Биологическая активность новых оксигенированных производных стигмастана и эргостана в клетках Hep G2 и MCF-7

Мехтиев, Ариф Раминович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биологическая активность новых оксигенированных производных стигмастана и эргостана в клетках Hep G2 и MCF-7
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биологическая активность новых оксигенированных производных стигмастана и эргостана в клетках Hep G2 и MCF-7"

На правах рукописи

□□3451682

Мехтиев Ариф Раминович

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НОВЫХ ОКСИГЕНИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ СТИГМАСТАНА И ЭРГОСТАНА В КЛЕТКАХ HEP G2 И MCF-7

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2008

003451682

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Мишарин Александр Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Соколов Николай Николаевич

доктор биологических наук Торховская Татьяна Ивановна

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение «Российский Кардиологический научно-производственный комплекс» Росмедтехнологий

Диссертационного совета Д 001.010.01 при Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук по адресу 119121, г. Москва, ул. Погодинская, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Научно-исследовательского института биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан

Защита диссертации состоится О/С&г. 2008

года в

часов на заседании

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

Карпова Е. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение физиологически акгивных природных соединений и их синтетических производных является важнейшим направлением современной биомедшншекой химии. Препараты, созданные на основе природных соединений, широко применяются в лечении и профилактике онкологических, инфекционных, сердечно-сосудистых, аутоиммунных заболеваний и нарушений метаболизма.

Высоким фармакологическим потенциалом обладают природные изопрсноиды, в частности сгерипы растительного и микробного происхождения, а также продукты их химической трансформации. Наибольшее значение имеют оксигенированные производные растительных и микробных стеринов, которые являются близкими структурными аналогами оксистеринов - важнейших регуляторных молекул в организме млекопитающих. При физиологических концентрациях оксистерины регулируют биосинтез, метаболизм и транспорт изопреиоидов, липидов, желчных кислот, углеводов, играют важную роль в процессах клеточной дифференцировки и апоптоза. Однако неоднократные попытки использования природных оксистеринов в качестве фармакологических регуляторов липидного обмена потерпели неудачу из-за их быстрого метаболизма в клетках печени, а также вследствие многочисленных побочных эффектов, обусловленных наличием множества потенциальных мишеней для соединений стеринового ряда.

В лаборатории Сшггеза физиологически активных соединений ГУ НИИ БМХ РАМН был осуществлен синтез повои серии оксигенированных производных стигмастана и эргоегапа. Основу проекта составляет гипотеза, что направленная химическая трансформация доступных молекул эргостерина и стигмастерина представляет собой перспективный путь получения новых оксистеринов, обладающих регуляторной активностью в клетках млекопитающих и проявляющих пролонгированный эффект по сравнению с аналогичными производными ряда ходесгана. Данная диссертация является частью этого проекта.

Цель и задачи исследования. Цель работы - изучение биологической активности и оценка фармакологического потенциала новых оксигенированных производных стигмастана и эргостапа в клетках гепатобластомы человека линии Hep G2 и карциномы молочной железы человека линии MCF-7.

Выбор вышеуказанных клеточных культур был обусловлен тем, что клетки MCF-7 и Hep G2 являются стандартными моделями для первичного тестирования потенциальных противоопухолевых препаратов и регуляторов липидного обмена, соответственно. Кроме того, исследование биологической активности оксигенированных производных стигмастана и эргостапа в клетках Hep G2 особенно интересно, поскольку в клетках печени регуляторно активные производные холестапа быстро деградируют, теряя активность.

Задачи работы:

1) Оценка влияния новых оксигенированных производных стигмастана и эргостана на жизнеспособность и пролиферацию клеток MCF-7 и Hep G2; исследование цитотоксичности наиболее активных соединений.

2) Изучение влияния оксигенированных производных стигмастана и эргостана на биосинтез холестерина в клетках Hep G2; исследование (22Е)-5а-эргоста-8(14),22-диен-15-он-Зр-ола, (228,238)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-ЗР-ола и (22Я,23Я)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-еп-15-он-ЗР-ола в качестве регуляторов биосинтеза и метаболизма холестерина в клетках печени.

3) Исследование влияния (228,235)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-Зр-ола и (22К,23К)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-Зр-ола на биосинтез холестериловых эфиров и активность ацилкофермент-А:холестерин-ацилтрансферазы (АСАТ) в клетках Hep G2.

4) Исследование влияния (225,235)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-ЗР-ола и (2211,23Я)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-ЗР-ола на метаболизм экзогенного холестерина в клетках Hep G2.

Научная новизна работы. В работе проведено исследование биологической активности 22 новых синтетических производных стигмастана и эргостана в клетках MCF-7 и Hep G2. Впервые показано, что новые производные стигмастана, содержащие (22К,23к)-22,23-днолы1ую функцию подавляют жизнеспособность клеток млекопитающих, причем токсический эффект определяется жесткой конформацией боковой цепи. В результате работы найдены три новых производных эргостана, эффективно подавляющих биосинтез и регулирующих метаболизм холестерина в клетках Hep G2. Регуляторная активность этих соединений определялась стереохимической конфигурацией атомов С22 и С23.

Теоретическое и практическое значение работы. Работа убедительно доказала справедливость гипотезы, согласно которой направленная модификация боковой цепи природных стеринов является перспективным подходом к созданию новых биологически активных соединений с высоким фармакологическим потенциалом. Проведенные исследования показали перспективу использования новых производных стигмастана и эргостана, содержащих оксигенированную боковую цепь, в качестве потенциальных цитотоксиков, цитостатиков, регуляторов клеточного сигналинга и липидного метаболизма, а также позволили провести прогноз биологической активности и оценки фармакологического потенциала некоторых стеринов растительного происхождения и их синтетических производных. Положения диссертации, выносимые па защиту:

1) В результате проведенных исследований установлено, что производные (22R,23R)-22,23-дигидроксистигмасгана токсичны в клетках MCF-7 и Hep G2.

2) В результате проведенных исследований установлена высокая цитотоксичность (22Я,23Я)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-ЗР-ола в клетках MCF-7.

3) В результате проведенных исследований установлено, что Л8(14)-15-кетопроизводиыми эргостана подавляют биосинтез и регулируют метаболизм холестерина в клетках Hep G2, причем различая в биологической активности определяются структурой боковой цепи и стсреохимической конфигурацией атомов С22 и С23.

4) В результате проведенных исследований установлено, что изомерные (22S,23S)-22,23-оксидо-5а-эргосг-8(14)-сн-15-он-Зр-ол и (22Я,23Я)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-сн-15-он-Зр-ол оказывают различное влияние на биосинтез холестериловых эфиров и активность АСАТ в клетках Hep G2.

5) В результате проведенных исследований установлено, что изомерные (22S,23S)-22,23-оксвдо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-Зр-ол и (2211,23К)-22.23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-Зр-ол активируют метаболизм экзогенного холестерина в клетках Hep G2.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на международных конференциях " Биологические мишени для действия лекарственных препаратов нового поколения (март 2006, ЦВТ ХИМРАР, г. Химки)", "Новые технологии создания шшовационных лекарств (декабрь 2006, ЦВТ ХИМРАР, г. Химки)", "Перспективы разработки противоопухолевых лекарств с новыми механизмами действия (декабрь 2007, ЦВТ ХИМРАР, г. Химки)", конференции научных работ ГУ НИИ БМХ РАМН (май 2007, Москва). Материалы диссертационной работы отражены в 9 публикациях'. 6 статей и 3 публикации в сборниках докладов научных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из 6 разделов: "Введение", "Обзор литературы (Биологическая активность фитосгеринов и их производных)", "Материалы и методы", "Результаты и их обсуждение", "Заключение", "Выводы". Диссертация изложена на 92 страницах, иллюстрирована 33 рисунками, список литературы включает 230 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы. Химические реактивы, растворители и хроматографичсские материалы получены от фирм "Sigma", "Merck", "Aldrich", "Woelm" и "МедХимЛаб"; культуральный пластик, срсды и сыворотка - от фирм "Greiner", "Costar", "Corning", "Gibco BRL" и "HyClone"; радиоактивные изотопы от фирмы "Amersham" и "ВО Изотоп"; синтетические олигонуклеотнды - от АОО "Ситод". 5а-Холеста-8(14)-диен-15-он-Зр-ол (15-кетостерин) и оксигенированные производные стигмасгана и эргостана (1 - 22) синтезированы в лаборатории Синтеза физиологически активных соединений ГУ НИИ БМХ РАМН. Структурные формулы соединений 1-22 приведены на рис. 1. Культуры клеток. Клетки гепатомы человека линии Hep G2 (ЕСАСС) и клетки карциномы молочной железы человека линии MCF-7 (АТСС), выращивали в 96-луночных, 24-луночных, 6-дуночных планшетах, чашках диаметром 35 мм или

флаконах площадью 25 см2. Клетки культивировали в среде К.РМ1 1640, содержащей 10% РСБ, в атмосфере 5% С02 при 37°С. Перед экспериментом клетки выдерживали 24 ч в среде, содержащей 10% ИСБ, или в бессывороточной среде. Исследуемые соединения добавляли к культуральной среде в этанолыюм растворе.

Рис. 1. Оксигенированные производные стигмастана и эргостана: 1 (Sti,Xj,Yi) -(228,238)-22,23-оксидостигмаст-5-ен-Зр-ол; 2 (Sti,XbY2) - (22R,23R)-22,23-оксидостигмаст-5-ен-ЗР-ол; 3 (Sti,XbY3) - (22R,23R)-CTiirMaCT-5-en-3(5,22,23--rpno.4; 4 (Sti,X7,Yi) - (22S,23S)-22,23-oKcimocTm-MacT-4-eH-3-on; 5 (Sti,X7,Y2) - (22R,23R)-22,23-оксидостигмаст-4-ен-З-он; 6 (Sti,X7,Y3) - (22R,23R)-22,23-,ttHrnnpoKcncrarMacr-4-eH-3-on; 7 (StbXg,Yi) - (22S,23S)-22,23-0KCiw0cnirMacT-4-eH-3,6-flH0H; 8 (St1;X8,Y2) -(22R,23R)-22,23-0KCfW0CTHrMacT-4-eH-3,6^H0H; 9 (St,,X8,Y3) - (22R,23R)-22,23-дигидроксистигмаст-4-ен-3,6-дион; 10 (St|,X2,Y3) - (22R,23R)-5a,6a-оксидостигмастан-Зр,22,23-триол; 11 (Sti,X3,Y3) - (22R,23R)-cTnrMacTan-3p,5a,6[i-22,23-пентаол; 12 (St,,X4,Yi) - (225,235)-22,23-оксидостигмаст-5-ен-7-он-Зр-ол; 13 (St,,X4,Y2) - (22R,23R)-22,23-OKCimocTHrMacT-5-eH-7-oii-3P^; 14 (StbX4,Y3) (22R,23R)-cmrMacT-5-eH-7-oii-3P,22,23-Tpmwi; 15 (St,,X5,Y|) - (22S,23S)-22,23-оксидостигмаст-5-ен-ЗР,7а-диол; 16 (Sti,X6,Y|) - (22R,23R)-22,23-0KCiW0CTnrMacT-5-en-Зр,7а-диол; 17 (Sti,X5,Y2) - (225,235)-22,23-оксидостигмаст-5-ен-Зр,7Р-диол; 18 (Sti,X6,Y2) - (22R,23R)-22,23-OKCHflocrarMacT-5-en-3i3,70-ff^; 19 (St2,Y4b (22E)-5a-эргоста-8(14)-диен-15-он-ЗР-ол; 20 (St2,Yi)- (22S,23S)-22,23-0KCJW0-5a-3pr0CT-8(14)-eH-15-он-ЗР-ол; 21 (St2,Y2)- (22R,23R)-22,23-oкcидo-5a-эprocт-8(14)-eн-15-oн-ЗP-oл; 22 (St2,Y3) - (22R,23R)-5a-3procr-8( 14)-ен-15-он-З р,22,23-триол.

Методы. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре "Thermospectronic Helios a." Измерение радиоактивности липидных экстрактов проводили в толуольном сцинтилляторе; измерение радиоактивности водных растворов и клеточных экстрактов - в сцинтилляторах ЖС-8 и "Unisolv" на счетчике Tri-Carb 2800 TR (Perkin Elmer).

Концентрацию белка определяли модифицированным методом Лоури [Markwell et al., 1978], или реакцией с бнцинхониновой кислотой [Smith ct al., 1985], концетрацшо холестерина - модифицировшшым методом Либермаиа-Бурхардта [Huang et al., 1961] пли ферментативным методом при помощи стандартного набора "Оксохром Холестерин" фирмы "Lachema" по протоколу фирмы-изготовителя. Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинках "Kieselgel UV 254", "HPTLC Kieselgel UV 254" и "PSC Kieselgel UV 254". Расчет низкоэпергетичсских конформаций боковой цепи оксистеринов иолуэмпиричсским методом AMI проводился с использованием программы "HyperChem 7.0" на компьютерном кластере лаборатории Динамики белков И МБ РАН; построение трехмерных моделей комплекса соединения 3 с димиристоилфосфатидилхолином проводилось в компьютерном центре Ушгаерситега штата Минессота (США). Все расчеты проведены м.и.с. ИМБ РАН Я.В. Ткачевым. Цнтотокснчность соединений 1 - 22. Оценку токсичности соединений 1 - 22 в клетках MCF-7 и Hep G2 проводили с использованием цветной реакции тстразолиевого красителя 3-(4,5-диметилтиазол-2-1ш)-2,5-дифенилтетразолин бромида (МТТ) с живыми клетками по методу [Mosmann, 1983], а также по включению [|4С]тимидцна в ДНК.

