Биохимические и иммунохимические свойства натрийуретического пептида В-типа и его предшественника

Тамм, Наталья Никитична

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биохимические и иммунохимические свойства натрийуретического пептида В-типа и его предшественника
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические и иммунохимические свойства натрийуретического пептида В-типа и его предшественника"

0046

.2034

На правах рукописи

TAMM НАТАЛЬЯ НИКИТИЧНА

БИОХИМИЧЕСКИЕ И ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА 11АТРИЙУРЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА B-ТИПА И ЕГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 1 НОЯ 2010

МОСКВА 2010

004612034

Работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Катруха Алексей Генрихович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Муронец Владимир Израилевич

доктор биологических наук, профессор Москалева Елизавета Юрьевна

Ведущая организация:

Московская Медицинская Академия имени И.М.Сеченова

Защита состоится 15 ноября 2010 года в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, д. 1, стр. 12, Биологический факультет, большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « » октября 2010 года Ученый секретарь диссертационного

совета, кандидат биологических наук

Медведева М.В.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Натрийуретический пептид В-типа (BNP) относится к семейству пептидных гормонов, сходных по структуре и участвующих в регуляции объема крови, кровяного давления и водно-солевого баланса организма. Помимо BNP, семейство натрийуретических пептидов (НП) включает в себя натрийуретический пептид А-типа (ANP) и натрийуретический пептид С-типа (CNP). Характерной особенностью НП является 17-ти членная кольцевая структура, образованная дисульфидной связью между двумя остатками цистеина. Одиннадцать из семнадцати аминокислотных остатков (а.к.о.) кольцевой структуры у всех представителей семейства НП идентичны, тогда как концевые фрагменты пептидов выраженной гомологии не имеют. BNP синтезируется кардиомиоцитами в форме предшественника, proBNPi-iog, состоящего из 108 а.к.о. Под действием специфической протеазы proBNP расщепляется на два фрагмента -физиологически активный С-концевой фрагмент (BNP77.108) и N-концевой фрагмент (NT-proBNP|.7f,), физиологическая активность которого к настоящему моменту не установлена. Все три пептида - BNP, NT-proBNP и proBNP присутствуют в кровотоке.

Концентрация BNP и NT-proBNP в крови здоровых доноров не превышает 60 и 200 пг/мл, соответственно. Однако при развитии сердечной недостаточности (СН) уровень синтеза и секреции BNP и NT-proBNP значительно увеличивается и может достигать 7-10 нг/мл в случае BNP и нескольких десятков нг/мл в случае NT-proBNP. СН - сложный клинический синдром, возникающий при нарушении сократительной способности сердца. Наиболее частой причиной СН является снижение способности левого желудочка (ЛЖ) к выбросу крови в аорту. В настоящее время СН является одним из наиболее распространенных осложнений сердечнососудистых заболеваний и оказывает существенное влияние на продолжительность и качество жизни пациентов. Клинические симптомы ранних стадий СН являются неспецифическими, что осложняет диагностику данного заболевания. В настоящее время важным инструментом для исключения СН и оценки дисфункции ЛЖ является определение уровня BNP (или NT-proBNP) с использованием иммунохимических диагностических систем. Применение диагностических систем, разрабатываемых на основе высокочувствительных методов иммуноанализа, использующих моноклональные антитела, является единственным возможным способом количественного определения пептидов, представленных в крови в столь низких концентрациях. Несмотря на широкое применение в клинической практике, до последнего времени практически ничего не было известно о биохимических особенностях BNP, обнаруживаемого в крови человека. Недостаточность знаний о пептиде связана, прежде всего, с его низкой концентрацией в крови и недостаточной

чувствительностью имеющихся в настоящее время методов исследования. Данные о том, в какой форме маркер существует в кровотоке, могут быть полезны как для разработки методов достоверного и надежного определения уровня пептида в крови больных, так и для решения более общих, фундаментальных задач - совершенствования существующей теории функционирования натрийуретических пептидов человека. Основной целью данной диссертационной работы было изучение биохимических и иммунохимических особенностей BNP человека и его предшественника proBNP с использованием такого высокочувствительного и высокоточного инструмента как моноклональные антитела. Моноклональные антитела, специфически взаимодействующие с различными эпитопами молекулы BNP, были получены в ходе выполнения данной работы.

Задачи исследования:

1. Получить и охарактеризовать набор моноклональных антител, специфически взаимодействующих с различными участками молекулы BNP человека.

2. Создать молекулярно-генетический конструкт для экспрессии рекомбинантного proBNP человека в клетках Е. coli. Разработать метод очистки препарата рекомбинантного proBNP.

3. На основе метода иммуноанализа сэндвич-типа разработать системы для количественного определения BNP и proBNP в образцах.

4. Исследовать биохимические и иммунохимические свойства BNP и его предшественника proBNP, присутствующих в крови больных с CH.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе выполнения данной работы впервые было показано, что вопреки существующей точке зрения концентрация предшественника BNP (proBNP) в крови больных с СН существенно выше, чем концентрация BNP. Так же установлено, что соотношение proBNP/BNP в крови варьирует у разных больных. Показано, что основная часть молекулы proBNP в крови больных гликозилирована. Показано, что гликозилирование молекулы proBNP на участке с 24-76 а.к.о. препятствует взаимодействию специфических антител с proBNP формой. Поэтому только антитела, специфически взаимодействующие с участком 13-24 молекулы NT-proBNP в комбинации с антителами, специфически взаимодействующими с участком 1123 или 26-32 молекулы BNP, могут быть использованы для создания системы дифференциального количественного определения молекулы предшественника proBNP. Экспериментально показано, что определение концентрации proBNP в крови больных с СН может иметь клиническую значимость. Эксперименты по изучению стабильности

BNP-иммунореактивных форм выявили, что BNP (синтетическая и эндогенная формы) нестабильны и подвергаются протеолитической деградации в плазме крови, в то время как эндогенная форма proBNP гораздо более устойчива к деградации. На основании полученных результатов нами впервые было предложено использовать гликозилированную форму proBNP, максимально соответствующую по иммунохимическим свойствам эндогенной форме proBNP, в качестве стабильного стандарта в системах для количественного определения BNP. Описанная нами низкая стабильность молекулы BNP позволила нам предположить, что в крови больных значительная часть BNP может присутствовать в виде протеолитических фрагментов. Мы показали, что иммунохимические методы, использующие антитела к С-концевому фрагменту пептида, недооценивают, иногда существенно, концентрацию BNP в образце, подтвердив тем самым предположение о наличии в крови значительного количества фрагментов молекулы BNP. Нами был разработан принципиально новый подход для количественного определения нестабильных молекул, таких как BNP. Предложенный нами иммунохимический метод является гораздо менее чувствительным к протеолитической деградации BNP, так как оба используемых в нем моноклональных антитела специфичны к одному и тому же небольшому и относительно устойчивому к протеолитической деградации фрагменту 11-23 молекулы BNP. Полученные данные могут найти практическое применение при разработке новых систем для количественного определения BNP в образце.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, на 34-м конгрессе Союза Европейских Биохимических Сообществ в 2009 году (Прага, Чехия), съездах Американской Ассоциации Клинической Химии в 2010 (Анахайм, США), в 2009 (Чикаго, США), в 2008 (Вашингтон, США), в 2007 (Сан-Диего, США) и в 2005 (Орландо, США) годах; на XXXI Конгрессе Клинической Химии Северных стран в 2008 году (Хельсинки, Финляндия); на четвертой Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения в 2008 году (Москва, Россия); на 17-м Европейском конгрессе Клинической Химии и Лабораторной Медицины в 2007 году (Амстердам, Голландия); на Международной конференции «Биотехнология и медицина» в 2006 году (Москва, Россия). Публикации. По теме диссертации было опубликовано 19 печатных работ, включая 5 статей в профильных журналах.

Структура и объем работы. Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты работы и их обсуждение, список цитированной литературы. Работа изложена на 140 страницах печатного текста, иллюстрирована 48 рисунками и 12 таблицами. Список цитированной литературы содержит 138 наименований.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Синтетические пептиды, соответствующие различным участкам последовательности BNP человека, были предоставлены профессором A.B. Ажаевым (Куопио, Финляндия). В работе использовали синтетический BNP человека компаний Bachem (Швейцария) и Peptide Institiute (Япония).

Рекомбинантный proBNP, экспрессированный в клеточной линии человека НЕК293 (чистота >98%) был любезно предоставлен компанией HyTest (Финляндия). Конъюгацию пептидов, соответствующих различным последовательностям молекулы BNP, с бычьим сывороточным альбумином (БС.А) проводили с использованием сукцинимидил-4-(№малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилата (SMCC) (Pierce, США). Конъюгацию молекулы BNP 1-32 с БСА проводили с использованием глутарового альдегида.

Экспрессия рекомбинантного proBNP. Экспрессию рекомбинантного proBNP осуществляли в клетках E.coli, штамм BL21(DE3). Компетентные клетки BL21(DE3) трансформировали плазмидой рЕТ23, содержащей вставку кДНК proBNP человека. Экспрессию белка индуцировали изопропил-р-О-тиогалактопиранозидом (IPTG) (1 мМ). Ионообменную хроматографию проводили, используя колонку, содержащую 1 мл карбоксиметил-сефарозы (HiTrap CM FF). Носитель уравновешивали 0.05 M Na-ацетатным буфером, pH 4.2, содержащим 0.1 M NaCl. Образец наносили со скоростью 1 мл/мин. Препарат proBNP элюировали линейным градиентом (от 0.1 до 0.4 M) NaCl. Электрофорез в трис-триииновой буферной системе проводили согласно методике описанной Шагер и фон Ягов (Schagger H. and von Jagow, 1987).

Сэндвич-иммунофосАоресиентный анапиз (сэндвич-ИФА). В лунки 96-ти луночного планшета вносили раствор антител (1 мкг/лунку) и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и постоянном перемешивании. После отмывки в лунки вносили образец и раствор антител (0.2 мкг/лунку), конъюгированных с фосфоресцентной меткой (стабильным хелатом европия). Планшеты инкубировали при тех же условиях. После отмывки в лунки вносили раствор усиления, инкубировали в течение 3 мин и измеряли фосфоресценцию на приборе Victor 1420 Multilabel Counter (Wallac-PerkinElmer, Финляндия).

Экстракцию BNP и proBNP га образцов плазмы крови больных с СН проводили с использованием картриджей Sep-Pak Cl8 (Millipore-Waters, США), как описано Shimizu H. и соавторами (Shimizu H. et al, 2002). Образец плазмы (2 мл) смешивали с 20 мл 1 M HCl, инкубировали на льду в течение 10 мин. После чего образец центрифугировали при 10000g в течение 10 минут, полученный супернатант пропускали через картридж,

предварительно промытый 5 мл метанола и 5 мл 0,1% водного раствора трифторуксусной кислоты (ТФУ). Пептиды элюировали 2 мл 0,1% раствора ТФУ в 90% метаноле. Элюаты высушивали в вакуумном эвапораторе Mini DNA (Heto Lab Equipment, Дания). Гелъ-Фильтпаиия. На колонку Superdex 75 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенную 0.1 M Na-фосфатным буфером, рН 7.4, содержащим 0.3 M NaCl и 0.005 M ЭДТА, наносили 150 мкл образца. Элюцию проводили тем же буфером при скорости протока 0.8 мл/мин.

Получение Fab-фрдгментов антител 24С5. Fab-фрагменты молекул антител получали при проведении реакции ферментативного расщепления антител под действием папаина в 0.1 M Na-ацетатном буфере, рН 5.5 при температуре 37°С течение 16 часов. Используемое соотношение фермент : субстрат составило 1:100.

Конъюгирование Fab-фрдгментов антител 24С5 с синтетическим BNP проводили в буфере, содержащем 50 мМ HEPES, рН 7.4, 150 мМ NaCl с использованием 1-этил -3-(3-диметиламинопрогтил) карбодиимида гидрохлорида (EDC) и N-гидроскисульфосукцинимида. Молярное соотношение Fab 24C5:BNP составляло 1:10. Масс-спектрометрический анатз был выполнен в ЗАО "ПИННИ" на тандемном MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Ultratlex IIBRUKER (Германия).

Результаты и их обсуждение

Получение моноклональных антител, специфичных к BNP человека

Первый этап работы был посвящен получению и исследованию моноклональных антител, которые на дальнейших этапах работы планировали использовать в качестве инструмента для изучения свойств эндогенных BNP и proBNP. Для иммунизации мышей линии Balb/C был использован как полноразмерный BNP (1-32), так и набор синтетических пептидов, перекрывающих всю последовательность BNP человека (пептиды 1-10, 11-23, 17-26, 26-32 а.к.о.). Фрагменты 1-10 и 26-32 молекулы BNP представлены уникальными последовательностями и не имеют гомологичных участков с молекулами ANP или CNP (Рис.1).

Отбор гибридом проводили, используя разработанный нами метод тестирования на основе иммуноанализа сэндвич-типа, где в качестве подложки использовали смесь моноспецифических поликлональных кроличьих антител, специфичных к различным эпитопам молекулы BNP, исключая антитела, узнающие предполагаемый эпитоп исследуемых антител.

ANP (28а.к.о.) ,SLRRSSCFGGRMÛ/?/GAQ.W/.GOnSFRY2S

BNP (32a.к.о.) jSPKMVQGSGCFGRKMDS/SSSSGLGCKVLRRHjî

CNP (22а.к.о.) iGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC22 r.

11 17_23 26

1 10 ■

SPKMVQGSGCFGRKMOK/SSSSGZ-GCKVLRRH

I-s_s_PS S

Рис. 1. A - Аминокислотные последовательности НП: ANP, BNP, CNP. Полужирным курсивом выделены a.к.о, гомологичные для всех трех представителей семейства НП. Б - Аминокислотная последовательность BNP. Линиями обозначены пептиды, использовавшиеся в качестве иммуногенов при получении моноклональных антител.

Для того чтобы отобрать гибридомы, продуцирующие антитела, способные взаимодействовать с молекулой BNP, необходимо было использовать BNP в качестве антигена. Однако, в случае сорбции небольшого пептида, состоящего из 32 а.к.о. на поверхность планшета, не исключена вероятность того, что некоторые эпитопы молекулы окажутся недоступными для антител. Таким образом, использование поликлональных антител было необходимо для обеспечения доступности всех возможных эпитопов небольшой молекулы BNP для тестируемых антител. Клетки отобранных гибридом дважды реклонировали для получения стабильных клеточных линий, продуцирующих моноклональные антитела (МАт). Наработку необходимого количества МАт осуществляли в асцитной опухоли сингенных мышей. Очистку МАт проводили с использованием Protein А-сефарозы. В ходе работы было получено 48 стабильных клеточных линий, продуцирующих МАт, специфичные к BNP человека. Из них 1 МАт узнавало пептид 1-10,4 МАт - пептид 11-23,43 МАт - полноразмерный пептид BNP 1-32.

Для определения эпитопной специфичности МАт, полученных в результате гибридизации клеток миеломы со спленоцитами мышей, иммунизированных полноразмерным пептидом BNP 1-32, исследовали способность антител взаимодействовать с синтетическими пептидами 1-10, 11-23, 17-26, 26-32, конъюгированными с овальбумином. Из 43 протестированных МАт 31 МАт специфически взаимодействовало с пептидом 26-32, 1 МАт - с пептидом 17-26, специфичность 11 МАт определить не удалось (Рис.2).

Результаты эпитопного картирования продемонстрировали, что на первом этапе работы нами был получен набор МАт, с эпитопами, расположенными вдоль всей последовательности молекулы BNP.

22С2 24С5 26В5 26Е2

7F5. 2G9, 42F11, 42G8, 44C5, 47C11, 4TD5, 49E7, 59A2, 5F3, 5F9

SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH

261

Рис. 2. Детализированная эпитопная карта полученных в ходе работы антител. Для

антител, выделенных синим цветом, эпитопы не были определены.

1В5, 1В6,1G4, 10В5, 29D11, 203, 2G6.33D9, ЗС9, 41А6, 43В12. 47В1. 48Н7, 48Е6, 4А8, 4Н10, 50В7, 50G12, 50Е1. 50Е6. 52В9, 53Е5, 54Н8, 56Н4, 57G2, 57Н11, 57Н6, 57НЗ, 58D5, 61D4, 7F12

Разработка системы для количественного определения BNP

При создании системы для количественного определения BNP был использован принцип иммунофосфоресцентного анализа сэндвич-типа (сэндвич-ИФА) (Рис.3).

Рис. 3. Принцип метода сэндвич-ИФА. Антитела, специфичные к исследуемому антигену, иммобилизуются на поверхности планшета (антитела подложки), после чего к ним добавляется антиген. Между антигеном и антителами подложки образуется первичный иммунный комплекс. Далее в лунки вносят антитела, специфичные к другому эпитопу исследуемого антигена (детекторные антитела). Детекторные антитела конъюгированы с какой-либо меткой (в данном случае со стабильным хелатом европия) и служат для выявления первичного иммунного комплекса. Регистрируемый фосфоресцентный сигнал прямо пропорционален концентрации антигена.

Детекторные антитела

Антиген

Антитела подложки

777777777777777

Все полученные МАт были протестированы как в роли антител подложки, так и в роли детекторных антител. В качестве антигена использовали синтетический BNP или объединенную сыворотку больных с СН, служившую источником эндогенного BNP. Было протестировано более 3500 комбинаций антител. В результате тестирования было выявлено, что большая часть МАт, специфичных к эпитопу 26-32 и МАт, эпитоп которых определен не был, способны образовывать «сэндвич» с антителами, специфичными к эпитопу 11-23, и синтетическим антигеном. Однако среди них только четыре системы, образованные антителами, специфичными к эпитопам 11-23 и 26-32 молекулы BNP, были способны детектировать BNP в крови больных с СН (Табл.1). Системы, использующие антитела, специфичные к эпитопам 1-10 и 17-26, не образовывали «сэндвич» ни с синтетической, ни с эндогенной формой BNP. Из четырех систем, способных узнавать эндогенный пептид, мы выбрали одну, где МАт 50ЕЬб-32 использовали в качестве иммобилизованного на планшет, а МАт 24С5ц.2з - в качестве детекторного. Такая комбинация антител с одинаково высокой чувствительностью детектировала

синтетический и эндогенный антигены. Систему 50ЕЬб-32 - 24С5ц.2з использовали в дальнейших исследованиях в качестве контрольной, способной детектировать наибольшее количество эндогенного BNP в образце плазмы больного. Чувствительность данной системы составила 0.5 пг/мл.

Таблица 1. Взаимодействие МАт различной эпитопной специфичности с синтетическим и эндогенным BNP в сэндвич-ИФА.

Детекто рные антитела« эпитоп)

11-23 26-32 не определен

синт BNP эндог BNP синт BNP ЭЦЦОГ BNP синт BNP эндог BNP

Антитела подложки (эпитоп) 11-23 - - + + + -

26-32 + + - - - -

неопределен + - - - - -

Получение и очистка рекомбинантного proBNP, экспрессированного в клетках Escherichia coli (Е. coli).

В задачи данной работы входило получение рекомбинантной формы proBNP (rproBNP) для исследования био- и иммунохимических свойств этого белка как предшественника BNP. Для проведения экспрессии rproBNP была создана молекулярно-генетическая конструкция на основе векторной системы рЕТ23, содержащая вставку кДНК proBNP человека. Бактериальную экспрессию rproBNP осуществляли в клетках Е. coli штамма BL21(DE3). RproBNP экспрессировался в растворимой форме и был локализован в цитоплазме бактериальных клеток. Очистку rproBNP проводили в две стадии. На первом этапе был применен метод иммуно-аффинной хроматографии с использованием носителя на основе сефарозы с иммобилизованными антителами 24С5ц-2з и 5OEI26-32, специфичными к BNP части молекулы proBNP. Дополнительную очистку белка проводили, используя метод ионообменной хроматографии на колонке, содержащей карбоксиметил-сефарозу (Рис.4А). Чистота полученного препарата rproBNP составляла >98%, что было достаточно для использования rproBNP в дальнейших исследованиях.

В молекуле эндогенного proBNP SH-группы остатков Cys86 и Cysl02 замкнуты между собой дисульфидной связью. Соответствие молекулярной массы полученного rproBNP теоретической массе proBNP, содержащему дисульфидный мостик между остатками цистеина в 86 и 102 положениях, было показано с использованием метода MALDI масс-спектрометрии (Рис.4Б).

Рис. 4. А - Трис-трициновый электрофорез рекомбинантного proBNP, экспрессированпого в клетках

Е. coli. На дорожки геля нанесено: I - стандарты молекулярных весов; 2 - /proBNP, после проведения иммуно-аффинной хроматографии, 6 мкг; 3 - rproBNP, после проведения ионообменной хроатографии, 3 мкг; Б - Масс-спектрометрический анализ полученного препарата rproBNP. Теоретически рассчитанное значение [М+Н+] proBNP 12036.1 Да.

При сравнении иммунореактивности /proBNP и синтетического BNP в системе 50Е126.з2 - 24С5ц.2з было показано, что данная система с одинаковой эффективностью взаимодействует с обеими молекулами (Рис. 5). Таким образом, мы показали, что система 50Е126-з2-24С5п_2з может быть использована для детекции как BNP, так и proBNP.

0.0001 0.001 0.01 0,1 1 10 100 Концентрация антигена, нмоль/л

Рис. 5. Калибровочный график для системы 50Е126-з2-24С5ц.2з-

Антигены:

♦ - синтетический ВЫР, А - рекомбинантный ргоВ№ (Е.соЧ). Время инкубации: 30 мин

Анализ BNP-иммунореактивных форм в крови больных с CH.

До последнего времени в литературе имелись весьма противоречивые данные о количестве и соотношении BNP-иммунореактивных форм (BNP и его предшественника) в крови. Согласно большинству исследований превалирующей формой является BNP, и лишь некоторые публикации свидетельствуют о возможном преобладании proBNP. Достоверная информация о концентрации и соотношении в крови двух пептидов - BNP и его предшественника, важна и для лучшего понимания процесса образования BNP из

proBNP, и для понимания механизма действия BNP. Следующий этап работы был посвящен исследованию этого вопроса.

Образцы индивидуальной плазмы семи больных с СН наносили на гель-фильтрационную колонку Superdex 75, позволяющую разделять пептиды и белки с молекулярной массой от 3 до 70 кДа. В полученных фракциях анализировали BNP-иммунореактивность. Результаты измерений представлены на Рис. 6.

35 30

к- п ю о" "l

II П I

Образцы пшэмы:

BNP сингет»№ский

Рис. 6. BNP-иммунореактивность, измеренная во фракциях после разделения белков плазмы крови пяти больных с СН методом гель-фильтрации на колонке Superdex75 10/300 GL. Для детекции BNP-иммунореактивности использовали систему 50Е12б-з2-24С5 п-23. Стрелками показано положение стандартов

молекулярных масс. Пунктирной линией показан пик

иммунореактивности синтетического BNP.

Номер фракции

Как видно из Рис.6 во всех образцах наблюдалось два пика иммунореактивности. Максимум иммунореактивности основного пика находился в области белков с молекулярной массой = 37 кДа, тогда как меньший пик был отмечен в области белков с молекулярной массой 4-6 кДа. Как было отмечено выше, система 50Е126-з2-24С5ц.2з способна с одинаковой эффективностью взаимодействовать и с BNP, и с proBNP. Мы предположили, что пик иммунореактивности, соответствующий белкам с большей молекулярной массой принадлежит proBNP, а второй пик - BNP. Молярное соотношение proBNP/BNP в семи исследуемых индивидуальных образцах плазмы составило от 1.8 до 10.8 (среднее 6.3). Таким образом, было показано, что: 1) в образцах крови больных с СН основной формой BNP-иммунореактивности является proBNP; 2) соотношение BNP-иммунореактивных форм отличается у разных пациентов.

Полученные в работе данные противоречили данным, представленным в большинстве публикаций на эту тему. Согласно большинству исследований именно BNP (а не proBNP) является превалирующей формой BNP-иммунореактивности в крови больных. Как показал анализ проведенных ранее исследований, в них также был использован метод гель-фильтрации. Однако перед нанесением образца на гель-фильтрационную колонку проводилось обязательное предварительное концентрирование пептидов и белков плазмы крови с использованием обратно-фазовой хроматографии на

носителе С18. Стадия концентрирования была необходима, так как чувствительность используемых методов иммуноанализа была недостаточной для детекции исследуемых пептидов во фракциях после проведения гель-фильтрации. Традиционно применяемый подход был использован нами в качестве контрольного при изучении BNP-иммунореактивных форм в крови больных. Мы сравнивали содержание обоих пептидов в исходных образцах плазмы и в тех же образцах плазмы после проведения экстракции (концентрирования) белков на картриджах Sep-Pak С18. Проведенные нами исследования показали, что в процессе концентрирования на носителе С18 происходит существенная потеря (до 75 %) (Табл. 2) proBNP, и это приводит к тому, что исследуемый препарат обогащается фракцией BNP. Разработанный нами высокочувствительный метод детекции BNP и proBNP позволил избежать стадии предварительного концентрирования белков плазмы и, таким образом, позволил определить истинное содержание (и соотношение) BNP-иммунореактивных форм в образцах плазмы крови.

На основании полученных данных можно заключить, что proBNP, а не BNP, как считалось ранее, является превалирующей формой BNP-иммунореактивности в крови больных.

Таблица 2. Соотношение proBNP/BNP в образцах плазмы больных с СН до и после экстракции на картриджах Sep-Pak С18.

Образец плазмы 1 2 3 4 5 6 7

Соотношение

proBNP/BNP 3.9 7.8 1.8 4.2 4.7 10.6 10.8

до экстракции

Соотношение proBNP/BNP после экстракции на CIS 3 0.7 1.3 0.3 2.5 1.7 1.09

Исследование иммунохимических свойств эндогенного ргоВОТ

Следующий этап нашей работы был посвящен исследованию иммунохимических свойств молекулы-предшественника ВЫР - ргоВЫР, в крови больных с СН. В работе были использованы четырнадцать «сэндвич» систем, использующие антитела, специфичные к эпитопам, расположенным вдоль всей последовательности молекулы ргоВЫР. Четырнадцать МАт, специфичных к участкам 1-12, 13-24, 31-39, 46-56, 63-76 молекулы ргоВОТ, полученные и охарактеризованные в нашей лаборатории, были использованы в качестве иммобилизованных антител. МАт 24С5В7-уу (специфичное к участку 11-23 молекулы ВЫР или участку 87-99 молекулы ргоВОТ, соответственно) использовали в качестве детекторного антитела, так как было показано, что МАт 24С5 способно взаимодействовать с эндогенным ргоВ№ с высокой эффективностью. В качестве антигена

использовали препарат rproBNP (Е. coli) и объединенную плазму больных с СН,

служившую источником эндогенного ргоВЫР. В ходе тестирования было установлено, что все комбинации антител узнают гргоВОТ. Однако с эндогенным ргоВ№ с высокой эффективностью взаимодействовали только те системы, в которых иммобилизованное антитело было специфично к Ы-концевому фрагменту молекулы ргоВОТ (участок 5-24) (Рис.7). Детектируемый сигнал был значительно ниже, когда антитело было специфично к пептиду 63-76. В случае если иммобилизованные антитела были специфичны к участку 31-56, сигнал практически отсутствовал. Результаты исследования иммунореактивности эндогенного ргоВЫР представлены на Рис.7.

Рис. 7. Сравнение

иммунореактивности эндогенного ргоВ№ и гргоВ№ с использованием метода сэндвич-

ИФА. Результаты представлены как соотношение иммунохимической активности ргоВОТ в образце плазмы к активности, измеренной в образце, содержащем тргоВИР в такой же концентрации. За 100% принято соотношение, полученное в системе Ш413-;4-24С5»7.99. По оси ОХ указаны антитела,

иммобилизованные на планшет и их эпитопы. В качестве детекторных использовали антитела 24С587.99.

Иммобилизованные антитепа Детекторные октете л a 24CS „.¡в Детеюорные антитела 24CS »7.99

Полученные результаты отчасти противоречили данными, полученными ранее в нашей лаборатории. Сеферян К.P. (Seferian et al. 2008) показала, что центральный участок эндогенного NT-proBNP недоступен (из-за гликозилирования) для взаимодействия с антителами, однако антитела, специфичные к эпитопу 63-76, были способны взаимодействовать с фрагментом 63-76 молекулы NT-proBNP. Мы предположили, что плохое узнавание антителами эпитопа 63-76 proBNP формы так же связано с наличием гликозилирования на данном участке. Однако открытым оставался вопрос, почему такое гликозилирование отсутствует в молекуле NT-proBNP. Позднее наше предположение о гликозилировании участка 63-76 proBNP было подтверждено Семеновым А.Г. (Semenov et al. 2009). В исследовании Семенова А.Г. было показано, что, действительно, у части экспрессируемых молекул proBNP участок 63-76 может быть гликозилирован, и гликозилирование данного участка играет ключевую роль в процессинге proBNP. Было установлено, что гликозилирование фрагмента 63-76 препятствует ферментативному расщеплению proBNP на BNP и NT-proBNP, что может объяснять наличие значительного количества предшественника в кровотоке.

Создание системы для дифференциальной детекции proBNP

Результаты исследований, демонстрирующие, что основной формой BNP-иммунореактивности в крови является proBNP, позволили предположить, что дифференциальная детекция proBNP может иметь диагностическую и прогностическую значимость. Как отмечалось выше, знание биохимических особенностей исследуемой молекулы лежит в основе правильного выбора антител для создания систем детекции. Результаты, полученные на первом этапе работы, продемонстрировали, что гликозилирование большей части молекулы proBNP препятствует ее узнаванию антителами. Только антитела, специфичные к эпитопу 13-24 эффективно узнавали N-терминальный фрагмент молекулы.

Антитела, специфичные к эпитопу 13-24 были протестированы в сэндвич-ИФА попарно с антителами, специфичными к эпитопам 87-99 и 102-108. Для дальнейшей работы была выбрана система, в которой антитело 50Е1 юг-юз используется в качестве иммобилизованного на планшет, а антитело 16F3b-24 - в качестве детекторного. Такая система одинаково эффективно узнавала рекомбинантную и эндогенную формы proBNP. Чувствительность разработанной нами системы для детекции proBNP в образце составила 3 пг/мл. Такой чувствительности было достаточно для исследования proBNP в образцах плазмы крови больных с СН без применения стадии предварительного концентрирования.

Для того чтобы оценить клиническую значимость дифференциального определения proBNP была исследована взаимосвязь между результатами, полученными при определении BNP-иммунореактивности в системе 50Е12б.з;-24С5ц-2з и proBNP-иммунореактивности в системе 50Е1 io2-u)8-16F3i3-24 в 46 образцах плазмы больных с CH. В качестве стандарта в обеих системах был использован rproBNP. Между двумя исследуемыми антигенами была обнаружена высокая степень корреляции (г = 0.98) (Рис.8). Значения молярной концентрации BNP, полученные в системе 50Е126-32-24С5ц.2з превышали значения концентрации proBNP, полученные в системе 50Е1102-108-I6F313-24 в среднем в 1.5 раза (от 0.8 до 3.6 раз). Количество BNP, детектируемое в системе 50ЕЬг,.з2 -24С5ц-2з, видимо, вносит несущественный вклад (в среднем 25%) в определение суммарной BNP-иммунореактивности (BNP + proBNP) в образце. Таким образом, полученные результаты могут свидетельствовать в пользу того, что дифференциальное определение концентрации proBNP в крови больных может иметь такое же клиническое значение, как и определение BNP-иммунореактивности.

Рис. 8. Корреляция результатов измерения концентрации proBNP и BNP в 46 образцах плазмы больных с СП.

о 1000

у »0.6952« ra = 0,9511

п.

600

♦

Концентрации были измерены в системах 50Е1 io2-ios-16F3 13.24

Q.Î 600

и 50ЕЬ(,.и-24С5ц.2з (калибратор rproBNP).

— 400

о -,_

Пунктирной линией на графике отмечена линия равных концентраций, также приведена линия регрессии.

200 400 600 800 1000 1200 Концентрация BNP, пмоль/л (50Е1-24С5)

Исследование стабильности BNP и proBNP

В работах, посвященных исследованию стабильности BNP, отмечалось, что синтетический BNP, растворенный в плазме здоровых доноров, демонстрирует крайне низкую стабильность. В то же время было показано, что BNP в плазме больных обладает гораздо большей стабильностью. Этот парадокс долгое время оставался без объяснения.

Опираясь на данные, полученные в описанных выше исследованиях, мы предположили, что, если proBNP, как превалирующая в крови форма, обладающая BNP иммунореактивностью, имеет более высокую стабильность, чем BNP, то и наблюдаемая «общая» стабильность должна быть более высокой. Для проверки этой гипотезы нами было проведено сравнительное исследование стабильности эндогенных BNP и proBNP, выделенных из объединенной плазмы больных с CH.

BNP и proBNP были экстрагированы из объединенной плазмы методом иммуно-аффшшой хроматографии. В качестве аффинного носителя была использована сефароза с иммобилизованными на ней МАт 24С5ц.2з и 50ЕЬб-з2. Затем проводили разделение proBNP и BNP, используя иммуно-аффинный носитель, содержащий МАт, специфические к N-концевой части proBNP (МАт 13G12i3.2o). При нанесении смеси форм (BNP+proBNP) на иммуно-аффинный носитель с иммобилизованными на нем МАт 13G12, специфичными к участку 13-20 молекулы proBNP, proBNP форма задерживается на носителе, тогда как BNP с носителем не связывается. Полученные препараты BNP и proBNP, а так же исходная смесь форм (BNP+proBNP), были лиофильно высушены, после чего их растворяли в объединенной плазме здоровых доноров. В эксперименте также проводили оценку стабильности рекомбинантного гликозилированного proBNP, экспрессированного в эукариотической экспрессионной системе (клетки линии НЕК293). Мы предполагали, что данная форма proBNP должна иметь стабильность, сходную со

стабильностью эндогенного proBNP. Исследуемые образцы инкубировали в одинаковых условиях в течение 0.5, 2, 4, 8, 24 и 48 часов. Измерение BNP-иммунореактивности в образцах проводили, используя систему 50Е12б-з2-24С5ц.2з (Рис.9).

Как видно из Рис.9 среди исследуемых полипептидов эндогенная форма BNP обладала самой низкой стабильностью. Мы наблюдали снижение BNP-иммунореактивности до 9% от исходной через 48 часов после начала инкубации. Смесь эндогенных BNP и proBNP демонстрировала существенно более высокую стабильность -40% от исходного уровня после инкубации в течение такого же промежутка времени. Наибольшая стабильность была показана для эндогенной и рекомбинантной форм proBNP - более 60% от исходной иммунореактивности определялось в образцах после 48 часов инкубации.

Эндогенный BNP Эндогенные (proBNP+BNP) Эндогенный proBNP rproeNP (НЕК293)

Рис. 9. Исследование стабильности BNP и proBNP при инкубации в течение 48 часов в объединенной плазме здоровых доноров при + 25С.

Измерение BNP-иммунореактивности

проводили с использованием системы 50Eb6.32-24C5n.23.

24 36

Время инкубации, часы

Таким образом, нам удалось найти объяснение описанной в литературе парадоксально высокой (по сравнению с синтетическим) стабильности эндогенного BNP.

На основании полученных результатов о преобладании proBNP в крови и его более высокой стабильности относительно BNP, нами было предложено использовать гликозилированную форму рекомбинантного proBNP в качестве стабильного стандарта в системах для количественного определения BNP.

Разработка метода иммуноанализа для количественного определения нестабильных молекул.

Как отмечалось выше, BNP относится к разряду весьма нестабильных молекул, подверженных быстрой деградации при хранении образца. Также нельзя исключить, что частичный протеолиз может происходить и в кровотоке больного. Протеолитическая деградация, в свою очередь, может негативно влиять на достоверность определения пептида в образце. Существующие в настоящее время системы сэндвич-типа для детекции BNP основаны на использовании двух антител, специфичных к двум различным участкам

молекулы антигена (РисЛОА). Чем дальше один эпитоп антитела расположен от другого, тем выше вероятность того, что полипептидная цепь между эпитопами или внутри эпитопов может содержать сайт щепления эндогенными протеазами. В случае подобного щепления детекция молекулы такими системами становится невозможной. Для детекции нестабильных молекул, таких как BNP, нами был разработан новый уникальный подход на основе метода сэндвич-ИФА. В разработанном нами методе антитело подложки и детекторное антитело специфичны к одному и тому же эпитопу молекулы BNP (Рис.1 ОБ), при этом, если антитело подложки взаимодействует непосредственно с антигеном, то детекторное антитело узнает только иммунный комплекс антигена с первым антителом и не взаимодействует с каждым компонентом комплекса в отдельности.

Рис. 10. Схематическое представление эпитопной специфичности антител, используемых: (А) в традиционных системах сэндвич-типа для количественного определения BNP; (Б) в новом типе иммуноанализа для количественного определения BNP и его фрагментов. Эпитопы используемых в системах антител обозначены овалами.

В ходе выполнения данной работы было установлено, что наибольшей устойчивостью к протеолитическому расщеплению обладает центральный участок молекулы BNP. Эпитоп 11-23 молекулы BNP мы расценили как наиболее стабильный фрагмент. Поэтому в роли первого антитела было выбрано МАт 24С5, специфичное к участку 11-23 молекулы BNP и взаимодействующее с эндогенным пептидом с высоким аффинитетом. При получении детекторного МАт, для иммунизации животных мы использовали комплексный иммуноген - иммунный комплекс антитела 24С5 с BNP. В ходе работы была получена гибридомная линия Ab-BNP2, продуцирующая МАт, специфически взаимодействующие с иммунным комплексом, образованным антителом 24С5 и молекулой BNP и не узнающие компоненты комплекса в отдельности. Дальнейшие исследования показали, что система 24C5n-23-Ab-BNP2 способна с одинаково высокой чувствительностью и эффективностью детектировать синтетический и эндогенный BNP, рекомбинантный и эндогенный proBNP. Чувствительность системы 24С5ц-23 - Ab-BNP2 составила около 0.4 пг/мл (при использовании синтетического BNP в качестве калибратора).

Сравнительный анализ чувствительности двух систем - традиционной системы сэндвич-типа - 50El26-32-24C5n_23 и нового типа иммуноанализа - 24С5ц-2з - Ab-BNP2 - к

протеолитической деградации антигена проводили с использованием синтетического BNP. Пептид растворяли в объединенной плазме здоровых доноров до концентрации 10 нг/мл и инкубировали при температуре +25'С в течение 0.5, 2, 4, 8 и 24 часов. При тех же условиях инкубировали индивидуальный образец плазмы больного с СН, содержащий BNP в количестве 3.7 нг/мл.

Время инкубации, часы

Рис. 11. Сравнительный анализ чувствительности двух систем к протеолитической деградации исследуемого пептида. Изменение иммунореактивности синтетического BNP, растворенного в объединенной плазме здоровых доноров (А), и эндогенных форм (BNP+proBNP) в индивидуальном образце плазмы (Б) при инкубации при температуре +25°С в течение 24 часов. Измерения проводились в системах 24C5n.23-Ab-BNP2 (-■-) и 50Е126.з2-24С5ц.2з (-♦-)■ Величины изменения BNP-иммунореактивности представлены в виде среднего ±SD (п=6).

Как видно из Рис.11 А, при исследовании стабильности синтетического BNP с использованием стандартного метода иммуноанализа (50Е126-32-24С5ц-2з) наблюдалось быстрое падение BNP-иммунореактивности. Уже после 8 часов инкубации при температуре +25"С BNP в образце практически не обнаруживался. Иммунореактивносгь эндогенного антигена при исследовании в такой системе снижалась за 24 часа инкубации до 60% от исходного уровня (Рис.ПБ). При измерении в системе 24C5n.23-Ab-BNP2 изменения иммунореактивности пептидов были существенно ниже. Около 40% от исходной иммунореактивности синтетического антигена было определено в образце даже после 24 часов инкубации (Рис.11 А). Иммунореактивносгь в образце эндогенного антигена после 24 часов инкубации практически не изменилась относительно исходной (Рис.ПБ). Таким образом, как и ожидалось, разработанная нами новая система была существенно менее чувствительна к протеолитической деградации пептида. Данное наблюдение имеет большое практическое значение: при использовании в клинической практике новой системы становится возможным более длительное хранение образцов крови при комнатной температуре до начала проведения исследований.

Влияние протеолитической деградации на определение концентрации BNP в крови больных.

В настоящее время в клинической практике для измерения концентрации BNP используются диагностические системы, в основе которых лежит принцип метода сэндвич-ИФА. В таких системах используются два антитела, специфичные к различным эпитопам молекулы BNP. Как правило, это антитела, специфичные к кольцевой структуре (стабильный фрагмент молекулы) и N- или С-концевым участкам (нестабильные фрагменты). Как видно из описанных выше экспериментов, на систему, использующую антитела, специфичные к С-концевой области молекулы (50Е126-32), протеолитическая деградация пептида оказывает значительное негативное влияние. Так как протеолитическая деградация BNP (или proBNP) возможна не только при хранении образца, но и в кровотоке больного, то можно предположить, что использование таких систем в клинической практике приводит к получению заниженных результатов измерения концентрации. Чтобы проверить это предположение концентрацию BNP в 103 индивидуальных образцах плазмы больных с различной степенью тяжести СН определяли с использованием системы компании Siemens AD VIA Centaur и разработанной нами новой системы 24C5n.23-Ab-BNP2. Диагностическая система компании Siemens использует два МАт, одно из которых специфически взаимодействует с эпитопом 14-21, другое - с эпитопом 27-32 молекулы BNP (Рис.1 OA). Результаты измерения BNP с использованием двух различных систем представлены на Рис.12. Как видно из Рис.12 концентрация BNP, определяемая системой 24C5n.23-Ab-BNP2 во всех случаях (п=103) превышает концентрацию BNP, определяемую системой Siemens (в среднем в 2 раза). В шести образцах (5.8 %) наблюдалось существенное - в 3 - 7,2 раз превышение концентрации BNP, определяемой системой 24C5u.23-Ab-BNP2 над концентрацией, определяемой системой Siemens.

0.000 0,500 1.000 1,500 2.000 2.500 3.000

Концентрация BNP, нмоль/л (система Siemens)

Рис. 12. Корреляция результатов измерения концентрации BNP в образцах плазмы крови 103 пациентов с CH. Концентрация измерена в системе 24C5-Ab-BNP2 (калибратор - rproBNP) и в диагностической системе компании Siemens (калибратор - rproBNP).

Пунктирной линией на графике отмечена линия равных концентраций.

Овалами отмечены образцы, в которых концентрация BNP при определении в системе 24C5-Ab-BNP2 была в 3 и более раз выше, чем концентрация BNP, определенная в системе Siemens.

Наблюдаемую разницу в концентрации BNP, определяемую с использованием традиционного (Siemens) и нового (24C5n.23-Ab-BNP2) методов, мы объясняем тем, что новый метод, в отличие от традиционного, позволяет детектировать в крови больного не только целые, но и частично фрагментированные (с С-конца) молекулы BNP и proBNP.

Для исключения и выявления СН обычно используются специфические пороговые концентрации BNP: BNP < 0.03 пмоль/мл (неподтвержденный диагноз СН) и BNP >0.12 пмоль/мл (достоверное наличие СН). Корректное определение BNP у пациентов с концентрацией маркера близкой к пороговому особенно важно, так как в зависимости от определяемой концентрации пациент либо будет отнесен в группу риска, либо у него будет диагностирована CH. В качестве примера на Рис.13 представлены результаты измерений в пяти выбранных образцах плазмы. При определении концентрации BNP в системе Siemens все пациенты (концентрация BNP в диапазоне от 0.03 до 0.12 пмоль/мл) могут быть ошибочно диагностированы как пациенты группы риска, а не как больные с CH. Однако когда в тех же образцах крови концентрацию BNP определяли с использованием системы 24C5n-23-Ab-BNP2, то результаты тестирования в образцах 1, 3 и 4 свидетельствовали в пользу наличия у пациентов CH. Этот пример подчеркивает преимущество разработанного нами нового метода для проведения клинических исследований.

0,24

| 0,21

1 »■«

с. 0,15 Q.

m о,12

го 0 09 о.

S 0,06

о 0.03

Образец плазмы

Рис. 13. Определение концентрации BNP в пяти образцах плазмы больных с использованием системы 24C5-Ab-BNP2 (серые столбики) и системы Siemens (белые столбики). При измерении BNP в системе Siemens у данных больных диагноз СН оказывается неподтвержденным (концентрация BNP в диапазоне от 0.03 до 0.12 пмоль/мл - «серая зона» - диапазон, в котором СН диагностируется недостоверно). При использовании системы 24C5-Ab-BNP2 - для больных 1, 3 и 4 достоверно показано наличие CH.

Таким образом, разработанный нами новый подход позволяет определить истинную концентрацию BNP в образце, что необходимо для постановки точного диагноза у больных, поступивших в отделение неотложной помощи с симптомами CH.

Выводы:

1. Получены и охарактеризованы моноклональные антитела, специфичные к различным участкам молекулы BNP человека.

2. Создана система экспрессии и разработан метод получения высокоочищенного препарата рекомбинантного proBNP.

3. Показано, что в крови больных с сердечной недостаточностью концентрация proBNP значительно превышает концентрацию BNP, а соотношение proBNP/BNP варьирует у разных больных.

4. Дано объяснение необычайно высокой стабильности эндогенного BNP, наблюдаемой в крови больных с сердечной недостаточностью.

5. Только антитела специфичные к фрагменту 13-24 молекулы proBNP могут быть использованы при создании системы для дифференциального количественного определения proBNP.

6. Предложен и разработан новый метод для количественного определения нестабильных молекул. Показано преимущество использования данного метода для определения BNP в крови больных с сердечной недостаточностью.

Публикации по теме диссертации:

1. Семенов АГ, Карпова НС, Постников АБ, Сеферян KP, Тамм НН. Серебряная ДВ, Блошицина МН, Катруха АГ. Гликозилирование по остатку треонина в положении 71 препятствует процессингу молекул предшественника натрийуретического пептида В. Тезисы конференции «Четвертая всероссийская с международным участием школа-конференция по физиологии кровообращения». Москва, 2008, стр. 88-89.

2. Semenov AG, Tamm NN. Seferian KR, Postnikov AB, Karpova NS, Serebryanaya DV, Katrukha AG. The role of furin and corin in processing of human B-type natriuretic peptide Precursor. Abstract, the Annual Meeting of the American Association for Clinical Chemistry. Anaheim, CA, USA, July 25-29, 2010. Clinical Chemistry, 2010, Vol. 56, No. 6, Supplement, C81.

3. Tamm NN. Semenov AG, Seferian KR, Bereznikova AV, Murakami MM, Apple FS, Koshkina EV, Krasnoselsky MI, Katrukha AG. Measurement of B-type natriuretic peptide by two assays utilizing antibodies with different epitope specificity. Accepted for publication 30 Sep 2010, Clinical Biochemistry, DOl 10.1016/j.clinbiochem.2010.09.030.

4. Tamm NN. Semenov AG, Seferian KR, Murakami MM, Apple FS, Koshkina EV, Krasnoselsky MI, Malanichev RV, Arutyunov AG, Katrukha AG. BNP measurements by two assays utilizing antibodies with different epitope specificity. Abstract, the Annual Meeting of the American Association for Clinical Chemistry. Anaheim, CA, USA, July 25-29, 2010. Clinical Chemistry, 2010, Vol. 56, No. 6, Supplement, C79.

5. Semenov AG, Postnikov AB, Tamm NN. Seferian KR, Karpova SN, Bloshchitsyna MN, Koshkina EV, Krasnoselskiy MI, Serebryanaya DV, Katrukha AG. Processing of proBNP is suppressed by O-glycosylation in the region close to the cleavage site. Clinical Chemistry, 2009;55(3):489-98.

6. Semenov AG, Karpova NS, Postnikov AB, Seferian KR, Tamm NN. Serebryanaya DV, Katrukha AG. O-Glycosylation-mediated heterogeneity of 67-76 region of endogenous pro-Brain Natriuretic Peptide (proBNP) and its processing. Abstract, FEBS congress, Prague, Czech Republic, 4-9 July 2009. The FEBS journal, 2009, Vol. 276, Supplement 1, p. 342.

7. Semenov AG, Postnikov AB, Karpova NS, Seferian KR, Tamm NN. Serebryanaya DV, Katrukha AG. New insights into human proBNP processing: the evidence for furin-mediated proBNP processing in vitro. Abstract, The Annual Meeting of the American Association for Clinical Chemistry. 19-23 July 2008, Chicago, IL. Clinical Chemistry, 2009, Vol 55, No S6, A71-A72.

8. Tamm NN. Seferian KR, Semenov AG, Mukharyamova KS, Koshkina EV, Krasnoselsky MI, Postnikov AB, Serebryanaya DV, Apple FS, Murakami MM, Katrukha AG. Novel immunoassay for quantification of brain natriuretic peptide and its precursor in human blood. Clinical Chemistry, 2008, Vol 54, No 9, pp 1511 -1518.

9. Semenov AG, Karpova NS, Serebryanaya DV, Postnikov AB, Tamm NN. Esakova TV, Seferian KR, Katrukha AG. Processing of brain natriuretic peptide precursor (proBNP) is affected by threonine 71 glycosylation. Abstract, The Annual Meeting of the American Association for Clinical Chemistry. 27-31 July 2008, Washington, DC. Clinical Chemistry, 2009, Vol 54, No S6, A94.

10. Semenov AG, Karpova NS, Postnikov AB, Serebryanaya DV, Tamm NN. Seferian KR, Kara AN, Katrukha AG. The difference in glycosylation between human proBNP and NT-proBNP suggests a new regulatory level in proBNP processing. Abstract, The Annual Meeting of the American Association for Clinical Chemistry. 27-31 July 2008, Washington, DC. Clinical Chemistry, 2009, Vol 54, No S6, A94.

11. Seferian KR, Tamm NN. Semenov AG, Postnikov AB, Katrukha AG. Novel findings

of the nature of circulating BNP, proBNP and NT-proBNP. Abstract, LabMed 2008, XXXI Nordic Congress in Clinical Chemistry, Helsinki, Finland, 14-18 June 2008. Abstracts book, 048.

12. Scfcrian KR, Tamm NN. Semenov AG, Tolstaya AA, Koshkina EV, Krasnoselsky MI, Postnikov AB, Serebryanaya DV, Katrukha AG, Apple FS, Murakami MM. Immunodetection of glycosylated NT-proBNP circulating in human blood. Clinical Chemistry, 2008, Vol 54, No 5, pp 866-873.

13. Tamm NN, Seferian KR, Katrukha AG. NT-proBNP, BNP and proBNP: biochemical characteristics and in vitro measurements. Clinical Laboratory, 2008, No 7.

14. Tamm NN. Seferian KR, Mukharyamova KS, Filatov VL, Kharitonov AV, Kara AN, Esakova TV, Katrukha AG. New type of immunoassay for quantification of brain natriuretic peptide (BNP) and its' precursor - proform of brain natriuretic peptide (proBNP) in human blood. Abstract, 17th IFCC-FESCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. Amsterdam, Netherlands, 3-7 June 2007. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 2007; 45, Special Supplement, p. S380.

15. Katrukha AG, Tamm NN. Semenov AG, Seferian KR, Postnikov AB, Agafonov MO, Kara AN, Esakova TV. Recombinant proform of brain natriuretic peptide (proBNP), expressed in eukaryotic cells as a stable standard for BNP immunoassay. Abstract, The Annual Meeting of the American Association for Clinical Chemistry. San Diego, California, July 15-19 2007. Clinical Chemistry 2007, Vol 53, No 6, Supplement, A23.

16. Katrukha AG, Semenov AG, Tamm NN. Seferian KR, Postnikov AB, Koshkina EV, Krasnoselsky MI, Mukharyamova KS, Tolstaya AA, Filatov V L. Glycosylation of NT-proBNP molecules and NT-proBNP immunoassays. Abstract, The Annual Meeting of the American Association for Clinical Chemistry. San Diego, California, July 15-19 2007. Clinical Chemistry 2007, Vol 53, No 6, Supplement, A23.

17. Katrukha AG, Seferian KR, Tamm NN. Semenov AG, Koshkina EV, Krasnoselsky MI, Tolstaya AA, Kharitonov AV, Filatov VL. ProBNP is a major form of BNP immunoreactivity in blood of patients with heart failure. Abstract, The Annual Meeting of the American Association for Clinical Chemistry. San Diego, California, July 15-19 2007. Clinical Chemistry 2007, Vol 53, No 6, Supplement, A6.

18. Seferian KR, Tamm NN. Semenov AG, Mukharyamova KS, Tolstaya AA, Koshkina EV, Kara AN, Krasnoselsky MI, Apple F, Esakova TV, Filatov VL, Katrukha AG. The brain natriuretic peptide (BNP) precursor is the major immunoreactive form of BNP in patients with heart failure. Clinical Chemistry, 2007; Vol 53, No 5, pp 866 - 873.

19. Tamm NN. Mukhariamova KS, Seferian KR, Antopolskii M, Filatov VL, Koshkina EV, Rrasnoselskii MI, Katrukha AG. New sensitive sandwich time resolved immunofluorometric assay for quantification of BNP in human blood. Abstract, The Annual Meeting of the American Association for Clinical Chemistry. Orlando, Florida, July 24-28, 2005. Clinical Chemistry 2005, Vol 51, No 6, Supplement, A26.

Заказ № 88-аЛ 0/10 Подписано в печать 13.06.2010 Тираж 70 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru ; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тамм, Наталья Никитична

Список используемых сокращений.

Введение.

2 Обзор литературы.

2.1 Натрийуретические пептиды.

2.1.1 Семейство натрийуретических пептидов. История открытия.

2.1.2 Строение натрийуретических пептидов.

2.2 Натрийуретический пептид В-типа.

2.2.1 Регуляция синтеза BNP.

2.2.2 Синтез и секреция BNP.

2.3 Строение и функционирование рецепторов натрийуретических пептидов.

2.3.1 Активация рецепторов А-типа.

2.4 Физиологическое действие BNP.

2.4.1 Действие НП на сердечнососудистую систему.

2.4.2 Действие BNP на эндокринную систему.

2.4.3 Действие НП на работу почек.

2.4.4 Действие натрийуретических пептидов в легких.

2.4.5 Фиброз и гипертрофия сердечной ткани.

2.5 Молекулярные формы BNP в крови.

2.5.1 N-концевой фрагмент предшественника BNP.

2.5.2 Пост-трансляционные модификации молекулы предшественника BNP.

2.5.3 Пост-трансляционные модификации молекулы NT-proBNP.

2.6 Инактивация натрийуретического пептида В-типа и его предшественника.

2.7 Формы BNP, проявляющие физиологическую активность.

2.8 Сердечная недостаточность.

2.8.1 Классификация сердечной недостаточности.

2.8.2 Эпидемиология сердечной недостаточности.

2.8.3 Биохимические аспекты патогенеза сердечной недостаточности.

2.8.4 Использование натрийуретических пептидов для диагностики сердечной недостаточности.

2.8.5 Количественное определение BNP в диагностике острой сердечной недостаточности.

2.8.6Диагностика бессимптомной дисфункции левого желудочка.

2.8.7 Неспецифические изменения кош{ентраг{ии BNP (NT-proBNP).

2.8.8 Использование BNP в оценке прогноза выживаемости.

2.8.9 Определение BNP (NT-pro BNP) для оценки эффективности терапии С H.

2.8.10 Использование BNP в терапии СН.

2.8.11 Пороговые концентрации BNP и NT-proBNP, используемые для постановки диагноза CH.

2.8.12 Методы измерения концентрации BNP в крови.

2.8.13 Диагностические системы для количественного определения NT-proBNP.

2.8.14 Диагностические системы для количественного определения proBNP.

2.8.15 Стандарты для BNP и NT-proBNP диагностических систем.

3 Материалы и методы.

3.1 Материалы.

3.1. 2 Образцы плазмы и сыворотки крови.

3.2 Методы.

3.2.1 Конъюгирование пептидов с белком-носителем.

3.2.2 Иммунизация кроликов и получение политональных антител специфичных к BNP человека.65 /у

3.2.3 Иммунизация мышей и получение линий гибридомных клеток, продуцирующих моноклональные антитела, специфичные к BNP.

3.2.4 Иммуноферментный и иммунофосфоресцентный анализы.

3.2.5 Конъюгирование антител.

3.2.5.1 Конъюгирование антител со стабильным хелатом европия.

3.2.5.2 Конъюгирование антител с производным биотина.

3.2.6 Иммуноферментный анализ.

3.2.7 Иммунофосфоресцентный анализ.

3.2.8 Сэндвич — иммунофосфоресцентный анализ.

3.2.9 Сэндвич-иммунофосфоресцентный анализ с направленной сорбцией антител на планшете.

3.2.10 ДСН-гель-электрофорез по методу Лэммли [167].

3.2.11 ДСН-гель-электрофорез в трис-трициновой буферной системе.

3.2.12 Иммобилизация антител, либо конъюгата пептида с трансферрином, на BrCN-активированной сефарозе.

3.2.13 Приготовление аффинного носителя с использованием Sulfolink Coupling Gel.

3.2.14 Создание молекулярно-генетической конструкции pET-23a(+)-proBNP для экспрессии рекомбинантного proBNP в клетках Е. coli.

3.2.15 Экспрессия и очистка рекомбинантного proBNP.

3.2.16 Алкшшрование SH-групп препарата рекомбинантного proBNP под действием йодацетамида.

3.2.17 Экстракция эндогенных BNP и proBNP из образцов плазмы крови с использованием картриджей Sep-Pak С18.

3.2.18 Хроматографическое разделение белков.

3.2.18.1 Гель-фильтрация.

3.2.18.2 Ионообменная хроматография.

3.2.18.3 Обратно-фазовая хроматография.

3.2.19 Масс-спектрометрический анализ рекомбинантного proBNP.

3.2.20 Получение Fab -фрагментов антител.

3.2.21 Конъюгирование Fab-фрагментов антител 24С5 с синтетическим BNP.

4 Результаты и их обсуждение.

4.1 Получение поликлональных и моноклональных антител, специфичных к BNP человека.

4.1.1 Конъюгирование пептидов, соответствующих различным участкам аминокислотной последовательности BNP человека, с белком-носителем.85 ¡*

4.1.2 Получение поликлональных антител, специфичных к BNP человека.

4.1.3 Получение линий гибридомных клеток, продуцирующих антитела, специфичные к BNP человека.

4.2 Разработка иммунохимической системы для количественного определения BNP.

4.3 Получение и очистка рекомбинантного proBNP, экспрессированного в клетках Escherichia coli (Е. coli).100 г

4.3.1 Создание молекулярно-генетической конструкции pET-23a(+)-proBNP для экспрессии рекомбинантного proBNP в клетках Е. coli.

4.3.2 Очистка рекомбинантного proBNP.

4.4 Анализ BNP-иммунореактивных форм в крови больных с СН.

4.5 Исследование иммунохимических свойств эндогенного proBNP.

4.6 Создание системы для дифференциальной детекции proBNP.

4.7 Исследование стабильности BNP и proBNP.

4.8 Разработка нового метода иммуноанализа для количественного определения нестабильных молекул.

4.8.1 Исследование чувствительности новой системы 24C5-Ab-BNP2 к протеолитической деградации BNP.

4.9 Влияние протеолитической деградации на определение концентрации BNP в крови больных.

Выводы.

Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биохимические и иммунохимические свойства натрийуретического пептида В-типа и его предшественника"

Натрийуретический пептид В-типа (BNP) относится к семейству пептидных гормонов, сходных по структуре и участвующих в регуляции объема крови, кровяного давления и водно-солевого баланса организма. Помимо BNP, семейство натрийуретических пептидов (НП) включает в себя натрийуретический пептид А-типа (ANP) и натрийуретический пептид С-типа (CNP). Характерной особенностью НП является 17-членная кольцевая структура, образованная дисульфидной связью между двумя остатками цистеина. Одиннадцать из семнадцати аминокислотных остатков (а.к.о.) кольцевой структуры у всех представителей семейства НП идентичны, тогда как концевые фрагменты пептидов выраженной гомологии не имеют. BNP синтезируется кардиомиоцитами в форме предшественника, proBNPi-ios, состоящего из 108 а.к.о. Под действием специфической протеазы proBNP расщепляется на два фрагмента -физиологически активный С-концевой фрагмент (BNP77-108) и N-концевой фрагмент (NT-proBNPi-76), физиологическая активность которого к настоящему моменту не установлена. Все три пептида - BNP, NT-proBNP и proBNP присутствуют в кровотоке.

Концентрация BNP и NT-proBNP в крови здоровых доноров не превышает 60 и 200 пг/мл, соответственно. Однако при развитии сердечной недостаточности (СН) уровень синтеза и секреции BNP и NT-proBNP значительно увеличивается и может достигать 7-10 нг/мл в случае BNP и нескольких десятков нг/мл в случае NT-proBNP. СН - сложный клинический синдром, возникающий при нарушении сократительной способности сердца. Наиболее частой причиной СН является снижение способности левого желудочка (ЛЖ) к выбросу крови в аорту. В настоящее время СН является одним из наиболее распространенных осложнений сердечнососудистых заболеваний и оказывает существенное влияние на продолжительность и качество жизни пациентов. Клинические симптомы ранних стадий СН являются неспецифическими, что осложняет диагностику данного заболевания. В последние годы важным инструментом для исключения СН и оценки уровня дисфункции ЛЖ является определение концентрации BNP (или NT-proBNP) в крови пациента с использованием иммунохимических диагностических систем. Использование высокочувствительных методов иммуноанализа, основанных на применении моноклональных антител, является единственным возможным способом количественного определения пептидов, представленных в крови в столь низких концентрациях.

Несмотря на широкое применение в клинической практике, до последнего времени практически ничего не было известно о биохимических особенностях BNP, обнаруживаемого в крови человека. Недостаточность знаний о пептиде связана, прежде всего, с его низкой концентрацией в крови и недостаточной чувствительностью имеющихся в настоящее время методов исследования. Данные о том, в какой форме маркер существует в кровотоке, могут быть полезны как для разработки методов достоверного и надежного определения уровня пептида в крови больных, так и для решения более общих фундаментальных задач - совершенствования существующей теории функционирования натрийуретических пептидов человека.

Таким образом, основной целью данной диссертационной работы было изучение биохимических и иммунохимических особенностей BNP человека и его предшественника proBNP с использованием такого высокочувствительного и высокоточного инструмента как моноклональные антитела.

В работе были поставлены следующие задачи:

4. Исследовать биохимические и иммунохимические свойства BNP и его предшественника proBNP, присутствующих в крови больных с сердечной недостаточностью.

2 Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Тамм, Наталья Никитична

Выводы

2. Создана система экспрессии и разработан метод получения высокоочищенного препарата рекомбинантного proBNP.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю, доктору биологических наук, Алексею Генриховичу Катрухе за чуткое руководство, а также коллективу лаборатории за неоценимую помощь в выполнении данной исследовательской работы.

Автор также выражает свою признательность финской биотехнологической компании Ну Test Оу за предоставленную возможность провести значительную часть исследований, представленных в данной работе, в лаборатории компании в городе Турку.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тамм, Наталья Никитична, Москва

1. Henry JP, Pearce JW. The possible role of cardiac atrial stretch receptors in the induction of changes in urine flow. J Physiol 1956;131 (3):572-85.

2. Vesely DL. Natriuretic peptides and acute renal failure. Am J Physiol Renal Physiol 2003;285 (2):F167-77.

3. Vesely DL. Atrial natriuretic hormones originating from the N-terminus of the atrial natriuretic factor prohormone. Clin Exp Pharmacol Physiol 1995;22 (2):108-14.

4. Schulz-Knappe P, Forssmann K, Herbst F, Hock D, Pipkorn R, Forssmann WG. Isolation and structural analysis of "urodilatin", a new peptide of the cardiodilatin-(ANP)-family, extracted from human urine. Klin Wochenschr 1988;66 (17):752-9.

5. Sudoh T, Minamino N, Kangawa K, Matsuo H. Brain natriuretic peptide-32: N-terminal six amino acid extended form of brain natriuretic peptide identified in porcine brain. Biochem Biophys Res Commun 1988; 155 (2):726-32.

6. Levin E. Natriuretic peptides. The New England Journal of Medicine 1998;339:321-8.

7. Richards AM, Lainchbury JG, Nicholls MG, Cameron AV, Yandle TG. Dendroaspis natriuretic peptide: endogenous or dubious? Lancet 2002;359 (9300):5-6.

8. Ogawa Y, Itoh H, Nakao K. Molecular biology and biochemistry of natriuretic peptide family. Clin Exp Pharmacol Physiol 1995;22 (l):49-53.

9. Komatsu Y, Nakao K, Suga S, Ogawa Y, Mukoyama M, Arai H, Shirakami G, Hosoda K, Nakagawa O, Hama N, et al. C-type natriuretic peptide (CNP) in rats and humans. Endocrinology 1991;129 (2):1104-6.

10. Minamino N, Kangawa K, Matsuo H. Isolation and identification of a high molecular weight brain natriuretic peptide in porcine cardiac atrium. Biochem Biophys Res Commun 1988;157 (l):402-9.

11. Tateyama H, Hino J, Minamino N, Kangawa K, Ogihara T, Matsuo H. Characterization of immunoreactive brain natriuretic peptide in human cardiac atrium. Biochem Biophys Res Commun 1990; 166 (3): 1080-7.

12. Hino J, Tateyama H, Minamino N, Kangawa K, Matsuo H. Isolation and identification of human brain natriuretic peptides in cardiac atrium. Biochem Biophys Res Commun 1990; 167 (2):693-700.

13. Mukoyama M, Nakao K, Saito Y, Ogawa Y, Hosoda K, Suga S, Shirakami G, Jougasaki M, Imura H. Human brain natriuretic peptide, a novel cardiac hormone. Lancet 1990;335 (8692):801-2.

14. Mukoyama M, Nakao K, Saito Y, Ogawa Y, Hosoda K, Suga S, Shirakami G, Jougasaki M, Imura H. Increased human brain natriuretic peptide in congestive heart failure. N Engl J Med 1990;323 (ll):757-8.

15. Yoshimura M, Yasue H, Okumura K, Ogawa H, Jougasaki M, Mukoyama M, Nakao K, Imura H. Different secretion patterns of atrial natriuretic peptide and brain natriuretic peptide in patients with congestive heart failure. Circulation 1993;87 (2):464-9.

16. Gerbes AL, Dagnino L, Nguyen T, Nemer M. Transcription of brain natriuretic peptide and atrial natriuretic peptide genes in human tissues. J Clin Endocrinol Metab 1994;78 (6):1307-11.

17. Tamura N, Ogawa Y, Yasoda A, Itoh H, Saito Y, Nakao K. Two cardiac natriuretic peptide genes (atrial natriuretic peptide and brain natriuretic peptide) are organized in tandem in the mouse and human genomes. J Mol Cell Cardiol 1996;28 (8): 1811-5.

18. LaPointe MC. Molecular regulation of the brain natriuretic peptide gene. Peptides 2005;26 (6):944-56.

19. Ruskoaho. Pressure Overload Increases GATA4 Binding Activity via Endothelin-1. Circulation 2001;103:730-5.

20. Bhalla SS, Robitaille L, Nemer M. Cooperative activation by GATA-4 and YY1 of the cardiac B-type natriuretic peptide promoter. J Biol Chem 2001 ;276 (14): 11439-45.

21. Liang Q, De Windt LJ, Witt SA, Kimball TR, Markham BE, Molkentin JD. The transcription factors GATA4 and GATA6 regulate cardiomyocyte hypertrophy in vitro and in vivo. J Biol Chem 2001;276 (32):30245-53.

22. Pikkarainen S, Tokola H, Kerkela R, Ruskoaho H. GATA transcription factors in the developing and adult heart. Cardiovasc Res 2004;63 (2): 196-207.

23. He Q, LaPointe MC. Interleukin-lbeta regulates the human brain natriuretic peptide promoter via Ca(2+)-dependent protein kinase pathways. Hypertension 2000;35 (1 Pt 2):292-6.

24. Klimpel KR, Molloy SS, Thomas G, Leppla SH. Anthrax toxin protective antigen is activated by a cell surface protease with the sequence specificity and catalytic properties of furin. Proc Natl Acad Sci U S A 1992;89 (21): 10277-81.

25. Molloy SS, Thomas L, VanSlyke JK, Stenberg PE, Thomas G. Intracellular trafficking and activation of the furin proprotein convertase: localization to the TGN and recycling from the cell surface. EMBO J 1994;13 (l):18-33.

26. Vidricaire G, Denault JB, Leduc R. Characterization of a secreted form of human furin endoprotease. Biochem Biophys Res Commun 1993; 195 (2): 1011-8.

27. Nakayama K. Furin: a mammalian subtilisin/Kex2p-like endoprotease involved in processing of a wide variety of precursor proteins. Biochem J 1997;327 ( Pt 3):625-35.

28. Sawada Y, Inoue M, Kanda T, Sakamaki T, Tanaka S, Minamino N, Nagai R, Takeuchi T. Co-elevation of brain natriuretic peptide and proprotein-processing endoprotease furin after myocardial infarction in rats. FEBS Lett 1997;400 (2):177-82.

29. Wu C, Wu F, Pan J, Morser J, Wu Q. Furin-mediated processing of Pro-C-type natriuretic peptide. J Biol Chem 2003;278 (28):25847-52.

30. Yan W, Wu F, Morser J, Wu Q. Corin, a transmembrane cardiac serine protease, acts as a pro-atrial natriuretic peptide-converting enzyme. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97 (15):8525-9.

31. Knappe S, Wu F, Madlansacay MR, Wu Q. Identification of domain structures in the propeptide of corin essential for the processing of proatrial natriuretic peptide. J Biol Chem 2004;279 (33):34464-71.

32. Chan J KO, Wu F, Morser J, Dole WP, Wu Q. Hypertension in mice lacking the proatrial natriuretic peptide convelíase, corin. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102:785-90.

33. Wu Q. The serine protease corin in cardiovascular biology and disease. Front Biosci 2007;12:4179-90.

34. Miyagi M, Misono KS. Disulfide bond structure of the atrial natriuretic peptide receptor extracellular domain: conserved disulfide bonds among guanylate cyclase-coupled receptors. Biochim Biophys Acta 2000; 1478 (l):30-8.

35. Potter LR, Hunter T. Guanylyl cyclase-linked natriuretic peptide receptors: structure and regulation. J Biol Chem 2001 ;276 (9):6057-60.

36. Schiffrin EL, Turgeon A, Tremblay J, Deslongchamps M. Effects of ANP, angiotensin, vasopressin, and endothelin on ANP receptors in cultured rat vascular smooth muscle cells. Am J Physiol 1991 ;260 (1 Pt 2):H58-65.

37. Suga S, Nakao K, Mukoyama M, Arai H, Hosoda K, Ogawa Y, Imura H. Characterization of natriuretic peptide receptors in cultured cells. Hypertension 1992; 19 (6 Pt 2):762-5.

38. Lowe DG, Chang MS, Hellmiss R, Chen E, Singh S, Garbers DL, Goeddel DV. Human atrial natriuretic peptide receptor defines a new paradigm for second messenger signal transduction. EMBO J 1989;8 (5): 1377-84.

39. Lopez MJ, Wong SK, Kishimoto I, Dubois S, Mach V, Friesen J, Garbers DL, Beuve A. Salt-resistant hypertension in mice lacking the guanylyl cyclase-A receptor for atrial natriuretic peptide. Nature 1995;378 (6552):65-8.

40. Pandey KN, Oliver PM, Maeda N, Smithies O. Hypertension associated with decreased testosterone levels in natriuretic peptide receptor-A gene-knockout and gene-duplicated mutant mouse models. Endocrinology 1999;140 (11):5112-9.

41. Yasoda A, Komatsu Y, Chusho H, Miyazawa T, Ozasa A, Miura M, Kurihara T, Rogi T, Tanaka S, Suda M, Tamura N, Ogawa Y, Nakao K. Overexpression of CNP in chondrocytes rescues achondroplasia through a MAPK-dependent pathway. Nat Med 2004;10 (l):80-6.

42. Tsuji T, Kunieda T. A loss-of-function mutation in natriuretic peptide receptor 2 (Npr2) gene is responsible for disproportionate dwarfism in cn/cn mouse. J Biol Chem 2005;280 (14):14288-92.

43. Stults JT, O'Connell KL, Garcia C, Wong S, Engel AM, Garbers DL, Lowe DG. The disulfide linkages and glycosylation sites of the human natriuretic peptide receptor-C homodimer. Biochemistry 1994;33 (37): 11372-81.

44. Potter LR, Abbey-Hosch S, Dickey DM. Natriuretic peptides, their receptors, and cyclic guanosine monophosphate-dependent signaling functions. Endocr Rev 2006;27 (1):47-72.

45. Nussenzveig DR, Lewicki JA, Maack T. Cellular mechanisms of the clearance function of type C receptors of atrial natriuretic factor. J Biol Chem 1990;265 (34):20952-8.

46. Juilfs DM, Soderling S, Burns F, Beavo J A. Cyclic GMP as substrate and regulator of cyclic nucleotide phosphodiesterases (PDEs). Rev Physiol Biochem Pharmacol1999; 13 5-67-104. --

47. Lucas KA, Pitari GM, Kazerounian S, Ruiz-Stewart I, Park J, Schulz S, Chepenik KP, Waldman SA. Guanylyl cyclases and signaling by cyclic GMP. Pharmacol Rev 2000;52 (3):375-414.

48. Brown LA, Nunez DJ, Wilkins MR. Differential regulation of natriuretic peptide receptor messenger RNAs during the development of cardiac hypertrophy in the rat. J Clin Invest 1993;92 (6):2702-12.

49. Pidgeon GB, Richards AM, Nicholls MG, Espiner EA, Yandle TG, Frampton C. Differing metabolism and bioactivity of atrial and brain natriuretic peptides in essential hypertension. Hypertension 1996;27 (4):906-13.

50. Hutchinson HG, Trindade PT, Cunanan DB, Wu CF, Pratt RE. Mechanisms of natriuretic-peptide-induced growth inhibition of vascular smooth muscle cells. Cardiovasc Res 1997;35 (1): 158-67.

51. Weidmann P, Gnadinger MP, Ziswiler HR, Shaw S, Bachmann C, Rascher W, Uehlinger DE, Hasler L, Reubi FC. Cardiovascular, endocrine and renal effects of atrial natriuretic peptide in essential hypertension. J Hypertens Suppl 1986;4 (2):S71-83.

52. Holmes SJ, Espiner EA, Richards AM, Yandle TG, Frampton C. Renal, endocrine, and hemodynamic effects of human brain natriuretic peptide in normal man. J Clin Endocrinol Metab 1993;76 (l):91-6.

53. Klinger JR, Warburton RR, Pietras LA, Smithies O, Swift R, Hill NS. Genetic disruption of atrial natriuretic peptide causes pulmonary hypertension in normoxic and hypoxic mice. Am J Physiol 1999;276 (5 Pt l):L868-74.

54. Cao L, Gardner DG. Natriuretic peptides inhibit DNA synthesis in cardiac fibroblasts. Hypertension 1995;25 (2):227-34.

55. Tamura K, Takamori S, Mifune H, Hayashi A, Shirouzu K. Changes in atrial natriuretic peptide concentration and expression of its receptors after pneumonectomy in the rat. Clin Sci (Lond) 2000;99 (4):343-8.

56. Rosenkranz AC, Woods RL, Dusting GJ, Ritchie RH. Antihypertrophic actions of the natriuretic peptides in adult rat cardiomyocytes: importance of cyclic GMP. Cardiovasc Res 2003;57(2):515-22.

57. Kishimoto I, Saito Y, Nakao K. The natriuretic peptide system]. Nippon Rinsho 2000;58 Suppl 1:139-47.

58. Tateyama H, Hino J, Minamino N, Kangawa K, Minamino T, Sakai K, Ogihara T, Matsuo H. Concentrations and molecular forms of human brain natriuretic peptide in plasma. Biochem Biophys Res Commun 1992; 185 (2):760-7.

59. Yandle TG, Richards AM, Gilbert A, Fisher S, Holmes S, Espiner EA. Assay of brain natriuretic peptide (BNP) in human plasma: evidence for high molecular weight BNP as a major plasma component in heart failure. J Clin Endocrinol Metab 1993;76 (4):832-8.

60. Hunt PJ, Yandle TG, Nicholls MG, Richards AM, Espiner EA. The amino-terminal portion of pro-brain natriuretic peptide (Pro-BNP) circulates in human plasma. Biochem Biophys Res Commun 1995;214 (3):1175-83.

61. Crimmins DL. Human N-terminal proBNP is a monomer. Clin Chem 2005;51 (6): 10358.

62. Crimmins DL, Kao JL. A glycosylated form of the human cardiac hormone pro B-type natriuretic peptide is an intrinsically unstructured monomelic protein. Arch Biochem Biophys 2008;475 (1):36-41.

63. Schellenberger U, O'Rear J, Guzzetta A, Jue RA, Protter AA, Pollitt NS. The precursor to B-type natriuretic peptide is an O-linked glycoprotein. Arch Biochem Biophys 2006;451 (2): 160-6.

64. Seferian KR, Tamm NN, Semenov AG, Tolstaya AA, Koshkina EV, Krasnoselsky MI, Postnikov AB, Serebryanaya DV, Apple FS, Murakami MM, Katrukha AG. Immunodetection of glycosylated NT-proBNP circulating in human blood. Clin Chem 2008;54 (5):866-73.

65. Hammerer-Lercher A, Halfinger B, Sarg B, Mair J, Puschendorf B, Griesmacher A, Guzman NA, Lindner HH. Analysis of circulating forms of proBNP and NT-proBNP in patients with severe heart failure. Clin Chem 2008;54 (5):858-65.

66. Brandt I, Lambeir AM, Ketelslegers JM, Vanderheyden M, Scharpe S, De Meester I. Dipeptidyl-peptidase IV converts intact B-type natriuretic peptide into its des-SerPro form. Clin Chem 2006;52 (l):82-7.

67. Lam CS, Burnett JC, Jr., Costello-Boerrigter L, Rodeheffer RJ, Redfield MM. Alternate circulating pro-B-type natriuretic peptide and B-type natriuretic peptide forms in the general population. J Am Coll Cardiol 2007;49 (11):1193-202.

68. Schou M, Dalsgaard MK, Clemmesen O, Dawson EA, Yoshiga CC, Nielsen HB, Gustafsson F, Hildebrandt PR, Secher NH. Kidneys extract BNP and NT-proBNP in healthy young men. J Appl Physiol 2005;99 (5): 1676-80.

69. Martinez-Rumayor A, Richards AM, Burnett JC, Januzzi JL, Jr. Biology of the natriuretic peptides. Am J Cardiol 2008;101 (3A):3-8.

70. Seymour AA, Asaad MM, Abboa-Offei BE, Rovnyak PL, Fennell S, Rogers WL. Potentiation of brain natriuretic peptides by SQ 28,603, an inhibitor of neutral endopeptidase 3.4.24.11, in monkeys and rats. J Pharmacol Exp Ther 1992;262 (l):60-70.

71. Kenny AJ, Bourne A, Ingram J. Hydrolysis of human and pig brain natriuretic peptides, urodilatin, C-type natriuretic peptide and some C-receptor ligands by endopeptidase-24.11. Biochem J 1993;291 (Pt l):83-8.

72. Chen HH, Lainchbury JG, Burnett JC, Jr. Natriuretic peptide receptors and neutral endopeptidase in mediating the renal actions of a new therapeutic synthetic natriuretic peptide dendroaspis natriuretic peptide. J Am Coll Cardiol 2002;40 (6): 1186-91.

73. Kerr MA, Kenny AJ. The purification and specificity of a neutral endopeptidase from rabbit kidney brush border. Biochem J 1974; 137 (3):477-88.

74. Norman JA, Little D, Bolgar M, Di Donato G. Degradation of brain natriuretic peptide by neutral endopeptidase: species specific sites of proteolysis determined by mass spectrometry. Biochem Biophys Res Commun 1991;175 (l):22-30.

75. Pankow K, Schwiebs A, Becker M, Siems WE, Krause G, Walther T. Structural substrate conditions required for neutral endopeptidase-mediated natriuretic Peptide degradation. J Mol Biol 2009;393 (2):496-503.

76. Goetze JP, Jensen G, Moller S, Bendtsen F, Rehfeld JF, Henriksen JH. BNP and N-terminal proBNP are both extracted in the normal kidney. Eur J Clin Invest 2006;36 (1):8-15.

77. Rutten JH, Boomsma F, van den Meiracker AH. Higher renal extraction of ANP compared with NT-proANP, BNP and NT-proBNP. Eur J Clin Invest 2006;36 (7):514-5.

78. Almirez R, Protter AA. Clearance of human brain natriuretic peptide in rabbits; effect of the kidney, the natriuretic peptide clearance receptor, and peptidase activity. J Pharmacol Exp Ther 1999;289 (2):976-80.

