Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические аспекты совершенствования процессов переработки гидробионтов моря

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биохимические аспекты совершенствования процессов переработки гидробионтов моря"

Р Г Б ОЛ

На правах рукописи

^1ГОЛКИНА ЛЮДМИЛА АНАТОЛЬЕВНА

БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ПРОЦЕССОВ ПЕРЕРАБОТКИ ГИДРОБИОНТОВ МОРЯ

Специальность: 03.00.23 - Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Дальневосточном государственном институте рыбной промышленности и хозяйства (Технический университет) и Тихоокеанском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства и океанографии (ТИНРО).

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Лейкин Юрий Алексеевич

доктор химических наук,

профессор Синицын Аркадии Пантелеймонович

доктор химических наук,

профессор Султанович Юрий Абрамович.

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии (ВНИРО).

Защита состоится " У " 1996 года

в 3 часов на заседании диссертационного совета Д 053.34.13 в Российском химико-технологическом университете имени Д.И. Менделеева по адресу: 125047, Москва, Миусская площадь, 9.

С диссертацией можно ознакомиться в Научно-информационном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Автореферат разослан " " а^г^&лих. 1996 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

И.И. Гусева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Изучение представителя суперсемейства протеаз - аспартильной про-теазы катепсина Д показало, что в тканях теплокровных животных и человека он играет важную роль в катаболизме белка, антигенных процессах, подавлении раковых клеток и других. Ряд исследователей (Riemann, Young, Tappel, Siebert) считают, что он играет роль инициатора процессов протео-лиза in vitro. Поскольку последние являются основой созревания рыбного и мясного сырья при технологической обработке, выдвинута гипотеза о механизме созревания соленых рыбопродуктов, основанная на том, что ка-тепсины ткани подготавливают мышечные волокна к последующему про-теолизу пищеварительными ферментами (Леванидов, Слуцкая). Проводимые в последние годы исследования показали возможность интенсифицировать процесс созревания рыбного, а также мясного сырья путем

использования группы катепсинов мышечной ткани, в том числе аспартильной протеазы катепсина Д, которые ускоряют процесс созревания, что позволяет расширить ассортимент рыбной продукции, повы -сить рентабельность производства.

Исходя из сказанного следует, что катепсин Д представляет интерес для медицины и фармакологии, научных исследований, связанных с механизмом и регулируемостью процессов протеолиза животных тканей, для практических целей в качестве биологического стимулятора процессов гидролиза тканевых белков в технологии рыбных продуктов. При этом, производство препаратов на основе этого фермента до сих пор не налажено.

В этой связи большое значение и актуальность приобретает направленный поиск недорогих и доступных источников ферментных препаратов, содержащих катепсин Д, изучение свойств этих препаратов и создание научных основ их промышленного получения.

Цели и задачи исследования. Целью исследования является разработка научных и экспериментальных основ технологии получения препаратов ферментов, содержащих катепсин Д рыб, из промывных вод рыбных фаршей в условиях перерабатывающих плавучих производств, а также береговых предприятий.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи: — научное обоснование рациональных приемов получения ферментных препаратов, содержащих катепсин Д рыб разной степени очистки; -- изучение биохимических и физико-химических характеристик препаратов катепсина Д рыб-

-установление существования разных форм катепсина Д мышечной ткани рыб;

-- научное обоснование технологии и создание новых аффинных сорбентов на основе производных природного полиамнносахарида хитина; -- биохимические исследования промывных вод производства рыбного фарша, изучение влияния продуктов окисления белковых веществ на морские организмы и оценка качества очистки промывных вод;

— разработка комплексной схемы, включающей выделение препаратов катепсина Д и белкового продукта из промывных вод рыбных фаршей в условиях перерабатывающих плавучих производств, которая позволяет уменьшить трофность сбрасываемых вод.

Научная новизна

— Впервые в стране получены препараты аспартильной протеазы катепсина Д рыб в очищенном состоянии.

- Впервые применен метод аффинной хроматографии на биоспецифических сорбентах для выделения и очистки мышечных протеаз рыб.

~ Впервые разработан количественный метод определения реакционноспо-собных амино-групп материала матрицы.

— Впервые выявлены два близких по свойствам фермента, предположительно разные формы катепсина Д мышечной ткани исследованных рыб, и разработан способ их разделения.

■С-формулированна гипотеза взаимосвязи различной биокаталитической активности катепсина Д рыб с его способностью существовать в разных формах.

- Впервые разработаны научные основы использования промывных вод производства фарша минтая в качестве сырьевого источника получения ферментного и белкового препаратов.

- Предложены комплексные схемы, включающие выделение из названного источника ферментного препарата и белкового продукта, которые позволяют снизить антропогенную нагрузку на окружающую среду. Практическая значимость работы. Научное и экспериментальное обоснование использования промывных вод рыбных фаршей в качестве доступных перспективных источников препаратов протеазы катепсина Д, интенсифицирующего процессы созревания рыбного и мясного сырья, разработка эффективных схем их выделения и очистки на основе методов аффинной хроматографии (патент РФ), ультрафильтрации, гель-хроматографии, а также комплексных схем выделения ферментных препаратов и белкового Продукта, являются научной основой для внедрения технологий утилиза-

ции ценных белковых компонентов рыбного сырья на плавучих производствах. Использование новых аффинных сорбентов, синтезированных на основе природного полисахарида хитозана (патент РФ^ делает процесс более экономичным и расширяет сферу применения продуктов переработки отходов рыбоперерабатывающих производств. Предложенный, разработанный и реализованный впервые метод определения качества природной, техногенной и смешанной друг с другом вод с использованием водных организмов Clorella vulgaris, Daphnia magna и Phaeodactylum tricornutum позволил установить высокую степень трофности промывных вод фаршевых. производств и возможность ее снижения путем утилизации белковых компонентов. При этом, наряду с уменьшением загрязнения-окружающей среды появляется возможность оборотного водоснабжения на стадиях пред-подготовки сырья.

Реализация результатов исследования. Разработанные новые методы и методики могут быть использованы в научно-исследовательских и учебных лабораториях для выделения и очистки протеаз мышечной ткани рыб, установления и разделения близких по свойствам ферментов, определения поверхностных аминогрупп хитозана и получения аффинных сорбентов на его основе, заготовки биологического материала на основе рыбного сырья. Часть методов после прохождения испытаний внедрена в научных лабораториях ТИНРО, ДВО РАН, МГУ им. М.В.Ломоносова, Дальрыбвтуза. В учебный процесс внедрены действующие установки, планшет-схема; материалы исследования используются в разделах учебных курсов, в НИРС и УИРС; по результатам работы изданы три методических пособия. В производственный процесс внедряется установка для получения белковых продуктов из сточных вод рыбоперерабатывающих предприятий. Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на следующих совещаниях, конференциях и семинарах: Всесоюзное совещание "Исследование и рациональное использование биоресурсов Дальневосточных и Северных морей СССР и перспектива создания технических средств для освоения неиспользованных биоресурсов открытого океана" (Владивосток, 1985); Краевая научно-техническая конференция "Интенсификация технологических процессов в рыбной промышленности" (Владивосток, 1987); Международный семинар по проблемам переработки морепродуктов и обмена опытом со специалистами СРВ (Владивосток, 1987); Всесоюзные семинарЬС "Интенсификация и автоматизация техйоло-ГИчесКих npouecfcbn обработки пищевых продуктов" (Москв;(, 1988-1989); Всесоюзное совещание "Биологически активные вещества гидробионтоё

при комплексной утилизации ресурсов океана" (Владивосток, 1988); Всесоюзная научно-техническая конференция "Интенсификация технологических процессов в рыбной промышленности" (Владивосток, 1989); VII Всесоюзное совещание "Автоматизация процессов управления техническими средствами исследования и освоения Мирового океана" (Калининград, 1989); Научно-техническая конференция проф.-преп. состава, аспирантов, научных и инженерно-технических работников" (Мурманск, 1991); Научно-техническая конференция "Обмен научно-производственным опытом, установление контактов между специалистами, предприятиями для широкого внедрения в производство научных разработок" (Владивосток, 1992); Региональная научно-методическая конференция "Пути повышения качества подготовки специалистов в современных условиях" (Владивосток, 1993); IV Всероссийская конференция "Производство и применение хитина и хитозана" (Москва, 1995); Международная научно-техническая конференция "Пища. Экология. Человек" (Москва, 1995), а также на; Гидробиологическом съезде (Казань, 1995), на ученых советах Тихоокеанского научно-исследовательского института рыбного хозяйства и океанографии (1980-1984) и межвузовских и внутривузовских конференциях (1985-1993).

Разработанная схема технологической установки экспонировалась на ВДНХ СССР (Москва, 1989) и вошла в Каталог тем, предлагаемых к продаже и разработке на выставке-ярмарке "Наука-производству" Публикации. По материалам диссертации опубликовано 28 работ, из них 3 методических пособия для студентов специальности "Технология рыбы и рыбных продуктов" и два патента РФ. Основные положения, выносимые на защиту:

- получение ферментных препаратов, содержащих аспартильную протеазу катепсин Д, интенсифицирующих процессы созревания рыбного и мясного сырья,из промывных вод рыбных фаршей в условиях плавучих производств в открытом море;

- способы и методы выделения и очистки ферментных препаратов данногб спектра действия из мышечной ткани промысловых рыб и их характеристики; .

~ разработка и технология регулируемого синтеза и создание аффинных сорбентов на основе природного полисахарида хитозана, открывающие перспективу развития аффинной хромотаграфии протеаз животного происхождений на новых типах сорбентов;

разработка лабораторных технологий н научное обоснование принципиальных схем выделения ферментах й беЛков^х препаратов иЗ гфомывньгх

вод производства фарша минтая, которые позволяют уменьшить трофность сбрасываемых в море вод;

- нормативная методология внедрения в учебный процесс основ наукоемких технологии путем реорганизации УИРС и НИ PC. Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, семи глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Работа изложена на 270 страницах печатного текста, включающих 36 таблиц и 46 рисунков. Список цитируемой литературы включает 220 наименований отечественных и иностранных авторов.

В Приложении приведены акты внедрения результатов исследования в научно-исследовательских и учебных лабораториях, сведения о практическом использовании научных результатов; опубликованная информация (проспект) о внедрении и продаже разработок; заключение специалистов лаборатории Морской экологии ВНИРО по результатам биотестирования промывных вод производства фарша минтая (в модельном эксперименте); расчет экономического эффекта.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Материалы и методы

Объектами исследования служили:

-промывные воды производства промытого фарша из минтая;

-аффинные сорбенты на основе хитозана;

-белая мышечная ткань тихоокеанских (кроме карпа) рыб: сельдь тихоокеанская - Clupea pallasi; сардина тихоокеанская (сельдь иваси) Sardinops sagax; минтай Theragra chalcogramma; лосось Salmo salar; карп -Syprimu carpió;

-морские одноклеточные диатомовые водоросли Phaeodactilum tricornutum, пресноводные одноклеточные протококковые водоросли Chlorella vulgaris и ветвистоусые рачки Daphnia magna. Материалы:

-хитин, хитозан (Дальрыбвтуз, ТИБОХ,ВНИРО), сефадекс G-25 ("Pharmacia"), сефароза-4В("РЬагтас1а");

-аффинные сорбенты грамицидин С - силохром, бацитрацин-силохром, бациллихин-силохром (МГУ им. М.В. Ломоносова), гемо-глобин-сефароза (Институт биохимии им. А.Н. Баха);

-мембраны: плоские (0,5 мкм), половолоконные типа ВПУ-100 (МТИММП).

В работе применяли общепринятые и специальные физические, физико-химические, биохимические, химические методы, в том числе хромато-графическне, электрофоретические, спектрофотометрические. аминокислоты» анализ, экофлуориметрические, колориметрические, электронная микроскопия. Также методы замораживания - оттаивания мышечной ткани рыб (Doke, 1980); ацетонового порошка (Morton, 1965), примененного впервые к мышечной ткани рыб; высушивания рыбного белка вымораживанием (Хлеап Хосе, 1984); проведения цветной реакции с 2,4,6-тринитро-бензолсульфонатом натрия (Inman et al., 1969); электрофлотации; контроля качества природной и техногенной вод, основанные на определении выживаемости ветвистоусых рачков и изменения уровня замедленной флуоресценции (ЗФ) у водорослей (ВНИРО: 1987; РД-118-02-90).

За единицу протеолитической активности принимали такое количество фермента, которое в условиях определения за 1 ч давало прирост оптической плотности (А:8о) на единицуv Удельную активность выражали в единицах протеолитической активности, отнесенной к оптической плотности раствора фермента при 280 нм.или на мг белка. Экстраполяционный расчет проводили по материальному балансу (Огородникова и др., 1989). При расчетах использовали номограммы (Скоупс, 1985). Достоверность экспериментальных результатов достигалась планированием числа экспериментов, необходимых и достаточных для достижения надежности Р = 0.90 - 0.95 при доверительном интервале Д = ±10%, для результатов биотестирования А = +5 % (Лакин, 1973).

На схеме 1 отражены основные направления исследования.

Исследование методов выделения и очистки " аспартильных протеаз мышечной ткани промысловых рыб

Исследов1ние методов синтеза биоспецифических сорбентов на основе хитина ихито-зана |

Характеристика препаратов катепсина Д рыб_

Катептические препараты мышечной ткани рыб

Обоснование потенциального источника препаратов _ катепсина Д на базе техногенных стоков РП в условиях моря

Исследован 1е воздействия техногенных стоков на морские организмы

Исследование технологии получения биологически активных белков из *— " промывных вод производства сурими

Схема 1. Проведение исследований

2. Исследования по выделению препаратов асмаршлыюй протсазм катепсина Д из промывных под рыбных фаршей

В мышечной ткани рыб содержатся протеолитические ферменты класса аспартильных протеаз и, в частности, катепсин Д, который вносит наибольший вклад в каталитическую активность этих ферментов. При контакте с растворами соли с концентрацией, близкой к физиологической, он экстрагируется из ткани вследствие разрушения лизосом в условиях проведения процесса (Яес1с11 й а!., 1972; Мактос1ап е1 а!., 1982). Производство рыбных фаршей типа сурими включает процесс промывки фарша, параметры которого близки к параметрам экстракции ферментов из мышечной ткани рыб. В морской водоем сбрасывается большое количество промывных вод, содержащих вещества белковой природы, в том числе аспартиль-ные протеазы мышечной ткани рыб, как было нами впервые определено.

2.1. Исследование перераспределения биологически активных белков в процессе промывки фарша из минтая

Из таблицы 1 следует, что при однократной обработке фарша водой из ткани рыбы вымывается 74% биологически активного белка с протео-литической активностью. Его удельная активность составляет 0.32 ед.акт./ мг белка, или в пересчете на 1 г промытого фарша - 1.17 ед.акт. Учитывая соотношение фарша и воды, равное 1:3, и уменьшение объема промывного стока по сравнению с объемом воды, расходуемым на промывку фарша (в эксперименте на 13%). определили, что в 1 л стока 1-ой промывки содержится 475 ед.акт.

Увеличение удельной активности препарата, содержащегося в воде первой промывки, по сравнению с удельной активностью в солевых экстрактах, связано с тем, что в солевые растворы экстрагируется большее число белковых фракций, чем в водные. Поэтому ферментные препараты промывных вод можно рассматривать как частично очищенные по сравнению с препаратами экстрактов с низким содержанием соли. Установлено, что со стоком первой промывки из фарша уходит около 50% соле-и водорастворимого белка мышечной ткани.

В стоке второй промывки также обнаружено значительное содержание белковых веществ, равное 30%, но активный белок практически отсутствует. В двукратно промытом фарше содержится до 13% белка с протеоли-тнческой активностью и 36% общего белка.

При замораживании гомогената ткани общая активность протеаз в непромытом фарше уменьшалась почти в четыре раза, а удельная в 7 раз. При однократной промывке этого фарша в промывочной жидкости содержалось в три раза меньше активного белка по сравнению с водой первой промывки фарша без дополнительного замораживания.

Таблица 1

I 1сследовапие локализации асиаргильных иротеаз в процессе ирш отопления фарша мин гая

Материал исследования

I 1.Экс1ракт фарша иеиром.

(0.5% КС1) | 2.Вода 1-он | нромыг.ки I фарша I ЗЛЗода 2-ои | прчмыпки ! <|1арша \ 4.г)кс!ракг дву-| кришопро-! мытого фарша I (0.5% КС 1)

Белок

Активность х

оищии, мг

369

мг мл

оощая, ед. акт.

78700

ед. акт, мл

640

X О3 Содерж.

удсльи., активного

"Г ед. акт. белка. %

— мг ------------

213 100

Содерж. общего

100

3

182 1.48 58400 475 320 74 ' 49.3

112 0.9 следи след!» — псзиачиг. 30.4

135 1.1 10500 85 78 13 36

При использовании метода замораживания-оттаивания в экспериментах на сельди иваси мы наблюдали увеличение удельной активности препарата в экстрактах в 1.5-1.7 раза.

На основании этого можно говорить о более высокой лабильности катепсинов минтая по сравнению с иваси при повторном замораживании мяса рыбы.

Вымываемый из мяса минтая биологически активный белок проявляет гемоглобин - расщепляющую способность в условиях экстракции ка-тепсина Д из мышечной ткани рыб.

Выявлено, что при двукратной промывке в сток уходит около 80 % соле- и водорастворимого белка.

Наличие в промывных водах фаршевых производств белков с протео-литической активностью, а также значительное содержание других белковых веществ, позволяют оценить эти воды как перспективный .источник ценных физиологически активных веществ.

Опм'М. м'1

2.2. Выделение и очистка аспартнльной протеазы катепсина Д рыб из промывных вод фарша минтая с помощью аффинной хроматографии.

При исследовании возможности выделения и очистки протеаз мышечной ткани рыб нами впервые применен метод аффинной хроматографии. В качестве аффинного сорбента для биохимической сорбции протеазы катепсина Д использовали бациллихин-силохром, показавший положительные результаты при выделении нами этого фермента из экстрактов мышечной ткани рыб. Как следует из таблицы 2, удельная активность полученного препарата составляет 1.04 ед.акт./мг белка, степень очистки - 69 раз, выход по активному белку - 95.6%. Выделяемый фермент специфически сорбировался и в процессе элюции сошел с колонки одним активным , пиком (рис. 1), при этом характер профиля элюции идентичен для катепсина Д, выделенного из солевого экстракта мышечной ткани минтая.

Аналогичные ферментные препараты нами получены из мышечной ткани промысловых рыб: сельди иваси (впервые), тихоокеанской сельди, карпа, минтая. Активность препаратов в обоих случаях одного порядка, что будет показано в параграфе 3.

При получении ферментного препарата из промывных вод фарша минтая отмечено, что объем полученного очищенного ферментного раствора (элюат) примерно в 3 раза меньше объема промывных вод, наносимых на колонку, что делает более технологичной подготовку препаратов к хранению методами лиофильной сушки или сульфат-аммонийной обработки. Согласно табл.2, фракцию элюата диализовали и лиофильно высушили. Масса сухого очищенного-препарата составила 7 мг. Расчет показал, что из 1 л воды первой промывки методом аффинной хроматографии можно выделить около 10-40 мг сухого очищенного ферментного препарата аспартнльной протеазы катепсина Д с общей активностью 124 ед.акт., что в пересчете на 1 кг непромытого фарша (экстраполяционный расчет) составляет 120 мг и 375 ед.акт., соответственно. Из полученных результатов следует, что благодаря применению метода аффинной хроматографии на биоспецифических сорбентах процесс выделения и очистки фермента из промывных вод фарша минтая проходит в одну стадию. Количество очищенного препарата, рассчитанное на единицу объема промывной воды или массы фарша, и его количественные характеристики отвечают требованиям препаративного применения.

Таблица 2

Выделение ферментного препарата, содержащего каимк'пн Д, ил воды первой промывки фарша минтая на бацпллнхип-силохроме

Белок Активность х 10' Степень Выход,

Стадии очнепен общий. общий. общая. ед. акт. удсльн., удсльн., очистки о,-•о

.А1' - ед. акт. мл ед./ед.А^о ед. / мг

Вода первой 2366 700 22750 130 10 32 1 100

промывки фарша

Аффинная 31.5 20.9 21750 375 690 10-10 69 95.6

хрома гогр.. ,шалил и лпоф.

сушка

2.3. Исследование возможности комплексного выделения ценных белковых

веществ из промывных вод производства фарша минтая

Нами предпринята попытка параллельно с ферментными препаратами выделять белковый продукт. Для этого часть воды первой промывки отвели и подвергли очистке электрофлотацией. Образовавшийся на поверхности белковый продукт собирали механическим способом, промывали спиртом и высушивали методом вымораживания. Досушивание продукта проводили при комнатной температуре в потоке воздуха. Из трёх литров было получено 7.0 г сухого продукта.

Результаты исследования качества полученного белкового продукта свидетельствуют о его высокой кормовой ценности. Он превосходит по качеству рыбную кормовую муку; содержит 60-80 % белка, в котором представлены как незаменимые, так и заменимые аминокислоты. Белковый продукт не денатурирован, сохраняет свойства нескоагулированно-го белка, лишен липидной фракции и продуктов окисления липидов, его можно долго хранить в высушенном состоянии. Он может быть использован в качестве ценного компонента специальных животных и рыбных кормов.

Исследования на экспериментальной установке показали возможность комплексного выделения ферментных препаратов и белкового продукта в процессах переработки гидробионтов современными методами - аффинной хроматографией и электрофлотацией. Установка прошла лабораторные испытания. Результаты являются научным обоснованием масштабирования процесса выделения ценных белковых продуктов из промывных вод фаршевых производств.

2.4. Концентрирование вод первой промывки фарша минтая, содержащих

протеолитические ферменты

Концентрирование вод первой промывки с использованием плоской мембраны показало отрицательный результат. Крайне низкая скорость фильтрации через плоскую мембрану приводила к увеличению длительности процесса. В результате происходила потеря активности до 80-90 %. Использование половолоконных мембран показало, что после первого цикла в концентрате наблюдалось увеличение удельной активности в 7.5 раз в результате отделения низкомолекулярных ингибиторов и балластных белков (табл. 3). Выход по активности составил 76.4%.

Таблица 3

Использование метода ультрафильтрации на половолоконных мембранах типа ВПУ-100 для концентрирования промывных вод производства фарша минтая

(рН 6.2)

Стадии процесса Объем, Бело к Л к т и внос т ь* 103 Сте- Вы- Т' Вре-

№ мл общий. o.e. А200 o.e. А2а) мл суммар- ед.акт. удельная, пень мя

ная, мл ед.акт. очист- филь-

ед.акт. o.e. ки трации, м

I. Приготовление ферментного раствора (моделирование 1-ой промывки) 174 1531 3.0 9 600 55 6 I 100

2. Ул ьтрафильтра-ция I:* концентрат I 270 140 170. в 1.22. 7 700 55 45 7.5 76.4 32

фильтрат I 130 159.9 1.23 0 0 0 - -

3. Ультрафильтрация "II: концентрат ¡1 70 463.8 6.62 6 130 '87 •17 2.8 63.8 25

фильтрат П 70 213.4 3.12 I 750 ' " г •25 >8 1.3 18.2

В фильтрате активный белок не обнаружен. Частичную потерю активности можно объяснить инактивацией части молекул фермента за счет уменьшения концентрации стабилизирующих веществ в растворе. Более глубокое концентрирование приводило к снижению выхода по активному белку до 63.8 %. При этом снизились удельная активность и степень очистки, что вызвано увеличением концентрации балластных белков, молекулы которых не проходят через поры данной мембраны. После двух циклов фильтрации (57 мин) ферментный раствор был сконцентрирован по активному белку в 1.6 раза (по объему в 4 раза). Предложенные в качестве оптимальных условия проведения процесса УФ позволяют сконцентрировать исследуемый раствор в 4 раза (по объему) в течение 30 мин. Полученные результаты показали, что примененный впервые для концентрирования промывных вод рыбных фаршей метод УФ может быть использован при получении ферментных препаратов, мышечной ткани рыб.

