Антигипоксическое и нейропротекторное действие N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипоксии in vivo и in vitro

Митрошина, Елена Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Антигипоксическое и нейропротекторное действие N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипоксии in vivo и in vitro
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Антигипоксическое и нейропротекторное действие N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипоксии in vivo и in vitro"

На правах р

МИТРОШИНА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

АНТИГИПОКСИЧЕСКОЕ И НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ N-АРАХИДОНОИЛДОФАМИНА ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ОСТРОЙ ГИПОКСИД/ZV VIVO И IN VITRO

03.03.01 - физиология 03.03.04- клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005557222 1 5 fr.3 2CÍ5

Москва - 2014 г.

005557222

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук

Мухина Ирина Васильевна Хаспеков Леонид Георгиевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Зинченко Валерий Петрович

заведующий лабораторией внутриклеточной сигнализации Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт биофизики клетки» РАН

Доктор биологических наук, профессор Савельев Сергей Вячеславович заведующий лабораторией развития нервной системы Федерального государственного бюджетного учреждения «Институт морфологии человека» РАМН

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии» РАН

Защита состоится «16» февраля 2015 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 на базе государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке и на сайте http://rsmu.ru ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «../.?...» .....^г^.^^гг?.. 2014

года

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук, доцент Кузнецова Татьяна Евгеньевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Регуляция физиологических функций организма является одной из актуальных проблем как физиологии, так и медицины. Поиск новых молекулярных мишеней управления позволяет не только изучить фундаментальные основы жизнедеятельности организма, но и разработать новые пути коррекции и предупреждения функциональных нарушений, возникающих при воздействии стрессогенных факторов.

Эндоканнабиноиды принадлежат к одному из активно изучаемых в последнее время семейств нейроактивных регуляторных липидов. Согласно современным концепциям о роли и функции эндогенной каннабиноидной системы в организме, нейроактивные липиды играют важную роль в регуляции процессов метаболизма, воспаления, боли, модуляции синаптической передачи и поддержании нормального функционирования нервной системы, в том числе процессов обучения, памяти, пищевого и оборонительного поведения (Хаспеков, Бобров, 2006; Riedel, Davies, 2005; Pertwee, 2006; Sagie et al., 2013; Davis, 2014; Morena, Campolongo, 2014; Tan et al., 2014; Younts, Castillo, 2014; Капо, 2014).

N-арахидоноилдофамин (N-ADA) - относительно недавно описанный и синтезированный эндоканнабиноид. N-ADA относится к группе N-ацилдофаминов (амидов длинноцепочечных жирных кислот) и представляет собой амид арахидоновой кислоты с дофамином (Walker et al., 2004; Bobrov et al., 2008), имеющий высокое сродство с канабинидными рецепторами 1-го и 2-го типов (CBR-1 и CBR-2) и практически не связывающийся с дофаминовыми рецепторами (Bisogno et al., 2000). Поскольку N-ADA также активирует и ванилоидные рецепторы (TRPV1) (Caterina, Julius, 2001; van der Stelt, Di Marco, 2004; Bradshow, Walker, 2005), его характеризуют как CBR-1/TRPV1-гибридный лиганд. Активация CBR-1 в новой коре (особенно в ее фронтальных отделах), мозжечке, гиппокампе, стволе головного мозга, базальных ганглиях, миндалине, гипоталамусе (Mackie et al., 2005) отвечает за поведенческие реакции животных, называемые классической каннабиноидной тетрадой: гипотермия, каталепсия, анальгезия, сниженная двигательная активность (Compton et al., 1993; Adams, Martin, 1996; Zimmer et al., 1996). На субклеточном уровне CBR-1 преимущественно локализованы на пресинаптических аксонных терминалях, в том числе в пресинаптической активной зоне, где они участвуют в регуляции высвобождения нейромедиаторов (Katona et al., 1999; Kofalvi et al., 2007), а также на мембранах митохондрий нейронов, где непосредственно регулируют клеточное дыхание и выработку энергии. Активация митохондриальных CBR-1 экзогенными каннабиноидами снижает концентрацию цАМФ, активность протеинкиназы А, активность I ферментативного комплекса и дыхание в митохондриях нейронов (Benard G. et al., 2012).

Физиологический механизм регуляции синаптической передачи в возбуждающих и тормозных синапсах N-арахидоноилдофамином путем

ретроградного ингибирования выброса нейротрансмиттеров, т.е. через активацию обратной отрицательной связи, для поддержания гомеостаза нейронной сети предполагает возможность включения этого нейролипина в состав эндогенной стресс-лимитирующей системы мозга, участвующей в ограничении повреждений тканей в условиях ответной реакции клеток на стрессогенные факторы, одним из которых является гипоксия.

Снижение поступления кислорода к тканям приводит к дисрегуляции окислительного фосфорилирования и процессов синаптической передачи, гибели клеток и разрушению нейронных сетей (Netto et al., 1993; Hodges, 1996; Virley et al., 1999; Лукьянова, Ушаков, 2004). Суммарно все эти процессы способствуют нарушению мнестических и когнитивных функций мозга (Yamomoto et al., 1993; Tanaka et al., 1998; Netto et al., 1993; Karasava et al., 1994; Nakagura, 2002).

Изучение роли эндогенной каннабиноидной системы в цитопротекции при гипоксии позволит найти новую мишень для разработки способов коррекции и предупреждения возникающей при гипоксии дисфункции мозга. В настоящее время существует значительное количество работ, посвященных изучению нейропротекторных свойств различных агонистов CBR (анандамида, 2-арахидоноилглицерина, WIN 55.212-2 и ряда других) при различных видах повреждения головного мозга (Nagayama et al., 1999; Panikashvili et al., 2001; Maresz et al., 2007; Mechoulam and Shohami, 2007; Koch et al., 2010; Pazos et al., 2013; Lara-Celador et al., 2013; Chiarlone et al., 2014; Dhopeshwarkar & Mackie, 2014). При этом нейропротекторные свойства N-ADA изучены пока недостаточно. В ряде работ показано, что N-ADA обладает антиоксидантными и нейропротекторными свойствами, сокращая объем очага инфаркта у животных при моделировании фокальной ишемии и повышая выживаемость нейронов в культуре in vitro при моделировании окислительного стресса, активации апоптоза к эксайтотоксичности (Bobrov et al., 2008; Бобров с соавт., 2010; Grabiec et al., 2012). Однако в целом механизмы его нейропротекторных свойств остаются на сегодняшний день мало изученными, а экспериментальные данные по объяснению эффектов N-ADA противоречивы и являются предметом дискуссии.

Исследование влияния N-ADA на сохранение функциональной активности нейронов и жизнеспособности нервных клеток при моделировании гипоксии in vitro, а также на поддержание поведенческих и когнитивных функций животных при гипоксических повреждениях ЦНС на сегодняшний день не проводилось.

Таким образом, вопросы, связанные с ролью N-ADA в регуляции синаптической передачи и функций ЦНС, остаются открытыми. Изучение эффекта, оказываемого N-ADA при гипоксическом воздействии in vitro и in vivo, позволит выявить роль нейролипинов в составе антистрессорной системы организма и предложить новые терапевтические подходы к коррекции состояний, связанных с неадекватным снабжением тканей и органов, и прежде всего нервной системы, кислородом.

