Ca2+-зависимые механизмы устойчивости нейронов гиппокампа к повреждающим факторам гипоксии

Туровская, Мария Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ca2+-зависимые механизмы устойчивости нейронов гиппокампа к повреждающим факторам гипоксии
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Ca2+-зависимые механизмы устойчивости нейронов гиппокампа к повреждающим факторам гипоксии"

На правах рукописи

Туровская Мария Владимировна

Са2+-ЗАВИСИМЫЕ МЕХАНИЗМЫ УСТОЙЧИВОСТИ НЕЙРОНОВ ГИППОКАМПА К ПОВРЕЖДАЮЩИМ ФАКТОРАМ ГИПОКСИИ

03.01.02-Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

31 ЯНВ 2013

Пущино - 2013

005048949

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Зинченко Валерий Петрович

Официальные оппоненты:

Чемерис Николай Константинович - доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки РАН, главный научный сотрудник лаборатории регуляции в биомедицинских системах.

Хаспеков Леонид Георгиевич - доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр неврологии" РАМН, руководитель лаборатории экспериментальной нейроцитологии.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук.

Защита диссертации состоится « 21 » февраля 2013 г. в 15 ч. 30 мин, на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан « » января 2013 г. Ученый секретарь диссертациопнс

кандидат биологических наук

Смолихина Татьяна Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что кратковременные эпизоды гипоксии защищают нейроны от гибели при глобальной гипоксии и ишемии. При этом повышение концентрации Са2+ в цитозоле ([Са2+]0, происходящее при глобальной ишемии, также уменьшается (Semenov et al., 2002). Это явление было названо прекондиционированием (preconditioning) и показано сначала в сердце в 1986 году, а позднее и в мозге (Murry et al., 1986; Kilagawa et al., 1990). Однако кроме прекондиционирования кратковременные эпизоды гипоксии вызывают эффект постгипоксической- гипервозбудимости (Godukhin et al., 2002; Turovskaya et al., 2011), который может приводить к гибели нейронов. В механизме повреждения и гибели нейронов в период гипоксии и реоксигенации важную роль играют различные типы глутаматных рецепторов. Увеличение концентрации внутриклеточного кальция при действии глутамата, может вызывать широкий спектр реакций нейронов, начиная с нормальной синаптической нейропластичности и регуляции возбудимости нервных клеток, до формирования нейротоксических эффектов, приводящих к апоптозу. Продолжительный вход кальция в цитозоль, через активированные глутаматом рецепторы-каналы и потенциал-управляемые кальциевые каналы, представляет собой ключевой фактор гибели нейронов при гипоксии и ишемии (Choi, 1985; Friedman, 2006). С другой стороны, амплитуда сигнала и частота Са2+ импульсов определяет специфику экспрессии генов приводящих либо к развитию синаптической нейропластичности, повышению жизнеспособности, либо к повреждению и гибели нейронов (Friedman, 2006; Obrenovitch, 2008).

Известно, что заболевания мозга сопровождаются индукцией внутримозговых иммунных и воспалительных процессов, основными медиаторами которых, являются цитокины. Согласно современным представлениям, цитокины, обладающие мультифункциональным действием, играют важную роль в межклеточных взаимодействиях в мозге и продуцируются такими резидентными клетками мозга, как астроциты и микроглия. При повреждениях мозга, вызванных механической травмой, гипоксией/ишемией или инфекционными агентами, -событий, часто ведущих к последующему развитию таких заболеваний как, эпилепсия, нейродегенерация и нарушение когнитивных процессов, экспрессия цитокинов в мозге резко возрастает. При этом экспрессируются не только провоспалительные цитокины, играющие отрицательную роль, но и противовоспалительные, способные оказывать нейропротектирующие воздействия. Поэтому, исследование механизмов протектирующего влияния на мозг цитокинов, обладающих одновременно иммуномодулирующими, антивоспалительными и трофическими действиями, имеет важное значение для создания нового класса лекарственных препаратов, которые, в отличие от ныне существующих средств, будут обладать более широким спектром лечебного действия.

Цель исследования. Целью данной работы является исследование Са2+-зависимых механизмов устойчивости нейронов гиппокампа к повреждающим факторам гипоксии.

Основные задачи исследования.

1. Изучить модулирующее действие кратковременных эпизодов гипоксии на изменение внутриклеточной концентрации Са2+ в нейронах гиппокампа, вызванное агонистами различных типов ионотропных рецепторов глутамата.

2. Исследовать явление гипоксического прекондиционирования и постгипоксической гипервозбудимости нейронов гиппокампа.

3. Изучить действие гипоксии на глутаматергические и ГАМКергические типы нейронов гиппокампа.

4. Установить эффекты интерлейкина-10 на постгипоксическую гипервозбудимость нейронов гиппокампа.

Научная новизна работы. В работе разработана методика создания кратковременных эпизодов гипоксии на нейроны первичной культуры гиппокампа, эффект которой, регистрировали с помощью системы анализа изображений.

Показано, что нейроны и астроциты гиппокампа, при воздействии на них кратковременными эпизодами гипоксии, отвечают транзитным увеличением [Са ]ь которое не приводит к повреждению и гибели клеток. В формировании кальциевого ответа, вызванного кратковременными эпизодами гипоксии, ведущую роль играет внутриклеточный кальциевый пул - эндоплазматический ретикулум. Показано, что нейроны различаются по величине амплитуды кальциевого ответа (АКО) на приложение кратковременной гипоксии. В каждой отдельной клетке, АКО достоверно повторяется при каждом последующем приложении гипоксии, что является характерными параметрами индивидуальной клетки.

В работе продемонстрировано, что кратковременные эпизоды гипоксии инициируют эффект прекондиционирования, который является естественным адаптивным процессом, направленным на защиту клеток от гибели. Эффект прекондиционирования проявляется в уменьшении АКО на повторную активацию АМРА- и ЫМБА-рецепторов селективными агонистами, после приложения кратковременных эпизодов гипоксии. При этом эффективность прекондиционирования зависит от «состояния» клетки, которое определяется степенью активности и экспрессии Са2+-транспортирующих систем. Также показано, что в культуре гиппокампа, эффекты прекондиционирования, направленные на ионотропные рецепторы глутамата не являются долговременными и сохраняются в течение 20 минут.

Кроме того, в работе показано, что кратковременные эпизоды гипоксии оказывают различное действие на глутаматергические и ГАМКергические типы нейронов гиппокампа. В глутаматергических нейронах выражен эффект гипоксического прекондиционирования, тогда как в ГАМКергических нейронах

эпизоды гипоксии не вызывают прекондиционирования, и, наоборот, в части клеток инициируют токсические эффекты.

Помимо эффекта прекондиционирования, показано, что активация ЫМЭА-рецепторов, с последующими кратковременными эпизодами гипоксии, способна приводить к появлению синхронного спонтанного транзиторного увеличения [Са } в период реоксигенации, амплитуда которого может увеличиваться при последующих эпизодах гипоксии, что является признаком постгипоксической гипервозбудимости нейронов. В представленной модели, формирование постгипоксической гипервозбудимости не зависит от входа кальция из экстраклеточной среды, а в генерацию спонтанных импульсов вовлечена активация 1Р3-рецептора и мобилизация Са + из эндоплазматического ретикулума.

Полученные результаты позволили показать, что противовоспалительный цитокин - интерлейкин-10 устраняет появление постгипоксической гипервозбудимости нейронов на сопряженное приложение к нейронам агониста возбуждающих глутаматных рецепторов ЫМЭА и кратковременных эпизодов гипоксии, и способствует появлению прекондиционирующего эффекта, что, несомненно, является проявлением быстрого нейропротектирующего действия интерлейкина-10 на нейроны гиппокампа.

Научно-практическая ценность. Полученные результаты позволят глубже понять процессы, связанные с функционированием нервных клеток в условиях гипоксии. Представленные данные расширяют существующие представления о механизмах устойчивости нейронов к повреждающим факторам гипоксии. Проведенные исследования способствуют развитию биомедицинских подходов жизнеобеспечения человека и животных. Результаты данной работы открывают возможности для разработки нового класса лекарственных препаратов на основе противовоспалительных иммуномодуляторов. Разработанные в ходе выполнения исследований подходы представляются перспективными для разработки новых противосудорожных и анти-гипоксических лекарственных средств, предназначенных для устранения развития и облегчения протекания заболеваний нервной системы.

Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011), на Международной конференции молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика 42» (Пущино, 2012) и на Всероссийской молодежной конференции «Актуальные вопросы биомедицинской инженерии» (Ростов на Дону, 2012).

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 9 печатных работах, из них 3 статьи в реферируемых журналах, 2 статьи в сборниках и 4 тезиса докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 144 страницах с использованием 35 рисунков, 2 таблиц и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные экспериментальные данные и их обсуждение, заключение и выводы. Список литературы содержит 472 ссылки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ГИППОКАМПА КРЫСЫ. Клетки выделяли из новорожденных (1-3 дня) линейных крыс породы Spraque Davvlay в соответствии с общепринятой методикой (Banker et al., 1977). Готовую суспензию клеток наносили на круглые покровные стекла диаметром 25мм, покрытые полиэтиленимином из расчета 1 гиппокамп на 10 стекол и помещали в 35мм чашки Петри. При этом использовали стеклянные цилиндры с отшлифованными торцами с внутренним диаметром 6мм, установленные на покровных стеклах. В каждый такой цилиндр помещали ЮОмкл суспензии клеток и оставляли на 6 часов для прикрепления во влажной атмосфере 5% С02 и 95% воздуха. После этого цилиндры убирали, а объем культуральной среды доводили до 1,5мл и культуру помещали в С02-инкубатор. Один раз в неделю заменяли 2/3 культуральной среды на свежую. В экспериментах использовали культуру в возрасте 7-21 дня в зависимости от решаемой задачи. Нейроны в культуре идентифицировали по транзитному увеличению [Ca2+]¡ в ответ на кратковременное (20 сек) приложение 35мМ КС1 в конце эксперимента.

ИЗМЕРЕНИЯ УРОВНЯ ЦИТОЗОЛЬНОГО КАЛЬЦИЯ МЕТОДОМ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ. Изменения [Ca2+]¡ в нейронах регистрировали по интенсивности флуоресценции двухволнового Са -чувствительного зонда Fura-2 (Rochefort et al., 2008; Hayashi and Miyata, 1994). Для измерения [Ca2+]¡ использовали систему анализа изображений на базе инвертированного моторизованного микроскопа Axiovert 200М, оснащенного монохромной CCD-камерой AxioCam HSM (Carl Zeiss, Германия) и системой высокоскоростной смены возбуждающих светофильтров Ludí МАС5000. При измерении уровня цитозольного кальция использовались объективы Plan Neofluar 10х/0,3 и 20х/0,7. Полученные на двух различных каналах временные серии изображений обрабатывали в программе ImageJ с использованием плагинов Time Series Analyzer и RatioPlus. При обработке серий изображений измеряли амплитуду кальциевых ответов одиночных клеток, выраженную как отношение сигналов флуоресценции Fura-2 при возбуждении 340 и 380нм. Для построения графиков и статистической обработки использовали Origin 7.5. В случае транзитного сигнала амплитуду рассчитывали исходя из максимального значения флуоресценции за период аппликации вещества, в случае с сигналом в виде плато амплитуда рассчитывалась исходя из среднего значения интенсивности флуоресценции во время нахождения сигнала на плато. Ошибка расчета среднего значения составляла 0,04.

СИСТЕМА ДЛЯ СОЗДАНИЯ КРАТКОВРЕМЕННЫХ ЭПИЗОДОВ ГИПОКСИИ. Условия гипоксии создавали в разработанной нами специальной вакуумной системе, где из среды Хенкса вытесняли растворенный кислород в процессе продувки ее инертным газом - аргоном. Уровень кислорода в гипоксическом растворе составлял 50-60 мм.рт.ст., что соответствует условиям умеренной гипоксии. Каждый из 3-х кратковременных эпизодов гипоксии, продолжительностью 3 минуты, создавали с помощью подачи гипоксической среды в камеру с клетками культуры гиппокампа. Для предотвращения контакта гипоксической среды с атмосферным воздухом, производили постоянный поддув аргона в экспериментальную камеру. После кратковременной гипоксии, производили замену среды на нормальную в 5-ти кратном объеме протока. Период реоксигенации составлял 10 минут, после чего проводили кратковременную активацию NMDA- или АМРА-рецепторов (30 сек) с помощью селективных агонистов. Эффекты гипоксии на нейроны гиппокампа крысы оценивали по изменению амплитуды кальциевого ответа (АКО) клеток на активацию соответствующих рецепторов до гипоксии, и после 3-х последовательных эпизодов гипоксии.

СИСТЕМА АППЛИКАЦИИ И ОТМЫВКИ ВЕЩЕСТВ. Для аппликации веществ нами была разработана система смены раствора в экспериментальной ячейке. Эта система позволяет осуществлять перфузию со скоростью 10 мл/мин. Разработанная система позволяет производить добавки известных концентраций агонистов и антагонистов рецепторов, а также растворов других соединений, и осуществлять полную их отмывку.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК. Число жизнеспособных и мертвых клеток определяли с использованием двойного окрашивания Hoechst 33342 (1 мкг/мл) и Propidium iodide (PI, 1 мкг/мл). Hoechst 33342, флуоресцирующий голубым светом, свободно проникает через плазматическую мембрану и прокрашивает хроматин клеток, при этом PI, флуоресцирующий красным светом, проникает только внутрь некротических клеток, целостность внешней мембраны которых нарушена. Для регистрации флуоресценции Propidium iodide и Hoechst 33342 использовали набор светофильтров (Carl Zeiss, Германия) FilterSet 45 и FilterSet 49.

ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ

ГАМКЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ. После записи кальциевых ответов клетки фиксировали, окрашивали антителами и Hoechst 33342, и регистрировали флуоресценцию антител на инвертированном конфокальном микроскопе. Для окрашивания использовали растворы: фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,4; 3% парафармальдегид в PBS; 2 и 10% сыворотку осла в PBS. Клетки фиксировали 3% парафармальдегидом в PBS в течение 10 мин. Затем препарат промывали PBS 3 раза по 5 минут. Для блокирования неспецифического связывания к клеткам добавляли 10 % сыворотку осла на 30 мин. На покровное стекло с культурой клеток ставили стеклянный цилиндр (внутренний диаметр 6 мм), и добавляли в него 100 мкл раствора первичных кроличьих антител против глутаматдекарбоксилазы 65 и 67, разведенных в 2% сыворотке осла в отношении 1:100. Через час цилиндр убирали и

промывали 3 раза по 15 минут PBS, содержащим 0,3% Triton Х-100. Далее на покровное стекло с культурой клеток опять ставили стеклянный цилиндр и добавляли в него 100 мкл вторичных антител осла против кролика, конъюгированных с Atto565 и разведенных в отношении 1:100 в фосфатно-солевом буфере, содержащим 0,3% Triton Х-100 и 0,05% NaN3, согласно руководства производителя (НПФ «Биотехнологии»). Окрашивание производили в темноте. После промывки (3 раза по 5 минут в PBS) препарат окрашивали в течение 3 минут в растворе Hoechst 33342 для выявления ДНК, используя сток 5 мг/мл, который разбавляли до 1 мкл/мл. После отмывки PBS клетки заливали глицерином. Флуоресценцию Hoechst 33342 и Atto565 регистрировали на инвертированном конфокальном микроскопе Leica TCS SP5, используя для возбуждения линии лазеров длиной волны 405 и 565 нМ, регистрацию флуоресценции производили в областях 450-500 и 575-650нМ соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ДЕЙСТВИЕ КРАТКОВРЕМЕННЫХ ЭПИЗОДОВ ГИПОКСИИ НА КЛЕТКИ ГИППОКАМПА. В нейронах и астроцитах гиппокампа в покое концентрация цитозольного кальция составляет 100±20нМ. Во время кратковременных эпизодов гипоксии [Са2+Ь в нейронах увеличивается до 120±12нМ (рис.1 А). После прекращения действия гипоксии, при реоксигенации, концентрация Са + в цитозоле восстанавливается в течение 2 минут до уровня покоя. В астроцитах, также, происходит увеличение цитозольного кальция ([Са2+]0 во время эпизодов гипоксии (рис.1Б). Увеличение амплитуды [Са2+], на гипоксию в астроцитах больше, чем в нейронах, и составляет, в среднем, 220±13нМ.

180

f 160-|Г~*140 ¿¿,120

KCl

2 *—* 2

Время, мин

Рис. 1. Кратковременные эпизоды гипоксии вызывают увеличение [Са2+]1 в нейронах (А) и астроцитах (Б) гиппокампа.

1 - кратковременный эпизод гипоксии; 2 - период реоксигенации. Третий кратковременный эпизод гипоксии для нейронов (3) создавали в номинально бескальциевой среде с добавлением 0,5мМ ЭГТА (рЬ-7,4). Представлен усредненный ответ 63 нейронов и 16 астроцитов. 8

Во время реоксигенации, производимой с помощью замены гипоксической среды на насыщенную воздухом, происходит быстрое возвращение интенсивности флуоресценции Fura-2 до начального уровня у каждой отдельной клетки, отреагировавшей повышением концентрации кальция в цитозоле во время гипоксии. Повторные кратковременные эпизоды гипоксии вызывают, в большинстве клеток, кальциевый ответ, по форме и амплитуде практически идентичный первому. Эксперименты, выполненные в номинально бескальциевой среде+ с добавлением 0,5мМ ЭГТА, демонстрируют, что увеличение концентрации [Ca2+]¡ не зависит от его присутствия в экстраклеточной среде. Как видно на рисунке 1А, третий эпизод гипоксии (обозначение 3), создаваемый для нейронов в+бескальциевой среде вызывает, в среднем, такое же увеличение концентрации Са2+ в цитозоле, как и при создании кратковременных эпизодов гипоксии в полной среде Хенкса (обозначение 1). Ингибитор SERCA - тапсигаргин, добавленный за 15 минут до начала эксперимента, препятствует появлению транзитного увеличения кальция в цитозоле у всех клеток первичной культуры гиппокампа в ответ на кратковременные эпизоды гипоксии, что доказывает ведущую роль мобилизации кальция из эндоплазматического ретикулума (ЭПР) в генерации ответа клеток на гипоксию. Таким образом, разработанная нами система создания условий гипоксии позволила показать, что в условиях кратковременной гипоксии в клетках первичной культуры гиппокампа происходит обратимое (не цитотоксичное), повторяющееся увеличение [Ca2+]¡ за счет мобилизации из ЭПР.

ДЕЙСТВИЕ КРАТКОВРЕМЕННЫХ ЭПИЗОДОВ ГИПОКСИИ НА АКТИВНОСТЬ АМРА-РЕЦЕПТОРОВ НЕЙРОНОВ ГИППОКАМПА.

Известно, что в пост-ишемический (пост-гипоксический) период наблюдается гибель нейронов различных отделов мозга в процессе апоптоза. Гиппокамп, особенно его область CAI, обладает повышенной чувствительностью к длительной непрерывной гипоксии или ишемии, которые вызывают гибель гиппокампальных нейронов. Механизм апоптоза запускается гиперактивацией рецепторов плазматической мембраны глутаматом, избыточное количество которого, выбрасывается из гибнущих на ранних стадиях ишемии/реперфузии нейронов (Вhat et all., 2004).

