Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конформационные изменения молекулярного шаперона GroEL в растворе

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Конформационные изменения молекулярного шаперона GroEL в растворе"

Ни правах рукописи УДК =577.322

Сурин Алексей Константинович

КОНФОРМЛЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО ШАПЕРОНА ОгоИ. В РАСТВОРЕ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Иутино - 1996 г.

Работа выполнена в Институте белка РАН Научный руководитель:

доктор физико-математических наук Г.В. Сеиисотнов

доктор физико-математических наук Н.Н Хечинашвили

кандидат бпоюгических наук В.Н. Ксензенко

Филиал Института биоорганической химии РАН, г. Пущино

Защита состоится 'У' -''- 1 1996 г. в ^ часов

/

на заседании диссертационного совета Д 200.22.01 Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292 г. Пущино, ИТЭБ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ.

Автореферат разослан У у " / >• / -/ 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

-Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Первые опыты по ренатурации белка (рибонуклеазы) in vitro, проведенные Анфинсеном более 30 лет назад позволили предположить, что вся информация необходимая для приобретения белком уникальной структуры хранится в его первичной последовательности. Позднее это было подтверждено на ряде других белков. Однако в последнее время появляется все больше фактов, свидетельствующих о том, что не все белки способны приобретать жесткую структуру без помощи внешних помощников. Около 20-и лет назад было открыто семейство белков, названных шаперонами, которые связывают ненативные конформации белковых цепей и промотируют их сворачивание как in v/'vo, так и in vitro. Это явилось одним из существенных аргументов, ставящих под сомнение основной принцип самоорганизации белков, утверждающий, что вся необходимая и достаточная информация для сворачивания белка заложена в его аминокислотной последовательности. Именно это обстоятельство вызвало повышеный интерес к исследованию физико-химических свойств шаперонов.

Одним из наиболее интенсивно исследуемых представителей семейства шаперонов является белок теплового шока GroEL иэ E.coli. Способность GroEL пррмотировать правильное сворачивание других белков делает привлекательным его использование в биотехнологии для реактивации вновь синтезируемых белков из "тел включения", образование которых часто сопровождает экспрессию генов в чужеродных клетках. Сложная олигомерная организация структуры GroEL, наличие целого ряда субстратов, участвующих в осуществлении его функции, затрудняет выяснение механизма его участия в процессе сворачивания белков. В этой связи возникает ряд вопросов, ответы на которые могут внести ясность во взаимосвязь функции GroEL с его структурной организацией. К таким вопросам относятся, в частности, выяснение стабильности и конформационной подвижности GroEL по отношению к изменению условий внешней среды (температуры, рН, концентрации денатурантов) и наличию субстратов, выяснение природы внутримолекулярных взаимодействий, стабилизирующих внутри- и межсубъединичную структуру GroEL. Определение диапазонов изменения внешних условий, при которых GroEL сохраняет свою структуру и функцию, является важным для использования GroEL в реактивации вновь синтезируемых белков из "тел включения", которые обычно растворяются при экстремальных внешних условиях (экстремальные рН и концентрации денатурантов).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование изменения кокформации и стабильности ОгоЕЬ в растворе при изменении условий внешней среды (присутствие функционально важных субстратов, изменение температуры, рН и концентрации денатурантов).

Научная новизна. Впервые подробно исследована устойчивость структуры ОгоЕЬ в широком интервале изменения внешних условий (концентрации денатуранта, рН раствора и температуры) и показано наличие широкомасштабных конформационных изменений ОгоЕЬ при его связывании с субстратами.

Практическая ценность. Проведенные в работе исследования с одной стороны позволяют приблизиться к пониманию природы субстрат-зависимого функционирования ОгоЕЬ как молекулярного шаперона, участвующего в процессе созревания белков в клетке, а с другой стороны представляют интерес с точки зрения использования ОгоЕЬ в биотехнологии при реактивации вновь синтезированных белков из "тел включения", часто образующихся при суперэкспрессии генетического материала в чужеродных клетках.

