Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение природных плазмид BACILLUS SUBTILIS

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение природных плазмид BACILLUS SUBTILIS"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ им. Н.И. ВАВИЛОВА

: . од---:--

I .¡спг На правах рукописи

о ¿Лги] и^З

УДК 579.252.58

КАНАШНА Асият Шарапудиновна ИЗУЧЕНИЕ ПРИРОДНЫХ Ш1АЗМИД

03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой.степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1995

Работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизма Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ -

доктор биологических наук, профессор A.A. Прозоров кандидат биологических наук В.З. Незаметдинова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор И.А. Хмель кандидат биологических наук Е.А. Огаркова

ВЩЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ - кафедра генетики биологическог факультета Московского государственного университета им. М.В Ломоносова

Защита диссертации состоится "_"____ 199_ г.

в _ час. __ мин. на заседании специализированного ученог

совета Д002.49.01 при Институте общей генетики им. Н.И. Вавилов РАН по адресу: Москва, В-333, ул. Губкина,3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОГен РАН.

Автореферат разослан "

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

199 . г.

Т.Н. Полухин;

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы„ Bacillus subtilis - генетически хорошо изученная непатогенная почвенная бактерия, удобная при использовании ее в качестве хозяина при клонировании чужеродной ДНК, и других генно-инженерных манипуляциях. Она способна расти при относительно высоких температурах, как на богатых, так и на бедных питательных средах. Кроме того, в. subtilis способна сек-ретировать белки в среду, что обеспечило широкое применение этого микроорганизма в биотехнологии.

Однако, в системе для клонирования ДНК помимо клетки-хозяина необходим второй компонент - удобный стабильный вектор. При клонировании в клетках бацилл до настоящего момента чаще всего использовали векторы, созданные на основе стафиллококковых плазмид (Ehrlich, 1977; Ehrlich et al., 1982; Gryczan et al., 1978). Они обладают широким спектром достоинств, необходимых векторам, но их существенным недостатком оказалась их нестабильность в системе В.subtilis, как структурная, так и сегрегационная (Ehrlich et al., 1986).

Использование в качестве векторов природных бактериальных плазмид позволяет избежать подобных трудностей, так как данные плазмиды, как правило, стабильны из-за эволюционно сформировавшихся максимально эффективных адаптационных взаимоотношений с функциональными системами клетки-хозяина.

Большинство природных бациллярных плазмид оказалось критическими, вследствие чего их биология и взаимоотношения с хромосомной ДНК хозяина оставались до сих пор слабо изученными. Поэтому интерес к изучению биологии природных бациллярных плазмид снова растет. По мнению ряда исследователей, они являются перспективным исходным материалом для создания на их основе подходящих высокостабильных векторов для клонирования в системе в. subtilis.

Цель работы. Целью данной работы было изучение распространенности критических плазмид среди большого количества штаммов в.subtilis - изолятов из почв Москвы и Московской области; выяснение некоторых особенностей репликации этих критических плазмид, и выявление возможности взаимодействия ДНК данных плазмид с хромосомной ДНК клетки-хозяина.

Задачи исследования. В задачи исследования входило обнаружение и определение характеристик природных плазмид в почвенных

I

штаммах, близких или идентичных B.subtilis 168; изучение некоторых особенностей репликации (тип репликации, характеристика после довагельносги ДНК мини-решшкона) одной из обнаруженных плаз-шд; выяснение возможности взаимодействия ДНК природной плазмиды с хромосомной ДНК Bacillus subtilis.

Научная новизна. Охарактеризована популяция природных плаз-мид почвенных штаммов Bacillus subtilis. Установлен тип репликации и охарактеризована последовательность участков ДНК мини-репликона типичной криптической бациллярной плазмиды р1414. Выдвинуто предположение о функционировании Rep-белка плазмид, реплицирующихся по о-типу, в качестве мембранного якоря. Показана возможность взаимодействия ДНК природной плазмиды с хромосомной ДНК хозяина. Установлено наличие "молчащей" копии ривпо в хромосоме лабораторного и почвенного штаммов Bacillus subtilis.

Практическая ценность. Полученные маркированные производные криптической бациллярной плазмиды могут быть использованы в качестве векторов для клонирования ДНК в системе B.subtilis, что может быть существенно для биотехнологии, полученные оригинальные данные о взаимодействии криптических бациллярных плазмид с хромосомной ДНК клетки-хозяина существенно меняют взгляды на биологию плазмид и в частности позволяют по новому объяснить причины стабильного поддержания их в клетке. Факты наличия в хромосоме бацилл встроенных плазмид требуют корректировки методов и подходов при использовании этих микроорганизмов в качестве хозяина и в лабораторных исследованиях, и в промышленном производстве. •

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на 11~оя Европейской конференции по генетической трансформации (Будапешт, ГЗ92), на 6~ом генетическом с'езде (Минск, 1ЭЭ2), на межлабораторном семинаре " Молекулярные и клеточные основы генетических процессов", МОГен, РАН (1995).

Об'ем работы. Диссертационная работа включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов, изложение результатов и их. обсуждение, заключение, выводы и список-цитируемой литературы. Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста,..содержит 3 таблицы и 24 рисунка в приложении. Список литературы включает 184 наименования.

МАТЕРИМЫ И МЕТОДЫ.

Штаммы бактерий и плазмиды. Б работе били использованы следующие штаммы Bacillus subtilis: 22 штамма из коллекции почвенных штаммов Bacillus subtilis, выделенных Ю.Е. Козловским (лаб. музей); Rub834, полученный от Н. Суеоки (Еулдер, США к BD224, (B.G.S.C., США); SB202 (рС194), (В.G.G.С., США), ß работе были использованы следующие штаммы е.coli: НВ101 (лаб. музей); XL1-blue (лаб. музей). Использовались плазмиды: ривно, рС194, рЕ194, pSA.0^01 , pBC1b, pT181, pLS12, pBN2Y, pBD64, pUC19, рЗ (Лаб. музей), pBluescript Ii KS - получена от Ксензенко В.Н. (МБФМ, РАН, Пущино), фаг М13 шр9 (лаб-. музей).

Среды и реактивы. Для выращивания бактериальных культур использовали мясо-пептонный бульон (МПБ), среду Lß (Маниатис и др., 1984) и минимальную среду Спицайзена (Spiaisen, 195В). Соответствующие твердые среды содержали 1,5% агара. В твердые селективные среды добавляли антибиотики в следующих, концентрациях: хло-рамфеникол - Б мкг/мл для в.subtilis и 20 мкг/мл для E.coli, ампициллин - 50 мкг/мл, тетрациклин - 15 -.-.кг/мл, канамицин - 20 мкг/мл. В работе использовали рестрикций!;ные эндонуклеазы фирмы "Beehringer Mannheim" (ФРГ) и НПО "Фермент" (Вильнюс, СССР); ДНК.— полимеразу I (фрагмент Кленова), si-нуклеазу, ДНК-лигззу фага Т4 фирмы "Boehringer Mannheim" (ФРГ), а также различные отечествен-ние и импортные реактивы.

Трансформацию клеток E.coli проводили по методу Кушнера (Маниатис и др., 1984)'. Трансформацию компетентных клеток в.subtilis проводили по модифицированному методу Анагностопулоса и Спйцзйзе-нз, принятому в нашей лаборатории (Прозоров, 1980).

Получение препаратов ДНК. Хромосомную ДИК В.subtilis получали в соответствии с методической разработкой емво. Плазмидную ДНК из клеток в.subtilis получали методом щелочной денатурации Вирн-бойма и Доли iBimboim. Doly, 1979). Плазмидную ДНК из клеток E.coli получали тем ке методом или методом кипячения (Holmes, Quigley, 1981). ДНК очищали в градиенте плотности хлористого цезия. Препараты плазмидной ДНК для обнаружения зв-формы получали по методу те Риле (te Riele et al., 198b).

Рестрикцию, обработку ДНК-полимеразой 1. лнплровзнда, обработку si-нуклеазой и радиоактивное мечеиие ДПК ор-лод&ли по общепринятым методикам (Маниатис и др.. 1984; мвтод-лепчзя разработка фирмы "Amersham").

Электрофорез ДНК проводили в агарозных и акриламидшх гелях в трис-боратном буфере (Маниатис и др., 1984).

Блоттинг-гибридизация. Перенос ДНК на нитроцеллюлозные фильтры' осуществляли по методу Саузерна (Маниатис и др.,1984). Гибридизацию ДНК с меченой пробой проводили по общепринятой методике в полиэтиленовых пакетах (Мэниатис и др., 1984).

Секвенирование последовательности ДНК выполняли по методу Сэнджера (Sanger et al., 1977) при активной помощи Ксензенко В.Н. (Пущино, МБФМ РАН).

Компьютерный анализ секвенированных последовательностей проводили с использованием программ GENEBEE (Бродский и др., 1991), BLAST (Altshul et al., 1990) и банков данных' SWISSFROT, ЕМВЬ, Brooklxav&n при активной помощи Канапина А.А. (Пущино, ШК РАН).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Природные плазмид» почвенных штаммов в.subtilis.

Для проведения исследований била использована коллекция почвенных штаммов бацилл, типированшх как B.subtilis, выделенных в лаборатории генетики микроорганизмов ИОГо'н РАН Ю.Е. Козловским. Мы использовали произвольно выбранные из коллекции 32 штамма, выделенных из II различных проб почвы. В "клетках ZI штамма была обнаружена шшмидная ДНК. Молекулярная масса большинства плазмид варьировала в пределах от 3 до 3 М4 (5-12 kb). В штаммах 1878 и 1553, наряду с легкими, присутствовало по одной тяжелой плазмиде (около 30 kb).

Нас интересовало, насколько обнаруженные олазмидц были родственны друг другу, и чем отличались..Мы провели опыты по блотт-гибридазации препаратов ДНК из изучаемых штаммов с ДНК' плазмиды р1414 (В kb, 8-10 копий на хромосомный'эквивалент), выделенной из штамма 1414. Dee мелкие пдазмиды гибридизовались с ДНК плэомиды• зонда. Только тяжс-'лые плазмиды из штаммов Í873 и Í553 не гибрида-зовались с рГ414. В опытах по блотт-гибридизации препаратов ДНК из плазмидсодержащих штаммов с фрагментом pI4Í4, несущим структуры минирешшкона(см. низке), гибридизационные сигналы выявились не на Есех треках: плазмиды из штаммов' 115. 865 и 1385 практически не гибридизовались с зондом в данных условиях. Равными по интенсивности были сигналы на треках с ДНК штаммов 1414, 1668 и 1801. На остальных же треках интенсивность сигналов варьировала

4

от уровня неспецифического связывания до близкого к максимуму. Полученные данные указывают на высокую степень родства мелких плазмид, выделенных из почвенных штаммов B.subtilis.