Аппликация АМРА - агониста АМРА-рецепторов в концентрации 5 мкМ вызывает обратимое увеличение [Ca2+]i. На рис. 2А показано, что в контроле (без кратковременных эпизодов гипоксии) аппликация АМРА вызывает быстрое увеличение [Ca2+]i в нейронах. После отмывки агониста, клетки быстро восстанавливают исходный уровень [Ca2+]¡. Повторные аппликации АМРА (после отмывки от агониста и 10 минутной паузы в записи) вызывают такой же по форме и амплитуде Са2+-ответ, как и первая аппликация агониста. Аппроксимация зависимости АКО на повторные аппликации АМРА в отношении к АКО на первую аппликацию агониста с помощью линейной функции показала, что коэффициент наклона прямой близок к 1 и составляет - 0,97 (рис. 2Б). Из рисунка следует, что в популяции нейронов гиппокампа клетки могут отвечать на аппликацию АМРА в широком диапазоне амплитуд. При этом у каждого отдельного нейрона, последующие добавки агониста вызывают ответы, идентичные первому.

во во o;o o¡3 ' o¡6 o¡9 ' 1¡2 i;s

Время, мин Амплитуда 1 ответа

Рис. 2. Са2+-ответы нейронов гиппокямпа на повторные кратковременные аппликации АМРА (5мкМ) в контроле (без гипоксии) и их линейная аппроксимация (Б).

А - Амплитуда кальциевого ответа в контроле сохраняется при повторных кратковременных аппликациях АМРА. Б - Отношение АКО нейронов на второй (1), третьей (2) и четвертой (3) кратковременных аппликаций АМРА (Амплшуда последующих ответов) от АКО на первую кратковременную аппликацию АМРА (Амплшуда 1ответа) для всех нейронов в поле зрения микроскопа и их линейные аппроксимации. Пунктиром (К) показана линейная аппроксимация зависимости амплитуд, тангенс угла наклона которой равен 1. Представлены усредненные Са -ответы 97 нейронов.

Для определения эффекта кратковременных эпизодов гипоксии на нейроны гиппокампа мы активировали АМРА-рецепторы с помощью кратковременной (30 секунд) аппликации 5мкМ АМРА после чего создавали условия гипоксии продолжительностью 3 минуты. На рисунке ЗА показано, что последовательные кратковременные эпизоды гипоксии приводят к подавлению амплитуды кальциевого ответа нейронов гиппокампа крысы, вызванной активацией АМРА-рецепторов.

30 40 Время, мин

0'0'0¡1 0¡2 0¡3 0|4 0,5 0,6 0,7 0,8 Амплитуда 1 ответа

Рис. 3. Действие кратковременных эпизодов гипоксии на АКО нейронов гиппокампа при активации АМРА-рецепторов.

А - После кратковременных эпизодов гипоксии (2) АКО нейронов на аппликацию АМРА (1) в концентрации 5мкМ уменьшается. Представлены усредненные Са2+-ответы 62 нейронов. Б - Зависимость амплитуды 4-го ответа на АМРА после третьего эпизода гипоксии от амплитуды первого ответа на АМРА и ее аппроксимация (1). Пунктиром (К) показана линейная

аппроксимация зависимости амплитуд в контроле (коэффициент наклона прямой - 1). Кривая 2 -аппроксимация АКО тех же клеток простой функцией экспоненциального падения.

На рисунке ЗБ показаны зависимости АКО всех нейронов в поле зрения микроскопа на аппликацию 5мкМ АМРА после трех эпизодов гипоксии от АКО на аппликацию агонистов до гипоксии. Пунктирной чертой показана линейная аппроксимация зависимости АКО первого и последнего ответов в контроле (прямая К, без гипоксии). После приложения кратковременной гипоксии происходит смещение линейной аппроксимации вправо (прямая 1), что свидетельствует об прекондиционирующем действии гипоксии на нейроны, причем, эффект постепенно увеличивался после каждого последующего эпизода гипоксии. Уравнение вида: у=А1*ехр (-x/tl) + уО, представляющее функцию простого экспоненциального падения, описывающее изменение АКО на АМРА до гипоксии и после трех эпизодов гипоксии показывает, что эффект прекондиционирования наиболее выражен у нейронов с большей амплитудой Са2+-сигнала (загиб кривой 2 на рис. ЗБ).

ДЕЙСТВИЕ КРАТКОВРЕМЕННЫХ ЭПИЗОДОВ ГИПОКСИИ НА АКТИВНОСТЬ NMDA-РЕЦЕПТОРОВ НЕЙРОНОВ ГИППОКАМПА. В нейронах CAI области гиппокампа показана очень высокая плотность NMDA-рецепторов, активация которых в условиях ишемии, приводит к увеличению концентрации [Ca2+]¡ с ОДмкМ (в нормальных условиях) до ЗО-бОмкМ, что не является физиологическими значениями (Erecinska and Silver, 1994). Таким образом, существуют данные о том, что в условиях недостатка кислорода происходит активация NMDA-рецепторов, через которые вход кальция в цитозоль может приводить к патологическим последствиям.

Как и при активации АМРА-рецепторов селективными агонистами, аппликация Ы-метил-О-аспартата (NMDA) в безмагниевой среде приводит к обратимому увеличению [Са +]¡ в нейронах гиппокампа, а линейная аппроксимация АКО показывает, что Са2+-ответы при повторной активации NMDA-рецепторов в точности повторяются в каждой клетке.

Кратковременные эпизоды гипоксии значительно подавляют активность NMDA-рецепторов, выраженную в уменьшении АКО. На рис. 4А показаны изменения АКО на аппликацию NMDA в концентрации ЮмкМ до и после кратковременных эпизодов гипоксии в среде без магния. Наблюдаются те же закономерности, что и для АМРА-рецепторов с той разницей, что АКО на NMDA в среднем больше, чем на АМРА и степень подавления ответа кратковременными эпизодами гипоксии выше. На рис. 4Б показаны зависимости АКО всех нейронов в поле зрения микроскопа на аппликацию NMDA после первого, второго и третьего кратковременного эпизода гипоксии от АКО на аппликацию NMDA до гипоксии. Пунктирной чертой показана линейная аппроксимация зависимости АКО на первую аппликацию NMDA от АКО на последнюю аппликацию в контроле (без гипоксии). Из рисунка видно, что величина подавления АКО гипоксией в каждой клетке зависит от исходной АКО на агонист и от числа эпизодов гипоксии. Чем больше

амплитуда ответа на ЫМЭА, тем больше степень ее подавления после кратковременного эпизода гипоксии. Кроме того, чем больше число эпизодов гипоксии, тем больше и степень подавления амплитуды последующего Са2+-ответа нейронов на ЫМБА. Функция линейной аппроксимации не проходит через «О» и тангенс угла наклона функции уменьшается после каждого последующего эпизода гипоксии (0,64; 0,43; 0,28).

А Б

Рис. 4. Действие кратковременных эпизодов гипоксии на АКО нейронов гиппокампа при активации NMDA-рецепторов.

А - Усредненный ответ 52 клеток на аппликацию NMDA ЮмкМ (1). (2) - период гипоксии, (3) -период реоксигенации. (*) - появление спонтанного Са2+-импульса в период реоксигенации. Б - Линейные аппроксимации зависимостей АКО на NMDA в контроле (К) и после первого (1), второго (2) и третьего (3) эпизода гипоксии в различных нейронах. Среда без магния.

Как правило, трехминутные эпизоды гипоксии не вызывали заметного постгипоксического увеличения базального уровня [Ca2+]¡ после ответов на агонисты АМРА-рецептора. Однако в случае NMDA, после каждого эпизода гипоксии и кратковременной аппликации NMDA, в период реоксигенации наблюдался спонтанный импульс Са2+ в цитозоле, который возникал синхронно во всей сети нейронов (обозначение (*) на рис. 4А). Спонтанный импульс всегда появлялся после каждого последующего эпизода гипоксии и, возможно, является проявлением или симптомом постгипоксической гипервозбудимости.

Таким образом, в наших экспериментах, выполненных на первичных смешанных культурах гиппокампа крысы, мы наблюдали 2 феномена нейропластичности при действии кратковременных эпизодов гипоксии и аппликации агонистов AMP А- и NMDA-рецепторов:

1) кратковременные эпизоды гипоксии последовательно подавляли увеличение [Ca2+]¡, вызываемое активацией глутаматных АМРА- и NMDA-рецепторов селективными агонистами;

2) активация NMDA-рецепторов с последующими кратковременными эпизодами гипоксии, вызывает спонтанное синхронное увеличение [Ca2+]i в период реоксигенации (спустя примерно 3 минуты после приложения эпизода гипоксии).

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ПОСТГИПОКСИЧЕСКОЙ

ГИПЕРВОЗБУДИМОСТИ НЕЙРОНОВ ГИППОКАМПА. Как показано выше, при кратковременной активации ЫМОА-рецептора с последующими повторными кратковременными эпизодами гипоксии, помимо эффекта гипоксического прекондиционирования, в период реоксигенации, может происходить спонтанное синхронное увеличение концентрации [Са2+];. Для генерации Са2+ сигналов клетки используют наружный и запасенный во внутриклеточных депо кальций. Эндоплазматический ретикулум представляет собой основное внутриклеточное депо Са2+, в том числе цистерны комплекса Гольджи, секретирующие везикулы и кальциосомы, хотя другие органеллы - прежде всего митохондрии - также участвуют в поддержании гомеостаза кальция в цитоплазме (Крутецкая и Лебедев, 2003). Высвобождение Са2+ из депо обеспечивается внутриклеточными Са2+ каналами (1Р3 и рианодиновыми (КуЯ) рецепторами) и сопровождается входом наружного Са2+ через разнообразные Са2+-транспортирующие ионные каналы.

Для исследования источника постгипоксического спонтанного увеличения Са2+ в цитозоле мы применяли бескальциевую среду с добавлением 0,5мМ ЕОТА, которую использовали для реоксигенации клеток после третьего эпизода кратковременной гипоксии. Спонтанный пик [Са2+], сохраняется во время реоксигенации в бескальциевой среде, при этом амплитуда данного пика уменьшается более чем в 2-3 раза, по сравнению, с первым или вторым спонтанным импульсом (рис. 5А).

А Б

-1-1-г—1-1-1—1-1-1-1-1—I-1 -■-1-■-1-1-1-■-1-1-1-Г—1-.

10 20 30 40 50 60 о 10 20 30 40 50 60

Время, мин Время, мин

Рис.5. Исследование источника формирования з[Са2+Ь в нейронах гиппокампа.

А - Спонтанный пик увеличения [Са2+]1 сохраняется во время реоксигенации (3) в бескальциевой среде (Са-Ггее) после аппликации ЮмкМ ЫМПЛ в безмапшевой среде (1) и последующего кратковременного эпизода гипоксии (2). Б - Аппликация тапсигаргина (ТГ) в концентрации 1 мкМ подавляет появление 5[Са2+]( в период реоксигенации (3), после активации ЫМОЛ-рснспторов (1) и кратковременных эпизодов гипоксии (2) в нейронах гиппокампа. В виде (*) на графике отмечено спонтанное увеличение кальция в цитозоле (5[Са2+]0. КС1 - аппликация 35мМ КС1.

Для исследования роли эндоплазматического ретикулума в генерации постгипоксического кальциевого импульса гипервозбудимости клетки перед третьей

аппликацией NMDA обрабатывали 1 мкМ тапсигаргина (рис. 5Б). Тапсигаргин в такой концентрации вызывает быстрое опустошение ЭПР от Са2+, что сопровождается временным увеличением Са2+ в цитозоле и откачкой его во внеклеточную среду. Такая обработка клеток тапсигаргином не изменяла Са2+ ответ HaNMDA, но предотвращала появление s[Ca2+]i. в период реоксигенации.

Поскольку изменение концентрации Са2+ в цитозоле является следствием нарушения равновесия между потоками Са2+ в цитозоль и откачкой из цитозоля, поэтому избирательное уменьшение скорости откачки Са2+ в ЭПР при действии малых концентраций ТГ должно увеличить амплитуду любого Са2+-ответа, связанного с мобилизацией Са2+ из ЭПР в случае, когда ЭПР еще не опустошен и не наступил момент нового равновесия. На рисунке 6 представлен эксперимент, в котором после первого и второго кратковременного эпизода гипоксии происходит появление s[Ca2+]i в период реоксигенации. Для нарушения одной из составляющих увеличения Са2+ в цитозоле, а именно, мобилизации кальция из ЭПР, третья добавка NMDA, кратковременная гипоксия и 10-ти минутный период реоксигенации, производились в среде с добавлением ЮОнМ тапсигаргина. Такого количества тапсигаргина в среде, не достаточно для полного ингибирования SERCA. Как видно из рисунка (рис.6), во время третьей реоксигенации, наблюдается s[Ca2+]i; амплитуда которого, в большинстве нейронов, почти в 3 раза больше, чем до инкубирования клеток с низкой концентрацией тапсигаргина. Таким образом, нарушение активности SERCA (но не ингибирование) приводит к гиперактивации входа кальция снаружи, что является подтверждением ведущей роли эндоплазматического ретикулума нейронов в генерации s[Ca2+]i.

Время, мин

Рис. 6. Изменение 8[Са2+Ь у нейронов, под действием малой концентрации ингибитора ЯЕКСЛ - тапсигаргина.

Действие тапсигаргина (ТГ) в концентрации 100 нМ на амплитуду вГСа24} в период реоксигенации (3), после активации ЫМПЛ-рецепторов (1) и кратковременных эпизодов гипоксии (2) в нейронах гиппокампа. Представлены усредненные ответы 23 клеток. В виде (*) на графике отмечено спонтанное увеличение кальция в цитозоле ^[Са2*],).

Инкубирование нейронов гиппокампа, в ходе эксперимента, с рианодином в течение 10 минут, в концентрации 1 мкМ, после второго периода реоксигенации и

перед третьей аппликацией НМБА - не влияет на возникновение в[Са2+]1 в период реоксигенации (рис.7А). На данном рисунке видно, что инкубирование нейронов с рианодином не предотвращает появления ни постгипоксического з[Са2+](, ни кальциевого ответа нейронов на саму гипоксию, что может свидетельствовать об общем механизме формирования кальциевого сигнала во время кратковременных эпизодов гипоксии и при генерации з[Са2+], во время реоксигенации.

40 50 60 0 Ю 20 30 40 50 60

Время, мин Время, мин

Рис. 7. Действие ингибиторов рианодинового рецептора (А) и фосфолипазы С (Б) на

постгипоксическую генерацию я[Са2+|;.

А - Аппликация рианодина (Яуа) в концентрации 1 мкМ. Б - Аппликация 1мкМ и73122. (1) -Кратковременная активация ЫМО А-рецепторов с помощью ЮмкМ М-метил-О-аепартата в безмагниевой среде, (2) - кратковременный эпизод гипоксии в полной среде, (3) - период реоксигенации. В виде (*) на графике отмечено КС1 — аппликация 35мМ КС1.

Для исследования роли 1Р3-рецептора в механизме генерации s[Ca +]i, мы использовали ингибитор фосфолипазы С (PLC) - U73122, так как, накопление в цитозоле 1Р3 происходит при активации именно этого фермента (Bleasdale et al., 1990). На рисунке 7Б показано, что инкубирование нейронов гиппокампа с 1мкМ U73122 предотвращает появление s[Ca2+]j, вызываемого активацией NMDA-рецепторов и действием кратковременного эпизода гипоксии. Таким образом, у культивируемых нейронов гиппокампа, механизм появления s[Ca2+]i, в период реоксигенации, после активации NMDA-рецепторов и кратковременных эпизодов гипоксии, не зависит от активации рианодинового рецептора эндоплазматического ретикулума, а включает высвобождение Са2+ через 1Р3-рецептор из тапсигаргин-чувствительного пула.

ДЕЙСТВИЕ КРАТКОВРЕМЕННЫХ ЭПИЗОДОВ ГИПОКСИИ НА ГАМКЕРГИЧЕСКИЕ НЕЙРОНЫ ГИППОКАМПА. Используя методику выявления ГАМКергических нейронов с помощью антител к САОб5/б7, мы сравнили действие кратковременной гипоксии на эффект прекондиционирования и эффект генерации з[Са2+], в ГАМКергических и глутаматергических нейронах. На рисунке 8

приведены изображения окрашенных антителами клеток и Ca ' -сигналы, полученные с этих нейронов. Видно, что в глутаматергических нейронах (рис.8, ядра клеток окрашены голубым цветом) после кратковременных эпизодов гипоксии выражен эффект гипоксического прекондиционирования, который проявляется в уменьшении АКО на аппликацию ЮмкМ NMDA в безмагниевой среде. Кроме того, в данных нейронах в период реоксигенации происходит появление спонтанного синхронного одиночного кальциевого импульса (*), являющегося симптомом постгипоксической гипервозбудимости, который не влияет на эффект прекондиционирования и не вызывает повреждения данного типа нейронов.

Гпутаматергические нейроны

1,2-]

KCl

ГАМКергичекие нейроны Б

и—■—I—1

50 60 Время, мин

KCl

0.6

T« 2

0.4-

50 60 Время, мин

Время, мин

Рис.8. Эффекты, оказываемые кратковременными эпизодами гипоксии на ГАМКергические и глутаматергические нейроны гиппокампа.

Клетки гиппокампа в культуре, окрашенные Hoechst 33342 (голубой) и антителами против GAD65/67 (красный). На рисунке представлен усредненный ответ 20 глутаматергических нейронов гиппокампа. А, Б, В и Г - Изменение уровня [Ca2+]¡ в ГАМКергических нейронах. Буквы соответствуют обозначениям на микрофотографии. (1) - аппликация 10 мкМ NMDA в безмагниевой среде; (2) - кратковременный эпизод гипоксии (3 минуты); (3) - период реоксигенации (10 минут); в виде (*) обозначено появление спонтанного увеличения кальция в цитозоле (s[Ca2+]¡); К+- аппликация 35мМ KCl

В клетках с интенсивно окрашенной цитоплазмой и определяемых как ГАМКергические нейроны после кратковременных эпизодов гипоксии наблюдается несколько эффектов, резко отличающихся от действия гипоксии на глутаматергические нейроны. На рисунке 8 А и Б видно, что после кратковременных эпизодов гипоксии не происходит гипоксического прекондиционирования, а наоборот, выражен токсический эффект, проявлением которого является увеличение АКО на аппликацию NMDA (рис.8А, Б). На рисунке 8 В и Г показаны 2 из 4-х ГАМКергических нейрона в которых во время реоксигенации происходило глобальное увеличение [Ca2+]¡, начало которого совпадало с генерацией синхронного Са2+ спайка в сети. У одного нейрона глобальное увеличение [Ca2+]¡ происходило после второго эпизода гипоксии, а у другого после третьего эпизода. Как показано многими работами, такое глобальное повышение Са2+ в дальнейшем приводит к гибели нейронов (Kristian and Siesjo, 1998).

Таким образом, кратковременные эпизоды гипоксии оказывают различное действие на глутаматергические и ГАМКергические нейроны гиппокампа. В отличие от глутаматергических нейронов, в ГАМКергических нейронах кратковременные эпизоды гипоксии не подавляют амплитуду Са2+-ответа на NMDA, а генерация спонтанного синхронного Са2+-спайка в сети во время периода реоксигенации приводит к глобальному повышению Са2+ и гибели популяции только ГАМКергических нейронов.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК ГИППОКАМПА В УСЛОВИЯХ ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ЭПИЗОДОВ ГИПОКСИИ. Для изучения жизнеспособности клеток в применяемой нами модели исследований, был проведен ряд тестов, позволяющих количественно определить число нейронов, в которых активированы механизмы гибели по типу апоптоза, либо некроза. Оценка жизнеспособности клеток проводилась с помощью двойного окрашивания зондами Propidium Iodide и Hoechst 33342. Жизнеспособные клетки не проницаемы для Propidium Iodide, в то время как, Hoechst 33342 свободно проникает сквозь плазматическую мембрану и окрашивает хроматин клеток. В соответствии с общепринятой методикой (Bryk et а!., 2011), нейроны гиппокампа определяли как апоптозные в случае, когда интенсивность флуоресценции Hoechst 33342 была в 3 -4 разы выше, чем в нормальных клетках, что свидетельствует о конденсации хроматина, которое происходит при индукции апоптоза.

Из представленной на рисунке 9 цитограммы видно, что в клеточной культуре до начала экспериментов (контроль, квадраты), число апоптозных и некрозных клеток незначительно (2+5). После проведения эксперимента по схеме, включающей 3 активации "ЫМБА-рецепторов и кратковременных эпизодов гипоксии с последующими периодами реоксигенации, клеточные культуры на 24 часа возвращали в С02-инкубатор. Спустя 24 часа после окончания эксперимента, число погибающих клеток увеличилось по сравнения с контролем в основном за счет апоптозных клеток (9+7). (рис.9, треугольники).

0,120-, о

<51 ООН

о <л

2 8СН

= 60-1

£ 4 СИ о

о 2 ОН

апоптоз

живые клетки

SO 100 150 200 2SO Propidium iodide fluorescence

Рис. 9. Эффект кратковременных эпизодов гипоксии на жизнеспособность клеток гиппокампа. По оси «Y» интенсивность флуоресценции Hoechst 33342, по оси «X» интенсивность флуоресценции Propidium Iodide в клетках гиппокампа в культуре.

Распределение клеток в зависимости от степени окраски Propidium Iodide и Hoechst 33342 в контроле без гипоксии (серые квадраты) и после действия кратковременных эпизодов гипоксии по схеме рис 4А. (черные треугольники). р<0,001

Таким образом, представленные данные свидетельствуют, о том, что кратковременные эпизоды гипоксии вызывают гибель лишь одиночных нейронов гиппокампа. По-видимому, это и есть те самые ГАМКергические нейроны, в которых при реоксигенации глобально повышался уровень Са2+ в цитозоле и усиливался ответ на NMDA.

ДЕЙСТВИЕ ИНТЕРЛЕЙКИН А-10 НА ПОСТГИПОКСИЧЕСКУЮ ГИПЕРВОЗБУДИМОСТЬ НЕЙРОНОВ ГИППОКАМПА, ИНДУЦИРОВАННУЮ АКТИВАЦИЕЙ NMDA-РЕЦЕПТОРОВ И КРАТКОВРЕМЕННЫМИ ЭПИЗОДАМИ ГИПОКСИИ. Интерлейкин-10 является противовоспалительным цитокином, который вырабатывается моноцитами и в меньшей степени - лимфоцитами. В мозге ИЛ-10 оказывает нейропротектирующее действие при повреждение нейронов, вызванное ишемическим инсультом или возбуждающими аминокислотами (Allan and Rothwell, 2001). В работах Левина и Годухина показано, что противовоспалительные цитокины - ИЛ-10 и TGF-01 оказывают антигипоксические эффекты и препятствуют развитию постгипоксической гипервозбудимости,

вызываемой кратковременными эпизодами гипоксии в пирамидных нейронах CAI области острых срезов гиппокампа крыс (Levin and Godukhin, 2011). Кроме того, эксперименты авторов показывают, что развитие постгипоксической гипервозбудимости, как в пирамидных нейронах срезов гиппокампа, так и в культивируемых нейронах гиппокампа, является Са2+-зависимым процессом (Levin and Godukhin, 2009; Turovskaya et al., 2011). Известно, что провоспалительные и противовоспалительные медиаторы, цитокины способны изменять проводимость ионных каналов, синаптическую передачу и нейропластичность (Beattie et al., 2002; Chin et al., 2002; Cacheaux et al., 2009). Причем эффекты цитокинов, направленные на нейромодуляцию, могут проявляться в течение нескольких минут - часов после кратковременного добавления цитокинов, а также, в течение часов - дней, после длительного инкубирования с цитокинами (Schäfers and Sorkin, 2008).

Как ранее показано, активация NMDA-рецепторов с последующими кратковременными эпизодами гипоксии, вызывает появление кратковременного спонтанного синхронного увеличения концентрации цитозольного кальция (s[Ca2+]¡) в нейронах гиппокампа в период реоксигенации, что является проявлением постгипоксической гипервозбудимости.

В соответствии с вышесказанным, противовоспалительные цитокины, в особенности интерлейкин-10 (ИЛ-10), должны препятствовать развитию постгипоксической гипервозбудимости нейронов гиппокампа. Так как выброс кальция из внутриклеточных депо опосредует как гибель нейронов, так и обеспечивает их жизнеспособность, мы предположили, что интерлейкин-10 может оказывать нейропротектирующее воздействие на клетки гиппокампа в условиях повторяющихся кратковременных эпизодов гипоксии, через модуляцию высвобождения кальция из эндоплазматического ретикулума.

В контрольных экспериментах ИЛ-10 в концентрации 1нг/мл вызывает осцилляции [Ca2+]¡ в 36% нейронов гиппокампа в поле зрения микроскопа (рис.ЮА). Колебания цитозольного кальция представляют собой пачки высокочастотных импульсов со средней амплитудой 0,25±0,08, которые повторяются, примерно, через каждые 7 минут. В 64% нейронов (рис.1 ОБ) аппликация 1нг/мл интерлейкина-10 не вызывает какого-либо кальциевого ответа.

А Б

1,6-iKCI

30 40 Время, мин

Рис. 10.Са2+-ответы нейронов гиппокампа на аппликацию ИЛ-10 (1нг/мл) без активации и эпизодов гипоксии.

А - Осцилляции [Са2+], под действием ИЛ-10 у 36% нейронов. Б - отсутствие какого-либо кальциевого ответа на ИЛ-10 у 64% нейронов. Представлены ответы одиночных нейронов, п-110.

Преинкубирование культивируемых нейронов гиппокампа с ИЛ-10 в течение 40 минут до начала эксперимента, предотвращает появление в[Са ]„ вызываемого активацией ЫМБА-рецепторов и эпизодами гипоксии у всех клеток в поле зрения (не показано). Подобный эффект наблюдается после инкубирования клеток с ИЛ-10 во время эксперимента, в течение 30-40 минут (во время инкубирования запись не производилась в целях избежания фотодеструкции Рига-2), после появления первого з[Са2+];. Интерлейкин-10, и в этом случае, предотвращает последующее появление гипервозбудимости, наблюдаемое во время первого эпизода реоксигенации, индуцированное активацией ЫМБА-рецепторов и кратковременными эпизодами гипоксии (рие.11).

Рис. 11. Быстрые эффекты ИЛ-10 на Са2+-ответы нейронов, вызываемые активацией NMDA-peцeптopoв и кратковременными эпизодами гипоксии.

Инкубирование нейронов гиппокампа с ИЛ-10 в течение 30-40 минут предотвращает появление постгипоксической гипервозбудимости в период реоксигенации (3), после активации ЫМОА-рецепторов (1) и кратковременных эпизодов гипоксии (2) в нейронах гиппокампа. В виде ( ) на графике отмечено спонтанное увеличение кальция в цитозоле (з[Са ],)■ Усредненные ответы 35 нейронов.

Как показано выше, кратковременные эпизоды гипоксии вызывают гибель исключительно ГАМКергических нейронов гиппокампа в результате глобального повышения концентрации кальция в цитозоле в период реоксигенации. Кроме того, в ГАМКергических нейронах гиппокампа наблюдается увеличение амплитуды Са -ответов на аппликацию ММБА после кратковременных эпизодов гипоксии. Для ответа на вопрос, является ли увеличение амплитуды Са2+-ответа на ЫМБА в ГАМКергических нейронах после кратковременной гипоксии следствием постгипоксической возбудимости или следствием отсутствия в этих нейронах механизма гипоксия-индуцированного подавления активности ЫМЭА каналов, мы исследовали влияние ИЛ-10 на эффект постгипоксического изменения активности

NMDA-рецепторов в ГАМКергических и глутаматергических нейронах. На рис 12А представлены Са2+-ответы глутаматергического (серая кривая) и ГАМКергического (черная кривая) нейронов гиппокампа на активацию NMDA-рецепторов после эпизодов гипоксии и периода реоксигенации. В глутаматергических нейронах выражен эффект гипоксического прекондиционирования после каждого из эпизодов гипоксии, тогда как в ГАМКергических происходит увеличение амплитуды Са -ответа на NMDA. Инкубирование клеток с ИЛ-10 (после второго эпизода гипоксии и третьей апликации NMDA) усиливает прекондиционирующий эффект гипоксии в глутаматергических нейронах и индуцирует появление такого эффекта в ГАМКергических нейронах, отменяет генерацию постгипоксического Са2+-спайка во всех нейронах, а так же препятствует глобальному повышению Са2+ в ГАМКергических нейронах и их гибели.

На рис.12Б показаны зависимости амплитуды Са2+-ответов на NMDA всех нейронов в поле зрения после второго (светлые фигуры) и третьего (черные фигуры) кратковременного эпизода гипоксии (Y) от амплитуды первого Са2+-ответа на NMDA до эпизодов гипоксии (X). Пунктирной чертой показана линейная аппроксимация данных в контроле (без эпизодов гипоксии). Белые треугольники соответствуют Са2+-ответам на NMDA 5-ти ГАМКергических нейронов после второго эпизода гипоксии, а черные треугольники - Са2+-ответам после инкубирования с ИЛ-10 и третьего эпизода гипоксии, (по схеме рис. 4А). Белые треугольники расположены выше линии аппроксимации данных в контроле, из чего ясно, что после двух эпизодов гипоксии в ГАМКергических нейронах не наблюдается эффект прекондиционирования, амплитуда Са2+-ответа на NMDA увеличивается. Тогда как в глутаматергических нейронах (белые квадраты) после двух эпизодов гипоксии происходит значительное уменьшение амплитуды Са -ответа на NMDA (рис. 12А, серая кривая). Преинкубирование нейронов с 1нг/мл ИЛ-10 вызывает еще большее подавление амплитуды Са2+-ответа на NMDA (увеличение прекондиционирующего эффекта) в глутаматергических нейронах (рис. 12Б, черные квадраты). В ГАМКергических нейронах (рис. 12Б, черные треугольники) также наблюдается сильный эффект подавления амплитуды Са2+-ответа на NMDA, что говорит об отмене возбуждающего действия гипоксии на активность NMDA-рецепторов в присутствии ИЛ-10 в ГАМКергических нейронах. Из этого эксперимента можно заключить, что повышение амплитуды Са2+-ответа на NMDA после эпизодов гипоксии в ГАМКергических нейронах, также как Са2+-спайк в период реоксигенации, является следствием постгипоксической гипервозбудимости.

Я 0,6

2 0,4

з и.

Й0.8

0,2-

1,0

Рис. 12. Эффект подавления амплитуды Са2+-ответов на NMDA в глутаматергических (серый) и ГАМКергических (черный) нейронах гиппокампа интерлейкином-10.

А - Представлены Са2+-ответы глутаматергического (серая кривая) и ГАМКергического (черная кривая) нейронов гиппокампа на активацию КМБА-рецепторов (1) после эпизодов гипоксии (2) и периода реоксигенации (3). В глутаматных нейронах выражен эффект гипоксического прекондиционирования после каждого из эпизодов гипоксии, тогда как в ГАМКергических происходит увеличение амплитуды Са2+-ответа на ШША. Инкубирование клеток с ИЛ-10 усиливает прекондиционирующий эффект гипоксии на глутаматергические нейроны, а так же отменяет токсическое действие гипоксии на ГАМКергические нейроны.

Б - Зависимости амплитуды Са2+-ответов на ИМЭА после кратковременных эпизодов гипоксии (У) от амплитуды Са2+-ответа до гипоксии (X). Белые треугольники - амплитуда Са +-ответа ГАМКергических нейронов после второго эпизода гипоксии. Черные треугольники - амплитуда Са2+-ответа ГАМКергических нейронов после инкубирования с ИЛ-10 и третьего эпизода гипоксии.

(1) - Аппроксимация экспоненциальной функцией зависимости амплитуды Са2+-ответа на ИМОА (К^-Ггее) в глутаматергических нейронах после 2-х (белые квадраты) эпизодов гипоксии.

(2) - Зависимости амплитуды Са2+-ответов на ЫМИА (М§-й-ее) в глутаматергических нейронах после 3-х (черные квадраты) эпизодов гипоксии в присутствии 1нг/мл ИЛ-10. К - линейная аппроксимация данных в контроле (без гипоксии). Уравнение экспоненциальной функции: у = А1*ехр(-хЛ1) + уО, где для кривой 1: у0= 0.59± 0.14, А1=-0.67±0.11, И=0.75±0.42; для кривой 2: у0=0.61±0.15, А1=-0.67±0.11, И=0.79±0.44.

Полученные результаты позволили показать, что противовоспалительный цитокин ИЛ-10 устраняет появление спонтанного кальциевого ответа на сопряженное приложение к нейронам агониста возбуждающих глутаматных рецепторов ЫмЬа и кратковременных эпизодов гипоксии. Поскольку, по нашим предположениям, этот кальциевый ответ лежит в основе постгипоксической гипервозбудимости, то механизм нейропротектирующего действия ИЛ-10 на постгипоксическую гипервозбудимость, индуцируемую в нейронах гиппокампа кратковременными эпизодами гипоксии, связан с устранением именно этого кальциевого ответа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Условия гипоксии являются сильнейшим стрессовым фактором, приводящим к функциональным нарушениям и повреждению клеток различных органов и тканей. Известно, что нейроны мозга являются одними из наиболее чувствительных клеток организма к повреждающим факторам недостатка кислорода. В научной литературе показано, что гипоксия оказывает практически мгновенные эффекты на функционирование клеток мозга. Эти эффекты являются обратимыми, в случае, когда гипоксия не была продолжительной. Однако длительное нарушение снабжения клеток мозга кислородом и, соответственно, нарушение энергетики клетки, ведет к необратимым функциональным повреждениям и, даже, гибели клеток, развивающимися в течение нескольких дней.

В условиях гипоксии, в следствие деэнергизации клеток, происходит избыточное накопление нейромедиаторов (в основном глутамата), который активирует различные глутаматные рецепторы. Активация ионотропных глутаматных рецепторов вызывает мощный вход кальция в цитозоль, повышение концентрации которого, способно приводить к трансдукции сигналов, вызывающих гибель клеток, либо активирующих цитотоксические каскады.

Тем не менее, при гипоксии в клетках реализуются различные сигнальные пути, направленные на поддержание гомеостаза и сохранение их нормальной физиологии.

В настоящем исследовании изучены эффекты гипоксии, оказываемые на клетки гиппокампа. В частности, продемонстрировано, что кратковременные эпизоды гипоксии вызывают увеличение кальция в цитоплазме нейронов и астроцитов, которое является обратимым, и уровень Са2+ быстро восстанавливается во время реоксигенации. Амплитуда кальциевого ответа на кратковременную гипоксию отличается в разных клетках, однако, остается практически неизменной при повторном приложении гипоксии в индивидуальных нейронах. В каждой отдельной клетке, АКО достоверно повторяется при каждом последующем приложении гипоксии, что является характерными параметрами индивидуальной клетки.

При исследовании действия кратковременных эпизодов гипоксии на активность ионотропных глутаматных рецепторов, продемонстрировано развитие эффекта прекондиционирования, выражающегося в уменьшении АКО на активацию АМРА- и NMDA-peцeптopoв селективными агонистами. Эффект гипоксического прекондиционирования является кратковременным и сохраняется на протяжении 20 минут, после чего постепенно исчезает. Кроме того, гипоксическое прекондиционирование выражено только в глутаматергических нейронах гиппокампа, тогда как в ГАМКергических нейронах наблюдаются токсические эффекты и гибель в условиях кратковременной гипоксии и реоксигенации.

Также, в работе подробно исследован механизм возникновения постгипоксической гипервозбудимости, наблюдаемой в нейронах гиппокампа при активации ЫМИА-рецепторов с последующей кратковременной гипоксией. Причиной спонтанного увеличения [Са2+][ в нейронах в период реоксигенации

является мобилизация кальция из внутриклеточного кальциевого пула (эндоплазматического ретикулума) при активации 1Р3-рецептора.

Современные представления о противовоспалительных цитокинах показывают, что в мозге они способствуют защите нейронов от повреждения, вызванного ишемическим инсультом или возбуждающими аминокислотами. При этом эффекты интерлейкина-10 являются наименее исследованными в нейробиологии. Существуют противоречивые данные о сигнальных путях, которые активируются при действии интерлейкина-10 на клетки мозга. Кроме того, лишь в работах нескольких научно-исследовательских групп показано быстрое нейропротектирующее действие интерлейкина-10 на нейроны мозга в условиях гипоксии/ишемии.

Наши результаты показали, что противовоспалительный цитокин -интерлейкин-10, препятствует появлению постгипоксической гипервозбудимости в нейронах гиппокампа. Таким образом, данный цитокин оказывает быстрый нейропротектирующий эффект на нейроны гиппокампа.

ВЫВОДЫ

1. Кратковременные эпизоды гипоксии уменьшают амплитуду Са2+ ответов при повторной активации глутаматных рецепторов селективными агонистами, что приводит к подавлению активности АМРА- и ЫМОА-рецепторов, и является проявлением эффекта гипоксического прекондиционирования. Степень подавления активности рецепторов различна в разных нейронах и пропорциональна амплитуде кальциевого ответа на агонист рецептора в каждой клетке.

2. Активация ЫМБА-рецепторов с последующим кратковременным эпизодом гипоксии, вызывает спонтанное увеличение цитозольного кальция (Б[Са ]0 в период реоксигенации, который является признаком постгипоксической гипервозбудимости и появляется синхронно во всей нейрональной сети. Появление Б[Са2+]1 не зависит от типа нейрона, но наиболее выражено в глутаматергических нейронах. В формировании постгипоксической гипервозбудимости нейронов гиппокампа, ведущую роль играет мобилизация Са2+ из эндоплазматического ретикулума через 1Р3-рецептор.

3. Кратковременные эпизоды гипоксии вызывают различные эффекты в глутаматергических и ГАМКергических нейронах гиппокампа. В глутаматергическом типе нейронов выражен эффект гипоксического прекондиционирования, тогда как в ГАМКергических нейронах гипоксия вызывает токсические эффекты, что приводит к их повреждению и гибели

4. Интерлейкин-10 препятствует появлению постгипоксической гипервозбудимости, ингибируя 1Р3-рецептор, тем самым оказывая быстрый нейропротектирующий эффект на нейроны гиппокампа

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах

1.МагИа V. Turovskava., Egor A. Turovsky., Valery P. Zinchenko., Sergei G. Levin., Alina A. Shamsutdinova., Oleg V. Godukhin. Repeated brief episodes of hypoxia modulate the calcium responses of ionotropic glutamate receptors in hippocampal neurons. Neuroscience Letters, 2011. Vol. 496 (№1): 11-14.

2.Turovskava M.V.. Turovsky E.A.. Zinchenko V.P.. Levin S.G.. Godukhin O.V. Interleukin-10 modulates [Ca2+]i response induced by repeated NMD A receptor activation with brief hypoxia through inhibition of InsP(3)-sensitive internal stores in hippocampal neurons. Neurosci Letters, 2012. Vol. 516 (№1): 151-1555.

3. Туровская M.B.. Туровский E.A., Зинченко В.П. Роль 1Р3-зависимой мобилизации кальция в формировании постгипоксической гипервозбудимости нейронов гиппокампа. Фундаментальные исследования, 2012. №12 (2): 317-320.

Статьи в сборниках

Х.Туровская М.В., Туровский Е.А., Годухин О.В., Зинченко В.П. Повторные эпизоды кратковременной гипоксии модулируют активность ионотропных глутаматных рецепторов нейронов гиппокампа крысы. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2011. (24-26 мая) 1, стр. 156-162.

2. Туропский Е.А.. Туровская М.В., Бережное А.В., Толмачева А.В., Ненов М.Н., Долгачева Л.П., Зинченко В.П., Маевский Е.И., Дынник В.В. Регуляция уровня [Ca2+]j в адипоцитах мыши норадреналином, аргинином и ацетилхолином. Конвергенция сигнализации аь а2 и ш3 рецепторов. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2011. (24-26 мая) 1, стр. 57-63.

Тезисы докладов

1. Туровская М.В.. Туровский Е.А., Зинченко В.П. Повторные кратковременные эпизоды гипоксии активируют механизм постгипоксической гипервозбудимости в нейронах гиппокампа крысы. Всероссийская молодежная конференция «Актуальные вопросы биомедицинской инженерии», Ростов на Дону 2012 год.

2. Туровская М.В.. Туровский Е.А., Зинченко В.П. Повторные кратковременные эпизоды гипоксии оказывают прекондиционирующее действие на АМРА- и NMDA-рецепторы нейронов гиппокампа крысы. Всероссийская молодежная конференция «Актуальные вопросы биомедицинской инженерии», Ростов на Дону 2012 год.

3. Туровская М.В.. Кононов А.В., Туровский Е.А., Зинченко В.П. Избирательная гибель гамкергических нейронов при действии кратковременных эпизодов гипоксии. «Экспериментальная и теоретическая биофизика 42», Пущино 2012 год.

4. Туровская М.В.. Туровский Е.А., Зинченко В.П. интерлейкин-10 препятствует появлению признаков постгипоксической гипервозбудимости в нейронах гиппокампа. «Экспериментальная и теоретическая биофизика '12», Пущино 2012 год.

Подписано в печать:

11.01.2013

Заказ № 8048 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Туровская, Мария Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гипоксия. Виды гипоксии

1.2. Гипоксия головного мозга

1.3. Патологические состояния, связанные с условиями гипоксии

1.3.1. Инфаркт мозга 12 1.3.1.2. Роль нейротрансмиттерных аминокислот при инфаркте мозга

1.3.2. Взаимосвязь гипоксии и канцерогенеза

1.3.3. Роль гипоксии в развитии болезни Алыдгеймера

1.4. Сенсоры кислорода в клетке. Модели восприятия кислорода

1.4.1. Эффекторные молекулы клеток, регулируемые кислородом

1.4.2. Физиологические реакции клеток на изменение уровня кислорода. Мембранная модель хемотрансдукции.

1.5. Са -транспортирующие системы клетки. Кальциевый гомеостаз

1.5.1. Механизмы входа

Са2+ в клетки

1.5.1.1. Истинные рецептор-управляемые каналы

1.5.1.2. Са2+- каналы, активируемые вторичными посредниками

1.5.1.3. G-белок-управляемые Са -каналы

1.5.1.4. Потенциал-управляемые кальциевые каналы

1.5.2. Внутриклеточные Са2+-зависимые каналы

1.5.2.1. 1Р3 рецепторы (IP3R). Структура и регуляция

1.5.2.2. Рианодиновые рецепторы (RyR). Структура и регуляция

1.6. Глутаматные рецепторы

1.6.1. NMDA-рецепторы (NMDAR) 36 1.6.1.1. Структура и функции NMDA-рецепторов

1.6.2. АМРА-рецепторы (AMPAR)

1.6.2.1. Структура и функции АМРА-рецепторов

1.6.2.2. Сигнализация и регуляция АМРА-рецепторов

1.7. Действие гипоксии на клетки мозга. Повреждающие факторы гипоксии

1.7.1. Изменение кальциевого гомеостаза в условиях гипоксии приводит к повреждению клеток мозга

1.7.2. Механизмы нарушения ионного транспорта при гипоксии. Роль глутамата и кальция

1.7.3. Активные формы кислорода (АФК) как повреждающий фактор гипоксии

1.8. Механизмы устойчивости клеток мозга к повреждающим факторам гипоксии

1.8.1. Эффект гипоксического прекондиционирования влияет на активность глутаматных и ГАМК-рецепторов нейронов мозга

1.8.2. Роль НШ в формировании устойчивости клеток мозга к условиям гипоксии

1.8.3. Защитное действие белков теплового шока (ШР) в условиях гипоксии и их вклад в формирование гипоксического прекондиционирования

1.8.4. Нейропротекторные эффекты противовоспалительных цитокинов.

Роль интерлейкина-10 (ИЛ-10)

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Получение культуры клеток гиппокампа

2.2. Измерения уровня цитозольного кальция методом флуоресцентной микроскопии

2.3. Система для создания кратковременных эпизодов гипоксии

2.4. Система аппликации и отмывки веществ

2.5. Определение жизнеспособности клеток

2.6. Иммуноцитохимический метод выявления ГАМКергических нейронов

2.7. Использованные реактивы

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Действие кратковременных эпизодов гипоксии на клетки гиппокампа

3.2. Действие кратковременных эпизодов гипоксии на активность АМРА-рецепторов нейронов гиппокампа

3.3. Действие кратковременных эпизодов гипоксии на активность ЫМОА-рецепторов нейронов гиппокампа.

3.4. Исследование длительности сохранения эффекта прекондиционирования, вызываемого кратковременными эпизодами гипоксии

3.5. Исследование механизмов постгипоксической гипервозбудимости нейронов гиппокампа

3.6. Действие кратковременных эпизодов гипоксии на ГАМКергические нейроны гиппокампа

3.7. Исследование жизнеспособности клеток гиппокампа в условиях повторяющихся эпизодов гипоксии

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ca2+-зависимые механизмы устойчивости нейронов гиппокампа к повреждающим факторам гипоксии"

Актуальность проблемы. Известно, что предшествующие глобальной гипоксии и ишемии кратковременные эпизоды гипоксии защищают нейроны от гибели. При этом концентрация Са2+ в цитозоле ([Са2+]0 при глобальной ишемии уменьшается после прекондиционирования кратковременными эпизодами гипоксии (Semenov et al., 2009). Однако, наряду с защитным эффектом, кратковременные эпизоды гипоксии часто вызывают симптомы постгипоксической гипервозбудимости (Godukhin et al., 2002; Turovskaya et al., 2011), которая, как известно, является фактором, приводящим к гибели клеток.

Увеличение [Ca2+]i при действии глутамата может вызывать широкий спектр реакций нейронов, от нормальной синаптической нейропластичности и регуляции возбудимости нервных клеток до формирования нейротоксических эффектов, приводящих к апоптозу. Продолжительный вход кальция в цитозоль через активированные глутаматом рецепторы-каналы и потенциал-управляемые кальциевые каналы представляет собой ключевой фактор гибели нейронов при гипоксии и ишемии {Choi, 1985; Noh et al., 2005; Friedman, 2006). С другой стороны, амплитуда сигнала и частота Са2+-импульсов определяет специфику экспрессии генов, приводящей либо к развитию синаптической нейропластичности и повышению жизнеспособности, либо к повреждению и гибели нейронов (Perkinton et ah, 1999; Vanhoutte and Bading, 2003; Zemke et al., 2004; Friedman, 2006; Obrenovitch, 2008).

Известно, что заболевания мозга сопровождаются индукцией внутримозговых иммунных и воспалительных процессов, основными медиаторами которых являются цитокины. Согласно современным представлениям, цитокины, обладающие мультифункциональным действием, играют важную роль в межклеточных взаимодействиях и продуцируются такими резидентными клетками мозга, как астроциты и микроглия. При повреждениях мозга, вызванных механической травмой, гипоксией/ишемией или инфекционными агентами, т.е., событиями, часто ведущими к последующему развитию таких заболеваний как эпилепсия, нейродегенерация и нарушение когнитивных процессов, экспрессия цитокинов в мозге резко возрастает. При этом экспрессируются не только провоспалительные цитокины, играющие отрицательную роль, но и противовоспалительные, способные оказывать нейропротекторные воздействия. Поэтому исследование механизмов защитного влияния на мозг цитокинов, обладающих одновременно иммуномодулирующими, антивоспалительными и трофическими эффектами, имеет важное значение для создания нового класса лекарственных препаратов, которые, в отличие от ныне существующих средств, будут обладать более широким спектром лечебного действия.

Цель исследования. Исследование Са2+-зависимых механизмов устойчивости нейронов гиппокампа к повреждающим факторам гипоксии.

Основные задачи исследования.

1. Разработать методику воздействия кратковременными эпизодами гипоксии на клетки гиппокампа в культуре.

2. Изучить модулирующее действие кратковременных эпизодов гипоксии на изменение внутриклеточной концентрации Са2+ в нейронах гиппокампа, вызванное агонистами различных типов ионотропных рецепторов глутамата.

3. Исследовать явление гипоксического прекондиционирования и постгипоксической гипервозбудимости нейронов гиппокампа.

4. Исследовать особенности действия гипоксии на глутаматергические и ГАМКергические типы нейронов гиппокампа.

5. Изучить эффекты интерлейкина-10 на постгипоксическую гипервозбудимость нейронов гиппокампа.

Научная новизна работы. Разработана методика воздействия на нейроны первичной культуры гиппокампа кратковременных эпизодов гипоксии, при одновременной визуализации ее эффекта с помощью системы анализа изображений.

Впервые показано, что нейроны и астроциты гиппокампа при воздействии на них кратковременными эпизодами гипоксии отвечают транзитным увеличением [Са2+]„ которое не приводит к повреждению и гибели клеток. В формировании кальциевого ответа, вызванного кратковременными эпизодами гипоксии, ведущую роль играет внутриклеточный кальциевый пул - эндоплазматический ретикулум. Показано, что нейроны различаются по величине амплитуды кальциевого ответа (АКО) на приложение кратковременной гипоксии. В каждой отдельной клетке АКО достоверно повторяется при каждом последующем приложении гипоксии, что является характерными параметрами индивидуальной клетки.

Обнаружено, что кратковременные эпизоды гипоксии инициируют эффект прекондиционирования, который является естественным адаптивным процессом, направленным на защиту клеток от гибели. Эффект прекондиционирования проявляется в уменьшении АКО на повторную активацию AMP А- и NMDA-рецепторов селективными агонистами после приложения кратковременных эпизодов гипоксии. При этом эффективность прекондиционирования зависит от «состояния» клетки, которое определяется степенью активности и экспрессии Са -транспортирующих систем. Также показано, что в культуре гиппокампа эффекты прекондиционирования, направленные на ионотропные рецепторы глутамата, не являются долговременными и сохраняются в течение 20 минут.

Кроме того, обнаружено, что кратковременные эпизоды гипоксии оказывают различное действие на глутаматергические и ГАМКергические типы нейронов гиппокампа. В глутаматергических нейронах выражен эффект гипоксического прекондиционирования, тогда как в ГАМКергических нейронах эпизоды гипоксии не вызывают прекондиционирования, а наоборот, в части клеток инициируют токсические эффекты.

Помимо эффекта прекондиционирования, показано, что активация NMDA рецепторов, с последующими кратковременными эпизодами гипоксии, способна приводить к появлению спонтанного транзиторного увеличения [Са2+]( в период реоксигенации, амплитуда которого может возрастать при последующих эпизодах гипоксии, что является признаком постгипоксической гипервозбудимости нейронов. В представленной модели формирование постгипоксической гипервозбудимости не зависит от входа кальция из экстраклеточной среды, а в генерацию спонтанных импульсов вовлечена активация ГРз-рецептора и мобилизация Са2+ из эндоплазматического ретикулума.

Полученные результаты позволили впервые показать, что противовоспалительный цитокин, интерлейкин-10, устраняет появление постгипоксической гипервозбудимости нейронов на сопряженное приложение к нейронам агониста возбуждающих глутаматных ЫГуГОА-рецепторов и кратковременных эпизодов гипоксии, что, несомненно, является проявлением быстрого нейропротекторного действия интерлейкина-10 на нейроны гиппокампа.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1Р3 - инозитол-1,4,5-трифосфат IP3R - рецептор IP3 PLC - фосфолипаза С

RyR - рианодиновый рецептор

Са ]i - концентрация ионов кальция в цитозоле АКО - амплитуда кальциевого ответа

SERCA - кальциевая АТФаза сарко- и эндоплазматического ретикулума ГАМК - гамма-аминомасляная кислота

АМРА - альфа-аминометилизоксазолпропионовая кислота, агонист АМРА-рецепторов

AMPAR - ионотропный рецептор глутамата, селективно связывающий АМРА

DIV - время культивирования клеток в днях (day in vitro)

FW - фторвиллардиин, селективный агонист АМРА-рецепторов

GAD65/67 - глутаматдекарбоксилаза 65/67

NMDA - N-Mcmn-D-acnapTaT

NMDAR - ионотропный рецептор глутамата, селективно связывающий NMDA

HIF - гипоксия-индуцибельный фактор транскрипции

АФК - активные формы кислорода

Р02 - давление кислорода

HSP - белки теплового шока

ИЛ-10 - интерлейкин 10

ТГ - тапсигаргин, ингибитор SERCA

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Туровская, Мария Владимировна

выводы

1. Разработана методика создания кратковременных эпизодов гипоксии, позволяющая индуцировать в культивируемых нейронах гиппокампа различные реакции, приводящие к изменению кальциевого гомеостаза.

2. Кратковременные эпизоды гипоксии уменьшают амплитуду увеличения [Ca2+]i в ответ на повторную активацию глутаматных рецепторов селективными агонистами, что приводит к подавлению активности AMP А- и NMDA-рецепторов и является проявлением эффекта гипоксического прекондиционирования. Степень подавления активности рецепторов различна в разных нейронах и пропорциональна амплитуде кальциевого ответа на агонист рецептора в каждой клетке.

3. Кратковременные эпизоды гипоксии вызывают различные эффекты в глутаматергических и ГАМКергических нейронах гиппокампа. В глутаматергических нейронах выражен эффект гипоксического прекондиционирования, тогда как в ГАМКергических гипоксия вызывает токсические эффекты, что приводит к их повреждению и гибели.

4. У культивирумых нейронов гиппокампа после кратковременных эпизодов гипоксии не обнаружено долговременных эффектов прекондиционирования на уровне рецепторов-каналов АМРА и NMDA. В экспериментах, направленных на выяснение длительности сохранения эффекта прекондиционирования, показано, что этот эффект сохраняется в течение 20 мин, затем уменьшается и через 30 мин исчезает.

5. Активация NMDA-рецепторов с последующим кратковременным эпизодом гипоксии вызывает в период реоксигенации спонтанное увеличение [Са ], (s[Ca ],), что является признаком постгипоксической гипервозбудимости. Появление s[Ca2+], не зависит от типа нейрона, но наиболее выражено в глутаматергических нейронах. В формировании постгипоксической гипервозбудимости нейронов гиппокампа ведущую роль играет

2 I мобилизация Са из эндоплазматического ретикулума, опосредуемая 1Рз-рецептором.

6. Интерлейкин-10 препятствует появлению постгипоксической гипервозбудимости, ингибируя 1Рз-рецептор и оказывая тем самым быстрый нейропротекторный эффект на нейроны гиппокампа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Условия гипоксии являются сильнейшим стрессовым фактором, приводящим к функциональным нарушениям и повреждению клеток различных органов и тканей. Известно, что нейроны мозга являются одними из наиболее чувствительных клеток организма к повреждающим факторам недостатка кислорода. Показано, что гипоксия оказывает практически мгновенные эффекты на функционирование клеток мозга. Эти эффекты являются обратимыми в случае, когда гипоксия не была продолжительной. Однако длительное нарушение снабжения клеток мозга кислородом и, соответственно, нарушение энергетики клетки ведет к развивающимся в течение нескольких дней необратимым функциональным повреждениям и даже гибели клеток.

В условиях гипоксии, вследствие деэнергизации клеток, происходит избыточное внеклеточное накопление нейромедиаторов (в основном глутамата), что приводит к гиперактивации различных типов глутаматных рецепторов. Активация ионотропных глутаматных рецепторов вызывает мощный вход кальция в цитозоль, повышение внутриклеточной концентрации которого способно приводить к индукции цитотоксических сигнальных каскадов, вызывающих гибель клеток. С другой стороны, при гипоксии реализуются различные сигнальные пути, направленные на поддержание ионного гомеостаза и сохранение нормального морфофункционального состояния клеток.

В настоящем исследовании изучены механизмы различных эффектов гипоксии, оказываемые на культивируемые клетки гиппокампа. В частности, продемонстрировано, что кратковременные эпизоды гипоксии вызывают увеличение [Са2+]) в нейронах и астроцитах, которое является обратимым, поскольку уровень [Са ], быстро восстанавливается до исходных значений во время реоксигенации. Амплитуда кальциевого ответа (АКО) на кратковременную гипоксию отличается в разных клетках, однако в индивидуальных нейронах при повторном приложении гипоксии остается практически неизменной. В каждой отдельной клетке АКО достоверно повторяется при каждом последующем приложении гипоксии, что является характерными параметрами индивидуальной клетки.

При исследовании действия кратковременных эпизодов гипоксии на активность ионотропных глутаматных рецепторов продемонстрировано развитие эффекта прекондиционирования, выражающегося в уменьшении АКО на активацию АМРА- и ЫМБА-рецепторов селективными агонистами. Эффект гипоксического прекондиционирования является кратковременным и сохраняется на протяжении 20 минут, после чего постепенно исчезает. Кроме того, гипоксическое прекондиционирование выражено только в глутаматергических нейронах гиппокампа, тогда как в ГАМКергических в условиях кратковременной гипоксии и реоксигенации наблюдаются токсические эффекты и гибель нейронов.

В работе также детально исследован механизм возникновения постгипоксической гипервозбудимости в нейронах гиппокампа при активации ММОА-рецепторов с последующей кратковременной гипоксией. Причиной спонтанного увеличения [Са2+]] в нейронах в период реоксигенации является мобилизация кальция из внутриклеточного кальциевого пула (эндоплазматического ретикулума) при активации 1Рз-рецептора.

Современные представления о противовоспалительных цитокинах свидетельствуют о том, что в они способствуют защите нейронов мозга от повреждения, вызванного ишемическим инсультом или возбуждающими аминокислотами. При этом наименее исследованными являются эффекты противовоспалительного цитокина интерлейкина-10. Существуют противоречивые данные о сигнальных путях, которые активируются при действии интерлейкина-10 на клетки мозга. Кроме того, лишь в работах нескольких научно-исследовательских групп показано быстрое защитное действие интерлейкина-10 на нейроны мозга в условиях гипоксии/ишемии.

Наши результаты показали, что интерлейкин-10 препятствует появлению постгипоксической гипервозбудимости в нейронах гиппокампа и, таким образом, оказывает быстрый нейропротекторный эффект.

Полученные данные расширяют существующие представления о функционировании нервных клеток в условиях гипоксии и о механизмах их устойчивости к повреждающим факторам гипоксии. Кроме того, результаты исследования открывают возможности для разработки нового класса лекарственных средств на основе антивоспалительных иммуномодуляторов, а также новых противосудорожных и антигипоксических фармакологических препаратов, препятствующих развитию заболеваний нервной системы, вызываемых гипоксией.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Туровская, Мария Владимировна, Пущино

1. Большая медицинская энциклопедия: в 30-ти томах АМН СССР. Гл. ред. Б.В. Петровский// М.: Советская энциклопедия. 1989 3-е изд.

2. Авдонин П.В., Ткачук В.А. Рецепторы и внутриклеточный кальций. М: Наука. 1984.-С. 31-61.

3. Агаджанян H.A., Елфимов А.И. Функции организма в условиях гипоксии и гиперкапнии // М: Медицина. 1986. С. 272.

4. Бадалян Л.О. Детская неврология // М: Медицина. 1984. С. 570.

5. Бачурин С. О. Медико-химические подходы к направленному поиску препаратов для лечения и предупреждения болезни Альцгеймера. // Вопросы медицинской химии. 2001. -№ 2. Р. 155-197.

6. Березовский В.А. Гипоксия и индивидуальные особенности реактивности // Киев. 1978.-С. 216.

7. Виленский Б.С. Неотложные состояния в неврологии: Руководство для врачей // СПб.: Фолиант. 2004. С. 509.

8. Воронин Л.Г. Физиология высшей нервной деятельности // Выш. Школа. 1979. -С. 312.

9. Гаврилова С.И. Фармакотерапия болезни Альцгеймера: Миф или Реальность? // М. 1999.-С. 25-32.

10. Кононов A.B., Баль Н.В., Зинченко В.П. Регуляция спонтанных синхронныхгл 2+осцилляции Ca в нейронах гиппокампа гамкергическими неиронами, содержащими каинатные рецепторы без десенситизации // Биологические мембраны. 2012. Т. 29. -№ 1-2.-С. 133-138.

11. Крутецкая З.И., Лебедев O.E., Курилова Л.С. Механизмы внутриклеточной сигнализации // СПб: Изд-во СПбГУ, 2003. С. 208.

12. Леонова Е.В., Висмонт Ф.И. Гипоксия (патофизиологические аспекты) // Мн.: БГМУ. 2002. С. 22.

13. Лосев Н.И., Хитров Н.К., Грачев С.В. Патофизиология гипоксических состояний и адаптации организма к гипоксии // М. 1982. - С. 48.

14. Мельников К.Н. Разнообразие и свойства кальциевых каналов возбудимых мембран // Психофармакология и биологическая наркология. 2006. Т. 6. - № 1-2. -С. 1139-1155.

15. Раевский К.С., Георгиев В.П. Медиаторные аминокислоты: нейрофармакологические и нейрохимические аспекты // М. 1986. С. 240.

16. Скворцова В.И., Раевский К.С., Коваленко А.В. Содержание нейротрансмиттерных аминокислот в спинномозговой жидкости больных острым ИИ // Журнал неврол. и психиат. 1999. Т. 2. - С. 34-39.

17. Степаничев М.Ю. Цитокины как нейромодуляторы в центральной нервной системе // Нейрохимия. 2005. Т. 22. -№ 1. - С. 5-11.

18. Acker Н. Mechanisms and meaning of cellular oxygen sensing in the organism // Respir Physiol. 1994. Vol. 95. - P. 1-10.

19. Acker Т., Acker H. Cellular oxygen sensing need in CNS function: physiological and pathological implications // J Exp Biology. 2004. Vol. 207. - P. 3171-3188.

20. Acker H. The oxygen sensing signaling cascade under the influence of reactive oxygen species // Phil Trans R Soc B. 2005. Vol. 360. - P. 2201-2210.

21. Aebersold D.M., Burri P., Beer K.T., Laissue J., Djonov V., Greiner R.H., Giaccia A., Siim B.G., Johnson R.S. Targeting HIF-1 for cancer therapy // Nat Rev Drug Rev. 2003. -Vol. 2.-P. 1-9.

22. Airey J.A., Grinsell M.M., Jones L.R., Sutko J.L., Witcher D. Three ryanodine receptor isoforms exist in avian striated muscles // Biochemistry. 1993.Vol. 32. № 22. - P. 5739-5745.

23. Aizenman E., Lipton S.A., Loring R.H. Selective modulation of NMDA induced responses by reduction and oxidation // Neuron. 1989. Vol. 2. - P. 1257-1263.

24. Aizenman E., Sinor J.D., Brimecombe J.C., Herin G.A. Alterations of N-methyl-D-aspartate receptor properties after chemical ischemia // J Pharmacol Exp Ther. 2000. Vol. 295.-P. 572-577.

25. Allan S.M., Rothwell N.J. Cytokines and acute neurodegeneration // Nature Neurosci. 2001. Vol. 2. - P. 734- 744.

26. Alsbo C.W., Wrang M.L., Johansen F.F., Diemer N.H. Quantitative PCR analysis of AMP A receptor composition in two paradigms of global ischemia // Neuroreport. 2000. -Vol. 11.-P. 311-315.

27. Arali J.A. Epilepsy and immune system // Arch Neurol. 2000. Vol. 57. - P. 16891692.

28. Ascher P., Bregestovski P., Nowak L. N-methyl-D-aspartate-activated channels of mouse central neurons in magnesium-free solutions // J Physiol (Lond). 1988. Vol. 399. -P. 207-226.

29. Archer S.L., Reeve H.L., Michelakis E., Puttagunta L., Waite R. O2 sensing is preserved in mice lacking the gp91 phox subunit of NADPH oxidase // Proc Natl Acad Sci USA. 1999. Vol. 96. - P. 7944-7949.

30. Askanazi J., Silverberg P.A., Foster R.J., Hyman A.I., Milic-Emili J., Kinney J.M. Effects of Respiratory apparatus on breating pattern// J. Appl. Physiol. Respir. Environ. Exercise Physiol. 1980. Vol.48. - P. 577-580.

31. Astrand P., Rodahl K. Texbook of work physiology // New York: Me Grow Hill Book col. 1970.-P. 476.

32. Bailey D.M. et al. Evidence for reactive oxidante generation during acute physical exercise and normobaric hypoxia in man // J. Physiol. 2000. - Vol. 525. -P. 33.

33. Bambrick L., Kristian T., Fiskum G. Astrocyte mitochondrial mechanisms of ischemic brain injury and neuroprotection // Neurochem Res. 2004. Vol. 29. - № 3. - P. 601-608.

34. Bartrons R., Caro J.J. Bioenerg. Hypoxia, glucose metabolism and the Warburg s effect // Biomembr. 2007. Vol. 39. - P. 223-229.

35. Beal M.F. Mechanisms of excitotoxicity in neurologic diseases // FASEB J. 1992. -Vol. 6. № 15. - P. 3338-3344.

36. Beattie E.C., Stellwagen D., Morishita W., Bresnahan J.C., Ha B.K., Von Zastrow M., Beattie M., Malenka R.C. Control of synaptic strength by glial TNFa // Science. 2002. -Vol. 295.-P. 2282-2285.

37. Beck H., Acker T., Wiessner C., Allegrini P.R., Plate K.H. Expression of angiopoietin-1, angiopoietin-2, and tie receptors after middle cerebral artery occlusion in the rat // Am J Pathol. 2000. Vol. 157. - P. 1473-1483.

38. Belousov A.B., Godfraind J.M., Krnjevic K. Internal Ca stores involved in anoxic responses of rat hippocampal neurons // J of Physiol. 1995. Vol. 486 - № 3. - P. 547-556.

39. Benarroch E.E. Hypoxia-induced mediators and neurologic disease // Neurology. 2009. Vol. 73. - № 7. - P. 560-565.

40. Benedeczky I., Molnar E., Somogyi P. The cisternal organelle as a1. Ca2+ -storingcompartment associated with GABAergic synapses in the axonal initial segment of hippocampal pyramidal neurons // Exp Brain Res. 1994. Vol. 101. - P. 216-230.

41. Beneyto M., Meador-Woodruff J.H. Expression of transcripts encoding AMPA-receptor subunits and associated postsynaptic proteins in the macaque brain // J Comp Neurol. 2004. Vol. 468. - P. 530-554.

42. Bennett M.R., Huxlin K.R. Neuronal cell death in the mammalian nervous system: the calmortin hypothesis // Gen Pharmacol. 1996. Vol. 27. - № 3. - P. 407-419.

43. Benquet P., Gee C.E., Gerber U. Transient brain ischemia: NMDA receptor modulation and delayed neuronal death // Med Sci .(Paris). 2008. Vol. 24. - P. 185-190.

44. Bergeron M., Gidday J.M., Yu A.Y., Semenza G.L., Ferriero D.M., Sharp F.R. Role of hypoxia-inducible factor-1 in hypoxiainduced ischemic tolerance in neonatal rat brain // Ann Neurol. 2000. Vol. 48. - P. 285-296.

45. Berridge M.J. Signals galore // Nature. 1993. Vol. 365. - P. 573-574.

46. Berridge M.J. Capacitative calcium entry // Biochem J. 1995. Vol. 312. -№ 1. - P. 1-11.

47. Berridge M.J. Elementary and global aspects of calcium signaling // J Exp Biol.1997. Vol. 200. - № 2. - P. 315-319.

48. Berridge M.J., Bootman M.D., Lipp P. Calcium-a life and death signal // Nature.1998. Vol. 395. - № 6703. - P. 645-648.

49. Berridge M.J. Neuronal calcium signaling // Neuron. 1998. Vol. 21. - № 1. - P. 13-26.

50. Berridge M.J., Lipp P., Bootman M.D. The versatility and universality of calcium signaling//Nat Rev Mol Cell Biol. 2000.-Vol. 1.-№ 1.-P. 11-21.

51. Bhat R.V., Budd Haeberlein S.L., Avila J. Glycogen synthase kinase 3: a drug target for CNS therapies // J Neurochem. 2004. Vol. 89. - № 6. - P. 1313-1317.

52. Biagas K. Hypoxic-ischemic brain injury: advancements in the understanding of mechanisms and potential avenues for therapy // Curr Opin Pediatr. 1999. Vol. 11. - P. 223-228.

53. Bishop G.M., Robinson S.R., Liu Q., Perry G., Atwood C.S., Smith M.A. Iron: a pathological mediator of Alzheimer disease? // Dev Neurosci. 2002. Vol. 24. - P. 184187.

54. Blomgren K., Zhu C., Hallin U., Hagberg H. Mitochondria and ischemic reperfusion damage in the adult and in the developing brain // Biochem Biophys Res Commun. 2003. -Vol. 304.-№3.-P. 551-559.

55. Bodsch W., Takahashi K., Barbier A., Ophoff B.G., Hossmann K.A. Cerebral protein synthesis and ischemia // Prog Brain Res. 1985. Vol. 63. - P. 197-210.

56. Bond A., Lodge D., Hicks C.A., Ward M.A., O'Neill M.J. NMDA receptor antagonism, but not AMPA receptor antagonism attenuates induced ischaemic tolerance in the gerbil hippocampus // Eur J Pharmacol. 1999. Vol. 380. - P. 91-99.

57. Bottner M., Unsicker K., Suter-Crozzolata C. Expression of TGF-beta type II receptor mRNA in the CNS // Neuroreport. 1996. Vol. 7 - № 18. - P. 2903-2908.

58. Brahimi-Horn M.C., Pouyssegu J. Oxygen, a source of life and stress // FEBS Lett. 2007. Vol.581. -P. 3582-3591.

59. Brahimi-Horn M.C., Chiche J., Pouyssegur J. Hypoxia signaling control metabolic demand // Curr Opin Cell Biol. 2007. Vol. 19. - P. 223-229.

60. Breder C., Dinarello C., Saper C. Interleukin-1 immunoreactive innervation of the human hypothalamus // Science. 1988. Vol. 240. - P. 321-324.

61. Broadwell R.D., Cataldo A.M. The neuronal endoplasmic reticulum: its cytochemistry and contribution to the endomembrane system. II. Axons and terminals // J Comp Neurol. 1984. Vol. 230. - P. 231 -248.

62. Brown J.M., Giaccia A.J. The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy // Cancer Res. 1998. Vol. 58. - P. 1408-1416.

63. Bunn H.F., Poyton R.O. Oxygen sensing and molecular adaptation to hypoxia // Physiol Rev 1996. Vol. 76. - P. 839-885.

64. Busa W.B., Nuccitelli R. Metabolic regulation via intracellular pH. // Am J Physiol. 1984. Vol. 246. - №4. - P.409-438.

65. Bush A.I. Copper, zinc, and the metallobiology of Alzheimer disease // Alzheimer Dis Assoc Disord. 2003.-Vol. 17.-№3.-P. 147-150.

66. Calvo C.F., Amigou E., Desaymard C., Glowinski J. A pro- and an antiinflammatory cytokine are synthetised in distinct brain macrophage cells during innate activation // J Neuroimmun. 2005. Vol. 170. - P. 21-30.

67. Cande C., Cecconi F., Dessen P., Kroemer G. Apoptosis-inducing factor (AIF): key to the conserved caspase-independent pathways of cell death? // J Cell Sci. 2002. Vol. 115. - P. 4727-4734.

68. Carafoli E. Intracellular calcium homeostasis // Annu Rev Biochem. 1987. Vol. 56. -P. 395-433.

69. Carbone E., Lux H.D. A low voltage-activated calcium conductance in embryonic chick sensory neurons // Biophys J. 1984. Vol. 46. - № 3. - P. 413-418.

70. Carmeliet P., Dor Y., Herbert J.M., Fukumura D., Brusselmans K., Dewerchin M. Role of HIF-1 alpha in hypoxia-mediated apoptosis, cell proliferation and tumour angiogenesis // Nat. 1998. Vol. 394. - P. 485-490.

71. Chandel N.S., Maltepe E., Goldwasser E., Mathieu C.E., Simon M.C. Mitochondrial reactive oxygen species trigger hypoxia-induced transcription // Proc Natl Acad Sci USA. 1998. Vol. 95. - P. 11715-11720.

72. Chandel N.S., McClintock D.S., Feliciano C.E.,Wood T.M., Melendez J.A. Reactive oxygen species generated at mitochondrial complex III stabilize HIF-1 a during hypoxia: a mechanism of 02 sensing // J Biol Chem. 2000. Vol. 275. - P. 25130-25138.

73. Chandel N.S., Schumacker P.T. Cellular oxygen sensing by mitochondria: old questions, new insight // J Appl Physiol. 2000. Vol. 88. - P. 1880-1889.

74. Chen J., Graham S.H., Zhu R.L., Simon R.P. Stress proteins and tolerance to focal cerebral ischemia // J Cereb Blood Flow Metab. 1996. Vol. 16. - P. 566-577.

75. Cohen S., Greenberg M. E. Communication between the synapse and the nucleus in neuronal development, plasticity, and disease annu rev// Cell Dev Biol. 2008. Vol. 24. - P. 183-209.

76. Chin J., Angers A., Cleary L.J., Eskin A., Byrne J.H. Transforming growth factor pi alters synapsin distribution and modulates synaptic depression in Aplysia // J Neurosci. 2002.-Vol. 22.-P. 1-6.

77. Choi D.W. Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture is calcium dependent // Neurosci Lett. 1985. Vol. 58. - № 3. - P. 293-297.

78. Choi D.W. Cerebral hypoxia: some new approaches and unanswered questions // J Neurosci. 1990.-Vol. 10,- №8. -P. 2493-2501.

79. Claire L.P., Cotton L., Henley J.M. The molecular pharmacology and cell Biology of a-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors // Pharm Rev. 2005. -Vol. 57.-P. 253-257.

80. Clements J.D. Transmitter timecourse in the synaptic cleft: its role in central synaptic function//Trends Neurosci. 1996.-Vol. 19.-№ 5.-P. 163-171.

81. Comerford K.M., Wallace T.J., Karhausen J., Louis N.A., Montalto M.C., Colgan S.P. Hypoxia-inducible factor-1-dependent regulation of the multidrug resistance (MDR1) // Gene Cancer Res. 2002. Vol. 62. - P. 3387-3394.

82. Conforti L., Millhorn D.E. Selective inhibition of a slow-inactivating voltage-dependent K+ channel in rat PC 12 cells by hypoxia // J Physiol. 1997. Vol. 502. - P. 293305.

83. Cornfield D.N., Reeve H.L., Tolarova S„ Weir E.K., Archer S. Oxygen causes fetal pulmonary vasodilation through activation of a calcium-dependent potassium channel // Proc Natl Acad Sci USA. 1996. Vol. 93. - P. 8089-8094.

84. Coronado R., Morrissette J., Sukhareva M., Vaughan D.M. Structure and function of ryanodine receptors. // Am J Physiol. 1994. Vol. 266. - № 6. - P. 1485-1504.

85. Cotman C.W., Iversen L.L. Excitatory amino acids in the brain focus on NMDA receptors // J. Trends in Neurosci. 1987. - Vol. 10. - № 7. - P. 263-265.

86. Cristofanilli M., Akopian A. Calcium channel and glutamate receptor activities regulate actin organization in salamander retinal neurons // J Physiol. 2006. Vol. 575. - № 2.-P. 543-554.

87. Cummins T.R., Jiang C., Haddad G.G. Human neocortical excitability is decreased during anoxia via sodium channel modulation // J Clin Invest. 1993. Vol. 91. - P. 608-615.

88. Currie R.W., Ellison J.A., White R.F., Feuerstein G.Z., Wang X., Barone F.C. Benign focal ischemic preconditioning induces neuronal Hsp70 and prolonged astrogliosis with expression of Hsp27 // Brain Res. 2000. Vol. 863. - P. 169-181.-Ill

89. De Grey Aubrey D.N.J. The Mitochondrial Free Radical Theory of Aging // Molecular biology intelligence unit. 1999. P. 212

90. De la Torre J.C. Alzheimer's disease prevalence can be lowered with non-invasive testing // J Alzheimers Dis. 2008. Vol. 14. - P. 353-359.

91. DeLorenzo R.J. Calcium-calmodulin protein phosphorylation in neuronal transmission: a molecular approach to neuronal excitability and anticonvulsant drug action // Adv Neurol. 1983. Vol. 34. - P. 325-338.

92. De Souza S., Fu J., States B.A., Ziff E.B. Differential palmitoylation directs the AMPA receptor-binding protein ABP to spines or to intracellular clusters // J Neurosci. 2002. Vol. 22. - P. 3493-3503.

93. Digicaylioglu M., Lipton S.A. Erythropoietin-mediated neuroprotection involves cross-talk between Jak2 and NF-kappaB signaling cascades // Nature. 2003. Vol. 412. - P. 641-647.

94. Dingledine R., Borges K., Bowie D., Traynelis S.F. 1999. The glutamate receptor ion channels // Pharm Rev. 51. № 1. - P. 7-62.

95. Dirnagl U., Iadecola C., Moskowitz M.A. Pathobiology of ischaemic stroke: An Integrated View // Trends Neurosci. 1999. Vol. 22. - P. 391-397.

96. Dirnagl U., Simon R.P., Hallenbeck J.M. Ischemic tolerance and endogenous neuroprotection // Trends Neurosci. 2003. Vol. 26. - P. 248-254.

97. Dirnagl U., Meisel A. Endogenous neuroprotection: mitochondria as gateways to cerebral preconditioning? // Neuropharmacology. 2008. Vol. 55. - № 3. - P. 334-344.

98. Drejer J., Larsson O.M., Schousboe A. Characterization of L-glutamate uptake into and release from astrocytes and neurons cultured from different brain regions // Exp Brain Res. 1982. Vol. 47. - № 2. - P. 259-269.

99. Droz B., Rambourt A., Koenig H.L. The smooth endoplasmic reticulum: structure and role in the renewal of axonal membrane and synaptic vesicles by fast axonal transport // Brain Res. 1975. Vol. 93. - P. 1-13.

100. Duffy T.E., Nelson S.R., Lowry O.H. Cerebral carbohydrate metabolism during acute hypoxia and recovery // J Neurochem. 1972. Vol. 19. - № 4. - P. 959-977.

101. Dufour E., Larsson N.G. Understanding aging: revealing order out of chaos // Biochim Biophys Acta. 2004. Vol. 1658. - № 1-2. - P. 122-132.

102. Dupont G., Croisier H. Spatiotemporal organization of Ca dynamics: a modeling-based approach // HFSP J. 2010. Vol. 4. - № 2. - P. 43-51.

103. Dyrks T., Dyrks E., Masters C., Beyreuther K. Membrane inserted APP fragments containing the beta A4 sequence of Alzheimer's disease do not aggregate // FEBS Lett. 1992.-Vol. 309.-№ l.-P. 20-24.

104. Eby G.A., Eby K.L. Rapid recovery from major depression using magnesium treatment // Med Hypotheses. 2006. Vol. 67. - № 2. - P. 362-370.

105. Eimerl S., Schramm M. Acute glutamate toxicity and its potentiation by serum9+albumin are determined by the Ca concentration // Neurosci Lett. 1991. Vol. 130. - № 1. -P. 125-127.

106. Erecinska M., Silver I. Ions and energy in mammalian brain // Prog Neurobiol. 1994. -Vol. 43.-P. 37-71.

107. Fan Y., Deng P., Wang Y.C., Lu H.C., Xu Z.C., Schulz P.E. Transient cerebral ischemia increases CA1 pyramidal neuron excitability // Exper Neurology. 2008. Vol. 212. - № 2. - P. 415-421.

108. Fan X., Heijnen C.J., Van der Kooij M.A., Groenendaal F., Van Bel F. The role and regulation of hypoxia-inducible factor-la expression in brain development and neonatal hypoxic-ischemic brain injury // Brain Res Rev. 2009. Vol. 62. - P. 99-108.

109. Fasolato C., Innocenti B. Receptor-activated Ca influx: how many mechanisms for how many channels? // Trends Pharmacol Sci. 1994. Vol. 15. - № 3. - P. 77-83.

110. Fesenko E.E., Kolesnikov S.S. Lyubarsky A.L. Induction by cyclic GMP of cationic conductance in plasma membrane of retinal rod outer segment // Nature. 1985. Vol. 313. -№6000.-P. 310-313.

111. Fill M., Copello J.A. Ryanodine receptor calcium release channels // Physiol Rev. 2002. Vol. 82. - № 4. - P. 893-922.

112. Fisher S.K., Heacock A.M., Agranoff B.W. Inositol lipids and signal transduction in the nervous system: an update // J Neurochem. 1992. Vol. 58. - P. 18-38.

113. Flanders K.C., Ren R.F., Lippa C.F. Transforming growth factor-(3s in neurodegenerative disease // Progress in Neurobiology. 1998. Vol. 54. - № 1. - P. 71-85.

114. Franco-Obregon A., Urena J., Lopez-Barneo J. Oxygen-sensitive calcium channels in vascular smooth muscle and their possible role in hypoxic arterial relaxation // Proc Natl Acad Sci USA. 1995. Vol. 92. - P. 4715-4719.

115. Franco-Obregon A., Lopez-Barneo J. Low P02 inhibits calcium channel activity in arterial smooth muscle cells // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 1996. Vol. 271. - P. 2290-2299.

116. Franklin T.B., Krueger-Naug A.M., Clarke D.B., Arrigo A.P., Currie R.W. The role of heat shock proteins Hsp70 and Hsp27 in cellular protection of the central nervous system // Int J Hyperthermia. 2005. Vol. 21. - P. 379-392.

117. Fridovich I. Superoxide radical and superoxide dismutases // Annu Rev Biochem. 1995.-Vol. 64.-P. 97-112.

118. Friedman L.K. Calcium. A role for neuroprotection and sustained adaptation // Mol Intervations. 2006. Vol. 6. - № 6. - P. 315-329.

119. Fruen B.R., Bardy J.M., Byrem T.M., Strasburg G.M., Louis C.F. Differential Ca(2+) sensitivity of skeletal and cardiac muscle ryanodine receptors in the presence of calmodulin // Am J Physiol Cell Physiol. 2000. Vol. 279. - № 3. - P. 724-733.

120. Frydman J. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones // Annu Rev Biochem. 2001. Vol. 70. - P. 603-647.

121. Fu X.W., Nurse C.A., Wang Y.T., Cutz E. Selective modulation of membrane currents by hypoxia in intact airway chemoreceptors from neonatal rabbit // J Physiol. 1999. -Vol. 514.-P. 139-150.

122. Fu X.W., Wang D., Nurse C.A., Dinauer M.C., Cutz E. NADPH -oxidase is an 02 sensor in airway chemoreceptors: evidence from K+ current modulation in wild-type and oxidase-deficient mice // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. Vol. 97. - P. 4374-4379.

123. Furuichi T., Mikoshiba K. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor-mediated Ca2+ signaling in the brain // J Neurochem. 1995. Vol. 64. - P. 953-960.

124. Ganfornina M.D., Lopez-Barneo J. Single K+ channels in membrane patches of arterial chemoreceptor cells are modulated by O2 tension // Proc Natl Acad Sci USA. 1991. -Vol. 88.-P. 2927-2930.

125. Ganfornina M.D., Lopez-Barneo J. Potassium channel types in arterial chemoreceptor cells and their selective modulation by oxygen // J Gen Physiol. 1992. Vol. 100.-P. 401-426.

126. Gatenby R.A., Gillies R.J. Why do cancers have high aerobic glycolysis? // Nat Rev Cancer. 2004. Vol. 4. - P. 891-899.

127. Gebremedhin D., Bonnet P., Greene A.S., England S.K., Rusch N.J. Hypoxia increases the activity of Ca2+- sensitive K+ channels in cat cerebral arterial muscle cell membranes // Pflugers Arch. 1994. Vol. 428. - P. 621-630.

128. Gee C.E., Benquet P., Raineteau O., Rietschin L., Kirbach S.W., Gerber U. NMDA receptors and the differential ischemic vulnerability of hippocampal neurons // Eur J Neurosci. 2006. Vol. 23. - P. 2595-2603.

129. Ghosh A., Greenberg M.E. Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences // Science. 1995. Vol. 268. -№ 5208. - P. 239-247.

130. Gilany K, Vafakhah M. Hypoxia: a Review Journal of Paramedical Sciences // JPS 2010.-Vol. l.-№2.-P. 43-60.

131. Gilles-Gonzalez M.A., Ditta G.S., Helinski D.R. A haemoprotein with kinase activity encoded by the oxygen sensor of Rhizobium meliloti // Nature. 1991. Vol. 350. -P. 170-72.

132. Ginsberg M.D. Local metabolic responses to cerebral ischemia // Cerebrovasc Brain MetabRev. 1990.-Vol. 2.-№ l.-P. 58-93.

133. Goldberg M.A., Dunning S.P., Bunn H.F. Regulation of the erythropoietin gene: evidence that the oxygen sensor is a heme protein // Science. 1988. Vol. 242. - P. 14121415.

134. Gordan J.D., Thompson C.B., Simon M.C. HIF and c-Myc: sibling rivals for control of cancer cell metabolism and proliferation // Cancer Cell. 2007. Vol. 12. - № 2. - P. 108113.

135. Gottlieb M., Matute C. Expression of ionotropic glutamate receptor subunits in glial cells of the hippocampal CA1 area following transient forebrain ischemia // J Cereb Blood Flow Metab. 1997. Vol. 17. - P. 290-300.

136. Grabb M.C., Choi D.W. Ischemic tolerance in murine cortical cell culture: critical role for NMD A receptors // J Neurosci. 1999. Vol. 19. - P. 1657-1662.

137. Grabb M.C., Lobner D., Turetsky D.M., Choi D.W. Preconditioned resistance to oxygen-glucose deprivation-induced cortical neuronal death: alterations in vesicular GABA and glutamate release // Neuroscience. 2002. Vol. 115. - P. 173-183.

138. Grilli M., Barbieri I., Basudev H., Brusa R., Casati C., Lozza G., Ongini E. Interleukin-10 modulates neuronal tdeshold of vulnerability to ischaemic damage // Eur J Neurosci. 2000. Vol. 12. - P. 2265-2272.

139. Guglielmotto M., Tamagno E., Danni O. Oxidative stress and hypoxia contribute to Alzheimer's disease pathogenesis: two sides of the same coin // Scientific World J. 2009. -Vol. 9.-P. 781-791.

140. Haddad G.G., Jiang C. O2 deprivation in the central nervous system: on mechanisms of neuronal response, differential sensitivity and injury // Prog Neurobiol. 1993. Vol. 40. -P. 277-318.

141. Haddad G.G., Jiang C. 02-sensing mechanisms in excitable cells: role of plasma membrane K+channels // Annu Rev Physiol. 1997. Vol. 59. - P. 23-42.

142. Hain J., Onoue H., Mayrleitner M., Fleischer S., Schindler H. Phosphorylation modulates the function of the calcium release channel of sarcoplasmic reticulum from cardiac muscle // J Biol Chem. 1995. Vol. 270. - № 5. - P. 2074-2081.

143. Halterman M.W., Miller C.C., Federoff H.J. Hypoxiainducible factor-1 alpha mediates hypoxia-induced delayed neuronal death that involves p53 // J Neurosci. 1999. -Vol. 19.-P. 6818-6824.

144. Hammarstrom A.K., Gage P.W. Inhibition of oxidative metabolism increases persistent sodium current in rat CA1 hippocampal neurons // J Physiol. 1998. Vol. 510. -P. 735-741.

145. Hamrick S.E., Ferriero D.M. The injury response in the term newborn brain: can we neuroprotect? // Curr Opin Neurol. 2003. Vol. 16. - № 2. - P. 147-154.

146. Hansen A. J., Effect of anoxia on ion distribution in the brain // Physiol Rev. 1985. -Vol. 65.-№ l.-P. 101-148.

147. Hansford R.G. Relation between mitochondrial calcium transport and control of energy metabolism // Rev Physiol Biochem Pharmacol. 1985. Vol. 102. - P. 1-72.

148. Hardie D.G. The AMP-activated protein kinase cascade: the key sensor of cellular energy status // Endocrinology. 2003. Vol. 144. - P. 5179-5183.

149. Hayashi H., Miyata H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2+ // J Pharmacol Toxicol Meth. 1994.-Vol. 31.-№ l.-P. 1-10.

150. Henley J.M., Proteins interactions implicated in AMPA receptor trafficking: a clear destination and an improving route map // Neurosci Res. 2003. Vol. 45. - P. 243-254.

151. Hermann G.H., Rogers R.C. TNFa: a trigger of autonomic dysfunction // Neuroscientist. 2008. Vol. 14. - № 1. - P. 53-67.

152. Herndon R.M. The fine structure of the Purkinje cell // J Cell Biol. 1963. Vol. 18. -P. 167-180.

153. Hirning L.D., Fox A.P., McCleskey E.W., Olivera B.M., Thayer S.A., Miller R.J., Tsien R.W. Dominant role of N-type Ca2+ channels in evoked release of norepinephrine from sympathetic neurons // Science. 1988. Vol. 239. - № 4835. - P. 57-61.

154. Hisatsune C., Mikoshiba K. Molecular biology of the InsP 3 Rs: focus on brain function in health and disease//Membrane Transport and Signaling 2012. Vol. 1. - № 5. -P. 589-604.

155. Hochedlinger K., Yamada Y., Beard C., Jaenisch R. Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell 2005; 121: 465—477.

156. Hockel M., Vaupel P. Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects // J Natl Cancer Inst. 2001. Vol. 93. - P. 266-276.

157. Hollmann M., Hartley M., Heinemann S. Ca2+-permeability of KA-AMPA-gated glutamate receptor channels depends on subunit composition // Science (Wash DC). 1991.-Vol. 252.-P. 851-853.

158. Hollmann M., Maron C., Heinemann S. N-Glycosylation site tagging suggests a three transmembrane domain topology for the glutamate receptor GluRl // Neuron. 1994. -Vol. 13.-P. 1331-1343.

159. Howard M., O'Garra A., Ishida H., De Waal R., De Vries J. Biological properties of interleukin 10 // J of Clin Immunol. 1992. Vol. 12. - № 4. - P. 239-247.

160. Hu S.H., Chao C.C., Ehrlich L.C., Sheng W.S., Sutton R.L., Rockswold G.L., Peterson P.K. Inhibition of microglial cell RANTES production by IL-10 and TGF-fi // J of Leukocyte Biology. 1999. Vol. 65. - P. 815-821.

161. Huang L.E., Gu J., Schau M., Bunn H.F. Regulation of hypoxia-inducible factor la is mediated by an 02-dependent degradation domain via the ubiquitinproteasome pathway // Proc Natl Acad Sci USA. 1998. Vol. 95. - P. 7987-7992.

162. Huntly B.J., Gilliland D.G. Leukaemia stem cells and the evolution of cancer-stem-cell research // Nat Rev Cancer. 2005. Vol. 5. - P. 311-321.

163. Iadecola C., Zhang F., Casey R., Clark H. B., Ross M.E. Inducible nitric oxide synthase gene expression in vascular cells after transient focal cerebral ischemia. Stroke. 1996. Vol. 27. - P. 1373-1380.

164. Irvine R.F., Schell M.J. Back in the water: the return of the inositol phosphates // Nat Rev Mol Cell Biol. 2001. Vol. 2. - № 5. - P. 327-338.

165. Isaac J.T., Nicoll R.A., Malenka R.C. Evidence for silent synapses: implications for the expression of LTP // Neuron. 1995. Vol. 15. - P. 427-434.

166. Ishiuchi S., Tsuzuki K., Yamada N., Okado H., Miwa A., Kuromi H., Yokoo H., Nakazato Y., Sasaki T., Ozawa S. Extension of glial processes by activation of Ca2+-permeable AMPA receptor channels // Neuroreport. 2001. Vol. 12. - P. 745-748.

167. Ito S. Ohta T., Nakazato Y. Characteristics of 5-HT-containing chemoreceptor cells of the chicken aortic body // J Physiol. 1999. Vol. 515. - P. 49-59.

168. Jankowsky J.L., Patterson P.H. The role of cytokines and growth factors in seizures and their sequelae // Prog Neurobiol. 2001. Vol. 63. - P. 125-149.

169. Jeyakumar L.H., Copello J.A., O'Malley A.M., Wu G.M., Grassucci R., Wagenknecht T., Fleischer S. Purification and characterization of ryanodine receptor 3 from mammalian tissue // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. - № 26. - P. 16011-16020.

170. Jiang C., Haddad G.G. A direct mechanism for sensing low oxygen levels by central neurons // Proc Natl Acad Sci USA. 1994. Vol. 91. - P. 7198-7201.

171. Johns L., Sinclair A.J., Davies J.A. Hypoxia/hypoglycemia-induced amino acid release is decreased in vitro by preconditioning // Biochem Biophys Res Commun. 2000. -Vol. 276.-P. 134-136.

172. Jonas P. AMPA-type glutamate receptors-nonselective cation channels mediating fast excitatory transmission in the CNS // EXS (Basel). 1993. Vol. 66. - P. 61-76.

173. Kakiuchi S., Sobue K. Ca -and calmodulin-dependent flip-flop mechanism in microtubule assembly-disassembly // FEBS Lett. 1981. Vol. 132. -№ 1. - P. 141-143.

174. Kallio P.J., Wilson W.J., O'Brien S., Makino Y., Poellinger L. Regulation of the hypoxia-inducible transcription factor la by the ubiquitin-proteasome pathway // J Biol Chem. 1999. Vol. 274. - P. 6519-6525.

175. Katchman A.N., Vicini S., Hershkowitz N. Mechanism of early anoxia-induced suppression of the GABAA-mediated inhibitory postsynaptic current // J Neurophysiol. 1994.-Vol. 71.-P. 1128-1138.

176. Kato H., Liu Y., Araki T., Kogure K. MK-801, but not anisomycin, inhibits the induction of tolerance to ischemia in the gerbil hippocampus // Neurosci Lett. 1992. Vol. 139. - P. 118-121.

177. Katz A.M., Reuter H. Cellular calcium and cardiac cell death // Am J Cardiol. 1979. -Vol. 44.-№ l.-P. 188-190.

178. Keinanen K., Wisden W., Sommer B., Werner P., Herb A., Verdoorn T.A., Sakmann B., Seeburg P.H. A family of AMPA-selective glutamate receptors // Science (Wash DC). 1990.-Vol. 249.-P. 556-560.

179. Keith B., Simon M.C. Hypoxia-inducible factors, stem cells, and cancer // Cell. 2007. Vol. 129. - P. 465-472.

180. Kim W.Y., Kaelin W.G. Role of VHL gene mutation in human cancer // J Clin Oncol. 2004. Vol. 22. - P. 4991-5004.

181. Kirino T., Tsujita Y., Tamura A. Induced tolerance to ischemia in gerbil hippocampal neurons // J Cereb Blood Flow Metab. 1991. Vol. 11. - P. 299-307.

182. Kj0ller C., Diemer N.H. GluR2 protein synthesis and metabolism in rat hippocampus following transient ischemia and ischemic tolerance induction // Neurochem Int. 2000. -Vol. 37.-P. 7-15.

183. Knowles R.G., Moncada S. Nitric oxide synthases in mammals // J Biochem. 1994. -Vol. 298. P. 249-258.

184. Konsman J.P., Parnet P., Dantzer R. Cytokine-induced sickness behaviour: mechanisms and implications //Trends Neurosci. 2002. Vol. 25. - № 3. - P. 154-159.

185. Krnjevic K., Leblond J. Changes in membrane currents of hippocampal neurons evoked by brief anoxia // J Neurophysiol. 1989. Vol. 62. - P. 15-30.

186. Krupp J., Vissel B., Thomas C.G., Heinemann S.F., Westbrook G.L. Interactions of calmodulin and actinin with the NR1 subunit modulate Ca2+-dependent inactivation of NMDA receptors // J Neurosci. 1999. Vol. 19. - P. 1165-1178.

187. Kukreja R.C., Kontos H.A., Hess M.L., Ellis E.F. PGH synthase and lipoxygenase generate superoxide in the presence of NADH or NADPH // Circ Res. 1986. Vol. 59. - P. 612-619.

188. Kuusinen A., Abele R., Madden D.R., Keinanen K. Oligomerization and ligand-binding properties of the ectodomain of the alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid receptor subunit GluRD // J Biol Chem. 1999. Vol. 274. - P. 28937-28943.

189. Kuwajima G., Futatsugi A., Niinobe M., Nakanishi S., Mikoinshiba K. Two types of ryanodine receptors in mouse brain: skeletalmuscle type exclusively in Purkinje cells and cardiacmuscle type in various neurons // Neuron. 1992. Vol. 9. - P. 1133-1142.

190. Lacmann A., Hess D., Gohla G., Roussa E., Krieglstein K. Activity-dependent release of transforming growth factor-beta in a neuronal network in vitro // Neuroscience 2007. Vol. 150. - № 3. - P. 647-657.

191. Lauf P.K. K+-C1~ -cotransport: "to be or not to be" oxygen sensitive // J Physiol. 1998. Vol. 511.-P. 1.

192. LeDoux S.P., Driggers W.J., Hollensworth B.S., Wilson G.L. Repair of alkylation and oxidative damage in mitochondrial DNA // Mutat Res. 1999. Vol. 434. - P. 149-159.

193. Leonard J.P., Salpeter M.M. Agonist-induced myopathy at the neuromuscular junction is mediated by calcium // J Cell Biol. 1979. Vol. 82. - № 3. - P. 811-819.

194. Levin S.G., Godukhin O.V. Anti-inflammatory cytokines, TGF-pl and IL-10, exert anti-hypoxic action and abolish posthypoxic hyperexcitability in hippocampal slice neurons: comparative aspects // Experim Neurology. 2011. Vol. 232. - P. 329-332.

195. Li C., Jackson R.M. Reactive species mechanisms of cellular hypoxia-reoxygenation injury // Am J Physiol Cell Physiol. 2002. Vol. 282. - № 2. - P. 227-241.

196. Liao D., Hessler N.A., Malinow R. Activation of postsynaptically silent synapses during pairing-induced LTP in CA1 region of hippocampal slice // Nature (Lond). 1995. -Vol. 375.-P. 400-404.

197. Liao D., Scannevin R.H., Huganir R. Activation of silent synapses by rapid activity-dependent synaptic recruitment of AMPA receptors // J Neurosci. 2001. Vol. 21. - P. 6008-6017.

198. Linde R., Laursen H., Hansen A.J. Is calcium accumulation post-injury an indicator of cell damage? // Acta Neurochir Suppl. 1996. Vol. 66. - P. 15-20.

199. Lipscombe D., Kongsamut S., Tsien R.W. Alpha-adrenergic inhibition of sympathetic neurotransmitter release mediated by modulation of N-type calcium-channel gating // Nature. 1989. Vol. 340. - № 6235. - P. 639-642.

200. Lipton P. Ischemic cell death in brain neurons // Physiol Rev. 1999. Vol. 79. - P. 1431-1568.

201. Littlewood T.J. The impact of hemoglobin levels on treatment outcomes in patients with cancer // Semin Oncol. 2001. Vol. 28. - P. 49-53.

202. Liu Y., Kato H., Nakata N., Kogure K. Temporal profile of heat shock protein 70 synthesis in ischemic tolerance induced by preconditioning ischemia in rat hippocampus // Neuroscience. 1993. Vol. 56. - P. 921-927.

203. Liu X.B., Murray K.D., Jones E.G. Switching of NMDA receptor 2A and 2B subunits at thalamic and cortical synapses during early postnatal development // J Neurosci. 2004. Vol. 24. - № 40. - P. 8885-8895.

204. Liu Q., Chen B., Yankova M., Morest D.K., Maryon E., Hand A.R., Nonet M.L., Wang Z.W. Ryanodine receptors are required for normal quantal size at the C. elegans neuromuscular junction // J Neurosci. 2005. Vol. 25. - № 29. - P. 6745-6754.

205. Llano I., Leresche N., Marty A. Calcium entry increases the sensitivity of cerebellar Purkinje cells to applied GAB A and decreases inhibitory synaptic currents // Neuron. 1991. -Vol. 6.-P. 565-574.

206. Llano I., González J., Caputo C., Lai F.A., Blayney L.M., Tan Y.P., Marty A. Presynaptic calcium stores underlie large-amplitude miniature IPSCs and spontaneous calcium transients // Nat Neurosci. 2000. Vol. 3. - № 12. - P. 1256-1265.

207. Llinás R.R., Sugimori M., Cherksey B. Voltage-dependent calcium conductances in mammalian neurons. The P channel // Ann NY Acad Sci. 1989. Vol. 560. - P. 103-111.

208. Lokuta A.J., Rogers T.B., Lederer W.J., Valdivia H.H. Modulation of cardiac ryanodine receptors of swine and rabbit by a phosphorylation-dephosphorylation mechanism // J Physiol. 1995. Vol. 487. -№ 3. - P. 609-622.

209. Lopez-Lopez J.R., Gonzalez C. Time course of K+ current inhibition by low oxygen in chemoreceptor cells of adult rabbit carotid body. Effects of carbon monoxide // FEBS Lett. 1992. Vol. 299. - P. 251-254.

210. Lopez-Barneo J. Oxygen-sensitive ion channels: how ubiquitous are they? // Trends Neurosci. 1994.-Vol. 17.-P. 133-135.

211. Lopez-Barneo J. Oxygen-sensing by ion channels and the regulation of cellular functions // Trends Neurosci. 1996. Vol. 19. - P. 435-440.

212. Lopez-Lopez J.R., Gonzalez C., Perez-Garcia M.T. Properties of ionic currents from isolated adult rat carotid body chemoreceptor cells: effect of hypoxia // J Physiol. 1997. -Vol. 499.-P. 429-441.

213. Lopez-Barneo J., Pardal R., Ortega-Saenz P. Cellular mechanism of oxygen sensing // Annu Rev Physiol. 2001. Vol. 63. - P. 259-287.

214. Lynch G., Baudry M. The biochemistry of memory: a new and specific hypothesis // Science. 1984.-Vol. 224.-№ 4653. P. 1057-1063.

215. MacDermott A.B., Mayer M.L., Westbrook G.L., Smith S.J., Barker J.L. NMDA-receptor activation increases cytoplasmic calcium concentration in cultured spinal cord neurons // Nature. 1986. Vol. 321. - № 6069. - P. 519-522.

216. Madison J.M., Ethier M.F. Interleukin-4 rapidly inhibits calcium transients in response to carbachol in bovine airway smooth muscle cells // Am J of Respiratory Cell and Molec Biology. 2001. Vol. 25. - P. 239-244.

217. Malenka R.C. Synaptic plasticity and AMPA receptor trafficking // Ann NY Acad Sci. 2003.-Vol. 1003.-P. 1-11.

218. Marambaud P., Dress-Werringloer U., Vingtdeux V. Calcium signaling in neurodegeneration // Mol Neurodegeneration. 2009. Vol. 4. - № 20. - P. 1-15.

219. Martin L.J., Blackstone C.D., Levey A.I., Huganir R.L., Price D.L. AMPA glutamate receptor subunits are differentially distributed in rat brain // Neuroscience. 1993. Vol. 53. -P. 327-358.

220. Martin R.L., Lloyd H.G., Cowan A.I. The early events of oxygen and glucose deprivation: setting the scene for neuronal death? // Trends Neurosci. 1994. Vol. 17. - P. 251-257.

221. Martin G., O'Connell R.J., Pietrzykowski A.Z., Treistman S.N., Ethier M.F., Madison J.M. IL-4 activates BKca channels in airway smooth muscle // Exp Physiol. 2008. -Vol. 93.-P. 908-918.

222. Martone M.E., Zhang Y., Simpliciano V.M., Can-agger B.O., Ellisman M.H. Three-dimensional visualization of the smooth endoplasmic reticulum in Purkinje cell dendrites // J Neurosci. 1993. Vol. 13. - P. 4636-4646.

223. Martone M.E., Alba S.A., Edelman V.M., Airey J.A., Ellisman M.H. Distribution of inositol-1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors in rat neostriatum // Brain Res. 1997. -Vol. 756.-P. 9-21.

224. Massey V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins // J Biol Chem. 1994. Vol. 269. - № 36. - P. 22459-22462.

225. Mahura I.S. Cerebral ischemia-hypoxia and biophysical mechanisms of neurodegeneration and neuroprotection effects // Fiziol Zh. 2003. Vol. 49. № 2. - P. 7-12.

226. Maynard M.A., Oh M. The role of hypoxia-inducible factors in cancer // Cell Mol Life Sci. 2007. Vol. 64. - P. 2170-2180.

227. Meldrum B.S. Excitotoxicity in ischemia: An overview // New York, Raven Press. 1989.-P. 47-60.

228. Meng S.Z., Ohyu J., Takashima S. Changes in AMPA glutamate and dopamine D2 receptors in hypoxic-ischemic basal ganglia necrosis // Pediatr Neurol. 1997. Vol. 17. - P. 139-143.

229. Michael F., Copello J. Ryanodine receptor calcium release channels // Physiol Rev. 2002. Vol. 82. - P. 893-922.

230. Michaelis M.L., Foster C.T., Jayawickreme C. Regulation of calcium levels in brain tissue from adult and aged rats // Mech. Ageing Dev. 1992. Vol. 62. - № 3. - P. 291-306.

231. Mikoshiba K. The InsP3 receptor and intracellular Ca2+ signaling // Cur Opin in Neurobiology. 1997.-Vol. 7.-№3.-P. 339-345.

232. Miou Z., Baudry M. Developmental changes in NMDA neurotoxicity reflect developmental changes in subunit composition of NMDA receptors // J Neurosci. 2006. -Vol. 26. № 11. - P. 2956-2963.

233. Mironov S.L., Richter D.W. L-type Ca channels in inspiratory neurones of mice and their modulation by hypoxia // J Physiol. 1998. Vol. 512. - P. 75-87.

234. Mochizuki-Oda N., TakeuchiY., Matsumara K., Oosawa Y.,Watanabe Y. Hypoxiainduced catecholamine release and intracellular Ca2+ increase via suppression of K+ channels in cultured rat adrenal chromaffin cells // J Neurochem. 1997. Vol. 69. - P. 377387.

235. Mojet M.H., Mills E., Duchen M.R. Hypoxia-induced catecholamine secretion in isolated newborn rat adrenal chromaffin cells is mimicked by inhibition of mitochondrial respiration // J Physiol. 1997. Vol. 504. - P. 175-189.

236. Molina-Holgado E., Vela J.M., Arevalo-Martin A., Guaza C. LPS/IFN-gamma cytotoxicity in oligodendroglial cells: role of nitric oxide and protection by the antiinflammatory cytokine IL-10 // Eur J Neurosci. 2001. Vol. 13. - P. 493-502.

237. Monaghan D.T., Bridges R.J., Cotman C.W. The excitatory amino acid receptors: their classes, pharmacology and distinct properties in the function of the central nervous system // Ann Rev Pharmacol Toxicol. 1989. Vol. 29. - P. 365-402.

238. Monyer H., Burnashev N., Laurie D.J., Sakmann B., Seeburg, P.H. Developmental and regional expression in the rat brain and functional properties of four NMDA receptors // Neuron. 1994. Vol. 12. - P. 529-540.

239. Morishima-Kawashima M., Ihara Y. Alzheimer's disease: beta-Amyloid protein and tau // J Neurosci Res. 2002. Vol. 70. - № 3. - P. 392-401.

240. Mosmann T.R., Cherwinski H., Bond M.W., Giedlin M.A., Coffman R.L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted protein // J Immunol. 1986. Vol. 136. - P. 2348-2357.

241. Motáis R., Garcia-Romeu F., Borgese F. The control of NaC/HC exchange by molecular oxygen in trout erythrocytes. A possible role of hemoglobin as a transducer // J Gen Physiol. 1987. Vol. 90. - P. 197-207.

242. Mozhaeva G.N., Naumov A.P., Kuryshev IuA. Activation of the calcium channels of A-431 cells by epidermal growth factor // Tsitologiia. 1989. Vol. 31. - № 9. - P. 10641073.

243. Nakamura T., Gold G.H. A cyclic nucleotide-gated conductance in olfactory receptor cilia // Nature. 1987. Vol. 325. -№ 6103. - P. 442-444.

244. Nakata N., Kato H., Kogure K. Inhibition of ischaemic tolerance in the gerbil hippocampus by quercetin and anti-heat shock protein-70 antibody // Neuroreport. 1993. -Vol. 4.-P. 695-698.

245. Nicotera P., Zhivotovsky B., Orrenius S. Nuclear calcium transport and the role of calcium in apoptosis // Cell Calcium. 1994. Vol. 16. - № 4. - P. 279-288.

246. Nilius B., Hess P., Lansman J.B., Tsien R.W. A novel type of cardiac calcium channel in ventricular cells // Nature. 1985. Vol. 316. - № 6027. - P. 443-446.

247. Nishi S., Taki W., Uemura Y., Higashi T., Kikuchi H., Kudoh H., Satoh M., Nagata K. Ischemic tolerance due to the induction of HSP70 in a rat ischemic recirculation model // Brain Res. 1993.-Vol. 615.-P. 281-288.

248. Nogawa S., Forster C., Fangyi Z., Nagayama M., Ross M.E., Iadecola C. Interaction between inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 after cerebral ischemia // Proc Natl AcadSci USA. 1998.-Vol. 95.-P. 10966-10971.

249. Nogawa S., Zhang F., Ross M. E., Iadecola C. Cyclo-oxygenase-2 gene expression in neurons contributes to ischemic brain damage // J Neurosci. 1997. Vol. 17. - P. 27462755.

250. Noh K.M., Yokota H., Mashiko T., Castillo P.E., Zukin R.S., Bennett M.V.L. Blockade of calcium-permeable AMPA receptors protects hippocampal neurons against global ischemia-induced death // PNAS USA. 2005. Vol. 102. - № 34. - P. 12230-12235.

251. Nordstrom C.H., Siesjô B.K. Effects of phénobarbital in cerebral ischemia. Part I: cerebral energy metabolism during pronounced incomplete ischemia // Stroke. 1978. Vol. 9,-№4.-P. 327-335.

252. Nowak L., Bregestovski P., Ascher P., Herbet A., Prochiantz A. Magnesium gates glutamate-activated channels in mouse central neurons // Nature (Lond.). 1984. Vol. 307. -P. 462- 465.

253. Nowycky M.C., Fox A.P. Tsien R.W. Three types of neuronal calcium channel with different calcium agonist sensitivity // Nature. 1985. Vol. 316. - № 6027. - P. 440-443.

254. Obrenovitch T.P. Molecular physiology of preconditioning-induced brain tolerance to ischemia // Physiol Rev. 2008. Vol. 88. - P. 211-247.

255. O'Kelly I., Stephens R.H., Peers C., Kemp P.J. Potential identification of the 02-sensitive K+ current in a human neuroepithelial body-derived cell line // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 1999. Vol. 276. - P. 96-104.

256. O'Kelly I., Lewis A., Peers C., Kemp P.J. O2 sensing by airway chemoreceptor-derived cells. Protein kinase C activation reveals functional evidence for involvement of NADPH- oxidase // J Biol Chem. 2000. Vol. 275. - P. 7684-7692.

257. Opitz T., Grooms S.Y., Bennett M.V., Zukin R.S. Remodeling of a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor subunit composition in hippocampalneurons after global ischemia // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. Vol. 97. - P. 1336013365.

258. Orrenius S., McCabe MJ Jr, Nicotera P. Ca( )-dependent mechanisms of cytotoxicity and programmed cell death // Toxicol Lett. 1992. Vol. 64-65. - P. 357-364.

259. Osipenko O.N., Tate R.J., Gurney A.M. Potential role for kv3.1b channels as oxygen sensors // Circ Res. 2000. Vol. 86. - P. 534-540.

260. Ozyurt E., Graham D.I., Woodruff G.N., McCulloch J. Protective effect of the glutamateantagonist, MK-801 in focal cerebral ischemia in the cat // Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1988. Vol. 8. - P. 138-143.

261. Palaiologos G., Hertz L., Schousboe A. Evidence that aspartate aminotransferase activity and ketodicarboxylate carrier function are essential for biosynthesis of transmitter glutamate // J Neurochem. 1988.-Vol. 51.-№ l.-P. 317-320.

262. Papa S., Skulachev V.P. Reactive oxygen species, mitochondria, apoptosis and aging // Mol Cell Biochem. 1997. Vol. 174. - № 1 -2. - P. 305-319.

263. Pardal R., Ludewig U., Garcia-Hirschfeld J., Lopez-Barneo J. Secretory responses of intact glomus cells in thin slices of rat carotid body to hypoxia and tetraethylammonium // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. Vol. 97. - P. 2361-2366.

264. Park E., Liu Y., Fehlings M.G. Changes in glial cell white matter AMPA receptor expression after spinal cord injury and relationship to apoptotic cell death // Exp Neurol. 2003.-Vol. 182.-P. 35-48.

265. Parvinder K., Aley K.E., Porter J. P., Boyle P.J., Peers C. Hypoxic modulation of Ca2+ signaling in human venous endothelial cells // J of Biol Chem. 2005. Vol. 280. - № 14.-P. 13349-13354.

266. Passafaro M., Nakagawa T., Sala C., Sheng M. Induction of dendritic spines by an extracellular domain of AMPA receptor subunit GluR2 // Nature (Lond). 2003. Vol. 424. -P. 677-681.

267. Peers C. Hypoxic suppression of K+ currents in type I carotid body cells: selective effect on the Ca2+-activated K+ current // Neurosci Lett. 1990. Vol. 119. - P. 253-256.

268. Perez-Garcia M.T., Lopez-Lopez J.R., Gonzalez C. Kvbl.2 subunit coexpression in HEK293 cells confers O2 sensitivity to Kv4.2 but not to Shaker channels // J Gen Physiol. 1999.-Vol. 113.-P. 897-907.

269. Perez-Pinzon M.A., Born J.G. Rapid preconditioning neuroprotection following anoxia in hippocampal slices: role of the K+-ATP channel and protein kinase C // Neuroscience. 1999. Vol. 89. - № 2. - P. 453-459.

270. Petersen O.H., Cancela J.M. New Ca -releasing messengers: are they important in the nervous system? // TINS. 1999. Vol. 22. - № 11. - P. 488-495.

271. Petralia R.S., Wenthold R.J. Light and electron immunocytochemical localization of AMPA-selective glutamate receptors in the rat brain // J Comp Neurol. 1992. Vol. 318. -P. 329-354.

272. Petrovic M., Horak M., Sedlacek M., Vyklicky L. Jr. Physiology and pathology of NMDA receptors // Prague Med Rep. 2005. Vol. 106. - № 2. - P. 113-136.

273. Pietrobon D., Di Virgilio F., Pozzan T. Structural and functional aspects of calcium homeostasis in eukaryotic cells // Eur J Biochem. 1990. Vol. 193. - № 3. - P. 599-622.

274. Piret J.P., Mottet D., Raes M., Michiels C. Is HIF-lalpha a pro- or an anti-apoptotic protein? // Biochem Pharmacol. 2002. Vol. 64. - P. 889-892.

275. Plata-Salaman C.R., Oomura Y., Kai Y. Tumor necrosis factor and interleukin-1 beta: suppression of food intake be direct action in the central nervous system // Brain Res. 1988.-Vol. 448.-P. 106-114.

276. Piatt S.R. The role of glutamate in central nervous system health and disease // Vet J. 2007. Vol. 173. - № 2. - P. 278-286.

277. Popot J.L., Changeux J.P. Nicotinic receptor of acetylcholine: structure of an oligomeric integral membrane protein // Physiol Rev. 1984. Vol. 64. - № 4. - P. 11621239.

278. Prass K., Ruscher K., Karsch M., Isaev N., Megow D., Priller J., Scharff A., Dirnagl U., Meisel A. Desferoxamine induces delayed tolerance against cerebral ischemia in vivo and in vitro // J Cereb Blood Flow Metab. 2002. Vol. 22. - P. 520-525.

279. Prass K., Scharff A., Ruscher K., Lowl D., Muselmann C., Victorov I., Kapinya K., Dirnagl U., Meisel A. Hypoxia-induced stroke tolerance in the mouse is mediated by erythropoietin // Stroke. 2003. Vol. 34. - P. 1981-1986.

280. Proenza C., O'Brien J., Nakai J., Mukherjee S., Allen P.D., Beam K.G. Identification of a region of RyRl that participates in allosteric coupling with the alpha(lS) (Ca(V)l.l) II-III loop // J Biol Chem. 2002. Vol. 277. - № 8. - P. 6530-6535.

281. Protasi F. Structural interaction between RYRs and DHPRs in calcium release units of cardiac and skeletal muscle cells // Front Biosci. 2002. Vol. 7. - P. 650-658.

282. Pulsinelli W.A., Brierley J.B., Plum F. Temporal profile of neuronal damage in a model of transient forebrain ischemia // Ann Neurol. 1982. Vol. 11. - № 5. - P. 491-498.

283. Queiroz G., Meyer D.K., Meyer A., Starke K., von Kugelgen I. A study of the mechanism of the release of ATP from rat cortical astroglial cells evoked by activation of glutamate receptors // Neuroscience. 1999. Vol. 91. - P. 1171-1181.

284. Racine R.J., Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizures // Electroencephalog Clin Neurophysiol. 1972. Vol. 32. - P. 281-294.

285. Rajdev S., Reynolds I.J. Effects of pH on the actions of dizocilpine at the N-methyl-D-aspartate receptor complex // Br J Pharmacol. 1993. Vol. 109. - P. 107-112.

286. Rankin E.B., Giaccia A.J. The role of hypoxia-inducible factors in tumorigenesis // Cell Death Differ. 2008. Vol. 15. - P. 678-685.

287. Reuter H. A variety of calcium channels // Nature. 1985. Vol. 316. - № 6027. - P. 391.

288. Rocca D.L., Martin S., Jenkins E.L., Hanley J.G. Inhibition of Arp2/3-mediated actin polymerization by PICK1 regulates neuronal morphology and AMP A receptor endocytosis // Nat Cell Biol. 2008. Vol. 10. - № 3. - P. 259-271.

289. Rochefort N.L., Jia H., Konnerth A. Calcium imaging in the living brain: prospects for molecular medicine // Trends Mol Med. 2008. Vol. 14. - № 9. - P. 389-399.

290. Rogers S.W., Hughes T.E., Hollmann M., Gasic G.P., Deneris E.S., Heinemann S. The characterization and localization of the glutamate receptor subunit GluRl in the rat brain//J Neurosci. 1991.-Vol. 11.-P. 2713-2724.

291. Roots R., Okada S. Estimation of life times and diffusion distances of radicals involved in x-ray-induced DNA strand breaks of killing of mammalian cells // Radiat Res. 1975. Vol. 64. - № 2. - P. 306-320.

292. Rosenbluth J. Subsurface cisternae and their relationship to the neuronal plasma membrane // J Cell Biol. 1962. Vol. 13. - P. 405-421.

293. Ross A.D., Dey I., Janes N., Israel Y. Effect of antithyroid drugs on hydroxyl radical formation and alpha-1-proteinase inhibitor inactivation by neutrophils, therapeutic implications // J Pharmacol Exp Ther. 1998. Vol. 285. -№ 3. - P. 1233-1238.

294. Ryan H.E., Lo J., Johnson R.S. HIF-1 is required for solid tumor formation and embryonic vascularization // EMBO J. 1998. Vol. 17. - P. 3005-3015.

295. Rychkov G.Y., Adams M.B., McMillen I.C., Roberts M.L. Oxygen-sensing mechanisms are present in the chromaffin cells of the sheep adrenal medulla before birth // J Physiol. 1998. Vol. 509. - P. 887-893.

296. Sadek H.A., Nulton-Persson A.C., Szweda P.A., Szweda L.I. Cardiac ischemia/reperfusion, aging, and redox-dependent alterations in mitochondrial function // Arch Biochem Biophys. 2003. Vol. 420. - № 2. - P. 201-208.

297. Saleh A., Srinivasula S.M., Balkir L., Robbins P.D., Alnemri E.S. Negative regulation of the Apaf-1 apoptosome by Hsp 70 // Nat Cell Biol. 2000. Vol. 2. - P. 476483.

298. Sanders R.D., Manning H.J., Robertson N.J., Ma D., Edwards A.D., Hagberg H., Maze M. Preconditioning and postinsult therapies for perinatal hypoxic-ischemic injury at term//Anesthesiology. 2010.-Vol. 113.-№ l.-P. 233-249.

299. Satrustegui J., Villalba M., Pereira R., Bogonez E., Martinez-Serrano A. Cytosolic and mitochondrial calcium in synaptosomes during aging // Life Sci. 1996. Vol. 59. - № 5-6. - P. 429-434.

300. Sawada M., Suzumura A., Hasoya H., Marunouchi T., Nagatsu T. Interleukin-10 inhibits both production of cytokines and expression of cytokine receptors in micriglia // J Neurochem. 1999.-Vol. 72.-P. 1466-1471.

301. Schäfers M., Sorkin L. Effect of cytokines on neuronal excitability // Neurosci Lett. 2008.-Vol. 437.-P. 188-193.

302. Schatzmann U., Koehli M., Dudan F., Rohr W., Jones R.S. Effect of postural changes on certain circulatory and respiratory values in the horse // Am J Vet Res. 1982. -Vol. 43,-№6. -P. 1003-1005.

303. Scheinberg P. The biologic basis for the treatment of acute stroke // Neurology. 1991.-Vol. 41.-№ 12.-P. 1867-1873.

304. Sharp F.R., Ran R., Lu A., Tang Y., Strauss K.I., Glass T., Ardizzone T., Bernaudin M. Hypoxic preconditioning protects against ischemic brain injury // NeuroRx. 2004. Vol. 1.- P. 26-35.

305. Sharp F.R., Bernaudin M. HIF1 and oxygen sensing in the brain // Nat Rev Neurosci. 2004.-Vol. 5.-P. 437-448.

306. Sharma G., Vijayaraghavan S. Modulation of presynaptic store calcium induces release of glutamate and postsynaptic firing // Neuron. 2003. Vol. 38. - № 6. - P. 929939.

307. Sharma S., Yang B., Xi X.P., Grotta J.C., Aronowski J., Savitz S.I. IL-10 directly protects cortical neurons by activating PI-3 kinase and STAT-3 pathways // Brain Res. 2011. -Vol. 1373.-P. 189-194.

308. Sheng M., Hyoung Lee S. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity: major unanswered questions // Neurosci Res. 2003. Vol. 46. - P. 127-134.

309. Shuttleworth T.J., Thompson J.L., Mignen O. ARC channels: a novel pathway for receptor-activated calcium entry // Physiology (Bethesda). 2004. Vol. 19. - P. 355-361.

310. Shoshan-Barmatz V., Ashley R.H. The structure, function, and cellular regulation of ryanodine-sensitive Ca2+ release channels // Int Rev Cytol. 1998. Vol. 183. - P. 185-270.

311. Seeburg P.H. The TINS/TiPS Lecture. The molecular biology of mammalian glutamate receptor channels // Trends Neurosci. 1993. Vol. 16. - № 9. - P. 359-365.

312. Selkoe D.J. Cell biology of protein misfolding: the examples of Alzheimer's and Parkinson's diseases // Nat Cell Biol. 2004. Vol. 6. - № 11. - P. 1054-1061.

313. Semenza G.L. Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor-1 // Annu Rev Cell Dev Biol. 1999. Vol. 15. - P. 551-578.

314. Semenza G.L. Expression of hypoxia-inducible factor-1: a novel predictive and prognostic parameter in the radiotherapy of oropharyngeal cancer // Cancer Res. 2001. -Vol. 61.-P. 2911.

315. Semenza G.L. Targeting HIF-1 for cancer therapy // Nat Rev Cancer. 2003. Vol. 3. -P. 721-32.

316. Siesjo B.K., Bendek G., Koide T., Westerberg E., Wieloch T. Influence of acidosis on lipid peroxidation in brain tissues in vitro // J Cereb Blood Flow Metab. 1985. Vol. 5. -№2.-P. 253-258.

317. Siesjo B.K. Oxygen deficiency and brain damage: localization, evolution in time, and mechanisms of damage // J Toxicol Clin Toxicol. 1985. Vol. 23. - № 4-6. - P. 267-280.

318. Siesjo B.K. Calcium and ischemic brain damage // Eur Neurol. 1986. Vol. 25. - № l.-P. 45-56.

319. Siesjo B.K., Bengtsson F. Calcium fluxes, calcium antagonists, and calcium-related pathology in brain ischemia, hypoglycemia, and spreading depression: a unifying hypothesis // J Cereb Blood Flow Metab. 1989. Vol. 9. - № 2. - P. 127-140.

320. Silver I.A., Erecinska M. Intracellular and extracellular changes of Ca2+. in hypoxia and ischemia in rat brain in vivo // J Gen Physiol. 1990. Vol. 95. - P. 837-866.

321. Silver I.A., Erecinska M. Ion homeostasis in rat brain in vivo: intra- and extracellular Ca2+. and [H+] in the hippocampus during recovery from short-term, transient ischemia // J Cereb Blood Flow Metab. 1992. Vol. 12. - № 5. - P. 759-772.

322. Simon R.P., Niiro M., Gwinn R. Prior ischemic stress protects against experimental stroke//Neurosci Lett. 1993.-Vol. 163.-P. 135-137.

323. Simpson P.B., Challis R.A.J., Nahorski S.R. Neuronal Ca2+ stores: activation and function // Trends Neurosci. 1995. Vol. 18. - P. 299-306.

324. Slevin M., Krupinski J., Kumar P., Gaffney J., Kumar S.J. Gene activation and protein expression following ischaemic stroke: strategies towards neuroprotection // Cell Mol Med. 2005. Vol. 9. - № 1. - P. 85-102.

325. Smith E.M., Cadet P., Stefano G.B., Opp M.R., Hughes Jr T.K. IL-10 as a mediator in the HP A axis and brain // J Neuroimmunol. 1999. Vol. 100. - P. 140-148.

326. Sommer C., Fahrner A., Kiessling M. H.muscimol binding to y-aminobutyric acidA receptors is upregulated in CA1 neurons of the gerbil hippocampus in the ischemia-tolerant state // Stroke. 2002. Vol. 33. - P. 1698-1705.

327. Soriano F.X., Papadia S., Hofmann F., Hardingham N.R., Bading H., Hardingham G.E. Preconditioning doses of NMDA promote neuroprotection by enhancing neuronal excitability // J Neurosci. 2006. Vol. 26. - P. 4509-4518.

328. Soucek T., Cumming R., Dargusch R., Maher P., Schubert D. The regulation of glucose metabolism by HIF-1 mediates a neuroprotective response to amyloid beta peptide // Neuron. 2003. Vol. 39. - P. 43-56.

329. Spacek J., Harris K.M. Three-dimensional organization of smooth endoplasmic reticulum in hippocampal CA1 dendrites and dendritic spines of the immature and mature rat // J Neurosci. 1997. Vol. 17. - P. 190-203.

330. Spires T.L., Hyman B.T. Transgenic models of Alzheimer's disease: learning from animals // NeuroRx. 2005. Vol. 2. - №3. - P. 423-437.

331. Srinivas V., Zhu X., Salceda S., Nakamura R., Caro J. Hypoxia-inducible factor la (HIF-la) is a non-heme iron protein. Implications for oxygen sensing // J Biol Chem. 1998. -Vol. 273.-P. 18019-18022.

332. Stadtman E.R., Levine R.L. Protein oxidation // Ann NY Acad Sci. 2000. Vol. 899. -P. 191-208.

333. Stankiewicz A.R., Lachapelle G., Foo C.P., Radicioni S.M., Mosser D.D. Hsp70 inhibits heat-induced apoptosis upstream of mitochondria by preventing Bax translocation // J Biol Chem. 2005. Vol. 280. - P. 38729-38739.

334. Starkov A.A., Chinopoulos C., Fiskum G. Mitochondrial calcium and oxidative stress as mediators of ischemic brain injury // Cell Calcium. 2004. Vol. 36. - № 3-4. - P. 257-264.

335. Stellwagen D., Beattie E.C., Seo J.Y., Malenka R.C. Differential regulation of AMPA receptor and GABA receptor trafficking by tumor necrosis factor-a // J of Neurosci. 2005. Vol. 25. - № 12. - P. 3219-3228.

336. Stern-Bach Y., Russo S., Neuman M., Rosenmund C. A point mutation in the glutamate binding site blocks desensitization of AMPA receptors // Neuron. 1998. Vol. 21. -P. 907-918.

337. Strle K., Zhou J.H., Shen W.H., Broussard S.R., Johnson R.W., Freund G.G., Dantzer R., Kelly K.W. Interleukin-10 in the brain // Crit Rev Immunol. 2001. Vol. 21. -№5.-P. 427-449.

338. Sun M.K., Reis D.J. Hypoxia-activated Ca2+ currents in pacemaker neurones of rat rostral ventrolateral medulla in vitro // J Physiol. 1994. Vol. 476. - P. 101-116.

339. Sun Y., Jin K., Xie L., Childs J., Mao X.O., Logvinova A., Greenberg D.A. VEGF-induced neuroprotection, neurogenesis, and angiogenesis after focal cerebral ischemia // J Clin Invest. 2003.-Vol. 111.-P. 1843-1851.

340. Sun Y., Ouyang Y.B., Xu L., Chow A.M., Anderson R., Hecker J.G., Giffard R.G. The carboxyl-terminal domain of inducible Hsp70 protects from ischemic injury in vivo and in vitro // J Cereb Blood Flow Metab. 2006. Vol. 26. - P. 937-950.

341. Sutko J.L., Airey J.A., Welch W., Ruest L. The pharmacology of ryanodine and related compounds // Pharmacol Rev. 1997. Vol. 49. - № 1. - P. 53-98.

342. Swope S.L., Moss S.J., Raymond L.A., Huganir R.L. Regulation of ligand-gated ion channels by protein phosphorylation // Adv Second Messenger Phosphoprotein Res. 1999. -Vol. 33.-P. 49-78.

343. Tai M.H., Chang C.C., Kiupel M., Webster J.D., Olson L.K., Trosko J.E. Oct-4 expression in adult human stem cells: evidence in support of the stem cell theory of carcinogenesis // Carcinogenesis. 2005. Vol. 26. - P. 495-502.

344. Tancredi V. Long-lasting changes in synaptic excitability induced by anoxia in the rat hippocampus // Prog Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiat. 1997. Vol. 21. - P. 211232.

345. Taylor B.L., Zhulin I.B. PAS domains: internal sensors of oxygen, redox potential, and light // Microbiol Mol Biol Rev. 1999. Vol. 63. - P. 479-506.

346. Thomlinson R., Gray L. Br. J. The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy // Cane. 1955. Vol. 9. - P. 539-549.

347. Thrower E.C., Hagar R.E. Ehrlich B.E. Regulation of Ins(l,4,5)P3 receptor isoforms by endogenous modulators // Trends Pharmacol Sci. 2001. Vol. 22. - № 11. - P. 580-586.

348. Terasaki M., Traverse Slater N., Fein A., Schmidek A., Reese T.S. Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons // Proc Natl Acad Sci USA. 1994.-Vol. 91.-P. 7510-7514.

349. Tsien R.W. Calcium channels in excitable cell membranes // Annu Rev Physiol. 1983.-Vol. 45.-P. 341-358.

350. Unruh A., Ressel A., Mohamed H.G., Johnson R.S., Nadrowitz R., Richter E., Katschinski D.M., Wenger R.H. The hypoxia-inducible factor-1 is a negative factor for tumor therapy // Oncogene. 2003. Vol. 22. - P. 3213-3220.

351. Vanhoutte P., Bading H. Opposing roles of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in neuronal calcium signaling and BDNF gene regulation // Curr Opin Neurobiol. 2003.-Vol. 13.-P. 366-371.

352. Vaupel P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology // Semin Radiat Oncol. 2004. Vol. 14. - P.-198-206.

353. Verkhratsky A. Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons // Physiol Rev 2005. Vol. 85. - P. 201-279.

354. Vitkovic L., Bockaert J., Jacque C. "Inflammatory" cytokines: neuromodulators in normal brain? // J Neurochemistry. 2000. P. 74. - P. 457-471.

355. Vitorica J., Satrustegui J. The influence of age on the calcium-efflux pathway and matrix calcium buffering power in brain mitochondria // Biochim. Biophys. Acta. 1986. -Vol. 851,-№2.-P. 209-216.

356. Walsh D.M., Selkoe D.J. Deciphering the molecular basis of memory failure in Alzheimer's disease // Neuron. 2004. Vol. 44. - № 1. - P. 181-193.

357. Walton P.D., Airey J.A., Sutko J.L., Beck C.F., Mignery G.A., Sudhof T.C., Deerinck T.J., Ellisman M.H. Ryanodine and inositol trisphosphate receptors coexist in avian cerebellar Purkinje neurons // J Cell Biol. 1991. Vol. 113. - P. 1145-1157.

358. Wang G.L., Jiang B.H., Rue E.A., Semenza, G.L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension // Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1995.-Vol. 92.-P. 5510-5514.

359. Weir E.K., Archer S.L. The mechanism of acute hypoxic pulmonary vasoconstriction: the tale of two channels // FASEB J. 1995. Vol. 9. - P. 183-189.

360. Weiss J.H., Sensi S.L. Ca -Zn permeable AMPA or kainate receptors: possible key factors in selective neurodegeneration // Trends Neurosci. 2000. Vol. 23. - № 8. - P. 365-371.

361. Whitlock J.R., Heynen A.J., Shuler M.G., Bear M.F. Learning induces long-term potentiation in the hippocampus // Science. 2006. Vol. 313. - № 5790. - P. 1093-1097.

362. Wo Z.G., Oswald R.E. Transmembrane topology of two kainate receptor subunits revealed by N-glycosylation // Proc Natl Acad Sci USA. 1994. Vol. 91. - P. 7154-7158.

363. Woon S.J., Kim D., Yand Gwang J.B. Cellular and molecular pathways of ischemic neuronal death // J Biochem Mol Biol. 2002. Vol. 35. - № 1. - P. 67-86.

364. Wrona D. Neural immune interactions: an integrative view of the bidirectional relationship between the brain and immune systems // J Neuroimmunol. 2006. - Vol. 172. -P. 38-58.2+ +

365. Wyatt C.N., Peers C. Ca -activated K channels in isolated type I cells of the neonatal rat carotid body // J Physiol. 1995. Vol. 483. - P. 559-565.

366. Yau K.W., Baylor D.A. Cyclic GMP-activated conductance of retinal photoreceptor cells // Annu Rev Neurosci. 1989. Vol. 12. - P. 289-327.

367. Yoshioka A., Bacskai B., Pleasure D. Pathophysiology of oligodendroglial excitotoxicity // J Neurosci Res. 1996. Vol. 46. - P. 427-437.

368. Youngson C., Nurse C., Yeger H., Cutz E. Oxygen sensing in airway chemoreceptors //Nature. 1993. Vol. 365. - P. 153-155.

369. Zablocka B. Domariska-Janik K. Enhancement of 3H.D-aspartate release during ischemia like conditions in rat hippocampal slices: source of excitatory amino acids // Acta Neurobiol Exp (Wars). 1996. Vol. 56. - № 1. - P. 63-70.

370. Zauner A., Daugherty W.P., Bullock M.R., Warner D.S. Brain oxygenation and energy metabolism: part biological function and pathophysiology // Neurosurgery. 2002. -Vol. 51. -№ 2. P. 289-301.

371. Zemke D., Smith J.L., Reeves M.J., Majid A. Ischemia and ischemic tolerance in the brain: an overview // Neurotoxicology. 2004. Vol. 25. - P. 895-904.

372. Zhang Q.G., Wang R.M., Han D., Yang L.C., Li J., Brann D.W. Preconditioning neuroprotection in global cerebral ischemia involves NMDA receptor-mediated ERK-JNK3 crosstalk // Neurosci Res. 2009. Vol. 63. - № 3. - P. 205-12.

373. Zhu W.H., Conforti L., Czyzyk-Krzeska M.F., Millhorn D.E. Membrane depolarization in PC 12 cells during hypoxia is regulated by an 02-sensitive K+ current // Am J Physiol Cell Physiol. 1996. Vol. 271. - P. 658-665.

374. Zhu P.J., Krnjevic K. Persistent block of CA1 synaptic function by prolonged hypoxia // Neuroscience. 1999. Vol. 90. - № 3. - P. 759-770.

375. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ1. Статьи в журналах

376. Turovskaya М. V., Turovsky Е.А., Zinchenko V.P., Levin S.G., Shamsutdinova A.A., Godukhin

377. О. V. Repeated brief episodes of hypoxia modulate the calcium responses of ionotropic glutamate receptors in hippocampal neurons. Neurosci. Lett., 2011. Vol. 496 (№1): 11-14.

378. Туровская М.В., Кононов A.B., Туровский Е.А., Зинченко В.П. Избирательная гибель гамкергических нейронов при действии кратковременных эпизодов гипоксии. «Экспериментальная и теоретическая биофизика '12», Пущино 2012стр

379. Туровская М.В., Туровский Е.А., Зинченко В.П. интерлейкин-10 препятствует появлению признаков постгипоксической гипервозбудимости в нейронах гиппокампа. «Экспериментальная и теоретическая биофизика '12», Пущино 2012 стр.

Информация о работе

Туровская, Мария Владимировна
кандидата биологических наук
Пущино, 2013
ВАК 03.01.02

Диссертация

Ca2+-зависимые механизмы устойчивости нейронов гиппокампа к повреждающим факторам гипоксии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы