательство ИПХФ РАН, 2005.

294. Беллами Л. Инфракрасные спектры сложных молекул. М.: Химия., 1963. 590 С.

295. Hribar В, Southall NT, Vlachy V, Dill KA.// J. Am. Chem. Soc. 2002 V. 124. P. 12302-12311

296. Spector A.A., Yorek M.A. // J.Lipid Res. 1985-V.26, P.1015-1035

297. Ultra Low Doses / Ed. Doutremepuich C- London, Washington, 1991. 2431. P

298. Духович Ф.С., Горбатова E.H., Дарховский М.Б., Курочкин В.К. // Химико- фармацевтический журнал. 2002.Т.36. №5 С. 26 32.

299. Simons К and Toomre D. // Nature Reviews Molecular Cell Biology, V 1 P 31-9 October 2000

300. Kai Simons, Elina Ikonen// NATURE V. 387 5 JUNE 1997

301. Brown DA, London E. // Annu Rev Cell Dev Biol. 1998;14:111-36. Review.

302. Kai Simons, Elina Ikonen // SCIENCE VOL 290 1 DECEMBER 2000

303. Mayor S., Sabharanjak S., Maxfield F. // EMBO J. 1998. V.17. P.4626-4638.

304. Muniz M., Mosomme P., Riezman H. // Cell. 2001. V.104. P.313-320.

305. Chini B, Parenti M. // J Mol Endocrinol. 2004 Apr;32(2):325-38. Review.

306. Drmota T, Novotny J, Gould GW, Svoboda P, Milligan G. // Biochem J. 1999 Jun 1;340 (Pt 2):529-38.

307. Anderson RG. //Proc Natl Acad Sci USA. 1993 Dec 1;90(23): 10909-13. Review.

308. YuR,HinklePM.//Mol Pharmacol. 1997 May;51(5):785-93.

309. Paschen W. // Cell Calcium. 2003 Oct-Nov;34(4-5):365-83. Review.

310. B.E. Холмогоров, А.И.Халоимов, Н.П.Лехтлаан-Тыниссон. // Сборник трудов III-го Международного Конгресса "Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине 2003 СПБ С. 13-14

311. Duszyk М,French AS,Man SF,Becker AB. //Eur Biophys J. 1991;20(2):65-9.

312. Kristian T, Kolaj M, Poledna J. //Gen Physiol Biophys. 1991 Jun;10(3):265-80.

313. Хакен Г. Синергетика. M.: Мир, 1980.

314. Николис Г., Пригожин И. Самоорганизация в неравновесных системах. М.: Мир, 1979.

315. Пригожин И., Стенгерс И. "Порядок из хаоса. Новый диалог человека с природой". Едиториал УРСС. Москва. 2001

316. Пригожин И., Стенгерс И. "Время Хаос Квант". Едиториал УРСС. Москва. 2001

317. Белоусов Б.П.,"Периодически действующая реакция и ее механизм" в Сборнике рефератов по радиационной медицине за 1958 год, М. Медгиз, 1959г. стр. 145 147.

318. Жаботинский А.М. Биофизика, 1964, т.9 стр. 306-311.

319. С. П. Капица, С. П. Курдюмов, Г. Г. Малинецкий. Синергетика и прогнозы будущего. Едиториал УРСС. 2003

320. Пасечник В.И. // Биофизика. 1989. - T.34,N 6. -С.965-970

321. Voeikov V.L. // Cellular and molecular biology 51,663-675

322. Pollack G. Gerald H.; Cameron, Ivan L.; Wheatley, Denys N., Voeikov V. // Water and the Cell. Biological significance of active oxygen-dependent processes in aqueous systems, Springer 2006 p. 285-298.

323. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. Практический курс. М., 1999.

324. E. Davenas, F. Beauvais, J. Amara, M. Oberbaum, B. Robinzon, A. Miadonnai, A. Tedeschi, B. Pomeranz, P. Fortner, P. Belon, J. Sainte-Laudy, B. Poitevin & J. Benveniste // Nature. 1988. V.333. P.816.

325. Бурлакова Е.Б. // Биофизика. -1967. -Т. 12. -С. 82-88.

326. Молочкина Е.М., Боровок Н.В., Каткова Г.Д., Бурлакова Е.Б. Внутриклеточная сигнализация. -М.: Наука. 1991.

327. Nishizuka Y. //Nature. 1984 Apr 19-25;308(5961):693-8. Review.

328. Паршина Е.Ю., Гендель Л.Я., Рубин А.Б. // Биофизика, 2004, №6, т. 49, с. 1094-1098.

329. Рихирева Г.Т., Голубев И.Н., Прудченко И.А., Михалева И.И. // Биологические мембраны. 2003. Т.20. №5. С.409-418.

330. Yamada М, Iwasaki Т, Satoh Т, Monden Т, Konaka S, Murakami М, Iruchijima Т, Mori М. // Neurosci Lett 1995 196:109-112

331. Anthony D.Whetton, Miles D.Houslay, Nicholas J.F.Dodd, W. Howard Evans // Biochem. J., 1983, v. 214, #3, pp.851-854.

332. M Foot, T F Cruz and M T Clandinin// Biochem. J. 1982 208 P. 631-640

333. DR Petrovich, S Finkelstein, AJ Waring, and JL Farber // J. Biol. Chem. 1984 259:13217-13223.

334. Wood R., Upreti G.C., de Anueto R.J. // Lipids, 1986 v.21 N 4 pp 292-300.

Информация о работе

Жерновков, Вадим Евгеньевич
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.02

Диссертация

Действие тиреотропин-рилизинг гормона в широком диапазоне концентраций на структуру биологических мембран - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы