Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антирестрикционные белки, ..одируемые трансмиссивными плазмидами групп I и N

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Антирестрикционные белки, ..одируемые трансмиссивными плазмидами групп I и N"

КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

РГ8 ОТ

, на правах рукописи

Дельвер Евгений Петрович

АНТИРЕСТРИКЦИОННЫЕ БЕЛКИ, ЗДИРУЕМЫЕ ТРАНСМИССИВНЫМИ ПЛАЗМИДАМИ ГРУПП X И N

Специальность 03.00.04 - биохимия

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1993 г.

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии Института Экспериментальной Кардиологии Кардиологического Научного Центра РАМН.

Научный руководитель - кандидат биологических наук,

Белогуров A.A.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор Смирнов Г.Б.

доктор биологических наук, Тер-Аванесян М.Д.

Ведущее учреждение - Институт биоорганической хими

им. М.М. Шемякина РАН

Защрт» состоится "i?Q.____1993 г.

в./.'..часов на заседании специализированного совета К 001.22.02 в Кардиологическом Научном Центре РАМН (121552, г. Москва, 3-я Черепковская ул., д. 15А)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотек Кардиологического Научного Центра РАМН.

Автореферат разослан ". " .. . 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы исследования. Изучение механизмов регуляции потока генов между различными бактериями, осуществляемых в природе трансмиссивными плазнидами и бактериофагами, позволяет приблизить нас к пониманию ключевых моментов в процессах формирования и адаптивного функционирования генома бактериальной клетки. Согласно современным представлениям в природе между различными, даже весьма отдаленными группами бактерий постоянно осуществляется обмен генетическим материалом, то есть нуклеиновыми кислотами (ДНК и, возможно, РНК). В частности известно, что множество природных трансмиссивных плазмид и умеренных бактериофагов способны эффективно осуществлять перенос ДНК между различными бактериальными клетками. Некоторые из них, включая R-плазмиды, кодируют гены резистентности к антибиотикам, и процесс их распространения между патогенными бактериями представляет собой важную проблему в чедицине и медицинской генетике.

Однако, когда ДНК плазмиды или фага входит в новую клетку, зна часто разрушается специфическим ферментами, рестрикционными эндонуклеазами, которые распознают "чужую" ДНК по отсутствию зпецифического метилирования, выполняющего роль своеобразного 'молекулярного паспорта". Эти наблюдения ассоциируются в 1астоящее время с природным механизмом "эммиграционного :онтроля", который, по-видимому, осуществляет контроль потока ■енов между различными популяциями бактерий и способствует ■пределенной генетической изоляции между отдаленными [икроорганизмами. В то же время известно, что многие большие (50 300 т.п.н.) трансмиссивные плазмиды способны с высокой ффективностыэ осуществлять свой перенос между бактериями с аэличными системами рестрикции. Этот факт указывает на то, что ти плазмиды могут кодировать антирестрикционные функции. В 19835 гг. такие антирестрикционные функции Ard (alleviation of estriction of DNA) были обнаружены в работах Белогурова и авильгельского. Отметим, что подобные антирестрикционные функции писаны для некоторых бактериофагов. Одна из них, кодируемая актериофагон Т7, была детально изучена в работах Studier et al. цнако молекулярные,основы антирестрикционных функций, кодируемых рансмиссивными плазмидами, оставались неизвестными.

Настоящая работа посвящена изучению детальной структуры ard

генов плаэнид pKMIOl и ColIb-P9, кодируемых ими антирестрикционных белков и особенностей их функционирования в клетках E.coli.

Цель исследования. Основная задача данной работы заключается в идентификации антирестрикционных Ard белков трансмиссивных плаэнид pKMIOl и Со11Ь-Р9, определении нуклеотидной последовательности кодирующих их генов и изучении особенностей функционирования Ard белков в клетках E.coli.

Новизна результатов. В данной работе определена нуклеотидная последовательность ard генов неродственных трансмиссивных плаэмид групп IncN и IncI и идентифицированы кодируемые ими антирестрикционные белки Ard. Показано, что эти белки гомологичны (имеют около 60% идентичных аминокислот) и функционально сходны. На основе анализа предсказанных аминокислотных

последовательностей Ard белков предложен механизм их действия на системы рестрикции-модификации I типа E.coli.

Практическая ценность работы. Данная работа позволяет прояснить механизмы регуляции обмена генами между различными бактериями, осуществляемого в природе при помощи трансмиссивных плазнид. Полученные результаты важны для понимания путей и способов распространения генов вирулентности и резистентности к антибиотикам среди бактерий, что имеет важно.е значение для медицины и медицинской генетики.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 93 Конгрессе Американского микробиологического общества в 1993 г. в Антланте (США).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано две статьи и одно тезисное сообщение.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы" и "Список литературы". Работа изложена на 124 страницах машинописного текста,

включающего 12 рисунков, 3 таблицы и список литературы, содержащий 182 ссылки.

Обзор литературы состоит из двух разделов. В первом разделе рассматриваются системы репликации и конъюгационного переноса трансмиссивных плазмид, играющих ключевую роль в процессе обмена генетической информацией между бактериальными клетками, во втором подробно обсуждаются клеточные системы,

которые способны контролировать этот, обусловленный миграцией плаэмид и умеренных бактериофагов, поток генов: системы рестрикции-модификации и, известные в настоящее время кодируемые фагами, системы антирестрикции.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы стандартные методы молекулярной биологии и биохимии (Sambrook et al., 1989). Манипуляции с бактериями и бактериофагами проводили согласно протоколам, описанным в руководствах (Миллер, 1976; Silhavy et al., 1984; Messing, 1983). Трансформацию бактерий E.coli плазмидами проводили согласно работе (Hanahan, 1985). Антирестрикционную активность, экспрессируемую ard генами в клетках E.coli, оценивали по эффективности посева немодифицированного бактериофага Х.О.

Анализ препаратов нуклеиновых кислот и белков проводили при помощи элехтрофоретичесхих методов с использованием агарозных и полиакриламидных гелей. При выделении ДНК небольших плаэмид использовали стандартные методы .очистки (Birnboim and Doly, 1979). Препараты ДНК больших (> 20 т.п.н.) получали при помощи более мягких методов выделения (Hansen and Olsen, 1978), включая метод очистки в равновесном градиенте плотности хлористого цезия в присутствии бромистого этидия.

Получение однонаправленных делеций при помощи нуклеаэ ЕхоШ и Mung Bean и упаковку однотяжевыи матриц при помощи фага-помощника проводили согласно протоколам фирмы Stratagene.

Секвенирование проводили на одно- и двухцепочных матрицах четодом дидеэокси-тернинации (Sanger et al., 1977) по обеим -штям. Реакции секвенирования анализировали в 5% полиакриламидном "еле с 7 М мочевиной с использованием геля длиной 55 см с -радиентон толщины 0.2-0.7 мм. Белковые образцы анализировали в L5% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, 1ибо в градиентном 5-25% полиакриламидном геле в присутствии (одецилсульфата натрия (Laeramli, 1970). Для анализа нуклеотидных I аминокислотных последовательностей использовали пакеты программ 'C-Gene и GCG Sequence Analysis Software Package.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Настоящая работа продолжает исследования антирестрикционных функций Ard (alleviation of restriction of DNA) кодируемых трансмиссивными плазмидами, ведущиеся с 1983 года, когда Белогуровым и Завильгельским был обнаружен феномен антирестрикционного действия IncN плазмиды pKMIOl на системы рестрикции I типа в E.coli. Затем было показано, что другие плазмиды группы IncN, а также плазмиды Indi группы несовместимости (в частности Со11Ь-Р9) обладают сходным антирестрикционным действием. Локусы, кодирующие Ard функции плазмид pKMIOl и Со11Ь-Р9 были грубо картированы при помощи Тп5 инсерционного мутагенеза (в случае pKMIOl) и субклонирования рестрикционного фрагмента (2,8 т.п.н.) в мультикопийный вектор (в случае ColIb-P9) (Belogurov et al. 1985, Котова и др. 1988). Отметим, что клонирование активного ard локуса IncN плазмиды pKMIOl ранее не удавалось по причине высокой нестабильности ("летальности") ard+ конструкций.

В настоящей работе мы определили нуклеотидн'ук) последовательность двух плазмидных генов ard и ardA и идентифицировали их продукты, антирестрикционные белки Ard и ArdA, соответственно. Были изучены также особенности функционирования этих белков в клетках E.coli и на основе этих результатов и анализа первичной структуры Ard белков предложен механизм их антирестрикционного действия.

Клонирование гена ardA плазмиды pKMIOl и идентификация регудяторного гена ardK.

На основании первых неудачных попыток субклонировать BgriU фрагмент плазмиды pKMIOl, который кодирует ardA ген, в мультикопийный вектор мы пришли к выводу, что ardA локус может кодировать ген типа kil, который обладает летальным на клетку хозяина действием. Однако нам удалось субклонировать ardA ген в составе XhoX-ВаиШ. фрагмента (10,3 т.п.н.) инсерционного производного плазмиды pKMIOl, pKMIOl::Tn5r¡291, в мультикопийный вектор pBluescript II. В результате была получена плазмида рАВ1, кодирующая активный ген ardA (Рис.1). Отметим, что в ДНК плазмиды pKMIOl Xhol сайты отсутствуют. Поэтому очень удобно использовать Xhol сайт, локализованный в каждом из концевых повторов Тп5 транспоэона, интегрированного в плазмиду pKMIOl, для

Анализ нуклеотидной последовательности, предшествующей ОРС ardA, выявил присутствие потенциально сильного промотора, который имеет -35 (TTGACT) и -10 (GATAAT) сайты, типичные для промоторов E.coll, разделенные характерным интервалом в 17 нукяеотидов. Сравнение этого промотора с известной промоторлой

последозательностьо показало, что этот промотор имеет -35 и -10 гексамеры, идентичные соответствующим сайтам PR промотора бактериофага лямбда (Harley and Reynolds, 1987).

Для идентификации продукта гена ardA мы использовали систему

каксиклеток E.colí (Sanear et al., 1979). Для этого белки,

+• TS

кодируемые плаэнидой рАВ7(апЗД ) специфически метились [ S)-

иетионином и анализировались в градиентном полиакриламидном геле

з присутствии додецилсульфата натрия (Рис.3). Отметим, что

эпыты с плазмидой pAB7(ardA+) проводились в присутствии

;овместимой плазмиды pORSO(ardK+), которая необходима для того,

1Тобы нейтрализовать летальное действие плазмиды рАВ7. Как

)идим, плазмида pAB7(ardA+) кодирует полипептид с молекулярным

¡есом около 20000 (трек 2), который отсутствует в препарате

¡елков, кодируемых в присутствии вектора pBluescript II и

>езидентной плазмиды o0R80(ardíC+) (трек 1). Этот 20 кД белок

отсутствует также в максиклетхах с мутантной ' плазмидой

>АВ8(ardA~) (грек 3), и его молекулярная масса находится в

оответствии с расчетным, полученным из нуклеотидной

оследовательности ardA, молекулярным весом. На основании этих

езультатов мы пришли к выводу, что 20 кД белок является

родуктом гена ardA.

елеционное картирование гена ard плазмиды Со11Ь-Р9 и дентификация его белкового продукта.

В результате субклонирования в мультикопийный вектор и элетирования рестрикционных фрагментов плазмиды Со11Ь-Р9 (Рис.4) шее была получена плазмида pVK8 (Котова и др., 1988), которая ала использована в данной работе в качестве исходной (Рис.5). )лее точное картирование ard гена было выполнено при помощи IÍ31 делеций. На Рис.5 представлены результаты этого :леционного анализа. Как видим, делетирование 2 20 п.н. (со •ороны RsaI сайта) и 259 п.н. (со стороны PvuII сайта) приводит потере Ard фенотипа (плазмиды pED220 и pED707, соответственно).

Продукт гена ard был идентифицирован при помощи ецифического мечения [ "®5S)-метионином белков, экспрессируемыу.

I 1-1-1-1-1-1-1-Ï-

« 10 20 30 40 50 60 70 SO

X s s s s sss

Lu_L........IJ_I_I II I I il il il il I_I 111

ibf imp ssbp.siBaril oriT exc юg

oriT Tra

Рис.4. Физическая и генетическая карта плаэмиды Со11Ь-Р9. Верхняя линия обозначает координатную сетку в т.п.н. За начало отсчета принято положения уникального Xbal сайта. Вторая линия указывает рестрикционные сайты и локализацию генов и существенных областей плаэмиды: sog (ДНК лраймаза), ехс (поверхностное исключение), nue (нуклеаза), ssb (белок, связывающийся с одноцепочечкой ДНК), imp (УФ-индуцированный мутагенез), eib (синтез колицина ХЪ), imm (иммунность к колицину), oriV (репликация), oriT (начало конъюгационного перелоса), psiB (предотвращение индукции SOS-ответа), Тга (конъюгационный перенос).

Сокращения: сайта EcoRI указаны вертикальными линиями |; s. Sail; X, Xbal.

Ard + плазмидами pED80 и pED199 в системе максиклеток E.coli. Анализ данных, представленных на авторадиограмме (Рис.6) показывает, что Ard+ плаэмиды pED80 и pED199 (треки 2 и 3, соответственно) кодируют белок с молекулярным весом около 22000, который отсутствует в клетках, несущих вектор рЦС19 (трек 1). Отметим, что Ard" плазмиды pED220 и pED605 (Рис.5) не способны экспрессировать этот полипепгид. Причем делеционное производное pED605, полученное путем делетирования фрагмента размером 361 п.н. от PvuII сайта специфицирует синтез более легкого полипептида с молекулярным весом около 20000 (трек 5), в то время как в треке, соответствующем препарату максиклеток с плазмидой pED220 (делеция в 220 н.п. от Rsal сайта) 22 кД белок полностью отсутсвует (трек 4). Одно из возможных объяснений этих результатов состоит в том, что делетирование области ard от Rsal сайта (pED220) инактивирует промотор ard гена, в то время как делеция от PvuII сайта (pED605) удаляет З1 часть ard гена, что приводит к образованию гибридного полипептида более легкого, чем продукт гена arcJ.

w

"Т I

_[—~T-p

25

I Г

Psil

Psil

Sail

PMl Psil

I I

IM I

I

I'M I

ssb

Sall-

Bell Rsal AccI Smal

J—i

-psiB

Bgll PvuII

ard

+ pED220R [> + pED265R £> + pED490R [> - pED535R 0

Шк

966

199

220

265

490

535

760

605

< pEDiSO +

pEDl» +

pED220 -

< pED265 -

< pED490 -

< pED535 -

< pED76(l +

< pED707 -

4 pED605 -

100

4 E>-

\ Colli. wiT

\

\

\

Psil

pvxx

Рис.5. Локализация ard гена плазмиды ColIb-P9 и его 3' части, кодирующей функциональный домен Ard белка.

Верхняя часть рисунка показывает лидерную область плазмиды Collb-Р9. Здесь использованы те же обозначения, что и на Рис.4. Ниже приведена рестриктная карта Sall-Pstl фрагмента плазмиды Со11Ь-Р9 (2,8 т.п.н.), содержащего ard локус и клонированного в вектор PUC19 (плазмида pVK8).Делетирование данного фрагмента от сайта Sali или PvuII (в составе pVK8) проводили с помощью нуклеазы Ва131. Получившиеся укороченные фрагменты были клонированы в PÜC18 и pUC19 в двух разных ориентациях по отношению к lac промотору, что показано на рисунке с помощью треугольников. Концы /короченных фрагментов были определены с помощью сиквенса и их збозначение соответсвует номеру нуклеотида, с которого они чачинаются (см. Рис.б). После трансформации этих рекомбинантных 1лазмид в способный к Eco К рестрикции штамм E.coli АВ1157 индивидуальные трансформанты проверялись на Ard активность в 1рисутствии (>) или в отсутствии (*) IPTC. "+" и "-" обозначают 1аличие или отсутствие Ard активности, соответственно. Больцмя :трелка показывает локализацию и ориентацию кодирующей области ird гена. Заштрихованная часть стрелки обозначает 3'-часть грнп, (одирующую функциональный домен Ard белка.

1 2___3 4__5

67 -

43 - .... .......... ... ....

30

20.1

Ар

А г ti

14.4 •

Рис.б. Белки, экспрессируемые плазмидами, содержащими и не содержащими активный ген ará.

Белки, кодируеные плазмидами, специфически метились нетиошшом в системе максиклеток E.coli (Sanear et al., 1979 ) и анализировались в 15% полиакриламидном геле, содержащем додецил сульфат натрия. Положение радиоактивно меченых белков в геле выявлялось ¿1ьторадиографически. На данном рисунке приведена авторадиограмма белков, кодируемых плазмидами: Трек 1, вектор PUC19; Трек 2, pED80; Трек 3, pED199; Трек 4, pED220; Трек 5, pED605. Черные стрелки (■<) указывают положение продукта нормального и мутантного ard гена и кодируемой векторной плазмидой р-лактамаэы (Ар). Молекулярные веса (в кДа) и положение маркерных белков на электрофореграмме указаны в левой части рисунка.

Определение нуклеотидной последовательности аг<7 гена.

Нуклеотидная последовательность агс! была определена при помощи сиквенса перекрывающихся фрагментов с использованием однонаправленных делеций. При анализе нуклеотидной

последовательности кодирующей нити, представленной на Рис.7, была идентифицирована . только одна достаточно длинная открытая рамка считывания (ОРС) с координатами 212 - 7 27, способная кодировать полипептид с молекулярным весом около 22 кД. Данные,

>' Л-_ . - . . .60

'^АСосттсссслстсспстсАссссстссстссттсссстстсссатсАттттсссстс

■ I-ь.рЕ080. • - 120

СТТСАСССССТСАСАТТТСССССТСТСАСССТССААСГСССаССАССССТСТСССТСАСа

180

СТСССССТТСССТТССССССТСТССАТСССССССТТАТССССССССТТТТАТССАСССАС

р->рЕ0199 . .|—^рЕ0220 240

СССАСС5СССССТСССССАСААСАТСТ5АСТАТССАССАТГССССААТСТСТСТТ6ТТСС -10 ЭБ М Б V V А

Асс! . г->рЕ0265

АССТССТСТАТАССТТССААССТОССАСАААГАСААСТСТССААССАТССССССАСССТС РАУУУ(;ТИНКУЯСС51АСКИ

360

СТТТСАССГСАССАССТТТСАТ<ЗАТСАСССССАСТГТТТСССССССТССССТССТСТТСА ЕОЬТТГОБЕЯОГРААСЕАЬН

.... Бта!

ССАССАТОААССССАТССТСААСТСАТСТТТСАССАТТАТСАСССАТТСССССССААТАТ ООЕАЕРЕЬМРООУЕОГРСЫМ

480

ССССТСТаААТСССАТАТСААСТСССССТСССТТСААСССТТСССССАСССАССССАТСА АЗЕСН1МИАМУЕСГК(2АЕОЕ

.(->рЕ0490 . . . |-3-р_Т535

АСССТСССААСАСССГТАТССТСТСТСССТССАССАТАССССГСАСАСССАТТТТСАСАС ССЕЕАУЕЬИУЕОТСЕТОРОТ

600

СТТСССССАТСССТаСТССССССАСССГСАСАСТСАССАСССТТТГСССОТТСАСТТССС Е И И А N И б ЕАОЭЕЕАРАУЕЕА

-г—1 рЕ0605 .

САСТСАТАССССССГССТСССТСАССТСССССАСАСССТСССССТСТАТТТТСАСТАТСА ЗОТСЬЬА ЭУРЕТУАЬУКОУЕ

рЕ0707 -1 . 720

СйСвТАТССв СССаАТТТАТТССТСвАСТССТТСАССТТТАТТаАСвС': САТСТСГТССО АУАЕ0ЬГЬ03ЕГР10СНУЕК

РЕР760-Ч-|Вд11

ТСССТСАТТТАСТСССССССТССССССССССТАТСОССТСССАССС И *** -» «-

Рис.7. Нуклеотидная последовательность гена агс2 плазмидм Со11Ь-М и предсказанная аминокислотная последовательность белка Агс]. Нумерация нуклеотидов начинается с первого нуклеотнпа п рестриктном сайте ЯгаI, расположенном в 5' напралленпи от гена. Предполагаемые -10 промоторная последовательность а тлнчр последовательность Шайн-Дальгарно (БЭ) подчеркнуты и подписаны. Изогнутые стрелки ( (-»■) указывают концы фрагментов п целетированных плаэмидах.

представленные на Рис.5, показывают, что 5' кон."и , -на arc" д.-.я-м ч быть локализован между нуклеотицами 200 и 221. На ,основании аг,:, данных, было идентифицировано два потенциальных инициирующих кодона ATG (позиции 212 и 227). Однако только ATG кодон с координатой 2 27 имеет перед собой типичный сайт связывания рибосом, последовательность Shine-Dalgarno 5'-GGAGG (Shine and Dalgarno, 1974). Расстояние между 3' концом этой последовательности и первым нуклеотидом инициирующего кодона составляет 7 нуклеотидов, что типично для сайтов связывания рибосом у Е.coli (Stormo et al., 1982). Таким образом, ОРС начинается от ATG кодона с координатой 2 27 и терминируется через 498 нуклеотидов стоп-кодоном TGA с координатой 72Ь. Эта ОРС способна кодировать полипептид, содержащий 166 аминокислот, с расчетным молекулярным весом 19193. Хотя в наших опытах подвижность Ard белка в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия соответствует молекулярному весу 22000, приведенные выше данные однозначно указывают на то, что эта ОРС кодирует ard ген. Отметим, что нам не ясны причины некоторого расхождения между расчетным молекулярным весом Ard белка и его молекулярным весом, определенным на основании электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Однако это расхождение не настолько велико, чтобы можно было говорить об аномальной электрофоретической подвижности Ard белка.

Анализ нуклеотидной последовательности, предшествующей структурной части гена ard, в плазмиде pED199 (Рис.7), содержащей активный ard ген, показал, что гексамер (дАасАТ) с координатами 20л- 20 5, имеющий некоторое сходство с консенсусной -10 последовательностью ТАТААТ (показано большими буквами) может быть частью промотора гена ard и играть роль -10 сайта. Однако мы не обнаружили на соответствующем расстоянии (15-20 нуклеотидов) от предполагаемого -10 сайта последовательность, похожую на -35 саит, что может свидетельствовать в пользу участия в инициации транскрипции белка-активатора.

Доь„умтольстг.о. что Ard белок содержит функциональный домен.

Мы обнаружили, что делеция 13 кодонов с 51 конца ard гена в г.л.1 змиде pED265R, в которой оставоаяся часть гена ard находится в •t:iMKC с «репрессированным геном lacZ' вектора pUC18, не

подавляет способность к экспрессии Ard функции (Рис.5). Этот результат предполагает, что только часть Ard белка необходима для осуществления антирестрикционной функции. Для того чтобы проверить это предположение мы получили серию делений ard гена с 5'-конца при помощи Ва131 нуклеазы. Часть гена, оставшуюся после обработки нуклеазой, сшивали при помощи ДНК-лигазы с 5'-частью гена lacZ4, кодируемой вектором pUC19. Ka Рис.5 приведены делеционные конструкции pED490R и pED535R, б которых 3'-часть гена ard находится в рамке с дерепрессированным геном 1¿ícZ' . Как-видим, делеция в 535 п.н. (pED535R) инактивирует Ard функцию, в то время как делетирование 490 п.н. (pED490R) не оказывает заметного ингибируюиего Ard активность действия, эти результаты, по-видимому, означают, что в области между 490 и 535 нуклеотидами находится область гена, кодирующая границу антирестрикционного домена Ard белка. Все полученные нами делеции 3'- конца гена ard и приведенные на Рис.5. полностью подавляют Ard активность. Таким образом, полученные нами результаты показывают, что Ard белок содержит С-концевой функциональный домен.

Анализ_нуклеотидных и соответствующих_аминокислотных

последовательностей генов ard и ardA.

Компьютерный анализ (программа FASTA) нуклеотидных и соответствующих (транслированных) аминокислотных последовательностей генов Collb ard и pKMIOl arcfA против базы данных GenBank и Ewirs-Prot не обнаружил существенных гомологии. В то же время ерлик^ние

pKMIOl Collb pKMIOl Collb pKMIOl Collb Рис.8.

последовательностей белков ArdA (pKHIOl) и Ard (Collb-I 9) . -

точки показывают идентичные аминокислоты. Точки показывлот п хог,::-аминокислоты (в однобуквенном коде: A,S и Т; D и Е; N ¡i О; р и }'; I, Ь, М и V; F, Y и W). области, идентичные с белком 0.3 tVtfti-i"/■. Т7 выделены двойной печатью и обведены.

mtdittpsvyvgtyhkyncgsiagawldltdfdsseefyercrelhaueadpefkfqdke

mswa-pavyvgtwhkyncgsiagrwfdlttfdderdffaacralt'QDEADPELHFQDYE

gipsd'mase'chxkwdfingfkqareegneaafvafvdlfnstdfdlfrdaykgeakdeet gfpgnmaseLhinwawvegfrqardegceeayrlwvedtgetdfdtfrdawv:geadski;a faeeylndsgIíl'neipe'svaryfdivayardlfigdfslhdghvfkmtc

favefasdtglladvp£tvalyfdyeayardlfldsftfidghvfrp. - ] f: •. Сравнительный анализ предсказанных ¿t.-.i'Ho: i'

аминокислотных последовательностей белков Collb Ard и pKMIOl ArdA показало, что они гомологичны и имеют около 60% идентичных аминокислот (Рис.8). Оба белка обладают большим избытком отрицательно заряженных аминокислот (аспарагиновая кислота + глутаминовая кислота; в однобуквеннок коде D и Е): 25 и 27 для Collb и pKMIOl, соответственно, что свидетельствует об отрицательном суммарном заряде Ard белков.

Специфичность действия Ard и ArdA функций на системы рестрикции I типа у E.coli.

В таблице 1 представлены данные о действии ArdA и Ard функций на различные системы рестрикции в клетках E.coli. Как в>-.дим, обе антирестрикционные функции эффективно ингибируют все пять систем рестрикции I типа (ЕсоА, ЕсоВ, EcoD, ЕсоК и £coR124) и не оказывает заметного влияния на систему рестрикции III типа (ícoPl), а также 5-метилцитоэин специфичные системы МсгА и МсгВС.

Единственное отличие между антирестрикционными функциями, кодируемыми Collb ard и pKMIOl ardA, заключается в том, что pKMIOl ArdA слабо ингибирует рестрикцию II типа (ЕсоШ) , в то время как для Collb Ard такая активность не обнаружена.

Действие ard генов на ЕсоК модификации (ЕсоК-специфическое метилирование).

Можно предположить, что антирестрикционное действие ard генов может бить обусловлено тем, что Ard белки каким-то образом стимулируют модификационную активность (специфическое

метилирование ДНК в сайте узнавания ЕсоК) систем рестрикции I типа подобно Ral функции бактериофага лямбда. Для проверки этого предположения мы изучили влияние функций, кодируемых генами ColIb-P9 ard и pKMIOl ardA, на модификацию немодифицированного фага \.О в процессе одного цикла развития в бактериях E.coli

В этой серии опытов в качестве тестового фага использовали x.vir.O. Данные, представленные в Таблице 2, показывает, что в штамме г^т^"*" немодифицированный фаг А.О модифицируется с эффективностью близкой к 100%. Однако ЕсоК модификация немодифицированного фага А.О в клетках E.coli К-12 сильно инглбируется в присутствии плазмид pED80 и рАВ7, кодирующих Collb Ard и pKMIOl ArdA, .соответственно. Этот результат указывает >ч то, что функции Ard и ArdA способны блокировать не только

¡'лблиц.1.1. Действие ardA гена плазмиды pKMIOl и ard гена плазмиды Со11Ь-Р9 на различные системы рестрикции E.coli.

Система рестрикции3 (тип )

Эффективность посева тестового фага на штаммах

Алтирест-

рикционная^

активность"

Антирест-

рикциопный

фенотип

не содержащих плазмиду содержащих pAB7 (ardA) содержащих pED80 (ard) ДЛЯ (ardA) для (ard) ДЛЯ ArdA для Ard

ЕсоА (Ib) 4х10~3 1.0 1.0 250 250 + +

Eco В (Ia) 2х10-4 1.0 1.0 5,000 5, , 000 + +

EcoD (Ia) 2х10~4 5xl0_1 5x10" 1 2,500 2, , 500 + +

ЕсоК (Ia) 1х10~4 1.0 1.0 10,000 10, ,000 + +

•ECOR124 (Ic) 4х10~4 1.0 1.0 2,500 2, , 500 + -r

EcoRI (II) lxlO-4 lxlO-2 1x10" •4 100 1 +- -

Eco PI (III) 5xlO"5 5xl0~5 5x10" 5 1 1 - -

McrA lxlO-1 lxlO-1 1x10" 1 1 1 - _

McrBC lxlO-1 lxlO-1 1x10" ■1 1. 1 - -

Были использованы следующие рестрицирующие штаммы: ЕсоА, WA2377Î EcoВ, НВ129; EcoD, BZ216; ЕсоК, АВ1157; £coR124, ВАТ3 57; EcoRI, BA5Q9; EcoPI, BA532; McrA and McrB, АБ1157. Так как штаммы ВА509, ВА532 и ВА2357 содержат две системы рестрикции мы использовали тестовый фаг А.К для того, чтобы он подвергался воздействию только £coRI, EcoPl или £coR12 4 систем рестрикции, соответственно. Для исследования МсгА и МсгВС рестрикции были использованы тестовые фаги х.К, метилированные с помощью М.ЯраИ или M.AZuI метилазы, соответственно. В остальных случаях был использован тестовый фаг Л.О.

Антирестрикционная активность определялась как величина отношения эффективности посева немодифицированного тестового фага на штамма, содержащем плазмиду рАВ7(агс?А+) или pED80(ard+) к эффективности посева на этом же штамме, не содержащем плазмиду (или содержащем либо ArdA- плазмиду рАВ8, либо Ard" плазмиду pED220). В опытах по изучению действия гена ardA все исследованные штаммы содержали совместимую плазиду pOR80(ardK+).

рестрикционную, но и модификационную активность системы рестрикции и модификации ЕсоК.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Плазмиды_Со11Ь-Р9 и РКМ101 колируют_гомологичные

антирестрикционные белки.

В настоящей работе мы показали, что две неродственные

плазмиды Со11Ь-Р9 и рКИ101 (1пс1 и 1псЫ групп, соответственно)

Таблица 2. Действие ardA гена плазмиды pKMIOl и ard гена плазииди Со1ХЬ-Р9 на эффективность EcoК модификации.

Штамм ' ard эффективность Эффект

(плазмида) ЕсоК- подавнения

модификации ЕсоК-

тестового фага модификации

ВА556

ВА556(рАВ7) - ardA+

ВА556(рАВ8) ardА"

BA556(pED80) ard+ ВА556(pED220) ard"

1.0 1 x 10~4 1.0 1 X 10~4 1.0

Эффективность £соК-модификации (специфического

метилирования) потомства немодифицированного фага определяли при размножении фага в течение одного цикла в штаммах rK~mK+. Для этого бактерии растили до титра 2 х 10 кл/мл и концентрировали до 1 х 10 кл/нл в ТМ-буфере. Немодифицированные фаги л.О адсорбировали при множественности инфекции 0,01 в течение 20 минут при +37°С. Инфицированные клетки разводили в 1000 раз в теплой LB-среде и инкубировали при +37 С в течение 2 часов. Эффективность ЕсоК-кодификации полученного потомства фагов определяли как отношение титра фага на способном к ЕсоК рестрикции итамме АВ1157 к тигру фага на безрестрикционнои штамме ВА556.

кодирует функционально схожие антирестрикционные функции. Соответствующие гены ard и ardA локализованы в лидерных областях плаэнид, то есть в непосредственной близости от oriT локуса, который первым входит в клетку-реципиент при конъюгации. Расстояние до oriT локуса для генов Collb ard и pKMIOl ardA составляет 4,5 и 4 т.п.н., соответственно. Анализ нуклеотидных последовательностей структурных частей обоих ard генов показал, что они могут кодировать гомологичные белки с молекулярным весом около 19000. Эти белки были идентифицированы нами в макси-клетках E.coli.

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белков Ard и ArdA, полученных на основании нуклеотидных последовательностей генов Collbard и pKMloiardA, показал, что Ard белки, кодируемые плазмидаии Collb и pKMIOl, гомологичны и имеют

i.....• ■■ v riviunK «эчииокислог (Рис.8). Белки Collb Ara и

¡ 'u'-iA iiit'iDf также близкие расчетные молекулярные веса:

19193 и 19427, соответственно. Длины полипептидных цепей также различаются незначительно: 166 аминокислот для Collb Ard и 169 аминокислот для pKMIOl Ardñ. Отметим, что компьютерный анализ (программа FASTA) нуклеотидных и соответствующих

(транслированных) аминокислотных последовательностей генов Collb ard и pKMIOl ardA против базы данных GenBank и Cwiss-Prot не обнаружил существенных гомологий.

Отличительной особенностью плазмидных Ard белков является их кислотный характер, обусловленный большим избытком отрицательно заряженных аминокислот (Asp и Glu). Для Collb Ard и pKMIOl ArdA он составляет 25 и 27, соответственно, и свидетельствует об отрицательном суммарном заряде Ard белков.

Отметим, что делеционный анализ" гена Collb ard показал, что для антирестрикционной активности белка достаточно его С-концевой половины (Рис.5). Эти результаты указывают на существование с-концеЕого функционального домена Ard белка. В этом случае отстается неясным функциональное значение и-концевой части Ard белка, которая, как показывает сравнительный анализ двух Ard белков, достаточно консервативна.

Сравнительный анализ функций, осуществляемых in vivo Ard белками, выявил их значительное сходство. Нами показано, что обе Ard функции специфически подавляют как рестрикционную, так и модифицирующую (специфическое метилирование) активности систем рестрикции-модификации I типа всех трех семейств (la, Ib и 1с). В то же время другие известные в настоящее врег.я системы рестрикции практически нечувствительны к действию Ard функций. Так например, обе Ard функции не оказывают сколько-нибудь заметного действия на систему рестрикции III типа, кодируемую бактериофагом PI (JEcoPl). Они также не ингибируют 5-иетилцитозин специфичные системы рестрикции МсгА и МсгВС (Табл.1). Единственное отличие между антирестрикционными функциями Collb Ard и pKMIOl ArdA, заключается в том, что pKMIOl ArdA слабо ингкбирует рестрикции II типа (EcoRI), в то время как для Collb Ard такая активность нами не обнаружена. Возможно, что способность pKMIOl ArdA белка взаимодействовать с системами рестрикции II типа может дать ей дополнительное преимущество в преодолении рестрикционного барьера клетки.

Возможные механизмы действия антирестрикционных Ard белков.

Логично предположить, что антирестрикционное д.-пстеи-í Ara белков, может быть результатом по крайней мере двух процессов: 1. Ard белок может непосредственно взаимодействовать с-мультифункциональным комплексом рестрикции-модификации; 2. Ard белок может конкурировать с системой рестрикции-модификации в области ее специфического связывания с ДНК.

Связывание Ard белка с ДНК кажется маловероятным из-за его значительного общего отрицательного заряда. Поэтому вторая возможность, основанная на специфическом связывании Ard белка ДНК, также кажется нам маловероятной. С другой стороны, высокая плотность отрицательных зарядов Ard белка предполагает, что Ard может действовать как полианион, который, связываясь с ДНК-связывающимся центром системы рестрикции-модификации, может воспрепятстбовать взаимодействию системы с ДНК и тем самым ингибировать обе ее функции - рестрикцию и модификацию ДНК.

Сходный механизм антирестрикционного действия был предложен ранее для отрицательно заряженного антирестрикционного белка, кодируемого 0.3 геном бактериофага Т7 (Bandyopadhyay et al., 1985). Этот фаговый белок специфически ингибирует систему рестрикции-кодификации I типа у E.coli путем специфического связывания с системой рестрикции-модификации клетки-хозяина и, таким образом, может служить моделью для плаэмидных антирестрикционных белков Ard. Компьютерный сравнительный анализ аминокислотных последовательностей антирестрикционного белка фага Т7 и плаэмидных Ard белков не обнаружил протяженной гомологии между ними, но выявил два небольших участка гомологии в 4 и 9 аминокислот, соответственно. Можно предположить, что эти участки, общие для всех трех антирестрикционных белков, играют существенную роль во взаимодействии (возможно, в связывании) антирестрикционных белков с системами рестрикции-модификации, кодируемыми клеткой-хозяином.

Интересно отметить, что помимо участков гомологии плаэмидные и фаговый антирестрикционные белки имеют еще несколько общих функциональных черт. Во-первых, все три антирестрикционные белка кодируются генами, локализованными в лидерных областях плаэмидных и фаговых геномов. Эти области первыми входят в клетку-реципиент в процессе коньюгации или инфекции и тем самым способны с-осспсчить синтез антирестрикционных белков сразу же после начала

транспорта ДНК в клетку. Понятно, что такое "географическое полох-ение" антирестрикционных генов может увеличить их функциональную эффективность. с другой сторона, все три антирестрикционных белка способны специфически подавлять как рестрикционную, так и модифицирующую активности систем рестрикции-модификации I типа у В.coli и не эффективны или оказывают слабое действие в отношении систем рестрикции II типа. Следует отметить, что ингибирующий эффект Ard белков на кодифицирующую активность систем рестрикции X типа указывает на то, что они функционально отличаются от Ral белка бактериофага лямбда, который, в отличие от Ard и 0.3 белков, действует посредством стимуляции специфической модификации, а не через подавление рестрикционной активности.

ВЫВОДЫ "

1. Определена нуклеогидная последовательность генов ar<JA и ard, кодирующих антирестрикционные функции генетически отдаленных конъюгативных ллазкид pKHIOl и Со11-Р9.

2. Идентифицированы продукты генов ardА и ard, антирестрикционные ' белки ArdA и Ard, соответственно, в системе максиклеток E.coli.

3. При помощи анализа нуклеотидных и соответствующих аминокислотных последовательностей ard генов показано, что антирестрикционные белки ArdA и Ard имеют высокую гомологию (около 60%) и содержат большой избыток отрицательно заряженных аминокислот.

4. Показана высокая специфичность действия in vivo плазмидных антирестрикционных Ard белков в отношении систем рестрикции-модификации I типа E.coli.

5. Показано, что плазмидные Ard белки способны эффективно ингибировать как рестрикционную, так и кодификационную активности систем X типа в клетках E.coli.

6. При помощи анализа антирестрикционной активности гибридных LacZ-Ard белков локализован функциональный, "антирестрикционный" домен Ard белка.

7. На основе анализа аминокислотных последовательностей плазмидных Ard белков и их фукциональных особенностей предложен механизм действия Ard белков на системы рестрикции-модификации I типа бактерий в процессе хонъюгационного переноса плазкид.

Список публикаций по теме диссертации.

1. Delver Е. P., V. U. Kotova,.G. В. Zavilgelsky, and А. А. Belogurov. Nucleotide sequence of the gene {art}) encoding the antirestriction protein of plasiaid ColIb-P9.// J. Bacteriol. 1991. - V.173. - P.5887-5892.

2. Belogurov A. A., E. P. Delver, and О. V. Rodzevich. IncN plasmid pKMloi and Incll plasmid ColIb~P9, encode homologous antirestriction proteins in their leading regions.// J. Bacteriol. 1992. - V.174. - P.5079-5085.

3. Belogurov A. A., E. P. Dslver, and 0. V. Rodzevich. Two types of antirestriction functions encoded by self-transmissible plasmids.// Abstracts of 93rd General Meeting of American Society for Microbiology. American Society for Microbiology, Washington D.C. 1993. - P.230.