Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Частично свернутое состояние лизоцима с развитой вторичной структурой вводно-органической смеси

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Частично свернутое состояние лизоцима с развитой вторичной структурой вводно-органической смеси"

На правах рукописи УДК 577. 322.7

СТРУКТУРОЙ В ВОДНО-ОРГАНИЧЕСКОЙ СМЕСИ

03. 00. 02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 1996

Работа выполнена в Институте белка РАН, г. Пущино НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

Кандидат физико-математических наук С. А. Потехин Доктор физико-математических наук Г. В. Семисотнов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор физико-математических наук В. П. Кутышенко Доктор биологических наук В.И.Лим

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт биофизики клетки РАН

Зашита диссертации состоится «¿Г» Q.¡ljl(¿A*% 1996 г. в/ь часов на заседании диссертационного совета Д. 200. 22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292, г. Пущино Московской области, проспект Науки, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Формирование белковых молекул происходит в два этапа: биосинтез соответствующей аминокислотной последовательности и самосборка биологически активной пространственной структуры. Факт спонтанной саморганизации функционально активной белковой структуры делает изучение сворачивания белков одной из важных задач физики белка.

Экспериментальное исследование самоорганизации белка включает в себя два основных подхода: равновесный и кинетический. Равновесный подход заключается в том, чтобы «выключать» часть молекулярных взаимодействий, поддерживающих нативную структуру белка, и анализировать конформационное состояние, которое при этом реализуется. Такое «выключение» части внутримолекулярных взаимодействий достигается постепенным изменением внешних условий (состава растворителя, температуры, рН среды и т.д.). Исследователи, используя равновесный подход, обратили внимание, что на пути разворачивания белковых молекул накапливаются конформационные состояния, промежуточные между нативной и полностью развернутой конформацией. Такие состояния получили названия «частично свернутых».

Было показано, что добавление низкомолекулярных спиртов способно индуцировать образование промежуточных состояний убиквитина, рибонуклеазы А и ряда других белков. Обнаружено, что для лизоцима куриного яйца в трифторэтаноле реализуется частично свернутое состояние, по свойствам аналогичное раннему интермедиату, наблюдаемому при изучении кинетики сворачивания лизоцима.

Кроется ли причина стабилизации промежуточных состояний белков спиртами в свойствах растворителей этого класса, или она заключена в изменении свойств раствора общего характера, например, уменьшении диэлектрической проницаемости среды? Чтобы ответить на вышеуказанный вопрос, необходимо применять растворители другого класса, например сульфоксидов. В данной работе был выбран апротонный растворитель - диметилсульфоксид (ОМЭО), который в отличие от спиртов не образует сети водородных связей с водой и белком.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состоит в том, чтобы найти условия, где промежуточный интермедиат лизоцима мог бы стабилизироваться, и изучить его различными методами, способными с разных точек зрения охарактеризовать его форму,

размеры, компактность, а также возможную его ассоциацию. При этом решались следующие задачи:

- изучение процесса денатурации лизоцима, индуцированного DMSO;

- подбор условий, где могло бы стабилизироваться частично свернутое состояние лизоцима;

- подбор методов, способных охарактеризовать частично свернутое состояние с разных точек зрения.

Научная новизна работы. Показано, что денатурация лизоцима, индуцированная диметилсульфоксидом, приводит к появлению частично свернутой конформации с высокой степенью спиральности, сравнимой с таковой для нативного белка. DMSO стабилизирует спиральные конформации в восстановленном карбоксиметилированном лизоциме, а также в коротких пептидах, полученных. путем трипсинолиза лизоцима. Обнаружено, что лизоцим при высоких концентрациях DMSO существует преимущественно в димерной форме.

Практическая значимость работы. Примененные в работе методы дают возможность характеризовать конфоркацию молекул в составе ассоциатов, что открывает перспективу их более широкого применения в области белковой самоорганизации.

