Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура и видоспецифичность действия гомолога микроцина B из Pseudomonas syringae

ВАК РФ 03.01.07, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Структура и видоспецифичность действия гомолога микроцина B из Pseudomonas syringae"

На правах рукописи

Метелев Михаил Васильевич

Структура и видоспецифичность действия гомолога микроцина В из Pseudomonas syringae

специальность 03.01.07 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 о:;т 2013

Москва 2013

005536819

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук. Научный руководитель:

Северинов Константин Викторович, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярной генетики микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук. Официальные оппоненты:

Четверина Елена Владимировна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка Российской академии наук

Говорун Вадим Маркович, доктор биологических наук, член-корреспондент РАМН, профессор, заместитель директора ФГУ НИИ физико-химической медицины Федерального медико-биологического агенства

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук. Защита диссертации состоится -¿'-^ 'У 2013 года в ^ на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32. Автореферат разослан ^ ^ 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета канд. фарм. наук

Грабовская Л.С.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Распространение лекарственной устойчивости среди патогенных штаммов различных микроорганизмов значительно сужает спектр доступных антибиотиков, в связи с этим поиск и изучение новых антибиотиков является крайне актуальной задачей.

Данная работа посвящена исследованию гомолога ингибитора ДНК-гиразы микроцина В из Pseudomonas syringae pv. glycinea B076. Микроцин В - пептидный антибиотик, продуцируемый штаммами Е. coli, - является оружием в конкурентной борьбе за выживание между близкородственными видами микроорганизмов. Мишенью микроцина В является ДНК-гираза (топоизомераза типа IIa) - фермент, ответственный за поддержание отрицательной сверхспирализации ДНК бактерий. Известно, что микроцин В стабилизирует двухцепочечный разрыв в ДНК, образующийся во время работы ДНК-гиразы, накопление двухцепочечных разрывов приводит к нарушению процесса репликации и индукции SOS ответа. К сожалению, детальный механизм действия микроцина В и его сайт связывания с ДНК-гиразой в настоящий момент не известны. Изучение механизма ингибирования ДНК-топоизомераз важно для понимания того, как функционируют эти ферменты, а также для разработки новых лекарственных препаратов. В настоящее время антибиотики из группы фторхинолонов, мишенью которых является ДНК-гираза, успешно применяются в клинической практике. Широкое использование фторхинолонов в немалой степени связано с пониманием механизма действия этих антибиотиков.

Микроцин В является рибосомально-синтезируемым пост-трансляционно-модифицируемым пептидом и относится к группе тиазол-оксазол модифицированных микроцинов (ТОММ). Биоинформатические и биохимические данные последних лет свидетельствуют о широкой распространенности ТОММ в природе, и многие из этих соединений представляют интерес с точки зрения разработки новых лекарственных препаратов. Поиск и исследование биологической активности неизученных ТОММ является важной научной задачей.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение гомолога микроцина В из Pseudomonas syringae pv. glycinea B076.

Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи: 1. Получить и очистить гомолог микроцина В из Pseudomonas syringae pv. glycinea B076;

2. Определить его химическую структуру (характер циклизации);

3. Исследовать антибактериальную активность полученного вещества;

4. Выявить и проанализировать опероны бактерий рода Pseudomonas, гомологичные mcb

оперону P. syringae.

Научная новизна и практическая значимость работы

В работе были обнаружены опероны, гомологичные mcb оперону Е. coli, в геномах нескольких патоваров растительных патогенов Pseudomonas syringae. Было показано, что при гетерологической экспрессии в клетках Е. coli с оперона mcb Pseudomonas syringae pv. glycinea B076 производится два варианта P. syringae микроцина (P.s-McB). Было выявлено, что микроцин из Е. coli (£с-МсВ) и Л-МсВ обладают разной специфичностью действия. Ес-МсВ не активен в отношении бактерий рода Pseudomonas, в то время как /VMcB является эффективным ингибитором роста таких бактерий. Важно отметить, что Л-МсВ способен ингибировать рост патогенного для человека штамма Р. aeruginosa PAOl. Также было показано, что специфичность действия микроцинов не зависит от специфичности взаимодействия с ДНК-гиразой и, по-видимому, определяется эффективностью транспорта внутрь клетки. Было продемонстрировано, что три немодифицированные аминокислоты в центральной области микроцина Ps-McB отвечают за специфичность действия в отношении штаммов рода Pseudomonas. Полученные результаты открывают новые возможности для конструирования пептидов, подобных микроцину В Е. coli, но с измененным спектром действия.

В геномах различных бактерий рода Pseudomonas были идентифицированы опероны, гомологичные оперону mcb Е. coli. Показано, что эти опероны кодируют вещества, способные ингибировать рост бактерий, но действие которых отлично от действия микроцина В Е. coli и Р. syringae. Дальнейшее изучение этих веществ перспективно с точки зрения поиска новых антибиотиков.

Публикации и апробация работы

По результатам диссертационной работы было опубликовано 4 печатные работы, в том числе 1 статья в международном рецензируемом журнале и 3 тезиса конференций. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: 1) «X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова», 14-17 ноября, 2011, Москва, Россия; 2) «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», 22-24 ноября, 2012, Казань, Россия (международная конференция); 3) Конгресс Федераций

европейских биохимических обществ 2013 «Биологические механизмы», 6-11 июля, 2013, Санкт-Петербург, Россия (международная конференция).

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов работы, заключения, выводов, благодарностей и списка использованной литературы. Работа изложена на 96 страницах машинописного текста, включая 29 рисунков и 2 таблицы. Список цитируемых литературных источников включает 121 наименование.

II. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение

Микроцин В - антибиотик пептидной природы, синтезируемый некоторыми штаммами Е. coli. Клетки Е. coli, которые продуцируют микроцин В, содержат оперон из 7 генов (mcbABCDEFG'). Ген тсЬА кодирует пептид-предшественник, гены тсЬВ, тсЬС и mcbD кодируют субъединицы ферментативного комплекса BCD. Гены тсЬЕ и mcbF ответственны за транспорт созревшего микроцина из клетки. Последний ген mcbG кодирует белок, который необходим для защиты от действия антибиотика внутриклеточной мишени микроцина - ДНК-гиразы продуцирующих микроцин клеток . Пептид-предшественник микроцина В имеет длину 69 аминокислот, из которых 26 N-концевых остатков составляют лидерную последовательность, а оставшиеся 43 аминокислоты образуют модифицируемый пептид. Ферментативный комплекс McbBCD специфически узнает лидерную последовательность, а затем вносит тиазольные и оксазольные гетероциклы в пептид МсЬА. Модификации подвергаются остатки серинов и цистеинов, которым предшествует глицин. Основная форма микроцина В, которая экспортируется из клетки, содержит 4 оксазольных и 4 тиазольных гетероцикла. Помимо одиночных гетероциклов в последовательности микроцина В есть оксазол-тиазольный и тиазол-оксазольный бис-гетероциклы, образующиеся в результате модификации трипептидов GlySerCys и GlyCysSer (сайты А и Б на рис. 1). В последовательности пептида-предшественника есть еще один трипептид GlyCysSer (сайт С на рис. 1), однако, производимый микроцин, как правило, содержит в этом

месте не бис-гетероцикл, а либо отдельный тиазольный гетероцикл, либо тиазольный гетероцикл и сложноэфирную связь, соединяющую аминокислотные остатки 51 и 52.

До последнего времени, микроцин В из Е. coli оставался единственным представителем ТОММ, ингибирующим ДНК-гиразу.

Идентификация mcb оперонов P. svrinsae

В базе данных NCBI пг при помощи программы BLASTp был проведен поиск (со стандартными параметрами) аминокислотных последовательностей схожих с последовательностью белка McbB (Р23184), компонента синтетазы микроцина В. Был обнаружен ряд последовательностей с высоким уровнем сходства (значение e-value менее 10"41). Найденные последовательности были обнаружены в геномах растительных патогенов Pseudomonas syringae патоваров glycinea и aesculi.

Анализ областей генома в окрестностях обнаруженных последовательностей выявил наличие полного набора генов, гомологичных генам оперона микроцина В Е. coli (рис. 1), в том числе и ген, кодирующий предположительный пептид-предшественник. Предсказанный пептид-предшественник МсЬА из P. syringae содержит аналогичный пептиду МсЬА из Е. coli набор GlySer и GlyCys дипептидов, а так же трипептиды GlySerCys и GlyCysSer в сайтах А и В, соответственно. На месте сайта С, в котором Е. coli МсЬА содержит трипептид GlyCysSer, в последовательности Р. syringae МсЬА находятся аминокислоты GlyCysGly. Как следствие, в этом сайте может образовываться только один тиазольный гетероцикл.

Последовательности пептидов-предшественников, закодированные в различных патоварах, идентичны за исключением позиции 60, в которой у патоваров glycinea находится треонин, а у патовара aesculi - пролин. Оперон mcb встречается не во всех штаммах Р. syringae: штаммы P. syringae pv. tomato str. DC3000, pv. syringae str. B728a и pv. phaseolicola str. 1448A не содержат этого оперона.

Исследование продукции вещества, подобного микроцину В. штаммом P. svrinsae pv. elvcinea В076

Для штамма P. syringae pv. glycinea В076, содержащего оперон, гомологичный оперону mcb Е. coli, была проанализирована способность производить вещество, подобное микроцину В. Анализируемые клетки выращивались на чашках с агаризованной средой при различных условиях (богатая среда LB, минимальные среды М9 и 925, pH 5-7.5, температура - от 4 до 30 °С, время роста - от 24 до 100 часов). Поверх чашек с выросшими клетками Р. syringae pv. glycinea В076 высевался газон тестируемых бактерий - Е. coli BL21 (DE3) и DH5a и Р. syringae В728, DC3000 и 1448а - и чашки инкубировали в течение 24 часов.

f. ООв Л)СЬ

Р. syrtrijae mcb

cmwi

P»Htb»(J« gfrono»)! ft-мсм Оманат.

Рис. 1. А. Схемы оперонов mcbABCDEFG Е. coli и Р syringac. Гены mcbBCD кодируют сннтстазу ми кропи на В; гены тсЬЕУ колируют компоненты транспортера микроцина В; ген тсЬС кодирует пентапептнлнын белок, необходимый для устойчивости к микроцину В. Б. Аминокислотное выравнивание продуктов генов тсЬЛ из £ coli и Р. syringac иатоваров glycinea и aesculi. Черными буквами обозначены ли- и трипептмды. которые могут участвовать в гетсроннклизаини. Трипептиды, которые могут участвовать в образовании слитых бис-гетсроциклов (сайты А и В), выделены рамкой: сайт С £с-МеЬЛ также выделен рамкой. Отмечены место отрезания лнлерной последовательности £с-МсЬА и предположительное место отрезания Р. .syringac McbA. Пептиды-предшественники штаммов Р. syringac отличаются по 60-й аминокислоте. Римскими цифрами обозначены основные места отличи* последовательностей £c-McbA и Pt-McbA.

Ни при одном из тестированных условий нам не удалось обнаружить зоны

ингибироваиия роста вокруг клеток штамма Р. syriitgac pv. glycinea В076. Как и ожидалось,

использованный в качестве положительного контроля игтамм £ coli, продуцирующий

микроцин В, ингибировал рост клеток Е. coli BL2I (DE3) и DH5a. Интересно, что

продуцирующие микроцин В клетки Е. coli не оказывали зффекта на рост Р. syringac,

которые, очевидно, не чувствительны к микроцину В (см. также ниже). Помимо тестов иа

биологическую активность были предприняты попытки детектировать продукцию всшесгва.

подобного микроцину В. клетками Р. syryngae pv. glycinea В076 методами масс-

спсктромстрии. Было проведено тестирование зкетрактов образцов агаризоваииой среды,

взятых непосредственно вблизи расту щих клеток Р. syringac pv. glycinea В076, а также самих

клеток на наличие всшесгва в диапазоне масс от 1000 до 5000 Да (поскольку невозможно

точно предсказать массу созревшего всшесгва. не зная сайта отрезания лидерной

последовательности от модифицируемого пептида, если таковой имеется). Клетки Е coli,

производящие микроцин В, помимо полностью созревшего вещества, содержащего 8

7

гетероциклов, секретируют наружу продукты с 7 и 6 гетероциклами. Поскольку образование гетероциклов приводит к снижению массы модифицируемого пептида на 20 Да, для масс-спектров препаратов микроцина В Е. coli характерны серии пиков, отличающихся друг от друга по массе на 20 Да. Анализ масс-спектров клеток Р. syringae pv. glycinea В076 или образцов агаризованной среды, взятых непосредственно поблизости от растущих клеток, не выявил таких характерных серий пиков в указанном диапазоне масс. Несмотря на то, что нам не удалось детектировать продукцию микроцин B-подобного вещества клетками Р. syryngae pv. glycinea В076, нами было обнаружено, что гены оперона тсЪ транскрибируются на уровне, сравнимом с уровнем транскрипции важного гена «домашнего хозяйства» gyrA.

Гетерологическая продукция Р. svrineae микроцина В в клетках Е. coli

Поскольку при тестированных условиях роста нам не удалось обнаружить продукцию вещества, подобного микроцину В, была предпринята попытка гетерологической экспрессии тсЪ оперона Р. syringae в клетках Е. coli. Полный оперон (mcbABCDEFG) был заклонирован в экспрессионный вектор под контроль регулируемого промотора araBAD, таким образом, что старт-кодон первого гена оперона (тсЬА) располагался на оптимальном расстоянии от консенсусной последовательности Шайна-Дальгарно, расположенной в векторе. Клетки Е. coli BL21(DE3), содержащие вектор с тсЪ опероном, были индуцированы арабинозой для активации транскрипции тсЪ оперона. Для выделения продуцируемых пептидов использовалась процедура, аналогичная выделению микроцина В Е. coli: клетки, продуцирующие микроцин, лизировались в уксусной кислоте, затем лизат клеток подвергался первичной очистке на С18 картридже, финальной стадией очистки являлась обратнофазная ВЭЖХ [Sinha Roy et. al., 1999]. В качестве контроля использовались клетки Е. coli BL21 (DE3), содержащие вектор без вставки. На хроматограмме, приведенной на рисунке 2, показаны результаты обратнофазной ВЭЖХ образца из клеток, содержавших плазмиду с mcb опероном Р. syringae.

Масс-спектрометрический анализ выявил, что более ранний хроматографический пик (время элюции 13,5 минут) содержит масс-ион со значением m/z=2302,8 [МН+], а так же минорный +20 Да масс-ион со значением m/z=2322,8 [МН+]. В более позднем хроматографическом пике был обнаружен мажорный масс-ион со значением m/z=2822,0[MH+] и два минорных масс-иона со значениями m/z=2842,0 [МН+] и 2862,0[МН+], соответствующие продуктам недоциклизации.

Рис. 2. ВЭЖХ профиль финальной стадии очистки всщсстп. продуцируемых при гстсрологичсской экспрессии в Е coli оперона пкЬ P. syringae. Два пика, обозначенные как Л*-МсВ1 и /'.s-McIi2, отсутствуют в контрольном образце (материале из клеток, содержащих вектор без вставки). В рамках изображены фрагменты MALDI-MS масс-спектров, снятых с материала, полученного при сборе каждой из фракций. Для мажорных масс-ионов, а также для минорных масс-ионов, соответствующих недоциклизованным продуктам реакции гетероциклизации (+20 Да), приведены значения т/г.

МС/МС спектры фрагментации масс-ионов со значениями т/г=2302,8 и 2822,0 приведены на рис. ЗА. Анализ спектров фрагментации был произведен с использованием сервиса Mascot MS/MS Ion Search. Представленные на рисунке ЗВ структурные формулы пост-траисляциоино модифицированных и процессированных МсЬА Р. syrlngae согласуются с результатами анализа МС/МС спектров фрагментации. Обе формы модифицированного микроцииа Р syringae. найденные в двух хроматографических пиках, содержат восемь гетсроциклов (4 одиночных тназольных и оксазальных пчероцикла и два слитых бис-гстероцикла), имеют идентичный N-коиец (соответствует Leu" Р. syrmgae МсЬА). который возникает после отрезания лидерной последовательности от модифицируемой части, содержащей гстсроциклы. Два вещества отличаются только С-коицевыми частями. Вещество, обнаруженное в минорном х ром ато графическом пике, имеет С-консц. соответствующий С-концу предсказанною P. syringae МсЬА. данная форма микроцина ниже будет обозначаться как ft-McBl. Всшесттю. обнаруженное в мажорном хроматографическом пике, ниже будет обозначаться как Л-МсВ2, укорочено с С-конца и его последней аминокислотой является Ser*1. Далее микроцин В, продуцируемый Е. coli, будет

9

обозначаться как £с-МсВ. Ранее было отмечено, что пептид-предшественник МсЬА штамма P. syringae pv. aesculi sir. NCPFB 3681 солержнт пролнн в позиции 60, в то время как в штаммах pv. glycinea в этой позиции присутствует треонин. На основе экспрессионного вектора, содержащего тсЬ оперой из P. syringae pv. glycinea, была создана конструкция, в которой в ген тсЬА была введена мутация, приводящая к аминокислотной замене Thr**1 на пролин. Клетки £ coli, экспрессируюшие такой вариант олерона. производят две формы мнкроцииа полностью аналогичные Pi-McBl и й-МсВ2.

»J»

О Р

as tgsggsggngg scg g gg cg g cg gg

• 4

1 - „„ "fr" ,

I. I, I 1 I.....t-l

Ttl T T

JJl^LJJlJjlI

0 <5

g scg g

j JJLJw

2822 0

s tgsggsggngg scg gggcg g об cg q gg scg gl

i» fj»i"

in

jl

900

1000

1500

2000

2900

ml!

ес-Мсв

pi-mcbl

Ps-Mc82

-•-О

Рис. 3. А. МС/МС спектры фрагментации А*-МсВ1 (сверху) и Л-МсВ2 (снизу). В спектрах присутствуют серии А- и пионов (обозначены только v-ионы). К-ноны, соответствующие местам образования тназольных и оксазольных гетероциклов, отсутствуют (эти связи устойчивы к фрагментации). Б. Структура £с-МсВ и структуры Р.«-МсВ1 и />*-МсВ2, соответствующие результатам МС/МС анализа.

ес мсв 5 ,s ■ ■ ее кл

■ PvMcBt Л ■ ■ ■ ■ (ЧМгв!

■ pvhcbj | ■ ■ ■ api-mdu

U" i: u J J

xu в4л и. i вы hc 1455 mbl&ss ncius

ЛЛ>пИ ton** f»tftW7MR <пкьС

Рис. 4. А. 2 мкд раствора, содержащего 50 мкМ кон цен грации £с-МсВ. Ps-McBI. /VMcB2 или 20 мкМ концентрацию ципрофлоксааина (cfx), было нанесено на поверхность гшона клеток £ со// XLI Blue лнкого типа или н:югснных штаммов, содержащих делению генов shmA или ompF. Диаметр зон ннгнбирояання роста (в мм) измерялся после инкубации мри комнатной температуре в течение 16 часов. Б. 2 мкл раствора, содержащего 200 мкМ концентрацию £с-МсВ. /ъ-McBI, АЧ-МсВ2 или 20 мкМ концентрацию ципрофлоксацина. было нанесено на поверхность газона клеток £ coli MG 1655 лнкого типа, производного штамма, несущего мутацию в гене gyrB (W75IR). или штамма лнкого типа, содержащего плазм иду. экспресснрующую ген mcbC £ coli.

Pv-McBI н /Ч-МеВ2 ингнГ»111)Уи>1 рост клеток f. coli н .icficiwvioi на ЛИК-mnaiv

/VMcBI и /VMcB2 были очищены при помошн ВЭЖХ. С использованием стандартного микробиологического теста (ингибнропаннс роста пиона клеток 8 мягком aiapc) была проверена биологическая активность данных веществ в отношении штаммов £. coli BL21 (DE3). XLI Blue и MGI655. /'.«-Me ВI ннгибирует рост тестяруемых штаммов Е-соП, однако его активность заметно ниже £с-МсВ (рис. 4, 6). Несмотря на то, что при концентрациях, используемых в эксперименте. />j-McB2 не ннгибирует рост штамма МО 1655 (KI2 шгамм), такой вариант мнкроцина ннгибирует рост £ coli BL2I (DE3) н XLI Blue (также штамм К12). Причина различной чувствительности штаммов £ coli к Л-МсВ (и к £с-МсВ) в настоящее время неизвестна.

£с-МсВ и /VMcB не активны в отношении штамма XLI Blue, содержащего делению гена sbmA. кодирующего расположенный на внутренней мембране транспортер, который необходим для транспорта £с-МсВ внутрь клетки (рис. 4А) [Lovina el. а!.. 1986]. Порин OmpF, расположенный на внешней мембране клеток £ coli, участвует в проникновении Ее-МсВ внутрь клетки. Деления гена ompF снижает чувствительность штамма XI. I Blue к обоим микроцннам (£с-МсВ и Л-МсВ) и влияет на эффективность действия щпрофлоксацина,

использовавшегося в качестве контроля. Таким образом, можно утверждать, что транспорт £с-МсЕ! и Ps-МсВ в Е. coli происходит одним и тем же путем.

Д$-МсВ1 не ингибирует рост клеток MG1655, содержащих мутацию в гене, кодирующем В субъединицу ДНК-гиразы (замена W751R, приводящая к устойчивости к Ес-МсВ) (рис. 4Б). Экспрессия плазмидной копии гена mcbG (закодированного в тсЪ опероне Е. coli или Р. syringae) в клетках MG1655 значительно снижает чувствительность к £с-МсВ и делает их полностью устойчивыми к P.s-McB 1 (при тех концентрациях, которые использовались в эксперименте). Эти результаты указывают на то, что внутриклеточной мишенью Ps-МсВ, так же как и Ее-МсВ, является ДНК-гираза Е. coli.

Для ответа на вопрос, способен ли Ps-МсВ индуцировать SOS ответ в Е. coli, на основе вектора, использовавшегося для гетерологической экспрессии оперона тсЪ Р. syringae, были созданы две генетические конструкции. Первая конструкция представляет собой тсЪ оперон Р. syringae, в котором делегирован ген mcbG (кодирует пентапептидный белок, необходимый для защиты ДНК-гиразы от Ее-МсВ), во второй конструкции помимо гена mcbG делегированы гены mcbEF, гомологи которых кодируют транспортер для экспорта £е-МсВ. Плазмидные вектора, содержащие полноразмерный оперон и варианты без генов автоимунности, использовались для трансформации клеток репортерного штамма Е. coli CSH50 sßA::lacZ, в котором экспрессия гена lacZ контролируется LexA-зависимым sfiA промотором. При индукции SOS ответа в результате накопления двухцепочечных разрывов такие клетки на агаризованой индикаторной среде McConkey образуют окрашенные в фиолетовый цвет колонии. В присутствие арабинозы (индуктора экспрессии mcb оперона), клетки CSH50 sfiAr.lacZ, несущие на плазмиде полноразмерный Р. syringae mcb оперон, образуют колонии белого цвета. Клетки с плазмидой, несущей оперон с генами mcbABCDEF, образуют колонии розового цвета, а клетки с плазмидой, несущей оперон с генами mcbABCD, формируют колонии фиолетового цвета (рис. 5А). В отсутствие индуктора клетки, несущие все три плазмиды, образовывали колонии белого цвета. Сходные результаты были получены и с клетками CSH50 sfiA::lacZ, трансформированными плазмидами на основе mcb оперона Е. coli. Данные результаты указывают на то, что mcb оперон Р. syringae ответственен за продукцию вещества, которое способно индуцировать SOS ответ в клетках Е. coli, в условиях, когда нарушен экспорт этого вещества из клетки (транспортеры McbEF) или отсутствует пентапептидный белок McbG, способный защищать ДНК-гиразу от действия микроцина В.

А

Б

\ * И!

3 в л * t

гжыагяк,

Л

Арабиноза

Арабимоза ♦

) ) « 5

Нис. 5. А. Штамм £ coli CSH50 sfiA::lacZ, трансформированный плазм идам и. жспреесируюпшми указанные гены оперона Р syringae mch. на чашкам с индикаторной срслой Mact'onkey agar. Клетки инкубировались на 30 "С в отсутствие (слева) или в присутствие (справа) индуктора экспрессии - арабинозы. Б. Нлазммла pUCI9 инкубировалась с ДНК-гираэой из £ coli (сверху) или P. syringae (сниту) в отсутствие (лорожка I) или в присутствие указанных ингибиторов (дорожки 2-5). Продукты реакции разделялись при помощи электрофореза в атарозноч геле, содержащем бромистый этилий. "ОС" - редактированная ДНК. "I." - линейная форма ДНК. "SC" - супсрскрученная ДНК.