Апробация работы и публикации. Основные результаты работы докладовались на ежегодных научных конференциях Института белка РАН (1994, 1995, 1996). По теме диссертации опубликовано три работы, и одна принята к печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения,_глав,

заключения, выводов и списка цитируемой литературы(из _наименований).

Работу иллюстрируют_рисунка и_таблицы, общий объем

диссертации_страниц.

II СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение

- Согласно данным электронной микроскопии и последним данным рентгеноструктурного анализа, ОгоЕЬ представляет собой олигомерную частицу, состоящую из 14 идентичных субъединиц с молекулярным весом около 60 кДа каждая. Субединицы организованы в два стекинюванных гептамерных кольца, образуя тороид с внешним диаметром 137 А, внутренним диаметром 45 А и толщиной 146 А. Внутри кольцевых структур электронная плотность резко

понижена. Это дает основание считать, что олигомерная структура GroEL имеет обширную полость, в которой, как предполагается, и происходит связывание ненативной молекулы белка. Кроме того, GroEL является слабой АТФ-азой. Установлено, что наиболее эффективно GroEL осуществляет свою функцию в присутствии его субстратов ADP, АТР, белкового ко-шаперона GroES (состоящего из 7 субъединиц с молекулярным весом 10 кДа каждая, организованных в кольцевую структуру) и ионов К+ и Mg++. Кроме того эти субстраты также участвуют и в эффективной сборке самой GroEL частицы из его мономерной формы.

Выделение и реактивация белков суперпродуцентов из тел включения обычно связаны с использованием экстремальных условий окружающей среды (высокие концентрации денатуранта, экстремальные значения рН и температуры). Использование GroEL с целью повышения выхода нативных белков при их реактивации из тел включения сталкивается с необходимостью знать диапазоны внешних условий, в которых GroEL сохраняет свои структурные и функциональные свойства. Эту информацию можно получить изучая денатурационные конформационные переходы белка. Кроме того, изучение этих переходов является одним из способов исследования механизма самоорганизации-самого GroEL, и природы внутримолекулярных взаимодействий, стабилизирующих различные уровни структурной организации белка.

2.1. Денатурациоиные конформационные изменения GroEL.

2.1.1. Денатурация повышением температуры. На рисунке 1 представлена зависимость эллиптичности белка на длине волны 220 нм от температуры. Видно, что повышение температуры выше 330 К приводит к резкому уменьшению амплитуды, что свидетельствует об уменьшении содержания вторичной структуры, т.е. о тепловой денатурации белка. Этот процесс заканчивается по достижении 350 К. Оценка температуры полуперехода дает температуру 340 К. Температурное плавление GroEL на сканирующем калориметре характеризуется пиком теплопоглощения в достаточно узком диапазоне температур с максимумом при 340 К (рис.2). Однако, температурное плавление GroEL является необратимым процессом, т.е. повторное плавление белка (рис.2) не сопровождается кооперативным теплопоглощением, характеризующим наличие жесткой третичной структуры (таким образом, жесткая третичная структура при

Температура (К)

Рис. 1. Температурная зависимость значения элиптичности на 220 нм для СгоЕЬ. Концентрация белка 0.3 мг/мл. Точка полуперехода ~ 340 К. 50 мМ НЕРЕБ, рН 7.5.

Рис.2.

Температурные зависимости удельной теплоемкости ОгоЕ!,. (1) - 50 мМ НЕРЕБ, рН 7.5; (2) - повторное плавление образца (1). Концентрация белка 1.8 мг/мл.

320 340

Температура (К)

360

понижении температуры после температурной денатурации не восстанавливается). Эти обстоятельство существенно осложняет анализ и трактовку кривых зависимостей Ср от температуры. Такая необратимость температурных переходов наблюдается достаточно часто, особенно в случае субъединичных глобулярных белков, что обычно объясняют межмолекулярной ассоциацией "расплавленных"

конформаций белка. Тем не менее, плавное изменение постденатурационной части кривой зависимости теплоемкости от температуры и совпадение температур полу перехода, измеренных различными мтодами (КД и сканирующей калориметрией) при различных концентрациях белка, дает возможность предположить, что вклад ассоциации в динамику изменения теплоемкости при увеличении температуры невелик. Рассчет из кривой калориметрического плавления (рис.2.) каллориметрической (АН™1) и эффективой (ДН'ФФ) энтальпий дает 16300 и 720 кДж/моль соответственно. Таким образом, отношение калориметрической энтальпии на мономерную субъединицу к эффективной энтальпии - квг (коэффициент Вант-Гоффа) составляет 1.6, что позволяет предполагать, что процесс тепловой денатурации белка представляет собой плавление более одного термодинамического блока в расчете на субъединицу.

2.1.2. рН зависимые денатурационные переходы. Исследование рН зависимых кон форма ционных переходов в белках позволяет оценить роль электростатических взаимодействий в стабилизации различных уровней структурной организации белков. На рис.3 представлена зависимость АТФ-азной активности ОгоЕЬ от рН раствора, которая определялась как прирост пирофосфата при ОгоЕЬ-зависимом гидролизе АТФ до АДФ и пирофосфата.

.о

1.0

.5

.5

.о

10

образцы инкубировались в течение 30 мин при 23°С. Выход АТФ-азной реакции определялся как прирост пирофосфата при гидролизе АТФ на АДФ и пирофосфат.

Рис,3. Зависимость АТФ-азной активности GroEL от pH среды. Для каждого измерения приготовлялись растворы на основе буферной системы: 50 мМ фосфатный буфер, 100 мМ KCl, 10 мМ Mg-ацеат. Все

pH

Видно, что эта зависимость является достаточно сложной и характеризуется несколькими выраженными участками. В диапазоне рН от 7.0 до 8.0 АТФ-азная активность СгоЕЬ остается неизменной резко увеличиваясь в интервале рН от 8 до 9.2 и практически исчезает в диапазонах рН от 7.0 до 5.8 и от 9.2 до 9.7. Однако, уменьшение АТФ-азной активности при изменении рН от 9.2 до 9.7 и от 7.0 до5.8 не является следствием денатурации белка. На это указывает неизменность спектров КД в дальней и ближней УФ областях (рис.4а и 46, соответственно) и наличие пика на кривой калоримерического плавления белка при рН 5.6 и 9.6 (рис.5). Кроме того, в указанных инервалах рН белок сохраняет свою олигомерную структуру, о чем свидетельствует отсутствие уменьшения интенсивности светорассеяния (не показано).

Рис. '4. Спектры кругового дихроизма СгоЕЬ. (а) - спектры КД в дальне! ультрофиолетовой области: 1 - рН 9.8; 2 - рН 7.5; 3 - рН 5.5; 4 - рН 4.1; 5 - рН 3.5; 6 - ] присутствие 4.5 молей мочевины, (б) -спектры КД в ближней ультрофиолетово: области: 1 - рН 9.8; 2 - рН 7.5; 3 - рН 5.5; 4 - в присутствие 4.5 молей мочевины Растворы приготовлялись на основе 50 мМ фосфатного буфера содержащего 100 м\ КС1, ЮмМ 1^-ацетат.

Рис.5. Температурные зависимости удельной теплоемкости GroEL при различных рН раствора. (I) - рН 9.6; (2) - рН 7.5; (3) - рН 5.6; (4) - рН 2.5 (аналогично для рН 3.1, рН3.5 и рН 3.8). Растворы приготовлялись на основе 50 mM HEPES, 100 гаМ КС!. 10 гпМ Mg-ацетат.

320 330 340

Температура (К)

1 .5

Э 10

S °-5

и о

Рис.6. Зависимость интенсивности флуоресценции АНС в присутствии GroEL от рН раствора. Отношение [AHC]/[GroEL]=50/l, концентрация белка - 0.02 мг/мл Флуоресценция возбуждалась при ,г,=390 нм и регистрировалась при ЯРсг=460 нм.