Апробация работы. Материалы исследований представлены на II Международной конференции "Principles of Protein Architecture" (Университет Васеда, Токио, Япония, 1995), на научной конференции Института белка РАН (Пушино, 1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы (2 статьи и тезисы) и 1 статья принята в печать. Структура и объем диссертации. Диссертация включает в себя четыре основные части: «введение», «литературный обзор», «экспериментальная часть», «результаты и обсуждение»; завершается выводами и списком литературы. Работа изложена на 103 страницах, включает 4 таблицы и иллюстрирована 28 рисунками, содержит 118 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Лизоцим куриного яйца был дополнительно дважды перекристаллизован. Чистоту препарата проверяли электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия при рН 8. 3 по методу Лэмли. Количество примесей не превышало 5%. В экспериментах использовали DMSO фирмы Serva (ФРГ).

Концентрацию белка в водных растворах измеряли спектрофотометрически с использованием коэффициента поглощения

IX

лизоцима А - 26. 7 для водного раствора. Коэффициенты

поглощения лизоцима при различных концентрациях ОМЭО определяли из светопоглощения растворов, полученных путем добавления необходимого количества ОМЗО к водному раствору белка с известной концентрацией.

Исчерпывающий трипсинолиз лизоцима проводили в 0. 1 М аммонийбикарбонатном буфере, рН 8. 0, при 37°С в течение 4 ч. Весовое соотношение фермент/субстрат составляло 1/50. Реакцию останавливали добавлением 10 мМ фенилметилсульфонилфторида. Степень гидролиза контролировалась электрофорезом в поли-акриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Калориметрические измерения проводили на сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4А (НПО «Биоприбор», Пущино), с объемом ячейки 0. 46 мл и скоростью сканирования 1 К/мин при избыточном давлении 2. 4 атм. Парциальный объем белка полагали равным О. 72 см3/г.

Дисперсию оптического вращения (ДОВ) измеряли на поляриметре Регкл.п-Е1тег-141 (США) при 25°С и концентрации белка 8-10 мг/мл. Длина оптического пути в ячейке равнялась 100 мм. Объем ячейки -1 мл. Результаты обрабатывали, используя уравнение Моффита-Янга.

Собственную флуоресценцию измеряли на коррекционном спектрофлуориметре Апипсо БРЕ-ЮОСБ (США) при 23°С и концентрации белка 0.1-0.3 мг/мл. Длина оптического пути в ячейке составляла 10 мм.

Измерения динамического рассеяния света (ДРС) проводились на спектрофотометре, подробно описанном в работе (Тимченко и др., 1988), при температуре 20±0. 2°С. Мощность лазера - 100-200 мкт. Относительная экспериментальная ошибка измерения составляла О.1-0. 3'/.. Обработку данных проводили с помощью программы «Некорректность», созданной в Институте белка РАН.

Измерения нейтронного рассеяния проводили на установке ЮМО (ОИЯИ, Дубна), подробно описанной в работе (БегсЗуик, 1995). Время эксперимента составляло 12 ч. Рассеяние измеряли в диапазоне величин переданного импульса Э=0»01-0.2 А.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии было исследовано влияние диметилсульфоксида на структуру лизоцима. Эксперименты проводились в широкой области концентраций водного ОМЭО при рН 2.3.

На рис. 1 показана зависимость парциальной молярной теплоемкости лизоцима от температуры при разных концентрациях

т.к

Рис. 1. Кривые зависимости парциальной молярной теплоемкости от температуры для лизоцима в водных растворах DMSO: 1 - 0%, 2 - 20%, 3 - 40%, 4 - 58% DMSO.

DMSO. Наличие пика теплопоглощения свидетельствует о разрушении жесткой третичной структуры. Отношение калориметрической к энтальпии Вант-Гоффа равно 1. Это означает, что разрушение третичной структуры лизоцима происходит по принципу «все или ничего» («two state»), то есть без каких-либо промежуточных состояний. При концентрациях водного DMSO выше BOY. никаких пиков теплопоглощения, которые могли бы быть отнесены к плавлению третичной структуры лизоцима, не наблюдается. Во всех случаях денатурация лизоцима в DMSO была полностью обратимой, на что указывало совпадение кривых теплопоглощения при первом и последующих прогревах. Данные суммированы в таблице 1.

Таблица 1

V. DMSO рН 2.5 Тш , ° С Нт, КДЖ/МОЛЬ

0 58 450

20 53 450

40 42 330

55 32 110

58 27 100

Таким образом, обнаружено, что ОМБО оказывает в целом дестабилизирующее действие на третичную структуру лизоцима.