Также, были исследованы эффекты Лт-MsB 1 и /VMcB2 на кататизнруемую ДНК-гнразой реакцию су перекручивания ДНК in vitro. При инкубации ДНК-тираты с рслаксированой плазмндной ДНК в присутствие ингибиторов, таких как ципрофлоксаиин или микроцин В, происходит стабилизация промежуточного каталитическою комплекса тираза-ДНК, что приводит к накоплению линейной формы плазмнды. Накопление линейной формы ДНК может быть детектировано с помощью электрофореза в агарозном геле. Нами была протестирована активность вариантов микроцииа в отношении рскомбинаннтых ДНК-гираэ из £ coll и Р syringae. В качестве положительною контроля использовали ципрофлоксаиин. Было показано, что инкубация ДНК-гнразы с рслаксированной плазмидой в присутствие 30 мкМ Бс-МсВ приводит к накоплению линейной формы плазмнды (рис. 5Б, лорожка 3). Интересно, что £с-МсВ ингибировал как ДНК-г иразу. выделенную из £ coli, так и из Л syringew. Инкубация ДНК-тиразы с рслаксированной плазмндной ДНК в присутствие 30 мкМ инпрофлоксацина приводит к накоплению значительно больших количеств линейной формы ДНК (рис. 5Б. лорожка 2), что согласуется с ранее опубликованными данными, показывающими, что антибиотики из группы фторхинолонов являются более эффективными ингибиторами ДНК-гиразы £. coli, чем £с-МсВ [HeJdle el. а!.. 2001\. Инкубация обоих вариантов Лт-.МсВ с ДНК-тиразой как из £. coli, так и из Р syringae, приводила к накоплению одинаковых количеств линейной ДНК плазмилы. Количества

линейной ДНК, образованные в присутствие P.s'-McB 1 и Л-МсВ2 были эквивалентны количествам, образовавшимся в реакциях, содержавших £с-МсВ (рис. 5Б, сравнение дорожек 4 и 5 с дорожкой 3). Таким образом, можно заключить, что оба варианта Л-МсВ ингибируют ДНК-гиразу in vitro и уровень ингибирования соответствует уровню ингибирования £с-МсВ.

Вндоспеинфичность действия /УМсВ и Ес-МсВ

Четыре штамма P. syringae, один из которых содержал оперон mcb (P. syringae pv. glycinea В076), а три - не содержали его (pv. tomato DC3000, pv. syringae B728a и pv. phaseolicola 1448a), а также штамм P. aeruginosa PAOl, были протестированы на чувствительность к /J.s-McB 1, fs-MsB2, £с-МсВ и ципрофлоксацину (тестировалось ингибирование роста газона клеток в мягком агаре). В качестве контроля использовались клетки Е. coli BL21 (DE3). Ципрофлоксацин ингибировал рост всех тестированных бактерий. £с-МсВ ингибировал рост Е. coli, но был неактивен в отношении всех тестированных бактерий рода Pseudomonas. Оба варианта fs-McB ингибировали рост Р. aeruginosa и штаммов Р. syringae, в которых не содержался mcb оперон, и были активны в отношении штамма BL21 (DE3), однако активность была значительно ниже по сравнению с £с-МсВ. Таким образом, можно заключить, что, несмотря на то, что варианты Л-МсВ являются менее эффективными антибиотиками в отношении штаммов Е. coli по сравнению с £с-МсВ, в отличие от последнего, они являются эффективными ингибиторами роста бактерий рода Pseudomonas. Штамм Р. syringae pv. glycinea В076 был не чувствителен к обеим формам Ps-МсВ, что указывает на то, что в нем образуется достаточное количество продуктов генов mcbEFG для обеспечения резистентности.

На рисунке 6А представлены результаты сравнения активности Ее-МсВ, Ps-McBl и /3.у-МсВ2 в отношении Е. coli BL21 (DE3) и Р. aeruginosa PAOl.

Сравнение химических структур £с-МсВ и Ял-МсВ1 показывает, что они различаются в трех районах (рис. 6Б). Во-первых, £с-МсВ содержит N-концевой пептид VGIG(G)9 перед первым слитым бис-гетероциклом сайта A, a /VMcBl и Ял-МсВ2 содержат в этом месте дипептид LG. Во-вторых, £с-МсВ содержит дипептид SN между тиазольным гетероциклом и вторым слитым бис-гетероциклом сайта В, в то время как оба варианта /VMcB содержат в этом месте трипептид GGG. Наконец, на С-конце £с-МсВ находится аминокислотная последовательность GSHI, в то время как на С-конце /VMcBl и Л-МсВ2 находятся последовательности GTSAPDHV и GTS, соответственно. Мы предположили, что одно из этих отличий или их комбинация может отвечать за наблюдаемую видоспецифичность

действия вариантов микроцима. Для того чтобы определит!, ключевое место, ответственное за специфичность действия, на основе плазмнд, содержащих mcb оиероны Е. coli и Р. syringae, были созданы шесть конструкций с химерными mchA генами. Соданные химерные варианты схематически изображены на рисунке 6 В. IIa основе нлазмиды, содержащей mcb онером £. со/т. были созданы три конструкции, колирующие варианты £с-МсЬА. содержащие I) VG дипептид вместо N- концевой последовательности VGIG(GK 2) üüG вместо SN в центральной области исіпнла. 3) С-концевую аминокислотную последовательность GTSAPDHV вместо GSIII. На основе илазмиды содержащей mcb оиерон P. syringae были созданы три конструкции, кодирующие варианты /».»-McbA. содержащие I) N-концсвую последовательность VGIG(G)v перед первым образующимся бис-гстероциклом вместо липептила I.G. 2) SN дипептид вместо трипептнла GGG в центральной области пептида и 3) С-концевую последовательность GSIII вместо GTSAPUIIV.

Рис. 6. Специфичность действия /Ч-МсВ н £с-МсВ. А. 2 мкл раствора, содержащего 200 мкМ кон цен граи и £с-МсВ, /Ъ-МсВ! иди №МсВ2 было нанесено иа гимн клеток Е coli BI.2I(DE3) или Р. aeruginosa PAOI. Клетки инкубировались в течение 16 часов при комнатной температуре, после чего измерялся диаметр зон ингибировани» роста (в мм). Б. Природные н химерные варианты микроциов изображены слева. Вещества отличаются наборами фрагментов, обозначенных как I. II и III. которые различны у £с-МсВ и />л-МсВ. Все пешесгва, содержащие полный набор гстсроииклов (молекулярные массы указаны в центре), были очищены и но 2 мкл раствора, содержащего 200 мкМ концентрацию соответствующею пептида, нанесено иа газоны клеток Е. coli MG 1655 и Р aeruginosa PAOI. Приведены диамегры зон ннгибиронания роста (в мм) после инкубации.

I I И й N

лммпр км албеим рост«

мы*»

■ мо!

ММ

Все плазмиды, кодирующие химерные конструкции, были трансформированы в клетки Е. coli и продуцированные варианты микроцинов были очищены с использованием стандартной методики очистки, разработанной для Ее-МсВ [Sinha Roy et. al., 1999]. Структура образующихся веществ была подтверждена при помощи масс-спектрометрического анализа. Оказалось, что все вещества содержали полный набор тиазольных и оксазольных гетероциклов. При экспрессии химерного варианта, созданного на основе £с-МсВ и содержащего С-концевую последовательность GTSAPDHV из Ял-МсЬЛ, продуцировалась только одна форма микроцина (С-концевой пептид APDHV не отрезался).

Для всех полученных вариантов микроцина была протестирована их способность ингибировать рост клеток на газонах в мягком агаре (рис. 6Б). Тестирование проводилось на штаммах P. aeruginosa PAOl и Е. coli MG1655. Вещество с заменой С-концевых аминокислот £с-МсВ на соответствующие аминокислоты Ps-McBl (на рисунке обозначено, как «£с-МсВШ»), было менее активно в отношении тестируемых клеток Е. coli, чем £с-МсВ, а активности в отношении P. aeruginosa PAOl не наблюдалось. Напротив, замена С-концевых аминокислот Л-МсВ1 на аминокислоты £с-МсВ (/'s-McBIII) привела к увеличению активности в отношении Е. coli по сравнению с Л-МсВ1 (наблюдаемая активность эквивалентна таковой для £с-МсВ). Полученные результаты говорят в пользу того, что С-концевые аминокислоты в значительной степени влияют на активность в отношении штаммов Е. coli, однако не определяют видоспецифичность действия в отношении Pseudomonas. Вариант £с-МсВ, содержащий VG дипептид вместо N-концевой последовательности VGIG(G)9 (£е-МсВ1), по своей активности был практически неотличим от £с-МсВ (хорошо действует на MG1655 и не действует PAOl). Таким образом, можно заключить, что N-концевая глицин-богатая последовательность Ее-МсВ несущественна для биологической активности. Отсутствие активности этого вещества в отношении Pseudomonas говорит о том, что N-концевая последовательность не является детерминантой видоспецифичности действия исследуемых микроцинов. Интересно, что модифицированный вариант Ps-McB, содержащий N-концевые аминокислоты VGIG(G)9 (Ps-McBI), становится активнее в отношении клеток Е. coli, чем немодифицированный P.s-МсВ, однако теряет активность в отношении Pseudomonas. Полученный результат свидетельствуют о том, что удлиненный N-конец блокирует способность Pi-McB ингибировать Pseudomonas. Возможно, причина кроется в том, что такая последовательность ингибирует транспорт вещества внутрь клеток Pseudomonas, либо маскирует последовательность, необходимую для узнавания этими транспортерами. Вариант /VMcB, содержащий дипептид SN вместо трипептида GGG (Л?-МсВП) в центральной области пептида, оказался неактивен в отношении и Е. coli

16

MG1655 и P. aeruginosa (однако, данный вариант микроцина ингибирует рост более чувствительных к микроцину В клеток Е. coli BL21(DE3), данные не приведены). Наиболее важным результатом является то, что вариант Ее-МсВ, содержащий в центральной области три глицина вместо SN (£e-McBII), сохраняет способность ингибировать рост клеток Е. coli MG1655 и приобретает способность ингибировать Р. aeruginosa. Таким образом, мы делаем вывод, что наличие центрального трипептида GGG является необходимым и достаточным условием для биологической активности против бактерий рода Pseudomonas.

Исследование продукции вещества, подобного микроцину В. закодированного в put опероне Pseudomonas putida КТ2440

В геноме почвенной бактерии Pseudomonas putida КТ2440 ранее был обнаружен оперон (далее обозначается как оперон put), родственный mcbABCDEFG оперону синтеза микроцина В Е. coli. В put опероне присутствуют гомологи всех генов mcb за исключением гена mcbG. Было сделано предположение, что оперон put может обеспечивать синтез вещества, подобного микроцину В Е. coli, но активного в отношении почвенных бактерий, конкурирующих с Р. putida КТ2440. Ген putA кодирует предполагаемый пептид-предшественник, содержащий характерные GlyCys и GlySer дипептиды, которые при модификации белками синтетазного комплекса BCD могут быть конвертированы в тиазольные и оксазольные гетероциклы (рис. 7А). Однако взаимное расположение аминокислотных остатков, которые могут участвовать в гетероциклизации, заметно отличается от последовательности гетероциклов в микроцинах из Е. coli и P. syringae. Так, например, отсутствуют трипептиды GlyCysSer и GlySerCys, которые могли бы быть конвертированы в слитые бис-гетероциклы. На настоящий момент, так же как и в случае со штаммом P. syringae pv. glycinea В076, обнаружить продукцию штаммом P. putida КТ2440 вещества, подобного микроцину В, не удалось. Была предпринята попытка гетерологической экспрессии put оперона в клетках Е. coli. Полный put оперон был клонирован в экспрессионный вектор под контроль промотора oraBAD. Клетки Е. coli, содержащие такой вектор способны продуцировать микроцин-подобное вещество. Очистка продуцирующихся пептидов проводилась согласно процедуре, основанной на процедуре выделения микроцина В приводившейся выше. При хроматографии материала, полученного из клеток, содержавших плазмиду с put опероном, идентифицируются несколько пиков (рис. 7Б, 20 минута элюции), отсутствующих в контрольном образце (материал, полученный из клеток, содержащих плазмиду без вставки).

Д А В С D Е F

putida put #

MENQYGlSVMELASOTHgy<EA£FfGGSGSAGGCGGSGGCGGGGGCKGGSGGSGGSGGNNGlHHDPVTl

минуты

Рис. 7. А. Схема pul оперона Г. pulida КТ2440. Ген ршЛ кодирует предположи! ел ьпый пептид-предшественник (приведена аминокислотная последовательность, подчеркнуты аминокислоты, которые могут подвергаться модификации синтстазным комплексом BCD). Гены pulBCDEF гомологичны генам mcbBCDEF. Б. ВЭЖХ профиль финальной стадии очистки Продуцируемых веществ при гетерологнческой экспрессии оп.-рона put в Е. coli. Отмечен пик. в котором присутствует масс-ион с т/г*3183.2 содержащий P/vMcB. В. Предположительная структура Я/vMcB, соответствующая последовательности пептида-предшественника PulA и данным МС7МС анализа.

Масс-спсктрометрический анализ материала большего из пиков выявил наличие масс-ноиа со значением m/r=3183.2 (МН+). MC/MC анализ этого масс-иона подтвердил, что выявленное вещество является продуктом модификации псптила-прсдшсствснника, закодированного в put опероне. Основываясь на известной первичной последовательности пептида-предшественника и данных МС/МС спектров фрагментации, нами была предложена химическая структура продуцируемого пептида (рис. 7В). Тиазольиые и оксазольиые гстероциклы образуются в результате конвертации всех липептидов GlyCys и GlySer,

18

присутствующих в последовательности пептида-предшественника PutA, эа исключением второго дипептила Gly^Ser10. Помимо этого, модифицированный PutA орезастся как с N-конца (первой аминокислотой в зрелом пептиде является Met20), так и с С-конца (последняя аминокислота зрелого пептида - Gly41). Далее такой модифицированный пептид будет обозначаться как /у>-МсВ.

Биологическая акчииносп. /У-МсВ

Для тестирования биологической активности Рр-МсВ был очинён при помощи ВОЖХ. Штаммы £. coli BL2I (DB3) и ОП5о, Р. syringae pv. lómalo sir. DC3000, pv. syringae str. B728a и pv. phaseolicola sir. I448A, P. pulida KT2440 (содержащий оперон put), и Pseudomonas pulida АТСС 12633 (полностью отсеквенированый, не содержащий ни одного гена оперона рм) были протестированы на чувствительность к />/>-МсВ. /'/?-МсВ не ингибировал рост ин одного из тестируемых штаммов. Поскольку нам не удалось найти штамм бактерий, чувствительных к /J/?-McB, мы протестировали, токсичен ли образующийся Рр-МсВ для клеток-продуцентов. в условиях нарушения экспорта, т.е. при делеции генов транспортеров PutEF. Оказалось, что экспрессия укороченной версии ооерона (putA BCD) приводит к ингибнрованию роста клеток (рис. 8А). Ингнбнрования роста клеток, экспрессировавших полноразмерный put оперон. не наблюдалось. Полученный результат свидетельствует о том, что производящийся и накапливающийся внутри клеток У/ьМсВ (или продукт его распада) является токсичным. Таким образом, можно предположить, что Рр-МсВ может обладать антибактериальной активностью. Отсутствие ингибировання роста при добавлении экзогенного /'/'•МсВ может быть связано с тем, что это вещество не транспортируется внутрь клеток Е. coli. Для доказательства этого утверждения требуются дополнительные эксперименты.

В in vitro эксперименте было протестировано, ингибирует ли />-МсВ реакцию суперскручивания, катализируемую ДНК-щразой (рис. 8Б). В контрольных экспериментах использовались цнпрофлоксацин, £с-МсВ и Л»-МсВ. Инкубация ДНК-гирозы с плазмидиой ДНК в присутствие Уу-МеВ не приводила к образованию линейной формы плазмидиой ДНК. Как и ожидалось, линейная форма плазмидиой ДНК накапливалась в реакциях, содержавших цнпрофлоксацин, £с-МсВ и /'.т-МсВ. Таким образом, можно утверждать, что Я/j-McB не является ингибитором ДНК-гиразы. То. что в pul опероне отсутствует гомолог гена mcbG, и то, что в последовательности зрелого пептида отсутствуют слитые бис-гетсроииклы. также указывает на то. что ДНК-гираза не является мишенью />-МсВ.

«12>«»*rs»MUUII M« И Рис. 8. А. Продукция Лр-МсВ внутри клеток £ coli ингибирует рост, если нарушен транспорт синтезируемого »сшества из клетки (в результате лелеиин генов pulEF). Б. Платила pUC19 инкубировалась с ДНК-гиразой из £. coli в отсутствие (дорожка I) или в присутствие указанных ингибиторов (дорожки 2-5) в концентрации 30 мкМ. Продукты реакции разделялись при помощи электрофореза в агарозном геле, содержащем бромистый этиднй. "ОС" - релаксированная ДНК. "L" - линейная форма ДНК. "SC* - суперскручениая ДНК.

Идентификации I очо.ин нчных нпепонои

При помощи программ BLASTp и tBLASTn по базам данных NC В пг и NCBI wgs был проведен поиск последовательностей, сходных с аминокислотной последовательностью PulB. Было обнаружено 14 последовательностей, обладающих высоким уровнем сходства (значение c-valoc <10~'4). которые не обнаруживались при аналогичном поиске с использованием последовательности McbB £. coli Все обнаруженные последовательности находятся в бактериях рола Pseudomonas (Р. fluorescens, Р. pseudoalcatigenes, Р. tolaasii. Р. pulida. Р. plccoglossicida. Р. laiwanensis). Был проведен анализ «бластей генома в окрестностях найденных последовательностей. Во всех случаях был обнаружен полноразмерный оперон, содержащий 6 lenca (ABCDEF'). На рисунке 9 приведено множественное выравнивание предположительных псптнлов-прслшсствснников. Из выравнивания видно, что все последовательности содержат консервативный участок, содержащий GlyCys и GlySer дипептиды. которые могут участвомть в образовании гетероциклов. и вариабельные участки на С- и N-конце. Взаимное расположение аминокислотных остатков, которые могут участвовать в гетероциклнзацни (дипептиды GlyCys и GlySer). близко у всех псптидов-прслшсствснников.

Рис. 9. Множественное выравнивание предположительных ненгилов-прслшсствснииков. закодированных в оперонах. гомологичных put оперону Pseudomonas put ¡da КТ2440.

«JUOMPIOOOOW -Н7_*Ю001<Ю0073 : М01ИІ11

ewewt

А&ЬОІОСООЗЗ

«JtCOlOOOOM AJJPOIOOOO«! HZ «0501000157 І NZJUMROIOOOOW KZ.MXHOIOOOOW -A&W01000033 -

Акгмоіоооои мг.Амгсо ltoooi 7:

W>_OOi>J2<Mt:

Таким образом, мы показали, что и бактериях рода Pseudomonas существует большое разнообразие оперонов, подобных put опероиу, которые, возможно, кодируют антибактериальные вещества, активные в отношении конкурирующих с этими бактериями организмов. Мы предполагаем, чо вариабельные С- и N-коиисвыс участки могут играть роль в обеспечении внлоспсциоичносги действия таких микроцинов. в то время как центральный модифицированный фрагмент формирует пространственную структуру необходимую для ингнбирования внутриклеточной мишени.

Заключение

В данной работе мы охарактеризовали подобное микроцину В вещество, гены биосинтеза которого имеются у ряда штаммов Pseudomonas syringae. Не смотря на то, что гены mcb оперона транскрибируются в протестированном нами штамме Р. syringae pv. glycinea В076, мы не обнаружили продукции веществ, подобных микроцину В. Однако при гетерологичсской экспрессии тек оперона из Р. syringae pv. glycinea В076 в клетках £ coli наблюдалась продукция двух іариантов Л-МсВ, которые содержали полный набор тиазольиых и оксазольнмх гстсроіиклов.

В процессе созревания микроцина В Е. coli после образования характерного числа гетероциклов продукты генов tidD и tldE (которые, по-видимому, кодируют протеазу) отрезают лилерную последовательность. Возможно, что при гетерологической экспрессии отрезание лидерной послсдовател .ностн Pj-McB также происходит под действием TldD/E Е. coli. Гены tldD и tldE консервативны среди бактерий и архей, и в том числе присутствуют в геноме Р. syringae. Возможно, что TldD/E также участвуют в созревании Л-МсВ в

природном штамме, однако, поскольку специфичность данного типа протеаз на настоящий момент не изучена, возможно, что в природном штамме продуцируемое вешество может отличаться от полученного нами при гетерологической экспрессии. В независимости от этого, полученные нами варианты Ps-McB обладают антибактериальной активностью в отношении штаммов P. syringae, не содержащих mcb оперона, а также в отношении патогенного для человека штамма P. aeruginosa. Интересно, что штамм P. syringae pv. glycinea В076, содержащий оперон mcb, устойчив к P¿-McB, что свидетельствует о присутствии в клетках достаточного количества продуктов генов mcbEFG, обеспечивающих резистентность клеток.

Интересно, что оба полученных варианта Л-МсВ и £с-МсВ одинаково ингибировали ДНК-гиразу как Е. coli, так и Р. syringae in vitro. Однако эти вещества обладали видоспецифичностью действия в отношении штаммов Е. coli и Pseudomonas in vivo. Рл-МсВ, не смотря на то, что проникает в клетки Е. coli тем же путем, что и Ес-МсВ (через порин OmpF и транспортер SbmA), менее активен по сравнению с последним, возможно, из-за сниженной эффективности проникновения в клетку. £с-МсВ, в отличие от вариантов Ps-МсВ, не активен в отношении бактерий рода Pseudomonas. Нами было показано, что за специфичность действия в отношении Pseudomonas отвечает находящийся в центральной области трипептид GGG, в то время как С-концевые аминокислоты оказываются важными для действия на Е. coli (варианты МсВ, содержащие С-концевой трипептид SHI были наиболее эффективны). Поскольку на ДНК-гиразу £с-МсВ и Rv-McB действуют одинаково, можно предположить, что специфичность действия определяется эффективностью проникновения в клетку. В геномах бактерий рода Pseudomonas нет гена, гомологичного sbmA, который в Е. coli кодирует транспортер внутренней мембраны и, как было показано, является необходимым для проникновения микроцинов в клетку. Отсутствие различимого гомологичного гена затрудняет биоинформатический анализ, поэтому для нахождения транспортера, через который Ps-McB проникает в клетки Pseudomonas, требуются дополнительные генетические эксперименты.

В данной работе также было обнаружено, что в ряде геномов бактерий рода Pseudomonas закодирован оперон, подобный оперону микроцина В, в котором отсутствует гомолог гена mcbG, продукт которого связывается с внутриклеточной мишенью - ДНК-гиразой - и обеспечивает автоимунность. Такие опероны были обнаружены в полностью и частично отсеквенированных геномах Р. pulida КТ2440, P. fluorescens А506 (СР003041), Р. fluoresces NZ052(NZ_AJXH00000000), Р. fluorescens BS2 (NZ_AMZG00000000), P. pseudoalcaligenes KF707 (AJMRO1000000), P. tolaasii NCPPB 2192 (AJXK01000000) и в

геномах ряда других представителей рода Pseudomonas. При гетерологической экспрессии put оперона P. putida КТ2440 в клетках Е. coli нами было получено вещество Z^-McB, содержащее 8 тиазольных и оксазольных гетероциклов. Мы предполагаем, что Рр-МсВ может обладать антибактериальной активностью в отношении бактерий, конкурирующих с Р. putida КТ2440 в природных условиях. На это косвенно указывает то, что Рр-МсВ ингибирует рост продуцирующих его клеток, если нарушена система экспорта. К сожалению, на настоящий момент нам не удалось обнаружить бактерий, чувствительных к такому веществу. В эксперименте in vitro было показано, что Рр-МсВ не ингибирует ДНК-гиразу. Биоинформатический анализ пептидов-предшественников, закодированных в оперонах подобных put оперону, показывает, что все пептиды имеют характерную последовательность гетероциклизуемых остатков, отличную от последовательности микроцина В. Мы предполагаем, что закодированные в таких оперонах вещества могут образовывать еще не изученный подкласс антибактериальных пептидов, специфичность действия которых определяется вариабельными участками на С- и N-конце, в то время как жесткий остов, образуемый набором гетероциклов, необходим для связывания и ингибирования внутриклеточной мишени, природа которой остается в настоящее время неизвестной.

III. ВЫВОДЫ

1. Обнаружено, что в ряде штаммов Р. syringae закодированы опероны, гомологичные mcb оперону Е. coli.

2. При гетерологической экспрессии в клетках Е. coli оперона mcb Р. syringae производится два варианта Р. syringae микроцина (/VMcB).

3. iVMcB является ингибитором ДНК-гиразы.

4. Pi-McB менее активен в отношении бактерий Е. coli по сравнению с микроцином В из Е. coli, однако, в отличие от последнего, ингибирует рост бактерий рода Pseudomonas. Наблюдаемая видоспецифичность не связана с различием в действии на мишень антибиотиков - ДНК-гиразу. Три немодифицированные аминокислоты в центральной области пептида Ps-McB отвечают за ингибирование роста бактерий рода Pseudomonas.

5. Ps-McB проникает в клетки Е. coli через те же транспортеры, что и микроцин В из Е. coli. Эффективность действия микроцинов на Е. coli в значительной степени зависит от С-концевых немодифицированных аминокислот.

6. В геномах различных бактерий рода Pseudomonas были обнаружены тсЬ-подобные опероны, в которых в отличие от тсЬ оперона Р. syringae отсутствует ген, кодирующий белок с пентапептидными повторами. Показано, что с одного из таких тсб-подобных оперонов, закодированного в геноме Pseudomonas putida КТ2440, синтезируется токсичное для клетки вещество, которое не является ингибитором ДНК-гиразы.

IV. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в науных журналах:

1. Metelev М., Serebryakova М., Ghilarov D., Zhao Y., Severinov К. Structure ofMicrocin B-Like Compounds Produced by Pseudomonas syringae and Species Specificity of Their Antibacterial Action. Journal Bacteriology. 2013. 195, 41294137.

Материалы конференций:

1. M. В. Метелев. Изучение взаимодействия ДНК-гиразы E.coli и белков, содержащих пентапептидные повторы. Сборник тезисов «X чтений памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова», конкурс молодых ученых. 2011. Том 2, стр. 46.

2. М. В. Метелев. Д. А. Гиляров, М. В. Серебрякова, Ю. Пискунова, К. В. Северинов. Исследование структуры и видоспецифичности действия гомолога ингибитора ДНК-гиразы микроцина В из Pseudomonase syringae pv. glycinea B076. Сборник тезисов III международной конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». 2012. Стр. 80.

3. М. Metelev. D. Ghilarov, М. Serebryakova and К. Severinov. Microcin-B-like compounds produced by Pseudomonas syringae: structure and species-specificity of antibacterial action. Abstracts of the 38th FEBS Congress. 2013. P. 493.

Заказ № 60-Р/10/2013 Подписано в печать 17.10.13 Тираж 80 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru; e-maihinfo@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Метелев, Михаил Васильевич, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук

04201364036

На правах рукописи

Метелев Михаил Васильевич

Структура и видоспецифичность действия гомолога микроцина В из Pseudomonas syringoe

Диссертационная работа на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности молекулярная генетика

(03.01.07)

Научный руководитель: д.б.н. Северинов Константин Викторович

Москва 2013

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.............................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ.......................................................................................................................................7

Актуальность работы................................................................................................................................7

Цели и задачи исследования...................................................................................................................8

Научная новизна и практическая значимость работы.............................................................................8

Публикации и апробация работы............................................................................................................9

Структура и объем работы.......................................................................................................................9

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................................................10

Общая характеристика ТОММ...............................................................................................................10

Линейные азол(ин)-содержащие пептиды............................................................................................13

Микроцин В...................................................................................................................................................16

Стрептолизин Б.............................................................................................................................................20

Плантазолицин.............................................................................................................................................21

Гоадспорин...................................................................................................................................................22

Цианобактины........................................................................................................................................23

Тиопептиды............................................................................................................................................27

Боттромицины........................................................................................................................................31

Перспективы изучения ТОММ...............................................................................................................35

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ....................................................................37

Оборудование........................................................................................................................................37

Расходные материалы...........................................................................................................................37

Реактивы и ферменты............................................................................................................................38

Буферные растворы...............................................................................................................................39

Микробиологические среды..................................................................................................................39

Бактериальные штаммы........................................................................................................................39

Метод ПЦР..............................................................................................................................................40

Электрофорез ДНК в агарозном геле.....................................................................................................41

Лигирование продукта амплификации в плазмидные вектора...........................................................41

Рестрикция.............................................................................................................................................42

Выделение плазмидной ДНК (минипреп).............................................................................................42

Секвенирование.....................................................................................................................................43

Переосаждение ДНК спиртом................................................................................................................43

Приготовление компетентных клеток Е. coli..........................................................................................43

Трансформация замороженных компетентных клеток Е. coli..............................................................44

Процедура получения штамма XL1 Blue с делецией в геноме..............................................................45

Процедура молекулярного клонирования оперонов...........................................................................46

Очистка ДНК-гиразы...............................................................................................................................47

Электрофорез белков в полиакриламидном геле.................................................................................48

Опыт по расщеплению ДНК ДНК-гиразой in vitro..................................................................................49

Получение релаксированной ДНК для определения активности ДНК-гиразы in vitro:........................49

Выделение микроцина из клеток Е. coli и ВЭЖХ-анализ.......................................................................49

Масс-спектрометрический анализ (МАЛДИ и тандемная MC)..............................................................50

Определение антибактериальной активности антибиотиков и демонстрация SOS ответа внутри клеток..................................................................................................................................................................51

Тестирование токсичности Рр-МсВ, производящегося в клетках..........................................................51

Выделение РНК......................................................................................................................................52

Обратная транскрипция.........................................................................................................................52

ПЦР в реальном времени.......................................................................................................................53

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ...........................................................................................................54

Идентификация mcb оперонов Р. syringae............................................................................................54

Исследование продукции вещества, подобного микроцину В, штаммом Р. syringae pv. glycinea В076 .............................................................................................................................................................................56

Гетерологическая продукция Р. syringae микроцина В в клетках Е. coli.............................................58

Ps-McBl и Ps-McB2 ингибируют рост клеток Е. coli и действуют на ДНК-гиразу...................................62

Видоспецифичность действия Ps-McB и Ес-МсВ....................................................................................68

Исследование продукции вещества, подобного микроцину В, закодированного в mcb опероне Pseudomonas putida КТ2440................................................................................................................................. 73

Биологическая активность Рр-МсВ.........................................................................................................77

Идентификация гомологичных оперонов.............................................................................................79

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.............................................................................................................................81

ВЫВОДЫ.......................................................................................................................................83

БЛАГОДАРНОСТИ......................................................................................................................84

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ..........................84

СПИСОК ПРОЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................86

Список сокращений

ATP (АТФ) - аденозинтрифосфорная кислота

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

CFX - ципрофлоксацин

Да - Дальтон

DMSO (ДМСО) - диметилсульфоксид ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота DTT - дитиотреитол

Ее-МсВ - микроцин, производящийся Е. coli

ЭДТА (EDTA) - этилендиаминтетрауксусная кислота

ИПТГ (IPTG) - изопропилтиогалактозид

ЛАП - линейные азол(ин)-содержащие пептиды

МА1_01(МАЛДИ) - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация МС - масс-спектрометрия

dNTP - смесь дезоксирибонуклеотидов (dGTP, dATP, dTTP и dCTP)

ПЦР - полимеразная цепная реакция

PIPES - пиперазин-Л/, Л/'-6ис(2-этансульфоновая кислота)

Рр-МсВ - гомолог микроцина В из P. putida.

Ps-McB - гомолог микроцина В из P. syringae

РПП - рибосомально-синтезируемые пост-трансляционно-модифицируемые пептиды РНК - рибонуклеиновая кислота

БОБ -додецилсульфат натрия

- стрептолизин Б Т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

ТОММ -тиазол-оксазол модифицированные микроцины ТФУ-трифторуксусная кислота РММ (ФМН) - флавинмононуклеотид

Введение

Актуальность работы

Распространение лекарственной устойчивости среди патогенных штаммов различных микроорганизмов значительно сужает спектр доступных антибиотиков, в связи с этим поиск и изучение новых антибиотиков является крайне актуальной задачей.

Данная работа посвящена исследованию гомолога ингибитора ДНК-гиразы микроцина В из Pseudomonas syringae pv. glycinea B076. Микроцин В - пептидный антибиотик, продуцируемый штаммами Е. coli, - является оружием в конкурентной борьбе за выживание между близкородственными видами микроорганизмов. Мишенью микроцина В является ДНК-гираза (топоизомераза типа Па) - фермент, ответственный за поддержание отрицательной сверхспирализации ДНК бактерий. Известно, что микроцин В стабилизирует двухцепочечный разрыв в ДНК, образующийся во время работы ДНК-гиразы, накопление двухцепочечных разрывов приводит к нарушению процесса репликации и индукции SOS ответа. К сожалению, детальный механизм действия микроцина В и его сайт связывания с ДНК-гиразой в настоящий момент не известны. Изучение механизма ингибирования ДНК-топоизомераз важно для понимания того, как функционируют эти ферменты, а также для разработки новых лекарственных препаратов. В настоящее время антибиотики из группы фторхинолонов, мишенью которых является ДНК-гираза, успешно применяются в клинической практике. Широкое использование фторхинолонов в немалой степени связано с пониманием механизма действия этих антибиотиков.

Микроцин В является рибосомально-синтезируемым пост-трансляционно-модифицируемым пептидом и относится к группе тиазол-оксазол модифицированных микроцинов (TOMM). Биоинформатические и биохимические данные последних лет свидетельствуют о широкой распространенности TOMM в природе, и многие из этих соединений представляют интерес с точки зрения разработки новых лекарственных препаратов. Поиск и исследование биологической активности неизученных TOMM является важной научной задачей.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение гомолога микроцина В из Pseudomonas syringae pv. glycinea B076.

Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:

1. Получить и очистить гомолог микроцина В из Pseudomonas syringae pv. glycinea B076;

2. Определить его химическую структуру (характер циклизации);

3. Исследовать антибактериальную активность полученного вещества;

4. Выявить и проанализировать опероны бактерий рода Pseudomonas, гомологичные mcb оперону Р. syringae.

Научная новизна и практическая значимость работы

В работе были обнаружены опероны, гомологичные mcb оперону Е. coli, в геномах нескольких патоваров растительных патогенов Pseudomonas syringae. Было показано, что при гетерологической экспрессии в клетках Е. coli с оперона mcb Pseudomonas syringae pv. glycinea B076 производится два варианта P. syringae микроцина (Ps-McB). Было выявлено, что микроцин из Е. coli (Ес-МсВ) и Ps-McB обладают разной специфичностью действия. Ес-МсВ не активен в отношении бактерий рода Pseudomonas, в то время как Ps-McB является эффективным ингибитором роста таких бактерий. Важно отметить, что Ps-McB способен ингибировать рост патогенного для человека штамма Р. aeruginosa РА01. Также было показано, что специфичность действия микроцинов не зависит от специфичности взаимодействия с ДНК-гиразой и, по-видимому, определяется эффективностью транспорта внутрь клетки. Было продемонстрировано, что три немодифицированные аминокислоты в центральной области микроцина Ps-McB отвечают за специфичность действия в отношении штаммов рода Pseudomonas. Полученные результаты открывают новые возможности для конструирования пептидов, подобных микроцину В Е. coli, но с измененным спектром действия.

В геномах различных бактерий рода Pseudomonas были идентифицированы опероны, гомологичные оперону mcb Е. coli. Показано, что эти опероны кодируют вещества, способные ингибировать рост бактерий, но действие которых отлично от действия микроцина В Е. coli и Р. syringae. Дальнейшее изучение этих веществ перспективно с точки зрения поиска новых антибиотиков.

Публикации и апробация работы

По результатам диссертационной работы было опубликовано 4 печатные работы, в том числе 1 статья в международном рецензируемом журнале и 3 тезиса конференций. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: 1) «X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова», 14-17 ноября, 2011, Москва, Россия; 2) «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», 22-24 ноября, 2012, Казань, Россия (международная конференция); 3) Конгресс Федераций европейских биохимических обществ 2013 «Биологические механизмы», 6-11 июля, 2013, Санкт-Петербург, Россия (международная конференция).

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов работы, заключения, выводов, благодарностей и списка использованной литературы. Работа изложена на 96 страницах машинописного текста, включая 29 рисунков и 2 таблицы. Список цитируемых литературных источников включает 121 наименование.

Обзор литературы

Общая характеристика ТОММ

Настоящий обзор посвящен биологически активным прокариотическим £ибосомально-синтезируемым пост-трансляционно-модифицируемым пептидам (РПП) [1], в которых аминокислотные остатки цистеина, серина и треонина подвергаются циклизации с образованием тиазольных(тиазолиновых) и (метил)оксазольных(оксазолиновых) гетероциклов. Общее название для таких веществ - тиазол-оксазол модифицированные микроцины (ТОММ). Биоинформатические и биохимические данные последних лет свидетельствуют о широкой распространенности ТОММ в природе [2]. Согласно современной номенклатуре, к ТОММ относятся такие классы РПП как линейные азол(ин)-содержащие пептиды, цианобактины, тиопептиды и боттромицины. Наиболее изученными представителями ТОММ являются микроцин В (ингибитор ДНК-гиразы), стрептолизин (гемолитический экзотоксин), тиострептон (ингибитор трансляции), транкамид (обладает противораковой активностью) и гоадспорин (сигнальное вещество).

В отличие от пептидов нерибосомальной природы, в последовательность которых могут входить нестандартные аминокислоты, в состав рибосомально синтезируемых пептидов могут входить лишь 20 канонических аминокислот. Однако после трансляции такие пептиды могут модифицироваться с участием специализированных ферментов. Такими модификациями могут являться дегидратация остатков серина или треонина, гетероциклизация остатков цистеина, серина и треонина, пренилирование, метилирование, образование дисульфидных связей, эпимеризация аминокислот, макроциклизация и другие. В результате образуются биологически активные низкомолекулярные вещества, в которых часто нелегко распознать исходный рибосомально-синтезированный пептид. Образование гетероциклов и макроциклов в процессе модификации пептидов создает фиксированную структуру, которая необходима для функционирования вторичных метаболитов и защищает их от деградации протеазами.

Для всех РПП характерна определенная схема биосинтеза. Все вещества, относящиеся к этому классу, первоначально синтезируются в виде пептида-предшественника длиной от 7

до 110 аминокислот. Гены, ответственные за продукцию каждого вещества, организованы в кластер. Помимо гена, кодирующего пептид-предшественник, в таком кластере находятся гены, кодирующие ферменты модификации пептида-предшественника, а также гены, ответственные за экспорт зрелого (функционально активного) вещества. В случае если производимый РПП является антибиотиком, в кластере также находятся гены, обеспечивающие устойчивость клеток-продуцентов к производимому ими веществу.

Пептид-предшественник РПП можно разделить на две части: собственно модифицируемый пептид и лидерную последовательность (см. рисунок 1). Модифицируемый пептид - та часть пептида-предшественника, которая подвергается модификации и образует конечное вещество. Лидерная последовательность необходима для узнавания пептида-предшественника ферментами, отвечающими за модификацию. Для многих представителей РПП было показано, что эти ферменты достаточно толерантны к мутациям в модифицируемом пептиде (если эти мутации непосредственно не изменяют химические группы, необходимые для модификации) и для их функционирования важна лишь специфическая лидерная последовательность [3]. Это свойство, по-видимому, объясняет высокое разнообразие природных РПП, а также открывает большие возможности к созданию различных искусственных РПП для использования в медицине и биотехнологии. Лидерная последовательность расположена, как правило, на Ы-конце пептида-предшественника, однако встречаются и исключения [4]. Лидерная последовательность может также отвечать за экспорт зрелого пептида из клетки. На последних стадиях созревания РПП лидерная последовательность отщепляется от модифицируемого пептида. У эукариотических РПП, таких как циклотиды и конопептиды, на 1\1-конце присутствует сигнальная последовательность, которая необходима для того, чтобы пептид попал в нужный компартмент клетки [5, 6].

Кластер генов ген пептида-предшественника

| транскрипция, трансляция

и

л.

I

лидерная последовательность

модифицируеммый пептид

модификация

Т Т т т т т

отрезание лидернои последовательности

зрелый модифицированный пептид

Рисунок 1. Общая схема биосинтеза РПП. Ген, кодирующий пептид-предшественник, и гены ответственные за его посттрансляционную модификацию организованы в кластер. Пептид-предшественник состоит из модифицируемой части