0.0

4 6 S 10

рН

На рис. 6 представлено изменение интенсивности флуоресценции гидрофобного зонда 8-Анилинонафталин-1-сульфоновая кислота (АНС) (характеризующей степень экспонированности гидрофобных кластеров белка на растворитель) в присутствии ОгоЕЬ от рН раствора. Видно, что в области рН от 5.5 до 10.0 не происходит существенного изменения в степени экспонированности гидрофобных кластеров белка на растворитель. Дальнейшее понижение рН от 5.5 до 2.5 сопровождается резким увеличением сродства гидрофобного зонда к ОгоЕЬ -интенсивность флуоресценции АНС увеличивается практически на порядок относительно нейтральных рН (рис. 6). Это свидетельствует об утере белком жесткой третичной структуры и увеличении степени экспонированности гидрофобных кластеров ОгоЕЬ на растворитель в этом интервале рН. Отсутствие жесткой третичной структуры ОгоЕЬ при низких рН (2.7; 3.0; 3.5; 3.8) подтверждается и отсутствием выраженного пика на кривых зависимости теплоемкости от температуры (рис. 5). Тем не менее, кислая форма белка характеризуется значительным содержанием вторичной структуры (рис. 4а). Вышеприведенные свойства характерны для белков, находящихся в состоянии "расплавленной глобулы". Вместе с тем, интенсивность светорассеяния ОгоЕЬ в "кислой" области рН существенно не уменьшается по сравнению с нейтральными рН (не показано), что свидетельствует о том, что, несмотря на разрушение жесткой третичной структуры белка в кислой области рН не происходит распад олигомерной частицы ОгоЕЬ на мономерные субъединицы.

Таким образом, установлено, что в диапазоне рН от 5.7 до 9.7 олигомерная частица ОгоЕЬ не претерпевает существенных внутрисубъединичных конформационных изменений и сохраняет жесткость третичной структуры. Сложное поведение АТФ-азной активности в этом интервале рН связано, по-видимому, с титрованием аминокислотных остатков ОгоЕЬ, входящих в активный центр или находящихся в непосредственной близости от него. Ими предположительно могут быть гистидиновые, цистеиновые и лизиновые остатки, рКа которых в белках (рК=6.5 + 7.0 - гистидин, рК=8.5 + 8.8 - цистеин, рК=9.8 10.2 - лизин) находятся в районе точек полупереходов изменения АТФ-азной активности ОгоЕЬ (рН 1/2=6.3, рН]/2=8.7 и рНш=9.5). Заметим, что важность цистеиновых остатков для осуществления АТФ-азной реакции ОгоЕЬ отмечалась в литературе ранее.

2.1.3. Денатурация мочевиной. Исследования денатурационных переходов с использованием таких денатурантов, как мочевина позволяет получать информацию о степени кооперативности структурной организации белка, стабильности различных уровней организации белковой молекулы и выявить возможные промежуточные состояния на пути сворачивания.

На рис. 7 представлены нормированные кривые зависимостей АТФ-азной активности, эллиптичности на 220 нм и интенсивности светорассеяния ОгоЕЬ от концентрации мочевины. Параметр Рк соответствует доле нативных молекул и определяется формулой:

где/- текущее значение параметра, а/и й' /.,- - значения данного параметра для денатурированного и нативного состояний, соответственно. Хорошо видно, что вплоть до концентрации мочевины 2.5 моля отсутствует заметное уменьшение АТФ-азной активности, интенсивности светорассеяния и амплитуды спектра КД в области поглощения пепдных связей, что свидетельствует о сохранении нативной структуры белка в этом интервале концентраций денатуранта. Дальнейшее увеличение концентрации мочевины инициирует резкий денатурационный переход, который полностью завершается при достижении концентрации мочевины 4.0 моля. Из рис; 7 видно также, что рассеяние света, АТФ-азная

FN=(f-fü)/(fN-fv) ,

зависимости А - АТФ-азной активности, О - величины элиптичности на 220 пт, □ -

Рис.7. Нормированные

величины

.5

О

рассеяние света на 330 пт от концентрации мочевины.