Метод КД оказался неприменимым ввиду сильного поглощения ОМБО в информативной области спектра (А<300 нм). Для контроля за уровнем вторичной структуры использовали метод ДОБ. Чтобы выяснить, при какой концентрации ОМБО происходит конформационный переход у лизоцима, была исследована зависимость параметра Ьо (уравнение Моффита- Янга) от концентрации ОМБО при рН 2.5. Известно, что абсолютная величина этого параметра прямо пропорциональна степени спиральности белков, а сам параметр Ь>о может быть использован для наблюдения за изменением уровня вторичной структуры белков как в водных, так и в органических растворителях. На рис. 2 приведены результаты этих экспериментов. Наблюдаемое монотонное уменьшение Ьо в диапазоне концентраций ОМБО 0-40% вряд ли связано с какими-либо существенными конформационными изменениями белка и отражает зависимость параметра Ьо от внешних условий для данной структуры. Далее, в области 40-60'/. ОМБО, происходит конформационный переход, сопровождающийся существенными изменениями структурных параметров лизоцима. При концентрации ЮМБО выше 60% и комнатной температуре лизоцим находится в денатурированном состоянии. Следует обратить внимание на то, что денатурация, индуцированная ОМБО, происходит

-100

-150

-200

-250

[ОМЭО], % (У/У)

Рис.2. Зависимость параметра Моффита-Янга (Ь ) для лизоцима от концентрации ОМБО при рН 2. 5 и 25°С.

с увеличением абсолютной величины bQ, а, следовательно, с увеличением степени спиральности лизоцима.

Исследована также зависимость параметра bQ от концентрации DMSO для смеси коротких пептидов, полученных путем трипсинолиза лизоцима. При концентрациях 10-40 % DMSO степень спиральности коротких пептидов составила 9%, а при 60-70% DMSO - 12%, в отличие от водного раствора, где у коротких пептидов спиральность составила 5%.

Измерение параметра bQ для восстановленного и карбоксимети-лированного лизоцима в водном растворе ( 10 мМ глициновый буфер рН 2. 5) и в 70'/. водном DMSO показало, что DMSO способно стабилизировать в таком лизоцине спиральные участки. Так, в водном растворе такой лизоцим имеет всего 6% спиральности, а 70% - уже 13%.

Чтобы оценить влияние электростатических взаимодействий на спиральность структуры денатурированного DMSO лизоцима, была получена зависимость степени спиральности от рН среды при двух температурах (20 и 70°С) в растворе 70% водного DMSO (рис.3). При комнатной температуре влияние рН на структуру оказывается существенным, хотя повышение температуры нейтрализует этот эффект. Следовательно, появление заряженных групп стабилизирует спиральные участки. Столь высокая степень спиральности денатурированного диметилсульфоксидом лизоцима вызвана, скорее

-50 -100 -150

о -О

-200

-250 -300

2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 РН

Рис.,3. Зависимость параметра Моффита-Янга (Ь ) для лизоцима в 70% DMSO от рН при 25 (1) и 70 С (2).

всего, уменьшением диэлектрической проницаемости среды и, как следствие, усилением дипольных взаимодействий пептидных связей с зарядами соседних боковых групп.

Принципиально важной характеристикой белка в

денатурированном состоянии является его компактность и степень гидратированности его боковых групп. Эти параметры отражают роль дальних взаимодействий в поддержании данной частично структурированной конформации. Чтобы выяснить, насколько подвижны и доступны растворителю боковые группы в денатурированном лизоциме, была исследована флуоресценция триптофанов лизоцима'при разных концентрациях ОНЭО в отсутствии и присутствии акриламида -тушителя флуоресценции.

На рис.4 приведены результаты этих экспериментов в виде зависимостей отношения интенсивностей при двух длинах волн (г320/ I ) от концентрации ИМБО. Там же дана эта зависимость для смеси

3 8 0

коротких пептидов, полученных трипсинолизом лизоцима. Размеры триптофансодержащих пептидов малы (не более 22 остатков, согласно оценке, сделанной на основании расположения аргининов и лизинов в аминокислотной последовательности белка), что исключает экранирование триптофанов в пептидах от растворителя. Вплоть до 40У. ЭМБО, для лизоцима наблюдается небольшой- рост отношения

[ОМБО], % [Ч/Ч)

Рис.4. Зависимость отношения интенсивностей собственной флуоресценции триптофанов лизоцима (1) и продуктов его трипсинолиза (2) при длинах волн 320 и 380 нм от концентрации ОМБО.

интенсивностей вследствие уменьшения полярности растворителя. Как и в случае с использованием ДОВ (рис.2), конформационный переход фиксируется в области 40-607. ОМБО. При дальнейшем повышении концентрации ОМБО отношения интенсивностей флуоресценции для лизоцима и продуктов его трипсинолиза практически совпадают. Это означает отсутствие компактной структуры в белке.

На рис. 5 приведена зависимость отношения интенсивностей при двух длинах волн (I „„/ !,„„) от концентрации ЮМБО для лизоцима и

3 20 3 8 0

продуктов его трипсинолиза в присутствии акриламида. В области концентраций 40-60У. фиксируется конформационный переход, как и в случае без акриламида и в экспериментах ДОВ. Повышение концентрации ОМБО приводит к совпадению отношения интенсивностей флуоресценции для лизоцима и коротких пептидов.

Следовательно, в присутствии БМБО молекула лизоцима переходит в состояние, где подвижность и доступность хромофоров не отличается от их подвижности и доступности в коротких пептидах.

[йМБО], % {Ч/Ч)

Рис. 5. Зависимость эффективности тушения акриламидом собственной флуоресценции триптофанов лизоцима (1) и продуктов его трипсинолиза (2) от концентрации ОМБО.

В 70'/» БИБО при рН 2.0 и достаточно высоких концентрациях белка (>1%) наблюдается эффект, указывающий на наличие достаточно сильных межмолекулярных взаимодействий. Измеряя параметр

Моффита-Янга к>о в таком растворе, обнаружили, что через определенное характерное время инкубации (более 10 ч. при рН 2.0) он приобретает положительное значение, что указывает на установление в растворе некоего порядка. Эффект может быть в значительной степени устранен прогреванием препарата (рис.6) или повышением рН среды.

Т (°С)

Рис.6. Зависимость параметра Моффита-Янга (Ь ) от температуры для пизоцима в 70% DMSO, рН 2.0.

Выявление межмолекулярных взаимодействий лизоцима в эастворах DKSO ставит вопрос количественного описания ассоциации иолекул белка и получения структурных характеристик для реальной конформации белковой молекулы.

Количественный анализ дисперсности растворов лизоцима в DMS0 5ыл проведен методом лазерной корреляционной спектроскопии. Этот юдход позволяет получить распределение частиц по размерам, уценить средние размеры и получить информацию о молекулярной •facce объекта (имеется в виду средневесовой молекулярный вес тстиц). Вычисляемая нормированная корреляционная функция первого торядка G(t) для смеси частиц представляется следующей суммой:

G(1) (t) = J а^ехр(-D.q t),

-де a - доля рассеянного излучения i-oro компонента, обладающего <оэффициентом поступательной диффузии D, q - модуль вектора

рассеяния.

Получая из разложения корреляционной функции коэффициент диффузии о и измерив вязкость растворителя Т), можно вычислить гидродинамический радиус, используя соотношение Эйнштейна-Стокса

I* = —

_кт__

бйт)5~

Для частиц с размерами, много меньшими длины волны видимого света можно вычислить молекулярную массу (так называемый средневесовой молекулярный вес).

Были исследованы растворы лизоцима в 25% йМЗО, где белок нативен, в 58У. ОМБО, что соответствует середине конформационного перехода и в 70'/. ОМБО, что соответствует последенатурационной области. Поскольку при рН 2.5 молекула лизоцима заряжена, то растворы белка в ОНЭО готовились таким образом, чтобы радиус Дебая-Хюккеля г - (с/у)0'5 был практически таким же, как и в отсутствие ШБО (с - относительная диэлектрическая проницаемость среды, г - ионная сила раствора), а также, чтобы концентрация белка во всех растворах была примерно постоянна и составляла 10 мг/мл. Данные суммированы в таблице 2.

Таблица 2

ОМБО

И/К» М/Мт

0%

1.0±0.1

1.0±0.3

25%

58%

1.0±0.1

1.0±0.3

2.3 + 0. 1

2.1±0.3

70%

2.4+0.1

2.4+0.3

Если предположить, что увеличение гидродинамических размеро! обусловлено димеризацией глобулярных мономеров белка, то, аппроксимируя мономер шаром, на основе теории Кирквуда-Райзман; (Кантор & Шимнел, 1984), легко вычислить, что гидродинамически! размеры димера всего в 1. 33 раза выше, чем у мономера. В случа* же трикеров эта величина не превышает 1. 7. Поэтому наблюдаемо! более чем вдвое увеличение гидродинамических размеров частиц ОМБО свидетельствует о неглобулярности молекулы лизоцима в эти: условиях.

Таким образом, уже на середине конформационного переход молекула лизоцина обнаруживает тенденцию к димеризации,

енатурированный диметилсульфоксидом лизоцим существует реимущественно в димерной форме. Наблюдаемая димеризация ероятнее всего есть результат взаимодействия гидрофобных ластеров молекулы, экспонирумых при разворачивании. Чтобы олучить более точные сведения о конформации молекулы лизоцима в оставе димера был использован метод малоуглового рассеяния ейтронов на малых углах. Использование этого метода может дать нформацию о компактности и форме молекул лизоцима енатурированного DMSO. Использование для этих целей ентгеновских лучей оказалось невозможным из-за их сильного оглощения диметилсульфоксидом.

Были исследованы растворы лизоцима в последенатурационной бласти при объемной концентрации DMSO 70% и рН 2.5. Растворы риготавливались с учетом тех же требований, что и при спользовании метода ЛКС. Концентрация белка во всех растворах ыла примерно постоянна и составляла 20 мг/мл.

Как известно, из малоугловой части кривой рассеяния можно олучить сведения о средних размерах объекта и его молекулярной ассе. На рис, 7 приведена малоугловая часть кривой рассеяния, остроенная в координатах Гинье (Kratky, 1982). В таких оординатах кривая рассеяния в начальной своей области редставляет собой прямую линию, тангенс угла наклона которой оставляет -R2/3, где R^ - радиус инерции частицы, а из начальной рдинаты можно вычислить молекулярную массу. Это можно сделать, спользуя следующие соотношения (Yeager, 1976):

I(S) = I(o)-exp[-(S2R2)/3] , где

(S) - интенсивность рассеяния нейтронов;

- вектор рассеяния (или иначе - величина переданного импульса); ; - радиус инерции частицы;

(о) - значение интенсивности, экстраполированное к нулевому углу.

I (о) связано с молекулярной массой белка следующим ыражением:

I(o)/c = k (р - ps) 2 v2 М/ N, : - инструментальный фактор;

i - плотность рассеяния излучения раствором белка; >s - плотность рассеяния излучения растворителя; 2- парциальный удельный объем белка;

I - молекулярная масса белка (средневесовой молекулярный вес); I - число Авогадро; с - концентрация белка.

Оказалось, что средняя молекулярная масса в (2.3±0.2) раз« превосходят массу нативного белка, а значение Rg наблюдаемых 1 растворе частиц равно 35±1 А. В то *е время значение Rg нативногс лизоцима составляет 14.6 X, а полностью развернутого лизоцима -27 X (Тимченко и др., 1983). Если считать, что лизоцим в 70% DMSC существует в димерной форме я' размеры мономеров близки к размерах нативной молекулы (исходя из сведений о средней молекулярно« массе), легко получить, что радиус инерции димера будет равен 23 X, что существенно меньше наблюдаемой величины Rg- 35 I. И только в случае линейного тримера величина Rg будет близка к наблюдаемо« величине и составит 33 X. Но эта модель не проходит как на основании данных по молекулярной массе, так и данных по гидродинамическим размерам, о чем говорилость выше.. Все это свидетельствует о том, что молекула лизоцима имеет развернутую конформацию и находится преимущественно в димерной форме.