Плэзмида pi414 не гибридизовалась с рядом известных плазмид стафилококков, стрептококков и бацилл: рС194, рЕ194, рТ181, рТ127, pUBi1 о, pLSi, pBci6. В то же время выявилось родство между р1414 и плазмидами pBN27 и pis12 - критическими плазмидами B.natto (Ким,: 1989.) и B.subtilis (Tanaka et al., 1977) соответственно. Аналогичные результаты получены в гибридизации ДНК с использованием в качестве зонда фрагмента р1414, несущего миниреп-ликон данной плазмиды.

Учитывая жесткие условия проведения гибридизации и отмывки фильтров, можно говорить о существовании протяженных участков гомологичной ДНК на критических плйзмидах' штаммов" B.subtilis, выделенных в различных географических регионах (Москва, Киев, Япония).

2. Критическая'плэзмида р1414.~

В ряде работ отмечено, что природные бациллярные (как правило. критические) плазмиды, в отличие от стафилококковых, обладают высокой структурной и сегрегационной стабильностью. Высказывались различные предположения относительно причин такой стабиль-кости, в том числе особенности репликации этих плазмид. Чтобы ответить на некоторые вопросы, касающиеся репликативных особенностей бациллярных плазмид, ми решили более детально изучить свойства одной из выделенных нами критических плазмид - плазмиды р1414.

2.1. Рестриктная карта рГ414, ее когшйность и стабильность.

Mu проверили наличие сайтов рестрикции на плазмиде р1414 для II эндоиуклеаз. Из них лишь рестриктазз Clal не имела сайтов узнавания на р1414. Была построена подробная рестриктная карта изучаемой плазмиды (рис.1). Молекулярный вес плазмиды р1414 составляет примерно г>д m.j. По сумме рестршстных фрагментов, размер плазмиды составляет а к.ъ. Уникальными на плазмиде являются сайты рестрикции BamHI, PvuII, Salí, Kpnl.

Для дальнейшей работы плэзмида р1414 была маркирована. Для маркирования мы использовали фрагмент плазмиды рС194 (1066 п.о.) с геном cat, обеспечивающим устойчивости к хлорамфениколу (Hori-aouohi, Weisblum, 1982). Этот фрагмент ранее был клонирован по сайту sail в векторе puctg. По этому же сайту его встраивали в

плазмвду р14-14. Полученная Cmrl плазмида была названа pVAi4 (9,1 kb) (рис.1).

а)

Ир Hp На н Pv Ва Hp В К Н Е На Н На , И Ь', В |P¡f Н Б Н i Р S К

V

fif И D ti I Г Ö л.

р1 414 рУА1 4

б) Hp Hp На

К Н fí На Н На i Н Е1 Б i Р

Hp Hp fí .El

3VA22

p V A2 b

Fkc. 1 а) Рестрикцпонная карта плазмида р1414 u ее производной pVAi4• б) Делеционные прок.водные плазмида р1414 -pVA22 И pVA2b..B-EooRl, K-Kpnl, H-Híndll i., Ha-Haelll, В- Bell, P-Fstl, I'v-i'vuli., Ba-BamHl, S-Sall, Нр-Н:>а1Г, - ДНК плазмида

pi 414, W$?í - фрагмент с геном oat (из р.; 194).

На модели pVAi4 мы определили копийность и изучали стабильность исходной нлззмиды. Коикйность определяли но методу . Прсяна (Pregan et al., 1983). Изучаемая плазмида была представлена в клетке в.количестве 8-10 копий в пересчете на хромосомный эквивалент, что является характерным для малскопийных плазмид, к которым откосится большинство криптических бациллярных плазмид. Для определения уровня стабильности изучаемой плазмида, штамм RUB834,содержащий pVAi4; выращивали, в неселективных условиях i без добавления хлора»ф} никола) в течение 110 генераций. При зтом плазмида сохранялась у 10'.']% клеток популяции. Кроме того, было показано, что плазмида, выделенные из клонов после 85 генераций, не имеют обнаруживаемых на электрофореграмме делеций или вставок. За этот же период контрольная плазмида pBDb4 (0mR) (Gryezan et al., 1980) стафилококкового происхождения, из клеток того же бациллярного штамма терялась полностью. Можно утверждать, что плазмида pVAi4 (а следовательно и р1414) крайне стабильна как в структурном, так и в сегрегационном отношении.

G

2.2. Определение типа репликации р!414.

Большинство мелких плазмид грамположительных бактерий реплицируются по a-типу. Мы предположили, что как и ряд уже изученных криптических плазмид В. subtlis, таких как рВАА1 (Devine et al., 1989), рТАЮбО (Haima et al., 1990), плазмида pI4I4 может реплицироваться по механизму "катящегося кольца".