А

Все растворы приготовлялись на

о.о

|—| основе 50 шМ Na-фосфэт, pH 7.5, 100 mM К.С1, 10 тМ Mg-ацетат. Белок инкубировался 30 6 минут при 23°С.

0 1 2 3 4 5

[Мочевина] (моль)

активность белка и уменьшение амплитуды спектра КД в дальней УФ области изменяются симбатно по мере возрастания концентрации денатуранта после 2.5 М. Это свидетельствует о том, что разрушение олигомерной, третичной и вторичной структур происходят одновременно. Очень узкий интервал концентраций мочевины и Б-образный характер уменьшения параметра Им свидетельствует о высокой степени кооперативности структурной организации ОгоЕЬ при данных экспериментальных условиях.

2.2. Субстрат-зависимые конформационные изменения вгоЕЬ.

Функционирование ОгоЕЬ как молекулярного шаперона сопряжено с его взаимодействием с рядом субстратов: АТФ, АДФ, ионами К+ и и белковым ко-шапероном ОгоЕБ. Исследование взаимодействий ОгоЕЬ с субстратами является одним из приорететных напрвлений в области выяснения механизма работы ОгоЕЬ как молекулярного шаперона.

2.2.1. Влияние субстратов на термостабильность СгоЕЬ. На рисунке 8 представлены температурные зависимости удельных теплоемкостей ОгоЕЬ в отсутствии и присутствии различных комбинаций субстратов. Анализ кривых зависимостей теплоемкостей от температуры при этих условиях позволяет оценить значения термодинамических величин этого процесса. Оценочные рассчеты калориметрических и эффктивных этальий, температур денатурации и коэффициентов Вант-Гоффа приведены в таблице 1. Видно, что разброс соотетствующих энальпий не превышает 20 % и укладывается в погрешность подсчета этих величин. Однако величины температур денатурации (соответствующие положению максимумов пиков на кривых плавления) имеют различия,превышающие ошибку экперимента.

Приутствие ионов К+ и увеличивает температуру денатурации ОгоЕЬ на 3 градуса. Наличие же АДФ наоборот уменьшает температуру денатурации ОгоЕЬ.

Белок ОгоЕБ является высокомолекулярным белковым кофактором ОгоЕЬ. Его присутствие в реакционной смеси повышает выход нативной конформации при

Таблица 1. Термодинамические характеристики ОгоЕЬи его комплексов с субстатами.

ОгоЕЬ СгоЕБ ионы К+ ЛИ1« Тл Квг

АДФ (кД ж/моль) (кДж/моль) (К.)

+ — — — 16300 720 340 1.6

+ — + — 16000 700 343 1.6

- + + + 1200 610 349 -

+ — + + 18000 760 339 1.7

+ + + + 19000 790 342 1.7

Рис.8. Температурные зависимости удельной теплоемкости ОгоЕЬ. (1) - 50 тМ НЕРЕБ, рН 7.5; (2) - 50 шМ НЕРЕ5, 100 тМ КС!, 10 шМ ацетат, рН 7.5; (3) - 50 шМ НЕРЕБ, 100 шМ КС1, 10 шМ \Ig-anerai, 2 мМ АДФ, рН 7.5; (4) - 50 тМ НЕРЕЭ, 100 тМ КС1, 10 тМ Mg-aцeтaт, 2 мМ АДФ, СгоЕБ, рН 7.5; отношение молярных концентраций СгоЕ1Л)гоЕ8 составляло 1:1.