Более детальную информацию о конформации частиц можно получить из кривой рассеяния, измеренной в широком диапазоне величин переданного импульса S. На рисунке 8 приведена кривая рассеяния лизоцима в 70'/. DMSO (кривая 1, показанная точками), построенная в координатах Кратки I(S)-S2 от S. Характерной особенностью этого графика является наличие обширного плато для

5.0

S2(A>I0-

Рис.7. Малоугловая часть кривой рассеяния нейтронов для лизоцима в 70% DMSO, постороенная в координатах Гинье.

5>0.04 Â"1 с небольшим спадом. Появление плато на кривой рассеяния является свидетельством неупорядоченности структуры белка (Kratky, 1982). Отрицательный наклон у плато указывает на отличие конформациимолекулы от таковой для идеального Гауссова клубка. Для сравнения на этом же рисунке изображена кривая рассеяния от кристаллической структуры лизоцина, (кривая 2, дана сплошной линией) рассчитанная методом кубиков (Pavlov.S Fedorov, 1983) .

Таким образом, совокупность полученных данных показывает, что при высоких концентрациях DMSO (70%) молекула лизоцима находится преимущественно в димерной форме. Мономер в составе димера приобретает частично развернутую конформацию с размерами существенно большими, чем у нативной молекулы, и развитой вторичной структурой со степенью спиральности, близкой таковой для нативного белка. Следует подчеркнуть, что примененные здесь методы дают уникальную возможность характеристики конформации молекул в составе ассоциатов, что открывает перспективу применения этих методов в области белковой самоорганизации.

4.0

сп

2.0

...... •••• ' . .

..... • ..

0.1

0.2

о-|

Б. А

Рис.8. Кривая рассеяния нейтронов для лизоцима в 70% ОМБО при рН 2.5, посторенная в координатах Кратки (1), индикатрисса рассеяния кристаллической структуры лизоцима (2) (1-52 от Б, где I интенсивность рассеяния, Б - модуль вектора рассеяния).

выводы

1. DMSO в водной растворе приводит к дестабилизации структуры лизоцима, и этот эффект возрастает с ростом концентрации DMSO. Одной из причин существования спиральной конформации в денатурированном лизоциме в присутствии DMSO является понижение диэлектрической проницаемости среды. Аналогичное заключение можно сделать для препаратов карбоксиметилированного лизоцима и коротких пептидов, полученных путей трипсинолиза лизоцииа.

2. По критериям доступности собственных хромофоров интактного лизоцима растворителю и их подвижности это состояние лизоцима не отличается от состояния коротких пептидов, полученных путем трипсинолиза лизоцима.

3. При низких концентрациях DMSO в растворе лизоцин существует в мономерной форме, а при высоких концентрациях -преимущественно в димерной форме. Оценено, что мономер в составе димера представляет собой частично свернутую конформацик лизоцима, что позволяет считать его похожим на ранни» интермедиат, наблюдаемый в кинетических экспериментах.

Список публикаций по теме диссертации.

I

1. Киркитадзе М. Д. , Сурин А. К. , Потехин С. А. «Денатурированное состояние лизоцима в динетилсульфоксиде». Биоорганическая ХИМИЯ. 1996. Т. 22. N. 1. С. 21-24.

2. Timchenko A.A., Kirkitadze M.D., Prokhorov D.A., Potekhir S.A. "Lysozyme unfolding by dimethylsulfoxide by neutror scattering and dynamic light scattering". 2nd Workshoj "Principles of Protein Architecture". Waseda University, Tokyo, Japan. 1995. Book of Abstracts. P. 78.

3. Ковригин E. Л. , Киркитадзе M. Д. , Потехин С. А. «Энтальпиг стабилизации структуры лизоцима куриного яйца в водных раствора; диметилсульфоксида». Биофизика. 1996. Т. 41. вып.С. С.

4. Тимченко А. А. , Киркитадзе М. Д. , Прохоров Д. А. , Потехи1 С. А. , Сердюк И. Н. «Частично свернутое состояние лизоцима t развитой вторичной структурой в динетилсульфоксиде». Биоорганическая ХИМИЯ. 1996. Т. 22. N 6.