Основным признаком этого механизма репликации является наличие ss-формы плазмидной ДНК в клеточных лизатах. Мы исследовали клеточные лизаты штаммов 1414 (р1414) и Rub834 (рУА14) на присутствие ss-формы плазмидной ДНК. Лизаты получали и очищали по методу Риле. Каждую пробу делили пополам и одну часть обрабатывали Si-нуклеазой, специфически разрушающей ss-ДНК. Затем препараты были разделены посредством электрофореза; ДНК переносили на

ор

фильтр и гибридизовали с ДНК pVAi4, меченной Р. В качестве контрольного штамма мы использовали штамм в. subtilis SB202, несущий плазмиду рС194. Нам не удалось в обычных условиях (без дополнительной обработки клеток) обнаружить ss-ДНК при репликации плазмид р1414 и pVAi4 (рис.2). Однако, после обработки клеток ри-фампицином в высокой концентрации (100 мкг/мл), фракции ss-ДНК были выявлены (рис.2), что свидетельствует о a-типе репликации данных плазмид, а также о зависимости функции ori(-) от активности РНК-полимеразы хозяина. Причем ori(-) данной плазмида, по-видимому, относится к разряду "сильных" (эффективность достройки ss-ДНК до ds-формы очень высокая).

2.3. Картирование районов, ответственных за репликацию плазмида р!414.

К репликацгонно значимым районам зз+-плазмид можно отнести области мини-репликона, включающего ori(+)-последовательность и ген йер-белка, и ori(-)-последовательность.

Известно, что делеция огК-)-последовательности приводит к усиленному накоплению ss-формы плазмидной ДНК. Мы получили деле-ционое производное р14Г4 - плазмиду pVA22 (рис.1), в которой фрагмент плазмида рГ414 Pstl-Kpnl с размером в 5,3 kb был лигирован с фрагментом плазмида рЗ, несущим cat-ген. Проверка pVA22 на образование ss-формы ДНК, в отличие от р1414 и рУА14 сразу дала положительный результат: ss-ДНК была обнаружена в лизатах клеток без их дополнительной обработки (рис.2)г- Этот факт указывает на отсутствие последовательности ori(-) или нарушение ее функций в

а) 0)

1 2 3 4 5 6 7 8 I 2 3 4 Б 6 7 _3 9 10

Рис.2 Накопление однонитевой ДНК : репликации плазмида р1414 и ее производных, а) пробы, не осоаботанные рифампицином; б) пробы, обработанные рифампицином. 1-V>;194; 2-рсч94, обработанная si-нуклеазой; 3-pVfV!4; 4-pVAi4^" -нуклеаза; 5-р1414; 6-PI414+S1-нуклеаза; 7-pVA22; 8-pVA22+si-нуклеаза; контроля: 9-pI4I4; 10—рС1Э4; —--указана ss-форма ДНК.

плазмиде pVA22. Следовательно, эта последовательность полностью или частично лежит нэ фрагменте Pstr-Kpnl (2,7 kb) плазмиды р1414.

Как мы установили, плазмида р!414 принадлежит к обширному классу аз+-плззмид, для автономной репликации которых необходимо и достаточно наличие op-i(+ (-последовательности ..и прилежащего к ней гена к&р-белка. Размеры фрагмента, на котором располагается вся необходимая для репликации информация, колеблются от 1,0 kb (fie Rossi et al., 199Я ДО 2kb (Нага et al., 1991).

Для картирования мини-репликона изучаемой плазмиды мы использовали метод "об*здания" ДНК экзонуклеазой Вагя. ДНК р!414 обрабатывали рестриктазой Kpnl. Затем аликвоты этой ДНК последовательно обрабатывали экзонуклеазой Ва131 (на протяжении разшх временных интервалов) и фрагментом Кленоьа. Полученные фрагменты лигировали с cat-геном, выделенным из плазмиды рЗ. Лигированной смесью трансформировали компетентные клемш штамма в. subtilis RUB834. В одном из немногочисленных трансформантов была обнаруже-

8

на плазмида, размером 3.7 kb, названная pVA26 (рис.1). Эта плаз-мида'явилась делециониой производной р1414, что было подтверждено гибридизацией ДНК, а затем и рестрикционным анализом pVA26.

Подробная рестриктная карта pVA26 представлена на рис.3. Плазмида pVA26 состояла из 1.5 kb фрагмента плазмиды р14£4, несущего репликэтивные структуры, и дуплицированного фрагмента с oat-геном. Размер полученного мини-репликона р1414 соответствует размеру решшконов подобных плазмид рМВ14, pbaai (Murai et al., 1987: Devine et al., 1989). Полученная плазмида pVA26, как и исходная, обладала очень высокой сегрегационной и структурной стабильностью. Видимо, полученную плазмиду можно использовать как вектор для клонирования ДНК в клетках в. subtiiis.

Flic, ч Схема клонирования фрагментов минирепликона плазмиды рШ4. E-EeoRI, H-Hinfl, Hp-HpaII, S-Smal: MM - p14U; ESS -фрагмент pCI94 с геном cat; i-1 - puci ■> и pBluesoript HKS;

H -полилинкетэ вектора; .....- секвениро;:энные фрагменты А (на

пласмиде рЕТ) и*Б (на плазмиде ркзч).

2.4. Клонирование и секвенирование фрагментов минирепликона плазмида у1414. ■

Чтобы определить, к какому семейству относится ori ^-последовательность плазмида р1414, мы клонировали и определили нуклеотидную последовательность двух фрагментов ее минирешшкона .

Фрагменты для клонирования получали ■ посредством рестрикции плазмида pVA26, Попытки клонировать фрагмент Hpaii (0,44 kb) плазмида pVA26 в системе фага MI3 оказались неудачными: фаговая ДНК с клонированным фрагментом была крайне нестабильна. Возможно, что эта нестабильность была вызвана присутствием на данном фрагменте активного в функциональном отношении локуса. Таким локусом могла быть последовательность ori(+) р1414.

Мы изменили схему клонирования и получили плазмиду рЕ1, представляющую СОбОЙ ГИбрИДНуЮ КОНСТРУКЦИЮ между pVA26 И pU019 по сайту EcoRl (рис. 3). Поскольку сайт EcoRl на плазмиде pVA26 расположен на фрагменте Hpaii, то определение нуклеотидной последовательности с обоих праймеров вектора >';С19 (универсального и обратного) позволило бы получить необходимую информацию о данном фрагменте.

Мы также клонировали фрагмент Hinfl (1,22 kb) плазмида pVA26 в векторе pBluescript II KS(+) (рис. 3). Этот фрагмент нес большую часть мини-репликона р1414 и часть встроенного гена cat. Полученная плазмида была названа pKS3 и использована для определения нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК.

В результате, мы определили нуклеотидные последовательности фрагментов А (115 п.о.) и Б (323 п.о.):плазмид рЕ1 и pKS3 соответственно (рис. 3, 4). Далее, весь анализ -и - сравнение с последовательностями других плазмид выполнялись для этих двух фрагментов.

2.5. Анализ полученных последовательностей.

Был обнаружен еысокий .уровень гомологии последовательностей фрагментов А и Б с последовательностями минирепликонов бациллярных криптических плазмид pUH1, pBS2, pFTB14, рВАА1 и pBC1 (табл.1). Компьютерный анализ нуклеотидной последовательности фрагмента А и результаты выполненного множественного выравнивания этой последовательности с гомологичными" ей последовательностями минирепликонов других плазмид позволили нам установить, что фрагмент А несет часть ori(+)-последовательности р1414 (рис.4).

Ю

Таблица NI

Гомология ДНК ori(+) и аминокислотных последовательностей Rep-белков (%).

Фрагменты Р1414

ori(+)

Rep-белок

Сравниваемые плазмида р1414 |pBS2 рРТВ14 |pUH1 IpBAAl 1рВС1 |pUB11Q

100

100

аб

68

82

67

69

92

77

70

50

59

43

34

ir

.tactatatag aaacaacaag attttttaaaatcggtttaaag с стшс cgtgtcaag

(-35)

(-10)

1

57 gctttaaagtgtttttgacaggtaaaaactccttctgctattattaagtgtcgaagc| .......... .......... -*

Т-

1 ^gagctttacagagcaaaagtggtatacgttactatggcaaaaaagctgagaaattgtgca ly raklvyltmakklrnca

60 gttgtgcggaatgtctttcgtttaaaagagacccggagacgcaaactaaagttgtatcaagct v v r n 7 р r l к etrrrklklyqa

123 gagttttgcaaagtgaggttatggccgatgtgtgcctggcgcaggtcgttaaaaattgcttat ef ckvrlcpmcawrrs lkiay

186 cacaAtaaattgatcgtagaagaagctaatcgtcagtatggatgcggatggatttttctcacg

hn klyv ee anrq yg с gw if lt 249 ttgagggttcggaatgttaagggtgacagtctgaaaacctcgatttctgagatgatgaaaggg ltv rnvkgdslktsisdmmkg

312 TTAAATCGCCTAgggg l n r l

Рис.4 Нуклеотидная последовательность секвенированных фрагментов А (115 п.о.) и Б (323 п.о.) минирепликона плазмиды р1414 и аминокислотная последовательность фрагмента ; предполагаемого ■ Rep-бвжа.'Н| - несеквенированные фрагменты; — - фрагмент консервативного блока ori ^-последовательности; —-— - возможные сайты блоков Прибнова; —**— - палиндромы; IR - инвертированный повтор; —» - прямые повторы.

Нами определена последовательность нуклеотидов, прилежащая к nick-сайту со стороны 3'-конца. Три нуклеотида - ATA - лежащие на конце определенной последовательности,- входят в консервативный блок из 15 нуклеотидов. Этот блок обнаружен у всех зз+-плазмид,

имеющих огК+)-последовательность типа рС194. На этом фрагменте были обнаружены сайты, гомологичные сайтам (-10) и (-35) блоков Прибнова, причем нуклеотидные последовательности этих сайтов и их положение относительно ш.ск-сайта точно совпадают с последовательностями и положением аналогичных сайтов в крилтических бациллярных плазмидах рин1, рвэг, рртв14 и рВАА1.

Также обнаружена серия прямых (от 5 до 7 п.о.) и инвертированных (от 5 до 12 п.о.) повторов. Среди инвертированных повторов некоторые имели пзлиндромную структуру. Наличие серии прямых и инвертированных повторов в районе огК+) р1414 также является характерной чертой оН.(+)-последовательностей зз+-плазмид.

Основываясь на гомологии нуклеотидных последовательностей, мы пришли к выеоду, что последовательность фрагмента Б несет часть гена Кер-бежа гглазмиды р1414. Было определено положение открытой рамки считывания на нуклеотидной последовательности данного фрагмента и получена соответствующая ей аминокислотная последовательность фрагмента предполагаемого Яер-белка (рис. 4).

Из полученных результатов следует, гго плазмида р1414 наиболее близка к критическим бациллярным плязмидам, обнаруженным в собственно В.БиЬ-ЫНБ (рВ32, рЦН1 , рРТВ14, рВАА1). Уровень ГОМОЛОГИИ нуклеотидной последовательности ог! р1414 с соответствующими последовательностями данных плазмид очень высок (от 69% до 86 %). На уровне аминокислотных последовательностей Нер-белков, гомология между этими плазмидами также высока (от 67% до 92%). Эти плазмида составляют отдельное, близкородственное подсемейство в группе плазмид, обладающих ог1()-последовательностью типа р0194 и ровно.

На аминокислотной последовательности фрагмента предполагаемого Еер-белкз р1414 нами был обнаружен мотив и*РМШ*к (М1), который является консервативным для большинства белков, составляющих группу нск-белков. Мы провели компьютерный поиск гомологии, сравнив аминокислотную последовательность участка Дер-белка, включающего мотив М1,, с последовательностями известных структурных и функциональных доменов белков (банк зваяе, около 41.000 доменов). Выявилось сходство в аминокислотной последовательности изучаемого участка Дер-белков с последовательностью ряда сигнальных пептидов различных секретируемых э-укариотических белков, а также трансмембранных белков. Уровень гомологии участков сравниваемых белков варьировал от-30 до 47%.

12

Проведя поиск по банку аминокислотных последовательностей белков, для которых установлена вторичная и третичная структуры посредством рентгеноструктурного анализа (Brookhaven bank), Мы выявили определенное сходство аминокислотной последовательности домена Rep-белка, содержащего Ml, с последовательностью L-арабинозз-связывающего белка е.col i. Данный белок вовлечен в систему мембранного транспорта L-арабинозы. Основываясь на сходстве сравниваемых доменов, мы предсказали возможную вторичную и третичную структуры домена Rep-белка, содержащего Ml. Из результатов компьютерного анализа следует, что с высокой вероятностью фрагмент домена Rep-бежа с 73 по 89 аминокислотный остаток, содержащий консервативный мотив, образует a-спиральную структуру и обладает четко выраженными гидрофобными свойствами.

Эти данные наряду с выявленной гомологией с некоторыми трансмембранными белками позволили нам предположить, что и-концевой домен Rep-белка может играть роль "мембранного якоря" в процессе репликации плазмиды, одним концом закрепляясь на мембране, а другим связываясь с плазмидной ДНК. Даш: е предположение может быть проверено в дальнейших экспериментальных исследованиях.

3. Взаимодействие плазмиды р141~ с хромосомной ДНК клетки-хозяина.

В процессе проведения опытое по гибридизации плазмиды р1414 с препаратами ДНК из других штаммов, содержащих плазмиды (см. выше), мы обнаружили, что плазмида р1414 гибридизуется с хромосомной ДНК всех плазмидсодержащих почвенных штаммов. Это можно было об'яснить тем. что в хромосоме почвенных штаммов B.subtilis существуют участки, высоко гомологичные плазмидной ДНК.

Мы попытались выяснить, характер сложившихся взаимоотношений между критической ттлазмидой р1414 и хромосомой штамма 1414 -природного хозяина этой плазмиды, а также характер взаимоотношений этой плазмиды с геномом лабораторного штамма B.subtilis.

3.1. Плазмида р!414 в природном штамме.

В литературе сообщалось о способности критической плазмиды PBN27, выделенной из B.natto, встраиваться в хромосому клетки-хозяина (Ким, 1989). Существуют также данные о встраивании плазмиды рЕ194 и ее производных в геном B.subtilis 168 (Hofemeister et al., 1983; Банкиров и др., 1986). Учитывая наши данные о. гибридизации плазмидной ДНК с хромосомой, мы предположили, что плазмида р1414 также монет встраиваться в геном клетки.

Мы провели ряд экспериментов с хромосомной ДНК штамма р1414, выделенной в градиенте плотности csci. Хромосомную ДНК штамма 14X4 - природного хозяина плазмиды,' обрабатывали рестриктазой Sali. Рестриктные■фрагменты разделяли в агарозном геле и переносили на нейлоновый фильтр, с которым ставили блот-гибридизацию. Зондом служила меченная ДНК плазмиды р1414. На рис.5 видно, что на треке с хромосомной ДНК штамма 1414, обработанной sail, выявилась одна интенсивная и две слабые полосы гибридизации. Интенсивная полоса соответствует линейной форме р1414. Ее происхождение может быть обусловлено, как амплифицированными копиями интегрированной плазмиды р1414, так и примесями мультимерной плазмидной ДНК в хромосомной фракции. Однако наличие дополнительных слабых полос однозначно указывает на существование в хромосоме штамма 1414 участков ДНК, обладающих протяженной выраженной гомологией с плазмидой р1414. Фрагменты, дающие дополнительные гибридазацион-ные полосы с р1414, скорее всего, соответствуют фланговым участкам, где ДНК встроенной плазмиды сопряжена с хромосомной ДНК. Разная интенсивность гибридизации могла "ить обусловлена в данном случае, количеством гибридизуюцегося материала. Вероятно, фрагменты ДНК, гомологичные р1414, где хромосомная ДНК сопряжена с плазмидной, представлены в хромосоме уникальными копиями. Размеры этих фрагментов соответствуют примерно 7,8 и 2,7 kb. В сумме они составляют 10,5 кь. что больше размеров самой плазмиды. Таким образом, полученные нами данные согласовываются с предположением о.наличии копии (копий) р1414 в составе хромосомной ДНК почвенного штамма 1414.

3.2. Поведение плазмиды р!414 в клетках лабораторного штамма B.subtilis 168.

Другой вопрос, интересовавший нас, был: возможна ли интеграция (de novo) изучаемой плазмиды в хромосому штамма, не имевшего контакта с этой плазмидой ранее. Мы трансформировали лабораторный штамм B.subtilis RUB834 маркированным вариантом плазмиды р1414 -плазмидой pYAi4 (CmR). Исходно, хромосомная ДНК этого штамма, обработанная рестриктазой Sali, не гибридизовалась с ДНК плазмиды р1414 (рис.6). На треке же с рестрицированной по сайтам Sali хромосомной ДНК, выделенной из штамма Rub834 (pVA.14), выявились множественные полосы гибридизации с этим зондом. Одна из них соответствовала линейной форме р1414 (при обработке рестриктазой

Рис 5.

Рис 6.

Рис 5. Результат« блат-гибридизации меченной ДНК плазмиды р1414 с хромосомной ДНК штамма T4I4. 1- нативная хромосомная ДНК штамма 1414; 2 - та же ДНК, обработанная рестриктазой Sali.

Рис.в. Результаты блот-гибридизации меченной ДНК плазмиды DI4I4 с хромосомной ДНК штамма ГОВ834 (рУА14). 1 - хромосомная ДНК штамма RUB834 (pVAH), обработанная рестриктазой Sali; 2 хромосомная ДНК штамма RUB834, рестрицированная Sali.

Sali из pVAi4 вырезается фрагмент, несущий cat-ген; этот фрагмент не дает гибридизационного сигнала с р1414).

Объяснение появления дополнительных гибридизациошшх сигналов на этом треке за счет возможных перестроек в автономно существующей pVAi4 кажется маловероятным, так как ранее нами была показана высокая структурная стабильность дайной плазмиды в штамме RUB834 (см. выше;. Возникновение стольких полос гибридизации может указывать, скорее всего, на множественность встраивания ДНК плазмиды pVAi4 в хромосому клетки-хозяина или на множественные перестройки интегрированной копии. Возможно, что интеграция рУА14 в хромосому сопровождается также амшшфшсмшонными-явлениями.

Мы не проводили исследований по оценке частоты подобного встраивания, поэтому трудно сказать что-либо определенное о его

15

механизме. Возможно, что этот процесс подобен интеграции посредством незаконной рекомбинации плазмиды р£194 в геном в.эиьииз (Hofemeiзter е! а!., 1983).

4. Некоторые аспекты взаимодействия р!414 с хромосомной ДНК: плазмида рА51 - условия возникновения и свойства.

Хромосомная ДИК бактерий, в том числе и В.БиЬИИз, содержит в своем составе различные чужеродные встроенные последовательности: дефектные фаги, интегрированные копии плазмидных репликонов инактивированные гены фагов и плазмид (Хмель, 1987; Прозоров, 1989). Эти, обычно молчащие, последовательности в определенных условиях могут вылепляться из хромосомы. Одно из таких явлений -новообразование плазмида - описано в данной главе.

Мы исследовали район огК+) и гена Нер-белка плазмиды р1414. В ряде экспериментов по картированию огК+) и гена Иер-белка мы трансформировали компетентные клетки штаммов 'В-еиМШв кивз:м и ВБ224 (гесА4) неспособными автономно реплицироваться фрагментами плазмиды рУА2б, литерованными с фрагментом, несущим са<;-ген (рис.?). Появление трансформантов в э'их вариантах опыта не овдалось.

Рис.7. Схема опытов, в результате которых появилась плазмида pAS1. Е - EcoRI, Н - Hindill, Нр - Hpall, НГ - Hinfl. ES3 - фрагмент с cat-геном (1066 п.о. )ЯШ- минирепликон плазмиды р!414

фрагменты, минирепликона

pAS1

Результаты оказались совершенно неожиданными: устойчивые к антибиотику трансформанты были получены со всеми реципиентами, в том числе и с гесМ. Частота их возникновения была примерно в 1000 раз меньше, чем при трансформации клеток B.subtilis нативной плазмидой pVA26. Почти все трансформантные стп клоны (более 30) содержали одну и ту же плазмиду размером около 4,6 kb. Она получила название pASi. Плазмида pASi стабильно поддерживалась в клетках хозяина без селективного давления. Число копий плазмида составляло 45-50 на хромосомный эквивалент.

Плазмида pASt- не гибридизовалась с р1414, следовательно протяженные участки' гомологии между pASi и р1414 отсутствовали. В то же время pASi несла фрагмент с геном cat из плазмида рс194. Чтобы выяснить происхождение остальной части обнаруженной плазмида, мы поставили блот-гибридизацию меченой ДНК плазмида pAS1 с хромосомной ДНК штамма B.subtilis RUB834, обработанной рестрик-тазой BaraHl. На треке выявлялись две полосы гибридизации, соответствующие фрагментам с размерами 2,0 и 3,8 kb. Следовательно, в составе хромосомы лабораторного штамма R ;Ь834 существует участок ДНК гомологичный плазмиде pASi. Такой же участок обнаружен в хромосоме почвенного штамма 1414.