79. Smith MW, Espiner EA, Yandle TG, Charles CJ, Richards AM. Delayed metabolism of human brain natriuretic peptide reflects resistance to neutral endopeptidase. J Endocrinol 2000; 167 (2):239-46.

80. Shimizu H, Masuta K, Aono K, Asada H, Sasakura K, Tamaki M, Sugita K, Yamada K. Molecular forms of human brain natriuretic peptide in plasma. Clin Chim Acta 2002;316 (1-2): 129-35.

81. Pankow K, Wang Y, Gembardt F, Krause E, Sun X, Krause G, Schultheiss HP, Siems WE, Walther T. Successive action of meprin A and neprilysin catabolizes B-type natriuretic peptide. Circ Res 2007;101 (9):875-82.

82. Dickey DM, Burnett JC, Jr., Potter LR. Novel Afunctional natriuretic peptides as potential therapeutics. J Biol Chem 2008;283 (50):35003-9.

83. Pemberton CJ, Johnson ML, Yandle TG, Espiner EA. Deconvolution analysis of cardiac natriuretic peptides during acute volume overload. Hypertension 2000;36 (3):355-9.

84. Heublein BK, Boerrigter G, Cataliotti A, Sandberg SM, Redfield MM, Burnett JC. Immunoreactivity and Guanosine 3',5'-Cyclic Monophosphate Activating Actions of Various Molecular Forms of Human B-Type Natriuretic Peptide. Hypertension 2007;49:1114-9.

85. Boerrigter G, Costello-Boerrigter LC, Harty GJ, Lapp H, Burnett JC, Jr. Des-serine-proline brain natriuretic peptide 3-32 in cardiorenal regulation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2007;292 (2):R897-901.

86. Liang F, O'Rear J, Schellenberger U, Tai L, Lasecki M, Schreiner GF, Apple FS, Maisel AS, Pollitt NS, Protter AA. Evidence for functional heterogeneity of circulating B-type natriuretic peptide. J Am Coll Cardiol 2007;49 (10):1071-8.

87. Моисеев ВС. Сердечная недостаточность и достижения генетики. Сердечная недостаточность 2000;1 (4):22-5.

88. ИЗ. Беленков ЮН, Фомин, И . В., Мареев, В. Ю Распространенность хронической сердечной недостаточности в Европейской части Российской Федерации-данные ЭПОХА-ХСН (часть 2). Сердечная Недостаточность 2006;7(3):3-7.

89. Hasking GJ, Esler MD, Jennings GL, Burton D, Johns JA, Korner PI.Norepinephrine spillover to plasma in patients with congestive heart failure:evidence of increased overall and cardiorenal sympathetic nervous activity. Circulation 1986;73:615-21.

90. Wei CM, Heublein DM, Perrella MA, Lerman A, Rodeheffer RJ, McGregor CG, Edwards WD, Schaff HV, Burnett JC, Jr. Natriuretic peptide system in human heart failure. Circulation 1993;88 (3):1004-9.

91. Remme WJ, Swedberg K. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic heart failure. Eur Heart J 2001 ;22 (17): 1527-60.

92. Cowie MR, Mendez GF. BNP and congestive heart failure. Prog Cardiovasc Dis 2002;44 (4):293-321.

93. Clerico A. The increasing impact of laboratory medicine on clinical cardiology. Clin Chem Lab Med 2003;41 (7):871-83.

94. Luchner A, Stevens TL, Borgeson DD, Redfield M, Wei CM, Porter JG, Burnett JC, Jr. Differential atrial and ventricular expression of myocardial BNP during evolution of heart failure. Am J Physiol 1998;274 (5 Pt 2):H1684-9.

95. McDonagh TA, Robb SD, Murdoch DR, Morton J J, Ford I, Morrison CE, Tunstall-Pedoe H, McMurray JJ, Dargie HJ. Biochemical detection of left-ventricular systolic dysfunction. Lancet 1998;351 (9095):9-13.

96. Cowie MR, Struthers AD, Wood DA, Coats AJ, Thompson SG, Poole-Wilson PA, Sutton GC. Value of natriuretic peptides in assessment of patients with possible new heart failure in primary care. Lancet 1997;350 (9088): 1349-53.

97. Mueller C, Scholer A, Laule-Kilian K, Martina B, Schindler C, Buser P, Pfisterer M, Perruchoud AP. Use of B-type natriuretic peptide in the evaluation and management of acute dyspnea. N Engl J Med 2004;350 (7):647-54.

98. Vasan RS, Benjamin EJ, Larson MG, Leip EP, Wang TJ, Wilson PW, Levy D. Plasma natriuretic peptides for community screening for left ventricular hypertrophy and systolic dysfunction: the Framingham heart study. JAMA 2002;288 (10): 1252-9.

99. Redfield MM, Rodeheffer RJ, Jacobsen SJ, Mahoney DW, Bailey KR, Burnett JC, Jr. Plasma brain natriuretic peptide to detect preclinical ventricular systolic or diastolic dysfunction: a community-based study. Circulation 2004; 109 (25):3176-81.

100. Clerico A, Del Ry S, Maffei S, Prontera C, Emdin M, Giannessi D. The circulating levels of cardiac natriuretic hormones in healthy adults: effects of age and sex. Clin Chem Lab Med 2002;40 (4):371-7.

101. Koglin J, Pehlivanli S, Schwaiblmair M, Vogeser M, Cremer P, vonScheidt W. Role of brain natriuretic peptide in risk stratification of patients with congestive heart failure. J Am Coll Cardiol 2001 ;38 (7): 1934-41.

102. Harrison A, Morrison LK, Krishnaswamy P, Kazanegra R, Clopton P, Dao Q, Hlavin P, Maisel AS. B-type natriuretic peptide predicts future cardiac events in patients presenting to the emergency department with dyspnea. Ann Emerg Med 2002;39 (2): 131-8.

103. Cardarelli R, Lumicao TG, Jr. B-type natriuretic peptide: a review of its diagnostic, prognostic, and therapeutic monitoring value in heart failure for primary care physicians. J Am Board Fam Pract 2003;16 (4):327-33.

104. Richards AM, Lainchbury JG, Nicholls MG, Troughton RW, Yandle TG. BNP in hormone-guided treatment of heart failure. Trends Endocrinol Metab 2002; 13 (4): 151-5.

105. Latini R, Masson S, de Angelis N, Anand I. Role of brain natriuretic peptide in the diagnosis and management of heart failure: current concepts. J Card Fail 2002;8 (5):288-99.

106. Troughton RW, Richards AM, Yandle TG, Nicholls G. Routine measurement of natriuretic peptide to guide the diagnosis and management of chronic heart failure.----Circulation 2004; 109 (25):e325-6; author reply e-6.

107. Doust JA, Glasziou PP, Pietrzak E, Dobson A J. A systematic review of the diagnostic accuracy of natriuretic peptides for heart failure. Arch Intern Med 2004; 164 (18): 197884.

108. Pfister R, Schneider CA. Natriuretic peptides BNP and NT-pro-BNP: established laboratory markers in clinical practice or just perspectives? Clin Chim Acta 2004;349 (1-2):25-38.

109. Mueller T, Gegenhuber A, Poelz W, Haltmayer M. Head-to-head comparison of the diagnostic utility of BNP and NT-proBNP in symptomatic and asymptomatic structural heart disease. Clin Chim Acta 2004;341 (l-2):41-8.

110. Quantative immonoradiometric assay kit for the determination of human brain (B-type) natriuretic peptide in plasma product insert]. Shionogi&Co., LTD 2002.

111. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic heart failure. Task force for the diagnosis and treatment of chronic heart failure, European Society of cardiology. Eur Heart J 2001;22:1527-60.

112. Elecsys Systems. Roche Diagnostics product insert]. 2001.

113. Vogeser M, Jacob K. B-type natriuretic peptide (BNP)—validation of an immediate response assay. Clin Lab 2001;47 (l-2):29-33.

114. Biosite Diagnostics Inc. product insert]. 2000.

115. Rawlins ML, Owen WE, Roberts WL. Performance characteristics of four automated natriuretic peptide assays. Am J Clin Pathol 2005; 123 (3):439-45.

116. Hughes D, Talwar S, Squire IB, Davies JE, Ng LL. An immunoluminometric assay for N-terminal pro-brain natriuretic peptide: development of a test for left ventricular dysfunction. Clin Sci (Lond) 1999;96 (4):373-80.

117. Apple FS, Panteghini M, Ravkilde J, Mair J, Wu AH, Tate J, Pagani F, Christenson RH, Jaffe AS. Quality specifications for B-type natriuretic peptide assays. Clin Chem 2005;51 (3):486-93.

118. Waldo SW, Beede J, Isakson S, Villard-Saussine S, Fareh J, Clopton P, Fitzgerald RL, Maisel AS. Pro-B-type natriuretic peptide levels in acute decompensated heart failure. J Am Coll Cardiol 2008;51 (19): 1874-82.

119. Horwich ТВ, Hamilton MA, Fonarow GC. B-type natriuretic peptide levels in obese patients with advanced heart failure. J Am Coll Cardiol 2006;47 (l):85-90.

120. Hemmila I. Fluoroimmunoassays and immunofluorometric assays. Clin Chem 1985;31 (3):359-70.

121. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970;227 (5259):680-5.

122. Schagger H, von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem 1987; 166 (2):368-79.

123. Остерман JIA. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. Москва: Наука 1985.

124. Harlow Е, Lane, D. Antibodies: a laboratory manual. 1988.

125. Kohno M, Horio T, Yokokawa К, Murakawa К, Yasunari К, Akioka К, Tahara A, Toda I, Takeuchi K, Kurihara N, et al. Brain natriuretic peptide as a cardiac hormone in essential hypertension. Am J Med 1992;92 (l):29-34.

126. Ishizaka Y, Yamamoto Y, Tanaka M, Kato F, Yokota N, Kato J, Kitamura K, Eto T, Kangawa K, et al. Molecular forms of human brain natriuretic peptide (BNP) in plasma of patients on hemodialysis (HD). Clin Nephrol 1995;43 (4):237-42.

127. Schulz H, Langvik ТА, Lund Sagen E, Smith J, Ahmadi N, Hall C. Radioimmunoassay for N-terminal probrain natriuretic peptide in human plasma. Scand J Clin Lab Invest 2001 ;61 (l):33-42.

128. Hunt PJ, Espiner EA, Nicholls MG, Richards AM, Yandle TG. The role of the circulation in processing pro-brain natriuretic peptide (proBNP) to amino-terminal BNP and BNP-32. Peptides 1997;18 (10):1475-81.

129. Murdoch DR, Byrne J, Farmer R, Morton JJ. Disparity between studies of the stability of BNP in blood: comparison of endogenous and exogenous peptide. Heart 1999;81 (2):212-3.

130. Belenky A, Smith A, Zhang B, Lin S, Despres N, Wu AH, Bluestein BI. The effect of class-specific protease inhibitors on the stabilization of B-type natriuretic peptide in human plasma. Clin Chim Acta 2004;340 (l-2):163-72.

131. Buckley MG, Marcus NJ, Yacoub MH, Singer DR. Prolonged stability of brain natriuretic peptide: importance for non-invasive assessment of cardiac function in clinical practice. Clin Sci (Lond) 1998;95 (3):235-9.

132. Evans MJ, Livesey JH, Ellis MJ, Yandle TG. Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones. Clin Biochem 2001 ;34 (2): 10712.

133. Niederkofler EE, Kiernan UA, O'Rear J, Menon S, Saghir S, Protter AA, Nelson RW, Schellenberger U. Detection of endogenous B-type natriuretic peptide at very low concentrations in patients with heart failure. Circ Heart Fail 2008; 1 (4):258-64.

Информация о работе

Тамм, Наталья Никитична
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Биохимические и иммунохимические свойства натрийуретического пептида В-типа и его предшественника - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы