Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Быстрые движения боковых остатков в белках по данным методов молекулярной динамики и спин-метки

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Быстрые движения боковых остатков в белках по данным методов молекулярной динамики и спин-метки"

ОБЯЗАТЕЛЬНЫЙ БсСПЛ - 7; ]Ь'Й ЭКЗЕМПЛЯР

На правах рукописи

Никольский Дмитрий Олегович

Быстрые движения боковых остатков в белках по данным методов молекулярной динамики и спин-метки

03 00.02- Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук,

профессор В.П. Тимофеев. Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор Шайтан К.В. доктор физико-математических наук Александров А.И.

Ведущая организация: Институт химической физики РАН, г. Москва.

Защита диссертации состоится _ _ 2006г. в _ часов на заседании

Диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском Государственном Университете по адресу: 119992, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан_марта 2006г.

1

Ученый секретарь / / /7 —"

диссертационного совета | /. 1Л (¿-^^ ^

доктор биологических наук, / 11/1

профессор [ Т.Е. Кренделева

ДОО£ А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Важной задачей современной науки является изучение локальной структуры и динамики биологических макромолекул (белков и нуклеиновых кислот). Большой интерес представляют исследование локальных конформационных изменений в белках в процессе их функционирования. Процессы взаимодействия белок-белок, белок-нуклеиновая кислота тоже напрямую связаны с локальными движениями поверхностных групп. Одним из важных инструментов исследования движения на молекулярном уровне является метод молекулярной динамики (М КагрЫв, ^У.Р.Уап Оип.^егеп, Н К Балабаев, К.В Шайтан и др.).

Основная трудность применения метода молекулярной динамики для белков заключается в том, что мощность современных компьютеров не позволяет провести длительный расчет траекторий движения, не делая при этом никаких допущений и упрощений. Другая трудность состоит в том, что расчет движения атомов в макромолекуле методом МД может быть неоднозначным Поэтому желательно вводить некий критерий корректности этих упрощений В данной работе вводится такой критерий как сравнение с экспериментом. Иными словами, необходимо получить теоретический спектр ЭПР из метода молекулярной динамики и сравнить его с экспериментальным спектром для одного и того же образца. Такой подход позволяет максимально точно подобрать условия моделирования соответствующие реальному эксперименту, особенно после модификации той или иной боковой группы белка.

Таким образом, результаты, полученные методом молекулярной динамики с использованием в качестве начальных координат атомов данные метода рентгеноструктурного анализа, мы сопоставляем с данными экспериментального метода спин-метки ЭПР. В основе метода спин-метки лежит модификация боковой группы макромолекулы Спектральный метод ЭПР нашёл широкое применение при решении различных задач молекулярной биологии Анализируя форму спектра присоединенной спин-метки можно получить информацию о молекулярных движениях в сложных биологических системах, таких как белки и нуклеиновые кислоты, что представляет собой доступный подход к изучению конформационных изменений и биологической функции макромолекулы.

Форма спектра ЭПР бежа в растворе определяется сложным движением спин-

метки. Это движение необходимо разделять на быструю переорирнтяпию с.ттин-мртст*

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.-Петербург 3

ОЭ т/рж^ЪО

относительно макромолекулы и медленную диффузию метки вместе с макромолекулой Вопрос о том, как учитывать собственное движение спин-метки относительно белка при анализе спектров ЭПР остается открытым.

Поэтому важно определить значимость быстрого движения спин-метки при интерпретации спектра ЭПР Это можно сделать, исключив движение белка как целого в реальном эксперименте ЭПР.

В настоящей работе реализуется такая задача при исследовании уникально приготовленного объекта: монокристалла спин-меченого лизоцима. Молекулы белка, находясь внутри элементарной ячейке монокристалла тетрагональной симметрии, остаются в строго ориентированном неподвижном состоянии, но при этом сохраняется локальная подвижность их боковых групп. Поэтому монокристалл белка является удобной моделью для исследования характера движения спин-метки на боковой группе белка, а, следовательно, и возможных локальных конформационных изменений

Цели и задачи работы

Целью настоящей работы является постановка численного эксперимента методом молекулярной динамики, в случае быстрого ограниченного в пространстве движения спин-метки на боковом остатке макромолекулы в рамках решения обратной задачи ЭПР спектроскопии спин-меченых макромолекул с сопоставлением результатов исследований, полученных методом молекулярной динамики и методом спин-метки

Для достижения этих целей необходимо было поставить и решить следующие основные задачи:

1 Экспериментально получить спектры ЭПР спин-меченого лизоцима в растворе и спектры ЭПР монокристалла спин-меченого лизоцима при различных ориентациях кристалла относительно магнитного поля.

2. На основании полученных экспериментальных данных определить магнитные параметры спин-метки.

3 Получить модельную пространственную структуру спин-меченого лизоцима, присоединив спин-метку к молекуле лизоцима и проведя оптимизацию структуры путем минимизации потенциальной энергии макромолекулы

4 Задать параметры для проведения численного эксперимента и ввести необходимые допущения, позволяющие ускорить процесс расчета траекторий движения методом молекулярной динамики.

5 Создать программный пакет, позволяющий рассчитывать спектры ЭПР спин-меченых объектов на основании данных о магнитных параметрах спин-метки и ее траектории, рассчитанной методом молекулярной динамики

6 Сравнить спектр ЭПР, полученный методом молекулярной динамики из траекторий движения спин-метки, с экспериментальным спектром ЭПР монокристалла спин-меченого лизоцима.

Научная новизна

Методом молекулярной динамики впервые проведен расчет спектра ЭПР, в случае быстрого ограниченного в пространстве движения спин-метки на боковом остатке макромолекулы.

Впервые проведено сравнительное исследование динамики боковых групп белка методом спин-метки и методом молекулярной динамики Результаты обоих методов сопоставлены в рамках решения обратной задачи ЭПР спектроскопии спин-меченых макромолекул.

Практическая ценность работы

Отработана технология получения методом молекулярной динамики траекторий движения атомов боковых групп белка с присоединенной спин-меткой.

Результаты работы могу! быть использованы для изучения динамики боковых групп белка с присоединенной спин-меткой методом молекулярной динамики

Использование метода молекулярной динамики для обработки экспериментальных данных спектроскопии ЭПР позволяет учесть вклад локальной подвижности боковых групп, включая спин-метку, в спектр ЭПР макромолекулы.

Использование метода молекулярной динамики совместно с методом спин-метки дает дополнительную информацию о локальных конформационных изменениях биологических макромолекул

Личный вклад

Все основные результаты, изложенные в диссертационной работе, получены автором самостоятельно Постановка задачи исследований и интерпретация полученных результатов осуществлялись автором совместно с научным руководителем - доктором физ -мат. наук, профессором В П Тимофеевым.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были представлены на XI Международной конференции "Магнитный резонанс в химии и биологии" (Звенигород-2001, Россия), на 3rd International Conference on Nitroxide Radicals (Kaiserslautern-2001, Germany), на III съезде биофизиков России (Воронеж-2004, Россия), на научных семинарах в ИМБ РАН и на кафедре биофизики физического факультета МГУ

Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа (83 станицы) состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (48 ссылок), содержит 28 рисунков, 6 таблиц и 48 формул.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение

Рассмотрена актуальность выбранной темы, обоснована практическая значимость, сформулирована цель работы и определены задачи исследования.

Глава 1. Обзор литературы

Глава состоит из двух разделов.

В первом разделе представлен обзор литературы по спектроскопии магнитного резонанса и методу спин-метки Особое внимание уделено проблеме решения обратной задачи спектроскопии ЭПР для метода спин-метки.

Во втором разделе содержится обзор литературы по численным методам моделирования. Он включает обзор систем силовых потенциалов, методов оптимизации для подготовки начальных условий численного эксперимента, метода молекулярной динамики, метода Монте-Карло, а также обзор исследований макромолекул методом молекулярной динамики.

Что касается метода спин-метки, то на сегодняшний день можно выделить, две основные модели описания движения нитроксила, прикрепленного к макромолекуле

Первая модель разработана американским исследователем Фридом и заключается в том, что движение объемной молекулы нитроксильного радикала, присоединенного к макромолекуле, описывается эллипсоидом вращения, где параллельная компонента характеризует быструю переориентацию нитроксила относительно носителя, а перпендикулярная - медленную диффузию самого носителя.

Фрид развил меюд ин!ерпретации спектров для не изотропно вращающихся радикалов, вводя в стохастическое уравнение Лиувилля 2-х компонентный тензор диффузии и несовпадение магнитных тензоров нитроксила с тензором диффузии. Затем ' он перенес этот подход на спин-меченые макромолекулы, предположив, что перпендикулярная компонента тензора диффузии соответствует изотропному времени вращательной корреляции глобулы белка, а перпендикулярная - времени корреляции метки относительно белка, при этом угол несовпадения осей Ъ диффузионного и магнитных тензоров соответствует параметру упорядоченности Б. Иными совами, подход Фрида оперирует быстрым движением радикала относительно макромолекулы и медленным движением макромолекулы в целом с помощью одного типа движения (броуновского). Однако, имеются веские основания считать, что быстрое хаотическое движение метки не зависит от изотропного броуновского движения ее носителя, более того, они различаются по своей природе.

Модель, предложенная В.П. Тимофеевым, независимо рассматривает быстрое хаотическое движение нитроксила и медленное изотропное вращение радикала В результате движения нитроксила относительно макроносителя усредняются компоненты магнитных тензоров нитроксила. Суть моделирования сводится к замене неизвестного хаотического процесса быстрого движения спин-метки на простой, описываемый с помощью математического аппарата процесс. * Описание хаотической, быстрой переориентации метки относительно

макромолекулы, приводящей к частичному усреднению главных значений компонент обоих магнитных тензоров радикала, можно проводить различными способами, согласно различным моделям вращения радикала. Например, движение нитроксила может описываться как вращательно-колебательные движения системы координат нитроксила на некий угол вокруг некой пространственной оси II или колебанием всей системы координат нитроксила вокруг некой оси Я на угол а.

Глава 2 Исследование локальной динамической структура белка в спин-меченом тетрагональном кристалле лизоцима методом спин-метки ЭПР

В этой главе представлены результаты исследования динамики белкового и водного окружения метки и локальных конформационных изменений в белке при дегидратации и регидратации кристаллов лизоцима методом спин-метки ЭПР. Спектры ЭПР кристаллов спин-меченого лизоцима регистрировали на ЭПР-спектрометре Е-104А "Vanan": мощность СВЧ 2-5 мВт, амплитуда ВЧ-модуляции 1, 2 и 2,5 G, диапазон развертки поля - 100G, время сканирования - 8 минут, постоянная времени НЧ фильтра -0,128с. Температура образца 20-23°С. Использовались спин-метки: SL1 - 4-(1-иод-2-оксопропилиден)-2,2,3,5,5-пентаметилимидазолиднн-1-оксил, SLII - 4-бромметил- 2,2,3,5,5-пентаметшшмидазолидин - 1-оксил.

Показано, что изменение формы спектра ЭПР кристаллов Lyz-Hisl5-SLI и Lyz-Hisl5-SLII зависит от ориентации кристаллографических осей относительно направления магнитного поля Анализ этой зависимости позволил сделать вывод о том, что ¿ .0си нитроксильных радикалов SLI и SLII ориентированы вдоль кристаллографических осей а и b Введем следующие обозначения' NRa -нитроксильный радикал, оси ¿ которого

ориентированы вдоль кристаллографической оси a; NRb -нитроксильный радикал, оси Z которого ориентированы вдоль кристаллографической оси Ь. Угол поворота кристалла относительно направления магнитного поля обозначим через При ¡;=0° ось а кристалла ориентирована параллельно направлению магнитного поля.

Таким образом, спектры ЭПР (рис.1) являются суперпозицией спектров от взаимно перпендикулярных нитроксилов NRa и NRb, лежащих преимущественно в одной плоскости. Ориентация молекулярной оси 2 нитроксила относительно осей кристаллов Lyz-Hisl5-SLI и Lyz-H¡sl5-SLII была определена нами на основании данных рентгеноструктурных исследований этих кристаллов с высоким разрешением. Направление оси 2 рассчитали как нормаль к плоскости, в которой расположены атомы имидазолидинового кольца и NO-группы нитроксила. Было получено, что направляющие косинусов оси Z : сх = -0 912; су = -0 486; cz = 0.184 для SLI и сх = -0.106; су =0.937; cz = -0.086 для SLII Значения величин направляющих косинусов по X (для SLI) и по Y (для SLII) близки к единице, следовательно, ориентация нитроксилов, полученная по данным ЭПР, полностью подтверждается.

На рис 1 представлены экспериментально полученные спектры ЭПР монокристалла спин-меченного лизоцима в тетрагональной форме при различных углах поворота \ монокриС! алла вокруг кристаллографической оси Спектр 4 на рис 1 соответствует тому случаю, когда оси Z нитроксилов спин-меток расположены в плоскости, перпендикулярной направлению магнитного поля.

О 20 40 60 80 100

Развертка магнитного поля (Гс)

Рис 1 Спектры ЭПР монокристалла спин-меченного лизоцима (100 % влажности) при различных >глах поворота | монокристалла вокруг кристаллографической оси, перпендикулярно которой направлен вектор магнитного поля Н (1-£=-45°, 2-^=0°, 3-^-45°, 4-4=90°, 5-^=135°)

Значение процента спин-меченых молекул лизоцима в образце монокристалла (10%), полученное из данных рентгеноструктурного анализа, хорошо совпадает с коэффициентом модификации спин-меткой, вычисленным посредством двойного интегрирования спектров ЭПР

Существенное отличие расстояния между крайними широкими пиками в спектрах ЭПР от удвоенной величины главного значения тензора СТС (в отсутствие диполь-дипольного взаимодействия между спин-метками в кристалле) прямо доказывает наличие частичного усреднения магнитных тензоров из-за быстрых ограниченных по углам переориентаций нитроксила на конце остатка His-15 Поскольку остатки His-15 экспонированы в большие межмолекулярные капалы тетрагонального кристалла лизоцима, то при 100 % влажности локальная подвижпостъ метки на His-15 в кристалле лизоцима такая же, как подвижность метки на белке в растворе Симуляция спектров ЭПР в растворе и в кристалле подтверждает этот тезис.

Анализ спектров ЭПР тетрагональных кристаллов спин-меченого по Hisl 5 лизоцима при разных значениях влажности показал снижение интенсивности спектров без смещения их положения В интервале от 100 до 40 % влажности процесс дегидратации лизоцима имеет двухстадийный характер. Первая стадия (100 - 75% ОВ), характеризуемая резким изменением наблюдаемых параметров (уширение спектра ЭПР, отражающее увеличение Гауссова распределения состояний спин-метки, увеличение дифракционного поля кристалла белка и уменьшение объема кристаллической ячейки), обусловлена как удалением основной массы объемной воды, изменением сетки водородных связей, образуемых молекулами воды, так и статической разупорядоченностью пе более, чем на 5° молекул белка, как целого Вторая стадия (75 - 40% ОВ) характеризуется незначительным изменением регистрируемых параметров, которое связано с удалением оставшейся объемной воды и изменением положения молекул слабосвязанной воды в ближайшем окружении метки.

Регидратация кристаллов лизоцима имеет также двухстадийный характер. Изменение регистрируемых параметров свидетельствует о сохранении некоторой разупорядоченности в кристалле после его регидратации

Глава 3. Обнаружение спин-спинового взаимодействия при введении в иммуноглобулин М и G спин-метки по углеводной части

Другим случаем, когда в спектре ЭПР явным образом проявляется быстрое движение, является быстрое обменное спин-спиновое взаимодействие между двумя спин-метками При спин-мечении моноклонального IgM и нормального IgG по углеводной части с помощью спин-метки 2,2,6,6-тетраметил-4-аминопиперидин-1-оксила были

получены препараты спин-меченых белков В процессе отделепия гельфильтрацией спин-меченых белков от свободной спин-метки был обнаружен препарат, спектр ЭПР которого свидетельствовал о наличии быстрого обменного спин-спинового взаимодействия между двумя спин-метками. Как оказалось, носителем такого спектра ЭПР является гликопептид, нековалентно связанный с Возникновение такого спин-спинового взаимодействия возможно при вхождении двух спин-меток в гликопептид. Длина использованной нами спин-метки составляет »бА Спин-спиновое взаимодействие возникает тогда, когда расстояние между атомами кислорода нитроксилов спин-меток не превышает 5А (Лакарст) Таким образом, максимальное расстояние между точками присоединения двух спин-меток, при котором возможно спин-спиновое взаимодействие, составляет - при оппозитном расположении спин-меченых остатков - не более 17А. Глава 4. Моделирование спектров ЭПР

Рассчитать спектры ЭПР магниторазбавленных монокристаллов низкомолекулярных соединений (спин-меток) можно, используя спин-гамильтониан и данные о пространственном расположении молекул спин-метки по отношению к магнитному полю. Спектры ЭПР для ориептаций монокристалла, когда одна из главных осей магнитных тензоров направлены вдоль магнитного поля, могут быть рассчитаны следующим образом.

Интенсивность первой производной от ЭПР спектра поглощения нитроксильного радикала в хаотически разбросанном состоянии, когда интегрирование проводится по всем углам, представляется как:

7(Я)= I[¡Ь(Н-Н^П, (1)

дН п

Ин-Ик) = —Г------7—^Т' (2)

и(Н-Ня-тА(в,ср)\

К s

1 g

с постоянной величиной С0= ^ , резонансным полем HR = Н0 j* ^ , dí2 = sin вdOdcp

и зависимыми от углов величинами g-фактора и константы СТС:

g{0, <р) = i¡g)t sin' в cos2 <р + g; sin в sin (р + g\ cos2 <p , (3)

sin2 в cos2 <p + Ay sin в sin <p + A\ cos2 q>, (4)

при условии, что #0 = 3250G, g0 =[gx +gr +gz)/3, трех значений величины m = 0, +1 и где Ь(Н - HR) есть Лоренцева форма индивидуальной ЭПР линии с шириной

8 Положение вектора магнитного поля Н в главной молекулярной системе координат нитроксила X, У, 7 определяется углами $, (р

Чтобы получить спектры ЭПР монокристалла при любом заданном направлении вектора магнитного поля Н относительно главных осей кристалла, можно воспользоваться формулой так называемого «порошкового спектра» (1), сохранив интегрирование по всем у1 лам путем введения £-функции по выбранным углам а

/(#) = л ¡¿{Н-НьЩе-вМ-сроЪсЮ. (5)

ан п

Введение £-функций в формуле (5) можно считать правомерным, так как в магниторазбавленном монокристалле спин-метки парамагнитные центры одинаково ориентированы.

Процедура расчета спектров ЭПР значительно усложняется по сравнению с предыдущим случаем, если в узлах решётки кристалла расположены молекулы белка, а спин-метка ковалентно привязана к боковому остатку белка. В этом случае, очевидно, что молекулы белка неподвижны, а спин-метка, как и ее ближайшее белковое окружение, может двигаться в потенциальном поле белка. Следовательно, парамагнитные центры могут быть лишь преимущественно пространственно ориентированы по углам д0 и <р0 с разбросом по углам 9, ср. Поэтому в формуле (5) необходимо вместо 6-функции подставлять двумерное распределение Гаусса с соответствующими дисперсиями по углам:

г(б?,р) = С, ехр

Таким образом, при моделировании спектров ЭПР (симуляции) мы должны выбрать модель быстрого движения спин-метки и учесть угловое распределение спин-меток по ансамблю (кластерная модель) спин-меченых молекул

В любой спектроскопии существует проблема прямой и обратной задачи Прямая задача ЭПР спектроскопии (более узко: метода спин-метки) включает решение соответствующих уравнений для получения формы линии ЭПР спектра при определенном физическом состоянии образца. Обратная задача включает нахождение адекватной теории или физической модели, в рамках которой с помощью вычисленных параметров, рассчитывается теоретический спектр ЭПР сходный с экспериментальным. Обратная задача решается методом симуляции, те путем расчета спектров ЭПР по выбранной модели поведения спин-метки Обратная задача может решаться с привлечением методов

Н0-Л

ехр

2 а.

(6)

имитации (симуляции) молекулярного движения на ЭВМ (метод молекулярной динамики (МД), метод броуновской динамики (БД) и динамический метод Монте-Карло (МК)). Методом молекулярной динамики рассчитывается траектория движения спин-метки, присоединенной к боковому остатку молекулы белка По этим данным, используя конкретный вид спин-гамильтониана нитроксила, рассчитывается спектр ЭПР

При моделировании спектров ЭПР спин-меченых макромолекул необходимо выбрать модель быстрого движения спин-метки и учесть распределение по ансамблю Наиболее простой (минимальной по числу параметров) моделью для симуляции спектров ЭПР является модель либрационного движения нитроксила (в пределах углов +а) вокруг оси Я, направление которой в молекулярной системе координат нитроксила задается углами в, (р . Либрационное движение приводит к частичному усреднению тензоров А и д, которое наблюдается экспериментально. Такой модельный процесс приводит к следующим формулам для частично усредненных главных компонент обоих магнитных тензоров нитроксила А и % с исходными главными компонентами (Ах,Ау>Аг, gx,gy,gг),

А, = К,А, +~[2К,Т1А1 + К.АХ+К^Т^+Т,^)], (7)

1 С, 2а) „ вша „ „ , „ вша „

Тх =(1-5Х1-т), Ту =(1-5Х1 + *");Г7 =25 +1; при ¡=х,у,г, А=а0+^ЛА;

/М=Д4-5-й4-(1-5) к, АА = А7--*-у^, ЗЛ=Ах~Ау ; = £Д = За,,

На рис. 2 показан симуляционный спектр, полученный в рамках вышеизложенного подхода.

Рис 2 Симуляционный спектр ЭПР 5-51 при £=90°, соответствующий экспериментальному

спектру, приведенному на рис 1(4)

Глава 5. Постановка вычислительного эксперимента на основе

метода молекулярной динамики

Расчёты траекторий методом молекулярной динамики проводились в рамках компьютерной программы HyperChem. За основу была взята система потенциалов АМБЕР, которая позволяет использовать концепцию «объединённых атомов», что способствует существенному увеличению эффективности расчетного алгоритма и сокращению реального времени счёта на ПК.

Сначала к структуре молекулы лизоцима, взятой из Protein Data Bank (7LYZ), в рамках программы HyperChem, было проведено ковалентное связывание спин-метки по аминокислотному остатку His 15 Таким образом, теоретически, была собрана молекула лизоцима, модифицированная по единственному i истидиловому остатку His 15 аналогично экспериментально исследуемому спин-меченому белку На рис 3 показана молекула лизоцима, в которую введена по аминокислотному остатку His 15 спин-метка Володарского 4-(1-иод-2-оксопропилиден)-2,2,3,5,5-пентаметилимидазолидин-1-оксил

Рис 3 Молекула лизоцима с присоединенной спин-меткой (показана жирной линией) к аминокислотному остатку Н1Б15

Корректность применения метода МД к спин-меченным объектам существенно зависит от того, какие выбраны параметры потенциалов для нитроксильного радикала, входящего в состав спин-метки Поэтому в добавление к стандартным параметрам силового поля АМБЕР необходимо было ввести дополнительно параметры, отражающие структуру и поведение спин-метки, используя литературные данные рентгеноструктурного анализа. ЯМР спектроскопии, а также константы более общих силовых полей Это параметры для потенциала Ван-дер-Ваальса, параметры потенциала, задающего химическую связь, параметры для валентных и торсионных углов

Была проведена оптимизация локальной пространственной структуры белка вблизи места присоединения спин-метки, включая структуру спин-метки Для начальной оптимизации был использован метод наискорейшего спуска, с последующим получением более точной картины методом Ро1ак-ШЫегс (один из вариантов метода сопряженных градиентов).

Рис 4 Пространственное расположение в молекуле лизоцима спин-метки SLI, ковалентно связанной с His 15

а) рисунок построен по данным рентгеноструктурного анализа

б) структура, полученная при оптимизации

Оптимизированная структура спин-меченого лизоцима (рис 46) хорошо сопоставима со структурой, полученной впоследствии по рентгеноструктурным данным (рис 4а).

Для проведения расчетов была выбрана относительно простая модель, согласно которой расчет траекторий движения спин-метки методом МД реализуется за сравнительно небольшое время. В рамках предлагаемой модели рассматривается «замороженная» в целом молекула белка и «размороженный» спин-меченый аминокислотный остаток.

а

б

Расчет методом молекулярной динамики проводился при постоянной температуре Дтя поддержания температуры использовался термостат Берендссна Вначале все, что входит в подвижную систему, постепенно «нагревали» от ОК до 300К в течении 1 Ops (lps=10"'2s), с шагом по температуре 10К, а по времени - 2fs (lfs=10"l3s) После чего, используя полученную картину распределения скоростей, проводили расчет нескольких траекторий движения «размороженных» атомов в течение 1-2 ns с шагом 2fs. Координаты атомов записывались через 0.1 ps. RMS спин-мепси за время расчёта траектории составил

~ 2.1 А.

Расчет положений NO-группы нитроксила для вычисления ЭПР спектров проводили из траекторий движения спин-метки, отслеживая подвижный вектор магнитного поля в неподвижной молекулярной системе координат нитроксила.

Все расчёты методом МД проводились в рамках выбранной нами модели, резко сокращающей время расчета на компьютере, - «замороженный» остов белка и подвижная спин-метка вместе с ближайшим белковым окружением.

Метод молекулярной динамики дает дискретный набор координат выбранных атомов в молекуле спин-меченого лизоцима во времени. Для того чтобы воспользоваться этим набором и извлечь из него информацию о переориентации нитроксила, необходимо было осуществить целый ряд шагов.

Первый шаг - это определение системы координат нитроксила. На рис 5 показано, что ось X совпадает с направлением N-0 связи и направлена от атома N(1) к атому 0(2), а ось Y направлена от атома С(4) к другому атому С(3). Ось Z направлена перпендикулярно пересекающимся осям X, Y так, чтобы все три оси образовывали правую тройку векторов. Второй шаг - это введение в определенную таким образом молекулярную систему координат X,Y,Z нитроксила вектора магнитного поля Н(а,р,у), который в неподвижной (лабораторной) системе координат задает направление внешнего магнитного поля с помощью углов Эйлера. Третий шаг - получение временной зависимости вектора Н относительно подвижной системы координат нитроксила X,Y,Z. Четвертый шаг -пересчет всех направлений вектора Н из зависящих от времени эйлеровых углов а,(3,у, в сферические в, q>.

На рис 6(1-4) приведены диаграммы углового распределения р{в,<р) вектора Н относительно молекулярной системы координат нитроксила в составе спип-метки, ковалентно связанной или с изолированным гистидином (3,4), или с His 15 в составе молекулы белка лизоцима (1,2) Па диаграмме также представлены расчеты в двух случаях (1,3 и 2,4) разной длины «размороженной» аминокислотной цепи гистидина Каждая точка из тысячи на этих диаграммах представляет положение вектора Н в

молекулярной системе координат нитроксила (см рис 5) в зависимости от сферических углов в, гр, задаваемых траекторией спин-метки, рассчитываемой методом МД.

Рис 6 Четыре диаграммы углового распределения направлений вектора магнитного поля Н, полученные с помощью метода МД, задаваемых сферическими углами 0, (р, относительно системы координат нитроксила 1,2 - спин-метка, присоединенная к белку, 3,4 - спин-метка, присоединенная к гистидину (при различной длине «размороженной» цепи аминокислотного остатка)

Моделирование методом МД показывает значительное различие характера переориентационной подвижности спин-метки, присоединённой к отдельно взятой аминокислоте гистидину и к аминокислотному остатку 15 в составе белка лизоцима. Эти различия обусловлены, главным образом, локальными конформационными ограничениями, накладываемыми на движение спин-метки пространственной структурой белка Точки на рис 6 1-2 сгруппированы компактно по сравнению с точками на рис.6 3-4 Если построить зависимость плотности точек (в заданные интервалы углов от

углов 9, <р, то получается двумерное распределение Гаусса (см. формулу (6)).

Глава 6. Вычисление спектров ЭПР спин-меченых макромолекул по данным МД

Спин-метка прикреплённая к молекуле лизоцима, находясь внутри кристалла, имеет достаточную свободу для движения, поскольку упаковка молекул лизоцима в кристалле такова, что между ними имеется свободное пространство, доступное для движения спин-метки. Ограничения подвижности спин-метки будут в основном определяться локальной структурой участка той поверхности молекулы белка, непосредственно к которой прикреплена молекула спин-метки, и уже в значительно меньшей степени соседними молекулами белка, входящими в кристалл. Таким образом, при исследовании монокристалла белка мы видим, что динамика всей молекулы бежа как глобулы в растворе отсутствует, а подвижность спин-мегки, пролонгирующую ту или иную боковую группу белка, имеет решающее влияние на спектр ЭПР Именно поэтому расчёт по методу молекулярной динамики и сравнение результатов этого расчета с экспериментом были проведены для случая монокристалла, а не для раствора, как пытались делать ранее (Штайпхоф, Робинсон, Хаббл и др.).

Необходимо отметить, что методом молекулярной динамики мы можем получить упрощенную картину движения спин-метки и «увидеть», как молекула белка ограничивает область возможных угловых «местонахождений» спин-метки.

Фактически методом МД рассчитывается распределение координат атомов по времени для одной молекулы белка Одна молекула белка - одна траектория поведения спин-метки во времени На основании этих данных мы получаем частично за счет быстрого движения спин-мстки относительно белка усредненные значения компонент тензора сверхтонкой структуры для спин метки.

Однако следует также учесть, что в реальном эксперименте ЭПР мы имеем дело не с одной молекулой, а целым ансамблем спин-меченых молекул белка входящих в монокристалл, состоящий из огромного числа молекул лизоцима (10|3-1014) (каждая десятая из них имеет парамагнитную метку) То есть в каждый конкретный момент

времени существует угловое распределение положений спин-метки по всему ансамблю спин-меченых молекул белка. Это стационарное распределение, поскольку спектр ЭПР от спин-меченого кристалла не меняется со временем Следовательно, существует глубокая связь между индивидуальной траекторией ориентационного движения спин-метки с вероятностью существования того или иного положения спин-метки, или с распределением положений спин-метки по всему ансамблю. Каждое положение спин-метки в траектории движения (МД) это определенный спектр ЭПР, взвешиваемый функцией распределения Следовательно, функция распределения указывает на то, с какой вероятностью нитроксил будет иметь то или иное положение, возникающее в процессе счета траектории.

Таким образом, вместо отслеживания отдельных положений (точек на диаграмме) спин-метки по траекториям, мы рассматриваем ансамбль спин-меток в кристалле лизоцима, описываемый распределением р{в, <р) см.(6), которое по центральной теореме Гаусса должно соответствовать в пределе распределению по времени. Учёт распределения по ансамблю схематически показан на рис.7.

Рис 7 Схематические модели для расчета спектров ЭПР при ковалентно связанной спин-метки с белком, где осью Я обозначено направление нитроксила по отношению к магнитному полю Н слева - распределение направлений осей Я нитроксила по ансамблю молекул белка, справа то же что и слева при наличии быстрых либраций нитроксила вокруг оси I?

Зная расположение молекул лизоцима в элементарной ячейке кристалла и на основании полученных методом молекулярной динамики траекторий движения можно рассчитать спектры ЭПР. Основное уравнение магнитного резонанса в скалярной форме для нитроксила имеет вид:

т.е поглощение СВЧ излучения будет наблюдаться при тех значениях магнитного поля, которые соответствуют (резонанс) этом у уравнению при фиксированной частоте v0, при этом: Aeff=Axx2cos2a+Ayy2 cos2р ( Ajcoii1 утл. geff=gxx2cos2a+gyy2 cos2fi+gjcos2y. (9)

a

H

hvo=g„g(a, P, y)PeHR+Aell(a, P, }jm, где m= 0,±1

(8)

Направляющие косинусы cosa, cos/}, cosy определяют положение вектора магнитного поля Н в молекулярной системе координат нитроксила Первая производная по полю Н от интенсивности сигнала поглощения, представляющую собой Лоренцову линию, дает спектр ЭПР, который нужно сравнивать с экспериментальным'

1 8 к * Ö2 + (Я - HR(a,ß,y)+m A{a,ß,y)f

(10)

I{a,ß,y,H)= ¡¡J

где Ял = 8оН°

R siß,ß,y)

Чтобы получить искомый спектр ЭПР необходимо усреднить выражение (10) по ансамблю спин-меченых макромолекул. Это означает, что вместо отслеживания отдельных положений молекулярной системы координат нитроксила по траекториям мы рассматриваем ансамбль спин-меток, описываемый распределением вероятности р(в,<р) Следовательно, умножив интенсивность спектра / (10) на р(9,ф) и проинтегрировать по всем в, <р, мы получаем искомый спектр ЭПР или проще согласно формуле (11).

hH)=lNh^(p„H) OD

Искомый спектр показан на рис.8, который соответствует случаю, когда все оси Z нитроксила находятся в плоскости перпендикулярной постоянному магнитному полю прибора ЭПР Полученный теоретический спектр хорошо согласуется с экспериментальным даже в рамках таких довольно жестких, но разумных предположений.

Н, Гс

Рис 8 Расчетный спектр ЭПР по данным метода МД, соответствующий экспериментальному спектру, приведенному на рис. 1(4)

Заключение

Монокристаллы спин-меченного лизоцима являются хорошей основой для теоретического и экспериментального исследования роли быстрого движения спин-метки в наблюдаемых спектрах ЭПР Исключив движение молекулы белка как целого, мы уделяем внимание исключительно этой компоненте, то есть изучению сложного быстрого движения бокового остатка, при наличии белкового окружения

Для изучения динамики бокового остатка белковой молекулы методом молекулярной динамики предложена простая модель, для которой был произведен расчет траекторий быстрого движения спин-метки на боковом остатке макромолекулы. В рамках предлагаемой модели рассматривается «замороженная» в целом структура молекула белка и подвижный спин-меченый аминокислотный остаток

Даже в рамках такой упрощенной модели без учета растворителя и кулоновских взаимодействий, на основании метода молекулярной динамики удалось получить теоретические спектры ЭПР хорошо согласующиеся с экспериментальными. Можно предположить, что учет заряда и добавление молекул несвязанной с белком воды будет влиять только на релаксационные свойства локальных конформационных перестроек в молекуле белка, а не на амплитудно-структурные изменения в макромолекуле.

Было бы некорректно пытаться рассчитывать спектр ЭПР только для одной как бы изолированной молекулы белка, поскольку регистрируемый спектр отражает вклад всего ансамбля спин-меченых молекул лизоцима Кроме того, надо принимать во внимание, что в ансамбле каждая спин-метка движется не синхронно с остальными, хотя и в рамках одного стационарного стохастического закона То есть, помимо усреднения магнитных тензоров за временные ворота метода ЭПР необходимо усреднять спектры ЭПР по ансамблю молекул белка, содержащих спин-метку

При анализе спектров ЭПР спин-меченных макромолекул в растворе необходимо вводить более сложную модель, учитывающую как медленное движение спин-метки вместе с макромолекулой (определяется временем вращательной корреляции т), так и быстрое движение спин-метки вместе с ближайшим окружением относительно макромолекулы. Впервые эта модель, состоящая из двух движений спин-метки: быстрого и медленного, была обозначена, как BiMoC model - (BiMotional Cluster model).

Используя развитые в работе подходы, открывается широкий спектр возможностей оценивать в реальных измеряемых физических величинах подвижность любой боковой группы в белках и нуклеиновых кислотах.

Выводы

1 На основании данных метода спин-метки ЭПР показано, что характер быстрых либрапионных движений спин-меченой боковой группы 5 в молекулах лизоцима как в составе тетрагонального кристалла при 100% влажности, так и в растворе остается неизменньм

2 Определена модельная пространственная структура снин-меченного лизоцима, оптимизированная путем минимизации потенциальной энергии макромолекулы, которая хорошо совпала со структурой, полученной впоследствии методом рентгеноструктурного анализа.

3 На основании расчета методом МД показано, что белковое окружение стерически ограничивает область возможных угловых переориентаций репортерской N0 группы нитроксила в составе спин-метки, что в свою очередь влияет на форму спектра ЭПР.

4 Впервые методом молекулярной динамики проведен расчет спектра ЭПР, в случае быстрот о ограниченного в пространстве движения спин-метки на боковом остатке макромолекулы в рамках решения обратной задачи ЭПР спектроскопии спин-меченых макромолекул Показано, что рассчитанный спектр ЭПР хорошо совпадает с экспериментальным спектром ЭПР монокристалла спин-меченого лизоцима.

5. Создан программный пакет, позволяющий рассчитывать спектры ЭПР спин-меченых объектов на основании записанного траекторного файла в рамках программы НурегСЬеш и исходных ма: нитных параметров спин-метки.

6 Впервые методом спин-метки исследуется влияние влажности на состояние кристалла. Оказалось, что изменение формы спектров ЭПР спин-меченого кристалла лизоцима происходит но двухстадийному механизму. При этом линии уширяются, а положение пиков остается неизменным.

7 Экспериментально обнаружено быстрое обменное спин-спиновое взаимодействие между двумя спин-метками, носителем которых является гликопептид, нековалентно связанный с иммуноглобулинами Миб. Анализ спектров ЭПР спин-меченого гликопептида как бирадикала показал, что расстояние между атомами кислорода двух спин-меток не превышает 5А.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

По материалам диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ:

1. Никольский Д.О., Тимофеев В.П. XI Международная конференция "Магнитный резонанс в химии и биологии", Звенигород-2001, Россия, Апрель, 20-27, 2001. "Молекулярная динамика нитроксильного радикала, локализованного на конце боковых групп биополимеров. Симуляция спектров ЭПР." Стр. 176-177.

2. Nikolsky D.O., Timofeev V.P., III-rd International Conference on Nitroxide Radicals, September 23-29, 2001 in Kaiserslautem, Germany. Abstracts. P.983. "Molecular dynamics of nitroxide moiety of the end of the macromolecule side chain groups. The simulation of EPR spectra."

3. Артюх Р.И, Качалова Г.С., Ланина Н.Ф., Никольский Д.О., Тимофеев В.П., Бартуник Х.Д. (2002) "Локальная динамическая структура белка в спин-меченом тетрагональном кристалле лизоцима при изменении влажности." Биофизика 47, 795-805.

4. Тимофеев В.П., Никольский Д.О., Лапук В.А., Алешкин В.А. (2002) "Обнаружение спин-спинового взаимодействия при введении в иммуноглобулины М и G спин-метки по углеводной части". Биофизика 47,618-624.

5. Timofeev V.P., Nikolsky D.O., Lapuk V.A., Aleshkin V.A. (2002) "Revealing of the spm-spin interaction due to incorporating a spin label in the carbohydrate parts of immunoglobulins M and G." J.Biomolecular Structure & Dynamics, 20, N4,1-7.

6 Никольский Д.О., Тимофеев В.П. "Роль быстрого движения спин-мепси при интерпретации спектров ЭПР спин-меченых макромолекул". Биофизика, 2003, Т.48, №4, с.606-617.

7. Timofeev V.P., Nikolsky D.O. "The role of the fast motion of the spin label in the interpretation of EPR spectra for spin-labeled macromolecules". Journal of Biomolecular Structure & Dynamics, 2003, ISSN 0739-1102, V.21, No 3.

8. Никольский Д.О., Тимофеев В.П. "Молекулярная динамика спин-меченых боковых групп в растворе и в кристаллах". III съезд биофизиков России, Воронеж-2004, Россия, июнь 24-29,2004.

#139 94

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 06.03.2006 г. Формат 60x90 1/16. Усл-печл. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ 135. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Никольский, Дмитрий Олегович

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

Спектроскопия магнитного резонанса и метод спин-метки.

Методы решения обратной задачи спектроскопии ЭПР.

Описание быстрой хаотической переориентации спин-метки.

Динамические модели движения, использующиеся при интерпретации спектров ЭПР.

Численные методы моделирования.

Метод Молекулярной Динамики.

Метод Монте-Карло.

Методы Оптимизации.

Исследования макромолекул методом молекулярной динамики.

Глава 2 Исследование локальной динамической структуры белка в спин-меченом тетрагональном кристалле лизоцима методом спин-метки ЭПР.

Условия эксперимента.

Результаты и обсуждение.

Глава 3. Обнаружение спин-спинового взаимодействия при введении в иммуноглобулин

М и G спин-метки по углеводной части.

Условия эксперимента.

Результаты исследования.

Обсуждение результатов.

Глава 4 Моделирование спектров ЭПР.

Вычисление спектров ЭПР монокристалла для низкомолекулярных соединений.

Вычисление спектров ЭПР спин-меченых макромолекул в составе монокристалла.

Глава 5. Постановка вычислительного эксперимента на основе метода молекулярной динамики.

Построение модельной системы и оптимизация.

Расчеты методом МД.

Глава 6. Вычисление спектров ЭПР спин-меченых макромолекул по данным МД.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Быстрые движения боковых остатков в белках по данным методов молекулярной динамики и спин-метки"

В настоящее время наблюдается повышенный интерес к применению метода спин-метки в молекулярной биологии, в связи с тем, что можно избирательно вводить спин-метки по любому аминокислотному остатку молекулы белка или основанию в ДНК [1,2]. Анализ формы спектра ЭПР таких спин-меченых макромолекул позволяет получить информацию о молекулярном движении и представляет собой доступный подход к изучению как конформационных изменений, так и биологических функций макромолекул.

Однако, несмотря на огромное количество полученных экспериментальных спектров ЭПР, корректной, недвусмысленной, единой для всех, кто использует метод спин-метки, интерпретации этих спектров до сих пор не существует. Нет единого подхода к решению обратной задачи ЭПР спектроскопии в методе спин-метки [3]. Основная причина отсутствия единого подхода к истолкованию спектров ЭПР заключается в следующем: нет четкого ответа на вопрос, как связывать экспериментальные параметры, определяемые из спектров ЭПР (для той или иной модели движения спин-метки), с наблюдающимися локальными конформационными изменениями структуры макромолекулы или с движением всей структуры макромолекулы в растворе.

При анализе спектров ЭПР необходимо учитывать, что вводимая в молекулу белка спин-метка не является статическим объектом, и характер ее собственного движения во многом определяет форму линии ЭПР спектра. С одной стороны мы имеем спектр ЭПР, отражающий локальную структуру макромолекулы в динамике, а с другой стороны -«застывшую» структуру по данным рентгеноструктурного анализа. При моделировании спектров ЭПР на ЭВМ используют различные модели быстрого переориентационного движения спин-метки. Однако, существует метод молекулярной динамики, который позволяет напрямую моделировать поведение сложных динамических систем [4,5], опираясь на данные рентгеноструктурного анализа. Метод молекулярной динамики представляет собой численное решение уравнений Ньютона для системы атомов, с учётом взаимодействия между ними. То есть метод молекулярной динамики в данном контексте можно рассматривать, как «мост» между экспериментальными данными ЭПР и данными рентгеноструктурного анализа. Иными словами, результаты, полученные методом молекулярной динамики с использованием в качестве начальных координат атомов данные метода рентгеноструктурного анализа, можно сопоставлять с данными экспериментальных методов магнитного резонанса, в том числе и ЯМР.

В настоящей работе методом молекулярной динамики оценивается влияние локальной структуры молекулы белка, уже известной по данным рентгеноструктурного анализа, на подвижность репортерской группы (нитроксила), присоединенной к выбранному аминокислотному остатку, и анализируется вклад собственного хаотического движения спин-метки относительно белка на спектр ЭПР. В качестве объекта исследования выбран спин-меченый монокристалл лизоцима [6]. Молекулы белка неподвижны в структуре монокристалла, по сама структура не препятствует локальной подвижности поверхностных групп. Поэтому белковый монокристалл можно рассматривать в качестве удобной модели для исследования характера движения аминокислотного остатка (или спин-метки) относительно белка. Ожидается, что сравнение теоретического спектра ЭПР, полученного методом молекулярной динамики, с экспериментальным будет критерием корректности развиваемого здесь физического подхода для решения биологических задач в рамках метода молекулярной динамики.

Наблюдение за характером быстрых движений боковых остатков в монокристаллах белков осуществлялось с помощью метода спин-метки [7,8]. Интерпретация спектров ЭПР монокристаллов спин-меченого лизоцима (при наличии различных ориентации тетрагонального кристалла белка относительно направления магнитного поля) проводилась с привлечением метода молекулярной динамики (МД). Предложена простая модель, согласно которой расчет траекторий движения спин-метки методом МД реализуется за сравнительно небольшое время. В рамках предлагаемой модели рассматривается «замороженная» в целом молекула белка и «размороженный» спин-меченый аминокислотный остаток. Для расчёта траекторий в вакууме была собрана модель спин-меченого лизоцима и заданы параметры силовых потенциалов атомов молекулы белка, включая спин-метку. Из проведенных расчётов следует, что белковое окружение стерически ограничивает область возможных угловых переориентаций репортерской N0 группы нитроксила в составе спин-метки, что в свою очередь влияет на форму спектра ЭПР. Однако, как оказалось, разброс положений репортерской группы в угловом пространстве соответствует распределению Гаусса. Используя координаты атомов спин-метки, полученные методом МД в выбранном временном интервале и учитывая распределение состояний спин-метки по ансамблю спин-меченых макромолекул в кристалле, мы смоделировали спектры ЭПР монокристаллов спин-меченного лизоцима. Полученные теоретические спектры ЭПР оказались сходными со спектрами, полученными экспериментальным путем.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Никольский, Дмитрий Олегович

Выводы

1. На основании данных метода спин-метки ЭПР показано, что характер быстрых либрационных движений спин-меченой боковой группы His 15 в молекулах лизоцима, как в составе тетрагонального кристалла при 100% влажности, так и в растворе, остается неизменным.

2. Определена модельная пространственная структура спин-меченного лизоцима, оптимизированная путем минимизации потенциальной энергии макромолекулы, которая хорошо совпала со структурой, полученной впоследствии методом рентгеноструктурного анализа.

3. На основании расчета методом МД показано, что белковое окружение стерически ограничивает область возможных угловых переориентаций репортерской N0 группы нитроксила в составе спин-метки, что, в свою очередь, влияет на форму спектра ЭПР.

4. Впервые методом молекулярной динамики проведен расчет спектра ЭПР в случае быстрого ограниченного в пространстве движения спин-метки на боковом остатке макромолекулы в рамках решения обратной задачи ЭПР спектроскопии спин-меченых макромолекул. Показано, что рассчитанный спектр ЭПР хорошо совпадает с экспериментальным спектром ЭПР монокристалла спин-меченого лизоцима.

5. Создан программный пакет, позволяющий рассчитывать спектры ЭПР спин-меченых объектов на основании записанного траекторного файла в рамках программы HyperChem и исходных магнитных параметров спин-метки.

6. Впервые методом спин-метки исследуется влияние влажности на состояние кристалла. Оказалось, что изменение формы спектров ЭПР спин-меченого кристалла лизоцима происходит по двухстадийному механизму. При этом линии уширяются, а положение пиков остается неизменным.

7. Экспериментально обнаружено быстрое обменное спин-спиновое взаимодействие между двумя спин-метками, носителем которых является гликопептид, нековалентно связанный с иммуноглобулинами М и G. Анализ спектров ЭПР спин-меченого гликопептида как бирадикала показал, что расстояние между атомами кислорода двух спин-меток не превышает 5А.

Заключение

Монокристаллы спин-меченного лизоцима являются хорошей основой для экспериментального исследования роли быстрого движения спин-метки в наблюдаемых спектрах ЭПР. Исключив движение молекулы белка как целого, мы уделяем внимание исключительно этой компоненте, то есть изучению сложного быстрого движения бокового остатка при наличии белкового окружения.

Для изучения динамики бокового остатка белковой молекулы методом молекулярной динамики предложена простая модель, для которой был произведен расчет траекторий быстрого движения спин-метки на боковом остатке макромолекулы. В рамках предлагаемой модели рассматривается «замороженная» в целом структура молекула белка и подвижный спин-меченый аминокислотный остаток.

Даже в рамках такой упрощенной модели без учета растворителя и кулоновских взаимодействий, на основании метода молекулярной динамики удалось получить теоретические спектры ЭПР хорошо согласующиеся с экспериментальными. Можно предположить, что учет заряда и добавление молекул несвязанной с белком воды будет влиять только на релаксационные свойства локальных конформационных перестроек в молекуле белка, а не на амплитудно-структурные изменения в макромолекуле.

Было бы некорректно пытаться получить спектр ЭПР только для одной как бы изолированной молекулы белка, поскольку спектр отражает вклад всего ансамбля спин-меченых молекул лизоцима. Кроме того, надо принимать во внимание, что в ансамбле каждая спин-метка движется не синхронно с остальными, хотя и в рамках одного стационарного стохастического закона. То есть, помимо усреднения магнитных тензоров за временные ворота метода ЭПР необходимо усреднять спектры ЭПР по ансамблю молекул белка, содержащих спин-метку.

При анализе спектров ЭПР спин-меченных макромолекул в растворе необходимо вводить более сложную модель, учитывающую как медленное движение спин-метки вместе с макромолекулой (определяется временем т), так и быстрое движение спин-метки вместе с ближайшим окружением относительно макромолекулы. Впервые эта модель, состоящая из двух движений спин-метки - быстрого и медленного, - была обозначена, как BiMoC model - bimotional cluster model.

Использование развитых здесь подходов открывает широкий спектр возможностей оценивать подвижность любой боковой группы в белках и нуклеиновых кислотах в реальных измеряемых физических величинах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Никольский, Дмитрий Олегович, Москва

1. Hubbell WL, Cafiso DS, Altenbach C. // Nature Struct. Biol. 2000 V.7. 735-739

2. Borbat P.P., Costa-Filho A.J., Earle K.A., Moscicki J.K., Freed J.H. // Science 2001. V.291. P. 266-269.

3. Тимофеев В.П. // Молекулярная биология. 1986. Т. 20. С. 697-711.

4. Балабаев Н.К. // Метод молекулярной динамики в физической химии. / Под ред. Товбина Ю.К. М.: Наука, 1996. С. 258-279.

5. Мазо М.А., Балабаев Н.К., Олейник. Э.Ф. // Метод молекулярной динамики в физической химии. / Под ред. Товбина Ю.К. М.: Наука, 1996. С. 280-295.

6. Артюх Р.И., Качалова Г.С., Ланина Н.Ф., Никольский О.Д., Тимофеев В.П., Бартуник Х.Д. (2002) Локальная динамическая структура белка в спин-меченом тетрагональном кристалле лизоцима при изменении влажности. Биофизика 47, 795-805.

7. Д.О. Никольский, В.П. Тимофеев "Роль быстрого движения спин-метки при интерпретации спектров ЭПР спин-меченых макромолекул". Биофизика, 2003, Т.48, №4, с.606-617.

8. V.P. Timofeev, D.O. Nikolsky "The role of the fast motion of the spin label in the interpretation of EPR spectra for spin-labeled macromolecules". Journal of Biomolecular Structure & Dynamics, 2003, ISSN 0739-1102, V.21, No 3.

9. L.J.Berliner. Spin Labeling I. Theory and Application. Academic Press Inc. New York. 1976.

10. L.J.Berliner. Spin Labeling II Theory and Application. Academic Press Inc. New York 1979

11. Berliner. L. J. and J. Reuben. 1989. Biological Magnetic Resonance 8, Spin Labeling. Plenum Press, New York.

12. Нордио П. Л. в кн.: Метод спиновых меток. Теория и применение/Под ред. Берлинера. М.: Мир, 1979, т.1 с. 13-63

13. Лихтенштейн Г. И. Метод спиновых меток в молекулярной биологии. М.: наука, 1974

14. Кузнецов А. Н. Метод спинового зонда. М.: Наука, 1976

15. McCalley R. С., Shimshik Е. L., McConnell Н. М. Chem. Phys. Lett., 1972, v 13, р 115-119

16. Freed, J. H. 1976. Theory of slow tumbling ESR spectra for nitroxides. In Spin Labeling Theory and Applications. L. J. Berliner, editor. Academic Press, New York. 53-132.

17. Timofeev V.P., Samarianov B.A. //Appl. Magn. Reson. 1993. V.4. P. 523-539.

18. Timofeev V.P., Samarianov B.A. //J. Chem. Soc. PERKIN TRANS. 1995. V.2. P.2175-2181.

19. Гриффит О.Г. в кн.: Метод спиновых меток. Теория и применение/Под ред. Берлинера. М.: Мир, 1979, т.1 с. 489-569

20. Schneider, D. J. and J. H. Freed. 1989. Calculating slow motional magnetic resonance spectra: a users guide. In Biological Magnetic Resonance 8. Spin Labeling. L. J. Berliner and J. Reuben, editors. Plenum Press. New York. 1-76.

21. Ю.А. Готлиб, А.А. Даринский, Ю.Е. Светлов. Физическая кинетика макромолекул, Ленинград, Химия, 1986.

22. А.А. Даринский, Ю.А. Готлиб 1980, Молекулярная динамика полимерных цепей с жёсткими связями. Локальные времена релаксации. Высокомолекулярные соединения т.22А, №1, стр. 123-132.

23. Метод молекулярной динамики в физической химии, Москва, Наука, 1996.

24. К.В. Шайтан, М.Д. Ермолаева, Н.К. Балабаев, А.С. Лемак, М.В. Орлов, Молекулярная динамика олигопептидов. 2. Корреляционные функции внутренних степеней свободы модифицированных дипептидов. // 1997,42, 3, 558-565.

25. К.В.Шайтан, М.Д.Ермолаева, С.С.Сарайкин, Молекулярная динамика олигопептидов. 3. Карты уровней свободной энергии модифицированных дипептидов и динамические корреляции в аминокислотных остатках. // Биофизика, 1999,44, 18-21.

26. К.В. Шайтан, А.А. Беляков, Молекулярная динамика олигопептидов. 4. Динамические особенности часто и редко встречающихся дипептидных фрагментов белков // Биофизика 2002, 47, 2, 219-227.

27. N.L. Allinger, J. Am. Chem. Soc., 99, 8127 (1977).

28. U.Burkert and N.L. Allinger, Molecular Mechanics, ACS Monograph 177 (1982).

29. J. Lii et. al., J. Сотр. Chem. 10, 503 (1989).

30. Weiner S.J., Kollman P.A., Case D.A., Singh U.C., Ghio C., Alagona G., Profeta S.J., Weiner P. //J. Am. Chem. Soc. 1984. V. 106 P. 765-784.

31. Weiner S. J., Kollman P.A., Nguyen D.T., Case D.A. // J. Сотр. Chem., 1986. V. 7. P. 230.

32. S. W. Homans 1990. A Molecular Mechanical Force Field for the Conformational Analysis of Oligosaccharides: Comparison of Theoretical and Crystal Structures of Manarl -3Man/?/-4GlcNAc. Biochemistry, 29, 9110-9118.

33. H.J. C. Berendsen, J. P. M. Postma, W. F. van Gunsteren, A. di Nola, and J. R. Haak 1984. J.1. Chem. Phys. 81,368

34. В.Л.Голо, К.В.Шайтан, Динамический аттрактор в термостате Берендсена и медленная динамика биомакромолекул, // Биофизика, 2002, 47 (4), 611-617.

35. A.S.Lemak and N.K.Balabaev, Molecular dynamics simulation of polymer chain in solution by collisional dynamics method,//J.Comput.Chem., 1996,17, 1685-1695.

36. Leo S.D. Caves, Jeffrey D. Evanseck, and Martin Karplus 1998. Locally accessible conformations of proteins: Multiple molecular dynamics simulations of crambin. Protein Science, 7:649-666. Cambridge University Press.

37. Balabaev N.K., Fushman D.A., Lemak A.S., Mironova Yu.V. 1990. Molecular dynamics simulation of spin label on model surface. Preprint, Pushchino.

38. Steinhoff, H.-J., and C. Karim. 1993. Protein dynamics and EPR-spectroskopy: comparison of molecular dynamic simulations with experiment. Ber.Bunsenges. Phys.Chem: 97:163-171.

39. Robinson, В. H., L. J. Slutsky, and F. P. Auteri. 1992. Direct simulation of continuous wave electron paramagnetic resonance spectra from Brownian dynamics trajectories. J. Chem. Phys. 96:2609-2616.

40. Steinhoff, H.-J., and Hubbell, W. L. 1996. Calculation of electron paramagnetic resonance spectra from Brownian dynamic trajectories: Application to nitroxide side chains in Proteins. Biophys. J. 71:2201-2212.

41. Артюх P.И., Качалова Г.С., Панина Н.Ф., Мозолева А.П. Анисимов Н.В., Тимофеев В.П. 1999. Спектры ЭПР спин-меченого лизоцима в кристаллах тетрагональной формы, ориентированных в магнитном поле. Молекуляр. биология. 33, 542-552.

42. Тимофеев В.П., Никольский О.Д., Лапук В.А., Алешкин В.А. (2002) Обнаружение спин-спинового взаимодействия при введении в иммуноглобулины М и G спин-метки по углеводной части. Биофизика 47, 618-624.

43. V.P.Timofeev, D.O.Nikolsky, V.A.Lapuk, V.A.Aleshkin (2002) Revealing of the spin-spin interaction due to incorporating a spin label in the carbohydrate parts of immunoglobulins M and G. J.Biomolecular Structure & Dynamics, 20, N4, 1-7.

44. Bernstein F.G., Katzie T.F., Williams G.J.B., Meyer E.F., Brice M.D., Rogers J.R., Kennard 0., Shmakouchi Т., Tasumi M. // J. Mol. Biol. 1977. V. 112. P. 535-546.

45. Артюх Р.И., Качалова Г.С., Самарянов Б.А., Тимофеев В. П. // Молекуляр. биология. 1995. Т. 29. С. 149-158.

46. Barone V., Bencini A., Cossi М., di Matteo A., Mattesini М., Totti F. // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. P. 7069-7078.

47. Morozov V.N., Morozova T.Ya., Kachalova G.S., Myachin E.T. 1988. Interpretation of water desorption isotherms of lysozyme. Int. J. Biol. Macromol. 10, 329-336.