Мы обнаружили, что плазмида pASi гибридизуется с плазмидами PUB110 из Б.aureus и рВС1б из B.cereus. Известно, что плазмида рВС1б и pUBi10 представляют собой один . и- тот же репликон, за исключением области, несущей ген устойчивости к тетрациклину у рВС16 и к канамицину у pUBHO (Polak, Novick, 1982). В результате проведеного сравнительного рестрикционного анализа плазмид рА31 и pUBiю.выяснилось, что они идентичны на протяжений почти всего решшкона, за исключением области, несущей ген антибиотикоустой-чиеости (рис.8). В отличие от рВС1б, плазмида pASi несла часть kan-гена плазмида ptiBi ю.

Сходное явлеше - возникновение плазмиды de novo - было описано в нескольких работах (Shishido, Tanaka, 1983; Temeyer, Chapman, 1987; Grand,jean et al., 1993). Во всех описанных примерах, в том числе и в нашем случае, выявляются общие характерные черты: сходная частота новообразования плазмиды (примерно 10~6); -невозможность автономной репликации плазмида-индуктора; RecA-независимость данного процесса и некоторые другие.

Многие черты этого явления сходны с сайт-специфической рекомбинацией между плазмидами, происходящей по так называемым

17

йБд-сайтам (Башкиров и др., 1986; Сеппаго ег а1., 1937). В роли таких сайтов могли бы выступать высоко гомологичные ог1 ^-последовательности плазмид. Строго консервативные 15 пар оснований, которые непосредственно окружают пхек-сайт, могли бы служить аналогом коровой последовательности йЗд-сайта.

PUB110

pAS1

Рис.а Сравнительная рестрикционная карта плазмид pASi, PUB110 И рВС1Ь. Е - BeoRI. Г -PvuII, На - Haelll, Hi - Hinfl, М -Mbol, в- BamHI; Е2223 - область совпадения ривпо и рВС1б; швт -область совпадения pASi и рШ1Ю; i > ~ гены, кодирующие устойчивость к Km (.........), Cm (оо»), гены гер (ллл) и pre (""");

• - точка начала репликации ori(+); * - сайты рестрикции на фрагменте с геном cat.

Таким образом, мы показали, что хромосома B.subtilis содержит молчащую последовательность риы ю-псдобного репликона, которая может в определенных условиях выщепляться, переходя к автономному существованию. Одна из стадий образования pASi может включать рекомбинацию, сходную с сайт-специфической recA-независммой рекомбинацией по 1&д-сайтам.

вывода

1. Среди 32 штаммов ВасШи?. зиьиИБ, выделенных из почвы, был обнаружен 21 штамм с критическими плазмидами, в основном небольших размеров, имеющими высокую степень взаимной гомологии.

2. Изучены основные характеристики одной из выделенных плазмид, р1414: копийность, степень стабильности в клетках хозяина; составлена рестриктная карта; установлен тип репликации (а-тнп); определена нуклеотидная последовательность двух фрагментов мини-репликона, на основе чего плазмида р1414 отнесена к группе рС194.

3. На основании компьютерного анализа и предсказания пространственной структуры ы-концевого домена иер-белка, выдвинуто предположение о роли этого белка, как мембранного якоря в процессе репликации.

4. Показано наличие в хромосоме почвенных штаммов B.subtilís и лабораторного штамма B.subtilís 1б8 Mai-burg, несущего плазмиду р1414,участка ДНК, обладающего протяженной гомологией с ДНК этой плазмиды.

5. Обнаружено явление гесА-независимой индукции плазмиды pASi, близкой к риВ110, после введения в клетки B.subtilis участков минирепликона р1414. Показано, что плазмида pASi выщеплялась из хромосомной ДНК бактерии!

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Канапина А.Ш. Плазмиды бацилл, родственных Bacillus subtil is. / Мол. генетика, микробиол. и вирусол., 1992, N 5-6, с.5-10.

2. Незаметдикова В.З., Канапина А.Ш., Козловский Ю.Е., Прозоров A.A. Изучение плазмид, выделенных из почвенных штаммов штаммов бацилл. / Генетика, 1992, т.28, N3, с.49-55.

3. Nezametdinova V.Z., Kanapina A.SI',., Prozorov A.A. Cryptic Plasmids of Bacillus subtilis soil strains. / 11th European meeting on genetic transformation. 23-27 August 1992, Budapest, Hungary.

4. Nezametdinova V.&., Kanapina A.Sh., Prozorov A.A. Plasmids of Bacillus soil strains. / In: DNA transfer and gene expression., Intercept Ltd., 1993, p.279-283.

5. Канапина А.Ш., Незаметдинова B.3., Кроон K.X., Прозоров A.A. RecA-независимая индукция новой плазмиды pASi после введения в клетки Bacillus subtilis 168 фрагментов криптической плазмиды р1414. / генетика, 1994, т.30, N6, с.776-782.

6. Канапина А.Ш., Незаметдинова В.З., Прозоров A.A. Плазмида pASi, выщеплящаяся из хромосомы Bacillus subtilis 168. / Докл. РАН, 1994, т.334, N6, с.791-793.

7. Канапина А.Ш., Канапин A.A., Прозоров A.A. Определение и сравнительный анализ нуклеогидной последовательности фрагментов минирепликона криптической плазмиды р1414. / Генетика, 1995, в печати.