Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы действия фенозана калия в сверхмалых дозах на плазматические мембраны IN VITRO

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы действия фенозана калия в сверхмалых дозах на плазматические мембраны IN VITRO"

005535444

На правах рукописи

Часовская Татьяна Евгеньевна

МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ФЕНОЗАНА КАЛИЯ В СВЕРХМАЛЫХ ДОЗАХ НА ПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ IN VITRO

03.01.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

7 4 ОКТ 2013

Москва 2013

005535444

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики имени Н.М. Эмануэля Российской академии наук

Научный Пальмина Надежда Павловва, доктор биологических

руководитель: наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории физико-химических основ регуляции биологических систем федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимической физики имени Н.М. Эмануэля Российской академии наук

Официальные Воейков Владимир Леонидович, доктор биологических оппоненты: наук профессор кафедры биоорганической химии

биологического факультета федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Куроптева Зоя Вениаминовна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории регуляции биоэнергетических и иммунных процессов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимической физики имени Н.М. Эмануэля Российской академии наук

Ведущая Федеральное государственное бюджетное учреждение

организация: науки Институт биофизики клетки Российской академии

наук, г. Пушино

Защита состоится «27» ноября 2013 г. в 12-00 на заседании Диссертационного совета Д 002.039.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики имени Н.М. Эмануэля Российской академии наук по адресу: 119334, г. Москва, ул. Косыгина, д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической физики им. H.H. Семенова Российской академии наук.

Автореферат разослан «/&>> октября 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат химических наук

ЛЛн

Мазалецкая Л.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Одним из важных фундаментальных открытий последних десятилетий является обнаружение влияния растворов биологически активных веществ (БАВ) в низких (включая пикомолярные) и сверхнизких (фемтомолярные и ниже) концентрациях на биологические процессы. Эффекты сверхмалых доз (СМД) были зарегистрированы в экспериментах с веществами различной химической природы и биологического действия: гормонами, антиоксидантами, противоопухолевыми агентами, иммуномодуляторами и др. (Бурлакова, 1986; Ашмарин, 1992; Зайцев, 1993; Bonavida, 1991; Doutremepuich, 1991; Benveniste, 1988; Ямсков, 1999) на системах с различным уровнем биологической организации - от макромолекул и клеточных структур, до целых организмов и популяций. Однако, несмотря на большой объем накопленных за десятилетия экспериментальных данных, до сих пор не создано единой теории, способной объяснить подобные явления. Тем не менее, был выявлен ряд общих закономерностей, характерных для эффектов разнообразных БАВ с СМД (РХЖ, 1999). Наличие подобных закономерностей, возможно, связано с общностью критических мишеней действия БАВ. В качестве последних могут выступать плазматические мембраны клеток (ПМ), поскольку в них сосредоточены важнейшие регуляторные системы, отвечающие за функционирование клетки: системы вторичных посредников (циклических нуклеотидов и фосфоинозитидного цикла), обладающие свойствами каскадного усиления сигнала при проведении его в клетку (Nishizuka, 1984; Yoshimasa, 1987; Taylor, 1986) и система регуляции пероксидного окисления липидов (ПОЛ), определяющая состояние липидного бислоя (Владимиров, 1972; Бурлакова, 1967). В силу своей общей локализации данные регуляторные системы влияют друг на друга (Yoshimasa, 1987; Bouvier, 1990; Mal'tseva, 1997), поэтому вещества, модифицирующие состояние одной из них, могут индуцировать изменения и в других.

Ранее было зафиксировано влияние СМД таких БАВ, как природный антиоксидант а-токоферол, пептид тиролиберин и форболовые эфиры, на основные параметры системы ПОЛ, в частности структуру мембран, и сделаны предположения о механизмах действия этих агентов в СМД (Жерновков, 2007; Белов 2011; Пальмина, 1992). Все эти вещества природного происхождения, т.е. в норме входят в состав биологических систем в физиологических концентрациях. Для ответа на вопрос о том, насколько общими являются механизмы действия разнообразных БАВ в СМД, целесообразно проведение аналогичных исследований с синтетическими веществами, например с синтетическим антиоксидантом. В качестве такого БАВ нами был выбран фенозан калия (3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил пропионат калия), обладающий широким спектром биологического действия, в том числе и в СМД.

Целью данной работы являлось выяснение возможных механизмов действия фенозана калия (ФК) в интервале концентраций I0"s-10"2° М на плазматические мембраны клеток печени мышей in vitro посредством изучения закономерностей действия данного вещества на структуру различных липидных регионов и термодинамические характеристики мембраносвязанных белков, а также на структурно-динамическое состояние, размеры и форму липосом, приготовленных из суммарных липидов ПМ.

Для достижения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить влияние ФК в концентрациях 10"5-10"2° М на микровязкость глубоколежащих областей (~20-22 А) и параметр упорядоченности поверхностных областей (~8 А) липидного бислоя ПМ и липосом, приготовленных из суммарных липидов ПМ, при постоянной температуре 20°С методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), с использованием в качестве зондов стабильных свободных радикалов 16- и 5-доксилстеариновых кислот, обозначаемых соответственно С,6 и С5, нитроксильные фрагменты которых локализуются в указанных липидных областях. Получить зависимости доза-эффект.

2. Исследовать влияние отдельных концентраций ФК, оказавших наибольший эффект на структурно-динамические параметры липидов при 20°С, на положение, ширину и эффективную энергию активации термоиндуцированных структурных переходов в различных областях липидного бислоя мембран и липосом в диапазоне температур 12-42°С методом ЭПР.

3. Определить изменения термодинамических характеристик суммарных белков, входящих в состав ПМ, индуцированные ФК в концентрациях, оказавших максимальное и нулевое влияние на липидную компоненту мембран методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК).

4. Изучить действие ФК в концентрациях 10"5-10"20 М на размеры и форму липосом, приготовленных из липидных экстрактов ПМ, методами динамического светорассеяния (ДРС) и атомно-силовой микроскопии (АСМ).

5. Провести корреляцию между изменениями структурных характеристик ПМ, индуцированных растворами ФК и физико-химическими свойствами этих растворов.

Научная новизна

В данной работе впервые показано, что синтетический антиоксидант ФК в экспериментах in vitro в широком диапазоне концентраций, включающем сверхмалые (10",3-10-19 М), существенно модифицирует структурно-динамические параметры различных липидных регионов ПМ, выделенных из печени мышей, и липосом, приготовленных из липидных экстрактов ПМ. Зависимость эффекта от дозы ФК имеет бимодальный характер с максимумами в интервале «физиологических»

концентраций (10"5-10"7 М) и СМД, разделенными «мертвыми зонами», где эффект отсутствует. Принципиально дозовые зависимости для ФК не отличаются от таковых, полученных для веществ природного происхождения, в частности а-ТФ (Белов, 2011), за исключением того, что максимумы эффектов ФК в СМД в поверхностных и глубоколежащих областях липидов ПМ наблюдаются при действии разных концентраций препарата: (10",3-10'15М) - в поверхностных; (10"18-10'19 М) - в глубоколежащих.

Впервые обнаружено, что ФК в концентрациях, вызывающих максимальные изменения в параметрах микровязкости и упорядоченности липидной компоненты, индуцирует появление дополнительного термоиндуцированного структурного перехода липидов в области физиологических температур (40-42°С).

Впервые показано, что эффект СМД ФК сохраняется при полном отсутствии белков в системе. Закономерности, наблюдаемые при действии СМД ФК на ПМ и липосомы, приготовленные из липидных экстрактов ПМ, полностью совпадают. Эти результаты позволяют полагать, что первичной мишенью действия ФК в СМД являются именно липиды и механизм данного феномена не обусловлен взаимодействием с рецепторными белками.

Впервые установлено, что эффект ФК в области СМД обусловлен физико-химическими свойствами «наноассоциатов», образованных из молекул ФК и воды.

Основные положения, выносимые на защиту

1. ФК способен модифицировать структурно-динамическое состояние гидрофильных и гидрофобных липидных регионов ПМ как в «физиологических» дозах (10"5-10'7 М), так и в СМД (10"13-10л5 М, 10" -10" М, соответственно). Концентрационная зависимость эффекта имеет бимодальный характер, свойственный веществам, проявляющим активность в СМД.

2. ФК в широком диапазоне концентраций, включающем СМД, способен оказывать влияние на температуры и энтальпии переходов в белках ПМ. Наибольшее воздействие наблюдается для доз 10"6 М и 10"18 М, что соответствует наибольшим изменениям в микровязкости глубоколежащих областей липидов ПМ (-20-22 А).

3. ФК способен модифицировать структурно-динамическое состояние гидрофильных и гидрофобных липидных регионов липосом, приготовленных из суммарных липидов ПМ, подобно влиянию на мембраны. Эффекты СМД ФК (10*,3-10"15 М, 10' |8-10"19 М) сохраняются в отсутствии белковой фракции, следовательно, первичной мишенью действия препарата являются липиды.

4. Изменения, индуцируемые в липосомах ФК в концентрациях 10"5-10'7 М и 10"13-10" 15 М приводят к увеличению их гидродинамического диаметра и изменению формы от шарообразной к палочкообразной.

5. Корреляция между структурно-динамическими изменениями, индуцированными СМД ФК в ПМ и липосомах, и дозовыми зависимостями физико-химических свойств разбавленных водных растворов ФК позволяет сделать вывод о ключевой роли «наноассоциатов», состоящих из молекул ФК и воды, в механизме действия СМД.

Личный вклад автора Личный вклад автора состоял в подготовке образцов, проведении биофизических экспериментов, обработке и анализе полученных данных, формулировании положений и выводов, подготовке статей к опубликованию и участии в конференциях. Все изложенные в диссертации новые результаты получены автором лично или при ее непосредственном участии в подготовке и проведении экспериментов.

Научно-прикладное значение работы

Данная работа является составной частью комплекса научных исследований проблемы действия БАВ в СМД. Полученные в работе выводы и используемые методологические подходы могут быть применены в её решении. В частности, изменение структурно-динамических характеристик биомембран и липосом может быть использовано в качестве чувствительной модели для скрининга БАВ, действующих в ультранизких концентрациях; снижения терапевтических доз препаратов, активных в СМД, при сохранении их эффективности и уменьшении вероятности побочных эффектов. Результаты о влиянии ФК в СМД на структуру и форму липосом могут быть полезны для разработки методов стабилизации липидных оболочек лекарственных препаратов.

Работа выполнена в лаборатории физико-химических основ регуляции биологических систем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук (ФГБУН ИБХФ РАН) в соответствии с научным направлением «Изучение механизмов и эффектов действия химических и физических факторов (в т.ч. в сверхмалых дозах и при низких интенсивностях излучения) на биологические системы различной степени сложности с целью создания новых протекторных средств и лекарственных препаратов». Работа поддержана Программой ОХНМ РАН «Химия и физико-химия супрамолекулярных систем и атомных кластеров».

Апробация диссертационной работы Материалы работы были представлены в России на: ежегодных молодежных конференциях ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика», Москва, ноябрь 20072010; Ежегодной конференции МФТИ, Долгопрудный, 2007; VII Международной конференции «Биооксидант», Москва, октябрь 2010; I международной конференции МФТИ БФК «Северный», Москва, май 2011; Всероссийской конференции с

международным участием «Спектроскопия и томография электронного парамагнитного резонанса в химии и биологии», Москва, октябрь 2011; Всероссийской молодежной конференции «Успехи химической физики», Черноголовка, июнь 2011; VI Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, июль 2012; Международной конференции «Структура воды: физические и биологические аспекты», Санкт-Петербург, сентябрь 2013.

Результаты были представлены на зарубежных конференциях: 50-th International Conference on the Bioscience of Lipid, Regensburg, Germany, August 2009; FEBS Advanced Course "Lipid Signaling and Disease", Ortona, Italy, September 2009; Issfal Conference. Maastricht, The Netherlands, May 2010; 8-th Euro Fed Lipid Congress, Munich, October 2010; 9-th Euro Fed Lipid Congress, Rotterdam 2011; 52-nd International Conference on the Bioscience of Lipids, Warsaw, Poland, August 2011; VI Conference on the Physics, Chemistry and Biology of Water, Vermont, USA, October 2011; International Workshop «Lipids: from Lipidomics to Disease and Green Energy», Spetses, Greece, August 2012; 10-th Euro Fed Lipid Congress, Cracow, Poland, September 2012.

Публикации в рецензируемых журналах Основные положения диссертационной работы опубликованы в 16 печатных работах, из которых 4 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень Высшей аттестационной комиссии, 12 публикаций в сборниках научных трудов и тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, 4 глав, основных выводов и списка литературы. Работа изложена на 160 страницах, иллюстрирована 42 рисунками и 10 таблицами. Библиография включает список из 257 работ.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Во введении охарактеризована тема работы, обоснована ее актуальность, определены цели и задачи исследований, положения, выносимые на защиту, научная новизна работы и ее научно-прикладное значение.

Глава 1 содержит обзор литературы по теме диссертации, в котором рассматриваются современные представления о роли клеточных мембран и регуляторных систем, сосредоточенных в мембранах, а также структурирования молекул воды в разбавленных растворах в механизме действия различных БАВ в СМД. Подробно рассмотрено строение и свойства фенозана калия, проявления его активности в СМД на различных моделях in vivo и in vitro.

Глава 2 посвящена материалам и методам исследования. Водные растворы ФК готовили методом последовательного разведения раствора исходной концентрации 10"3 М на порядок. В качестве исследуемых объектов использовали ПМ печени

мышей линии Fl (С57 х DBA2), выделенные методом последовательного центрифугирования (Loten, 1986). Содержание белка в мембранах определяли по методу Лоури (Lowry, 1951). Экстракция липидов из ПМ производилась по методу Блайя и Дайера (BHgh, 1954). Липосомы готовили из суммарных экстрагированных липидов с помощью регидратации буфером СЭТ (pH 7,3), содержащим 0,25М сахарозы, ЮмМ трис-HCl и 1мМ ЭДТА, использовавшимся для хранения мембран, и обработки полученной суспензии ультразвуком. Все проведенные эксперименты воспроизводились на мембранах, выделенных в разные времена года. Для опытов использовались мембраны, размороженные в день эксперимента и хранившиеся не более 4х дней при 4°С, или липосомы, хранившиеся не более Зх дней после приготовления при 4°С.

Структурное динамическое состояние ПМ и липосом изучали на ЭПР-спектро-метрах "Bruker 200D" и "Bruker ЕМХ" (Германия) методом спинового зонда (Кузнецов, 1976, Гриффит, 1979). В качестве зондов были взяты стабильные нитроксильные радикалы 5- и 16-доксилстеариновые кислоты (зонды С5 и Ci6), локализующиеся на различных глубинах в липидном бислое (~8Ä и ~20-22 А, соответственно; рис. 1). Конечная концентрация зондов в мембранах и липосомах не превышала 6-10"5 М. Спектры зонда С5 характеризовали параметром упорядоченности S, а зонда С)6 временем вращательной корреляции тс (рис. 1).

16-доксилстеариновая кколспа 5-доксилстеариновая кислота

Рисунок I. Структурные формулы, спектры в мембранах и липосомах, а также формулы расчета параметров 8 и тс зондов С16 (а) и С5 (б)

Образцы для исследования методом ЭПР инкубировали при 4°С с зондом в течение 15-20 минут, затем измеряли контроль при постоянной температуре 20°С, после чего к измеренным образцам добавляли ФК в необходимой концентрации, и, после инкубации в течение 15 минут, измерения повторялись для исследования эффекта

6

введения препарата. При изучении температурных зависимостей структурно-динамических характеристик ПМ и липосом в диапазоне 12-42°С измерения контроля и опыта проводились на разных образцах, т.к. нагретые до 42°С в контроле пробы были непригодны для использования в опыте.

Положения термоиндуцированных структурных переходов определялись по изломам между линеаризованными участками температурных зависимостей в Аррениусовых координатах, как показано на рис. 2 и описано в работе (Chapman, 1975). Точками излома считали те точки, добавление которых к спрямленному участку графика выводило коэффициент корреляции за пределы норм, определяемых статистической надежностью 95%. На рис. 2 также представлен способ расчета эффективной энергии активации д£* переходов в глубоколежащих слоях липидов ПМ и липосом.

Исследование влияния ФК на термолабильность белковой фракции ПМ проводили с помощью дифференциального сканирующего микрокалориметра ДАСМ-4 (Пущино, Россия). Метод ДСК подробно описан в работах (Шестак, 1987, Hohne, 2003). Эксперименты выполнены совместно с к.х.н. Козловым С.С. и д.х.н. Семёновой М.Г.

Суспензия ПМ объемом 1мл, содержащая 5мг/мл белка, помещалась в калориметрическую ячейку и исследовалась в интервале температур 40-90°С при скорости нагрева 1°С/мин и избыточном давлении 2.5 бар. Образцом сравнения служила среда выделения СЭТ (pH 7,3). Полученные ДСК-термограммы суспензии ПМ после вычитания базовой линии обрабатывали методом деконволюции с помощью программы PeakFit v4.12 (SeaSolve Software Inc.). Положения скрытых пиков вычисляли на основе анализа второй производной калориметрической кривой. В качестве примера, на рис. 3 представлена деконволюция ДСК-термограммы ПМ в контроле.

Определение гидродинамического диаметра липосом проводили методом динамического рассеяния света, ДРС, или фотонной корреляционной спектроскопии

7

Рисунок 2. Характерная температурная зависимость параметра тс зонда Сі6 в Аррениусовых координатах на примере контрольной пробы ПМ

термограммы ПМ в контроле. Концентрация белка 5 мг/мл, скорость сканирования ГС/мин

(Berne, 1990) при постоянной температуре +25 °С с помощью анализатора Malvern Zetasizer Nano S (Malvern Instruments Ltd., Великобритания). Эта часть работы выполнена совместно с к.х.н. Плащиной И.Г. Показания измеряли в контроле, затем в исследуемом образце последовательно увеличивая концентрацию ФК от 10"'9 М до 10~4 М (после каждого добавления препарата образец инкубировали 15 минут). Как показали данные, полученные в ходе экспериментов, схема введения (интервал увеличения концентраций, стартовая концентрация в серии) не влияла на результат. Для сравнительного анализа гидродинамического диаметра частиц использовали положение максимума наибольшего пика интенсивности сигнала (70-90%), которое усредняли по 6-9 независимым экспериментам для каждой концентрации ФК. Индекс полидисперсности составлял в среднем 0,4, средняя скорость счета 280 kcps.

Действие ФК на форму и размеры липосом было изучено методом атомно-силовой микроскопии, ACM (Muller, 2008, Dufrene, 2008) совместно с к.б.н. Бинюковым В.И.. Изображения липосом были получены с помощью атомно-силового микроскопа SOLVER Р47 (SMENA, NT-MDT, Россия), в полуконтактном режиме на частоте колебаний 150 кгц, с использованием кантилевера NSG. Измерения производили с использованием воздушно сухих пленок, образующихся при высыхании тонкого слоя суспензии липосом на кремниевой подложке при комнатной температуре. Характеристики липосом по полученным изображениям вычислялись с помощью программы NT-MDT Image Analysis V. 2.2.

Статистическая обработка данных осуществлялась методами параметрической и непараметрической статистики с использованием пакетов компьютерных программ Microsoft® Office Excel и OriginLab® 8.5 при статистической надежности 95%. Относительные эффекты рассчитывались по формуле X — X

Эффект= 100% ——-"""'-'""', где Х- исследуемый параметр

^конпро.хь

Результаты экспериментов Представлены в Главе 3 диссертации.

Влияние ФК на плазматические мембраны клеток печени мышей in vitro 1. Действие ФК в концентрациях l^-lff20 М на вязкостные характеристики различных по глубине липидных регионов плазматических мембран при постоянной температуре 20 "С, изученное методом ЭПР

Вязкостные характеристики липидного бислоя при заданной температуре являются важными структурно-динамическими параметрами, влияющими на функциональную активность компонентов мембраны. Мы изучили влияние ФК на тс глубоколежащих (-20-22 Á) и S поверхностных областей (~8 Ä) липидов ПМ при постоянной

температуре 20 °С. Полученные данные представлены на рис. 4 и выражены в

Каждая точка на рис. 4 является усреднением результатов 3-5 независимых экспериментов (каждый эксперимент включает 10 измерений контроля и 12 -опыта). Средние значения изучаемых параметров в контроле составили тс = 1,71±0,03 не, S = 0,643±0,002. Дозовая зависимость для тс (кривая 1), описывается наличием двух максимумов 10"5-10-7 М (-11%) и 10'l7-10_i9 М (~7%), разделенных интервалом концентраций 10"8-10"16 М, для которого не обнаружено статистически достоверных эффектов. Для параметра упорядоченности S, (кривая 2) - двумя максимумами 10"б-10"7 М (-1,8%) и 10~'3-10"15 М (-1,5%), также разделенными областью концентраций 10"8-10"'2 М, где эффект отсутствует. Сравнивая положение максимумов на данных кривых, можно отметить, что в области традиционных «физиологических» концентраций (10'5-10"9 М) наблюдаются однотипные увеличения параметров тс и S, в то время как вторые максимумы на кривых 1 и 2 на рис. 4 в области СМД относятся к разным концентрационным интервалам (10"|3-10"15 М для S и 10"ls-10"19 М для тс).

Полученные дозовые зависимости эффекта ФК на структурно-динамические характеристики ПМ имеют полимодальный характер, типичный для веществ, проявляющих эффект в СМД.

2. Влияние отдельных концентраций ФК на термоиндуцированные структурные переходы в различных по глубине липидныхрегионах, а также на эффективную энергию активации переходов в глубоколежащих областях липидов ПМ в диапазоне температур 12-42 "С, наблюдаемое методом ЭПР

Помимо изменений вязкостных параметров липидного бислоя при постоянной температуре (тс и S), важными характеристиками, описывающими динамическое состояние мембраны, являются количество и качество термоиндуцированных структурных переходов. Они представляют собой кооперативные структурные перегруппировки липидов при повышении температуры, которые сопровождаются скачкообразным изменением вязкостных характеристик. Для выявления переходов были определены зависимости тс и S от температуры в контроле и при добавлении тех

9

процентах по отношению к контролю.

Ыякровяэкость

-»-Степень

упорядоченности

■ LS [OKI

3.5 3

2.5 2

2° -0.5

Рисунок 4. Дозовые зависимости влияния ФК на микровязкость глубоколежащих областей (кривая I, черная) и жескость поверхностных регионов плазматических мембран (кривая 2, серая) при температуре 20 °С

концентраций ФК, которым соответствовали максимумы или отсутствие эффектов на дозовых зависимостях (рис.4). Полученные результаты в Аррениусовых координатах представлены на (рис. 5).

Рисунок 5. Температурные зависимости параметра тс, характеризующего микровязкость глубоколежащих областей липидного бислоя (20-22 А), и параметра Э, характеризующего степень упорядоченности областей липидного бислоя (8 А) в контроле (а, г) и при действии ФК в концентрациях 10"6(й), 10 "7(б), 10"14 (в) и 10"'8 М (е). Стрелками отмечены положения термоиндунированных структурных переходов

Полученные сведения о положениях и эффективной энергии активации переходов (в глубоколежащих областях) суммированы в табл. 1.

Таблица 1. Положения термоиндунированных переходов в ПМ в контроле и под действием различных концентраций ФК, а также эффективная энергия активации переходов в глубоколежащих

областях ДкДж/М

т,°с 12 14 16 18 20 22 | 24 26 28 30 | 32 34 36 38 40 42

с,6 контроль 6,5±0,2= 8,1 ±0,5

10-"МФК 6.9±0,3 1 "8,8±,0,8

Ю'-'МФК 6,5±0,3 | 8,1±0,7 |

10'18МФК 7,8±0,4. | 9,1±0,9

С5 контроль

ю~6м ФК • ' 1

Ю-'МФК

10-|2МФК 1

Ю-'4 МФК

Ю^МФК

По сравнению с контролем, для которого характерно два перехода, СМД ФК, которым соответствовали максимумы на дозовых зависимостях при температуре 20 °С (рис. 4), вызывают появление дополнительного третьего перехода при температурах 24-26сС в поверхностных областях (при действии ФК в концентрациях 10",4-10~15 М), и 40-42°С в глубоколежащих областях липидов (при действии ФК в концентрации 10"18 М). Для концентраций, соответствующих «мертвым зонам» на дозовых зависимостях на рис. 4, общее количество переходов не меняется, однако в поверхностных областях по сравнению с контролем они сдвигаются в область более высоких температур, в том числе и «физиологических». Эффективная энергия активации в глубоколежащих областях ПМ при воздействии различных концентраций ФК меняется незначительно. Учитывая важную роль фазовых переходов липидов биологических мембран в жизнедеятельности клетки (в изменении проницаемости мембраны, образовании пор, слиянии мембран, терморегуляции и т.д. (Антонов, 1992, Харакоз, 2001)), эти эффекты ФК могут иметь регуляторное значение для живых систем.

3. Действие отдельных концентраций ФК на температуру и энтальпию структурных переходов в белках ПМ, исследованное методом ДСК Фазовое состояние липидов мембран напрямую сказывается на активности мембраносвязанных белков, т.к. влияет на их конформацию, подвижность, степень гидратации и т.д. Структурное состояние белков, в свою очередь, связано с их термодинамическими характеристиками плавления и денатурации. Чтобы выяснить, каким образом действие ФК отражается на белковой фракции ПМ, были проведены исследования методом ДСК по изучению изменений температуры и энтальпии переходов в ПМ под действием ФК. В контроле и для каждой исследованной концентрации ФК (10"5 М, 10"6 М, 10"14 М, 10"18 М) было сделано по 3 независимых эксперимента, при этом результаты воспроизводились во всех опытах.

Рисунок 6. ДСК-термограммы плазматических мембран в контроле и при добавлении ФК в концентрациях: 10'18 М (1), 10"5 М (2), Ю"6 М (3), 10"8 М (4), К)"10 М (5), 10'14 М (6). Концентрация белка 5 мг/мл, скорость сканирования - 1 "С/мин

Полученные в результате экспериментов термограммы представлены на рис. 6. Для всех исследованных образцов ПМ наблюдались несимметричные, с широким

11

Сруз, Дл:-Т

0,18 0,16 0.14 112 11 0,08 0.06 0.04

о,о:

у

10 Л) 30

температурным интервалом эндотермического перехода, ДСК-термограммы, при этом все исследованные концентрации ФК меняют форму кривых по сравнению с контролем. Наибольшее изменение наблюдается при действии концентраций ФК 10"5 М, 10'6 М и 10"18 М (кривые 1,2 и 3 на рис. 6). На представленных термограммах после деконволюции отчетливо выделяются 4-5 пиков, относящихся к суммарным классам белков нескольких групп. Характеристики выявленных таким способом переходов (температура, изменение энтальпии) приведены в табл. 2 и 3.

Таблица 2. Температуры переходов (Т„) для отдельных эндотермических пиков, полученных в деконволюции ДСК-термограмм образцов плазматических мембран

Тт, °С

Пик А Пик В Пик С Пик D ПикЕ Пик F

Контроль 37.1±0.2 - 52.8±0.3 61.1±0.2 71.1±0.3 79.6±0.2

Iff5 МФК 36.4±0.2 - 54.4±0.1 - 70.6±0.3 77.8±0.3

Iff6 МФК - 48.8±0.2 57.0І0.3 - 72.5±0.1 79.6±0.1

10" М ФК - - 54.4І0.1 62.6±0.4 70.2±0.3 77.8±0.3

10-'°МФК - - 53.8±0.3 61.7±0.6 69.6±0.3 77.1±0.6

1014 МФК - - 53.3±0.1 62.6±0.6 70.9±0.2 78.8±0.4

1018МФК - - 52.3±0.3 60.2±0.2 70.2±0.2 77.8±0.3

Из табл. 2 видно, что ФК, использованный как в «физиологических» концентрациях, так и в СМД, существенно изменяет термолабильность белковой фракции ПМ: в высоких дозах уменьшает её, а в СМД — увеличивает. Сравнивая эти результаты с данными, имеющимися в литературе о влиянии различных БАВ на термоиндуцированные структурные переходы в мембранных белках (Epand, 1999, Bennett, 2008), можно сказать, что ФК даже в СМД вызывает существенные изменения в этом показателе.

Таблица 3. Общая энтальпия образцов плазматических мембран и энтальпии отдельных переходов, полученных в результате деконволюции ДСК-термограмм образцов плазматических мембран

ДН (общая), Дж/г ДН, Дж/г (по результатам деконволюции)

Пик А Пик В Пик С ПикО ПикЕ ПикР

Контроль 10.6±0.4 0.1±0.1 - 6.5±0J 0.6±0.1 3.2±03 0.2±0.1

10 s МФК 5.9±0.3 0.04±0,1 - 4.4±0.3 - 0.9±0.1 0.6±0.1

10"6МФК 4.5±0.4 - 1.3±0Д 1.8±0.2 - 1.0±0.1 0.25±0.1

10 s МФК 8.4±0.4 - - 4.9±0.4 1.0±0.1 2.1±0.2 0.5±0.1

Ю''°МФК 9.2±0.4 - - 4.4±0.3 1.6±0.2 2.3±0.2 1.1±0.1

Iff14 МФК 10.6±0.3 - - 7.0±0.4 0.8±0.1 2.1 ±0.2 0.7±0.1

Iff" М ФК 5J±0.4 - - 2.7±0.2 1.0±0.1 1.1±0.1 0.4±0.1

Из табл. 3 видно, что ФК в концентрациях 10"" М и 10'18 М в два раза уменьшает как суммарную энтальпию, так и энтальпию отдельных переходов в ПМ. Под действием концентраций 10"8 М, Ю'10 М и 10"14 М энтальпия меняется незначительно.

Наблюдается отрицательная корреляция между микровязкостью глубоколежащих областей липидного бислоя ПМ под действием ФК в концентрациях 10"6 М и 10"'8 М, определенной методом ЭПР (рис. .4),; и - энтальпией переходов в белках ПМ (как суммарной, так и отдельных пиков).

Исходя из того, что ФК вызывает изменения в температурных характеристиках большей части белковой фракции ПМ, а не только отдельных белков, можно заключить, что это влияние опосредовано, и связано главным образом с модификацией структурно-динамических свойств липидного бислоя ПМ, а не с рецепторным взаимодействием ФК с белками.

Влияние ФК на липосомы, приготовленные из суммарных липидов ПМ 1. Действие ФК в концентрациях 1(Г5-10~20 М на вязкостные характеристики различных по глубине липидных регионов липосом при постоянной температуре 20 "С, изученное методом ЭПР Эксперименты по изучению влияния ФК в диапазоне концентраций Ю"5-10-20 М на структурно-динамические характеристики липосом, приготовленных из суммарных

липидов ПМ, проводились абсолютно аналогично экспериментам на ПМ с использованием метода ЭПР и парамагнитных зондов С5 и С16. Дозовые зависимости исследованных параметров в липосомах представлены на рис. 7.

Добавление ФК в суспензию липосом в концентрациях 10"7-10"8 М и 10"18-10"19 М статистически достоверно увеличивает микровязкость липидного окружения зонда С16, что отражается в увеличении значения времени вращательной корреляции тс на 5-6 % по сравнению с контролем. В промежуточном интервале концентраций 10'9-10'17 М достоверных эффектов не наблюдается. Влияние ФК на параметр 8 также носит нелинейных характер: наблюдается два максимума при действии концентраций Ю-4-Ю-6 М (2,53,5%) и 10'13-10~15 М (2-2,5%), причём положения максимумов эффекта ФК в мембранах и липосомах полностью совпадают.

Эти данные позволяют сделать принципиально важное заключение о том, что именно липиды являются мишенью действия ФК в СМД, и для реализации этого

Рисунок 7. Дозовые зависимости влияния ФК на микровязкость глубоколежащих областей (кривая 1, черная) и жескость поверхностных регионов липосом (кривая 2, серая) при температуре 20 °С

воздействия не требуются суперафинные рецепторы и какие-либо другие белковые системы.

2. Влияние отдельных концентраций ФК на термоиндуцированные структурные переходы в различных по глубине липидных регионах, а также на эффективную энергию активации переходов в глубоколежащих областях липосом в диапазоне температур 12-42 "С, наблюдаемое методом ЭПР Для сравнения влияния ФК на положение термоиндуцированных структурных переходов в различных липидных регионах ГТМ и липосом мы изучили зависимости изменения параметров Б и тс в липосомах от температуры. В результате были получены данные, аналогичные зафиксированным ранее для ПМ (рис.5). Температурные зависимости исследуемых параметров в липосомах в Аррениусовых координатах представляли собой линеаризованные участки с изломами, положения которых совпадали во всех сериях измерений. Сводные данные по термоиндуцированным структурным переходам в липосомах представлены в табл. 4.

Таблица 4. Положения термоиндуцированных переходов в липосомах в контроле и под действием различных концентраций ФК, а также эффективная энергия активации переходов в глубоколежащих областях ДкДж/М

т,°с 12 14 16 18 20 22 24 | 26 28 30 | 32 34 36 38 40 42

С,6 контроль 9.910,4 15,9*0,6

10'МФК 10,7±0,3 | 1, ё,7±0,5

1013МФК -10,1*0,4 : 15,4«,8 1

Ю^ИФК 10,9+0,7 ( 14,8±0,6; 16,6±0,9

с5 контроль 1 1

10" МФК

10-иМФК

ю-'4 МФК г ■ 1

Из табл. 4 следует, что в контроле и при действии исследованных концентраций ФК липосомы имеют такое же количество термоиндуцированных структурных переходов в поверхностных областях и глубоколежащих областях, как и ПМ. Переходы в поверхностных областях липосом в контроле происходят при более низких температурах, чем в ПМ. В глубоколежащих областях ПМ и липосом температуры переходов мало отличаются, тогда как эффективные энергии активации в 1,5-2 раза выше в липосомах, чем в ПМ. Воздействие СМД ФК 10"14 М и 10"18 М, которым соответствовали максимумы эффекта на дозовой зависимости на рис. 7, также как и в ПМ, в липосомах индуцируют появление дополнительного перехода в области физиологических температур (34-42°С).

Наблюдаемое сходство влияния ФК на переходы в липосомах и ПМ, как и совпадение максимумов на дозовых зависимостях в области СМД (рис. 4 и 7) при

постоянной температуре, говорит о едином механизме действия СМД ФК на мембраны и липосомы.

3. Действие ФК в концентрациях 1(Г4-Iff'9 М на гидродинамический диаметр липосом, исследованное методом ДРС

Чтобы выяснить, каким образом структурно-динамические изменения в поверхностных и глубоколежащих областях липосом, обнаруженные методом ЭПР, отражаются на их внешних свойствах, было изучено влияние различных концентраций ФК на их гидродинамический диаметр методом динамического рассеяния света (ДРС).

Полученная зависимость эффекта от дозы препарата (в % по отношению к контролю) представлена на рис. 8. ФК в концентрациях 10"4-1(Г7 М и

10-'3-10"'5 М

способен существенным образом (13-17%) увеличивать гидродинамический диаметр липосом по сравнению с контролем. Промежуточные концентрации

10'9-1012 М, а

также более низкие концентрации 10"16-10"19 М не оказывали статистически достоверного эффекта.

Если сравнить эти данные с полученными нами ранее методом ЭПР результатами по влиянию ФК на структурно-динамическое состояние липидов в липосомах, можно отметить существенную корреляцию с изменением жесткости поверхностных областей липосом во всем исследованном диапазоне концентраций (г=0,98, р=0,0001).

Наличие высокой количественной корреляции говорит о том, что изменения структуры, индуцируемые ФК в поверхностных областях липидного бислоя (~ 8 А) как в «физиологических» концентрациях, так и в СМД, напрямую связаны с динамическим вязкостным

взаимодействием между липо-сомами и окружающей их жидкостью.

Физический смысл увеличения гидродинамического диаметра состоит в замедлении хаотического броуновского движения частиц в суспензии. Это, свою очередь, может быть связано не только с увеличением средних размеров частиц, но и с изменением их формы. Для более детального изучения влияния ФК на внешние характеристики липосом был использован метод атомно-силовой микроскопии (АСМ).