СгоЕЬ-ассистируемом сворачивании некоторых белков. Известно, что в присутствии низкомолекулярных субстратов (АДФ и ионов К* и образуется устойчивый

комплекс ОгоЕ1^*СгоЕБ в соотношении 1:1. На рисунке 8 представлена зависимость удельной теплоемкости от температу ры для вгоБЬ в присутствии низкомолекулярных субстратов и СгоЕБ. Значительная разница в молекулярных весах этих белков, значениях калориметрических энтальпий и температур

денатурации (таблица 1) позволяет пренебречь вкладом вгоЕЗ при анализе кривой плавления комплекса ОгоЕЬ*СгоЕ8. Видно, что кривая калориметрического плавления сдвигается в сторону более высоких температур по сравнению с кривой для комплекса СгоЕЬ с АДФ при практически неизменном значении калориметрической энтальпии (таблица 1). Таким образом образование межмолекулярного комплекса ОгоЕЬ*ОгоЕ5 в присутствии Л^-АДФ стабилизирует структуру СгоЕЬ относительно действия температуры.

2.2.2. Влияние субстратов на скорость протеолитической деградации вгоЕЪ.

Доступность белка протеазе при ограниченном протеолизе является еще одним тестом на структурные перестройки и динамику белка в растворе. Для исследования влияния субстратов СгоЕЬ на скорость его протеолитической деградации в качестве протеазы был использован трипсин при соотношении молярных концентраций трипсин : СгоЕЬ = 1 : 50. Кинетики ограниченного трипсинолиза представлены на рис. 9. Хорошо видно, что в отсутствие субстратов, при использованых условиях

12 3 4

СгоЕЬ (а)

Рис. 9. Ограниченный трилсинолиз молекулярного шаперона ОгоЕЬ и его комплексов с различными субстратами. Молярное отношение трипсин : ОгоЕЬ= 1 : 5. Через каждые 30 сек из реакционной смеси извлекалась часть образца и после ингибирования действия протеазы анализировалась БОБ-электрофорезом -в полиакриламидном геле. Время прошедшее с момента добавления протеазы до ингибирования ее действия: 1 - 30 сек, 2-60 сек, 3-90 сек, 4-120 сек. Стрелкой (4-) указаны фрагменты которые были просиквенированы.

1234 12 3 4 1234

СгоЕЬ*АДФ СгоЕЬ*АТФ СгоЕЬ'С.гоЕв

*АДФ

(б) (в) (с)

эксперимента, СгоЕЬ устойчив к действию протеазы (рис. 9а). Вместе с тем, добавление АТФ или АДФ (рис. 96, 9в) приводит к существенному увеличению скорости протеолиза, что свидетельствует о неких структурных перестройках в белке или об увеличении его конформационной подвижности, приводящих к увеличению доступности протеазе. Образование комплекса СгоЕЬ*СгоЕ5 в присутствии Мц-АДФ существенным обазом не изменяет кинетику деградации комплекса СгоЕЬ *АДФ. Кинетика ограниченного протеолиза СгоЕЬ в присутствии субстратов характеризуется накоплением двух фрагментов с молекулярным весом ~ 30 кДа, устойчивых к действию протеазы. Больший (указанный на рисунке 9) фрагмент был идентифицирован по сиквенсу >Г-концевых аминокислотных остатков. Им оказался Ы-концевой фрагмент белка начиная с 268 аминокислотного остатка. Таким образом, можно заключить, что в основном С-концевая часть белка дестабилизируется по отношению к действию протеазы в комплексе СгоЕЬ с нуклеотидами.

2.2.5. Влияние субстратов на степень жспонированности гидрофобных кластеров СгоЕЬ на растворитель. В настоящее время метод связывания гидрофобного зонда широко используеся в качесве теста на структурные перестройки в белках, сопровождаемые изменениями степени экспонированности гидрофобных кластеров на растворитель. Методом Скетчерда по данным прямого и обратного титрования было определено количество молекул АНС связанных с олигомерной частицей СгоЕЬ в свободном состоянии и в комплексе с АДФ и СгоЕБ. Эти данные приведены в таблице 2.

