Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЕМЫ РАСШИРЕНИЯ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ЛЮПИНА

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЕМЫ РАСШИРЕНИЯ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ЛЮПИНА"

л-бы я

На правах рукописи

КОСТЮЧЕНКО ДИНА АЛЕКСЕЕВНА

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЕМЫ РАСШИРЕНИЯ ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ЛЮПИНА

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Работа выполнена в отделе физиологии и биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института люпина; в лаборатории кафедры лесных культур и почвоведения Брянской государственной инженерно-технологической академии.

Научный руководитель -

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Лихачев Борис Степанович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Павловская Нинэггь Ефимовна

кандидат биологических наук Голышкин Леонид Викторович

Ведущая организация

Орловский государственный университет

Защита состоится « 2004г. в /4' —час на заседании

диссертационного совета КМ 220,052,01 при Орловском государственном аграрном университете по адресу; 302019, г.Орел, ул. Генерала Родина, 69 Орел ГАУ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Орел ГАУ: г. Орел, Бульвар Победы, 19

Просим принять участие в работе совета или прислать отзыв в двух экземплярах, заверенных печатью

Автореферат разослан « » ¿7 КкЛА^ 2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета,доцент г/ц \ЦпакееваТ.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Повышению результативности селекционного процесса должно способствовать совершенствование его технологии. В этом плане большое значение имеет качественно новое изучение генофонда культурных растений, направленное на выявление генетических источников и доноров селектируемых признаков. Для этого необходимо расширение исследований по всем направлениям, имеющим отношение к селекции, и особенно по частной генетике и биотехнологии, как в целях создания нового исходного материала, так и для выявления морфологических, физиологических, биохимических и т.н. маркеров селектируемых признаков.

В этой связи нами проведены исследования возможностей использования биотехнологических приемов в расширении генофонда исходного материала люпина — культуры, обладающей огромным биологическим и экономическим потенциалом.

Новые разработки, в которых используются культуры клеток и тканей, а также методы генной инженерии значительно сокращают затраты времени и труда на создание новых исходных форм для селекции. Техниха рекомбинаитных ДНК и ее последовательное применение в селекции растений способствует преодолению барьеров, препятствующих межвидовому скрещиванию, что особенно актуально для люпина. Она позволяет увеличить генетическое разнообразие, которое существенно пострадало из-за широкого распространения ограниченного числа высокопродуктивных сортов.

Быстрое внедрение нового сорта в практику сдерживается невозможностью получения большого количества семян или посадочного материала дня вегетативного размножения в течение одного сезона. Это препятствие устраняется с помошью биотехнологии, которая предлагает селекционерам эффективный и быстрый метод микроразмножения растений.

Цель работы - изучить способность разных видов люпина к клональному микроразмножению и генетической трансформации,

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

- оценить разные органы растений люпина по способности к кадлусообразованию и регенерации;

- изучить морфо- и ризогенез в разных условиях культивирования;

- экспериментально подобрать наиболее эффективные питательные среды для клонапьного размножения разных видов люпина;

- установить возможность использования культуры незрелых зародышей в сохранении ценных генотипов люпина;

- получить растения-регенеранты из различных органов люпина;

- отработать методику генетической трансформации клеток люпина с помощью агробактерий. ................... . ,

| инб мсха ;

АсЗМиЬ—. 1

Научная новизна. Выявлены особенности пролиферации верхушечных и пазушных почек при культивировании in vitro 16 перспективных сортов и сортообразцов желтого, 10 сортов узколистного, 4 сортов белого, а также многолнотного люпина. Установлена зависимость умножения и развития побегов от количественного состава среды, содержания гормонов и режима пассирования. Определены наиболее эффективные среды для корнеобразования разных видов люпина. Предложены схемы для регенерации растений из незрелых зародышей желтого, узколистного и белого люпина. Впервые получена каллуеиая ткань узколистного люпина, трансформированная с помощью Agrobacterium tumefaciens (рВШЬЗД) и приобретшая в результате трансформации устойчивость к канзмицину.

Практическая значимость результатов исследования. Предложены схемы регенерации растений из незрелых зародышей узколистного, желтого и белого люпина. Разработаны условия лля этапа адаптации растений-регенерантов к культивированию ¡л vivo. Доказана возможность использования методов генетической трансформации тканей люпина с помощью агробактерий при создании принципиально нового исходного материала. Часть полученных регенератов узколистного (АТ-Д-2-Г/1) и желтого люпина (Искорость) используется в селекционных программах.

Обоснованность выводов н достоверность редультатов исследований подтверждается достаточным объемом экспериментального материала, собранного и обработанного с использованием современных методов исследований и ЭВМ, получением из каллусов растекий-pe ге нерантов и генетически измененных форм, использованием их в селекционных программах.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Видовая и сортовая специфичность реакции люпина на разные питательные среды и другие условия культивирования in vitro.

2. Схемы и условия клонального микроразмножения разных видов люпина.

3.' Эффективность корнеобразования и адаптации к естественным условиям культивируемых видов люпина.

4.' Способность люпина к генетической трансформации с помощью Agrobacterium tumefaciens (рВЬНЬЗД).

Личный вклад автора. Разработка программы и методики исследований, получение, обработка, анализ и обобщение экспериментального материала, формулирование общих выводов по результатам выполненной работы, подготовка докладов и статей, оформление диссертации выполнены самостоятельно.

Апробация результатов НИР. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались ежегодно на Ученом совете Всероссийского научно-исследовательского института люпина (1989-1995 гг.), научно-практической конференции "Ускорение научно-технического процесса в агропромышленном комплексе Брянской области" (Брянск, 1992), межрегиональной научно-практической конференции «Биологический и экономический потенциал люпина и пути его реализации» (Брянск, 1997), Саввичевских научных чтениях (Брянск: БГСХА, 2003, 2004), на научной конференции «Вклад ученых и специалистов в национальную экономику» (Брянск: БГИТА, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертации изложена на 124 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, выводов, практических рекомендаций, списка использованных источников и приложений. Она иллюстрирована 29 таблицами, 22 рисунками, список использованных источников включает 216 наименований, в том числе 133 на иностранных языках..

Объекты исследований. Объектами исследований являлись верхушечные и пазушные почки, незрелые зародыши, проростки, каллускые ткани видов люпина: желтого (Lupinus luteus), узколистного (L. angustifolius), белого (L, albus) и многолистного (L. polyphillus).

Методы исследований. Для работы с культурой ткани использовали модифицированную методику Р.Г.Бутенко (1964).

Семена подвергались поверхностной стерилизации: 20 мин в 96% этаноле, 15 мин в 0,1% растворе диацида с последующей пятикратной отмывкой стерильной водой. Стерильные проростки получали, высевая стерильные семена на "голодный" агар 0,8%. Для стерилизации тканей ее тегирующих растений (зародышей, проростков, полученных из нестерильных семян, использовали метод, предложенный фирмой " Колб иох им-Беринг" (Filter, Krikorian, 1982).

Используемые питательные среды: Мураснге-Скуга (Murashige, Skoog, 1962); Гамборга В5 (Gamborg, Miller,Ojima, 1968); Лиисмайера-Скуга (Sroga. 1983); Смирнова (Смирнов, 1970); Нича (Kyte, 1988); Хеллера (Kyte, 1988); Торри (Rundolf, Kocks, 1985).

Штаммы Agrobacterium tumefaciens Л277, А281, Л348, 1Д1, С58 и А. rhi zogen es A8196, 15834 и A4b выращивали в жидкой питательной среде LB (Zhan X. et al., 1988) или на чашках Петри. Препарат плазмиды рВЬНЬЗД, несущей ген запасного белка ячменя - гордеина и маркерный ген устойчивости к канамицину, был любезно предоставлен институтом Обшей генетики РАН. Для дальнейших исследований плазм иду трансформировали в штамм Escherichia coli HB1Ö1 и затем выделяли в нрепаративных количествах по методикам, описанным Р. Дэвисом (1984), По этим же методикам проводили трансформацию А. tumefaciens А281.

Трансформация каллусных клеток люпина агробактериями проводилась кокультивироааннем на агаризованной среде, отбор трансформантов вели на среде, содержащей антибиотик ампициллин (цефотаксим).

Статистическая обработка. Опыты проводили в трехкратной повторности. Полученные данные после статистической обработки представили в виде М ± ш, где М - математическое ожидание, am- стандартная ошибка среднего (С не декор, 1961; Доспехов, 1979).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Культура верхушечных и пазушных почек

Пролиферация верхушечных и пазушных меристем. Наши предварительные исследования и анализ литературных данных указывают, что умножение побегов на одном экспланте люпина требует богатых по составу питательных сред, таких как MS и В5. При этом подтверждена видовая специфичность в реакции эксплаитов на условия культивирования in vitro. В литературных источниках наиболее пригодные среды для клонального микроразмножения возделываемых видов люпина очень сильно варьируют по составу гормонов. Исходя из этого, в первых опытах было оценено влияние изменения в составе питательных сред содержания минерального азота, сахарозы и гормонов на коэффициент умножения побегов (табл. 1).

Таблица 1

Состав питательной среды и число побегов на одном экспланте из почки многолнетпого люпина

Среда MS Вариант

1 2 3 4 5

Сахароза, г/л 10 20 30 40 50

NH^NOj, мг/л 206 412 825 1650 3300

KNO,, мг/л 118 237 475 950 1900

БАП, мг/л 0 0,5 1,0 1,5 2,0

ИУК, мг/л 0 0,01 0,04 0,15 0,4

Число побегов 1,0 2,7 ± 0,3 2,9 ± 0,6 3,0 ±0,3 4,0 ± 0,6

Хотя, на первый взгляд, увеличение концентрации компонентов среды сопровождается повышением коэффициента умножения побегов, это увеличение непропорционально. Математическая обработка соотношения изучаемых компонентов и числа полученных побегов позволяет заключить, что оптимальной является питательная среда со вторым уровнем компонентов.

Высокий уровень содержания всех исследуемых компонентов в питательной среде (варианты 4 и 5) приводит к появлению бурно развивающейся каллусной ткани у основания побегов, а также к витрификации побегов, особенно в последнем варианте.

Клональное микроразмножение узколистного люпина исследовано на верхушечных и пазушных почках 7*8 дневных проростков сорта Брянский 123 (табл. 2).