Проточная цитофлуориметрия. Цитофлуориметрический анализ клеток MCF-7, инкубированных с соединениями 3 и 21, проводили на проточном цитофлуоримстре BD FACSAria в режиме FL1.

Микрофотографии клеток. Микрофотографии клеток MCF-7, инкубированных с соединениями 3 и 21 (в режиме фазового KOirrpacTa и после окрашивания гидрохлоридом 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI)), получали на приборе Axiovert 200М (Zeiss).

Уровень биосинтеза холестерина, жирных кислот, триглицеридов и холестериловых эфиров в клетках Hep G2, инкубированных с исследуемыми соединениями в различных условиях, оценивали по скорости включения биосинтетических предшественников - [14С]ацетата и [14С]олеата в соответствующие продукты по методу [Goldstein et al., 1983].

Влияние соединений 20 и 21 на активность АСАТ в бесклеточной системе.

Получение клеточного лизата; приготовление модельных субстратов, содержащих холестерин, 25-гидроксихолестерии, кетостсрины 20 и 21; инкубацию модельных субстратов с клеточным лизатом и [1-нС]олеоил-КоА проводили по методу [Cheng et al., 1995]

Включение [3И]холестерина; влияние соединений 20 и 21 на метаболизм экзогенного холестерина в клетках llcp G2. Инкубацию клеток с [3Н]холестерином и исследуемыми соединениями проводили в присутствии 10% FCS в течение 24 ч, затем клетки инкубировали 24 ч в отсутствии радиоактивности, образовавшиеся радиоактивные продукты анализировали ТСХ в экстрактах из клеток и культуральной среды.

Влияние соединений 19 - 21 на уровень мРНК HMG-CoA-редуктазы, CYP27A1 и CYP3A4 в клетках Hep G2. Тотальную РНК выделяли из клеток Hep G2, инкубированных с исследуемыми соединениями, гуанидинизотиоцианатным методом [Chomczynski, Sacchi, 1987]. К-ДНК получали по протоколу фирмы "Promega", ПЦР проводили по методу [Маниатис и соавт., 1984]; продукты амплификации разделяли электрофорезом в агарозном геле; зоны, окрашенные бромфеноловым синим, анализировали на приборе WAT-137LH и с помощью программы "ImageJ 1.36".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. ОЦЕНКА ЦИТОТОКСИЧНОСТИ 22,23-ОКСИГЕНИРОВАНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ СТИГМАСТАНА (1 -18)

Первой задачей работы было исследование влияния новых оксигенированных производных стигмастана 1 -18 на жизнеспособность и пролиферацию клеток МСР-7 и Нер 02 при 48 ч инкубации в бессывороточной среде (рис. 2 - 5).

На основании результатов оценки цитотоксичности все исследованные соединения 1-18 были разделены на 4 группы: группа 1 (токсичные соединения): оксистерины 3, 11, 14, 17; группа 2 (избирательно токсичные соединения): оксистерины б, 9 и 10 проявляли токсичность только в клетках МСР-7, а соединение 15, проявляя умеренную токсичность в клетках Нер 02, не оказывало токсического эффекта в клетках МСР-7; группа 3 (нетоксичные и слаботоксичные соединения) : оксистерины 1, 2, 8, 13, 16, 18; группа 4 (соединения, показывающие сложную зависимость МТТ-теста от концентрации): оксистерины 4, 5, 7 и 12 в низких концентрациях достоверно увеличивали значения МТТ-теста выше контрольного в клетках МСР-7.

MCF-7

120- Т

100 1 л

80- ■ж V

60- \

40-

20-

0- 1 —Г...... 1

О 5 10 15 20 25 30

Hep G2

10 15 20 25 30

Концентрация, мкМ

Рис. 2. Влияние цитотоксичных производных стигмастана 3, 11, 14 и 17 (группа 1) на жизнеспособность клеток MCF-7 и Hep G2 при 48 ч инкубации в бессывороточной среде

MCF-7

10 15 20 25 30

—■—6

•-<•• 10

Hep G2

—r

10 15 20 25 30

—■—6 л- 10

-▼—15

Концентрация, мкМ

Рис. 3. Влияние избирательно токсичных производных стигмастана 6, 9, 10 и 15 (группа 2) на жизнеспособность клеток MCF-7 и Hep G2 при 48 ч инкубации в бессывороточной среде

V-

О) 5 о: 140-1

Л Ь о X с; о Р- X 120100 ■!

ID О о 80-

о о с 1-О 60-

о ^

ш X 40-

s X 200

MCF-7

—г 5 10 15 20 25 30

-г

О 5 10 15 20 25 30

Концентрация, мкМ

Рис. 4. Влияние нетоксичных и слабо токсичных производных стигмастана 1, 2, 8, 13, 16 и 18 (группа 3) на жизнеспособность клеток MCF-7 и Hep G2 при 48 ч инкубации в бессыворогочной среде

—.— 4

• 7

—Т—12

Концентрация, мкМ

Рис. 5. Влияние производных стигмастана, стимулирующих пролиферацию клеток МС1--7 4, 5, 7 и 12 (группа 4) на жизнеспособность клеток MCF-7 и Hep G2 при 48 ч инкубации в бессыворогочной среде

Наибольшую токсичность проявляли (22К,23К)-3(3,22123-тригидроксистигмаст-5-ен 3 и (22К,23К)-ЗР,22,23-тригидроксистип.;аст-5-еп-7-оп 14; (22R,23R)-22,23-дигидроксистигмаст-4-ен-3,6-дион 9 был избирательно токсичен в клетках MCF-7; токсичность производных (22Л,23К)-22,23-дигидроксистигмастана значительно превосходила таковую для производных (228,238)-22,23-оксидостигмастана; среди исследованных производных (22R,23R)-22,23 -оксидоетигмастана цитотоксичных соединений не выявлено. Соединения, входящие в группу 4 в низких концентрациях увеличивали значения МТТ-теста выше контрольного, что указывает на высокую активность митохондриальных гидрогеназ и стимулировании пролиферации. Можно отметить, что таких эффектов никогда ранее не наблюдалось для оксигенированных производных холестанаи стигмастана [Maguire et al, 2003; Ryan et al., 2005; Adcox et al., 2001; Lizard et al., 1999; Lemair-Ewing et al., 2005; O'Callahan et al., 1999; Hall, 2006].

Полученные результаты позволяют заключить, что токсичность производных стигмастана 3,6,9,10,11,13,15 и 17 значительно отличается от токсичности основных оксигенированных производных ряда холестана (оксистеринов):

1) среди производных (22R,23R)-22,23-flnrnapoKCHCTHrMacTaHa найдены соединения в 10-20 раз более токсичные, чем 7-кетохолестерин и 7р-гидроксихолестерин в клетках Hep G2 и MCF-7;

2) 7Р-гидроксихолестерин, как известно, является наиболее токсичным среди основных оксистеринов, однако среди исследованных производных стигмастана только соединение 17, обладающее 7Р-гидроксильной группой, показало умеренный токсический эффект;

3) введение в кольцо В производных холестана кислородсодержащих заместителей приводит к цитотоксичным соединениям (таким как 5,6-эпоксихолестан-Зр-ол или холестан-3р,5а,6р-триол), но в ряду (22R,23R)^nrnapoKcncrarMacraHa токсичность (22R,23R)-3p,22,23-TpHrHflp0KCi[-5a,6a-0KCHfl0CTHTMacTaHa 10 и (22R,23R)-Зр,5а,бр,22,23-пентагидроксистигмаетана 11 была значительно ниже, чем токсичность (22К,23К)-Зр,22,23-трип1дроксистигмаст-5-ена 3.

Вероятно, токсичность 22,23-оксигенированных производных стигмастана определяется структурными особенностями боковой цепи. Расчет низкоэнергетических конформаций соединений 1-18 показал, что производные (22S,23S)-22,23-оксидостигмастана и (22Л,23Л)-22,23-оксидостигмастана существуют в виде пары развернутых, близких по энергии конформеров, с различной ориентацией боковой цепи, в то время как для производных (22Л,23К)-22,23-дигидроксистигмастана реализуется одна низкоэнергетическая конформация, характеризующаяся жесткой скрученной боковой цепью и низким значением двугранного угла С22-С23 (рис. 6).

Рис. fi. Рассчитанная низкоэнергетическая конформации боковой пени соединения 3.

!kc наиболее токсичные производные стнгмасгана (3, !> и 14) содержали (2 2 R.2 3 R)-22,2 3-диильную группировку Можно полагать, что в отличие ог большинства стеринов и оксистсринов, при встраивании в лигщдную бислойную мембрану дня производных (22 R,23 R) -22,23- дм ги дро кс исгагмаста] i а наиболее вероятна сольватация Пщкжсильных групп боковой цени, а не заместителя и положен™ 3.

Рис. 7. Молекулярная модель (22 R,2 3 R)-cth галет-¡>-efi-3|i,22,23-триоли 3. встроенного в бнелойпую мембрану димиристоилфосфатидияхо^гпша,

Трехмерная модель бислоя димиристоилфосфатидилхолина со встроенным (22И.,2311)-стигмаст-5-ен-Зр,22,23-триолом 3 (рис. 7) позволяет сделать следующие заключения:

Ориентация главной оси стероидного цикла (СЗ-С17) практически параллельна ориентации жирнокислотных остатков. В области полярных "головок" фосфолипида расположен фрагмент С22-С29, при этом наблюдаются нарушения регулярности поверхностного слоя. Связывание стерина вызывает нарушение в упаковке жирнокислотных остатков (по крайней мере два слоя липидов, окружающих молекулу стерина, испытывают возмущение). Толщина бислоя в месте связывания стерина меньше, чем толщина бислоя индивидуального димиристоилфосфатидилхолина.

Поэтому мы считаем, что высокую цитотоксичность производных (22R,23R)-22,23-дигидроксистигмастана можно объяснить структурными изменениями внутренних мембран клетки.

2. ОЦЕНКА ЦИТОТОКСИЧНОСТИ Д8(14)-15-КЕТОПРОИЗВОДНЫХ 5а-ЭРГОСТАНА 19 - 22

Среди регуляторов метаболизма холестерина, представляющих интерес в качестве потенциальных фармакологических агентов, важное место занимают Д8(14)-15-оксигенирова1шые стерины. Синтетический ингибитор биосинтеза холестерина 3ß-гидрокси-5а-холест-8(14)-ен-15-он (15-кетостерин) проявлял

гипохолестеринемическую активность и эффективно регулировал метаболизм холестерина in vivo и в культуре клеток [Schroepfer et al., 1977а; 1977b; 1980; 1982; 1984; 1988а; 1988b; 2000; Miller et al., 1980; Swaminathan et al., 1995; Schmidt et al., 2006].

Особое место занимает проблема создания 15-кетостеринов с СП-боковой цепью, отличной от боковой цепи холестана, поскольку быстрая метаболическая деградация в клетках печени ведет к потере биологической активности 15-кетостерина [Schroepfer et al., 1988; St. Pyrek et al., 1989; Пийр и соавт., 2003]. Поскольку наличие С24-алкильного заместителя блокирует расщепление боковой цепи стерина в клетках печени [Boberg et al., 1990; 1991; Bjorkhem, 1992], исследование новых 15-кетостеринов ряда 5а-эргосгана в культуре клеток печени, несомненно, представляет интерес.

Влияние четырех новых Д8(14)-15-кетостеринов ряда 5а-эргостана 19 - 22 на жизнеспособность клеток Hep G2 и MCF-7 при 48 ч инкубации в бессывороточной среде представлено на рис. 8. 15-Кетопроизводное эргостадиена 19 не проявляло токсического эффекта в обоих культурах. Наибольшей токсичностью в клетках MCF-7 обладал (22К,23К)-эиоксид 21, рассчитанное значение ТС50 составляло 0.4 ± 0.1 мкМ, что на порядок превосходило значение ТС50 для известных оксистеринов и было сравнимо с соответствующими значениями для природных соединений стероидного ряда, используемых в качестве цитотоксических и цитостатических

_ X

§ г

•з

8 ; = ^

0 !

1 3 1

л я

Жизнеспособность клеток (% от контроля )

О!

М к £

■в-■В*

1 I

3 3

5 I

э -о Ста =

Л н

а I

й §

2 I

В ^

1 п

а я £ й

1 а

г. ^

4 5

р 1 :

гГ § §

•а ° г.

5 5 «

2 н О -а

3. ТОКСИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ СОЕДИНЕНИЙ 3 И 19 В КЛЕТКАХ МСК-7

Инкубация клеток МСР-7 с наиболее токсичными окскстсринами (22Н,23Щ$-ЙЙГмасг-З-еК'ЗрД2.23-трволом 3 и (22а,23К)-22.23-оксндо-5а-эргост-8(14)-сн-15-он-3[)-олом 21 сопровождалась нарушениями конфлуеитности монослоя, снижением числа прикрепленных клеток и морфологическими изменениями.

Рис. 10. Анализ клеток МСР-7 методом проточной щпгофлуоримстрки. КлеткиМСР-7 в отсутствии оксистерннов (контроль) - Д; и присутствии (22И,23Ю-3[}.22,23-тригндрокси-сткгмаст-5-еИа 3 - Б; в присутствии (2211,2311 )-Зр-гндрокеи-22,23-окспдо-5а-эргоет-8{ 14)-ен-15-она а - В.

Данные цмтофлуориметрического анализа клеток МСР-7, инкубированных с соединен и ши 3 и 21, приведены на рисунке 10: микрофотографии клеток (в режиме

фазового контраста и флуоресцентные микрофотографии, полученные после инкубации клеток с красителем DAP1, специфично сортирующимся на ДНК) ■ па рис ! I.

Гиг. 11. Микрофотографии клеток MCF-7. Л - клетки MCF-7 в отсутствии оксистерннов (контроль); 13 - в присутствии (22R.23R)-стигм аст-5-ен-З р,22,23-трио ла 3, ß ■ в присутствии (22R* 23RV22.23 -оксидо-5 а-эргост-8(14)-ен-15-он-З ¡З-ола 21. Слева представлены поля фазового контраста, справа - поля фазового контраста, со к мешенные с полем флуоресценции DA PI (А, Б), и только поле флуоресценции DAP! (В).

В контрольных клетках MCF-7 отсутствовали алоптотичсские клетки; в клетках, инкубированных с Соединением 3. популяция апоптотячееккх клеток не превышала 5%: в клетках, инкубированных с соединением 19, популяция апоптотнчсских клеток составляла 19% В контрольных клетках и клетках, инкубированных с (22R.23R)-ст1пмаст-5-ен-Зр,22,23-трнолом 3, не замечено фрагментации ядер, а в клегкач,

инкубированных с (22 ^23^22,23 Ч)Ксадо-5а-эргост-8(14 21, были

видны клетки с фрагментироеаттыми ядрами (показано стрелкой).

4. IIИIIIЫ1 РОВ А КИЕ БИОСИНТЕЗА ХОЛЕСТЕРИНА В КЛЕТКАХ НЕРС2 СОЕДИНЕНИЯМИ 1 - 22

На первом этапе исследовалось влияние соединений ! - 22 на уровень биосинтеза холестерина из радиоактивного предшественника - [МС| ацетата в условиях краткосрочной (3 ч) инкубации к бессывороточной среде Среди 22,23-окси 1С л про ванных производим стш наста на только 7-кето содержащие соединении (225,23 5>22,23-окси достигмаст-5-вй-7-он-З Мл 12 и (22К,23К)-стшмаст-5-еи-7-он-30,22,23-триол 14 иигабиропали баоиоггсз холестерина (значения ¡С >о составляли: 12 ± 2 мкМ и 5 ± 2 мкМ, соответственно). Кетостерия 12 избирательно подавлял биосинтез холестерина в концентрации до 20 мкМ. а в концентрации 30 мкМ ингиШировал биосинтез холестерина, жирныя кислот н триглидеридов.

концентрация, мкМ

Рис. 12. Ингибироваие биосинтеза холестерина в клетках HepG2 соединениями 19- 22.

На рисунке 12 представлен уровень биосинтеза холестерина 8ä { С]ацетата при Зч инкубации с соединениями 19 - 22. rJn окси содержащие кетостерины 20 и 21 эффективно подавляли биосинтез холестерина пропори нон ально их концентрации ц среде (рассчитанные значения IC,« для соединений 2(1 н 2! составляли 1.9 + 0.2 мкМ и 0.6 ± 0.2 мкМ, соответственно) йншбиторная активность (22Е)-3(1-гидрокси-5сх-эргоста-8(14),22-диен-15-она 19 была ниже (рассчитанное значение 1С50З.1 ± 0.4 мкМ). Можно отмегать. что в тех же условиях значение ICsD для 15-кетостерииа составляло

4.0 ± 0.4 мкМ. Трнол 22 подавлял биосинтез холестерина в этих условиях слабее, чем 15-кстостсрип и кегостсрииы 19-2!

Для того чтобы выяснить влияние ¿8( 14)-15-кетопр0)ГШ0дяы;х ряда эргостана на экспрессию сена НМО СпА редуктазы в клетках Пер С2, были проведены эксперименты по количественной оценке уровня мРНК НМО СоА редуктазы в клетках, инкубированных 24 ч с соединениями 19-21.

£ с

120-

1 □□

С 80-

О £

X к.

х в.

2 л

Е И D О

HMGR актин

К 19 20 21

Рис. 13. Влияние соединений ¡У - 21 в концентрации 5 мкМ на уровень мРНК HMG СоА редуктазы в клетках Нер G2 при 24 ч инкубации в бессывороточпой среде.

Известно, что в клетках Нер G2 ! 5-кстостерин слабо снижает уровень мРНК HMG СоА редуктазы [Киселева н соаит.. 1999; Kisseleva et al., 1499]. Оказалось, что ¡5-кетонроизводпые эргостана 19. 20 и 21 существенно снижали уровень мРНК HMG СоА редуктазы в клетках Нер G2 в концентрации 5 мкМ (рис 13), причем эффект зависел от структуры стерина.

Тем не менее, очевидно, что влияние соединений 19 - 21 па уровень экспрессии гена I-1MG СоА редуктазы не является причиной ингибирования биосинтеза холестерина в клетках Нер G2 этими соединениями. Кетостерни 21 являлся самым мошным ингибитором биосинтеза холестерина, но снижал уровень мРНК HMG СоА редуктазы слабее, чем менее эффективные ингибиторы биосинтеза холестерина 19 и 20 (ср. рис. 12 и 13).

15-Кетостерик и (22Е)-3 р-гидро кси-5а-Эргоста-8( 14)Д2-диен-15-он 19 в концентрации 5 нкМ к присутствии 10% FCS не влияли па уровень биосинтеза холестерина в клетках Hep G2 Однако оказалось, что кетостерины 2(1 и 21, содержащие 22,23-эгюксигруцггу, способны снижать уровень биосинтеза холестерина в клетках Hep G2: культивированных в присутствии сыворотки.

На рисунке 14 представлены уровни биосинтеза радиоактивных липидов (холестерина, жирных кислот и триглицеридов) из |14С1 ацетата в клетках Hep G2 в присутствии соединений 20 и 21, Уровень биосинтеза холестерина был значительно снижен (52 ± 6 % и 57 ± 6 % от' контроля, соответственно); содержите радио активных свободных жирных кислот составляло 76 ± 9 % и 79 ± 10 %, а трштшцеридов - 12i ± 10 % и 131 ± 9 %, соответственно. По-ввдимому, присутствие соединений 20 и 21 не оказывало существенного влияния на биосинтез жирных кислот, но стимулировало Их включение в тригдииериды.

£ 2[Ю

в 6 тас-

(С h- !Й0-

Zj (С MQ-

и 520-

■—1 100-

X 80-

п ■и 60"

1- J0-

20-

Z fj-

■X

□

триглицвреды

холестерин жирные кислоты

л Л £

gor

iCMCM c,<N CN e-NN

£ E S

S S °

Рис. 14. Влияние соединений 20 и 21 в концентрации 5 мкМ на уровень биосинтеза холестерина, жирных кислот и триглицеридов в клетках Hep G2 при 24 ч инкубации в среде с 10% FCS. Контрольные значения (100 %} составляли: дли холестерина -40 100; ДЛЯ жирных кислот - 49 900; для триглицеркпов -106 000 (ими./мин на I мг клеточного белка за й ч)

Результаты, представленные в этом разделе, свидетельствуют, что Д8(14)-15-кетоиронзводые эргостяна 19 - 21 эффективно подавляют биосинтез холестерина в клетках I lep G2, причем эффекты этих соединений существенно отличаются от эффектов 15-кетостерина. Среди новых ДЙ(14)-15-кетопронзводых эргаспапа найдено соединение (21), ингибярующее биосинтез холестерина в 7 раз эффективнее, чем 15-кетосгерин. В данной работе впервые показано, что Д 8( 14)-15 -kctoi ipo из волн ы с Эргостана подавляют экспрессию гена HMG СоА редуктазы в клетках Hep G2. Кроме того, соединения 20 и 21 способны снижать уровень биосинтеза холестерина в клетках

Hep G2 в присутствии сывороточных ЛИПИДОВ, TO ССТЬ проявляли активность при культивировании клеток печени в условиях, близких к физиологическим.

5. ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИЙ 20 И 211IA БИОСИНТЕЗ ХОЛЕСТЕРИНОВЫХ ЭФИРОВ И АКТИВНОСТЬ АСАТ В КЛЕТКАХ HEP G2 Соединения 2(1 и 21 оказывали различное влияние па биосинтез холестериловых эфиров (ХЭ) в клетках Hep G2, что было показано в экспериментах но оценке скорости биосинтеза ХЭ из радиоактивных предшественников - (''С] ацетата и [|4С]олеата (рис. 15 и 16).

О X то п G !-X S О

0 s ю л

1 а> 01 О

200 -|

150-

100-

50-

опыт 2

ОПЫТ 1

1 2

3 4

Рис. 15. Влияние соединений 20 и 21 на уровень биосинтеза ХЭ из [ С}ацетата в клетках Нср С2, прединкуоировакных 24 ч в среде, содержащей 10% РСК и исследуемые соединения в концентрации 5 мкМ. К - Контрольное значение (100 %, 5500 имп./мин / 1 мг клеточного белка за 6 ч) ! - Образование | '4С]ХЭ в клетках, обработанных соединением 20; 2 - образование [|4С]ХЗ в клетках, обработанных соединением 21 (опыт I проводился в отсутствие кетостеринов в среде). 3 -Образование [|4С]ХЭ в клетках, обработанных соединением 20; 4 - образование ¡МС]ХЭ в клетках, обработанных соединением 21 (опыт 2 проводился в присутствии 5 мкМ кетостеринов в среде).

Очевидно, что включение радиоактивности во фракцию ХЭ зависит от скоростей биосинтеза холестерина и жирной кислоты, а также от скорости АСАТ-зависимого ацилирования холестерина. В опыте I (рис. 15) эффекты соединений 20 и 21 достоверно не различались, а включение радиоактивности во фракцию ХЭ было ниже, чем в конзроле (65% и 69%, соответственно). Поскольку кетостернны подавляли включение [''С]алетата в холестерин (рис. 14). можно полагать, что предиикубашЕЯ клеток с соединениями 20 и 21 не оказывает Заметного влияния на биосинтез ХЭ. В опыте 2 (рис 15) уровень биосинтеза ХЭ был выше, чем в опыте I - в присутствии

соединения 20 включение радиоактивности во фракцию ХЭ составляло 84 + 8 % от контрольного, а в присутствии соединения 21 - I S0% ± 15% от контрольного.

Очевидно, что присутствие кетостерипов 20 и 21 во время инкубации клеток с радиоактивным предшественником, оказшаст стимулирующее влияние на ацилирование холестерина (аналогично 25-гидроксихолсстсрину и некоторым другим оксистеринам [Millar, Melnykovich, 1984; Morin, Peng, 1992; Kissel с va et al, I999J.

Иарис. 16 представлено влияние соединений 20 и 21 на уровень биосинтеза ХЭ в клетках Hep G2 из [|4С]олсата. Кстостсрш! 20 стимулировал включение [|4С]олеата во фракцию ХЭ пропорционально концентрации; кетостерии 21 эффективно увеличивал включение радиоактивности во фракцию ХЭ в низких концентрациях (0-2 мкМ), но при более высоких концентрациях (3 - б мкМ) стимулирующий эффект пропадал. Низкий уровень биосинтеза холестериновых эфнрои при 18 мкМ соедипсння 21 можно объяснить тем, что в этих условиях проявляется чбший цитотокеический эффект соединения, приводящий к ингибированию всех путей ацетатного биосинтеза.

концентрация, мкМ

Ряс. 16. Влияние соединений 20 и 21 на уровень биосинтеза ХЭ из [ С^олеата в клетках Hep G2 и среде, содержащей Ш% PCS Контрольное значение" (уровень биосинтеза ХЭ в отсутствии исследуемых соединений), принятое за 100 %, составляло 1200 импУмин / 1 мг клеточного белка зи 6 ч.

Для определения влияния кетосгеринов 2(1 и 2! па активность АСАТ мы использовали метод, основанный на реакции [мС]олеоил-СоА с холестерином, входящим в состав модельного субстрата, в присутствии ЯЕзгга клеток Hep G2 о качестве источника фермента [Cadigan, Chang, 1988; Cheng et al., 1995, Zhang et al., 2003]. В качестве модельного субстрата были использованы фосфолипидные мицеллы, содержащие холестерин, 25-гидроксихолестсрин (251IC), соединения 20 и 21.

На рисунке 17А показано образование [|4С]ХО в АСАТ-катапизируемой ¡«акции в отсутствии (прямая К) и в присутствии 25ПС. Рассчитанные из графика скорости ферментативной реакции [9.6 (± 1) пмолт, ХО /мин/ 1 мг клеточного белка] и двукратный стимулирующий эффект 25НС на активность АСАТ, соответствовали описанным в работе [Cheng et al., 1995]. Па рисунке 17 В показано образование ["С]ХО

к АСАТ-каггалнзируемой реакции ¡1 отсутствие кетоетеринов (прямая К), и в присутствии кетостершюв 20 и 21.

Рис. 17. А, АСАТ-зависимое образование [,4С]ХО в реакции [14С]олеонл-КоА и модельного субстрата, содержащего 50 мкг холестерина (К) или 50 мкг холестерина и 150 мкг 25НС (25НС).

1>, АСАГ-зависимос образование [С]ХО в реакции [иС]олеоил-КоА и модельного субстрата, содержащего 50 мкг холестерина (К); 50 мкг холестерина и 150 мкг кетостерина 2(1: 50 мкг холестерина и 150 мкг кетостерима 21

13 присутствии соединения 20 начальная скорость АСАТ-зависимого ацилироваши холестерина сохраняла линейную зависимость от времени в течение 15 мин и превышала начальную скорость реакции в контрольном эксперимент« на 45%. Стимулнруюший эффект кетосгсрина 20 на активность АСАХ был ниже, чем эффект 25 КС в тех же условиях, К присутствия соединения 21 скорост ь образования (|4С]ХО за первые 5 мин была значительно выше, чем в контроле. Однако при увеличении времени инкубации не наблюдалось дальнейшего увеличения [14С]ХО (рис. 17К). Последнее указывает на быструю инактивацию фермента.

Полученные результаты свидетельствуют, что 15-кето про из водные эргостана 20 и 21, содержащие 22,23-зпокснгруппу, регулируют биосинтез холестер иловых зфиров и активность АСАТ в клетках Нср 02. причем эффект зависит от стереохимнчсской конфигурации атомов С22 и С23.

6. ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИЙ 20 И 21 НА МЕТАБОЛИЗМ ЭКЗОГЕННОГО ХОЛЕСТЕРИНА 13 КЛЕТКАХ НЕРС2

Следующей задачей являлась оценка влияния кетостершюв 20 и 21 на метаболизм экзогенного холестерина в клетках Нер С2. Схема опыта представлена на рис 13.

время, мин

время, мкн

рН]холестермн + кетостерин

ке то стер и к

24 ч инкубация г4 ч „«^садии

(

Aria л 11 j радноактиины* проектов в клетка»

Анализ радиоактивных продукте вереде

Рис. ¡8. Клетки Hep G2. прединкубироваяньте 24 ч в среде, содержа шей кепосгерины 21) и 2! в концентрации 5 икМ, иикубировшт в той же среде в присутствии [HJxoJiecrepnaa и хетостеришв в течение 24 ч, а затем еще 24 ч без радио активности в присутствии кстостерипов.

Присутствие соединений 2(1 и 21 не оказывало влияния iia включение (*IIjхолестерина в клетки, а также па содержание радиоактивных метаболитов, образовавшихся в клетках за время 24 ч инкубации (рис. i У А). Последующее культивирование клеток, меченных [Н]холестерииом, в среде без радиоактивности приводило к накоплению радиоактивных метаболитов в культуральной среде. В присутствии кетостеринов 20 и 21 содержание радиоактивных полярных продуктов (ПИ) было повышено (156% ы ¡75% относительно контроля, соответственно), а содержание радиоактивных холестериловых эфнров (ХЭ) не отличалось от кошродя (рис. 19Б и 19В).

Результаты этого опыта продемонстрировали, что соединения 2(1 и 21 не оказывают заметного влияния из включение экзогенного холестерина в клетки Hep G2, а также на скорость обмена холестерина между клеточной мембраной и средой, однако стимулируют образование полярных продуктов из экзогенного [ £1¡холестерина. Последнее указывает на активацию окислительных процессов к клетке.

Влияние соединений 20 и 21 на уровень мРНК митохоняриальяой етерин-27-гндроксилазы (Сур27А1, ключевого фермента расщепления (токовой цени стерипон, активность которого и клетках печени активируется некоторыми гормонами и метаболитами) ti СурЗА4 (монооксигеназы, играющей важнейшею роль в катаболизме ксснобнотикои и освобождении клетки от токсичных метаболитов) представлено на рисунке 20.

Рис. ¡9- Л — Содержание радиоактивности и клетках Нер 02 после 24 ч инкубации в ереде, содержащей [?Н]холестерин в отсутствии (контроль) и в присутствии соединений 20 и 21 Контрольное значение (100 %) составляло 611 300 (имп./мин на 1 мг клеточного белка).

[> - Содержание радиоактивных полярных продуктов после 24 ч инкубации меченых клеток в отсутствии (контроль) и в присутствии соединений 20 и 21; значение для контрольной инкубации составляло 101 700 (ими /мин на 1 мг клеточного белка) - (16 %).

В - Содержание радиоактивных холестериновых эфиров после 24 ч инкубации меченых клеток в отсутствии (К) и в присутствии соединений 20 и 21, значение для контрольной инкубации составляло 29 000 (имп./мин на 1 мг клеточного белка) - (5 %).

Сур27А1

СурЗА4

К 20 21

р г

i ?

S 550

I fe

g. Ж--

20 21

Рае. 20. Влияние соединений 20 и 2f в концентрации 5 мкМ "а уровень мРИК Сур27А1 (А) и СурЗЛ4 (Б) в клетках Hep G2 при 24 ч инкубации в присутствии 10% FCS.

Кетостерин 20 не вызывал достоверных изменений в уровне мРНК Сур27А1 и СурЗА4 в клетках Hep G2, а кетостерин 21, не влияя на уровень мРНК Сур27А1, значительно (в 3,2 раза) увеличивал уровень мРНК СурЗА4 (рис. 20). Мы полагаем, что этот эффект можно объяснить активацией ядерного рецептора PXR. В пользу этого предположения свидетельствует заметная цитотоксичность кетостерина 21, а также известные данные [Shenoy et al., 2004] о PXR-зависимой активации экспрессии гена СурЗА4 токсичными оксистеринами в клетках печени.

Результаты, представленные в этом разделе свидетельствуют, что эпоксисодержащие Д8(14)-15-кетопроизводые эргостана 20 и 21 стимулировали превращение экзогенного холестерина в полярные продукты в клетках Hep G2, при этом (2211,2311)-22,23-оксидо-5а-эргосга-8(14)-ен-15-он-ЗР-ол 21 увеличивал уровень мРНК СурЗА4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что ряд новых оксигенированных производных стигмастана и эргостана влияют на жизнеспособность и пролиферацию клеток млекопитающих в культуре и регулируют метаболизм липидов в клетках Нер 02. Среди новых оксигенированных производных эргостана и стигмастана найдены соединения с высокой биологической активностью. Производные стигмастана, содержащие (22К,23К)-22,23-диольную функцию, показали выраженный цитотоксический эффект в опухолевых клетках, причем данные, представленные в диссертации, позволяют заключить, что цитотоксичность соединения определяется особенностями конформации боковой цепи.

15-Кетопроизводные эргостана 19, 20 и 21 оказались новыми эффективными регуляторами метаболизма холестерина в клетках Нер С2. Обращает на себя внимание различие в биологической активности изомерных (228,238)- и (2211,23К)- эпоксидов 20 и 21. Соединения 20 и 21 существенно различались по способности регулировать уровень мРНК НМО СоА редуктазы и СурЗА4, ингибировать биосинтез холестерина, влиять на биосинтез холестериловых эфиров и активность АСАТ в клетках Нер 02.

Полученные в диссертации результаты указывают, что биологическая активность новых оксигенированных производных эргостана и стигмастана определяется участием этих соединсиий в функционировании сложных регуляторных комплексов, интегрированных во внутренние мембраны клетки.

выводы

1. Среди 22 новых оксигенированных производных стягмаегана и эргостана наибольшую цитотокеичноегь в клетках MCF-7 и Hep G2 проявляли соединения, содержащие (22Я,23К)-диольную функцию; (22К,23К)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-Зр-ол проявлял высокую токсичность в клетках MCF-7.

2. Новые Д8(14)-15-кетопроизводные эргостана: (22Е)-5а-эргоста-8(14),22-диен-15-он-Зр-ол, (225,235)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-ЗР-ол и (22R,23R)-22,23-оксндо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-Зр-ол эффективно подавляли биосинтез холестерина и снижали уровень мРНК HMG СоА редуктазы в клетках Hep G2; ингибирующий эффект эпоксисодержащих кетостеринов проявлялся в условиях культивирования клеток в присутствии липидов и липопротешюв.

3. (22S,23S)-22,23-Оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-ЗР-ол и (22R,23R)-22,23-okciwo-5а-эргосг-8(14)-ен-15-он-Зр-ол различно регулировали биосинтез холестериловых эфиров и активность АСАТ в клетках Hep G2.

4. (225,235)-22,23-Оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-ЗР-ол и (22R,23R)-22,23-okciWo-5а-эргоет-8(14)-ен-15-он-ЗР-ол стимулировали превращение экзогенного холестерина в полярные продукты в клетках Hep G2; инкубация клеток с (22R,23R)-22,23-OKCiwo-5a-3procT-8(14)-eH-15-OH-3P-onoM стимулировала экспрессию СурЗА4.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дроздов Ф.В., Мехтиев А.Р., Морозевич Г.Е., Тимофеев В.П., Мишарин А.Ю. Цитотоксичные производные (22К,23К)-22,23-дигидроксистигмастана // Биоорган, химия. - 2007. - Т. 33. - С. 349-356.

2. Misharin A.Yu., Ivanov V.S., Mehtiev A.R., Morozevich G.E., Tkachev Ya.V., Timofeev V.P. Novel side chain modified A8(14)-15-ketosterols // Steroids. - 2007. - V. 72. - P. 305-312.

3. Мехтиев A.P., Морозевич Г.Е., Иванов B.C., Мишарин А.Ю. Влияние (22S,23S)- и (22Я,23Я)-33-гидрокси-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-онов на биосинтез липидов и метаболизм экзогенного холестерина в клетках Hep G2 // Биомед. химия. -2007.-Т. 53.-С. 221-227.

4. Мехтиев А.Р., Мишарин А.Ю. Биологическая активность фитостеринов и их производных // Биомед. химия. - 2007. - Т. 53. - С. 497-521.

5. Мехтиев А.Р., Козлова Н И., Скршшик В В., Мишарин А.Ю. Влияние (22S,23S)- и (22R,23R)-3 р-гидрокси-22,23-оксидо-5а-эргост-8( 14)-ен- 15-онов на биосинтез холестериловых эфиров и активность ацил-КоА:холестерин-анилтрансферазы в клетках Hep G2 // Биомед. химия. - 2008. - Т. 54. - С. 341-348.

6. Misharin A.Yu., Mehtiev A.R., Morozevich G.E., Tkachev Ya.V., Timofeev V.P. Synthesis and cytotoxicity evaluation of 22,23-oxygenated stigmastane derivatives // Bioorgan. Med. Chem. - 2008. - V. 16. - P. 1460-1474.

7. Дроздов Ф.В., Мехтиев A.P., Пийр E.A., Мишарин А.Ю. Цитотоксичные производные (22К,23К)-дигидроксисти1мастгна // Материалы Международной конференции "Биологические мшпени для действия лекарственных препаратов нового поколения". - Химки, 2006. - С. 40-42.

8. Мехтиев А.Р., Морозевич Г.Е., Дроздов Ф.В., Мишарин А.Ю. Токсичность новых оксигенировашшх фитостеринов в клетках гепатобластомы Hep G2 и карциномы молочной железы MCF-7 // Материалы 3-ей Международной паучно-нрактической конференции «Новые технологии создания инновационных лекарств. От достижений «постгеномной эры» к национальным фармацевтическим брендам». -Химки,2006.-С. 26.

9. Мехтиев А.Р., Морозевич Г.Е., Козлова Н.И., Чеглаков И.Б., Федченко В.И., Мишарин А.Ю. 22,23-Оксигешфованные производные сгигмастапа и эргосгана вызывают гибель клеток карциномы молочной железы MCF-7 // Материалы 4-ой Международной конференции «Постгеномные технологии разработки противоопухолевых агентов с новыми механизмами действия». - Химки, 2007. - С. 21.

Подписано в печать 16.09.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 741 Тираж: 75 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мехтиев, Ариф Раминович

1. ВВЕДЕНИЕ 3 1.1. ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ФИТОСТЕРИНОВ И ИХ

ПРОИЗВОДНЫХ"

2.1. ФИТОСТЕРИНЫ И ПИТАНИЕ

2.2. ФИТОСТЕРИНЫ И АБСОРБЦИЯ ЛИПИДОВ

2.3. ФИТОСТЕРИНЫ И МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ

2.4. ВЛИЯНИЕ ФИТОСТЕРИНОВ НА КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ 22 В КУЛЬТУРЕ

2.5. ПРОДУКТЫ ОКИСЛЕНИЯ ФИТОСТЕРИНОВ

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. МАТЕРИАЛЫ

3.2. МЕТОДЫ

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 .ОЦЕНКА ЦИТОТОКСИЧНОСТИ 22,23 -ОКСИГЕНИРОВ АНЫХ

ПРОИЗВОДНЫХ СТИГМАСТAHA (1-18)

4.2. ОЦЕНКА ЦИТОТОКСИЧНОСТИ Д8(14)-15-КЕТОПРОИЗВОДНЫХ 5а-ЭРГОСТАНА (19 — 22)

4.3. ТОКСИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ СОЕДИНЕНИЙ 3 И 19 В КЛЕТКАХ

4.4. ИНГИБИРОВАНИЕ БИОСИНТЕЗА ХОЛЕСТЕРИНА В КЛЕТКАХ

HEP G2 СОЕДИНЕНИЯМИ 1

4.5. ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИЙ 20 И 21 НА БИОСИНТЕЗ ХОЛЕСТЕРИЛОВЫХ ЭФИРОВ И АКТИВНОСТЬ АСАТ В КЛЕТКАХ

HEP G

4.6. ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИЙ 20 И 21 НА МЕТАБОЛИЗМ ЭКЗОГЕННОГО ХОЛЕСТЕРИНА В КЛЕТКАХ HEP G

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологическая активность новых оксигенированных производных стигмастана и эргостана в клетках Hep G2 и MCF-7"

Изучение физиологически активных природных соединений и их синтетических производных является важнейшим направлением современной биомедицинской химии. Препараты, созданные на основе природных соединений широко применяются в лечении и профилактике онкологических, инфекционных, сердечно-сосудистых, аутоиммунных заболеваний и нарушений метаболизма. На долю противовоспалительных и противораковых препаратов, созданных на основе природных соединений, приходится около 70% и 60%, от всех соответствующих лекарств, представленных в настоящее время на мировом рынке.

Высоким фармакологическим потенциалом обладают природные изопреноиды, в частности стерины растительного и микробного происхождения, а также продукты их химической трансформации. Наибольшее значение имеют оксигенированные производные растительных и микробных стеринов, которые являются близкими структурными аналогами оксистеринов - важнейших регуляторных молекул в организме млекопитающих [1].

Природные оксистерины - полярные производные, образующиеся из холестерина в разных тканях организма, являются промежуточными продуктами метаболических превращений холестерина в стероидные гормоны и желчные кислоты. При физиологических концентрациях оксистерины регулируют биосинтез, метаболизм и транспорт изопреноидов, липидов, желчных кислот, углеводов, играют важную роль в процессах клеточной дифференцировки и апоптоза [обзоры 1-9]. Неоднократные попытки использования природных оксистеринов в качестве фармакологических регуляторов липидного обмена потерпели неудачу. Оксигенированные производные ряда холестана, являясь природными метаболитами, при их использовании в физиологических концентрациях быстро метаболизировали в печени с образованием нормальных желчных кислот и не оказывали эффекта в экспериментах in vivo. Использование оксистеринов в концентрациях, на порядки превышающих физиологические, вызывало у подопытных животных многочисленные побочные эффекты из-за наличия в организме млекопитающих большого количества потенциальных мишеней для соединений стеринового ряда.

В литературе имеются только отдельные упоминания об исследовании продуктов окисления основных растительных стеринов [см. литературный обзор], однако многие оксистерины, выделенные из экзотических растений и морских организмов, обладают высокой биологической активностью в клетках млекопитающих и используются в практической медицине для борьбы с инфекционными и онкологическими заболеваниями [10-15].

В лаборатории Синтеза физиологически активных соединений ГУ НИИ БМХ РАМН был осуществлен синтез новой серии оксигенированных производных стигмастана и эргостана. Основу проекта составляет гипотеза, что направленная химическая трансформация доступных молекул эргостерина и стигмастерина представляет собой перспективный путь получения новых оксистеринов, обладающих регуляторной активностью в клетках млекопитающих и проявляющих пролонгированный эффект по сравнению с аналогичными производными ряда холестана.

29 холестан стигмастан эргостан

Данная диссертация является частью этого проекта. Цель работы:

Изучение биологической активности и оценка фармакологического потенциала новых оксигенированных производных стигмастана и эргостана в клетках гепатобластомы человека линии Hep G2 и карциномы молочной железы человека линии MCF-7.

Выбор вышеуказанных клеточных культур был обусловлен тем, что клетки MCF-7 и Hep G2 являются стандартными моделями для первичного тестирования потенциальных противоопухолевых препаратов и регуляторов липидного обмена, соответственно. Кроме того, исследование биологической активности оксигенированных производных стигмастана и эргостана в клетках Hep G2 особенно интересно, поскольку в клетках печени регуляторно активные производные холестана быстро деградируют, теряя активность.

Задачи работы:

2) Изучение влияния оксигенированных производных стигмастана и эргостана на биосинтез холестерина в клетках Hep G2; исследование (22Е)-5а-эргоста-8(14),22-диен-15-он-ЗР-ола, (228,238)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-ЗР-ола и (22Я,23К)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-Зр-ола в качестве регуляторов метаболизма холестерина в клетках печени.

3) Исследование влияния (228,238)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-Зр-ола и (22К,2311)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-ЗР-ола на биосинтез холестериловых эфиров и активность ацилкофермент-А:холестерин-ацилтрансферазы в клетках Hep G2.

4) Исследование влияния (228,238)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-Зр-ола и (22К,2311)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-Зр-ола на метаболизм экзогенного холестерина в клетках Hep G2.

Положения диссертации, выносимые на защиту:

1) В результате проведенных исследований установлено, что производные (22R,23R)-22,23-дигидроксистигмастана токсичны в клетках MCF-7 и Hep G2.

2) В результате проведенных исследований установлена высокая цитотоксичность (22К,23К)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-Зр-ола в клетках MCF-7.

3) В результате проведенных исследований установлено, что Д8(14)-15-кетопроизводными эргостана подавляют биосинтез и регулируют метаболизм холестерина в клетках Hep G2, причем различия в биологической активности определяются структурой боковой цепи и стереохимической конфигурацией атомов С22 и С23.

4) В результате проведенных исследований установлено, что изомерные (22S,23S)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-ЗР-ол и (22К,2311)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-ЗР-ол оказывают различное влияние на биосинтез холестериловых эфиров и активность АСАТ в клетках Hep G2.

5) В результате проведенных исследований установлено, что изомерные (22S,23S)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-Зр-ол и (2211,2311)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-Зр-ол активируют метаболизм экзогенного холестерина в клетках Hep G2.

1.1. ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

Апо - аполипопротеин; ЛП - липопротеины;

ЛПДС - липопротеин-дефицитная сыворотка (плазмы крови человека);

ЛВП - липопротеины высокой плотности;

ЛНП - липопротеины низкой плотности;

ЛОНП - липопротеины очень низкой плотности;

ЛПП - липопротеины промежуточной плотности;

КоА - кофермент А;

РНКаза А - рибонуклеаза А;

ТСХ - тонкослойная хроматография;

ТХУ - трихлоруксусная кислота;

ФХ - фосфатидилхолин (яичного желтка);

ХО - холестерилолеат;

ХЭ - холестериловые эфиры;

25НС - 25-гидроксихолестерин;

АВСА1, ABCG1 (ATP binding cassette) — мембранные АТФ-зависимые белки, участвующие в выведении холестерина и фосфолипидов; Ас - ацетил;

АсОН - уксусная кислота;

АСАТ - ацил-СоА:холестерин-ацилтрансфераза;

AHR (aryl hydrocarbon receptor) - рецептор ароматических углеводородов; BSA — бычий сывортоточный альбумин;

СаСо2 (colon carcinoma 2) - линия клеток карциномы кишечника;

СНО (chinesian hamster ovary) — линия клеток яичника китайского хомяка;

Сур27А1 - митохондриальная стерин-27-гидроксилаза;

Сур7А1 - гепатическая холестерин-7а-гидроксилаза;

DAPI - 4',6-диамидино-2-фенилиндол гидрохлорид;

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота (Na соль);

Et - этил;

ЕЮ Ас - этилацетат; Et20 — диэтиловый эфир; EtOH - этанол;

FCS (fetal calf serum) - эмбриональная сыворотка теленка;

HMG CoA - гидроксиметилглутарил кофермент A;

LXR (liver X receptor) - активируемый (248)-24,25-оксидохолестерином ядерный рецептор, контролирующий экспрессию многих генов, участвующих в метаболизме липидов и липопротеинов;

МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид;

PBS (phosphate buffered saline) - фосфатсодержащий физиологический раствор;

PMSF — фенилметилсульфонилфторид;

Рг'ОН — изопропанол;

RXR (retinoid X receptor) - активируемый 9-цис-ретиноевой кислотой ядерный рецептор;

SCAP (SREBP cleavage-activating protein) - регуляторный белок, образующий комплекс с SREBP, и регулирующий его протеолиз;

SREBP-1 (sterol regulatory element binding protein-1) - регуляторный белок, протеолиз которого контролирует экспрессию важнейших генов липогенеза;

SREBP-2 (sterol regulatory element binding protein-2) - регуляторный белок, протеолиз которого контролирует экспрессию важнейших генов стероидогенеза;

PPAR (peroxisoma proliferators activated receptor) - пролифератор-активируемый рецептор пероксисом;

TNF (tumor necrosis factor) - фактор некроза опухолей.

В разделе "2. Литературный обзор" для обозначения обсуждаемых соединений использована нумерация римскими цифрами; в разделах "3. Материалы и методы" и

4. Результаты и их обсуждение" для обозначения исследованных в работе соединений использована нумерация арабскими цифрами.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ФИТОСТЕРИНОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ

Растения представляют собой неисчерпаемый источник биологически активных соединений. Растительные пищевые продукты содержат значительное количество терпеноидов, из которых главными являются С29- и С28-стерины (фитостерины). Влияние фитостеринов на многие проблемы нормальной физиологии питания, гастроэнтерологии, гепатологии, диабета, нарушений липидного обмена, сердечнососудистых патологий неоднократно обсуждались в обзорной литературе.

Опубликованы обзоры, суммирующие многочисленные популяционные исследования о влиянии алиментарных фитостеринов на гомеостаз холестерина и липопротеинов [16 - 22], а также обзоры, посвященные влиянию фитостеринов на состояние иммунной системы и их противовоспалительной, противовирусной, анти-неопластической и антиканцерогенной активности [23, 24].

Целью данного обзора является обобщение исследований биологической активности основных фитостеринов и некоторых их производных, опубликованных за последнее десятилетие. В обзоре рассматриваются вопросы поступления и выведения фитостеринов в организме; влияния фитостеринов на рост и жизнеспособность клеток млекопитающих в культуре; участия алиментарных фитостеринов в гомеостазе холестерина, а также влияния фитостеринов на метаболизм липидов в клетках кишечника и печени. Специальные разделы посвящены продуктам окисления фитостеринов и сравнению биологической активности продуктов окисления фитостеринов и продуктов окисления холестерина (оксистеринов).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Мехтиев, Ариф Раминович

6. выводы

1) Среди 22 новых оксигенированных производных стигмастана и эргостана наибольшую цитотоксичность в клетках MCF-7 и Hep G2 проявляли соединения, содержащие (2211,2311)-диольную функцию; (2211,23К)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-ЗР-ол проявлял высокую токсичность в клетках MCF-7.

2) Новые Д8(14)-15-кетопроизводные эргостана: (22Е)-5а-эргоста-8(14),22-диен-15-он-Зр-ол, (228,238)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-Зр-ол и (22R,23R)-22,23-оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-Зр-ол эффективно подавляли биосинтез холестерина и снижали уровень мРНК HMG Со А редуктазы в клетках Hep G2; ингибирующий эффект эпоксисодержащих кетостеринов проявлялся в условиях культивирования клеток в присутствии липидов и липопротеинов.

3) (228,238)-22,23-Оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-Зр-ол и (22R,23R)-22s23-okchao-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-Зр-ол различно регулировали биосинтез холестериловых эфиров и активность ацилкофермент-А:холестерин-ацилтрансферазы в клетках Hep G2.

4) (228,238)-22,23-Оксидо-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-Зр-ол и (22R,23R)-22,23-0kchfl0-5а-эргост-8(14)-ен-15-он-Зр-ол стимулировали превращение экзогенного холестерина в полярные продукты в клетках Hep G2; инкубация клеток с (22R,23R)-22,23-oкcидo-5a-эpгocт-8(14)-eн-15-oн-Зp-oлoм стимулировала экспрессию СурЗА4.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что ряд новых оксигенированных производных стигмастана и холестана влияют на жизнеспособность и пролиферацию клеток млекопитающих в культуре и регулируют метаболизм липидов в клетках Hep G2. Среди новых оксигенированных производных эргостана и стигмастана, найдены соединения с высокой биологической активностью. Данная работа убедительно доказала справедливость нашей гипотезы, согласно которой направленная модификация боковой цепи природных стеринов является перспективным подходом к созданию новых биологически активных соединений с высоким фармакологическим потенциалом.

Производные стигмастерина, содержащие (2211,2311)-22,23-диольную функцию показали выраженный цитотоксический эффект в опухолевых клетках, причем данные представленные в диссертации позволяют заключить, что цитотоксичность соединения определяется особенностями конформации боковой цепи, и как следствие, влиянием на мембрану.

Необходимо отметить, что интерес к мембранным эффектам оксистеринов возник сравнительно недавно [174 - 177, 224]. В течение многих лет исследования стеринов и оксистеринов развивались отдельно и независимо друг от друга. Поскольку стерины являются необходимым интегральным компонентом биологических мембран, основным аспектом изучения стеринов было их влияние на параметры и свойства липидов, составляющих мембрану. В то же время, оксистерины, в их физиологической концентрации, растворимы в воде, и поэтому основное внимание уделялось взаимодействию оксистеринов с белками - ферментами, транспортерами и специфичными рецепторами.

Однако, современные достижения в изучении процессов клеточной регуляции и сигналинга показали, что многие регуляторные эффекты оксистеринов связаны с их участием в функционировании сложных комплексов, составными частями которых являются интегрированные в мембрану белки; мембранные липиды, являющиеся составной частью рафтов; и специфические мембранные ферменты, обеспечивающие процессинг, который и определяет функцию комплексов. Примерами участия оксистеринов в функционировании таких сложных регуляторных систем являются цитированные работы [4, 107 - 110], а также интересные исследования [225 - 230], выходящие, однако, из круга работ, рассматриваемых в данной диссертации.

15-Кетопроизводные эргостана 19, 20 и 21, исследованные в настоящей работе, оказались новыми высокоэффективными регуляторами метаболизма холестерина в клетках Hep G2. Обращает на себя внимание различие в биологической активности изомерных (22S,23S)- и (22R,23R)- эпоксидов 20 и 21. Соединения 20 и 21 существенно различались по способности регулировать уровень мРНК HMG СоА редуктазы в клетках Hep G2. Как изестно, уровень мРНК HMG СоА редуктазы определяется контролируемым процессингом регуляторного мембранного белка SREBP-2. Очевидно, что соединения 20 и 21, различающиеся стереохимической конфигурацией атомов С22 и С23, по-разному связываются со сложным мембранным комплексом, в который входят регуляторные трансмембранные белки SREBP, SCAP, INSIG.

Соединения 20 и 21 по-разному регулировали биосинтез холестериловых эфиров и активность AC AT в клетках Hep G2. AC AT является сложным мембранным комплексом, причем оксистерины могут связываться как с каталитическим, так и с регуляторным центром фермента [115, 211]. Разумно считать, что различия в каталитической активности и стабильности модельных субстратов ФХ-холестерин-стерин 20 и ФХ-холестерин-стерин 21 зависят от структуры и конформации боковой цепи стерина, входящего в состав комплекса.

Подводя итоги, можно утверждать, что наиболее активные, интересные и перспективные соединения исследованной серии стеринов содержат конформационно жесткую боковую цепь. Результаты, полученные в клетках Hep G2 и MCF-7, не только позволили найти несколько соединений с высоким фармакологическим потенциалом среди оксигенированных производных стигмастана и эргостана, но и провести прогноз биологической активности некоторых классов стеринов растительного происхождения.

Мы считаем перспективным продолжением данного проекта химический синтез и оценку биологической активности в клетках млекопитающих некоторых брассиностероидов (фитогормонов, содержащих (22R,23R)-22,23-flHonbHyio группировку), а также некоторых стероидных сапогенинов, и родственных сапогенинам спиростеролов и спиростанолов, обладающих жесткой боковой цепью.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мехтиев, Ариф Раминович, Москва

1. Schroepfer G.J., Jr. Oxysterols: modulators of cholesterol metabolism and other processes // Physiol. Rev. 2000. - V. 80. - P. 361-554.

2. Smith L.L. Biological Effects of Cholesterol Oxides / K. Peng, R.J. Morin eds. Boca Raton, Fl. : CRC Press, 1992. - P. 7-31.

3. Bjorkhem I. Do oxysterols control cholesterol homeostasis? // J. Clin. Invest. 2002. -V. 110.-P. 725-730.

4. Thompson E.B., Ayala-Torres S. Oxysterols and apoptosis: evidence for gene regulation outside the cholesterol pathway // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1999. -V. 34.-P. 25-32.

5. Kaul D. Molecular link between cholesterol, cytokines and atherosclerosis // Mol. Cell Biochem. 2001. - V. 219. - P. 65-71.

6. Panini S.R., Sinensky M.S. Mechanisms of oxysterol-induced apoptosis // Curr. Opin. Lipidol. 2001. - V. 12. - P. 529-533.

7. Bjorkhem I., Diczfalusy U. (2002). Oxysterols: friends, foes, or just fellow passengers? // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2002. - V. 22. - P. 734-742.

8. Пийр E.A., Мишарин А.Ю. Оксистерины как сигнальные молекулы // Биол. мембраны. 2004. - V. 21. - Р. 273-294.

9. Massey J.B. Membrane and protein interactions of oxysterols // Curr. Opin. Lipidol. -2006.-V. 17.-P. 296-301.

10. D'Auria M.V., Minale L., Ricco R. Polyoxygenated steroids of marine origin // Chem. Rev.-1993.-V. 93.-P. 1839-1895.

11. Min B.S., Gao J.J., Nakamura N., Hattori M. Triterpenes from the spores of Ganoderma lucidum and their cytotoxicity against meth-A and LLC tumor cells // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 2000. - V. 48. - P. 1026-1033.

12. Gao J.J., Min B.S., Ahn E.M., Nakamura N., Lee H.K., Hattori M. New triterpene aldehydes, lucialdehydes A-C, from Ganoderma lucidum and their cytotoxicity against murine and human tumor cells // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 2002. - V. 50. - P. 837-840.

13. Takei Т., Yoshida M., Ohnishi-Kameyama M., Kobori M. Ergosterol peroxide, an apoptosis-inducing component isolated from Sarcodon aspratus (Berk.) // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2005. - V. 69. - P. 212-215.

14. Hata K., Sugawara F., Ohisa N., Takahashi S., Hori K. Stimulative effects of (22E,24R)-ergosta-7,22-diene-3beta,5alpha,6beta-triol from fruiting bodies of

15. Tricholoma auratum, on a mouse osteoblastic cell line, MC3T3-E1 // Biol. Pharm. Bull. 2002. - V. 25. - P. 1040-1044.

16. Ling W.H., Jones P.J. Dietary phytosterols: a review of metabolism, benefits and side effects // Life Sci. 1995. - V. 57. - P. 195-206.

17. Schwandt P., Richter W.O. Drug therapy of hypercholesterolemia // Wien. Klin. Wochenschr. 1995. -V. 107. - P. 544-548.

18. Pedersen T.R. Lowering cholesterol with drugs and diet // N. Engl. J. Med. 1995. - V. 333.-P. 1350-1351.

19. Moghadasian M.H. Pharmacological properties of plant sterols in vivo and in vitro observations // Life Sci. 2002. - V. 67. - P. 605-615.

20. Wong N.C. The beneficial effects of plant sterols on serum cholesterol // Can. J. Cardiol. 2001. - V. 17. - P. 715-721.

21. Tapiero H., Townsend D.M., Tew K.D. Phytosterols in the prevention of human pathologies // Biomed. Pharmacother. 2003. - V. 57. - P. 321-325.

22. Ostlund R.E. Phytosterols and cholesterol metabolism // Curr. Opin. Lipidol. 2004. -V. 15.-P. 37-41.

23. Qullez J., Garcla-Lorda P., Salas-Salvado J. Potential uses and benefits of phytosterols in diet: present situation and future directions // Clin. Nutr. 2003. - V. 22. - P. 343351.

24. Awad A.B., Fink C.S. Phytosterols as anticancer dietary components: evidence and mechanism of action // J. Nutr. 2000. - V. 130. - P. 2127-2130.

25. Sehayek E. Genetic regulation of cholesterol absorption and plasma plant sterol levels: commonalities and differences // J. Lipid Res. 2003. - V. 44. - P. 2030-2038.

26. Boberg K.M., Skrede В., Skrede S. Metabolism of 24-ethyl-4-cholesten-3-one and 24-ethyl-5-cholesten-3 beta-ol (sitosterol) after intraperitoneal injection in the rat // Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 1986. - V. 184. - P. 47-54.

27. Compassi S., Werder M., Weber F.E., Boffelli D., Hauser H., Schulthess G. Comparison of cholesterol and sitosterol uptake in different brush border membrane models // Biochemistry. 1997. - V. 36. - P. 6643-6652.

28. Igel M., Giesa U., Lutjohann D., von Bergmann K. Comparison of the intestinal uptake of cholesterol, plant sterols, and stanols in mice // J. Lipid Res. 2003. - V. 44. - P. 533-538.

29. Heinemann Т., Kullak-Ublick G.A., Pietruck В., von Bergmann K. Mechanisms of action of plant sterols on inhibition of cholesterol absorption. Comparison of sitosterol and sitostanol // Eur. J. Clin. Pharmacol. 1991. -V. 40. - P. 59-63.

30. Hakala K., Vuoristo M., Miettinen T.A. Serum cholesterol, cholesterol precursors and plant sterols in different inflammatory bowel diseases // Digestion. 1996. - V. 57. - P. 83-89.

31. Hakala K., Luukkonen P., Vuoristo M., Jarvinen H., Miettinen T.A. Cholesterol metabolism and non-cholesterol sterols in patients with ileal pouch anastomosis // J. Hepatol. 1997. -V. 26. - P. 1306-1312.

32. Meijer G.W., Bressers M.A., de Groot W.A., Rudrum M. Effect of structure and form on the ability of plant sterols to inhibit cholesterol absorption in hamsters // Lipids. -2003.-V. 38.-P. 713-721.

33. Nissinen M., Gylling H., Vuoristo M., Miettinen T.A. Micellar distribution of cholesterol and phytosterols after duodenal plant stanol ester infusion // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. -2002. -V. 282. P. 1009-1015.

34. Relas H., Gylling H., Miettinen T.A. Effect of stanol ester on postabsorptive squalene and retinyl palmitate // Metabolism. 2000. - V. 49. - P. 473-478.

35. Moreau R.A., Hicks K.B. The in vitro hydrolysis of phytosterol conjugates in food matrices by mammalian digestive enzymes // Lipids. 2004. - V. 39. - P. 769-776.

36. Sarkkinen E.S., Uusitupa M.I., Gylling H., Miettinen T.A. Fat-modified diets influence serum concentrations of cholesterol precursors and plant sterols in hypercholesterolemic subjects // Metabolism. 1998. - V. 47. - P. 744-750.

37. Relas H., Gylling H., Miettinen T.A. Acute effect of dietary stanyl ester dose on post-absorptive alpha-tocopherol, beta-carotene, retinol and retinyl palmitate concentrations // Br. J. Nutr. 2001. - V. 85. - P. 141-147.

38. Mortimer B.C., Mortimer B.C., Tso P., Phan C.T., Beveridge D.J., Wen J., Redgrave T.G. Features of cholesterol structure that regulate the clearance of chylomicron-like lipid emulsions // J. Lipid Res. 1995. - V. 36. - P. 2038-2053.

39. Robins S.J., Fasulo J.M., Pritzker C.R., Patton G.M. Hepatic transport and secretion of unesterified cholesterol in the rat is traced by the plant sterol, sitostanol // J. Lipid Res. 1996.-V. 37.-P. 15-21.

40. Burris T.P., Eacho P.I., Cao G. Genetic disorders associated with ATP binding cassette cholesterol transporters // Mol. Genet. Metab. 2002. - V. 77. - P. 13-20.

41. Berge K.E. Sitosterolemia: a gateway to new knowledge about cholesterol metabolism // Ann. Med. 2003. - V. 35. - P. 502-511.

42. Cobb M.M., Salen G., Tint G.S., Greenspan J., Nguyen L.B. Sitosterolemia: opposing effects of cholestyramine and lovastatin on plasma sterol levels in a homozygous girl and her heterozygous father // Metabolism. 1996. - V. 45. - P. 673-679.

43. Parsons H.G., Jamal R., Baylis В., Dias V.C., Roncari D. A marked and sustained reduction in LDL sterols by diet and cholestyramine in beta-sitosterolemia // Clin. Invest. Med. 1995. - V. 18. - P. 389-400.

44. Lee M.H., Lu K., Patel S.B. Genetic basis of sitosterolemia // Curr. Opin. Lipidol. -2001.-V. 12.-P. 141-149.

45. Ntanios F.Y., Jones P.J. Effects of variable dietary sitostanol concentrations on plasma lipid profile and phytosterol metabolism in hamsters // Biochim. Biophys. Acta. 1998. -Y. 1390.-P. 237-244. , ,

46. Ramjiganesh Т., Roy S., Mclntyre J.C., Luz Fernandez M. The hypocholesterolaemic effects of sitostanol in the guinea pig are in part related to changes in hepatic lipids and lipoprotein composition//Br. J. Nutr. -2001. V. 85.-P. 165-172.

47. Schmitz. G., Langmann Т., Heimerl S. Role of ABCG1 and other ABCG family members in lipid metabolism // J. Lipid Res. 2001. - V. 42. - P. 1513-1520.

48. Duan L.P., Wang H.H., Wang D.Q. Cholesterol absorption is mainly regulated by the jejunal and ileal ATP-binding cassette sterol efflux transporters Abcg5 and Abcg8 in mice // J. Lipid Res. 2004. - V. 45. - P. 1312-1323.

49. Graf G.A., Yu L., Li W.P., Gerard R., Tuma P.L., Cohen J.C., Hobbs H.H. ABCG5 and ABCG8 are obligate heterodimers for protein trafficking and biliary cholesterol excretion // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - P. 48275-48282.

50. Ikeda I., Nakagiri H., Sugano M., Ohara S., Hamada Т., Nonaka M., Imaizumi K. Mechanisms of phytosterolemia in stroke-prone spontaneously hypertensive and WKY rats // Metabolism. 2001. - V. 50. - P. 1361-1368.

51. Yang C., Yu L., Li W., Xu F., Cohen J.C., Hobbs H.H. Disruption of cholesterol homeostasis by plant sterols // J. Clin. Invest. 2004. - V. 114. - P. 813-822.

52. Yu L., Hammer R.E., Li-Hawkins J., von Bergmann K., Lutjohann D., Cohen J.C., Hobbs H.H. Disruption of Abcg5 and Abcg8 in mice reveals their crucial role in biliary cholesterol secretion // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - V. 99. - P. 16237-16242.

53. Nguyen L.B., Shefer S., Salen G., Tint S.G., Batta A.K. Competitive inhibition of hepatic sterol 27-hydroxylase by sitosterol: decreased activity in sitosterolemia // Proc. Assoc. Am. Physicians. 1998. - V. 110. - P. 32-39.

54. Miettinen T.A., Tilvis R.S., Kesaniemi Y.A. Serum plant sterols and cholesterol precursors reflect cholesterol absorption and synthesis in volunteers of a randomly selected male population // Am. J. Epidemiol. 1990. - V. 131. - P. 20-31.

55. Miettinen T.A., Vanhanen H. Dietary sitostanol related to absorption, synthesis and serum level of cholesterol in different apolipoprotein E phenotypes // Atherosclerosis. -1994.-V. 105.-P. 217-226.

56. Gylling H., Miettinen T.A. Serum cholesterol and cholesterol and lipoprotein metabolism in hypercholesterolaemic NIDDM patients before and during sitostanol ester-margarine treatment // Diabetologia. 1994. - V. 37. - P. 773-780.

57. Gylling H., Siimes M.A., Miettinen T.A. Sitostanol ester margarine in dietary treatment of children with familial hypercholesterolemia // J. Lipid Res. 1995. - V. 36. - P. 1807-1812.

58. Gylling H., Miettinen T.A. Effects of inhibiting cholesterol absorption and synthesis on cholesterol and lipoprotein metabolism in hypercholesterolemic non-insulin-dependent diabetic men // J. Lipid Res. 1996. - V. 37. - P. 1776-1785.

59. Jones P.J., McDougall D.E., Ntanios F., Vanstone C.A. Dietary phytosterols as cholesterol-lowering agents in humans // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1997. - V. 75. -P. 217-227.

60. Jones P.J., Howell Т., McDougall D.E., Feng J.Y., Parsons W. Short-term administration of tall oil phytosterols improves plasma lipid profiles in subjects with different cholesterol levels // Metabolism. 1998. - V. 47. - P. 751-756.

61. Weststrate J.A., Meijer G.W. Plant sterol-enriched margarines and reduction of plasma total- and LDL-cholesterol concentrations in normocholesterolaemic and mildly hypercholesterolaemic subjects // Eur. J. Clin. Nutr. 1998. - V. 52. - P. 334-343.

62. Nguyen T.T., Dale L.C., von Bergmann K., Croghan I.T. Cholesterol-lowering effect of stanol ester in a US population of mildly hypercholesterolemic men and women: a randomized controlled trial // Mayo Clin. Proc. 1999. - V. 74. - P. 1198-1206.

63. Jankowski P., Bilo G., Bryniarski L., Bryniarska-Mirek E., Pajak A. Stanols a new perspective in treatment of hypercholesterolemia? // Przegl. Lek. - 2000. - V. 57. - P. 655-658.

64. Ntanios F.Y., Duchateau G.S. A healthy diet rich in carotenoids is effective in maintaining normal blood carotenoid levels during the daily use of plant sterol-enriched spreads // Int. J. Vitam. Nutr. Res. 2002. - V. 72. - P. 32-39.

65. Meguro S., Higashi K., Hase Т., Honda Y., Otsuka A., Tokimitsu I., Itakura H. Solubilization of phytosterols in diacylglycerol versus triacylglycerol improves the serum cholesterol-lowering effect // Eur. J. Clin. Nutr. 2001. - V. 55. - P. 513-517.

66. Vaskonen Т., Mervaala E., Seppanen-Laakso Т., Karppanen H. Diet enrichment with calcium and magnesium enhances the cholesterol-lowering effect of plant sterols in obese Zucker rats // Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis. 2001. - V. 11. - P. 158-167.■

67. Vaskonen Т., Mervaala E., Sumuvuori V., Seppanen-Laakso Т., Karppanen H. Effects of calcium and plant sterols on serum lipids in obese Zucker rats on a low-fat diet // Br. J. Nutr. 2002. - V. 87. - P. 239-245.

68. Geelen A., Zock P.L., de Vries J.H., Katan M.B. Apolipoprotein E polymorphism and serum lipid response to plant sterols in humans // Eur. J. Clin. Invest. 2002. - V. 32. -P. 738-742.

69. Sugano M., Morioka H., Ikeda I. A comparison of hypocholesterolemic activity of beta-sitosterol and beta-sitostanol in rats // J. Nutr. 1977. - V. 107. - P. 2011-2019.

70. Ikeda I., Nakashima-Yoshida K., Sugano M. Effects of cycloartenol on absorption and serum levels of cholesterol in rats // J. Nutr. Sci. Vitaminol. 1985. - V. 31. - P. 375384.

71. Ling W.H., Jones P.J. Enhanced efficacy of sitostanol-containing versus sitostanol-free phytosterol mixtures in altering lipoprotein cholesterol levels and synthesis in rats // Atherosclerosis. 1995. -V. 118. - P. 319-331.

72. Katamoto H., Yoneda N., Shimada Y. Effects of isoprothiolane and phytosterol on adipocyte metabolism and fatty acid composition of serum and tissue lipids in rats // J. Vet. Med. Sci. 1991. - V. 53. - P. 905-910.

73. Ntanios F.Y., Jones P.J., Frohlich J.J. Dietary sitostanol reduces plaque formation but not lecithin cholesterol acyl transferase activity in rabbits // Atherosclerosis. 1998. -V. 138.-P. 101-110.

74. Grundy S.M., Мок H.Y. Colestipol, clofibrate, and phytosterols in combined therapy of hyperlipidemia // J. Lab. Clin. Med. 1977. - V. 89. - P. 354-366.

75. Gylling H., Miettinen T.A. The effect of cholesterol absorption inhibition on low density lipoprotein cholesterol level // Atherosclerosis. 1995. - V. 117. - P. 305-308.

76. Denke M.A. Lack of efficacy of low-dose sitostanol therapy as an adjunct to a cholesterol-lowering diet in men with moderate hypercholesterolemia // Am. J. Clin. Nutr.- 1995.-V. 61.-P. 392-396.

77. Jakulj L., Trip M.D., Sudhop Т., von Bergmann K., Kastelein J.J., Vissers M.N. Inhibition of cholesterol absorption by the combination of dietary plant sterols and ezetimibe: effects on plasma lipid levels // J. Lipid Res. 2005. - V. 46. - P. 26922698.

78. Lu T.T., Repa J.J., Mangelsdorf D.J. Orphan nuclear receptors as eLiXiRs and FiXeRs // J. Bol. Chem. -2001. V. 276. - P. 37735-37738.

79. Repa J J., Mangelsdorf D.J. Nuclear receptor regulation of cholesterol and bile acid metabolism // Curr. Opin. Biotechnol. 1999. - V. 10. - P. 557-563.

80. Peet D.J., Janowski B.A., Mangelsdorf D.J. The LXRs new class of oxysterol receptors // Curr. Opin. Gen. Develop. 1998. - V. 8. - P. 571-575.

81. Plat J., Nichols J.A., Mensink R.P. Oxidized plant sterols in human serum and lipid infusions as measured by combined gas-liquid chromatography-mass spectrometry // J. Lipid Res. 2005. - V. 46. - P. 2468-2476.

82. Plat J., Mensink R.P. Increased intestinal ABCA1 expression contributes to the decrease in cholesterol absorption after plant stanol consumption // FASEB J. 2002. -V. 16.-P. 1248-1253.

83. Field F.J., Born E., Mathur S.N. Effect of micellar beta-sitosterol on cholesterol metabolism in CaCo-2 cells // J. Lipid Res. 1997. - V. 38. - P. 348-360.

84. Ho S.S., Pal S. (2004). Phytosterols decrease the secretion of atherogenic lipoproteins from HepG2 liver and Caco2 intestinal cells // Asia Рас. J. Clin. Nutr. 2004. - V. 13. -P. 68.

85. Ho S.S., Pal S. Margarine phytosterols decrease the secretion of atherogenic lipoproteins from HepG2 liver and Caco2 intestinal cells // Atherosclerosis. 2005. -V. 182.-P. 29-36.

86. Vallett S.M., Sanchez H.B., Rosenfeld J.M., Osborne T.F. A direct role for sterol regulatory element binding protein in activation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase gene // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 12247-12253.

87. Brown M.S., Goldstein J.L. A proteolytic pathway that controls the cholesterol content of membranes, cells and blood // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - P. 11041-11048.

88. Brown M.S., Goldstein J.L. The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor // Cell. 1997. - V. 89. - P. 331-340.

89. Sato Y., Nishikawa K., Aikawa K., Mimura K., Murakami-Murofushi K., Arai H., Inoue K. Side-chain structure is critical for the transport of sterols from lysosomes to cytoplasm // Biochim. Biophys. Acta. 1995. - V. 1257. - P. 38-46.

90. Buhman K.F., Accad M., Farese R.V. Mammalian acyl-CoA:cholesterol acyltransferases // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - V. 1529. - P. 142-154.

91. Smith J.L., Rangaraj К., Simpson R., McLean, D J., Nathanson L.K., Stuart K.A., Scott S.P., Ramm G.A., de Jersey J. Quantitative analysis of expression of ACAT genes in human tissues by real-time PCR // J. Lipid Res. 2004. - V. 45. - P. 686-696.

92. Laraki L., Pelletier X., Mourot J., Debry G. Effects of dietary phytosterols on liver lipids and lipid metabolism enzymes // Ann. Nutr. Metab. 1993. - V. 37. - P. 129133.

93. Tamura M., Suzuki H., Itoh K. Effect of beta-sitosterol on ultrastructure of liver cells in young and aged mice // Int. J. Vitam. Nutr. Res. 1998. - V. 68. - P. 146-148.

94. Awad A.B., Smith A.J., Fink C.S. Plant sterols regulate rat vascular smooth muscle cell growth and prostacyclin release in culture // Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 2001. - V. 64. - P. 323-330.

95. Awad A.B., Chen Y.C., Fink C.S., Hennessey T. beta-Sitosterol inhibits HT-29 human colon cancer cell growth and alters membrane lipids // Anticancer Res. — 1996. V. 16. -P. 2797-2804.

96. Awad A.B., von Holtz R.L., Cone J.P., Fink C.S., Chen Y.C. beta-Sitosterol inhibits growth of HT-29 human colon cancer cells by activating the sphingomyelin cycle // Anticancer Res. 1998.-V. 18.-P. 471-473.

97. Awad A.B., Downie A.C., Fink C.S. Inhibition of growth and stimulation of apoptosis by beta-sitosterol treatment of MDA-MB-231 human breast cancer cells in culture // Int. J. Mol. Med. 2000. - V. 5. - P. 541-545.

98. Awad A.B., Roy R., Fink C.S. beta-Sitosterol, a plant sterol, induces apoptosis and activates key caspases in MDA-MB-231 human breast cancer cells // Oncol. Rep.2003.-V. 10.-P. 497-500.

99. Awad А.В., Gan Y., Fink C.S. Effect of beta-sitosterol, a plant sterol, on growth, protein phosphatase 2A, and phospholipase D in LNCaP cells // Nutr. Cancer. 2000. -V. 36. P. 74-78.

100. Awad A.B., Burr A.T., Fink C.S. Effect of resveratrol and beta-sitosterol in combination on reactive oxygen species and prostaglandin release by PC-3 cells // Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 2005. - V. 72. - P. 219-226.

101. Choi Y.S., Goto S., Ikeda I., Sugano M. Effect of dietary n-3 polyunsaturated fatty acids on cholesterol synthesis and degradation in rats of different ages // Lipids. 1989. -V. 24.-P. 45-50.

102. Jia X., Ebine N., Wang Y., Awad A.B., Jones P.J. Effects of different phytosterol analogs on colonic mucosal cell proliferation in hamsters // J. Nutr. Biochem. 2006. -V. 17.-P. 396-401.

103. Baginski M., Resat H., Borowski E. Comparative molecular dynamics simulations of amphotericin B-cholesterol/ergosterol membrane channels // Biochim. Biophys. Acta. -2002.-V. 1567.-P. 63-78.

104. Onda M., Inoue Y., Kawabata M., Mita T. Susceptibilities of phospholipid vesicles containing different sterols to amphotericin B-loaded lysophosphatidylcholine micelles // J. Biochem. (Tokyo). 2003. - V. 134. - P. 121-128.

105. Hac-Wydro K., Dynarowicz-Latka P., Grzybowska J., Borowski E. Interactions of amphotericin В derivative of low toxicity with biological membrane components—the Langmuir monolayer approach // Biophys. Chem. — 2005. V. 116. - P. 77-88.

106. Plat J., Brzezinka H., Lutjohann D., Mensink R.P., von Bergmann K. Oxidized plant sterols in human serum and lipid infusions as measured by combined gas-liquid chromatography-mass spectrometry // J. Lipid Res. 2001. - V. 42. - P. 2030-2038.

107. Boberg K.M., Lund E., Olund J., Bjorkhem I. Formation of C21 bile acids from plant sterols in the rat // J. Biol. Chem. 1990. - V. 265. - P. 7967-7975.

108. Boberg K.M, Skrede В., Skrede S. Metabolism of 24-ethyl-4-cholesten-3-one and 24-ethyl-5-cholesten-3 beta-ol (sitosterol) after intraperitoneal injection in the rat // Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1986. -V. 184. - P. 47-54.

109. Boberg K.M., Einarsson K., Bjorkhem I. Apparent lack of conversion of sitosterol into C24-bile acids in humans//J. Lipid Res. 1990.-V. 31.-P. 1083-1088.

110. Adcox, C., Boyd, L., Oehrl, L., Allen, J., Fenner, G.J. Comparative effects of phytosterol oxides and cholesterol oxides in cultured macrophage-derived cell lines // Agric. Food Chem. 2001. - V. 49. - P. 2090-2095.

111. Macias F.A., Chinchilla N., Varela R.M., Molinillo J.M. Bioactive steroids from Oryza sativa L. II Steroids. 2006. - V. 71. - P. 603-608.

112. Bok J.W., Lermer L., Chilton J., Klingeman H.G., Towers G.H. Antitumor sterols from the mycelia of Cordyceps sinensis П Phytochemistry. 1999. - V. 51. - P. 891-898.

113. Kaneko E., Matsuda M., Yamada Y., Tachibana Y., Shimomura I., Makishima M. Induction of intestinal ATP-binding cassette transporters by a phytosterol-derived liver X receptor agonist // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - P. 36091-36098.

114. Wilson W.K., Wang K.-S., Kisic A., Schroepfer G.J. Concerning the chemical synthesis of 3p-hydoxy-5a-cholest-8( 14)-en-15-one, a novel regulator of cholesterol metabolism // Chem. Phys. Lipids 1988. - V. 48. - P. 7-17.

115. Markwell M.A.K., Haas S.M., Bieber L.L., Folbert N.E. A modification of the Lowry procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples // Analyt. Biochem. 1978. -V. 87. - P. 206-211.

116. Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T., Mallia A.K., Gartner F.H., Provenzano M.D., Fujimoto E.K., Goeke N.M., Olson B.J., Klenk D.C. Measurement of protein using bicmchoninic acid // Anal. Biochem. 1985. -V. 150. - P. 76-85.

117. Стероиды / P. Полюдек-Фабини, Т. Бейрих / Органический анализ. JI. : Химия, 1981.-С. 434-438.

118. Mosmann Т. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. Meth. 1983. - V. 65. - P. 55-63.

119. Goldstein J.L., Basu S.K., Brown M.S. Receptor-mediated endocytosis of low-density lipoprotein in cultured cells // Methods Enzymol. 1983. - V. 98. - P. 241-260.

120. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroforme extraction // Analyt. Biochem. — 1987. — V. 162. — P. 156-159.

121. Cheng D, Chang CC, Qu X, Chang T.Y. Activation of acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase by cholesterol or by oxysterol in a cell-free system // J. Biol. Chem. —1995.-V. 270.-P. 685-695.

122. Robe P. A., Nguyen-Khac M., Jolois O., Rogister В., Merville M.-P., Bours V. Dexamethasone inhibits the HSV-tk/ ganciclovir bystander effect in malignant glioma cells // BMC Cancer (online). 2005. - V. 5, № 32. - P. 1-11.

123. Baratta M., Grolli S., Poletti A., Ramoni R., Motta M., Tamanini C. Role of androgens in proliferation and differentiation of mouse mammary epithelial cell line HC11 // J. Endocrynol. 2000. - V. 167. - P. 53-60.

124. Adcox C., Boyd L., Oehrl L., Allen J., Fenner G.J. Comparative effects of phytosterol oxides and cholesterol oxides in cultured macrophage-derived cell lines // Agric. Food Chem. 2001. - V. 49. - P. 2090-2095.

125. O'Callaghan Y.C., Woods J.A., O'Brien, N.M. Comparative study of the cytotoxicity and apoptosis-inducing potential of commonly occurring oxysterols // Eur. J. Nutr. -1999.-V. 3.-P. 127-137.

126. Hall, M.C. The effect of oxysterols, individually and as a representative mixture from food, on in vitro cultured bovine ovarian granulosa cells // Mol. Cell. Biochem. 2006. -V. 293.-P. 1-11.

127. Beattie M.E., Veatch S.L., Stottrup B.L., Keller S.L. Sterol structure determines miscibility versus melting transitions in lipid vesicles // Biophys. J. 2005. - V. 89. -P. 1760-1768.

128. Massey J.B., Pownall H.J. The polar nature of 7-ketocholesterol determines its location within membrane domains and the kinetics of membrane microsolubilization by apolipoprotein A1 // Biochemistry. 2005. - V. 44. - P. 10423-10433.

129. Massey J.B., Pownall H.J. Role of oxysterol structure on the microdomain-induced microsolubilization of phospholipid membranes by apolipoprotein a-i // Biochemistry -2005. V. 44. - P. 14376-14384.

130. Massey J.B., Pownall H.J. Structures of biologically active oxysterols determine their differential effects on phospholipid membranes // Biochemistry. 2006. - V. 45. - P. 10747-10758.

131. Schroepfer G.J., Parish E.J., Chen II. W., Kandutseh A.A. Inhibition of sterol biosynthesis in L cells and mouse liver cells by 15-oxygenated sterols // J. Biol. Chem. 1977. - V. 252. - P. 8975-8980.

132. Miller L.R., Pajewski T.N., Schroepfer G.J. Inhibitors of sterol synthesis. Studies of in vitro effects of C27 15-oxygenated sterols on sterol synthesis in cell free homogenates of rat liver // J. Biol. Chem. 1982. - V. 257. - P. 2412-2419.

133. Пийр E.A., Игнатов Д.В., Медведева H.B., Мишарин A.IO. Превращение ЗР-(2-гидроксиэтокси)-5а-холест-8(14)-ен-15-она в полярный метаболит в клетках гепатомы Hep G2 // Биоорган, химия. 2003. - V. 29. - Р. 648-654.

134. Izzo I., De Riccardis F., Sodano G. Synthesis of (25R)-5a-Cholestane-3p,6p, 15a, 16p,26-pentol, a Cytostatic Starfish Steroid // J. Org. Chem. 1998. -V. 63. - P.4438-4443.

135. Rogers L.L., Zeng L., McLaughlin G.L. New bioactive steroids from Melia volkensii II J. Org. Chem. 1998. -V. 63. - P. 3781-3785.

136. Misharin A.Yu., Kisseleva A.F., Alquier C., Shatalov N.A. New 3-substituted A8(14)-15-ketosterols. Chemical synthesis and effects on cholesterol biosynthesis in Hep G2 cells // Med. Chem. Res. 1999. - V. 9. - P. 61-68.

137. Киселева А.Ф., Горюнова JI.E., Медведева H.B., Алки К., Мишарин А.Ю. Влияние ЗР-замещенных А8(14)-15-кетостеринов на метаболизм холестерина в клетках гепатомы Hep G2 // Биохимия. 1999. - V. 64. - Р. 456-463.

138. Russel D.W. The enzymes, regulation and genetics of bile acid synthesis // Annu. Rev. Biochem. 2003. - V. 72. - P. 137-174.

139. Chiang J.Y. Bile acid regulation of hepatic physiology: III. Bile acids and nuclear receptors // Am. J. Physiol. 2003. - V. 284. - P. 349-356.

140. Norlin M., von Bahr S., Bjorkhem I., Wikvall K. On the substrate specificity of human CYP27A1: implications for bile acid and cholestanol formation // J. Lipid. Res. 2003. -V. 44.-P. 1515-1522.

141. Araya Z., Tang W., Wikvall K. Hormonal regulation of the human sterol 27-hydroxylase gene CYP27A1 // Biochem. J. 2003. - V. 372. - P. 529-534.

142. Vallett S.M., Sanchez H.B., Rosenfeld J.M., Osborne T.F. A Direct role for Sterol Regulatory Element Binding Protein in activation of 3-Hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A Reductase gene // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 12247-12253.

143. Gong Y., Lee J.N., Brown M.B., Goldstein J.L., Ye J. Juxtamembranous aspartic acid in Insig-1 and Insig-2 is required for cholesterol homeostasis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2006.-V. 103.-P. 6154-6159.

144. Kisseleva A.F., Goryunova L.E., Planells R, Lafont H., Alquier C. HMG CoA reductase and LDL receptor genes are regulated differently by 15-Ketosterols in Hep G2 cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. - V. 259. - P. 688-694.

145. Miller S.C., Melnykovich G. Regulation of cholesterol biosynthesis and esterification by 25-hydroxycholesterol in a macrophage-like cell line: uncoupling by progesterone // J. Lipid Res. 1984. - V. 25. - P. 991-999.

146. Morin R.J., Peng S.K. Effects of cholesterol oxidation derivatives on cholesterol esterifying and cholesteryl ester hydrolytic enzyme activity of cultured rabbit smooth muscle cells // Lipids. 1992. - V. 27. - P. 478-480.

147. Kisseleva A.F. Goryunova L.E., Medvedeva N.V., Alquier C., Morozkin A.D., Misharin A.Yu. Distribution of exogeneous 25-hydroxycholesterol in Hep G2 cells between two different pools // FEBS Letters. 1999. - V. 446. - P. 163-168.

148. Cheng D., Chang C.C.Y., Qu X.-M., Chang T.Y. Activation of Acyl-Coenzyme A: Cholesterol Acyltransferase by cholesterol or by oxysterol in a cell free system // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 685-695.

149. Cadigan K.M., Chang T.Y. A simple method for reconstitution of CHO cell and human fibroblast acyl coenzyme A:cholesterol acyl transferase activity into liposomes // J. Lipid Res. 1988. - V. 29. - P. 1683-1692.

150. Phillips M.C., Johnson W.J., Rothblat G.H. Mechanisms and consequences of cellular cholesterol exchange and transfer // Biochim. Biophys. Acta. 1987. - V. 906. - P. 223-276.

151. Johnson W.J., Mahlberg F.H., Rothblat G.H., Phillips M.C. Cholesterol transport between cells and high density lipoproteins // Biochim. Biophys. Acta. 1991. — V. 1085.-P. 273-298.

152. Rothblat G.H., Mahlberg F.H., Johnson W.J., Phillips M.C. Apolipoproteins, membrane cholesterol domains and the regulation of cholesterol efflux // J. Lipid Res. 1992. - V. 33.-P. 1091-1097.

153. Schmitz G., Langmann T. Transcriptional regulatory networks in lipid metabolism control ABCA1 expression // Biochim. Biophys. Acta. 2005. - V. 1735. - P. 1-19.

154. Sabol S.L., Brewer H.B., Jr., Santamarina-Fojo S. The human ABCG1 gene: identification of LXR response elements that modulate expression in macrophages and liver//J. Lipid Res. -2005. V. 46. - P. 2151-2167.

155. Sporstol M., Mousavi S.A., Eskild W., Roos N., Berg T. (2007). ABCA1, ABCG1 and SR-BI: hormonal regulation in primary rat hepatocytes and human cell lines. BMC Molecular Biology (online). 2007. - V. 8, № 5. p. 1-8.

156. Xie W., Evans R.M. Orphan nuclear receptors: the exotics of xenobiotics // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - P. 37739-37742.

157. Xie W., Radominska-Pandya A., Shi Y., Simon C.M., Nelson M.C., Ong E.S., Waxman D.J., Evans R.M. An essential role for nuclear receptors SXR/PXR in detoxification of cholestatic bile acids // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V. 98. -P. 3375-3380.

158. Kliewer S.A. Cholesterol detoxification by the nuclear pregnane X receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V. 102. - P. 2675-2676.

159. Axon A., Cowie D.E., Mann D.A., Wright M.C. A mechanism for the anti-fibrogenic effects of the pregnane X receptor (PXR) in the liver: inhibition of NF-kB? // Toxicology. 2008. - V. 246. - P. 40-44.

160. Javitt N.B. Oxysterols: Novel biologic roles for the 21st century // Steroids. 2008. -V. 73.-P. 149-157.

161. Bjorkhem I. Rediscovery of Cerebrosterol // Lipids. 2007. - V. 42. - P. 5-14.

162. Leonarduzzi G., Biasi F., Chiarpotto E., Poli G. Trojan horse-like behavior of a biologically representative mixture of oxysterols // Mol. Asp. Med. 2004. - V. 25. -P. 155-167.

163. Vaya J., Schipper H.M. Oxysterols, cholesterol homeostasis, and Alzheimer disease // J. Neurochem. 2007. - V. 102. - P. 1727-1737.

164. Corcoran R.B., Scott M.P. Oxysterols stimulate Sonic hedgehog signal transduction and proliferation of medulloblastoma cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2006. - V. 103.-P. 8408-8413.

165. Особо хочу поблагодарить моих родителей Рамина Гасановича Мехтиева, Анну Гургеновну Мехтиеву, сестру Сабину Раминовну Ногину, друзей и коллег за их терпение, душевное тепло, поддержку и дружеское участие.

Информация о работе

Мехтиев, Ариф Раминович
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Биологическая активность новых оксигенированных производных стигмастана и эргостана в клетках Hep G2 и MCF-7 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы