Анализ структурно-функциональных изменений церулоплазмина человека в растворе и в составе крови при действии УФ- и лазерного излучений

Рязанцев, Сергей Вячеславович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ структурно-функциональных изменений церулоплазмина человека в растворе и в составе крови при действии УФ- и лазерного излучений
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Анализ структурно-функциональных изменений церулоплазмина человека в растворе и в составе крови при действии УФ- и лазерного излучений"

1а правах рукописи

Рязанцев Сергей Вячеславович

АНАЛИЗ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ЦЕРУЛОЯЛАЗМИНА ЧЕЛОВЕКА В РАСТВОРЕ И В СОСТАВЕ КРОВИ ПРИ ДЕЙСТВИИ УФ- И ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЙ

03.00.02-Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж-2007

003054419

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Артюхов Валерий Григорьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Попова Татьяна Николаевна

кандидат биологических наук Дмитриев Евгений Владиславович

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет

Защита состоится 2 марта 2007 г. в 15-00 часов на заседании диссертационного совета Д.212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, г. Воронеж, Университетская пл., 1, ауд. 59.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан 3 ^ января 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, доктор биологических наук

Грабович М.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время не ослабевает внимание ученых к изучению влияния оптического излучения на биообъекты. Напротив, в последние годы в этой области исследований возросла доля теоретических работ по сравнению с прикладными. Это связано, в первую очередь, с тем, что в медицинской практике накоплен уже достаточно большой объем данных об успешном применении ультрафиолетового и видимого излучений. Для достижения терапевтического эффекта при лечении различных заболеваний наиболее часто применяют метод аутотрансфузии УФ-облученной крови (АУФОК) и эндоваскулярное лазерное облучение крови (ЭЛОК). В связи с этим остро стоит вопрос о необходимости раскрытия закономерностей и механизмов действия оптических излучений с целью прогнозирования возможности и эффективности применения данных методов для лечения более широкого спектра заболеваний.

Актуальность проблемы диктует необходимость глубокого и целенаправленного изучения действия низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) и ультрафиолетового излучения на молекулярно-клеточном уровне для выяснения ключевых механизмов, лежащих в основе лечебного действия света на живые организмы.

К настоящему времени накоплены экспериментальные данные о влиянии на биообъекты различных диапазонов длин волн электромагнитных излучений. Для терапевтических целей в основном используют НИЛИ с длинами волн 632 нм и 830-888 нм, которое дают гелий-неоновые и углекислотные лазеры. Низкоинтенсивное лазерное излучение не вызывает видимых деструктивных изменений в тканях, однако, поглощаясь биологическими структурами, оказывает на них фотохимическое действие. Разнообразные биологические эффекты, проявляющиеся при действии НИЛИ на молекулярном, клеточном, тканевом и организменном уровнях, обусловливают широкий диапазон медицинских эффектов: прогавоотечный, противовоспалительный, обезболивающий, бактерицидный, иммуномодулирующий и др. (В.И. Козлов, В.Н. Буйлин, 1993; И.Г. Ляндрес, 1998). Биологический эффект связан в первую очередь с акцепцией квантов света ферментами, имеющими в составе ме-таллосодержащие простетические группы. Акцепторами НИЛИ, запускающими клеточный ответ, являются церулоплазмин, супероксидцисмутаза (Е.А. Горбатенкова с соавт., 1988; М.С. Жуманкулов с соавт., 1989), каталаза, глутатионпероксидаза, дегидрогеназы, фосфатазы и др. (Г.Е. Брилль, А.Г. Бриль, 1997; В.М. Чудновский с соавт., 1989; Т. Кати, 1999).

Аутотрансфузия УФ-облученной крови в настоящее время также широко используется при лечении гнойно-септических, сердечно-сосудистых и других заболеваний (В.И. Карандашов, Е.Б. Петухов, 1997). При проведении экспериментальных и клинических исследований выявлен противовоспалительный, дезинтоксикационный, иммуномодулирующий эффект действия УФ-света (К.А. Самойлова, 1986), его роль в структурно-функциональных модификациях ферментов антиоксидантной системы защиты организма: су-пероксидцисмутазы, каталазы, пероксидазы и др. (В.Г. Артюхов с соавт., 1997; О.В. Башарина с соавт., 1996).

Характерной особенностью механизмов действия видимого и длинноволнового УФ-света на молекулярно-клеточном уровне является их зависимость от присутствия кислорода, что указывает на ведущую роль реакций фотоокисления (G.M. Halliday et al., 1998). Механизм "кислородной зависимости" эффектов УФ-облучения связан со способностью 02 выступать в роли акцептора первичных восстановительных радикалов реакций фотолиза НгО с образованием активированных кислородных метаболитов (АКМ), в частности, синглетного кислорода ('Ог), супероксидного анион-радикала (О2), гид-роксильного радикала (ОН") и пероксида водорода (Н2О2). Кроме того, АКМ могут образовываться в результате поглощения квантов света белками. Эта реакционноспособные продукты зарегистрированы при облучении видимым монохроматическим (лазерным) и полихроматическим светом различных клеток человека и животных in vitro (N. Grossman, 1998; D.A. Oren et al., 2001). В связи с этим большой интерес представляют данные о состоянии антиоксидантаой системы в условиях лазерного и УФ-облучения.

В литературе практически отсутствуют сведения о влиянии низкоинтенсивного лазерного и ультрафиолетового излучений на один из важнейших глобулинов крови - церулоплазмин (ЦП), который, во-первых, является основным белковым антиоксидантом плазмы крови, проявляя как специфическую, так и неспецифическую активность, связанную со снижением уровня АКМ; во-вторых, обладает оксидазной активностью, окисляя различные субстраты, в том числе и Fe2+ (ферроксидазная активность); в-третьих, является основным медь-транспортным белком и, в-четвертых, относится к "белкам острой фазы", поэтому уровень его активности в плазме крови служит критерием при диагностике и прогнозе течения воспалительных заболеваний.

С целью выявления механизмов действия оптического излучения представляется необходимым изучение влияния ультрафиолетового и низкоинтенсивного лазерного излучений на структурно-функциональные свойства церу-лоплазмина. Исследование фотоиндуцированных процессов на биофизическом и биохимическом уровнях способствует выявлению молекулярных механизмов, лежащих в основе эффектов биологического действия излучения на организм. Это позволит теоретически обосновать практическое применение методов АУФОК и ЭЛОК в клинической практике.

Цель и задачи диссертационной работы. Целью настоящей работы явилось изучение структурно-функциональных свойств церулоплазмина человека в условиях лазерного и УФ-облучения.

В связи с этим перед нами стояли следующие задачи:

1. Изучить влияние УФ-света (240-390 нм) на спектральные, хромато-графические и электрофоретические свойства церулоплазмина человека.

2. Исследовать функциональную (оксидазную и супероксиддисмутаз-ную) активность церулоплазмина в условиях УФ-облучения.

3. Изучить действие низкоинтенсивного лазерного излучения (632,8 нм) на структурно-функциональные характеристики церулоплазмина.

4. Проанализировать сочетанное действие УФ-света и церулоплазмина на состояние мембран лимфоцитов крови человека.

Научная новизна. Работа является комплексным исследованием, посвященным изучению структурных свойств и функциональных особенностей церулоплазмина в условиях УФ- и лазерного облучения.

Впервые исследовано влияние широкого диапазона доз (151 -ь 4530 Дж/м2) интегрального потока (240-390 нм) УФ-излучения на спектральные, хроматографические и электрофоретические свойства церуло-плазмина человека. Наблюдаемые изменения спектральных характеристик ЦП свидетельствуют о значительных структурных перестройках молекулы гликопротеида. Зарегистрированное методом гель-хроматографии снижение кажущейся молекулярной массы ЦП после действия максимальных доз УФ-света позволяет высказать предположение о возможных нарушениях структуры молекулы, затрагивающих микроокружение активного центра фермента, что приводит к снижению оксидазной активности вследствие затруднения конформационных взаимодействий субстрата (донора электронов) и атомов меди в составе активного центра ЦП.

Показано повышение супероксидцисмутазной активности церулоплаз-мина после УФ-облучения его растворов; УФ-модификация плазмы крови приводит к аналогичному, но менее выраженному эффекту.

Исследования, посвященные изучению влияния видимого света (632,8 нм), подтверждают обратимый характер процессов разворачивания и сворачивания молекул гликопротеида, о чем свидетельствуют фотоиндуциро-ванные изменения хроматографических и спектральных свойств ЦП. Изменения элеюрофоретических свойств указывают на потерю холоцерулоплазми-ном меди и переходом части молекул белка в форму апоЦП, что сопровождается разворачиванием глобулы вследствие разрыва водородных связей между доменами 1 и 6.

Показано увеличение функциональной активности ЦП при облучении светом гелий-неонового лазера, причем более фоточувствительной оказалась супероксиддисмутазная активность.

Выявлено, что инкубация лимфоцитов с церулоплазмином приводит к понижению уровня пероксидного окисления липидов мембран клеток, при УФ-модификации клеточных суспензий защитный эффект фермента понижается.

Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы расширяют современные представления о структурно-функциональных изменениях одного из антиоксидантных ферментов— церулоплазмина при действии на него излучения ультрафиолетовой и видимой областей спектра электромагнитных колебаний.

Эксперименты с применением широкого диапазона доз низкоинтенсивного лазерного и УФ-излучения выявляют динамику фотоиндуцированных превращений молекул ЦП и позволяют установить закономерности связи между дозой облучения и наблюдаемым эффектом. Полученные результаты дополняют представления о механизмах, лежащих в основе модифицирующего действия оптического излучения на сложные белки. Это вносит вклад в раскрытие сущности процессов, обусловливающих положительные эффекты ЭЛОК и АУФОК или других видов фототерапии. Результаты проведенных модельных экспериментов можно использовать для подбора оптимальных доз облучения при лечении различных заболеваний.

Данные, полученные при исследовании фотоиндуцированных процессов на поверхности лимфоцитов (уровень процессов ПОЛ, изменение естественной пероксидазной активности), позволяют понять пути изменения со-

стояния мембран изолированных лимфоцитов в условиях УФ-облучения.

Предложенная схема событий, протекающих при УФ- и лазерном облучении растворов церулоплазмина, помогает раскрыть совокупность процессов, инициированных излучением, что может быть полезно для понимания молекулярных аспектов действия различных методов фототерапии.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены: на IV Съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2001); IV Международной конференции "Циклы природы и общества" (Ставрополь, 2002); Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2002); III Международном Конгрессе "Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине" (Санкт-Петербург, 2003); 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003); Междисциплинарной конференции с международным участием "Новые биокибернетические и телемедицинские технологии 21 века для диагностики и лечения заболеваний человека" (Петрозаводск, 2003); III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 6 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. УФ-излучение (240-390 нм) в дозах 151-Н530 Дж/м2 индуцирует модификацию спектральных, хроматографических, электрофоретических и функциональных свойств церулоплазмина человека, обусловленную обратимыми процессами восстановления и реокисления Си I типа.

2. Воздействие аскорбиновой кислоты на нативный и предварительно облученный УФ-светом в дозах 151-Н530 Дж/м2 церулоплазмин способствует обратимому восстановлению Си I типа. Аскорбат проявляет фотопротекторные свойства по отношению к церулоплазмину, более выраженные при предварительной инкубации с гликопротеидом.

3. Низкоинтенсивное лазерное излучение (632,8 нм) приводит к процессам разворачивания или компактизации белковой глобулы; наблюдается обратимый переход части молекул холоцерулоплазмина в апоформу.

4. Схема возможных процессов в молекуле церулоплазмина, приводящих к изменению структуры и основных функциональных свойств гликопро-теида при его фотомодификации УФ-светом и низкоинтенсивным лазерным излучением.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает 153 страницы машинописного текста, 10 таблиц, 51 рисунок. Состоит из введения, шести глав, заключения, выводов. Список литературы содержит 228 источников, из них 109 - отечественных и 119 - зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Церулоплазмин: строение и функции

В главе представлен анализ литературных данных о структуре, физико-химических и функциональных характеристиках церулоплазмина человека.

ГЛАВА 2. Современные представления о механизмах действия оптического излучения на биосистемы

В главе изложены современные представления о фотомодификации биосистем, в частности, описаны УФ-индуцированные превращения антиок-сидантных ферментов и клеток иммунной системы, а также механизмы действия низкоинтенсивного лазерного излучения на молекулярно-клеточном уровне.

ГЛАВА 3. Объекты и методы исследования

В экспериментах были использованы буферные (рН 5,5; 0,4 моль/л №-ацетатный буфер) растворы церулоплазмина человека ("ИмБио", Н. Новгород) в концентрациях 3-Ю"4; 3-Ю-5; 3-Ю-6 и 1,5-Ю"6 моль/л (концентрацию ЦП определяли спектрофотометрически при длине волны 610 нм, £бю = 4,5'103 л-моль"'-см'1); а также кровь доноров и больных с воспалительными заболеваниями почек. Выделение лимфоцитов из дефибринированной крови доноров проводили с помощью седиментации в градиенте плотности фиколл-урографина (1,077 г/мл).

Источником лазерного излучения служил гелий-неоновый лазер ЛГН-207А с длиной волны 632,8 нм, выходная мощность — 1,3 мВт. Исследуемые образцы облучали в термостатируемой (20+ГС) кювете полусферической формы при постоянном перемешивании. Время экспозиции составляло 1, 5, 10, 20, 30 и 60 мин.

УФ-облучение растворов церулоплазмина и плазмы крови доноров проводили в термостатируемой (20±1°С) кювете при постоянном перемешивании магнитной мешалкой. Источником УФ-света служила ртутно-кварцевая лампа типа ДРТ-400. Интегральный поток УФ-излучения (240390 нм) выделяли при помощи светофильтра УФС-1. Интенсивность излучения — 151 Дж-(м2,мин)"'. Время облучения образцов соответствовало дозам 151 -г 4530 Дж/м2.

Регистрацию электронных спектров поглощения растворов ЦП человека проводили на спектрофотометрах СФ-46 и СФ-56 ("ЛОМО", Россия) в диапазоне длин волн от 240 до 730 нм.

Гель-фильтрацию растворов церулоплазмина проводили на хромато-графической колонке, упакованной сефадексом С-150 и уравновешенной 0,9 % раствором хлорида натрия.

Диск-электрофорез церулоплазмина человека проводили в 3 % концентрирующем и 7 % разделяющем полиакриламидном геле и трис-глициновом электродном буфере, рН 8,3. Электрофоретические фракции ЦП окрашивали амидочерным 10-В или о-дианизидином. Избыток несвязавшегося красителя отмывали 7 % раствором уксусной кислоты. Используя денситограммы контрольных и опытных образцов, проводили расчет ширины отдельных полос, электрофоретическую подвижность (ЭП) фракций и процентное содержание белка в них.

Для определения интенсивности протекания процессов ПОЛ использовали метод люминолзависимой хемшпоминесценции (ХЛ). Измерение ХЛ проводили на биохемилюминометре БХЛ-06М.

Супероксидцисмутазную активность образцов исследовали по изменению интенсивности ХЛ, опосредованной супероксидными анион-радикалами Ог, при окислении люминола (Л.Т. Рязанцева с соавт., 2001).

Изучение оксидазной активности растворов церулоплазмина основано на фотометрическом определении окрашенных продуктов, образующихся в результате окисления о-фенилендиамина под действием церулоплазмина. Оптическую плотность реакционной смеси измеряли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 492 нм.

Для определения пероксидазной активности мембран лимфоцитов человека в качестве субстрата использовали раствор тетраметилбензидина в цитратном буфере. Измерение оптической плотности проводили при Х=450 нм на вертикальном фотометре АИФР-01 "Униплан".

Жизнеспособность лимфоцитов определяли по стандартной методике с использованием красителя трипанового синего.

Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью интегрированного пакета программ "81а1£гарЫсз". Отличия в контрольных и опытных сериях экспериментов анализировали с помощью ^критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 4. Влияние УФ-излучения на структурные характеристики и

функциональные свойства молекул церулоплазмина человека

Нами было изучено влияние различных доз (151 -5- 4530 Дж/м2) интегрального потока УФ-излучения (240 + 390 нм) на спектральные характеристики буферных растворов церулоплазмина человека в области длин волн 240 - 730 нм.

Анализ полученных результатов показал, что электронные спектры поглощения интактных растворов ЦП человека (рис. 1; кривая 1) характеризуются наличием максимума в ультрафиолетовой области (Хтах= 278 нм), который является результатом совокупного поглощения энергии квантов света ароматическими аминокислотами. Присутствие меди в ЦП обусловливает возникновение полосы поглощения в видимой области спектра (^шах= 610 нм). Зависимость оптической плотности в максимуме светопогло-щения как белковой части, так и неорганического компонента ЦП от дозы УФ-излучения имеет сложный характер. УФ-свет в дозах 906 и 1359 Дж/м2 индуцирует возрастание оптической плотности растворов ЦП в области 240 - 350 нм. Это повышение обусловлено, по-видимому, экспонированием хромофоров ароматических аминокислот в растворитель.

При УФ-облучении ЦП в дозе 2265 Дж/м2 наблюдаются противоположные изменения: значения оптической плотности как в максимуме, так и в минимуме спектра поглощения фермента приближаются к таковым для на-тивного ЦП (хотя и остаются несколько выше контрольных значений), это может указывать на процессы сворачивания глобулы или на разрушение под действием УФ-света части хромофоров белкового компонента молекул.

Облучение раствора фермента уже в минимальной использованной нами дозе 151 Дж/м2 приводит к увеличению оптической плотности растворов

Рис. 1. Влияние УФ-облучения на спектральные свойства растворов церулоплазмина в ультрафиолетовой (а) и видимой (б) областях спектра: 1 - контроль (нативный фермент), после облучения в дозе: 151 (2), 906 (3), 1359 (4), 2265 (5), 4530 (6) Дж/м2

ЦП при 610 нм (рис. 16, кривая 2). Это может быть связано с окислением меди I типа. УФ-излучение в дозах 906 — 2265 Дж/м2 вызывает уменьшение све-топоглощения при 610 нм, индуцируя, таким образом, восстановление меди. Кроме того, изменение спектра поглощения может быть обусловлено экранированием меди первого типа. При воздействии на ЦП УФ-света в максимальной дозе 4530 Дж/м2 выявляется повышение светопоглощения во всем исследуемом диапазоне длин волн (рис. 1а, б).

С целью дальнейшего изучения УФ-индуцированных конформацион-ных изменений церулоплазмина человека нами было исследовано влияние УФ-излучения (240 + 390 нм) на гель-хроматографические свойства данного гликопротеида. Результаты экспериментов представлены в табл. 1.

Таблица 1

Величины кажущихся молекулярных масс интактного и УФ-модифицированного ЦП человека

Доза облучения, Дж/м2 Объем выхода, мл Молекулярная масса, кДа

0 11,9±0,2 123,5+3,7

151 12,0±0,1 122,5±1,1

453 12,0±0,1 122,5+1,1

906 12,2±0,2 117,4±5,0

1359 12,4±0,4 113,4±7,4

2265 13,0±0,3* 102,2+5,9*

4530 13,2+0,4* 98,2±7,2*

Растворы нативного церулоплазмина человека в условиях эксперимента элюируют из хроматографической колонки одной фракцией с кажущейся молекулярной массой 123,5±3,7 кДа. УФ-свет в дозах 151 + 1359 Дж/м2 не вызывает статистически достоверных изменений величины молекулярной массы

фракции УФ-облученного гл и коп роте и да по сравнению с контролем. Увеличение дозы УФ-излучения до 2265 и 4530 Дж/м2 приводит к достоверному уменьшению кажущейся молекулярной массы белка.

Анализ полученных нами данных позволяет сделать заключение о том, что УФ-облучение растворов церулоплазмина человека не приводит к фрагментации молекулы, так как на кривой профиля элюции имеется только один пик, соответствующий церулоглазмину. Уменьшение кажущейся молекулярной массы молекул ЦП на 23,9 % при воздействии УФ-света в дозе 4530 Дж/м2, не связано с отрывом олигосахаридных цепей от белковой глобулы, о чем свидетельствует положительная реакция на гексозы во фракциях, содержащих ЦП, и отсутствие таковой во всех остальных пробах. Следовательно, снижение величин кажущихся молекулярных масс хромате графических фракций белка, индуцированное УФ-облученисм, связано с компактиза-цией белковой глобулы.

Нами были изучены эле ктро ф оретич ее км е свойства и проведена количественная оценка фракционного состава, электрофоретической подвижности и содержания отдельных компонентов церулоплазмина человека до и после его УФ-модификации. Интактный ЦП разделяется на три белковые фракции: две минорные и одну основную. Первая и вторая фракции обладают оке и данной активностью по отношению к о-дианизидину, они были идентифицированы как холоцерулоплазмин, а третья фракция не окрашивается специфическим красителем и соответствует апобелку. Электрофореграммы нативного и УФ-модифи-цнрованного ЦП представлены на ¡шс. 2.

УФ-облучение в дозах 151 — 1359 Дж/м не приводит к достоверным изменениям электрофоретической подвижности всех трех фракций; увеличение дозы до 2265 и 4530 Дж/м1 индуцирует уменьшение скорости миграции всех фракций ЦП: ЭП первой фракции снижается на 7 %, основной — на 9 %, фракции апобелка — на 12% (табл. 2). Относительное постоянство показателя ЭП фракций церулоплазмина после воздействия широкого диапазона доз УФ-света (151 - 1359 Дж/м2) свидетельствует об устойчивости белкового компонента молекул ЦП к воздействию модифицирующего агента. Эти факты коррелируют с данными хроматограф ических исследований о постоянстве молекулярных масс белка после воздействия тех же доз УФ-радиации. Предположения о возможной компактизации белковой глобулы рИс, 2. Электрофореграмма при модификации растворов ЦП макси- препаратов церулоплазмина малыдами дозами УФ-света находят под- человека, облученных УФ-светом: тверждение в уменьшении подвижности ] . натнвный белок, 2 - 15! Дж/м'; всех фракций белка, что свидетельствует 3 . 453 дж/мг- 4 _ об уменьшений количества о трицательно ? _ Ш9 ДжД>. б . 2?65 д^ заряженных групп на поверхности белковой глобулы.

12 3 4 5 6 7

7 - 4530 Дж/м1

Таблица 2

Электрофоретические характеристики фракций нативного и УФ-облученного церулогшазмина человека

Доза облучения-, Дж/м2 1 фракция 2 фракция 3 фракция

ЭП содержание белка, % ЭП содержание белка, % ЭП содержание белка, %

0 0,56±0,01 6,7±1,2 0,45+0,01 80,7±1,3 0,24±0,01 12,6±0,7

151 0,57±0,01 7,3±2,2 0,46±0,01 80,5±1,6 0,24±0,01 12,2±1,1

453 0,55±0,01 9,3±2,7 0,44+0,02 80,2±1,4 0,22±0,02 10,5±0,6*

906 0,56±0,03 7,9±1,7 0,43±0,03 77,1±2,7 0,22±0,01 15,0±1,9

1359 0,56±0,02 7,8±0,5 0,46±0,02 78,6±2,8 0,24±0,01 13,6±1,8

2265 0,53±0,01* 5,5±0,2 0,42±0,01* 81,9±1,7 0,21±0,01* 12,6±1,6

4530 0,51±0,01* 8,4±1,4 0,41+0,01* 68,3±5,0* 0,21±0,01* 23,3±5,7*

Изменение содержания белка в электрофоретических фракциях в зависимости от дозы облучения носит сложный характер. Так, после УФ-модификации растворов ЦП в дозе 453 Дж/м2 наблюдается статистически достоверное снижение процентного содержания белка во фракции апоцеру-лоплазмина. Максимальная доза УФ-излучения (4530 Дж/м2) способствует переходу части белка из основной фракции в третью: содержание белка во второй фракции составляет -68 %, а во фракции апоЦП -23 % (для нативного ЦП ~81 и 13 % соответственно), изменения содержания белка в первой минорной фракции недостоверны.

УФ-излучение всего исследуемого диапазона доз не приводит к достоверным изменениям ширины полос электрофоретических фракций церуло-плазмина человека.

Зарегистрированные УФ-индуцированные изменения структуры молекулы ЦП позволяют высказать предположение о возможных перестройках в микроокружении активного центра фермента, приводящих к изменению функциональной активности вследствие затруднения конформационных взаимодействий субстрата (донора электронов) и атомов меди в составе активного центра.

Нами изучено влияние интегрального потока УФ-света (240-390 нм) в дозах 151 -^4530 Дж/м2 на функциональные свойства раствора ЦП при его концентрации в реакционной смеси 3-Ю"6 моль/л (что примерно соответствует содержанию данного гликопротеида в крови человека). При действии на ЦП ультрафиолетового света в минимальной дозе выявлено повышение окси-дазной активности фермента на 3,4 %, однако с ростом дозы облучения активность понижалась (рис. 3, кривая 2). Известно, что ЦП является высоко стабильным к действию радиации белком (А.И. Ярополов, 1986). Это подтверждается и нашими результатами: УФ-свет в дозе 2265 Дж/м2 приводит к снижению оксидазной активности только на 16,7 %. При дальнейшем увеличении дозы до 4530 Дж/м2 фермент теряет 49,8 % своей активности.

Полученные данные согласуются с приведенными выше изменениями спектральных свойств растворов ЦП. По-видимому, снижение активности гликопротеида при воздействии на его образцы УФ-излучения в дозах 906 - 2265 Дж/м2 связано в основном с восстановлением меди. При действии

ультрафиолетового света в максимальной дозе значительный вклад в процесс фотоинактивации фермента вносят конформационные перестройки молекулы белка.

Кинетические зависимости окисления о-фенилендиамина как на-тивным, так и УФ-облученным ферментом не подчиняются уравнению Михаэлиса-Ментен. Не наблюдается линеаризации в двойных обратных координатах Лайнуивера-Берка и координатах Иди-Хофсти. Происходит менее резкий выход скорости ферментативной реакции на предельное значение с ростом концентрации субстрата по сравнению с гиперболической кривой классической кинетики Михаэлиса, это может указывать на отрицательную кинетическую коопе-ративность активных центров ЦП.

Изучение зависимости супероксиддисмутазной активности растворов церулоплазмина (3-10"5 моль/л) от дозы облучения показало, что воздействие УФ-света приводит к повышению активности фермента во всем исследуемом диапазоне доз (рис. 3, кривая 1). УФ-излучение в дозе 2265 Дж/м2 индуцирует увеличение СОД-активности ЦП на 70,2 %. Приведенные данные позволяют высказать предположение, что "голубой" ион меди в домене 4 (Си 1В), не входящий в состав активного центра, также может осуществлять реакцию дисмутации супероксидных радикалов. По-видимому, УФ-индуцированные конформационные перестройки молекулы белка приводят к облегчению контакта супероксидных радикалов и ионов меди I типа как в домене 6, так и домене 4, а также, возможно, к усилению взаимодействия между компонентами цепи переноса электронов, что приводит к повышению супероксиддисмутазной активности фотомодифицированного ЦП.

Изучение супероксиддисмутазной активности плазмы крови при ее облучении выявило неоднонаправленность действия УФ-света, в связи с чем доноры были разделены на две группы: у первой группы (7 человек) не наблюдалось достоверных изменений исследуемого показателя; у второй (8 человек) отмечалось дозозависимое изменение СОД-активности. Воздействие УФ-излучения приводило к повышению антиоксидантной активности во всем исследуемом диапазоне доз; максимальное увеличение исследуемого параметра наблюдалось при дозе 1359 Дж/м2 и составляло 12,8 %. Следующая серия экспериментов была направлена на изучение изменения активности анти-оксидантной системы плазмы при УФ-облучении цельной крови. Для исследований также была взята кровь 15 доноров, достоверные изменения СОД-активности плазмы обнаружены у 7 из них. Повышение активности наблюдалось в диапазоне доз 453 - 2265 Дж/м2, при этом максимальный уровень фо-

Рис. 3. Изменение функциональной активности церулоплазмина при УФ-облучении его растворов

1 - супероксиддисмутазная активность

2 - оксидазная активность

тоактивации отмечался после УФ-модификации в дозах 906 и 1359 Дж/м2 и составлял ~ 7 %.

Известно, что основным антиоксидантом плазмы, проявляющим как неспецифическую, так и специфическую антио кем да! ггную активность (элиминирование супероксидных радикалов), является дерулоплазмин. Меньшая эффективность действия УФ-света на С ОД-активность плазмы крови по сравнению с растворами очищенного церул о плазм и н а связана со сложностью и многокомпонентностью изучаемого объекта; по-видимому, наблюдается "экранирование" церул оплазмина от ультрафиолетового излучения белками плазмы, в случае облучения цельной крови определенный вклад в этот процесс вносят ее форменные элементы.

ГЛАВА 5, Проявление защитных свойств церул о плаз ми на но

отношению к лимфоцитам и его модификация аскорбиновой кислотой в условиях УФ-о б л учения

Биологические эффекты действия УФ-излучения на клетку в значительной степени обусловлены процессами структурной трансформации биомембран, а также протекающими в них процессами ПФОЛ.

Нами выявлено, что инкубация лимфоцитов с ЦП приводит к снижению естественной персксидазной активности (ЕПА) клеток на 27,3 %. После УФ-облучения суспензии лимфоцитов наблюдается достоверное увеличение их пероксидазной активности при всех исследуемых дозах в среднем на -12% (рис.4). Изменение исследуемого параметра при фотомодификации лимфоцитов связано, в первую очередь, с активацией ферментов, обладающих пероксидазной активностью. По всей видимости, фотоактивация данных ферментов является следствием изменения мнкроокружения их молекул в результате интенсификации процессов пероксидно-го окисления липидов на мембранах лимфоцитов. При фотомодификации лимфоцитов, инкубированных с ЦП, изменеиия функциональных свойств носят аналогичный характер: перокси-дазная акта вноси, клеток повышается на 19,6; 19,1; 20,4; 17,6 и 12,9 % соответственно при дозах УФ-облучения 151, 453, 906, 1359 и 2265 Дж/м3. Таким образом, лимфоциты, предварительно инкубированные с церуло-плазмином, более фотолабильны гго критерию ЕПА: данный па- естественную перокешшзмую активность раметр повышается в большей лимфоцитов: степени при фотсмодифнкации I I - лимфоциты; клеток. СИ] лимфоциты, инкубированные с ЦП

1 ч- л» -

1,0

0,8

0,6

0,4 0,2

0 151 453 906 13592265 Дж/м2 Рис. 4. Влияние УФ-света на

л!,

В связи с тем, что ЦП является основным ферментом плазмы крови, проявляющим СОД-активность, а также имеющимся в литературе сведениям о его взаимодействии с лимфоцитарными мембранами (О.Ф. Сенюк с соавт., 1994), мы исследовали влияние ЦП на уровень ПОЛ мембран лимфоцитов.

Выявлено, что инкубация лимфоцитов с церулоплазмином приводит к понижению уровня ПОЛ мембран клеток на 95,6 %. После УФ-облучения суспензии лимфоцитов, инкубированных с ЦП, происходит снижение уровня ПОЛ при всех исследуемых дозах (151, 453, 906, 1359 и 2265 Дж/м2) на 90,5; 82,2; 80,4; 78,0 и 65,5 % соответственно (рис. 5). При помощи теста с трипа-новым синим мы определили жизнеспособность лимфоцитов после их инкубации с ЦП. Действие всего диапазона доз УФ-излучения на лимфоциты (как инкубированные с ЦП, так и нативные) не приводит к гибели клеток, жизнеспособность остается в пределах 98+0,5 % и статистически достоверно не отличается от интактной системы.

Таким образом, нами было показано, что инкубация церулоплазмина с лимфоцитами приводит к уменьшению продукции АФК, а, следовательно, к ослаблению процессов ПОЛ, снижению перокси-дазной активности мембран. Эти данные необходимо принимать во внимание при проведении АУФОК, так как при УФ-облучении именно накопление АФК и инициация ПОЛ являются основными процессами, влияющими на структурно-функциональное состояние биомембран клеток.

Аскорбиновая кислота (АК) - наиболее важный низкомолекулярный ан-тиоксидант плазмы крови, необходимый компонент всех тканей и клеток живых организмов, где она поддерживает на низком стационарном уровне сво-боднорадикальные автоокислительные процессы.

В связи с тем, что АК и ЦП проявляют сходные функции в антиокси-дантной защите организма, и возможно их сочетанное применение в медицинской практике, нами были исследованы спектральные свойства нативного и УФ-облученного церулоплазмина в присутствии аскорбиновой кислоты в концентрации 7,5-Ю"5 моль/л, которая соответствует физиологическому диапазону. Результаты экспериментов свидетельствуют о сложном характере взаимодействия между ЦП и АК.

Нами было исследовано влияние аскорбиновой кислоты на нативный и УФ-облученный (151-И530 Дж/м2) белок. Аскорбиновая кислота способствует обратимому восстановлению Си I типа: сразу после добавления АК проис-

,% 35 30 25 20 15 10 5 0

0 151 453 906 1359 2265 Дж/м" Рис. 5. Влияние церулоплазмина на уровень пероксидного окисления липидов в мембранах лимфоцитов при УФ-облучении: за 100 % принимали уровень пероксидного окисления липидов в интактных клетках

ходит снижение оптической плотности в максимуме поглощения Cul типа (610 нм), что указывает на восстановление Си2+ до Си+; затем наблюдается возрастание Déio, свидетельствующее о протекании обратного процесса - рео-кисления Си+ до Си2+.

Воздействие УФ-света (151 и 2265 Дж/м2) на ЦП, предварительно инкубированный с АК в течение одного часа, не вызывает достоверного изменения оптической плотности в максимуме, обусловленном белковой частью молекулы, по сравнению с необлученным ЦП, модифицированным аскорбиновой кислотой. Повышение дозы облучения до 4530 Дж/м2 приводит к снижению оптической плотности. Таким образом, аскорбиновая кислота препятствует УФ-индуцированным конформационным перестройкам белковой глобулы под влиянием УФ-света, зарегистрированным ранее (см. рис. 1).

УФ-облучение ЦП, модифицированного аскорбиновой кислотой, приводит к частичному восстановлению меди при действии максимальных доз УФ-света (оптическая плотность растворов ЦП в максимуме при 610 нм снижается на 4,6 и 11,7%). Это указывает на фотопротекторные свойства АК, выраженные в случае ее предварительной инкубации с белком.

ГЛАВА 6. Изменение структурно-функциональных свойств церулоплазмина при действии лазерного излучения

Наши дальнейшие исследования были посвящены изучению спектральных характеристик растворов церулоплазмина человека, облученных светом He-Ne лазера (632,8 нм). Это излучение может быть воспринято неорганическим компонентом церулоплазмина, а именно медью I типа, имеющей широкую полосу поглощения с максимумом при 610 нм. Однако приведенные ниже экспериментальные данные указывают на изменения не только в активном центре фермента, что свидетельствует о факте реализации энергии поглощенных квантов в определенных участках апобелка.

Нами исследованы спектральные свойства растворов ЦП, подвергнутых воздействию излучения гелий-неонового лазера. При действии лазерного излучения выявляется сложный характер зависимости оптической плотности в максимумах светопоглощения белка от времени экспозиции (рис. 6).

Так, при облучении растворов фермента в течение 1; 5 и 30 мин наблюдается повышение светопоглощения во всем исследуемом диапазоне длин волн. Это связано, вероятно, с разворачиванием белковой глобулы и экспонированием хромофоров ароматических аминокислот в растворитель; в процесс роста оптической плотности в максимуме поглощения меди 1типа определенный вклад вносит реакция реокисления металла. Облучение ЦП в течение 10 мин приводит к возрастанию оптической плотности в максимуме поглощения только белковой части фермента. При увеличении времени экспозиции до 20 мин спектр поглощения в УФ-области идентичен характерному для на-тивного состояния белка, что говорит об обратимости процессов конформа-ционных перестроек молекул гликопротеида. Значения оптической плотности ЦП при данной экспозиции в максимуме светопоглощения при 610 нм оказались выше контрольных значений на 8,3 %, что обусловлено в первую очередь окислением меди.

Рис. 6. Влияние излучения Не-№ лазера на спектральные свойства растворов церулоплазмина в ультрафиолетовой (а) и видимой (б) областях спектра: I - нативный фермент, после облучения в течение 1 (2), 5 (3), 10 (4), 20 (5), 30 (6) мин

Таким образом, экспериментальные данные свидетельствуют об изменениях не только в активном центре, но и во всей молекуле фермента. По-видимому, фотомодификация активного центра ЦП вызывает обратимые конформационные изменения апобелка, находящие отражение в состоянии определенных аминокислот, в том числе ароматических.

Следующим этапом исследования структурных свойств церулоплазмина человека, модифицированного излучением гелий-неонового лазера, было изучение гель-хроматографических характеристик белка. В табл. 3 приведены значения объема выхода ЦП и величины кажущихся молекулярных масс ЦП после действия лазерного излучения. Из полученных данных следует, что при воздействии модифицирующего агента на растворы церулоплазмина процессы ассоциации и фрагментации его молекул не выявляются.

Таблица 3

Величины кажущихся молекулярных масс интактного и модифицированного лазерным излучением церулоплазмина человека

Время экспозиции, мин Объем выхода фракции, мл Молекулярная масса, кДа

0 11,9±0,2 123,5+3,7

1 11,4±0,4 135,8+8,8

5 10,910,2* 149,3±7,4*

10 11,4±0,2* 136,2±6,1*

20 11,7±0,4 128,7+9,3

30 11,3±0,2* 138,1±6,0*

60 12,0±0,4 121,9±8,8

Исследование влияния лазерного излучения на величину молекулярной массы ЦП подтверждает факт разворачивания белковой глобулы: при 5-ти, 10-ти и 30-ти минутной экспозиции наблюдается увеличение кажущейся молекулярной массы гликопротеида на 9,7; 4,4 и 5 % соответственно (табл. 3).

Результатом этого процесса является выход дополнительных хромофорных групп на поверхность молекулы, что приводит к увеличению оптической плотности в максимуме поглощения при 278 нм (см. рис. 6а).

Фотоиндуцированные изменения хроматографических и спектральных свойств ЦП коррелируют друг с другом и указывают на обратимый характер внутримолекулярных процессов разворачивания (облучение в течение 5, 10 и 30 мин) и сворачивания (1, 20 и 60 мин) белковой глобулы.

. Для расширения представлений о структурных превращениях молекул ЦП при воздействии лазерного излучения нами были изучены элекгрофоре-тические характеристики фотомодифицированного белка. После облучения ЦП светом лазера в течение 1 + 60 мин количество фракций не изменялось, оставаясь равным трем. При 10-ти и 30-ти минутной экспозиции наблюдалось достоверное снижение содержания белка в основной элекгрофоретической фракции на 3,4 и 6,4 % соответственно (табл. 4). Первая фракция оказалась наиболее стабильной: содержание белка в ней уменьшалось только после 5-ти минутной экспозиции.

Таблица 4

Электрофоретические характеристики церулоплазмина человека, модифицированного лазерным излучением

Время экспозиции, мин 1 фракция 2 фракция 3 фракция

ЭП содержание белка, % ЭП содержание белка, % ЭП содержание белка, %

0 0,56±0,01 6,7±1,2 0,45+0,01 80,7±1,3 0,24±0,01 12,6±0,7

1 0,54+0,01 3,5±2,5 0,43+0,01 83,4±2,7 0,22±0,01 13,1±0,5

5 0,54+0,02 2,7+1,4* 0,42+0,01* 80,9±1,4 0,23±0,01 16,4±2,4*

10 0,52±0,01* 4,9±2,7 0,42±0,01* 77,3±1,9* 0,22±0,01 17,8±1,3*

20 0,55+0,01 7,2+2,4 0,43±0,01 78,2±1,3 0,22±0,02 14,6±1,8

30 0,55±0,01 6,4+1,5 0,43±0,01 74,4±2,7* 0,23±0,01 19,2±3,0*

60 0,53+0,01* 4,0±1,9 0,42±0,0Н 81,4±3,05 0,22±0,01 14,6±1,9

В третьей, самой медленной, фракции, соответствующей апоЦП, после действия излучения He-Ne лазера в течение 5, 10 и 30 мин наблюдалось повышение содержания белка на 3,8; 5,2 и 6,6 %, что говорит о потере холоце-рулоплазмином меди и переходом части молекул белка в форму апоЦП. В литературе имеются сведения о том, что при образовании апоЦП наблюдается разворачивание белковой глобулы вследствие разрыва водородных связей между доменами 1 и 6 (P. Vachette et al., 2002). При исследовании спектральных характеристик выявлено увеличение оптической плотности растворов ЦП в максимуме светопоглощения при 278 нм после воздействия лазерного излучения в течение 1, 5, 10 и 30 мин (см. рис. 6а); можно предположить, что повышение экстинкции обусловлено тем, что в области контактов пар доменов находятся 5 остатков триптофана и 19 тирозина, и вероятен процесс экспонирования части из них в растворитель.

Электрофоретическая подвижность фракции апобелка не изменяется, наблюдается уменьшение подвижности обеих фракций холоЦП после 10-ти и

60-ти минутной экспозиции на 7 и 5 % для минорной, и на 7 и 7 % для основной фракции соответственно; 5-ти минутное облучение также снижает ЭП второй фракции на 7 %. Эти изменения обусловлены, по-видимому, уменьшением общего отрицательного заряда белковой глобулы вследствие кон-формационных перестроек молекул ЦП.

Таким образом, описанные экспериментальные данные свидетельствуют об изменениях структуры фермента, что указывает на факт реализации энергии квантов, поглощенных ионами меди, в определенных участках апо-белка в составе молекулы ЦП.

В последние годы все чаще появляются работы об успешном использовании гелий-неонового лазера в медицине. Применение облучения крови в клинической практике требует углубленного изучения механизмов фотобиологических эффектов с целью оптимизации выбора интенсивности излучения, дозы и количества сеансов облучения. В связи с этим представляется важным изучить влияние различных доз облучения света Не-Ые лазера на функциональную активность одного из важных звеньев антиоксидантной защиты — церулоплазмина.

Воздействие гелий-неонового лазера на образцы индуцирует незначительное повышение оксидазной активности церулоплазмина, носящее сложный характер (рис. 7а). После облучения в течение 1 и 5 мин отмечено достоверное увеличение активности фермента на 3,0 и 4,4 % соответственно, воздействие лазерного излучения в течение 10 мин не приводит к изменению данного параметра. Напомним, что после 10 мин облучения спектральные свойства растворов фермента в видимой части спектра также не изменяются. Максимальный уровень оксидазной активности церулоплазмина (дА=5,9 %) наблюдается именно после модификации растворов фермента лазерным излучением в течение 20 мин; именно после воздействия данной дозы отмечает-

А, ед.

0,213 •

0,207 -

0,201

0,195

А, ед.

Рис. 7. Действие излучения Не-Ые лазера на оксидазную (а) и супероксиддисмутазную (б) активности растворов церулоплазмина: 1 - контроль (нативный фермент); действие лазерного излучения в течение 1 (2 ), 5 (3), 10 (4), 20 (5) и 30 (6) мин

ся максимальное увеличение оптической плотности растворов ЦП в видимой области спектра, свидетельствующее о процессах окисления меди в составе активного центра (см. рис. бб, кривая 5). Динамика изменения супероксид-дисмутазной активности ЦП носит аналогичный характер (рис. 76), однако ее повышение более значительно: при действии излучения гелий-неонового лазера в течение I; 5; 20 и 30 мин отмечается возрастание активности на 40,5; 48,9; 63,1 и 46,5 % соответственно. При 10-минутной экспозиции суперок-сиддисмутазная активность ЦП увеличивалась на 15,0 % по сравнению с на-тивным белком.

Анализ изменения функциональной активности, а также спектральных свойств растворов церулоплазмина, модифицированных лазерным излучением, позволяет высказать предположение, что повышение оксидазной и СОД-активности ЦП под влиянием лазерного излучения происходит, по всей вероятности, в результате процесса окисления меди, хотя изменение конфор-мации молекул белка также вносит определенный вклад в модификацию функциональной активности церулоплазмина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С помощью методов спектрофотометрии, гель-хроматографии, вертикального диск-электрофореза, определения ферментативной активности изучено действие УФ-излучения (240-390 нм, 151+4530 Дж/м2) и низкоинтенсивного лазерного излучения (632,8 нм) на структурно-функциональные свойства церулоплазмина человека; использование методов люминолзависимой хе-милюминесценции и определения пероксидазной активности позволило исследовать влияние УФ-света и церулоплазмина на состояние мембран лимфоцитов крови доноров, изучено сочетанное действие УФ-излучения и аскорбиновой кислоты на спектральные характеристики церулоплазмина.

На основании собственных экспериментальных и литературных данных нами предложена схема возможных процессов в молекуле церулоплазмина, приводящих к изменению структуры и основных функциональных свойств гликопротеида при его фотомодификации УФ-светом и низкоинтенсивным лазерным излучением (рис. 8).