Таблица 2

Состав питательной среды и число побегов узколистного люпина Брянский 123 на одном эксштанте верхушечной и пазушной почки

Среда Вариант

МБ 1 2 3 4 5

Сахароза г/л 5 10 15 20 30

ЫН4Ы05, мг/л 206 412 825 1650 3300

КМОз, мг/л 118 237 475 950 1900

БАП мг/л 0,1 0,5 1,0 1,5 2,0

ИУК мг/л 0,01 0,05 0,1 0,15 0,2

Среднее 2,0 ± 0,9 2,9 ± 0,4 3,6 ±0,3 2,8 ± 0,4 3,5 ±0,68

Изучение соотношения числа индуцированных побегов и концентраций компонентов питательной среды показало, что оптимальными для размножения узколистного люпина являются: сахароза в концентрации 15г/л; минеральный азот в половинной норме от МЭ, БАП 1мг/л и ИУК 0,1мг/л, что соответствует 3 уровню.

Для определения оптимального состава питательной среды для клонального микроразмножения желтого и белого люпина нами проведена серия опытов с разными питательными средами и опыты по исследованию богатых по составу сред, для которых примеияли кратное снижение концентраций основных макро- и микроэлементов. Отработка метода проведена на сортах люпина желтого -Брянский 6 и белого - Козелецкий. Концентрацию гормонов рассчитывали с учетом опытов на узколистном и многолистном люпине. Основные результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3

Микроразмножение желтого и белого люпина на разбавленных _питательных средах_

Концентрация гормонов, мг/л Соотношение экспл ант/побеги и коэффициент умножения

Брянский 6 Козелецкий

МвО) + БАП 0,5+ ИУК 0,05 24/88 3,7 24/57 2,4

Мв(2) + БАП 0,5+ИУК 0,05 24/86 3,6 24/61 2,5

В5(1)+БАП0,5+ ИУК 0,05 24/69 2,9 24/79 3,3

В5(2) + БАП 0,5+ИУК 0,05 24/66 2.8 24/84 3,5

Примечание: 1) - питательные среды МС и В5 разводили в 2 раза;

2) в 4 раза снижали концентрацию макроэлементов и в 2 раза - концентрацию

м и к роэлементо в.

Как видно из данных таблицы 3, пролиферация побегов желтого и белого люпина находится на уровне и даже несколько превышает результаты, полученные на узколистном и многолистном люпине. Снижение концентрации макро- и микроэлементов в питательной среде благоприятно сказывается на процессах пролиферации верхушечных и пазушных меристем желтого и белого

/жнпша Необходимо отметить, что белый люпин явно «прелпочитает» среду I a\t бор га Н5 п более разбавленный вариант, а на среде MS в ряде случаев наблюдается образование каллуса.

На эксалантах желтого люпина не только увеличивалось число адвентивных (Точек, из которых в дальнейшем развиваются побеги, но и побеги росли быстрее, не наблюдалось признаков витрификации. На верхушечных и пазушных почках проростков желтого люпина сортов Брянский 6 и Жемчуг в предварительных опытах установлено, что на разбавленных средах MS повышение содержания гормонов в 2 раза увеличивает выход регенерантов без признаков витрификации.

В таблице 4 представлены результаты определения регенерационной способности различных генотипов желтого люпина в условиях tn vitro.

Таблица 4

Кдональное микроразмножение желтого люпина

1 Соотношение эксплант/ побеги и

Сорт коэффициент умножения на средс

(сортообразец) М$/2+БАП0.5+ MS/2+БАП 1+ИУК 0.1

ИУК 0,05

Кастрычиик 24/93 3,9 24/105 4,4

С.Н122/90 24/84 3,5 24/93 5,9 —1

С.Н.81/90 24/79 3,3 24/84 3.5

Ж1777 24/96 4,0 ! 24/106 4.4

WTD585 24/77 3,2 24/84 3.5

Жемчуг 24/108 4,5 24/112 4,7

ВБ 1717 24/100 4,2 24/108 4.5

Искорость 24/232 9.7 24/264 11,0

! Цит 24/124 5,2 24/144 6,0

1 Афус 24/93 3.9 24/103 4.3

! Мутант 273 24/103 4,3 24/120 5.0

; Гриф 24/96 4.0 24/100 4,2

| Флорида 24/79 ^ + 24/91 3.8

1 Брянский 6 1 24/88 3,7 24/117

s С.Н.П8/90 24/9! 3,8 24/103 Ь 4.3 1

; С.Н. 167'91 24/93 ! 3,9 24/108 I 4,5

Примечание: концентрация гормонов приведена в мг/л.

Как видно из таблицы, значение коэффициента умножения варьирует от 3,2 до 9,7 в первом опыте и от 3,5 до 11,0 в опыте с увеличенным содержанием гормонов.

Из изученных сортов и сортообразцов по способности индуцировать многочисленные побеги выделился сорт Искорость (в отдельных случаях получали до 15-17 побегов на экелланте). Сорта и сортообразцы желтого люпина, показавшие более высокую интенсивность пролиферации побегов, характеризуются раннеспелостью, а сорт Искорость относится к ультраранним

формам. Позднеспелый WTD 585 показывает наименьшую степень умножения побегов в течение первых недель культивирования in vitro. Анализируя полученные нами данные, можно предположить, что одним из факторов, влияющих на способность к органогенезу, является скороспелость.

Оптимизированная для узколистного люпина питательная среда (вариант 3, табл.2) применялась для изучения клонального микроразмножения различных генотипов L. angustifolius.. Кроме того, исследовано влияние удвоенного содержания гормонов на разбавленной среде (табл. 5)

Таблица 5

Микро эазмножение узколистного люпина

Сорт Соотношение эксплант/ побеги и коэффициент умножения на среде

MS/2+БАП 1+ИУК0Д MS/2+БАП 2+ИУК 0,2

Данко 24/67 2,8 24/71 3,0

Узколистный 109 24/92 3,8 24/98 4,1

Ладный 24/84 3,5 24/96 4,0

Сидерат 892 24/106 4,4 24/127 5,3

Першацвет 24/96 4,0 24/108 4,5

Добры ня 320 24/93 3,9 24/100 4,2

Ащадный 24/91 3,8 24/101 4,2

Миртан 24/84 3,5 24/90 3,8

Митан. 24/81 3,4 24/88 3,7

Брянский 123 24/86 3.6 24/97 4,1

Примечание: концентрация гормонов приведена в мг/л.

Анализируя данные таблицы 5, можно отметить более выровненные значения микроразмкожения узколистного люпина. И хотя в пределах одного сорта наблюдалась гетерогенность по степени умножения побегов, средний коэффициент в зависимости от сорта варьирует от 2,8 до 4,4 в первом опыте и от 3,0 до 5,3 - во втором, при повышенном содержании гормонов.

Небольшой набор образцов белого люпина в исследованиях объясняется тем, что по своим характеристикам этот вид люпина характерен для более южных районов. В Брянской области посевы белого люпина ограниченны в связи с его позднеспелостью. В последнее время ведется работа по созданию и районированию скороспелых и устойчивых сортов белого люпина. В наших исследованиях использовались семена как известных, устойчивых сортов, так и новых сортообразігов белого люпина (табл. 6).

Таблица 6

Микроразмножение белого люпина

Сорт (сорто образец) Соотношение эксплант/побеги и коэффициент умножения на среде

MS(2)+BAn 0,5+ИУК 0,05 В5(2) +БАП 0,5+ИУК 0,05

Козелецкий 24/61 2,6 24/83 3.5

Старт 24/45 1,9 24/69 2,9

№72 24/89 3,7 24/95 4,0

№73 24/74 3,1 24/81 3.4

Примечание: (2) в 4 раза снижали концентрацию макроэлементов и в 2 раза - концентрацию микроэлементов; концентрация гормонов приведена в мг/л.

Как свидетельствуют данные таблицы 6, пролиферация побегов на разбавленной среде В5 заметно выше, чем на среде MS.

При проверке влияния других гормонов роста, таких как гибберелловая кислота, оказалось, что на средах MS+BAn2+TK0,2 у узколистного (Брянского 165) и многолистното люпина через каллус начали развиваться многочисленные побеги, которые после разделения и пересаживания на среды MS/2-б/г +уголь показали укоренение с хорошей частотой (около 60 % побегов дали корни через 4 недели, еще 20% - в течение последующих 4 недель), однако еще через 4 недели более 20% укорененных побегов выбросили цветочную кисть. По мнению Аль-Атаби и Поуэра (Ai-Atabee J.S., Power J.B.,1990) гнббереллину принадлежит ключевая роль в снижении витрификации и стимуляции зацветания.

Оптимизация метода укоренения побегов. С довольно низкой частотой — примерно 20-25% - побеги образуют корни на без гормональных средах, и только добавление определенных ауксинов приводит к повышению частоты корнеобразования. В той или иной мере все ауксины могут индуцировать ризогенез. На белом люпине в первых опытах было получено укорененное растение-регенерант го пазушной почки при введении в питательную среду 2,4-Д. Единичные примеры можно получить и с НУК. Но в основном эти два ауксина приводят к образованию каллусных «пяток» у основания побегов.

Нами была определена степень воздействия разных ауксинов на укоренение побегов люпина, на разбавленной питательной среде MS. Первые опыты показали, что ин до лил масляная кислота (ИМ К) уже в таких низких концентрациях, как 0,02 мг/л, оказывает положительный эффект, но максимум достигается при концентрации 1 мг/л. При этой концентрации было проведено сравнительное исследование влияния трех ауксинов - индолилуксусной (ИУК), итаконовой кислоты (ИТАК) и ИМК на эффективность корнеобразования трех видов люпина (рис, I).

Как видно из диаграммы, ИМК оказывает наибольший ризогенный эффект на всех трех видах люпина, хотя на узколистном различия более заметны. Для белого люпина различия в действии трех ауксинов несущественны.

Брянский 123 Брянский 6 Коз елецкий Узколистный Желтый Белый

Рис. 1. Влияние ИМК, ИТАК и ИУК на степень укоренения побегов трех видов люпина

Адаптация к естественным почвенным условиям Следует отметить, что несколько регенерантов узколистного люпина Ащадный и сортообразца ВБ-1717 зацвели в пробирках, В открытый грунт они высаживались имея цветки, в основном по одному на растении, которые в скором времени образовывали боб. Семена в этих бобах были недоразвитыми, щуплыми, с зеленым оттенком. В других бобах этих растений, сформировавшихся позже, семена соответствовали норме.

В полевых условиях продуктивность растений-регенерантов узколистного люпина Брянский 123 и желтого - Искорость, полученных in vitro нз верхушечных и пазушных меристем, в целом не превышала уровня исходной формы. Однако среди регенерантов сорта Искорость было отобрано 4 растения, превосходящих исходную форму. Анализ продуктивности этих регенерантов показал, что по количеству бобов на растении и массы семян отдельные растения превышают исходные формы более чем в 2 раза, а количество семян одного расгения-регенеранта примерно в 1,5 раза выше.

В условиях сильной вирусной инфекции узколистного люпина (1996г.) регенеранты Ащадный и Митан проявили повышенную устойчивость к заболеванию, собранные семена использованы в дальнейшем селекционном процессе.

Из верхушечной почки узколистного люпина коллекционного образца К-402 (АТ-Д-2-Г/1) было регенерировано полноценное растение. Его жизненный цикл (от вычленения верхушечной почки до созревания семян) составил более 11 месяцев. Для регенеранта АТ-Д-2-Г/1 наблюдался необычно высокий уровень завязываемости бобов - 202 боба, в фазу созревания убрано 123 боба. Обшая масса зрелых семян составила 47,0 г. Собранные семена были использованы для получения урожая следующих поколений и для изучения электрофоретических

спектров белков. Электрофоретическин анализ белков различных регенерантов выявил определенную гетерогенность регенерированных растений.

Культура незрелых зародышей

На питательных средах, различных по составу минеральных компонентов и гормонов, нами изучен характер направленности процесса регенерации незрелых зародышей 3-х видов люпина - белого, желтого н узколистного люпина, а также в отдельных опытах - многолистного. Незрелые зародыши размером 1-2 мм, вычлененные из бобов выращенных в поле растений развивались на питательных средах на основе МЭ и Гамборга В5. Исследуемые варианты среды МБ приведены в таблице 7.

Таблица 7

Состав среды для культивирования незрелых зародышей люпина _(основные компоненты и витамины -согласно МЭ)_

Компоненты среды МБ, М5г МБз М5< МБ; МЭб

Гидролизат казеина, г/л 2,0 2,0 2,0 - 2,0 -

БАП, мг/л - 1,5 1,5 5,0 - -

НУК, мг/л - - 1,0 2,0 - -

2,4-Д, мг/л - - - - 2,0 5,0

Кинет ин, мг/л - - - - 0,25 -

Итаконовая кислота, мг/л - - - - - 1,0

Проведенные исследования показали, что реакция растительной ткани на состав питательной среды зависит от вида люпина (табл.8).

Таблица 8

Развитие полноценных растений из незрелых зародышей трех

видов люпина на вариантах питательной среды МБ_

Узколистный Желтый Белый

Вариант Отношение Отношение Отношение

среды зародыш/побег/нор зародыш / побег / зароды ш/побег/нор

м. раст. норм. раст. м. раст.

М5і 12/17/15 12/14/8 12/19/4

МЭ2 12/39/5 12/20/4 12/15/1

М83 12/44*/0 12/34*/0 12/7*/0

МБ, 12/51* 12/40*/0 12/3*/0

МЭ5 12/каллус 12/4^8* 12/0*70

М5б 12/каллус 12/12* 12/0*70

Примечание: * - каллусообразование; сэ - соматические эмбрионы

На срсле М5\ для культуры мродышей нечаемых «шив люгшиа характерно ралиггие одною-двух побегов. которые впоследствии образуют корни с довольно высокой эффективностью.

Введение в среду ¡.5 мг/л БАП (среда М5;) приводит к образованию множественных побегов как непосредственно из зародышевой почки, так и через образование каллуса. Однако необходимо заметить, что в то же время БАП препятствует развитию корней: индуцированные корни, достигнув среды, содержащей БАП, начинали темнеть и отмирать и только после перенесения на свежую среду без цитокинина. проростки образовывали добавочные корни. Результаты наших опытов согласуются с литературными данными о том, что для успешного развития корней эмбрионды или побеги должны выращиваться на среде без ЦНТОКИНИНОВ

На всех остальных вариантах среды (М5? -МБ^) на зародышах узколистного люпина развивался каллус. При этом на среде с высоким содержанием 2,4-Д (5 мг/л -МЭь) каллус был водяннстым, рыхлым и не давал дальнейшего развития ни в эмбрионы, ни в побеги.

Каллус, индуцированный на М5;. содержащей 1 мг/л 2,4-Д и 0,25 мг/л кинетина, при перенесении на среду, содержащую БАП 1,0 мг/л и НУК 1.0 мг/л, давал начало многочисленным побегам у многолистного люпина.

В опытах с культурой незрелых зародышей желтого люпина подтверждаются литературные данные о недостаточности используемой концентрации БАП 1.5 мг/л для получения многочисленных побегов. На средах МБ) и МБ; развиваются тонкие, удлиненные побеги с низким коэффициентом умножения. Проведенные исследования показали, что на увеличение числа побегов из ткани незрелого зародыша желтого люпина ■ положительно влияет использование питательной среды М5 с уменьшенной вдвое концентрацией основных компонентов, н только в разбавленной среде дает эффект повышение концентрации цитокинина (до 5,0 мг/л БАП). На средах, содержащих 2,4-Д или НУК, зародыши образовывали каллус. На среде на интактных зародышах желтого люпина наблюдалось явление соматического эмбриогенеза (рис.2). Эмбриогенез происходил только на одной, прилегающей к питательной среде семядоле, остающейся зеленой и даже увеличенной, тогда как вторая семядоля желтела и усыхала.

Рис. 2 Соматический эмбриогенез на незрелых зародышах желтого люпина

Среда Гам бор га. используемая в исследованиях, согласно литературным и нашим предварительным данным, является подходящей для культивирования незрелых зародышей люпина. Результаты культивирования незрелых зародышей трех видов люпина на питательных средах, приготовленных на основе В5, представлены в таблице 9.

Таблица 9

Получение нормальных растений из незрелых зародышей люпина __на разных вариантах среды В5 _

Узколистный Желтый Белый

Вариант среды Отношение Отношение Отношение

(гормоны, мг/л) зародыш/ % зародыш/ % зародыш/ %

норм, раст. норм. раст. норм. раст.

1 - без гормонов 11/9 82 9/7 78 14/3 21

2 БАП 0,1+ИУК0,01 10/6 60 9/6 67 13/1* 7

3 Зеа 0,5+ ИУК0.05 13/9 69 12/7 64 12/0* 0

42,4-ДОЛ+Кин 0,01 13/8* 62 12/8* 67 12/0* 0

Примечание: * - интенсивное каллусообразование

Наибольший выход нормальных здоровых проростков получен для зародышей узколистного люпина. Зародыши белого люпина, развиваясь на полноценной среде В5, образуют деформированные листья с утолщенными черешками и корнями. Такие проростки характеризуются пониженной жизнеспособностью и плохо адаптируются к почвенным условиям.

Анализ приведенных в табл. 9 данных свидетельствует о том, что для нормального развития незрелых зародышей необязательно присутствие в питательной среде регуляторов роста. Из использованных фитогормонов наилучшие результаты для узколистного люпина получены при сочетании зеатина и инаолилуксусной кислоты.

Проростки желтого люпина, полученные из незрелых зародышей размером 1-1,5 мм на среде В5|, при достижении размеров 4-6 см и хорошем развитии корневой системы, были перенесены в почвенную смесь и адаптированы к нестерильным условиям.

Таким образом, в результате наших исследований подтверждены данные, что на средах с добавлением 2,4-Д и кинетика происходит сдвиг в развитии зародышей в сторону каллусообразования. По нашим наблюдениям, люпин всех четырех исследуемых видов, а в особенности белый люпин, очень легко переходит к каллусообразованию на полноценной среде МБ даже с незначительным содержанием фитогормонов (0,1 мг/л 2,4-Д и 0,1 мг/л кинетина). На желтом люпине наблюдали явление прямого соматического эмбриогенеза при концентрации гормонов 2,4-Д 2 мг/л + Кин 0,2 мг/л. На питательной среде В5 получены полноценные растения трех видов люпина, причем на безгормональной среде идет простое развитие эмбрионов, без умножения побегов, с одновременным развитием верхушечных меристем к корней.

Также были проведены эксперименты по изучении жизнеспособности зародышей люпина на начальных стадиях развития. По литературным данным успешным оказался метод выращивания на двухфазных питательных средах (жидкость на агаре) с повышенной концентрацией сахарозы -80-120 г/л (VuiHaum, Hoff, 1986). Использование этой методики в наших опытах привело к тому, что через две недели зародыши прекращали развитие. Варьирование условий выращивания позволило установить, что определяющим фактором таких изменений является присутствие высоких концентраций сахарозы. Положительный эффект на развитие зародышей оказало ступенчатое снижение концентрации сахарозы в среде: 120 —90 60 -» 30 15 г/л

Ниже приводится схема выращивания незрелых зародышей белого люпина.

Зародыши

белого люпина Старт

В 5/2 б/г сах 90-120:

¡адаптация к условиям in vitro

_АП 1, сах 60;

| умножение побегов В5/2 б/г. сах 30, агар 5 г/л

| развитие побегов ■ В5/2 б/г. сах 15, агар 5 г/л

j развитие побегов Смирнова б/г +акт. уголь J укоренение

В таких условиях зародыши всех исследуемых нами видов люпина развивались нормально, почти со 100% выходом проростков.

Трансформация люпина с ломошью агробактерий

В предварительных опытах была проверена вирулентность имеющихся в лаборатории штаммов A. tumefaciens: А277, А281, А348, IД1, С50 и A. rhizogenes А8196, 15834 и А4Ь на чувствительных к агробактериям растениях каланхоэ (Zhan, Jones, Kerr, 1988). Через 3-4 недели на месте введения бактерий развивалась опухоль.

Из испытанных штаммов A, rhizogenes только два, А4в и 8196, обнаружили способность образовывать характерную опухоль "бородатый корень".

При инокуляции вирулентных штаммов Agrobacterium tumefaciens и А. rhizogenes в ткани 5-8 дневных проростков люпина, в первом опыте результаты

были получены через три недели - штаммы А277, С58 и A28I индуцировали галлы на черешках листьев и семядолей. Изменение вирулентности штаммов агробактерий изучено при последовательных пассажах через ткани люпина. При повторном введении в ткани недельных проростков люпина чистых культур агробактерий, выделенных из галлов (обозначенные в дальнейшем индексом «л» - люпин), первые признаки развития опухоли наблюдали на восьмой день для штаммов А277л и А281 л, на 12-15 день - для С58л и контрольных штаммов А277 и А281. Характерные галлы на люпине развиваются за 30-40 дней, причем наилучшие результаты получены при инфицировании черешков листьев. Можно отметить, что внешний вид галлов на каланхоэ и люпине отличается, но биохимический контроль (тест на 3-кетолактозу) доказывает, что в тканях люпина развивается именно штамм агробактерий.

При введении в ткани люпина штаммов A. rhizogenes эффекта не было. Не вирулентны ми оказались и штаммы A. tumefadens A34S и 1Д1, хотя, как показало исследование, агробактерии в тканях люпина не погибают и могут быть выделены из участка инфицирования.

Проведение еще одного цикла заражения люпина свежевыделенной культурой агробактерий подтвердило результаты: появление признаков опухолеобразования на 8-12 день и развитие характерных галлов через 30-40 дней.

Из полученных данных можно заключить, что на люпине возможно проведение генно-инженерных работ с использованием штаммов Agrobacterium tumefadens А277, А281 и С58. Пассажи в тканях люпина повышают вирулентность агробактерий. Наиболее чувствительными к инфекции являются черешки листьев.

Для доказательства трансформации тканей люпина агробактериями предпочтительны штаммы, несущие маркерные гены устойчивости к какому-либо антибиотику. Такой штамм был получен нами при трансформации наиболее вирулентного для люпина штамма A. tumefadens А281 ДНК плазмиды pBLHL3A, несущей ген запасного белка ячменя - гордеина и маркерный ген устойчивости к канамицину. Для этого любезно предоставленная нам институтом Общей генетики РАН плазм и да pBLHL3A была вначале трансформирована в штамм Е.соН НВ101, затем выделена препаративно. Электрофоретический анализ фрагментов рестрикции выделенного препарата плазмидной ДНК и исходной плазмиды рВЬНЬЗД показал тождество этих фрагментов. На последнем этапе была проведена трансформация A. tumefadens А281 препаратом выделенной плазмиды и отобраны клоны агробактерий, устойчивые к канамицину в концентрации 20 мг/л.

Для того, чтобы определить концентрации канамицина, эффективные для отбора трансформированных клеток и тканей люпина, было изучено влияние канамицина на развитие проростков, а также на рост каллусных культур. Было показано, что развитие проростхов заметно ингибируется при 100 мг/л Км в среде. На каллусных культурах узколистного люпина было проверено действие канамицина в интервале концентраций от 0 до 100 мг/л (табл. 10).

Таблица 10

Рост каллусной ткани узколистного люпина Брянский 123 ____на среде с канамицином__

Концентрация канамицина, мг/л Начальная масса, г Конечная масса, г Прирост, г %

0 0,177810,0093 0,7036+0,0527 0,525810,040 100

10 0,204810,0117 0,6791 ±0,05 77 0,4743+0,0427 90,21

20 0,2132+0,0098 0,6088+0,0670 0,3956+0,0475 75,74

50 0,169910.0073 0,5103+0,0475 0,3404+0,0306 64,74

100 0,2087±0,0116 0,404710,0526 0,1960±0,0215 37,27

В таблице 11 представлены результаты исследования влияния канамицина на рост инфицированной агробактериямн каллусной ткани узколистного люпина.

Таблица 11

Рост каллусной ткани узколистного люпина Брянский 123, инфицированной _ А. Пдгс^аЫепа А281, на среде с канамицином _

Концентрация Начальная Конечная Прирост*, %

канамицина, масса, масса*, г

мг/л г г

0 0,326310,0196 0,4983±0,0399 0,1717+0,0153 100

10 0,4210+0,0189 0,672510,0827 0,251710,0327 113,41

20 0,2743+0,0206 0,4150+0,0456 0,140810,0169 97,6

50 0,3154+0,0252 0,472510,0803 0.156710,0267 94,49

100 0,3 53 б±0,0240 0,520010,0374 0,167510,0114 89,92

* - третий пассаж (пересаживание каждые три недели)

Проведенные нами предварительные исследования показали, что в первые 4 недели после трансформации развитие каллуса на средах с канамицином в концентрации 20 мг/л и более заметно ингибируется. И только в третьем и последующих пассажах выявлена Км-устоЙчивость большинства исследуемых каллусных культур узколистного люпина.

Как видно из таблицы, низкие концентрации канамицина (10 мкг/мл) не только не ингибируют рост каллуса, но на них рост даже лучше, чем в контроле. Лишь ¡три увеличении содержания антибиотика в среде до 50 мкг/мл и выше начинается ингибирование роста каллуса и при концентрации канамицина 100 мкг/мл снижение темпа роста составило чуть более 10% по сравнению с контролем.

Таким образом, проведенные исследования позволяют заключить, что штаммы Agrobacterium tumefaciens, а именно А277, С58 и в наибольшей степени

IS

A28I, могут трансформировать ткани люпина. Получена каллусная культура узколистного люпина, стабильно наследующая устойчивость к канамицину, что подтверждает передачу чужеродной генетической информации с помощью агробактериалъной трансформации.

Выводы

1. Показана видовая, сортовая и генотипическая специфичность тканей люпина в культуре in vitro.

2. Коэффициент умножения побегов в культуре верхушечных и пазушных почек зависит от количественного и качественного состава питательной среды: на бедных по составу средах Уайта, Готре, Миллера - происходит развитие побегов без пролиферации, тогда как на средах MS н В5 на одной почке развивается до 15 побегов в течение месяш,

3. Добавление гнбберреловой кислоты благоприятно сказывается на развитии побегов и дальнейшем укоренении при микроклональном размножении люпина

4. Высокие концентрации гормонов, а также повышение содержания сахарозы и азота приводит к потере морфогенетического потенциала и появлению нитрифицированных побегов.

5. Для культуры ткани люпина предпочтительным является постепенное изменение концентраций гормонов и сокращение периодичности пассирования с четырех до трех, а для белого - до двух недель,

6. Предложены схемы ведения культуры верхушечных и пазушных почек и культуры незрелых зародышей трех видов люпина в условиях in vitro.

1. Получены регенеранты люпинов желтого и узколистного, которые могут служить потенциальными источниками высокой семенной продуктивности,

8. Получены вирулентные для люпина штаммы Agrobacterium tumefaciens А281, А277, несушие плазмиду pBLHL3A, кодирующую устойчивость к антибиотику канамицину и несущую ген запасного белка ячменя -гордеика.

9. Получена каллусная культура, устойчивая к канамицину в концентрации 100 мг/л, что свидетельствует об успешной генетической трансформации клеток люпина.

Практические рекомендации производству

1. В целях создания принципиально нового исходного материала для селекции люпина использовать клональное микроразмножение и генетическую трансформацию, обеспечивающие выявление наиболее ценных форм.

2. Рекомендуется использовать разработанные нами схемы и условия клонального микроразмножения и адаптации к естественным условиям выращивания.

3. Для гарантированного сохранения наиболее цепных генотипов люпина предлагается использовать культуру незрелых зародышей.

Список работ, опубликованные по теме диссертации

1. Костюненко Д.А., Сычева Т.П., Коспоченко В.И. Культивирование незрелых зародышей Lupinus polyphyllus в условиях in vitro: Тез. докл. научн.-практ. конф. Ускорение научно-технического процесса в агропромышленном комплексе Брянской области. - Брянск, 1992,-С. 129-130.

2. Сычева Т.П., Костюченко Д.А., Костюченко В.И. Регенерация люпина непосредственно из культивируемых эксплантов: Тез. докл. научн.-практ. конф. Ускорение научно-технического процесса в агропромышленном комплексе Брянской области. - Брянск, 1992. - С. 160-161.

3. Kostyuchenko, V.l.; Kharaborkina, N.L and Kostyuchenko, D.A. Callus cultures of Lupinus spp.: A comparison of peroxidase and amylase activity and plant regeneration; Abst/ - VII Intern.Lupin Confer, April, 18-23, Evora, Portugal, 1993.

4. Костюченко В.И., Костюченко Д.А„ Хараборкина Н.И., Яговенко Т,В. Изучение водорастворимых белков, активности амилазы, пероксидазы в тканях разных видов люпина //Биологический и экономический потенциал люпина и пути его реализации: Тез, докл. Межрегион, научн. - практ. конф. 15-17 июля 1997г. - Брянск, 1997. - С.85-88,

5. Пимохова Л.И., Костюченко В.И., Костюченко Д.А., ГІигарева С.А. Оценка селекционного материала люпина с помощью физиолого-биофнзических методов //Биологический и экономический потенциал люпина и пути его реализации: Тез. докл. Межрегион.научн.*практ. конф. 15-17 июля 1997г. -Брянск, 1997. -C.88-9Ö.

6. Костюченко Д,А,, Яговенко Т.В, Костюченко В.И., Пигарева С.А.. Сравнительная характеристика различных генотипов люпина в культуре тканн in vitro //Сельскохозяйственная биология, - 1998. - №5. — С.69-74.

7. Костюченко В.И., Костюченко Д.А., Пигарева С.А., Яговенко Т.В. Развитие незрелых зародышей трех видов люпина на различных питательных средах //Биологический и экономический потенциал зернобобовых и крупяных культур и пути его реализации. - Орел, 1999. - С. 136-142.

8. Яговенко Т.В., Пигарева С.А., Костюченко Д.А, Особенности недифференцированного роста разных видов люпина в условиях in vitro //Сб.статей. Саввичевские научные чтения. - Брянск: Изд-во БГСХА, 2003. -С.41-47.

- 6321

Формат60х84 1/16 Тираж 100 Объем 1 п,л.

Брянская государственная инженерно-технологическая академия Редакционно-издательский отдел