Таким образом, выявлен доступный сырьевой источник препаратов протеолитического фермента катепсина Д, представляющий собой промывные воды производства рыбных фаршей типа сурими; теоретически и экспериментально доказано, что этот источник перспективен в условиях плавучих производств. Показана возможность комплексного подхода к извлечению из промывных вод ферментного препарата и белкового продукта в одном технологическом процессе; показана возможность концентрирования промывных вод методом УФ с сохранением свыше 70 % активного белка.

3. Исследование аспартнлыюй иротеазы катепсина Д мышечной ткани рыб

Аспартильные протеазы, имеющие в активном центре два остатка ас-парагиновой кислоты, детально изучены у млекопитающих и микроскопических грибов. В последние годы их выделили из геммул пресноводной губки и различных органов растений (Руденская, 1993). Выделение и очистка аспартильных протеаз мышечной ткани рыб в наших исследованиях проводится впервые в стране.

При исследовании потерь ферментативной активности в технологическом процессе промывки фарша пресной водой, а также для выявления роли мышечных протеаз в протеолизе изучили их содержание в мышечной ткани промысловых рыб, характеристики и разработали методические приемы выделения и очистки.

Экстракцию ферментов проводили солевыми растворами с низкой концентрацией соли по общепринятым методикам в модификации из на-

тивной (сырой) ткани, а также из ацетонового порошка мышечной ткани рыб, что было предпринято нами впервые. Применение ацетонового порошка было обусловлено тем, что гидробионты отличаются нестабильностью тканей по сравнению с тканями других организмов.

Таблица 4

Сравнительная гемоглобин - расщепляющая активность аспартильных протеаз мышечной ткани рыб (эктрагирующий раствор - 0.5% KCl; рНопт. активности - по катепсину Д)

Источник Соотн. Активность х 103

фермента ткань: ед. акт. ед. акт. ед. акт. ед. акт. рНопт.

раствор мл мг белка ед. А:8о г ткани актив.

1. Тихоокеан- 1 :25 550 32 13750 3.6

ская сельдь

(ацегг. пор.) 1 : 25 75 19 9 1875 3.6

2. Тихоокеан- 1 : 4 163 10 - 700 3.6

ская сельдь

(сыр. ткань) 1 : 4 183 - 9 521 3.6

3. Лосось (ацет. 1 : 25 72 - - 1800 3.2

пор.)

4. Минтай 1 : 25 575 — 75 14375 3.0

(ацет. пор.)

5. Минтай 1 : 4 150 - 15 570 3.0

(целая рыба)

6. Минтай 1 : 4 527 — 44 1581 3.0

(разделан.)

7. Сельдь иваси

(2 мес. 1 ; 4 138 28 8.8 552 3.6

Хр.,вод.глаз.)

8. Сельдь иваси 1 : 4 125 24 8.0 500 3.6

(2 мес. хр.)

9. Сельдь иваси 1 : 4 125 23 8.0 482 3.6

сырец

10. Сельдь ива-

си (ткань замо- 1 ; 4 237 43 10.1 914 3.6

рож. - размо-

рож.)

11. Карп 1 : 25 193 50 30 4825 3.6

(ацет. пор.)

12. Карп (ацет. 1 : 50 89 - 28 4450 3.6

пор.)

13. Карп (сыр. 1 : 3 220 - • 11 660 3.6

ткань)

Нами проведены исследования величины катептической активности в экстрактах мышечной ткани рыб в зависимости от таких факторов, как физиологический, биологический, физико-химический, химический, техноло-гическиУ.В табл.4 приведены оптимальные результаты для 13 образцов 5-ти видов рыб. Показано, что для всех экстрактов при различных соотношениях компонентов гомогенатов характерна катептическая активность, определенная по субстрату гемоглобину. Величина активности варьирует для разных рыб от 0.01 до 0.05 ед.акт./мг белка (0.009-0.075 ед.акт./ед. А280), при этом в экстрактах из ацетонового порошка она выше, чем из сырой ткани. Отмечено внутривидовое различие величин удельной активности для экземпляров рыб, заготовленных в разные периоды лова. Например, для тихоокеанской сельди значения этих характеристик выше для образцов весеннего лова по сравнению с январским. Удельная активность ферментных препаратов рыб, хранившихся в разделанном виде выше, чем хранившихся в виде целой рыбы. Для минтая отношение этих активностей составляет около трех, что больше, чем для других видов рыб. Это говорит о существенном влиянии на катептическую активность ткани способа подготовки сырья для хранения. Хотя и в меньшей степени, но этот фактор характерен и для сельди иваси: ферментативная активность выше для образцов, хранившихся в виде целой рыбы, покрытой водной глазурью, по сравнению с образцами в виде разделанной рыбы. По результатам измерений сделан вывод, что активность ферментов сохраняется в мышечной ткани при хранении в течение 2-3 месяцев разделенной рыбы и целой рыбы с водной глазурью, причем, по второму способу активность несколько выше.

3.1. Новый способ выделения протеазы катепсина Д мышечной ткани рыб

Анализ литературы показал, что схемы выделения и очистки катепсина Д из мышечной ткани рыб включают от 7 до 12 основных стадий. (Siebert et al., 1964; Ting et al„ 1968; Makinodan et al., 1969, 1976; Doke et al„ 1980). Такие схемы трудоемки во времени, требуют применения дорогостоящих импортных реагентов, прибороемки. Часто они дают недостаточный для препаративных целей выход по активному белку. Упрощение процесса выделения ферментов с помощью аффинной хроматографии, хотя и требует большой трудоемкой работы, которая была нами проведена, но может привести к получению недорогих ферментов в требуемых количествах. Указанный метод для очистки протеаз рыб был применен впервые.

На рис. 2 представлены варианты использования аффинной хроматографии в схемах очистки катепсина Д рыб, из которых следует, что хрома-

тографию фермента проводили как непосредственно из экстрактов, так и после предварительной очистки фермента. ■, а также в одну и две ступени.

Исходный экстракт

Аффинная хроматография 1

Очищенный ферментный препарат

Аффинная хроматография 1

Диализ (или без)

I

Повторная аффинная хроматография

Очищенный ферментный препарат

Высаливание, гель-фильтрация или диализ, кислотная', щелочная и тепловая обработки

Аффинная хроматография -► Повторная аффинная хроматография

1

Очищенный ферментный препарат Рис. 2. Различные варианты использования аффинной хроматографии в схемах очистки катепсина Д рыб,

Анализ результатов выделения и очистки ферментных препаратов, содержащих катепсин Д мышечной ткани рыб, методом аффинной хроматографии показал следующее. При выделении и очистке катепсина Д из экстрактов мышечной ткани сельди иваси (сардины тихоокеанской) применен метод биоспецифической сорбции на гемоглобин-сефарозе - 4В. Перед аффинной хроматографией фермент был очищен методами тепловой обработки, осаждения (МН-О^О.! и кислотной обработки. Предварительные стадии способствовали очистке фермента от балластных белков в 7.3 - 14.6 раз (для разных экземпляров рыб). В результате этого биоспецифическая сорбция оказалась эффективной и при однократном ее проведении фермент очистился в 45.3 - 248.8 раз, а при двукратной аффинной хроматографии - в 413.3 раза.

С целью увеличения выхода активного белка в препаратах сельди иваси мы изменили схему процесса очистки, исключив стадии тепловой и кислотной обработок, на которых происходит значительное пнгибированне фермента. Также вместо гемоглобин-сефарозы в схему процесса включили другой аффинный сорбент - бациллихин-силохром (табл. 5).

Таблица 5

Выделение и очистка катепсина Д мышечной ткани сельди иваси (сардины тихоокеанской) на б.щпллихин- сшюхроме

' Сталин Белок Агл'пшюсть х 10-* Степень Вы ход,

очистки | 1 о. е. / мл о л: / мг общая, сд. акт. удсльп., ед./о.е. удсльп., ед. / мг белка очистки (по о.е.) /о

Схема - I. Дс-"ая рыба, водная глазурь

1 .Экстрами

2.Диализ

3.Аффшш, хроматог.

15.60 12.60

0.08

5.00 -1.-10

0.06^

15700 28000

2800

8.8 19

537

28 54

717

1

2.1 60

100 более 100 18

Схема -II.