Цель исследования

Целью работы явилось изучение антигипоксических и нейропротекторных свойств N-ADA при моделировании острой гипоксии в культуре клеток гиппокампа и острой гипобарической гипоксии in vivo.

Задачи исследования

1. Изучить влияние N-ADA на индуцированные гипоксией изменения спонтанной биоэлектрической активности нейронной сети в первичной культуре клеток гиппокампа.

2. Исследовать ранние и отдаленные эффекты действия N-ADA на индуцированные гипоксией изменения спонтанной кальциевой активности нейронной сети в первичной культуре клеток гиппокампа.

3. Изучить влияние N-ADA на выживаемость клеток в первичной культуре клеток гиппокампа, подвергнутых гипоксии.

4. Исследовать антигипоксические и нейропротекторные свойства N-ADA в условиях острой гипобарической гипоксии in vivo.

5. Оценить вклад каннабиноидных и ванилоидных рецепторов в реализацию цитопротекторного действия N-ADA при моделировании гипоксии in vitro и in vivo.

Научная новизна

Впервые выявлены ранние и отдаленные эффекты, оказываемые N-ADA на индуцированные острой нормобарической гипоксией изменения спонтанной биоэлектрической активности нейронной сети в культуре клеток гиппокампа, проявляющиеся в поддержании сетевой биоэлектрической активности нейронов в период гипоксии, а также сохранении паттерна сетевой пачки импульсов в отдаленном постгипоксическом периоде.

Впервые обнаружено, что N-ADA уменьшает индуцированные гипоксией изменения спонтанной кальциевой активности нейронной сети в культуре клеток гиппокампа, что выражается в нормализации длительности и частоты спонтанных кальциевых осцилляции в отдаленном постгипоксическом периоде.

Установлено, что превентивная аппликация N-ADA (10 мкМ) при моделировании гипоксии и в 1 сутки после нее предотвращает гибель клеток гиппокампа in vitro, вызванную кислородной депривацией.

Установлено, что ведущую роль в реализации антигипоксического и нейропротекторного эффектов N-ADA играет активация каннабиноидных рецепторов 1 типа (CBR-1) и ванилоидных рецепторов (TRPV1).

Показано, что распределение CBR-1 и CBR-2 в культивируемых клетках гиппокампа в результате воздействия острой нормобарической гипоксии изменяется. Введение N-ADA во время гипоксии и в первые сутки после нее предотвращает снижение размеров и числа кластеров CBR-2 и повышает количество кластеров CBR-1, сохраняя их нормальные размеры.

Впервые изучен антигипоксический эффект превентивного парентерального применения N-ADA при моделировании острой гипобарический гипоксии у мышей. Показано, что N-ADA повышает резистентность к острой гипобарической гипоксии, что проявляется в более высоком проценте выживаемости животных на высоте «смертельной

площадки», а также сохранении мнестических функций ЦНС мышей в отдаленном постгипоксическом периоде.

Научно-практическая значимость

Полученные результаты расширяют имеющиеся фундаментальные знания о нейропротекторной роли N-ADA и выявляют его антигипоксические свойства. Показано, что превентивная аппликация N-ADA при моделировании острой гипоксии in vitro поддерживает функциональную активность нейронных сетей в культуре клеток гиппокампа мыши как по данным биоэлектрической активности, так и по параметрам изменения содержания внутриклеточного кальция. При моделировании гипоксии in vivo превентивное применение NADA повышает резистентность мышей к гипоксии, улучшает восстановление мнестических функций после реоксигенации. Продемонстрированы рецептор-зависимые механизмы антигипоксического действия N-ADA.

Полученные результаты являются экспериментальным обоснованием возможности практического использования N-ADA в качестве фармакологического агента, способного препятствовать патологическим морфофункциональным изменениям в нервной системе при острой гипоксии и активировать репаративные процессы в постгипоксический период.

Основные положения, выносимые на защиту

1. N-ADA обладает выраженным антигипоксическим и нейропротекторным действием при моделировании острой гипоксии in vitro и in vivo.

2. Антигипоксическое действие N-ADA опосредуется прежде всего через каннабиноидные рецепторы ! типа (CBR-1) и ванилоидные рецепторы (TRPV1), тогда как активация каннабиноидных рецепторов 2 типа (CBR-2) оказывает менее выраженный нейропротекторный эффект.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на Международном симпозиуме «Topical Problems of Biophotonics — 2009» (Нижний Новгород, 2009), XIV Нижегородской сессии молодых ученых «Естественные науки науки» (Нижний Новгород, 2009), XV Международной конференции по нейрокибернетике (Нижний Новгород, 2009), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009), Всероссийской конференции с международным участием «Гиппокамп и память: норма и патология»» (Пущино, 2009), VI международном конгрессе «Оптика - XXI век» (Санкт - Петербург, 2010), XXI Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), 7-м Международном Европейском форуме нейронаук (7th FENS forum of European Neuroscience, Amsterdam, 2010), Международной конференции «Speckle2010:speckle fields forever" (Brazil, Florianopolis, 2010), Международном симпозиуме «Topical Problems of Biophotonics — 2011» (St. Peterburg - Nizhny Novgorod, 2011), X научной сессии молодых ученых и студентов «Современное решение актуальных научных проблем в медицине» (Нижний Новгород, 2011), IV Всероссийском Съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012), Международном конгрессе «International Brain Injury Association's Ninth World Congress on Brain injury» (Edinburgh, Scotland, 2012);

Международном симпозиуме «Topical Problems of Biophotonics-2013» (Нижний Новгород, 2013); XXII Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013); X международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2014); Международном симпозиуме «International Scientific School «Frontiers in modern neuroscience» (Nizhny Novgorod, 2014); Международном симпозиуме «8lh International Symposium on Neuroprotection and Neurorepair» (Magdeburg, Germany, 2014); 9-м Международном Европейском форуме нейронаук «9th FENS Forum of Neuroscience» (Milan, Italy, 2014).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 31 печатная работа, 7 из которых - статьи в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК, в том числе 4 статьи в рецензируемых научных изданиях, индексируемых в системах цитирования Scopus, 2 статьи в рецензируемых научных изданиях, индексируемых в системах цитирования Web of Science, 2 - в сборниках статей, 22 -материалы конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа в объеме 147 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 24 отечественных и 193 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 35 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследований in vitro служили первичные диссоциированные культуры клеток гиппокампа, полученные от 18-дневных мышиных эмбрионов линии СВА. Всего в экспериментах была использована 361 культура.

В опытах in vivo использовали 116 4-х недельных самцов мышей линии C57BL/6. Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали нормативам, указанным в Приказе Минздрава России № 708н от 23.08.10 «Об утверждении Правил лабораторной практики» и были согласованы с этическим комитетом при ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава России

Культивирование первичных диссоциированных клеток гиппокампа.

Диссоциирование нервных клеток достигалось путем обработки ткани эмбрионального гиппокампа 0,25% трипсином. Клетки ресуспендировали в нейробазальной среде Neurobasal™ (Invitrogen) в комплексе с биоактивной добавкой В27 (Invitrogen), глутамином (Invitrogen), эмбриональной телячьей сывороткой (ПанЭко) и культивировали, согласно ранее разработанному протоколу (Мухина И.В. и др., 2009), в течение 28 дней in vitro (DIV) на мультиэлектродных матрицах систем МЕА60 (Multichannel Systems, Германия) и MED64 (AlfaMed Science, Япония). Для исследования кальциевой активности и проведения иммуноцитохимических исследований посадка культур проводилась на покровные стекла размером 18x18 мм, для оценки жизнеспособности клетки культивировали на 48-луночных планшетах (Costar).

Исходная плотность культур на матрицах составляла 9000 кл/мм2. Жизнеспособность культур поддерживалась в С02-инкубаторе при температуре 35,5°С и газовой смеси, содержащей 5% С02 в течение месяца.

Регистрация и анализ спонтанной сетевой биоэлектрической активности нейронов. Спонтанную биоэлектрическую активность нейронов регистрировали с помощью мультиэлектродных матриц системы MED64 (Alfa Med Science, Япония), содержащей 64 микроэлектрода и МЕА60 (Multichannel Systems, Германия), содержащей 60 микроэлектродов. Внеклеточные потенциалы действия (спайки), характеризующие биоэлектрическую активность нейронов культуры гиппокампа, регистрировали на 21-й день культивирования (DIV) в исходном состоянии, при моделировании 10-минутной гипоксии, во время реоксигенации, через 2 часа после гипоксии и каждые 24 часа в течение 7 последующих дней. Исследовали следующие характеристики биоэлектрической активности: количество малых сетевых пачек; количество спайков в малой сетевой пачке. Критерием малой сетевой пачки являлось наличие спайков минимум на 4-х различных электродах матрицы с межспайковым интервалом ire более 100 мс. Для количественной обработки и анализа полученных данных использовался набор программного обеспечения Conductor™ (Alpha MED Sciences, Japan), а также пакет прикладных программ Matlab (The Math Works).

Функциональный кальциевый имиджинг. Для исследований функциональной активности возбудимых и невозбудимых клеток в культуре гиппокампа использовали динамику кратковременного изменения концентрации внутриклеточного кальция (Са2+ осцилляции), регистрируемую с помощью лазерного сканирующего микроскопа Zeiss LSM 510 NLO Duoscan (Германия). В качестве флуоресцентных зондов были выбраны специфический кальциевый краситель Oregon Green 488 ВАРТА-1 AM (OGB1) (Invitrogen) и Са2+-нечувствительный краситель Suiforhodamine 101 (SR101) (Sigma). Регистрировались временные серии изображений поля флуоресценции красителей. Выделение кальциевых осцилляции, полученных при помощи флуоресцентной конфокальной микроскопии, проводили с помощью оригинального программного пакета «Astroscanner». Учитывались следующие параметры: общая длительности Са2+осцилляции и частота Са2+осцилляций.

Иммуноцитохимические методы. Через 7 суток после гипоксии клетки фиксировали 15 минут 4% раствором параформальдегида, далее 30 минут обрабатывали 0,03% раствором тритона-ХЮО. Для маркирования CBR-1 использовались первичные кроличьи антитела к CBR-1 (Abeam) и вторичные козьи антитела к антителам кролика, конъюгированные с Alexa 555 (Invitrogen) для маркирования CBR-2 - первичные козьи антитела к СВ2 (Sigma) и вторичные антитела морской свинки к козьим антителам, конъюгированные с Alexa 555 (Invitrogen). Для идентификации глиальных клеток использовали первичные куриные антитела к глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP) (Abeam) и вторичные ослиные антитела к куриным антителам, конъюгированные с Alexa 430 (Invitrogen). Нейроны маркировались мышиными антителами к белку цитоскелета МАР2 и вторичными ослиными антителами к антителам мыши, конъюгированными с Alexa 647 (Invitrogen). Для

визуализации использовался конфокальный микроскоп Zeiss LSM 510 NLO Duoscan. Обработка полученных результатов проводилась с помощью программы ImageJ (Wayne Rasband (NIH))

Оценка жизнеспособности культивируемых клеток ' в диссоциированной культуре. Оценка жизнеспособности клеток проводилась в период нормоксии (21 DIV) и через 1, 3, 7 и 10 суток после гипоксического воздействия. С целью идентификации мертвых клеточных ядер и общего количества клеточных ядер в культуре клеток гиппокампа соответственно использовали пропидий йодид (Sigma) и бис-бензимид (Sigma). Количество живых клеток рассчитывалось как разница между количеством бис-бензимид позитивных и пропидий иодид позитивных клеток.

Моделирование нормобарической гипоксии in vitro проводилось на 21 DIV путем замены нормоксической культуральной среды на среду с низким содержанием кислорода (кислородная депривация) в течение 10 минут. Вытеснение кислорода из культуральной среды осуществлялось в герметичной камере, в которой воздух был замещен на инертный газ (аргон). При моделировании гипоксии и в течение первых суток после гипоксии в среду добавляли вещества: N-ADA (синтезирован в лаборатории оксилипинов ИБХ РАН) в концентрациях 2,5 и 10 мкМ, SR141716A (Sanofi) - антагонист CBR-1, 1 мкМ, SR144528 (Sanofi) - антагонист CBR-2, 1 мкМ и капсазепин (Tocris) -антагонист TRPV1, 1 мкМ. Параметры, характеризующие ответную реакцию нейронов первичной культуры гиппокампа на гипоксию, регистрировали сразу после реоксигенации, через 2 часа и каждые 24 часа в течение 7 дней после гипоксии.

Моделирование острой гипобарической гипоксии (ОГБГ) in vivo. Для

моделирования острой гипобарической гипоксии использовалась вакуумная проточная барокамера при внешней температуре 20—22°С. Мыши помещались в условия, соответствующие подъему на высоту 10000—10500 м со скоростью 183 м/с (Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических средств, 1990). Регистрируемыми параметрами в данном тесте явились: время жизни (Тж-, мин) на «смертельной площадке; выживаемость (Вж,). По выживаемости животных определялся коэффициент защиты исследуемого соединения (К3)

Тест "открытое поле" проводился по стандартной методике. Визуально подсчитывалось количество отдельных поведенческих актов. Регистрировались следующие показатели поведенческой активности мышей: горизонтальная двигательная активность (ГДА, число пересеченных квадратов в «открытом поле»), вертикальная двигательная активность (число стоек-подъемов на задние лапы в «открытом поле»), время замирания животных, число реакций принюхивания.

Тест «Водный лабиринт Морриса» проводился по стандартной методике (Morris, 1982), модифицированной для мышей (диаметр бассейна 90 см, диаметр скрытой в воде платформы 10 см). Протокол теста состоял из пяти сеансов обучения, по пять проб в каждом до гипоксии. Траектория движения

животного фиксировалась с помощью установки для видео регистрации объектов. Анализ данных выполнялся с помощью разработанного в программной среде Matlab (The Math Works) оригинального пакета алгоритмов MouseTrack и Traceman. Оценивался отсроченный коэффициент сохранения долговременной памяти (оКс) - доля времени пребывания мыши в квадранте, где находилась платформа, по отношению в общему времени пребывания мыши в лабиринте (D'Hooge R. and De Deyn P.P., 2001), время мнимого достижения платформы и траектория свободного плавания.

Статистическая обработка результатов. Полученные результаты in vivo и in vitro обрабатывались статистически с помощью пакета прикладных программ Microsoft Exel, и SigmaPlot 11.0. Данные представлены в форме "среднее значение ± стандартная ошибка среднего". Проверка гипотезы о нормальном распределении проводилась с применением критерия Пирсона, который не зависит ни от вида распределения случайной величины, ни от её размерности. Достоверность статистических различий выборок, имеющих нормальное распределение проверялась с помощью t-теста Стьюдента, различия между выборками, имеющим распределение, отличающееся от нормального, оценивались с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни в программе SigmaPlot 11.0. Различия между выборками считались статистически значимыми при р< 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование антигипоксического и нейропротекторного действия

N-арахидоиоилдофамина при моделировании гипоксии in vitro

1.1. Влияние N-арахидоноилдофамина на спонтанную биоэлектрическую активность культивируемых клеток гиппокампа при моделировании гипоксии

На 21 DIV в диссоциированных культурах гиппокампа наблюдалась стабильная спонтанная биоэлектрическая активность. Острая нормобарическая гипоксия вызывала снижение биоэлектрической активности в пять раз (рис. 1, А). В период реоксигенации наблюдалось кратковременное усиление активности. В дальнейшем в постгипоксическом периоде происходило необратимое снижение спонтанной биоэлектрической активности вплоть до практически полного прекращения пачечной активности к 7-м суткам после воздействия. Следует отметить, что уже через сутки изменялось не только количество, но и структура пачек импульсов, число спайков в пачке достоверно снижалось (рис. 1, Б), что свидетельствовало о нарушении синаптических связей в сети, формирующей индивидуальный характер работы каждой культуры in vitro.

Аппликация N-ADA во время гипоксии и в первые сутки после нее дозозависимо снижала негативное влияние гипоксии и реоксигенации на спонтанную биоэлектрическую активность (рис. 1, А, Б), что проявлялось в сохранении пачечной активности сети в отдаленном постгипоксическом

периоде практически на уровне спонтанной сетевой биоэлектрической активности интактной группы культур. Отмечено, что применение 10 мкМ И-АГ)А сохраняет не только количество спайков в пачке, но нормальную структуру пачки импульсов после гипоксии (рис. 2).

Для выявления возможных механизмов антигипоксического действия исследуемого вещества в часть культур были добавлены Н-АОА в сочетании с блокаторами каннабиноидных рецепторов 1 и 2 типов и ванилоидных рецепторов (рис. 3). Блокада СВЯ-1 нивелировала антигипоксический эффект И-АБА, что выражалось в снижении уровня биоэлектрической активности на 1 сутки после гипоксии более чем вдвое, а на 7 сутки активность полностью отсутствовала. Блокада ТЯРУ1 капсазепином только частично снижала антигипоксический эффект Ы-АОА. При блокаде СВ11-2 антигипоксический эффект ТЧ-АОА сохранялся. Интересно отметить, что при блокаде СВЯ-1 происходило резкое увеличение спайков в пачке при реоксигенации (рис. 3 Б), а в отдаленном постгипоксическом периоде активность культур практически полностью прекращалась, вероятно, из-за гибели нейронов от глутаматной эксайтотоксичности.

Рисунок 1. Динамика спонтанной электрической активности нейронов первичной культуре клеток гиппокампа после гипоксии, 21-28 DIV: А - количество малых пачек импульсов за 10 минут; Б - количество спайков в пачке: 1 - до гипоксии (исходный уровень, 21 DIV); 2 — гипоксия; 3 — реоксигенация; 4-2 часа после гипоксии/реоксигенации; 5-1 сутки после гипоксии/реоксигенации; 67 суток после гипоксии/реоксигенации; * - различия в сравнении с показателями «до гипоксии» достоверны (р<0,05) критерий Манна-Уитни

Таким образом, проведенные исследования выявили, что N-ADA обладает антигипоксическим действием, частично поддерживая уровень спонтанной сетевой биоэлектрической активности нейронных сетей в культуре клеток гиппокампа во время гипоксии и сохраняя структуру сетевой пачки импульсов в постгипоксическом периоде. Изучение механизмов действия N-ADA при гипоксическом повреждении выявило доминирующую роль каннабиноидных рецепторов 1 типа в реализации антигипоксического действия N-ADA.

1 а

£ 40

2 20

—

1_______ ._______ QS i

Ш о ......i„ .

ge 200

. i, J

...— -. .......... £§ioo j /■

■ ..... 0 \J ""4'i"

in' « 60 tL-Г". 1 а»*.,,. а tev s - t7" n Шг-- £ 20 [ ' l... „

500 1000 !i Время, «с

До ГИПОКСИИ

DIV21

о =

'FI"T—|

1... LA] ___!

j________l_____J| „i..j

О fl]

——j—

6«

200 300 400 500 Время, мс

24 ч после гипоксии DIV22

Время, мс До ГИПОКСИИ

DIV21

§60 о

В « g

S20

200 400 600 800

Время, мс

24 ч после гипоксии 0IV22

Рисунок 2. Количество спайков за 50 мс (сверху) и растровые диаграммы спонтанной биоэлектрической активности нейронов в культуре клеток гиппокампа (снизу). А - контрольная культура; Б - культура с аппликацией И-АОА, 10 мкМ

ill

J3L

5 I

31 a: Oil fl"

Л.

] Через 1 сутки после 8 Через 7 суток после гипоксии гипоксии

D Через 1 сутки после ■ Через 7 суток после гипоксии гипоксии

Рисунок 3. Показатели спонтанной биоэлектрической активности нейронов в культуре клеток гиппокампа относительно исходного уровня, принятого за 100%,

21-28 день развития in vitro'. А - количество пачек импульсов за 10 минут; Б -среднее количество спайков в пачке. 1 - интактные; 2 - контроль; 3 - N-ADA 2,5 мкМ; 4 -N-ADA 10 мкМ; 5 -N-ADA+SR1; 6 — N-ADA+SR2; 7 - N-ADA+ Cpz; * -различия в сравнении с показателями «до гипоксии» достоверны (р<0,05) критерий

Манна-Уитни

1.2. Влияние 1Ч-АОА на спонтанную кальциевую активность культивируемых клеток гиппокампа при моделировании гипоксии

На 21 в нейронныхй сетях клеток гиппокампа наблюдалась

спонтанная кальциевая активность (рис. 4А). Частота возникновения

кальциевых осцилляций составляла 6,83±1,78 осцилляций в 1 мин. Активность проявляли 83,9±5,57% клеток. Гипоксия вызывала достоверное (р<0,05) снижение спонтанной кальциевой активности вплоть до практически полного ее исчезновения к третьей минуте наблюдения. Активность сохраняли всего 5,01±1,84 % клеток, частота осцилляций составила 0,14±0,03 в 1 минуту. После реоксигенации активность частично возобновлялась. ]Ч-АЕ>А предотвращал изменения спонтанной кальциевой активности нейронов, вызванные воздействием кислородной депривации (рис. 4Б). Во время гипоксического воздествия активность сохраняло 24,5±6,91% клеток, изначально проявляющих активность, что достоверно больше, чем в контрольных культурах, подвергнутых гипоксии.

е «

Т, мин

¡««гиниякимвва

I : НЬ'. ГШМ» М

»г:"г: ■ . «-¡г } №1«

- | • |г- а

Т, мин Исходная активность

Т. мин

ЗГ м

« 60

Т. МИН Гипоксия

Реоксигенация

Рисунок 4. Растровая диаграмма Са2+ осцилляций в культуре клеток гиппокампа при моделировании гипоксии: А - контроль (10 мин гипоксия/реоксигенация без аппликации каннабиноида) Б - М-АОА 10 мкМ (,10 мин гипоксия/реоксигенация с аппликацией Ы-АБА, 10 мкМ) Оценка гипоксического воздействия на кальциевую активность в отдаленном постгипоксическом периоде проводилась на 7 сутки после гипоксии. Доля клеток, проявляющих кальциевую активность в отдаленном постгипоксическом периоде, в контрольной группе культур, подвергшихся гипоксическому воздействию в отсутствие М-АГ)А составила 19,06±7,0%. В культурах, получавших аппликацию Ы-АОА 10 мкМ этот показатель составил 56,37±8,69%, что достоверно больше (р<0,01), чем в контрольной группе культур и не отличается от показателей интактных культур (69,3±5,57 %).

Следует отметить, что гипоксия вызывала не только снижение количества клеток, имеющих кальциевую активность, но и существенно изменяла форму кальциевых осцилляций. В профиле активности клеток в постгипоксическом периоде появлялись «суперосцилляции», длительность которых составляла до 100 с, в отличие от длительности типичной осцилляции (6-12 с, рис. 5).

Аппликация N-ADA оказывала дозозависимый протекторный эффект на кальциевую активность нейронных сетей, в том числе достоверно уменьшала длительность суперосцилляций до 41-48 с (рис. 5).

Таким образом, N-ADA оказывает антигипоксический эффект на индуцированные острой гипоксией in vitro изменения спонтанной кальциевой активности нейронной сети в культуре клеток гиппокампа, выражающийся в поддержании количества активных клеток, а также частичной нормализации длительности и частоты кальциевых осцилляции.

I .V'jw-1—чдг

Вре.чЯ, С

'-.¡-■'¡■Г

Рисунок 5. Характерные профили кальциевой активности нейронов на 7 день после моделирования гипоксии в культурах клеток гиппокампа. По оси абсцисс — время, с, по оси ординат - интенсивность флуоресценции, усл. ед. 1 - интактные; 2 - контроль (10 мин гипоксия/реоксигенация без аппликации каннабиноида); 3 — АБА 2,5 мкМ, 4- М-АОА 10 мкМ

1.3. Влияние ¡Ч-АБА на выживаемость культивируемых клеток гиппокампа при моделировании при моделировании гипоксии

Число живых клеток в интактных культурах на протяжении всего периода наблюдения практически не изменялось (рис. 6).

Контрол

ь Гипоксия N-ADA N.ADA 10 мкМ + SR1

■ 1 сутки из сутки а 7 сутки а-10 сутки

после гипоксии

Рисунок 6. Количество живых клеток в культуре клеток гиппокампа после гипоксии, *- статистически достоверные различия в сравнении с контрольной группой, р<0.05, **- различия в сравнении с контрольной группой # -статистически достоверные различия с группой, подвергавшейся гипоксии (р<0,05,

критерий Стьюдента).

Гипоксическое воздействие вызывало гибель клеток: через сутки после реоксигеиации в культуре появлялись первые разрушенные клеточные элементы, количество которых увеличивалось в течение 10 последующих дней при реципрокном снижении живых клеток.

Аппликация И-АОА достоверно повышала выживаемость клеток в постгипоксическом периоде более чем вдвое относительно контроля. Применение селективного антагонистов СВЬМ и Т11РУ1 устраняло защитный эффект Ы-АБА, тогда как блокада СВ11-2 его практически не снижала. Следует отметить, что предварительными результатами в наших исследованиях было показано, что блокада СВЯ-1, СВЯ-2 и ТЯРУ1 в интактной культуре клеток гиппокампа не оказывало эффекта на их выживаемость.

1.4. Влияние 1Ч-АПА на распределение каннабиноидных рецепторов первого и второго типов в диссоциированных культурах гиппокампа при моделировании гипоксии

Иммуноцитохимические исследования показали, что СВЯ-1 и СВТ1-2 присутствовали в культурах на 28 БТУ (рис. 7 и 8). Гипоксическое воздействие приводило к уменьшению размера кластеров СВК.-1, при сохранении их количества на 7 сутки постгипоксического периода (рис. 7). Аппликация Ы-АБА (10 мкМ) сохраняла размер кластеров СВТ1-1, количество же кластеров увеличивалось.

I 20 §

| 10

5 о £

Контроль Гипоксия N Л Г) А

Контроль Гипоксия N -АОА

Рисунок 7. Распределение СВЯ-1 рецепторов в культурах клеток гиппокампа на 7 сутки после гипоксии. А - число кластеров СВ1 рецепторов на 100 мкм отростка нейрона, Б - средняя площадь кластера; * - статистически достоверные различия с показателями «до гипоксии» (р<0,05, критерий Стьюдента)

Контроль Гипоксия N Л!>Л

Контроль Гипоксия N Л[)Л

Рисунок 8. Распределение СВ11-2 рецепторов в культурах клеток гиппокампа на 7 сутки после гипоксии. А - число кластеров СВ11-2 рецепторов на 100 мкм2, Б -средняя площадь кластера; * - статистически достоверные различия различия с показателями «до гипоксии» (р<0,05, критерий Стьюдента)

Маркирование CBR-2 выявило их присутствие преимущественно на глиальных клетках. На 7 сутки после гипоксии достоверно уменьшалось как количество кластеров рецепторов, так и их средний размер. При введении NADA (10 мкМ) в культуральную среду во время гипоксии и в первые сутки после нее в отдаленном постгипоксическом периоде количество и размер CBR-2 не отличались от интактных культур (рис. 8).

2. Исследование аитигипоксического и нейропротекторного действия N-ADA при моделировании гипоксии in vivo

Проведенные исследования in vivo выявили, что превентивное применение N-ADA повышало устойчивость мышей (увеличивало время их жизни на «высоте») в условиях острой гипобарической гипоксии (ОГБГ). Эффективными оказались дозы 6 мг/кг и 10 мг/кг, которые вызывали статистически достоверное увеличение данного показателя с 6 до 8 и 9 мин соответственно.

Эффективность антигипоксических свойств N-ADA оценивали по выживаемости животных при моделировании ОГБГ (табл. 1). Выявлено, что NADA дозозависимо повышал выживаемость животных при воздействии острой гипобарической гипоксии. Максимальный коэффициент защиты составил 1,58 при применении N-ADA в дозе 10 мг/кг, что сопоставимо с Кз Реамберина (1,5).

Таблица 1. Коэффициент защиты мышей линии C57BL/6 при моделировании острой гипобарической гипоксии

Группа животных

Контроль 2 (растворитель N-ADA)

Кз

1,06

Реамберин 150 мг/кг

1,50

N-ADA 2,5 мг/кг

1,16

N-ADA 6 мг/кг

1,33

N-ADA 10 мг/кг

1,58

При превентивном применении N-ADA отмечалось увеличение доли средне- и высокорезистентных к гипоксии животных, низкоустойчивых животных в этих группах не зарегистрировано (рис. 9). Наибольшая доля высокоустойчивых животных была в группе, получавшей N-ADA в дозе 10 мг/кг.

Таким образом, N-ADA оказывал антигипоксический эффект, способствуя повышению времени жизни животных «на высоте», доли высокорезистентных к гипоксии животных и выживаемости животных на «смертельной площадке».

Дополнительно для подтверждения защитного действия N-ADA при гипоксии применялось тестирование животных в «открытом поле» и «водном лабиринте Морриса» Нами было выявлено, что гипоксическое повреждение вызывает достоверное снижение двигательной активности по параметру числа пересеченных квадратов у контрольной группы животных, получавших инъекцию физиологического раствора, на первые сутки после моделирования

гипоксии (27% от исходного количества пересеченных квадратов с последующим ее восстановлением к 14 суткам постгипоксического периода до 86,5%). В контрольной группе, получавшей инъекцию растворителя, двигательная активность не нормализовалась и на 14 сутки была достоверно ниже, чем у кнтактной группы (60% от исходного уровня). Превентивное внутрибрюшинное введение Ы-АБА позволило предотвратить вызванное гипоксией снижение двигательной активности. При введении Ы-АГ)А в дозах 2,5 и 6 мг/кг двигательная активность уже на первые сутки после гипоксии была достоверно выше по сравнению с контрольной группой 1 и не отличалась от уровня активности интактных животных (59,5% и 77,1% от исходного уровня ГДА, соответственно). По другим параметрам двигательной активности в постгипоксическом периоде не было выявлено значительных изменений в поведении животных различных серий в «открытом поле».

100 90 80 70 60 50 40 30 20

£2

N £

I? II

о <

< <

И Низкоустойчивые ¡3 Высокоустойчивые □ Среднеустойчивые

о г

Рисунок 9. Распределение степени устойчивости в группах мышей линии С57ВЬ/6 при моделировании острой гипобарической гипоксии (% от общего числа

особей в группе)

При тестировании в «лабиринте Морриса» было показано, что острая гипобарическая гипоксия оказывала негативное влияние на сохранение долговременной памяти. Отсроченный коэффициент сохранения в контрольных группах был достоверно ниже, чем у интактных животных (табл.2). В то же время, широко применяемый антигипоксант реамберин не оказывал влияние на сохранение долговременной памяти после ОГБГ. Применение Ы-АБА при моделировании ОГБГ позволяло сохранить долговременную память после навигационного научения на уровне интактных животных.

Таблица 2. Значение отсроченного коэффициента сохранения

долговременной памяти у мышей после моделирования ОГБГ

Группа животных оКс, усл.ед. Группа животных оКс, усл.ед.

Интактные 31,87±3,74 N-АБА 6 мг/кг 33,09±3,11

Контроль 1 (с физ.раствором) 21,01±5,83 * N-ADA 10 мг/кг 34,17±7,43

Контроль 2 (растворитель) 19,95±3,36* N-АБА 6 мг/кг + SR1 1 мг/кг 22,38±3,57

Реамберин 21,53±5,10* N-ABA 6 мг/кг + SR2 1 мг/кг 30,06±5,86

Ы-АБА 2, 5 мг/кг 25,74±3,12 N-АБА 6 мг/кг + cpz 1 мг/кг 25,32±5,50

Блокада СВ11-2 и ТТУ? VI не препятствовала нейропротекторному действию Ы-АБА, а блокада СВЯ-1 вызвала тенденцию к его снижению.

Оценка траектории движения животных по секторам лабиринта Морриса (рис. 10) выявила 3 основных стратегии поиска цели: прямое движение к цели, активный поиск платформы с учетом предыдущего научения, хаотический поиск. Некоторые животные не достигли бы платформы за все время проведения тестирования (отрицательный результат).

120

I 1 1 ! 1 'к й l l 1 1 IS

з * г « i i 1 1 - 1 S и: о 3 § X p-pi Контроль 2 (растворитель) Реамберин N-A0A 2,5 мг/кг N-ADA 6 МГ/КГ - N-ADA 10 мг/кг N-ADA + SRI N-ADA+ SR2 N-ADA+ cpz

к Прямой поиск О Активный поиск

и Хаотический поиск ■ Отрицательный результат

Рисунок 10. Распределение стратегий поиска цели в группах животных при отсроченном тестировании в водном лабиринте Морриса после воздействия ОГБГ

После гипоксии в контрольных группах существенно снизилась доля животных, которые применяли стратегию прямого поиска. Превентивное введение Ы-АБА во всех изученных концентрациях нивелировало негативные

последствия гипоксического повреждения головного мозга. Во всех трех опытных группах отсутствуют животные, которые не смогли бы найти платформу. В группах, получавших N-ADA в концентрациях 2,5 мг/кг и 10 мг/кг, наибольшую долю составляют животные, использующие стратегию поиска с учетом научения (55% и 60 % соответственно). При исследовании механизмов протекторного действия N-ADA обнаружено, что при блокаде CBR-1 и TRPV1 нейропротекторный эффект N-ADA частично нивелируется. Блокада CBR-2 существенных изменений в распределении стратегий поиска цели не вызывала.

Таким образом, в экспериментах in vivo было показано, что N-ADA обладает антигипоксическим действием, предотвращает мнестические нарушения у животных после гипоксического воздействия. Выявлено, что антигипоксический и нейропротекторный эффект N-ADA опосредован активацией каннабиноидных рецепторов первого типа и ваниллоидных рецепторов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа посвящена изучению антигипоксического и нейропротекторного эффекта синтетического аналога эндоканнабиноида N-арахидоноилдофамина, оказываемого им на функциональную активность и выживаемость нейронов в первичной культуре клеток гиппокампа при моделировании острой гипоксии in vitro и на резистентность животных к гипоксическому воздействию in vivo.

В экспериментах in vitro было проведено комплексное исследование функциональной сетевой активности нейронов гиппокампа с применением современных электрофизиологических и имиджинговых методик, позволяющих изучить сетевую биоэлектрическую и кальциевую активность культивируемых клеток. Впервые показано, что аппликация N-ADA во время гипоксии и в первые сутки постгипоксического периода препятствует необратимым изменениям нейросетевой биоэлектрической и кальциевой активности, а также гибели культивируемых клеток гиппокампа в течение как минимум 7 суток после острого гипоксического воздействия. Максимальное защитное действие N-ADA оказывает в концентрации 10 мкМ. Антигипоксическое действие NADA опосредуется прежде всего через каннабиноидные рецепторы 1 типа и ванилоидные рецепторы. Активация каннабиноидных рецепторов 2 типа оказывает менее выраженный нейропротекторный эффект. Впервые было показано, что N-ADA предотвращает изменения размеров и количества кластеров CBR-2 и увеличивает количество кластеров CBR-1, сохраняя их нормальные размеры.

При исследовании антигипоксических свойств N-ADA in vivo на модели острой гипобарической гипоксии было установлено, что превентивное введение N-ADA повышает резистентность мышей к гипоксии, снижает их смертность от гипоксического воздействия и способствует сохранению долговременной памяти в постгипоксический период. Выявлен важный вклад активации CBR-1 и TRPV1 в поддержании мнестических функций ЦНС после гипоксии/реоксигенации.

Отсутствие эффекта блокады CBR-1, CBR-2 и TRPV1 на активность нейроной сети гиппокампа и жизнеспособность клеток интактных культур in vitro и на поведение интактных животных in vivo подтверждает гипотезу о включении механизма обратной связи и активацию пресинаптических каннабиноидных рецепторов только при гипоксии.

Полученные результаты указывают на перспективу использования IMADA в качестве фармакологического агента для предотвращения гипоксического повреждения мозга.

ВЫВОДЫ

1. N-ADA обладает антигипоксическим действием, способствуя сохранению уровня биоэлектрической активности нейронной сети в диссоциированных культурах клеток гиппокампа, структуры сетевой пачки импульсов во время острой нормобарической гипоксии in vitro и в постгипоксическом периоде.

2. N-ADA оказывает антигипоксический эффект на индуцированные гипоксией in vitro изменения спонтанной кальциевой активности нейронной сети, выражающийся в поддержании числа клеток, проявляющих активность, а также частичной нормализации длительности и частоты кальциевых осцилляций в постгипоксическом периоде.

3. Превентивная аппликация N-ADA (10 мкМ) предотвращает вызванную гипоксией гибель культивируемых клеток гиппокампа после гипоксии/реоксигенации.

4. Введение N-ADA во время гипоксии/реоксигенации in vitro предотвращает снижение размеров и числа кластеров каннабиноидных рецепторов 2 типа и повышает число кластеров каннабиноидных рецепторов 1 типа, сохраняя их нормальные размеры.

5. При превентивном парентеральном введении N-ADA оказывает антигипоксический эффект, способствуя сохранению двигательной активности и долговременной пространственной памяти после острой гипобарической гипоксии у мышей линии C57BL/6. Максимальный антигипоксический эффект оказывает применение N-ADA в дозе 10 мг/'кг.

6. Ключевую роль в реализации антигипоксического и нейропротекторного эффектов N-ADA играет активация каннабиноидных рецепторов 1 типа (CBR-1) и ванилоидных рецепторов (TRPV1) и, в меньшей степени, каннабиноидных рецепторов 2 типа (CBR-2).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Митрошина Е.В. Мультиэлектродные матрицы - новые возможности в исследовании пластичности нейрональной сети. / Мухина И.В., Казанцев

В.Б., Хаспеков Л.Г. и др. // Современные технологии в медицине. - 2009. - № 1.-С. 8-15.

2. Митрошина Е.В. Функциональные характеристики клеток гиппокампа в нейроглиальной сети, развивающейся in vitro: кальциевый имиджинг и спонтанная активность в культуре на мультиэлектродной матрице / Мухина И.В., Хаспеков Л.Г., Казанцев В.Б. и др. // Материалы международная конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация". -Сборник статей под ред. Зинченко В.П., Колесниковой С.С., Бережновой А.В.: Пущино, 2009. - Т.1. - С. 138-142.

3. Mitroshina E.V. Study the functional properties of low density hyppocampal neuronal networks using multielectrode arrays / Mukhina I.V., Kazantsev V.B., Khaspekov L.G. et al. // Proceedings Joint Symposium on International Workshop on Nonlinear Dynamics in Biological Systems and Soft-matter Biophysics. - Taipei, Taiwan. - 2009. - P.35.

4. Митрошина Е.В. Изучение влияния N-арахидоноилдофамина на уровень внутриклеточного кальция в диссоциированной культуре гиппокампа / Митрошина Е.В., Мухина И.В., Ведунова М.В. // Материалы XIV Нижегородской сессии молодых ученых. Естественные науки. -Н.Новгород. -2009,- С. 110-111.

5. Митрошина Е.В. Исследование пластичности нейроналной сети гиппокампа in vitro при культивировании на мультиэлектродной матрице MED64 / Мухина И.В., Казанцев В.Б., Хаспеков Л.Г. и др.// Материалы всероссийской конференции "Нелинейная динамика в когнитивных исследованиях". - Нижний Новгород: ИПФРАН. - 2009. - С.97-99.

6. Mitroshina E.V. Cannabinoid receptor agonist N-arachidonoyldopamine modulates neuron-to-astrocyte calcium signaling in hippocampal cell culture / Khaspekov L.G., Mukhina I.V., Bobrov M.Yu. et al. // Материалы международного симпозиума "Topical Problems of Biophotonics - 2009". Нижний Новгород. - 2009. - C.247-249.

7. Митрошина Е.В. Спонтанная активность нейронов в сети в культуре клеток гипокампа на мультиэлектродной матрице MED64 / Мухина И.В., Хаспеков Л.Г., Казанцев В.Б. и др. // Материалы всероссийской конференции с международным участием «Гиппокамп и память: норма и патология».-Пущино. - 2009. - С 46-47.

8. Митрошина Е.В. Исследование нейротропных свойств N-арахидоноилдофамина в диссоциированной культуре гиппокампа / Мухина И.В., Хаспеков Л.Г., Ведунова М.В., Митрошина Е.В. и др. // Материалы XV Международной конференции по нейрокибернетике. - Ростов-на-Дону. -2009.-С. 41-44.

9. Митрошина Е.В. Динамика развития функциональной активности нейронной сети гиппокампа in vitro при культивировании на мультиэлектродной матрице MED64 / Мухина И.В., Казанцев В.Б., Хаспеков

Л.Г. и др. // Материалы XV Международной конференции по нейрокибернетике. - Ростов-на-Дону. - 2009. - С.124-127.

10. Митрошина Е.В. Анализ синхронности кальциевых осцилляции в нейрон-глиальных сетях по изображениям лазерного сканирующего микроскопа / Ершова А.В., Митрошина Е.В., Ведунова М.В. и др. // Труды ХП1 научной конференции по радиофизике, посвященной 85-летию со дня рождения М.А. Миллера. - Нижний Новгород: изд. «Талам». - 2009. - С. 113114.

11. Mitroshina E.V. Cultured hippocampal function network during development and its N-arachidonoyldopamine modulation /' Mukhina I.V., Kazantsev V.B., Vedunova M.V. et alЛ Proceedings 7th FENS forum of European Neuroscience, Amsterdam. - 2010. - Ref.: FENS Abstr. Vol.5. - Abstract no: 192.37.

12. Митрошина E.B.. Действие глутамзта на кальциевый гомеостаз нейрон-глиальной сети мозга in vitro / Митрошина Е.В., Мухина И.В., Ведунова М.В. и др. // Материалы XXI съезда физиологического общества им. Павлова - Москва - Калуга. - 2010. - С. 408.

13. Митрошина Е.В. Флуоресцентный анализ паттернов метаболической активности нейрон-глиальной сети /' Мухина И.В, Митрошина Е.В., Коротченко С.А. и др. // Сборник трудов международной конференции и семинаров «Фундаментальные проблемы оптики». - Спб,-2010.-Т.1.-С. 164-167.

14. Митрошина Е.В. Оценка динамики функционального состояния диссоциированной культуры гиппокампа in vitro / Митрошина Е.В., Ведунова М.В., Широкова О.М. и др. // Вестник ННГУ им. Н.И. Лобачевского. - 2011. - № 2(2). - С. 283-286.

15. Mitroshina E.V. Monitoring of function network activity in vitro / Mukhina I.V., Mitroshina E.V., Pimashkin A.S. et al. // Proceeding «Topical Problems of Biophotonics — 2011». St. Peterburg. - Nizhny Novgorod. -2011.-P. 242-243.

16. Митрошина Е.В. Флуоресцентный анализ паттернов метаболической активности нейрон-глиальной сети / Захаров Ю.Н., Митрошина Е.В,, Ведунова М.В и др. // Оптический журнал. Название англоязычной копии Journal of Optical Technology. - 2012. - Т. 79. - №6. -С. 47-51.

17. Митрошина Е.В. Нейропротекторное действие N-арахидоноилдофамина на функционирование нейронной сети первичной культуры гиппокампа при глюкозной депривации / Митрошина Е.В., Ведунова М.В., Бобров М.Ю. и др. // Материалы IV Съезда биофизиков России - Н.Новгород. - 2012. - С. 100.

18. Mitroshina Е. Modeling and pharmacological modulation of neuronal network activity injury on a microelectrode array / . Mukhina I., Mitroshina E.,

Vedunova M // BRAIN INJURY.- 2012 - V.26 (4-5). - P. 785-786. - Meeting Abstract: 0895.

19. Митрошина E.B. Нейропротекторное действие канпабнпонда N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипобарической гипоксии мозга / Митрошина Е.В., Ведунова М.В., Миронов A.A. и др. /7 Неврологический вестник им. Бехтерева. - 2012. - Ks 1. - С. 14-19.

20. Митрошина Е.В. Влияние N-арахидоноилдофамина на спонтанную кальциевую активность культур гиппокампа при моделировании гипоксии in vitro / Митрошина Е.В., Ведунова М.В., Сахарнова Т.А. и др. // Материалы XXII Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. - Волгоград. -2013.-С. 354.

21. E.V. Mitroshina Neuroprotective properties of cannabinoid N-arachidonoyl dopamine in hippocampal neural network cultured on multielectrode arrays / E.V. Mitroshina, M.V. Vedunova, T.A. Sakharnova, M.Yu. et al. // Материалы IV международного симпозиума "Topical Problems of Biophotonics - 2013". - Нижний Новгород. - 2013. - С. 233-234.

22. E.V. Mitroshina. Antihypoxic effect of n-arachidonoyl dopamine in the hippocampal culture neuron network / E.V. Mitroshina, M.V. Vedunova, M.Yu. Bobrov et al. // Материалы международного симпозиума "Topical Problems of Biophotonics — 2013". - Нижний Новгород. - 2013. - C.243-245.

23. Митрошина E.B. Влияние N-арахидоноилдофамина на функционирование нейронной сети первичной культуры гиппокампа при моделировании гипоксии / Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Сахарнова Т.А. и др.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 2013,- Т. 156. - №10. - С. 447-451.

24. Митрошина Е.В. Морфофункциоиальные закономерности развития нейронных сетей диссоциированных культур гиппокампа in vitro / Широкова О.М., Фрумкина JI.E., Ведунова М.В., Митрошина Е.В. и др. .// Современные технологии в медицине. - 2013. - Хг2. - С. 6-13.

25. E.V. Mitroshina Microelectrode aiTays and Ca2+ imaging in combination with in vitro model of stroke as a tool to investigate pathological changes in network activity / I.V. Mukhina, M.V. Vedunova, E.V. Mitroshina et al. // Материалы международного симпозиума "Topical Problems of Biophotonics - 2013". - Нижний Новгород. - 2013. - С. 245-247.

26. Mitroshina, E.V. Calcium transient imaging as tool for neuronal aud glial network interaction study / Zakharov, Y.N., Mitroshina, E.V., Shirokova, O., Mukhina, I.V. // Springer Proceedings in Mathematics and Statistics (Models, Algorithms, and Technologies for Network Analysis). - 2013. - P. 225-232.

27. Mitroshina E.V. Mechanisms of N-arachydonoildopamine neuroprotective and antihypoxic effects in acute normobaric hypoxia in vitro: role of CB1, CB2 and TRPV1 receptors / Mitroshina E.V., Vedunova M.V.,

Sakharnova Т.A. et al. //' Proceedings of 8th International Symposium on Neuroprotection and Neurorepair. - Magdeburg.- 2014.

28. E.V. Mitroshina The role of N-arachidonoyldopamin (N-ADA) in maintaining of neural network functional homeostasis in normal conditions and hypoxia / E.V. Mitroshina, M.V. Vedunova, T.A. Sakharnova et al. // Proceedings International Scientific School «Frontiers in modern neuroscience». - Nizhny Novgorod. - 2014. - P. 24-25.

29. Mitroshina E.V. Antihypoxic effects of N- arachydonoildopamine in hippocampal cultures by activating both cannabinoid and vanilloid receptors / Mitroshina E.V., Vedunova M.V., Sakharnova T.A. et al. // Proceedings 9th FENS Forum of Neuroscience.- Milan. -2014. - Abstract Number: FENS-3045.

30. Млтрошина E.B. Влияние N-арахидоноилдофамина на распределение каннабиноидных рецепторов 1 и 2 типа в первичных культурах гиппокампа при моделировании острой гипоксии in vitro / Митрошина Е.В., Ведунова М.В., Сахарнова Т.А. и др. // Материалы десятого международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак. 2014. С. 236-237.

31. Митрошина Е.В. Влияние N-арахидононлдофамина на распределение каннабиноидных рецепторов 1- и 2-го типа в первичных культурах гиппокампа при моделировании острой гипоксии in vitro / Е.В Митрошина., М.В. Ведунова, Т.А. Сахарнова, и др. // Биомедицинская радиоэлектроника. - 2014. - №4. - С. 54-55.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Вж — выживаемость

ГДА - горизонтальная двигательная активность

К, - коэффициент защиты

ОГБГ - острая гипобарическая гипоксия

оКс — отсроченный коэффициент сохранения памяти

Тж - время жизни «на высоте»

ЦНС - центральная нервная система

CBR-1 - cannabinoid receptor typel, каннабиноидный рецептор типа1

CBR-2 - cannabinoid receptor type 2, каннабиноидный рецептор типа 2

DIV - day in vitro, день развития культуры in vitro

N-ADA - N-arachidonoyl dopamine, N-арахидоноилдофамин