Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Денатуранты и стабилизаторы структуры белков

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Ковригин, Евгений Леонидович, Пущино

/

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БЕЛКА

На правах рукописи УДК 577.32

КОВРИГИН ЕВГЕНИЙ ЛЕОНИДОВИЧ

ДЕН АТУ РАНТЫ И СТАБИЛИЗАТОРЫ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ: АНАЛИЗ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОЙ СОЛЬВАТАЦИИ

03.00.03 - Молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: к.ф.-м.н. С. А. Потехин

Пущино - 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ б

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8

2.1 Явление предпочтительной сольватации как основа механизмов стабилизации/дестабилизации структуры белков в водных растворах с высоким содержанием неводной компоненты. 8

2.1.1 Предыстория вопроса 8

2.1.2 Термодинамический анализ влияния состава раствора на

равновесия (денатурационное, растворение и олигомеризация белков) И

2.1.2.1 Основные величины И

2.1.2.2 Связь между предпочтительными взаимодействиями и молекулярными контактами 14

2.1.3 Экспериментальные наблюдения 17

2.1.3.1 Выделение вкладов воды и добавки в предпочтительную сольватацию 18

2.1.3.2 Предпочтительная гидратация и стабилизация белков 19

2.1.3.3 Два основных типа предпочтительной гидратации 20

2.1.3.3.1 Первый тип: неспецифическое взаимодействие 21

2.1.3.3.2 Второй тип: специфическое взаимодействие 24

2.2 Стабилизация и денатурация: калориметрия и нетермодинамические

методы 26

2.2.1 Температурная зависимость стабильности белков в смешанных растворителях 26

2.2.1.1 Влияние малополярных органических добавок на термостабильность, энтальпию и скачок теплоемкости при денатурации. Предсказание температур схождения энтропии и энтальпии. 26

2.2.1.2 Влияние стабилизаторов на термодинамические параметры

денатурации. Скачок теплоемкости. Температуры схождения энтальпий. 32

2.2.1.3 Комбинированное использование денатурационных данных и

равновесного диализа 34

2.2.1.4 Стабилизация нативного свернутого состояния белка не обязательно требует от растворителя способности формировать упорядоченные кластеры

вокруг гидрофобных групп 38

2.2.1.5 Гипотетический эффект стабилизации белков при пониженных

температурах малыми концентрациями денатурантов 39

2.2.2 Структурные исследования белков в смешанных средах: возникновение ненативных лабильных конформаций белковой цепи 44

2.2.3 Белки в средах с низким содержанием воды. Ферментативная активность в смешанных средах 47 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 53

3.1 Реактивы 53

3.2 Приготовление буферных растворов с высоким содержанием

неводной компоненты 54

3.2.1 Буферные растворы 54

3.2.2 Измерение реального рН водно-органической смеси 54

3.2.3 Контроль состава раствора (рефрактометрия и гравиметрия) 56

3.3 Спектрофотометрическое определение концентрации белка в водно-органической смеси 56

3.4 Контроль мономолекулярности нативного состояния белка 57

3.5 Сканирующая микрокалориметрия 57 3.5.1 Оборудование и подготовка препаратов 57 3-5.2 Экспериментальые проблемы, вызванные высоким содержанием неводной компоненты 58

3.5.3 Первичная обработка термограмм тепловой денатурации 59

3.5.4 Обработка результатов экспериментов методом наименьших квадратов 60

3.6 Методы расчета основных термодинамических функций

стабилизации нативной структуры лизоцима 61

3.6.1 Выбор уравнений для подгонки экспериментальных значений температуры и энтальпии 61

3.6.2 Аналитические уравнения для энтропии и свободной энергии стабилизации структуры, поглощения протонов и скачка сольватации при переходе из нативного в денатурированное

состояние 62

3.7 Измерение давления насыщенного пара над водными растворами органических веществ 63

3.7.1 Аппарат для измерения давления паров 63

3.7.2 Вычисление парциального давления водяного пара 65

3.7.3 Вычисление коэффициентов активности 65

ЗЛА Температурная зависимость коэффициентов активности 67

3.7.5 Измерения парциальной удельной энтальпии воды в растворах полиспиртов 68

3.8 Расчет скачка предпочтительной сольватации при температурах тепловой денатурации на основе денатурационных данных 69