Разделанная рыба

1 ,с)кстр;и;ц

2. Лффанн. хроматог-рафия

1.5.00 0.6.0

5.10 0.-19

14200 3300

8 80

2-1 102

1

10

100 23

схема-Ц |. Снеженылоплешгая, разделанная, охлажденная

1. Экстракп; 15.50

2. Диализ Аффинная хроматогр: 1 фрак. И фрак.

4.00

0.195 0.200

5.50 3.64

14250 9120

5560 8580

8 19

288 438

23 21

1

2.3

36 55

100 64

39 60

Анализируя результаты выделения катепсина Д из мышечной ткани разных образцов сельди иваси, представленных в таблице5, можно видеть, что выход активного белка составляет от 18 до 99% (по сумме активных фракций); степень очистки фермента имеет значения от 36 до 60. Предварительная очистка диализом увеличивает выход фермента до 100% и удельную активность в 5-7 раз, улучшая качество продукта.

Необходимо отмстит}., что препарат катепсииа Д сельди иваси, выделяемый по схемам в таблице 5 проявляет большую стабильность в процессе очистки, чем по схеме, описанной на странице 17 . Эти результаты еще раз подтверждают, что использование кислотной и щелочной обработок при выделении катепсина Д исследованных рыб необходимо свести к минимуму, вследствие значительного необратимого ингибирования фермента.

Следует отметить, что наличие катепсина Д в мышечной ткани сельди иваси нами установлено впервые, также впервые проведены его выделение и очистка.

Из таблицы 6 видно, что используя метод аффинной хроматографии в схемах выделения и очистки катепсина Д мышечной ткани тихоокеанской сельди, получили препарат, очищенный в 43.3-52 раз с выходом по активному белку 3269 %. Обработка экстракта (ЫН-ОгБО-! перед нанесением на колонку позволила в две стадии получить продукт с более высоким выходом - 55 % и степенью очистки 52 (табл. 6, схема IV). Для наших объектов метод сульфат-аммонийной обработки в качестве предварительной стадии очистки оказался эффективнее диализа. Отсутствие предварительных стадий очистки (табл. схема III) привело к уменьшению сорбции до 15%, при этом 85 % акпгвносги фермента не сорбировалось. Его общая активность составила более 100 %, что можно объяснить реактивацией фермента в результате контакта с сорбентом. Для возврата активного белка в схему подключили вторую хроматографическую колонку с сорбентом грамицидин С - силохромом . В результате получили препарат, содержащий 69 % активного белка от нанесенного на эту колонку, и более 100 % по отношению к исходной активности. Эти опыты показали, что для получения препаратов с высоким выходом по активному белку можно применять двуступенчатую аффинную хроматографию, исключив при этом стадии предварительной очистки. Разработанный методический прием является существенным в перспективной технологии выделения ферментных препаратов в условиях плавучих производств. Очистка осуществляется в две стадии. Полученные результаты показали, что количественные характеристики препаратов катепсина Д тихоокеанской сельди имеют один порядок, независимо от вариантов схем получения и вида аффинного лиганда, что говорит о стабильности этих препаратов и возможности выбора приемлемой схемы очистки.

Из экстрактов мышечной ткани карпа удаюсь выделить и очистить препарат катепсина Д в одну стадию, используя аффинную хроматографию на бацил-лихин-силохроме. Выход препарата составил 76 %, степень очистки -6.4 раза.

Таблица 6

Аффинная хроматография катепснна Д мышечной ткани тихоокеанской сельди (колонка 1X8 см).

Стадии Белок, Активность х 103 Степень Выход,

очистки рН ед. А280 очистки %

и' * и общая, удельная,

,01 ед.акт. ед./ед.Агяо

1. Экстракция

из сырой тка- 6.2 2925 20860 9 1 100

ни

2. Диализ I 6.2 322 9660 30 3.3 46.3

З.Хроматогр.

на бицнлли- 5.0 2.25 875 389 43.3 31.7

хин-

силохроме

1 .Эктракция и [

из ацетон, по- 6.5 169.0 1500 9 1.0 100

рош.ткани

2.Диализ II 6.5 69 1800 25 2.9 более

100

З.Хроматогр.

на грамици- 6.5 1.7 720 410 45.5 48

дин -С-

силохроме

1 .Экстракт 6.5 169.0 1500 9 1.0 100

ткани

2.Хроматогр. проскок

на бацилли- III 6.5 46.5 2470 50 5.5 более

хин- 100

силохроме

З.Хроматогр.

на грамици- 6.5 10.1 1710 170 19.0 69

дин

С-силохроме

1 .Экстракция

из ацетон, по- 6.5 85 900 9 1 100

рош. ткани

2.Осаждение

(ЫН^Ол и IV 6.5 - 0 0 — —

гель-фильр.

З.Хроматогр.

на грамици- 5.0 1.76 825 470 52 55 '

дин С-

силохроме.

Полученные результаты аналогичны результатам для катепсина Д тихоокеанской сельди, выделяемого в тех же условиях.

Таблица 7

Результаты выделения катепсина Д из экстракта мышечной ткани карпа на

грамицидин С-силохроме

Стадии очистки РН Белок, ед. А 280 Активность х 103 Степень очистки Выход, %

общ., ед.акт. удельн., ед./ед.Азяо

1. Экстракция 7.0 1000 11000 11.0 . 1.0 100

из сыр. ткани

2.Афф. хроматог.:

фракция I - 600 2400 4.0 - 21.8

проскок

фракция II - 3.35 420 125.4 11.5 4.0

элюат

З.Диализ более

фракции I 6.5 382 4400 11.5 2.8 100

4.Аффин. хрома-

тоф. фракции1:

элюат - 1 3.92 592 151 37.8 24.6

элюат - 2 3.78 1044 276 69 43.5

Для повышения степени очистки ферментного препарата разработан способ очистки протеаз мышечной ткани рыб двуступенчатой хроматографией с диализом между ступенями (табл. 7). Способ позволяет допол-нительнОочистить катепсин Д из мышечной ткани рыб в 2-3.6 и сохранить высокий процент выхода по активному белку. Новизна способа подтверждена патентом РФ.

На приведенных схемах впервые показана применимость метода аффинной хроматографии на биоспецифнческих сорбентах для выделения и очистки аспартильных протеаз мышечной ткани рыб. Метод позволяет сократить число стадий процесса выделения и очистки с 6-14 до 1-4, а также упростить схему процесса, в частности из солевых экстрактов мышечной ткани рыб можно в одну стадию выделить ферментный препарат с выходом до 76% (карп). Различные варианты использования аффинной хроматографии, включая двуступенчатую, в схеме очистки протеаз позволяют выделять препараты катепсина Д со степенью очистки от 6 до 413 раз.

Показано, что аффинная хроматография требует особого подхода к решению задачи в каждом конкретном случае, что позволяет быстро, с хорошим выходом и требуемой степенью очистки получать протеазы рыб. Полученные данные являются основой для разработки технологии при масштабировании процесса выделения и очистки ферментных препаратов из отходов рыбопереработки в условиях открытого моря.

3.1.2. Возможные разновидности форм катепсина Д рыб Важным фактором, выявленным в ходе исследования катепсина Д мышечной ткани рыб методом аффинной хроматографии, является наличие в препаратах некоторых рыб двух близких по свойствам активных белков, предположительно, разных форм катепсина Д.

Рис.3 Рис.4

Рис. 3. Аффинная хроматография катепсина Д мышечной ткани тихоокеанской сельди на колонке (1x8 см) с грамицидин С-силохромом после осаждения сульфатом аммония (50-80 % нас.) и гель-фильтрации через сефадекс G-25. Рис. 4. Повторная хроматография катепсина Д мышечной ткани тихоокеанской сельди на колонке с грамицидин С-силохромом (1x8 см). Пики содержащие активный белок, заштрихованы.

По-видимому, грамицидин С и бациллихин, будучи сорбентами общего типа, обнаруживают определенную степень специфичности, что и позволило нам выявить и разделить разные формы исследуемой протеазы. Разделенные хроматографией на грамицидин С - силохроме активные формы ка-тепсина Д карпа имели: удельные активности (гемоглобин; рН 3.6) 151x10-3 и 276x10'3 ед.акт./ед. Амо; степени очистки 37.8 и 69; выход 24.6 % и 43.5%. Для сельди иваси эти характеристики имеют такой же порядок, но удельные активности и процент выхода выше, примерно, в 1,5-2 раза. Наличие двух близких по свойствам активных форм белка в очищенном препарате катепсина Д ( предположительно, его изоформ) подтверждено результатами диск-электрофореза. На электрофореграмме присутствуют две интенсивно окрашенные на белок полосы, являющиеся основными и две слабоо-крашенные, близко расположенные к первым, представляющие, возможно, минорную форму активного белка.

На рисунке 3 активные пики I и II проявились при хроматографии предварительно очищенного препарата катепсина Д тихоокеанской сельди на грамицидин С-силохроме. При повторной хроматографии активные белки удалось разделить (рис. 4). Интересно отметить, что использование сорбента с лигандом бациллихином на первой ступени хроматографии катепсина Д карпа не позволяет выявить асимметрию кривой элюции.

Тактика использования впервые примененных к протеазам рыб отечественных биоспецифических сорбентов (грамицидин С-силохрома, бациллихин- и бацитрацин-силохрома) позволила впервые выявить, разделить и получить два близких по свойствам белка, предположительно изоформ катепсина Д рыб: сельди иваси, сельди тихоокеанской, карпа. Вследствие этого метод аффинной хроматографии в приложении к протеазам мышечной ткани рыб выполняет функции также аналитического метода.

Установление существования разных форм катепсина Д мышечной ткани рыб позволяет в новом аспекте рассмотреть механизм его участия в протеолизе при созревании рыбного сырья, который заключается в последовательном вступлении в реакцию разных форм фермента.

Результаты проведенных разработок по применению аффинной хро-] матографии для очистки протеаз мышечной ткани рыб, а также компакт -I ность оборудования, комфортность работы, удобство транспортировки, известное в литературе устройство для аффинной хроматографии (Григорьев и др., 1992) позволяют рекомендовать этот метод для получения препаратов протеолитических ферментов рыб в промышленных количествах.

4. Синтез новых аффинных сорбентов на основе полмаминосахарида хитозана

Одной из причин, ограничивающих промышленное применение аффинной хроматографии, является отсутствие дешевых носителей для синтеза биоспецифических сорбентов.

Примененные в работе известные сорбенты синтезированы на основе агарозы и кремнезема. Эти носители имеют ряд недостатков, в частности, кремнезем обладает недостаточной химической устойчивостью, особенно в щелочной среде, неспецифической сорбцией, химической инертностью поверхности, требующей предварительного ее аминирования. Наши данные и литература свидетельствуют о необходимости поиска новых материалов-носителей для синтеза более доступных и совершенных видов аффинных сорбентов. Перспективным, на наш взгляд, носителем-матрицей для биоспецифических сорбентов является биополимер на полиаминосахарид-ной основе - хитозан.

В работе проведен синтез и получены новые аффинные сорбенты на основе хитозана.

Хитозан получают из природного полиамипосахарида хитина (полимер М-ацетил-О-глюкозамина) путем щелочного деацетилирования. Изучение микроструктуры хитозана с помощью электронного микроскопа (рис. 5) показало, что, благодаря наличию пор, слоистости структуры, микротрещин, наблюдаемых также на торце хрупкого скола, он может быть эффективным материалом в качестве матрицы аффинных сорбентов. С целью проведения регулируемого синтеза с участием хитозана на пяти образцах разных партий и источников разработали методику количественного определения реакционно доступных (поверхностных) аминогрупп, в основе которой лежит метод проведения цветной реакции с ТНБС. Анализ результатов показал, что число аминогрупп, доступных для химических веществ синтеза, зависит от метода получения хитозана, а не от природы хитин содержащего источника.

Выбор специфических лигандов обоснован экспериментально

Результаты показали, что аспартильные протеазы мышечной ткани рыб проявляют специфичность в отношении антибиотиков-полипептидов бациллихина, бацитрацина и грамицидина С. Ковалентное связывание лигандов с хитозаном происходило посредством конденсирующих агентов глутарового альдегида или п-бензохинона, наиболее эффективным из которых оказался глутаровый альдегид.

Рис. 5. Электронограммы поверхности хитозана, полученного из хитина Камчатского краба - образец N 5: 5-а и 5-6 - вид поверхности торца хрупкого скола; 5-В - один из участков поверхности; 5-г (нижняя часть снимка) -сканирование участка поверхности верхней части снимка.

Число включений лиганда (мкМ/г), определяющее емкость сорбента, рассчитывали по результатам аминокислотного анализа. Количественные характеристики и результаты синтеза аффинных сорбентов (табл. 8 ) на основе хитозана свидетельствуют, что полученные новые химические материалы (число включений лиганда от 4.5 до 26.0 мкМ/г сорбента) относятся к биоспецифическим сорбентам. Процент выхода для большинства полученных образцов составляет 21.6 - 94 %. При его расчете использовали число реакционно доступных аминогрупп.

Таблица 8

Синтез аффинных сорбентов на основе хитина и хитозана

Ма!сриал- Число Т 1 Кондепсир. рсагсшы Лигаиды ::____________]■ Включение

ш'сшс.п» рсакцмон. I глугаров. п-бспзо- грамици- бациллнхин бани фации ! лиганда,

МЬ-фуни | альдегид ХИ11011 дин С 1 ! мк Моль

1 (М=108),г (М=108).г (М=1269),г (М-14000 ).г (М-ПООО).г | г

1.Хточаи 30 5.57 0.15 26

криля

2.Хшочаи 68 ~ 1 0.383 0.16 4.5

криля

З.Хигочан - -- 0.383 0.15 - - 5.0

краба

4.Хиючан 30 5.57 - - 0.5 ~ 8.5

криля

5. XI поза п 30 5.57 - 0.1 8.5

криля

С'.Х|!10!ан 30 5.57 - - - 0.15 8.0

крпчп

7.Хш ни - 5.57 - - - 0.15 13

криля

_____________

; Выхол.

21.6 3.5 4.2 24

94 57 93

с\

Использование хитозана в качестве матрицы не требует применения активатора поверхности - дорогостоящего у.-аминопропилтриэтоксисилана. Вместо канцерогенного п-бензохинона, применяемого в синтезе сорбентов на основе кремнезема, в качестве конденсирующего агента, мы показали возможность использования глутарового альдегида. Благодаря предварительному определению количества поверхностных аминогрупп расход антибиотиков - лигандов сокращается в несколько раз. Химическая формула одного из новых аффинных сорбентов - грамицидин С - хитозана приведена на рис. б .

Ы_еи

О-РЬе

ЬРго

1г\'а1

ЬОгп

X

■ ЬУа1

ЬРго

й-РЬе

Ней

Рис. 6 . Химическая модификация поверхности хитозана. Лиганд - грамицидин С ; Связующий агент - п - бензохинои.

или С-СНг-СН-СНгС

снгон

Грамиппдпп С - хптсиаи.

Таким образом, разработана химическая технология регулируемого синтеза новых аффинных сорбентов с использованием в качестве матрицы хитозана, получаемого в результате переработки вторичных биоресурсов моря.

Изучение свойств полученных сорбентов на примере аффинной хроматографии аспартильной протеазы пепсина показало, что они обладают

определенной нсспецифической сорбцией; их гидродинамические свойства сравнимы с сорбентами на основе силохрома. Выход по активному белку пепсину составил 11 - 22 %, что указывает на способность синтезированных сорбентов избирательно сорбировать протеазу животного происхождения.

Результаты аффинной хроматографии аспартильной протеазы катеп-сина Д мышечной ткани минтая на бацитрацин-хитозане (табл. 9) показывают, что выход по активному белку составил 23 %, степень очистки 6.2. При сравнении с результатами, полученными для минтая на бациллихин-силохроме в аналогичных условиях очистки, видно, что процент выхода по активности на бациллихин-хитозане выше при сходных степенях очистки.

Таблица 9

Результаты аффкппой хроматохрафии катепсипа Д мышечной ткани минтая па бапитрашш - хиточане.

Стадии ! ПСЛОК ! АК1 ИШЮСТ ь X 10"' ; Степень | Выход,

1 хромато-! общ., | общая,. ед.акт. | ед.акт', 1 ОЧИСТКИ , 0 ' .- о

■ графин ; о.е. ед.акт. ! мл 1 ! о.е. 1

| Экстракт ! 35.9 1900 3X0 50 1 100

1 Проскок | 12.3 430 ПО 30 ~ 22.5

■ Промин.:

; фракц. -I | 8.95 3875 !55 430 8.6 45.5

фракц. -2 ! 0.6

; фрикц. -3 | 1.5 - - —

; Элюат | 1.1 440 44 310 6.2 23

Таким образом, разработка технологии получения биоспецифических сорбентов на основе полиаминосахарида хитозана открывает перспективу развития аффинной хроматографии протеаз животного происхождения на новых типах сорбентов. Новизна способа получения сорбентов защищена патентом РФ.

5. Влияние сброса промывных вод до и после очистки на жизнеспособность диатомовых водорослей в открытом морс

Качество морской воды принято характеризовать уровнем жизнеспособности диатомовых водорослей. Его устанавливают по величине изменения замедленной флуоресценции (ЗФ), представляющей индуцированную фотохемофлуоресценцию, которая возникает в результате предварительного освещения объекта. Анализ загрязнений природной воды химическими компонентами техногенного стока на жизнеспособность водорослей показал, что в первые сутки после сброса вод первой промывки уровень ЗФ у морских одноклеточных диатомовых водорослей Phaeodactilum tricornutum при солености смешанных вод 8 °/оо снижается на 41 %, что соответствует средней токсичности среды и разбавлению стока морской водой в 2 раза.

Следует отметить, что вода первой промывки, | Chlorella vulgaris и Daphnia magna ¡исследованная до попадания в морскую среду на пресноводных био-тестах^ не проявляла токсичности в первые сутки. При попадании воды первой промывки в природную (морскую) воду в зонах их смешения, содержащих высокую концентрацию белка, что соответствует низкому разбавлению стока (соленость 8 %о), отмечается ускорение процесса подавления ЗФ: на вторые сутки на 50 %, а на третьи - все водоросли погибли. В опытных пробах ощущали сильный запах сероводорода, жидкая среда приобрела зеленоватую окраску.

Полученные результаты говорят о высокой степени трофности промывных вод рыбных фаршей и о необходимости предварительной их очистки перед сбросом в открытое море. Применение метода сульфат-аммонийного осаждения белковой фракции, содержащей целевой фермент, позволило снизить концентрацию белковых веществ в воде первой промывки. Супернатант был диализован и смешан с водой второй промывки (1:1) с целыо снижения в последней концентрации белка. Результаты исследования частично очищенного суммарного стока первой и второй промывок с помощью морских одноклеточных водорослей показали, что при разбавлении стока морской водой в 2 раза (соленость образца 8 ('/оо) изменение уровня ЗФ через трое суток составило 38 %, что характерно для среды средней токсичности по отношению к контролю, тогда как для неочищенного стока в течение первых двух суток изменение уровня ЗФ происходило на 41-50 %, а на третьи сутки все водоросли погибли.

Показано, что, попадая в морской водоем с промывными стоками, белковые вещества промывных вод рыбопереработки подвергаются

химическому превращению, образуя токсичные продукты, которые являются причиной вторичного загрязнения водоема.

Предложена технология уменьшения степени трофности промывных вод рыбных фаршей, основанная на удалении методом сульфат-аммонийного осаждения белковых веществ из воды первой промывки с последующим использованием очищенной воды в качестве оборотной для разбавления стока второй промывки перед сбросом в море. Метод контроля загрязненных сред с помощью морских биотестов Р1шеос1асШит Шсогптит можно использовать в качестве экспресс-метода при решении задач рыбохозяйственного нормирования допустимых загрязнений морского водоема.

Утилизация белковых компонентов промывных вод плавзаводов по производству промытых рыбных фаршей будет способствовать улучшению экологической обстановки в районах промысла и рациональному использованию рыбного сырья. '

6. Разработка схемы промышленного получения ферментных препаратов ка-тепсина Д и белкового продукта

По результатам исследования разработана принципиальная схема технологического процесса выделения ценных белковых компонентов рыбного сырья из промывных вод производства фарша минтая (рис. 7). Целевые продукты - препараты катепсина Д и белковый кормовой продукт - могут быть получены как параллельно (схемы А и В), так и автономно (схемы А или В). Рабочий цикл получения ферментного препарата включает фильтрование воды 1-ой промывки, биоспецифическую сорбцию протеаз, концентрирование ферментного раствора на ультрафильтрационном модуле, обессоливание препарата гель-фильтрацией с последующей лиофильной сушкой или консервирование сульфатом аммония: Рабочий цикл получения белкового продукта включает фильтрацию промывных вод, электрофлотацию (угольно-железные электроды), обезвоживание белкового продукта, его сушку и гранулирование.

С целью повышения эффективности процесса очистки промывных вод фаршевых производств в схему внедрена стадия доочистки этих вод от белка с помощью адсорбции на цеолите. Предварительные исследования ученых Приморского края показали, что этот минерал эффективен в процессах адсорбции при больших объемах очищаемых растворов.

-»1 — л

о * С С) п

- — "2

о ^ 5

■з а

к г

I —

■е- -• =

г £

1 = г

= ^

5 а _

с о

2 4- 1 1 ¡'иЧ'¡||||'

■ о 'и!1!;!!!',1,! — з;

■р 5

? 2 5 |

5 Р г в

о 5 =

я = ел о *_

£ о

С т> с\

= О Г-

ОБЕССОЛЕННЫЙ ФЕРМЕНТНЫЙ РАСТВОР

Адсорбционная колонка с цеолитом включалась в схему процесса после стадии электрофлотации. Результаты показали, что промывные воды фарша минтая с использованием цеолитов в схеме были очищены от белка на 90 % (информ.листок N 60 - 95, 1995). Это позволяет получать технически очищенную воду и использовать ее в качестве оборотной на первых стадиях технологического процесса производства фарша минтая. Цеолит с адсорбированным нативным белком представляет кормовую добавку на минеральной основе.

Перспективы масштабирования разработанных схем заключаются в том, что:

- в качестве сырьевого источника протеолитических ферментов животного происхождения предлагается использовать промывные стоки производства рыбных фаршей типа сурими в условиях открытого моря; 1 л промывочной воды содержит 475 ед.активности;

- в регионе имеется сырьевая база для получения сорбентов по разработанному способу (пат. РФ) из отходов переработки ракообразных и на основе полезных ископаемых, которые прошли лабораторные испытания с положительным результатом;

- внедрение комплексных технологий позволит наряду с ферментным препаратом получать ценный содержащий белок кормовой продукт. Выделение белкового продукта будет способствовать улучшению экологической обстановки в промысловых районах.

Проведенный расчет предварительного экономического эффекта от выделения белкового продукта по рыбомучной базе (РМБ) проекта 413 показал следующие результаты.

При годовом объеме производства "Особого фарша мороженого" из мяса минтая, равном 2089 т, с расходом воды на промывку, равном 12534 т (с концентрацией белка в промывных водах 2 г/л ), экономический эффект составил 14900 руб. Расчет произведен на одно судно. По всем судам ВРПО "Дальрыба" - 60792 руб., в ценах 1986 г. (Отчет о НИР, 1986).

выводы

1. Научно обосновано использование промывных вод рыбного фарша для извлечения обычно теряемых физиологически активных компонентов -фермента суперсемейства аспартильных протеаз катепсина Д и белка.

2. Установлено, что из фарша минтая в процессе промывки экстрагируется до 70 % ферментов с катептической активностью. Это позволяет оценивать промывные воды, как сырьевой источник ферментов данной направленности.

Показано, что величина катептической активности в водных и с низкой концентрацией соли экстрактах мышечной ткани промысловых рыб находится в пределах 1.8 - 14.4 ед.акт./г нативной ткани или 0.02 - 0.05 ед.акт./мг белка.

3 . Установлено, что использование методов традиционной биохимии (рН -

осаждение, сульфат - аммонийное осаждение, тепловая обработка в сочетании с рН - осаждением) позволяет получить катептические препараты из экстрактов мышечной ткани рыб, очищенные в 50 раз с выходом^ 20%.

4 . В качестве аффинных сорбентов для выделения катепсинов из мышечной

ткани рыб впервые использованы грамицидин С- силохром, бацилли-хин-силохром и бацитрацин- силохром- сорбенты отечественного производства, что позволило получить ферментные препараты катепсина Д в 1-4 стадии со степенью очистки 6-60 раз и выходом от 10 дсЗ 100 %, удовлетворяющими препаративным целям. Способ защищен патентом РФ. Использование методов аффинной хроматографии на сорбентах зарубежного производства (гемоглобин-сефароза) в сочетании с традиционными методами очистки позволяет получать ферментные препараты катепсина Д рыб с высокой степенью очистки (413), но низким выходом -до 4.5 %.

5. Разработана технология регулируемого синтеза и впервые получены аффинные сорбенты на основе хитозана с грамицидином С и бацитрацином в качестве лигандов. Способ защищен патентом РФ. разработка технологии получения биоспецифических сорбентов на основе полиаминосаха-рида хитозана открывает перспективу развития аффинной хроматографии протеаз животного происхождения на новых типах сорбентов.

6 . Предложена технология удаления белка из промывных вод, основанная на осаждении белковых веществ сульфатом аммония (50-76 % нас.). Параллельно ведется разбавление последующего стока очищенным предыдущим. Уменьшение концентрации белковых веществ в промыв-

ных стоках способствует улучшению экологической ситуации в районах промысла и рыбопереработки. 7. Предложены три технологические схемы выделения ферментного препарата:

1 - выделение только ферментного препарата;

2 - выделение ферментного препарата и белкового продукта (с очист-

кой воды по белку до 70 %);

3 - выделение ферментного препарата и практически полное удаление

белка из промывных вод. Масштабирование технологических процессов в соответствии с приведенными схемами экономически целесообразно, так как целевые продукты получают из отходов рыбопереработки, а для приготовления сорбентов используют продукт переработки вторичных отходов производства морепродуктов - хитозана.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах.

1. Иголкина Л.А., Слуцкая Т.Н., Руденская Г.Н. Применение аффинной хроматографии на биоспецйфических сорбентах отечественного производства для выделения мышечных протеаз рыб// Всесоюз. совещ. "Исслед. и рационал. использование биоресурсов Дальневост. и Северных морей СССР и перспективы создания техн. средств для освоения неиспольз. биоресурсов Мирового океана": Тез. докл. - Владивосток : 1985.

2. Иголкина JI.A., Руденская Г.Н., Слуцкая Т.Н. Использование аффинных сорбентов отечественного производства для выделения катептического препарата из мышечной ткани рыб // Исследования по технологии гид-робионтов Дальневосточных морей: Владивосток: ТИНРО, - 1986. -С.36-40.

3. Слуцкая Т.Н., Иголкина JI.A., Соколова Е.В. Выделение катепсина Д из мышечной ткани рыб // Прикл. биохим. и микробиол. - 1987. - т.23, вып. 4. - С. 447-450.

4. Иголкина Л.А., Слуцкая Т.Н. Выделение катепсина Д из мышечной ткани тихоокеанской сардины // "Интенсификация технол. процессов в рыбной промыш." Тез. докл. - Владивосток: 1987- С. 10-11.

5. Иголкина Л.А., Филенкова В.В. Промывные воды при производстве фарша минтая как источник протеаз // Всесоюз. совещ. "Биологически активные вещества гидробионтов при комплексной утилизации ресурсов океана": Тез. докл. - Владивосток: 1988. - С. 12-13.

6. Иголкина JI.A., Слуцкая Г.Н. Выделение препаратов катепсина Д из мышечной ткани рыб на специфических сорбентах // Изв. вузов СССР. Пищ. технол. - 1989. - N4. - С. 16-18.

7. Иголкина Л.А., Слуцкая Т.Н. Выделение катепсина Д из мышечной ткани сельди иваси // Интенсиф. технол. процессов в рыб. пром. - Деп. в ВНИИЭРХ, 1989, N10(216). - 5с.

8. Иголкина Л.А. Использование промывных вод фарша минтая для получения ферментного препарата // Проблемы технологии переработки нетрадиционного сырья из объектов Дальневосг. промысла. - Владивосток: ТИНРО; - 1989. -С.53-57.

9. Иголкина Л.А., Жамская H.H. Выделение ферментных препаратов и белковых продуктов из сточных вод рыбной промышленности // Всесо-юз. совещ. "Автоматизация процессов управления техн. средствами ис-след. и освоен. Мирового океана.": Тез. докл. - Калининград. - 1989. -С.234.

10.Иголкина Л.А., Горбачев C.B. Исследование полярных свойств двойных растворителей переменного состава.// Тр. МХТИ им. Д.И.Менделеева:М., 1972.-B.71.-C. 95.

И.Иголкина Л.А., Порыгина Т.В. Заготовка биологического материала гидробионтов методом ацетонового порошка II Всесоюз. научн.-техн. конфер. "Интенсификация технолог, процессов в рыбной промыш.": Тез. докл. - Владивосток: 1989. - С. 148-149.

12.Иголкина Л.А. Влияние физико-химических свойств двойных растворителей переменного состава на растворимость органических веществ: Ав-тореф. дисс. на соиск. учен. степ. канд. хим. наук. - М., 1973. - 22с.

13.Иголкина Л.А., Жамская H.H. Технология получения ферментного препарата и белкового продукта из промывных вод фарша минтая // Каталог тем, предлагаемых к продаже и разработке на выставке-ярмарке "Наука-производству": М., 1989.

М.Иголкина Л.А. Исследование возможности использования метода ультрафильтрации в технологии выделения протеолитических ферментов из промывных вод фаршевого производства // Науч. - техн. конф. Тез. докл. - Мурманск: 1991. - С.207-208.

15.Иголкина Л.А. Технология выделения ферментного препарата из промывных вод производства фарша минтая. 4.1 Мет. пособ. для студ.

^BAadHRûcrûk. : Hiâ. йальрЬ1БвтгЗАч „i M'î.. - t\c .----\

спец. Гехнолопш рыоы и рыбных продуктов и Водные биоресурсы . ->*

16.Иголкина JI.A. Химические дисциплины в профессиональной подготовке студентов//Высшее образование в России. - 1994.-N1. - С. 120-12 4.

17. Иголки на Л.А. Системно-структурный подход к реорганизации УИРС в вузе с применением постадийного и алгоритмизированного методов обучения : Мет. пособ. для преподават. и студ. - Владивосток: изд. Даль-рыбвтуза, 1992. - 18с.

18.Иголкина Л.А. Расчет аминокислотного состава белка: Метод, пособ. для учеб. и науч.-исслед. работы с приложен, программы для микроЭВМ. - Владивосток: изд. Дальрыбвтуза, 1993. - Юс.

19.Иголкина JI.A. Синтез сорбентов на основе хитозана для биоспецифической хроматографии протеаз // Всерос. конф. "Производство и применение хитина и хитозана". Тез. докл. - М.: 1995. - С.59-61.

20.Иголкина JI.A. Проблемы безотходной технологии и охраны окружающей среды // Междунар. Науч.-техн. конф. "Пища. Экология. Человек". Тез. докл.-М.: 1995. -С.93.

21.Жамская H.H., Шапкин Н.П.. Иголкина JI.A. Установка для получения белковых продуктов из сточных вод рыбоперерабатывающих предприятий: РОСИНФОРМРЕСУРС Информ. лист. N60-95. Сер.Р.70.25.17. -1995. - Зс.

22.Старцева А.И., Соколова С.А., Иголкина JI.A. Токсичность сточных вод предприятий рыбной отрасли по производству рыбного фарша II Гидробиологический съезд. Тез. докл. - Казань: 1996.- 2 с.

23.Пат. 2065876 РФ МКИ С 12 N9/50 Способ извлечения ферментного препарата из мышечной ткани рыб /Л.А.Иголкина. - 1995.- 5 с.

24.Пат. 2065807 РФ МКИ С 12 N9/50 Способ получения аффинного сорбента/Л.А.Иголкина, Г.Н.Руденская. - 1995.-6 с.

Подписано к печати Заказ 0/ Объем., л.п.2,^ Формат 60x84 1/16_Тираж /ОО

ВНИРО. 107140, Москоа, В.Краносельская, 17