Рисунок 8. Концентрационная зависимость эффекта ФК на гидродинамический диаметр липосом О, оцененный методом ДРС, при температуре 25°С. Концентрация липидов в суспензии 1,5 мг/мл. Приведены средние результаты из 9 независимых экспериментов. Диаметр в контроле составлял 175,5±10,8 нм

4. Влияние отдельных концентраций ФК на форму и размеры липосом, изученное методом АСМ.

Метод АСМ позволил оценить влияние ФК на различные визуальные характеристики липосом, такие как площадь поперечного сечения, высота, отношение длины к ширине и т.д. В табл. 5 приведен полный список и средние значения данных параметров в контроле из 17 независимых экспериментов.

Таблица 5. Характеристики АСМ-имиджей липосом в контроле

среднее максимальное минимальное

Кол-во липосом К, шт. 31 76 7

Средняя высота Ъ, нм 6,2 9,65 2,48

Площадь 5, мкм2 0,007 0,019 0,004

Объем V, мкмЗ 0,055 0,18 0,01

Диаметр Э, мкм 0,09 0,11 0,065

Длина Ь, мкм 0,14 0,17 0,09

Ширина Ш, мкм 0,06 0,08 0,04

Длина/ширина ЬГМ 2,66 2,87 2,47

Для оценки изменений формы липосом под воздействием ФК в концентрациях 10" М, 10~8 М, Ю"14 М и 10"ls М использовался параметр LAV, отношение длины к ширине. Перечисленные концентрации ФК были выбраны, поскольку им соответствовали максимумы влияния на структурные характеристики различных регионов липосом, полученные методом ЭПР (рис. 7) Типичные АСМ-имиджи липосом, полученные в результате экспериментов, представлены на рис. 9.

а о в

Рисунок 9. АСМ-имиджи липосом в контроле (а), и при действии концентраций ФК 10"14 М (б), Ю"6 М (с). Изображения, полученные для концентраций ФК 10"18 М, 10"8 М не отличались от контроля

а б

Рисунок 10. Трехмерные модели липосом в контроле (а) и при действии ФК в концентрации 10" 14 М (б), построенные по АСМ-имиджам

Приближенные участки трехмерных изображений, смоделированные с помощью программы NT-MDT Image Analysis по интенсивности АСМ-имиджей, представлены на рис. 10. •

На рис. 9 и 10 видно, что липосомы в контроле имеют округлую форму, что полностью соответствует данным, имеющимся в литературе (Ruozi, 2007, Spyratou, 2009). При действии ФК в концентрациях 10"8 М и 10"18 М их форма не изменяется. Под действием ФК в концентрациях 10"' М и 10"14 М они визуально «вытягиваются», что отражается количественно в изменении отношения длины к ширине липосом (LAV), которое представлено на рис. 11 в виде гистограммы (эффект по отношению к контролю).

Рисунок 11. Влияние ФК в широком диапазоне концентраций на отношение длины к ширине липосом (столбцы гистограммы, серый цвет) и на параметр упорядоченности S поверхностных областей липосом (черная кривая)

ФК вызывает статистически достоверное увеличение L/W на 12-14% по сравнению с контролем при действии в концентрациях 10"6 М и 10"14 М. При этом добавление ФК в концентрациях 10"8 М и 10"18 М в суспензию не оказывает достоверного влияния на данный параметр. Наблюдается хорошее соответствие изменения отношения L/W и параметра упорядоченности S (рис. 11, черная кривая), а отсутствие эффекта по показателю S коррелирует округлой формой липосом. Таким образом, можно сделать вывод о том, что изменения структурно-динамических свойств приповерхностных слоев липидов, индуцированные ФК, непосредственно связаны с изменениями формы липосом.

Совпадение эффектов для методов АСМ и ДРС говорит о том, что наблюдаемые изменения внешних характеристик липосом не связаны со способом измерений и обусловлены именно действием ФК на липиды как в «физиологических» концентрациях, так и в СМД.

Заключение

Приведено в четвертой главе диссертации, где кратко суммированы основные результаты предлагаемого исследования, а также сделаны определенные выводы о механизме действия ФК в широком диапазоне концентраций (10"5-10"2° М) на ПМ клеток печени мышей in vitro.

В данной работе в первую очередь были изучены особенности действия ФК структурно-динамическое состояние различных по глубине областей ПМ методом ЭПР. Было установлено, что зависимости параметров S и тс, характеризующих состояние различных областей липидного бислоя, от концентрации вводимого ФК при температуре 20°С имеют немонотонный, бимодальный характер, связанный с наличием эффектов в трёх областях доз: области «физиологических» концентраций ФК (Ю^-Ю"9 М), в которых он обычно используется при введении в организм; его СМД (10"в-10"15 М) и даже «мнимых» концентраций (10"18-10"19 М). Максимумы на кривых разделены так называемыми «молчащими» зонами, где эффект ФК на исследуемые структурно-динамические характеристики мембран не наблюдается. Сопоставляя полученные данные с литературными, следует подчеркнуть, что, несмотря на разнообразия биологических моделей, в большинстве экспериментов зафиксированы наибольшие эффекты ФК в концентрациях 10"4-10"5 М и 10",4-10'15 М (Молочкина, 1999; Трещенкова, 2003; Пальмина, 2003; Наглер, 2008; Жигачева 2010). Наибольшее соответствие в эффекте ФК на различных моделях коррелирует с изменением параметра упорядоченности S в ПМ, установленным нами, и, вероятно, именно изменения в структурно-динамическом состоянии поверхностных областей липидов мембран приводят затем к модификации в функционировании и регуляторных систем, локализованных в них, и, соответственно, биологическому эффекту.

Бимодальный характер дозовых зависимостей эффектов ФК на структурные характеристики липидного бислоя ПМ может быть связан с преобладанием в определенных интервалах доз роли различных механизмов действия ФК. Ранее при рассмотрении вопроса о возможных механизмах действия БАВ в СМД на примере а-токоферола (а-ТФ) и тиролиберина (ТРГ) были высказаны предположения о причинах возникновения максимумов на дозовых зависимостях в разных концентрационных интервалах, которые были частично подтверждены и экспериментально: в области традиционных «физиологических» концентраций (10 -10'9 М) - встраиванием молекулы БАВ в мембрану; в интервале СМД (10'9-10'18 М) -специфическим связыванием БАВ с лигандами на мембране; в интервале «мнимых» концентраций (10'18-10"25 М) - изменением структурно-динамических характеристик воды, выступающей в роли полярного растворителя а-ТФ и ТРГ и среды окружающей мембраны (Жерновков, 2007; Белов, 2011). Сопоставляя полученные

18

нами результаты с высказанными ранее предположениями о механизмах действия БАБ, можно заключить, что максимум в интервале высоких концентраций ФК также обусловлен неспецифическим характером его взаимодействия с липидной компонентой ПМ. В пользу этого предположения говорит и ряд результатов, полученных в нашей лаборатории, об изменении текучести различных биологических мембран под действием ФК в концентрации 10"4-10"6М, измеренных при использовании других зондов в экспериментах in vivo (Трещенкова, 2003). Второй максимум на дозовых зависимостях для а-ТФ (он также общий для S и тс) Белов В.В. с соавт. объясняют возможным взаимодействием препарата со специфическими местами его связывания на мембране (протеинкиназой С или включающими этот фермент рафтами). Так как ранее в работе Мальцевой Е.Л. (1997) было установлено, что ФК является суперактиватором данного фермента, в том числе и в СМД, мы провели сравнение полученной нами дозовой зависимости изменения под воздействием ФК параметра тс в ПМ (рис.4) и активности мембраносвязанной ПК-С

Как видно из рис. 12, существует определённая качественная корреляция между этими величинами, что позволяет связать максимум эффекта тс в интервале концентраций 10'18-10'19 М с образованием комплекса ФК с ПК-С или модификацией под влиянием ФК липидных мембранных кластеров, или рафтов, содержащих ПК-С. В пользу такой взаимосвязи говорят и полученные нами данные о закономерностях изменения энтальпии переходов в белках плазматических мембран под влиянием различных концентраций ФК (табл. 3). Минимальные значения изменений общей энтальпии и переходов в отдельных фракциях белков отмечены методом ДСК при воздействии ФК в концентрациях 10"6 М и 10"18 М, которые соответствуют максимальной способности ФК активировать ПК-С и повышать микровязкость глубоколежащих областей ПМ (рис. 12).

Оставался открытым вопрос о том, какой процесс является первичным: взаимодействие ФК с ПК-С как с рецептором и последующее воздействие на липиды или встраивание ФК в липидную компоненту мембраны и изменение активности фермента, липид-зависимость которого доказана в независимых экспериментах

Рисунок 12. Сравнение дозовых зависимостей влияния ФК на микровязкость глубоколежащих областей ПМ и активность мембраносвязанной протеинкиназы-С

(Leonard, 2011). Ответ на него был получен нами после проведения исследований на липосомах, приготовленных из липидных экстрактов ПМ. При действии ФК в широком интервале концентраций (10"5-10"2° М) на липосомы мы получили дозовые зависимости изменения микровязкости липидов и жёсткости поверхностных областей липосом, аналогичные наблюдавшимся нами ранее в экспериментах с ПМ (рис. 4 и 7). Это доказывает, что ФК непосредственно действует на липидную компоненту ПМ. Тот факт, что в области СМД обнаружено совпадение максимумов на кривых изменения тс липосом и активности ПК-С, свидетельствует о том, что ФК, индуцируя увеличение микровязкости глубоколежащих областей липидов, затем приводит к изменениям состояния белковой компоненты мембран и активации фермента, то есть именно липиды являются мишенью действия ФК в СМД. Дополнительные подтверждения этого заключения были получены нами при определении влияния ФК на положения термоиндуцированных структурных переходов в глубоколежащих липидных областях ПМ и липосом (табл. 1 и 4). Из таблиц видно, что ФК в концентрации 10"'8 М вызывает появления дополнительного термоиндуцированного структурного перехода при 40-42°С. Есть литературные данные о том, что мембраносвязанная ПК-С обладает максимальной активностью именно в интервале температур 37-40°С (Micol, 1999; Константинова, 1991).

Результаты экспериментов по влиянию на физико-химические свойства липидов в липосомах, полученные методом ЭПР, были существенно расширены и дополнены при исследовании влияния ФК на размеры и форму липосом методами ДРС и АСМ. Было установлено, что ФК влияет на размеры липосом, причём дозовые зависимости изменения гидродинамического диаметра липосом, определяемого методом ДРС, и параметра упорядоченности S в поверхностных слоях липидов идентичны в исследованном диапазоне концентраций, между ними обнаружена линейная корреляция. Методом АСМ было показано также, что форма липосом принципиально изменяется, переходя от шарообразной к палочкообразной, в соответствии с изменением того же параметра S (рис. 11): при использовании ФК в концентрациях 10"6М и 10'14 М зафиксирован переход к палочкообразной форме, а при действии ФК в концентрациях Ю'10 и 10'18 М форма липосом не изменена по сравнению с контролем. Что же может быть причиной таких существенных изменений, как в свойствах ПМ, так и липосом под действием ФК в СМД, когда концентрация активного веществе в системе ничтожно мала?

В качестве одного из механизмов эффекта БАВ в СМД ряд авторов рассматривают передачу информации через водную систему. Было установлено, что влияние на биологические мембраны некоторых БАВ в области СМД коррелировало со свойствами их водных растворов в инфракрасной области спектра (Жерновков, 2007); при использовании растворов а-ТФ в вазелиновым масле эффект препарата в СМД

исчезал (Белов, 2011). В некоторых работах (Pollack, 2001; Zheng, 2009) развиваются представления о наличии у гидрофильных поверхностей и частиц, в качестве которых могут рассматриваться и мембраны, толстых "приповерхностных" слоев воды (~200 мкм), отличающихся от "объемной" воды по вязкости, плотности, диэлектрической проницаемости, электропроводности. В свою очередь, академиком Коноваловым А.И. с соавторами обнаружено, что многие БАВ в СМД образуют в водных растворах наноассоциаты размером около 200 нм, которые также могут выступать в роли гидрофильных поверхностех (Рыжкина, 2010-2013). Концентрационные зависимости размеров наноассоциатов и удельной электропроводности растворов имеют полимодальный характер и взаимосвязаны. В нашей совместной работе с Коноваловым А.И. и его сотрудниками было установлено (Пальмина, 2009), что, действительно, изменение удельной электропроводности растворов ФК в зависимости от степени их разбавления представляет собой кривую с двумя максимумами: в области 10~9 Ми 10",3-10~16 М, которые разделены областью снижения измеряемого параметра в интервале трех порядков концентраций. Для дозовых зависимостей изменения жесткости в ПМ и липосомах и удельной электропроводности растворов ФК в области сверхмалых доз Ю-12—Ю-18 М, получены достоверные корреляции между этими показателями в ПМ (г = 0.738, р = 0.05) и липосомах (г=0,705, р= 0,076).

В области СМД Ю',5-Ю"20 М наблюдается высокая корреляция между средним диаметром ассоциатов ФК в водных растворах и их влиянием на микровязкость глубоколежащих областей ПМ (г = 0,932, р = 0,047) и липосом (г = 0,831, р = 0,092). Этот факт также позволяет предполагать взаимосвязь между свойствами образующихся в разбавленных водных растворах ФК структур и их влиянием на состояние мембран.

Таким образом, в результате проделанной работы были получены экспериментальные данные, позволяющие на примере ФК сделать важные выводы о возможных механизмах действия БАВ в СМД. Сведения об изменении физико-химических свойств биологических мембран и водной среды ставят новые вопросы и дают новый импульс для дальнейшего изучения этих сложных и во многом загадочных систем.

ВЫВОДЫ

1. Изучено действие синтетического антиоксиданта ФК в широком диапазоне концентраций (10"5-10'2G М) на структурные характеристики плазматических мембран клеток печени мышей in vitro и липосом, приготовленных из их липидных экстрактов. Установлено, что и для ПМ, и для липосом, характерны полимодальные дозовые зависимости эффектов ФК на жесткость поверхностных (~8 А) и микровязкость глубоколежащих (-20-22 А) областей липидного бислоя,

имеющие во многом аналогичный характер и типичные для БАБ, проявляющих активность в широком диапазоне концентраций, включающем СМД.

2. Показано, что полимодальность полученных дозовых зависимостей как в ПМ, так и в липосомах связана с наличием статистически достоверных эффектов ФК в трех областях концентраций, каждый из которых обусловлен преобладающим вкладом одного из возможных механизмов действия ФК. А именно:

а) в области традиционных «физиологических» концентраций ФК (10~5-10"9 М) -непосредственным и неспецифическим взаимодействием препарата с компонентами мембраны;

б) в области СМД ФК (10"13-10"19 М) изменения в структуре ПМ и липосом, по-видимому, обусловлены образованием в разбавленных растворах ФК «наноассоциатных» комплексов препарата и воды, причём максимум на кривой изменения «жёсткости» поверхностных слоев липидов в интервале концентраций (10"13-10"ls М) коррелирует с удельной электропроводностью этих растворов; а максимум на кривой изменения микровязкости липидов в интервале (10"'8-10"19 М) - с изменением диаметра «наноассоциатов».

3. Определены температурные зависимости вязкостных характеристик различных по глубине областей липидов ПМ и липосом. Обнаружено, что концентрации СМД ФК (10"14 М; 10"18 М), которым соответствовали максимумы на дозовых зависимостях при температуре 20°С, вызывают появление дополнительного термоиндуцированного структурного перехода в области физиологических температур (32-42 °С).

4. Установлено наличие аналогичных количественных (максимумы на дозовых кривых) и качественных (появление дополнительного термоиндуцированного перехода) изменений в структуре липидов при действии СМД ФК на ПМ и липосомы, свидетельствующее о том, что именно липиды являются мишенью действия ФК в этих концентрациях.

5. Обнаружена прямолинейная взаимосвязь между изменением под действием ФК параметра упорядоченности липидов в поверхностных областях липосом и их формой и размерами. Методами ДРС и АСМ показано увеличение гидродинамического диаметра липосом на 12-15% и переход от шарообразной к палочкообразной форме липосом под влиянием ФК в концентрациях, вызывающих максимальные изменения параметра упорядоченности S (10'6 М и 10"14 М).

6. Методом ДСК показано влияние ФК в СМД 10'14 М и 10"18 М на термолабильность белковой фракции ПМ, коррелирующее с изменениями в структурно -динамическом состоянии липидов мембран, индуцированными ФК: увеличение термостойкости белковых фракций на 1-4°С, а также (при действии 10"18 М)

снижение суммарной энтальпии и энтальпии отдельных переходов в 2 раза по сравнению с контролем.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Часовская Т.Е., Мальцева E.JI., Пальмина Н.П. Действие фенозана калия на структуру плазматических мембран клеток печени мышей in vitro // Биофизика. -2013. - Т.58. -№1. - С.97 - 105.

2. Часовская Т.Е., Плащина И.Г., Пальмина Н.П. Физико-химические изменения в липосомах, индуцированные низкими концентрациями синтетического антиоксиданта - фенозана калия // Доклады Академии Наук. - 2013. - Т. 449. - №6. - С. 673-677.

3. Пальмина Н.П., Часовская Т.Е., Белов В.В., Мальцева E.JI. Дозовые зависимости изменения микровязкости липидов биологических мембран, индуцированные синтетическим антиоксидантом фенозаном калия // Доклады Академии Наук. -2012. - Т.443. - №4. - С. 511-515.

4. Пальмина Н.П., Часовская Т.Е., Рыжкина И.С., Мургазина Л.И., Коновалов А.И. Водные растворы фенозана калия: влияние на структуру биологических мембран и электропроводность // Доклады Академии Наук. - 2009. - Т.429. - №1. - С. 128131.

5. Пальмина Н.П., Белов В.В., Часовская Т.Е., Жерновков В.Е., Мальцева Е.Л. Роль воды в эффекте биологически активных веществ в сверхнизких концентрациях // Тезисы Международной конференции «Структура воды: физические и биологические аспекты», Санкт-Петербург, - 2013,- С. 40-42.

6. Пальмина Н.П., Часовская Т.Е., Бинюков В.И., Плащина И.Г. Механизм действия синтетического антиоксиданта фенозана калия в сверхнизких концентрациях на поверхностные области липидов плазматических мембран // Труды VI международного конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине». - 2012. - С. 84-97.

7. Palmina N., Chasovskaya Т. Modification of lipid domains in liver plasmatic membranes by phenosan potassium salt in a wide concentration range in vitro // Chemistry and Physics of Lipids. - 2009. - V.160. - SI. - P. 19.

8. Palmina N., Chasovskaya Т., Binyukov V. Changes in structure of microdomains of liposomes under the effect of synthetic antioxidant in a wide concentration range // European Journal of Lipid Science and Technology. - 2011. - V.133. - SI. - P. 56.

9. Chasovskaya Т., Binyukov V., Palmina N. Changes in structure of microdomains of liposomes under the effect of synthetic antioxidant in a wide concentration range // Chemistry and Physics of Lipids. - 2011. - V. 164. - N.7. - P. 48.

10. Palmina N.P., Chasovskaya Т.Е., Binukov V.I., Plaschina I.G. Modification of rigidity of surface areas, size and shape of liposomes by potassium phenosan // Book of Abstracts of 10th Euro Fed Lipid Congress. Cracow. Poland. - 2012. - P.275.

11. Часовская Т.Е., Пальмина Н.П. Модификация структуры плазматических мембран синтетическим антиоксидантом // Сборник тезисов докладов всероссийской конференции с международным участием «Спектроскопия и томография электронного парамагнитного резонанса в химии и биологии». - 2011. - С. 224.

12. Часовская Т.Е., Пальмина Н.П. Влияние фенозана калия на структуру плазматических мембран in vitro // Сборник тезисов докладов всероссийской молодежной конференции «Успехи химической физики». - 2011. - С. 215-216.

13. Часовская Т.Е., Пальмина Н.П. Механизмы действия фенозана калия в сверхмалых дозах // Труды X Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН- ВУЗЫ «Биохимическая физика». - 2010. - С. 254-258.

14. Часовская Т.Е., Пальмина Н.П. Влияние фенозана калия в широком диапазоне концентраций на структуру плазматических мембран клеток печени in vitro // Труды IX Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗЫ «Биохимическая физика». - 2009. - С. 263-264.

15. Балясина Т.Е. (Часовская), Баранников С.П., Белов В.В., Пальмина Н.П. Исследование влияния фенозана калия на микровязкость липидной компоненты плазматических и микросомальных мембран клеток печени in vitro // Труды VII Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗЫ «Биохимическая физика». - 2007. - С. 18-20.

16. Балясина Т.Е. (Часовская), Баранников С.П., Белов В.В., Пальмина Н.П. О влиянии фенозана калия в широком интервале концентраций на микровязкость липидной компоненты плазматических и микросомальных мембран клеток печени in vitro // Труды 50-й Всероссийской молодежной научной конференции с международным участием Московского физико-технического института «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук». Секция биохимической физики. - 2007. - С. 27-29.

Подписано в печать: 15.05.2013 Тираж: 100 экз. Заказ № 975 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Часовская, Татьяна Евгеньевна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики имени Н.М. Эмануэля Российской академии наук

На правах рукописи

04201364829

ЧАСОВСКАЯ ТАТЬЯНА ЕВГЕНЬЕВНА

МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ФЕНОЗАНА КАЛИЯ В СВЕРХМАЛЫХ ДОЗАХ НА ПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ IN VITRO

03.01.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель профессор, доктор биологических наук Пальмина Надежда Павловна

Москва - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....................................................................................6

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................7

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................15

1.1. Действие биологически активных веществ в сверхмалых дозах -перспективная область исследований.................................................................15

1.1.1. Основные закономерности действия биологически активных веществ в сверхмалых дозах..........................................................................18

1.1.2. Роль рецепторных взаимодействий в механизме действия биологически активных веществ в сверхмалых дозах................................22

1.2. Особенности структуры жидкой воды, наноассоциатных комплексов БАВ и их роль в механизме действия биологически активных веществ в сверхмалых дозах..................................................................................................26

1.2.1. Структура жидкой воды.......................................................................27

1.2.2. Роль воды в эффектах сверхмалых доз биологически активных веществ.............................................................................................................31

1.3. Биологические мембраны как мишень действия сверхнизких концентраций активных веществ........................................................................35

1.3.1. Состав и структура биомембран.........................................................35

1.3.2. Система регуляции пероксидного окисления липидов в биологических мембранах.............................................................................38

1.3.3. Влияние различных биологически активных веществ на регуляторные системы, сосредоточенные в биомембранах.......................40

1.4. Фенозан калия - вещество, проявляющее активность в сверхнизких

концентрациях.......................................................................................................42

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................................47

2.1. Методика приготовления растворов фенозана калия.................................47

2.2. Выделение плазматических мембран из клеток печени мышей...............47

2.3. Определение концентрации белка в мембранах.........................................49

2.4. Экстракция липидов из плазматических мембран.....................................49

2.5. Приготовление липосом из липидов методом озвучивания......................50

2.6. Применение метода спиновых зондов для изучения структурно-динамического состояния глубоколежащих областей липидов плазматических мембран и липосом...................................................................51

2.6.1. Измерение вязкостных характеристик различных областей липидного бислоя мембран при постоянной температуре.........................52

2.6.2. Определение положения термоиндуцированных структурных переходов в липидном бислое мембран и расчет эффективной энергии их активации.........................................................................................................55

2.7. Определение размеров липосом методом динамического лазерного светорассеяния.......................................................................................................59

2.8. Определение размеров и формы липосом методом атомно-силовой микроскопии..........................................................................................................61

2.9. Применение метода дифференциальной сканирующей калориметрии для исследования термодинамических характеристик плазматических мембран 62

2.10. Статистические методы обработки данных..............................................64

Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ

РЕЗУЛЬТАТОВ.....................................................................................................68

3.1. Влияние фенозана калия на структурное состояние липидов плазматических мембран клеток печени мышей in vitro..................................69

3.1.1. Влияние фенозана калия на состояние глубоколежащих областей (-20-22 А) липидного бислоя плазматических мембран в диапазоне концентраций 10"5-10"20 М при температуре 293 К.....................................70

3.1.2. Влияние фенозана калия в диапазоне концентраций Ю'5-Ю-20 М на анизотропию вращения зонда С\в в плазматических мембранах клеток печени мышей.................................................................................................74

3.1.3. Температурные зависимости времени вращательной корреляции xci зонда Ci6 и термоиндуцированные структурные переходы в глубоколежащих областях плазматических мембран в контроле и под

действием фенозана калия в концентрациях 10"6 М, 10'13 М и 10"18 М в диапазоне температур 285-315 К...................................................................75

3.1.4. Влияние фенозана калия на структуру поверхностных областей (~8 А) липидного бислоя плазматических мембран в диапазоне концентраций Ю"5-10'20 М при температуре 293 К...............................................................80

3.1.5. Температурные зависимости параметра упорядоченности Б зонда С5 и термоиндуцированные структурные переходы в поверхностных областях плазматических мембран в контроле и под действием фенозана калия в концентрациях 10"6 М, 10"7 М, 10"12 М, 10"14 М и 10'15 М в диапазоне температур 285-315 К...................................................................84

3.2. Влияние фенозана калия на термоиндуцированные структурные переходы в плазматических мембранах и их энтальпию, изученные методом дифференциальной сканирующей калориметрии............................................90

3.3. Влияние фенозана калия на структурно-динамические характеристики липосом, приготовленных из липидных экстрактов плазматических мембран клеток печени мышей...........................................................................................95

3.3.1. Изменение микровязкости глубоколежащих областей липидов липосом (-20-22 А) под действием фенозана калия в диапазоне

5 10

концентраций 10 -10 М при температуре 293 К.....................................96

3.3.2. Температурные зависимости микровязкости глубоколежащих слоев липосом в контроле и при действии фенозана калия в концентрациях 10'6 М; 10'12 М и 10'18 М.........................................................................................99

3.3.3. Изменение жесткости поверхностных областей (~8 А) липосом под действием фенозана калия в диапазоне концентраций 10"5-10"20 М при температуре 293 К.........................................................................................104

3.3.4. Температурные зависимости параметра упорядоченности приповерхностных областей липосом в контроле и при действии фенозана калия в концентрациях 10'6 М, 10"12 М и 10-14М......................107

3.4. Влияние фенозана калия в концентрациях 10"4-10"19 М на гидродинамический диаметр липосом, приготовленных из суммарных липидов плазматических мембран....................................................................111

3.5. Изменения формы и размеров липосом, приготовленных из суммарных липидов плазматических мембран, под действием различных концентраций

фенозана калия, изученные методом атомно-силовой микроскопии............115

Глава 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................119

ВЫВОДЫ.............................................................................................................130

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................132

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ACM - атомно-силовая микроскопия

а-ТФ - альфа-токоферол, витамин Е

БАВ - биологически активное вещество

ДРС - динамическое рассеяние света

ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия

Зонд С5 - 5-доксилстеариновая кислота

Зонд Ci6 - 16-доксилстеариновая кислота

РЖ - инфракрасный диапазон

ПК-С - протеинкиназа С

ПМ - плазматические мембраны

ПОЛ - пероксидное окисление липидов

СМД - сверхмалая доза

ТРГ - тиреотропин-рилизинг гормон, тиролиберин

ФК - фенозан калия, 3-3,5-дитретбутил-4-гидрокснфенил пропионат калия ФЛ - фосфолипид

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс ЭР - эндоплазматический ретикулум

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Действие биологически активных веществ (БАВ) в сверхмалых дозах (СМД, концентрациях ниже 10"13 М), впервые было открыто в 1980х годах. Однако, до сих пор не создано единой теории, объясняющей это явление. Эффекты СМД были обнаружены в экспериментах с веществами различной химической природы и биологического действия: гормонами, антиоксидантами, противоопухолевыми агентами, иммуномодуляторами и др. [1-8]. Уровень биологической организации систем, в которых наблюдалось действие СМД БАВ in vivo и in vitro, также весьма разнообразен - от макромолекул и клеточных структур, до целых организмов и популяций [1-8]. Однако возникновение эффекта при действии вещества в концентрациях ниже 10"13 М не удается объяснить с точки зрения классических представлений о лиганд-рецепторном взаимодействии, связать с какой-то определенной структурой вещества или ступенью биологической организации системы. До сих пор не создано единой теории, способной объяснить подобные явления. Тем не менее, накопленные за десятилетия экспериментальные данные позволили выявить ряд общих закономерностей, характерных для различных БАВ, проявляющих активность в СМД [2]. В первую очередь, это полимодальность зависимости доза-эффект, как правило, содержащей несколько максимумов, разделенных интервалами концентраций, при действии которых эффекта не наблюдается. Другой закономерностью является то, что при уменьшении концентрации некоторых БАВ происходит «расслоение» их свойств, когда сохраняется влияние, но исчезает побочное действие. Поразительным является тот факт, что многие БАВ в СМД могут оказывать существенное влияние на системы, в которых уже присутствует данное вещество в гораздо более высоких концентрациях. Также характерно то, что добавление БАВ с СМД может изменять чувствительность биологической системы к другим агентам.

Наличие общих закономерностей, возможно, связано с общностью критических мишеней БАВ. В качестве последних могут выступать плазматические мембраны (ПМ), поскольку в них сосредоточены важнейшие регуляторные системы, отвечающие за функционирование клетки. Это, во-первых, системы вторичных посредников (циклических нуклеотидов и фосфоинозитидного цикла), обладающие свойствами каскадного усиления сигнала при проведении его в клетку [9-12]. Во-вторых, это система регуляции пероксидного окисления липидов (ПОЛ) [13-15]. Важно отметить, что в силу своей общей локализации данные регуляторные системы влияют друг на друга [15-18], поэтому вещества, модифицирующие состояние одной из этих систем, могут индуцировать изменения и в других.

Ранее на основании подробных исследований на различных биологических мембранах было зафиксировано влияние СМД таких БАВ, как природный антиоксидант а-токоферол, пептид тиролиберин и форболовые эфиры, на основные параметры системы пероксидного окисления липидов (структура мембран, продукты окисления) [19-21], активность ключевых ферментов регуляторных систем, сосредоточенных в мембранах [22-24], и сделаны определённые заключения о механизмах действия этих агентов в СМД [15, 2528]. Все эти вещества природного происхождения, поэтому возникает вопрос о том, насколько выводы, сделанные для природных БАВ, справедливы для синтетических агентов.

Для ответа на него, с нашей точки зрения, в качестве исследуемого БАВ может быть выбран синтетический фенольный антиоксидант фенозан калия (3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил пропионат калия). Он способен существенным образом модифицировать процессы ПОЛ в мембранах [29, 30] и является суперактиватором ключевого фермента фосфоинозитидного цикла, протеинкиназы-С [31]. Различными авторами было показано, что ФК проявляет активность в СМД на целом ряде моделей как in vitro, так и in vivo [30, 32-37].

Следует отметить, что, несмотря на неоднократно высказываемые предположения о том, что именно биологические мембраны являются мишенью

действия БАВ в СМД, по-прежнему не ясно, какая компонента мембраны -белковая или липидная, изменяется в первую очередь. Многие авторы полагают, что для реализации эффекта СМД в исследуемой системе должны присутствовать суперафинные рецепторы данного вещества. Тем не менее, в литературе отсутствуют исследования о влиянии БАВ в СМД на липосомы, хотя для ответа на вопрос о «рецепторном» механизме эффекта СМД такие эксперименты являются ключевыми. Несомненно, проверка данной гипотезы весьма актуальна, а изучение влияния ФК в широком диапазоне концентраций на свойства липидной и белковой компонент ПМ, как в составе мембраны, так и отдельно от белков в виде липосом, приготовленных из суммарных липидов ПМ, даст возможность продвинуться дальше в понимании фундаментальных механизмов эффекта СМД.

Поэтому целью данной работы являлось выявление и сопоставление закономерностей влияния ФК в интервале концентраций 10"5-10-20 М на:

1) структуру различных липидных регионов ПМ клеток печени в экспериментах in vitro;

2) структурно-динамическое состояние, размеры и форму липосом, приготовленных из суммарных липидов данных мембран;

3) термодинамические характеристики белков в составе изучаемых мембран in vitro.

В задачи работы входило: 1) Изучение влияния ФК в концентрациях 10"5-10"20 М на микровязкость глубоколежащих областей (-20-22 А) и параметр упорядоченности поверхностных областей (-8 А) липидного бислоя ПМ и липосом, приготовленных из суммарных липидов ПМ, методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) с использованием в качестве парамагнитных зондов стабильных свободных радикалов 16- и 5-доксилстеариновых кислот, соответственно (Qe и С5), нитроксильные

фрагменты которых локализуются в указанных липидных областях, при постоянной температуре 283 К. Получение зависимостей доза-эффект.

2) Исследование влияния концентраций ФК, оказавших наибольший эффект на структурно-динамические параметры липидов, на положение, ширину и эффективную энергию активации термоиндуцированных структурных переходов в различных областях липидного бислоя мембран и липосом в диапазоне температур 285-315 К методом ЭПР.

3) Изучение действия ФК в концентрациях Ю*5-10"20 М на размеры и форму липосом, приготовленных из липидных экстрактов ПМ, методами динамического светорассеяния (ДРС) и атомно-силовой микроскопии (АСМ).

4) Определение изменений термодинамических характеристик суммарных белков, входящих в состав ПМ, индуцированных ФК в концентрациях, которым соответствовали максимумы и отсутствие влияния на липидную компоненту мембран методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК).

5) Выяснение роли физико-химических характеристик водных растворов ФК (размеров «наноассоциатов», удельной электропроводности растворов) в механизме обнаруженных эффектов сверхмалых концентраций ФК на структуру ПМ.

Научная новизна

В данной работе впервые показано, что синтетический АО ФК в широком диапазоне концентраций, включающем сверхмалые дозы (10"13-10'19 М), существенно модифицирует структурно-динамические параметры различных липидных регионов ПМ, выделенных из печени мышей, в экспериментах in vitro. При этом зависимость эффекта от дозы вводимого вещества имеет бимодальный характер с максимумами в интервале «физиологических» концентраций (10"5-10-7 М) и СМД, разделенными «мертвыми зонами», где эффект отсутствует. Принципиально дозовые зависимости для ФК не

отличаются от таковых, полученных для веществ природного происхождения, в частности а-токоферола [27]. Однако, в отличие от природного антиоксиданта, максимумы эффектов ФК в СМД в поверхностных и глубоколежащих областях липидов ПМ наблюдаются при действии разных концентраций препарата: (10"12-10' М) — в поверхностных; - в глубоколежащих.

Впервые обнаружено, что ФК в концентрациях, вызывающих максимальные изменения в параметрах микровязкости и упорядоченности липидной компоненты, индуцирует появление дополнительного термоиндуцированного структурного перехода липидов в области физиологических температур (40-42 °С).

Впервые показано, что эффект СМД сохраняется при полном отсутствии белков в системе, а именно, все закономерности, полученные на ПМ (характер дозовых зависимостей, положения максимумов на кривых, количество и положения температурных переходов) и липосомах, приготовленных из липидных экстрактов ПМ, полностью совпадают. Эти результаты позволяют полагать, что первичной мишенью действия ФК в СМД являются именно липиды и механизм этого феномена не связан с рецепторным взаимодействием.

Впервые установлено, что каждый из наблюдаемых максимумов на кривых доза-эффект обусловлен своим особым механизмом взаимодействия: максимумы на дозовых зависимостях в интервале относительно высоких концентраций ФК (10"5-10"7 М) обусловлены ограничением при упаковке углеводородных цепей липидов вблизи молекулы за счет его неспецифического встраивания в мембрану и взаимодействия с окружающими молекулами фосфолипидов (ФЛ); в области СМД - физико-химическими свойствами «наноассоциатов», образованных из молекул ФК и воды.

Основные научные положения, выносимые на защиту

1) ФК способен модифицировать структурно-динамическое состояние гидрофильных и гидрофобных липидных регионов ПМ как в «терапевтических» дозах (10'5-10"7 М), т