Таблица 2.

СгоЕЬ Субстраты колличество связанного АНС на молекулу белка

К+ и Мк*+ АДФ СгоЕБ

+ + — — 4

+ — + — 12

— — — + 1

+ + + + 12

Видно, что присутстие ионов К+ и Mg++ не изменяет количество молекул АНС связываемых с одной молекулой СгоЕЬ. Однако присутствие АДФ приводит к

заметному увеличению количества связанных молекул АНС, вследствие увеличения экспонированности гидрофобных кластеров белка на растворитель. Вместе с тем, образование комплекса ОгоЕЬ*СгоЕ8 в присутствии АДФ не приводит к изменению числа молекул АНС, связанных с молекулой ОгоЕЬ в присутствии АДФ. Таким образом данные по связыванию гидрофобного зонда подтверждают результаты ограниченного протеолиза и свидетельствуют о наличии структурных изменений олигомерной частицы ОгоЕЬ при ее связывании с нуклеотидами.

ВЫВОДЫ

1. Молекулярный шаперон СгоЕЬ сохраняет свои основные структурные характеристики в интервалах концентраций мочевины до 2.5 М при 23°С и рН 7.5, температуры до 57°С и рН от 5.6 до 9.8.

2. Зависимость АТФ-азной активности СгоЕЬ от рН характеризуется наличием плато в интервале рН от 7.0 до 8.0, трехкратным увеличением в интервале рН от 8.0 до 9.2 (рНиг = 8.7) и падением до нуля в интервалах рН от 7.0 до 5.8 (рНш = 6.3) и от 9.2 до 9.8 (рНт= 9.5).

3. Связывание АДФ дестабилизирует структуру ОгоЕЬ по отношению к действию температуры и трипсина, а также приводит к трехкратному увеличению мест связывания гидрофобного зонда - АНС, что свидетельствует о наличии АДФ-зависимых внутрисубъединичных конформационных изменений ОгоЕЬ.

4. Взаимодействие ОгоЕЬ с ОгоЕБ в присутствии АДФ приводит к повышению температуры тепловой денатурации (на 3 °С), не внося заметных изменений в доступность ОгоЕЬ протеазе и гидрофобному зонду.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. A.K. Surin, I.A. Kashparov, H. Kihara, N.V. Kotova, V.D. Marchenkov, S.Y. Marchenkova, B.S. Melnik, A.A. Timchenko, G.U. Semisotnov - Nucleotide action on the stability,and conformation of chaperonin, GroEL/ES . 2nd Workshop "Principles of Protein Architecture" Waseda University, Internat. Convention Center 1-6-1, Nishiwaseda, Shinjuku-ku, Tokyo Dec. 12-13, 1995, p. 165.

2. A.K. Surin, I.V. Sokolovsky, S.Y. Marchenkova, N.V. Kotova, N.A. Rodionova, S.Y. Yaklichkin, G.V. Semisotnov - Urea and pH induced denaturing transitions of the molecular chaperonin GroEL. 2nd Workshop "Principles of Protein Architecture" Waseda University, Internat. Convention Center 1-6-1, Nishiwaseda, Shinjuku-ku, Tokyo Dec. 1213, 1995, p. 166.

3. A.A. Timchenko, H. Kihara, N.V. Kotova, V.P. Kutyshenko, B.S. Melnik, A.K. Surin, G.V. Semisotnov - Conformation and stability of the co-chaperonin GroES. 2nd Workshop "Principles of Protein Architecture" Waseda University, Internat. Convention Center 1-6-1, Nishiwaseda, Shinjuku-ku, Tokyo Dec. 12-13, 1995, p. 167.

4. A.K. Сурин, И.В. Соколовский, H.A. Родионова, H.B. Котова, С.Ю. Марченкова, С.Ю. Якличкин, Г.В. Семисотнов. Денатурационные переходы молекулярного шаперонина GroEL из E.coli. Биоорганическая химия, 1996, в печати.