4. РЕЗУЛЬТАТЫ 71

4.1 Исследование стабилизирующего влияния полиспиртов 71

4.1.1 Исследование активности воды в растворах полиспиртов 71

4.1.2 Расчет скачка предпочтительной сольватации при тепловой денатурации лизоцима в растворах полиспиртов 74

4.2 Исследование дестабилизирующего эффекта органических неионных

денату рантов 77

4.2.1 Исследование тепловой денатурации лизоцима методом сканирующей калориметрии 77

4.2.2 Расчет активности компонентов в растворах ряда органических неионных соединений 84

4.2.3 Расчет изменения предпочтительной сольватации 86

4.3 Исследование тепловой денатурации лизоцима в растворах

ацетонитрила методом сканирующей калориметрии 89

4.3.1 Контроль кинетики денатурации 90

4.3.2 Результаты сканирующей калориметрии 91

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 95

5.1 Термодинамика влияния стабилизирущих добавок на лизоцим 95

5.2 Термодинамика влияния денатурирующих добавок на лизоцим 98

5.2.1 Корелляция скачка предпочтительной сольватации при денатурации лизоцима в водных растворах ряда негомологичных органических соединений с их активностью 98

5.2.2 Различие зависимостей денату рационного скачка сольватации лизоцима в растворах ДМ С О и других рассмотренных соединений 100

5.3 Температурная зависимость термодинамических параметров

стабилизации лизоцима в смешанном растворителе 101

5.3.1 Энтальпия разворачивания 102

5.3.2 Термодинамическая стабильность лизоцима в водных растворах

МеСЫ 103

5.3.3 Поглощение протонов при разворачивании 106

5.3.4 Скачок предпочтительной сольватации (разность между

нативным и денатурированным состоянием белка) 107

5.3.5 Противоречия, возникающие при моделировании взаимодействия смешанного растворителя с поверхностью лизоцима 108

6. ВЫВОДЫ 111

7. БЛАГОДАРНОСТИ 112

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 113

1. ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время проблема предсказания влияния сложного растворного окружения на стабильность и конформационную подвижность белковых макромолекул является одним из весьма актуальных вопросов физики белка. Растворное окружение белков in vivo представляет собой сложную среду, состоящую из множества специфических и неспецифических лигандов (в число которых входит и вода), взаимодействующих с белковой поверхностью. В связи с этим, возникает насущная необходимость научиться количественно предсказывать влияние денатурирующих и стабилизирующих добавок на белки в водных растворах. Решение этой задачи даст возможность a priori оценивать стабильность белков в реальном многокомпонентном окружении в условиях как нормальных, так и стрессовых.

Кроме того, одним из плодотворных и многообещающих направлений энзимологии является использование многокомпонентных сред для проведения ферментативного катализа. Необходимость использования различных растворных добавок здесь обусловлена возможностью управления специфичностью и скоростями катализа, что делает многие ферментные системы реально применимыми в биотехнологии. Будучи одним из критически значимых факторов для осуществления каталитической функции, стабильность ферментов в применяемых смешанных растворителях до сих лор количественно не оценивалась и выбор сред для катализа ведется практически методом "проб и ошибок". Разработка количественных представлений о стабилизации белков в присутствии растворных добавок различной природы способна стимулировать прогресс в этой важной области исследований.

Диссертация посвящена изучению параметров стабилизации третичной структуры лизоцима куриного яйца в водных растворах ряда веществ, которые оказывают как стабилизирующее, так и денатурирующее действие на белок. Лизоцим был избран как наиболее удобный объект для такого рода исследования, поскольку это относительно небольшой, хорошо растворимый белок, процесс разворачивания которого близок к механизму "все-или-ничего" во всех практически изученных условиях. Термодинамика стабилизации этого белка в водных растворах и растворах солей, мочевины и гуанидин гидрохлорида достаточно подробно изучена, что формирует хорошую базу для исследования механизмов

взаимодействия белковой поверхности с ко-растворителями менее полярной природы. Выбор веществ, влияние которых на лизоцим изучалось в данной диссертации, был обусловлен как практической важностью данных ко-растворителей с точки зрения молекулярной биологии и ферментативного катализа, так и интересами физической химии белков. В диссертации были исследованы и проанализированы параметры стабилизации лизоцима в растворах следующих веществ: (1) денатурантов - ацетон, диоксан, диметилсульфоксид, ацетонитрил, метанол, этанол, пропанол; (2) стабилизаторов: этиленгликоль, глицерин, мезо-эритрит, ксилит, сорбит, мезо-инозит.

Полученные результаты позволяют

(1) сделать предположения о возможном общем механизме действия ряда органических неионных денатурантов,

(2) критически пересмотреть существующую гипотезу относительно стабилизации белков в присутствии полиспиртов,

(3) впервые подтвердить существовавшую ранее гипотезу о возможности стабилизации структуры белка малыми концентрациями органического неионного денатуранта при низких температурах.

Диссертация состоит из двух основных частей. Первая - Обзор Литературы посвящена рассмотрению текущего состояния проблем связанных со стабильностью, структурой и функцией белков в смешанных средах. Вторая часть, -экспериментальная, включает в себя описание материалов и методов использованных и разработанных в диссертации, результаты работы и их обсуждение.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Белки в растворах стабилизаторов и денатурантов

2.1 Явление предпочтительной сольватации как основа механизмов стабилизации / дестабилизации структуры белков в водных растворах с высоким содержанием неводной компоненты.

2.1.1 Предыстория вопроса

На протяжении большей части этого столетия общепринятой практикой среди биологов и биохимиков при выделении биологически активных компонентов клетки или выделении органелл было (и остается) добавление высоких концентрации сахарозы (до 1М) или глицерина (до 10%) к препарату, чтобы сохранить и стабилизировать его активность. Точно также, общепринятой практикой при выделении ферментов и других белков было использование высоких концентрации солей (1-4М), чаще всего сульфата аммония, а также органических растворителей (этанола, ацетона), для осаждения белков (высаливание). И, наконец, исследователям было известно, что высокие концентрации мочевины (8М) или гидрохлорида гуанидина (GuHCl) (6М) приводят к денатурации белков, то есть к потере биохимической активности и к сильным изменениям свойств раствора. Последнее интерпретировалось как следствие разворачивания нативной структуры белка.

Механизмы высаливания и денатурации изучаются уже в течение более чем 50 лет; результаты этих работ суммированы в нескольких больших обзорах (Brandts, 1969; Kauzmann, 1959; Расе, 1986; Tanford, 1968, 1970; Timasheff 1992а,b, 1993, 1998; Baldwin, 1996). Явление высаливания изучалось как с теоретической, так и с экспериментальной точек зрения, и было проанализировано еще в классической монографии Кона и Эдсола (Cohn and Edsall, 1943). Эффект солей на белки рассматривался как состоящий из двух противоположных явлений:

"всаливания", то есть увеличения растворимости белка за счет Дебай-Хюккелевского экранирования при низкой концентрации соли, и "высаливания" -при более высокой концентрации (значение ионной силы больше 1). Было установлено, что процесс высаливания линейно связан с ионной силой, при этом, численной характеристикой этого процесса является константа высаливания Ks, определяемая как наклон зависимости логарифма растворимости белка от ионной силы.

В случае денатурации белков мочевиной или GuHCl исследователи давно поняли, что процесс разворачивания сопровождается прямым взаимодействием (связыванием) денатуранта с молекулой белка. В результате детальных работ с модельными соединениями Танфорд показал (Tanford, 1964, 1970), что эффект мочевины и GuHCl на процесс разворачивания белка определяется изменениями свободной энергии при переносе нативного белка и денатурированного белка из воды в раствор денатуранта, то есть возникает за счет свободной энергии взаимодействия денатуранта с белковыми группами, которые экспонирутся в растворитель при разворачивании. Недавние работы Махатадзе и Привалова (Makhatadze and Privalov, 1995), группы Мерфи (Zou et al., 1998) и других показали, что взаимодействие мочевины и GuHCl с белковой цепью основано, главным образом, на образовании водородных связей с пептидными группами, причем мочевина образует две таких связи, a GuHCl - четыре (Makhatadze and Privalov, 1995).

Явление стабилизации белков сахарозой, глицерином и родственными им веществами привлекало мало интереса, так как в этом случае с белком ничего не происходит. Первоначально существовало туманное предположение, что эти вещества образуют некоторого рода защитное покрытие - оболочку, которая удерживает белок от разворачивания, однако до начала девяностых годов никаких экспериментальных данных на этот счет не существовало. Усилиями группы Тимашеффа было показано (Gekko and Timasheff, 1981а; Lee and Timasheff, 1981), что справедливо в точности обратное: эти вещества не только не формируют никакой оболочки вокруг белка, но и даже исключаются из непосредственной близости к белковой поверхности, что приводит к обогащению сольватной оболочки белка водой (по сравнению с основной массой раствора).

Взаимодействие белков в растворах с менее полярными неионными веществами (спирты, органические растворители и т.д.) интенсивно изучалось в

основном в ключе их денатурирующей способности. Влияние этих веществ на белки объяснялось, в основном, с позиций взаимодейсвия неполярной части молекулы добавки с неполярными группами белка, экспонирующимися при денатурации. Этот класс веществ представляет для нас наибольший интерес, так как механизм их взаимодействия изучен наименее полно; к его детальному рассмотрению мы перейдем несколько позже.

Несмотря на то, что все эти явления кажутся на первый взгляд несвязанными между собой, они имеют одно общее основное свойство: денатурация, стабилизация и высаливание - все они требуют высоких концентраций добавляемого агента (1-8 М). Поэтому, какова бы ни была природа участвующих взаимодействий - они не являются ни сильными, ни специфическими, и попадают таким образом, в область термодинамики слабо взаимодействующих систем. В действительности, недавние систематические работы по взаимодействиям растворимых белков с агентами, вызывающими стабилизацию белковой структуры, осаждение белка из раствора и процессы специфической ассоциации, показали, что во все эти явления вовлечен один и тот же набор слабых взаимодействий (Arakawa et al., 1990а,b). Эти явления могут быть описаны в терминах термодинамической теории трехкомпонентных растворов, в которой вода учитывается явным образом (Cassassa and Eisenberg, 1964; Kirkwood and Goldberg, 1950; Stockmayer, 1950). Оказалось, что все добавки, вызывающие выпадение в осадок и само-ассоциацию - предпочтительно исключаются из сольватной сферы белка (Arakawa et al., 1990а,b). Считалось также, что денатурантами являются те вещества, которые предпочтительно связываются с поверхностью белка (Inoue and Timasheff, 1968; Noelken and Timasheff, 1967; Reisler at al., 1977). Однако, позднее исследователи поняли, что стабилизация белковой структуры связана более сложным образом со связыванием/исключением добавленного агента, а именно: здесь имеет значение разность в степени связывания/исключения добавки между денатурированным и нативным состоянием белка (Arakawa et al., 1990b,с). Сейчас уже совершенно ясно, что стабилизация, денатурация и высаливание есть лишь частные случаи единого термодинамического явления, предпочтительного взаимодействия белков с компонентами раствора (Timasheff, 1993). По-видимому, стабилизаторы (сахара, полиспирты и т.п.) и денатуранты (мочевина, GuHCl, спирты и т.п.) формируют континуум, в котором наблюдается непрерывный переход от агентов, усиливающих

нативную третичную структуру белка, до агентов, эффективно ее разворачивающих. То же самое верно и для эффекта добавок на растворимость белков. Действие добавленного вещества, будь это стабилизация/дестабилизация структуры, осаждение/растворение белка, определяется только балансом сродства белка к воде и к данному веществу; причем это сродство может варьировать от сильного предпочтения к воде до сильного предпочтения (связывания) к добавленному агенту.

Рассматриваемые взаимодействия и процессы оказываются широко распространены в природе. Живая клетка защищается от замерзания или осмотического шока накоплением некоторых веществ внутри себя в очень высоких (>1М) концентрациях. Удивительно, как оказался мал выбор веществ, которые используются для этой цели организмами от единичных клеток до амфибий и высших растений (Уапэеу е! а1., 1982). Эти вещества, известные как осмолиты или криопротекторы, принадлежат, почти все без исключения, к ря