УФ-излучение с длиной волны 240-390 нм, поглощаемое белковым компонентом молекул, индуцирует конформационные перестройки как в апо-белке, так и в активном центре ЦП. Данные изменения приводят к модификации функциональной активности гликопротеида— повышению супероксид-дисмутазной и неоднонаправленным изменениям оксидазной активностей. Сольватированный электрон, "выбитый" из ароматической аминокислоты, может участвовать во многих фотохимических реакциях. Вышеуказанные процессы описаны в некоторых схемах фотохимических превращений белков (В.Г. Артюхов, 1995; Ю.А. Владимиров, А.Я. Потапенко, 1989; C.B. Конев, И.Д. Волотовский, 1979). Анализ спектральных данных (рис. 16, кривые 3-5) свидетельствует о процессе восстановления меди, в котором, по всей вероятности, могут участвовать сольватированные электроны. В литературе имеются данные о том, что Тгр-669, находящийся на поверхности домена 4, играет важную роль в связывании субстратов (биогенных аминов) и дальнейшем переносе электронов к Си IA или Си IB (V.N. Zaitsev et al., 1999). УФ-индуциро-

Рис. 8. Схема возможных фотофизических и фотохимических процессов, протекающих в молекуле церулоплазмина

ванное снижение оксидазной активности может быть вызвано конформаци-онными изменениями белковой части фермента, приводящими, по-видимому, к ухудшению связывания доноров электронов с Тгр-669 и нарушениям в цепи переноса электронов к активному центру церулоплазмина.

Нами также высказано предположение, что в повышении супероксид-дисмутазной активности церулоплазмина, модифицированного УФ-излучением, значительную роль играют изменения в апобелке, приводящие к усилению взаимодействия иона Си 1В, не входящего в состав активного центра, с супероксидными радикалами.

Излучение гелий-неонового лазера (632,8 нм), поглощаемое медью в составе ЦП, вызывает повышение функциональной активности белка. Это происходит, на наш взгляд, двумя путями: непосредственно за счет реокисле-ния меди и в результате изменения конформации активного центра. Кроме того, фотомодификация активного центра белка вызывает, вероятно, локальные конформационные превращения в апобелке, приводящие к изменению окружения второго "голубого" иона, который вносит определенный вклад в повышение супероксидцисмутазной активности ЦП.

Нами показано, что добавление аскорбиновой кислоты к нативному и предварительно облученному УФ-светом церулоплазмину способствует обратимому восстановлению меди I типа. Этот процесс, как известно, имеет место при функционировании ЦП в качестве оксидазы; донором электронов, вызывающих восстановление меди, служит аскорбат, окисляющийся до дегидроа-скорбата. Фотопротекторные свойства АК более выражены в случае предварительной инкубации с белком: УФ-облучение ЦП, модифицированного аскорбиновой кислотой, приводит к незначительному восстановлению меди только при действии максимальных доз УФ-света. Этот защитный эффект мы связываем именно с накоплением в растворе продукта оксидазной реакции церулоплазмина— дегидроаскорбата — формы АК, проявляющей антиокси-дантные свойства. Однако, перенося данный процесс на целостный организм, необходимо учитывать тот факт, что в плазме обнаруживается очень низкая концентрация дегидроаскорбата, это связано с высокой активностью клеточных механизмов восстановления аскорбиновой кислоты.

Нами исследовано сочетанное влияние церулоплазмина и УФ-излуче-ния на состояние мембран лимфоцитов крови человека. Показано, что инкубация ЦП с лимфоцитами приводит к уменьшению продукции активных форм кислорода, а, следовательно, к ослаблению процессов ПОЛ, снижению пероксидазной активности мембран и внутриклеточной СОД-активности. Это необходимо принимать во внимание при проведении курсов АУФОК, так как именно накопление АФК и инициация пероксидного окисления липидов являются основными процессами, влияющими на структурно-функциональное состояние биомембран клеток при УФ-облучении. Нами продемонстрировано защитное действие церулоплазмина на лимфоцитарные мембраны в условиях УФ-облучения. Для фотомодифицированных клеток, предварительно инкубированных с ЦП, характерно снижение продукции АФК, уменьшение пероксидазной активности мембран, и, как следствие, ослабление процессов ПФОЛ; при этом не наблюдается снижения жизнеспособности лимфоцитов.

Полученные данные способствуют установлению закономерностей действия низкоинтенсивного лазерного и ультрафиолетового излучений на сложные белковые системы, которые могут бьггь использованы для объяснения механизмов клинического эффекта применения церулоплазмина в качестве лекарственного препарата, а также АУФОК и ЭЛОК.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что УФ-облучение в диапазоне доз (151 + 4530 Дж/м2) вызывает модификацию спектральных свойств церулоплазмина человека: происходит обратимое экспонирование хромофоров ароматических аминокислот в растворитель, Си I типа подвергается процессам восстановления и реокисления.

2. Обнаружено, что УФ-облучение растворов церулоплазмина в дозах 2265 и 4530 Дж/м2 приводит к уменьшению кажущейся молекулярной массы белка на 18 и 20 % соответственно. Это изменение не связано с отрывом углеводного компонента церулоплазмина, кроме того, не обнаружены белковые фрагменты, свидетельствующие о разрывах связей в полипегггад-ной цепи, то есть УФ-свет индуцирует компактизацию белковой глобулы.

3. Исследование электрофоретических свойств показало, что церу-лоплазмин разделяется на три белковые фракции. Первая и вторая фракции были идентифицированы как холоцерулоплазмин, а третья фракция соответствует апобелку. УФ-облучение в дозах 151 ■*■ 1359 Дж/м2 не приводит к изменениям электрофоретической подвижности всех трех фракций; увеличение дозы до 2265 и 4530 Дж/м2 вызывает уменьшение ее у всех фракций.

4. Обнаружен эффект фотоактивации церулоплазмина: УФ-свет (151 4530 Дж/м ) вызывает увеличение супероксиддисмутазной активности белка; минимальная доза УФ-излучения (151 Дж/м2) приводит к повышению оксидазной активности церулоплазмина.

5. Установлено, что инкубация лимфоцитов с церулоплазмином индуцирует понижение уровня ПОЛ мембран клеток на 95,6 %, при увеличении дозы УФ-света защитный эффект фермента уменьшается.

6. Выявлено, что инкубация лимфоцитов с церулоплазмином приводит к снижению естественной пероксидазной активности клеток на 27 %. УФ-облучение суспензий интактных и инкубированных с церулоплазмином лимфоцитов вызывает увеличение их пероксидазной активности при всех исследуемых дозах УФ-излучения.

7. Воздействие аскорбиновой кислоты на нативный и предварительно облученный УФ-светом в дозах 151 —4530 Дж/м2 церулоплазмин способствует обратимому восстановлению ионов Си I типа. Предварительная инкубация церулоплазмина с аскорбиновой кислотой способствует проявлению последней фотопротекторных свойств.

8. Установлено, что после облучения растворов фермента низкоинтенсивным лазерным излучением (632,8 нм) в течение 1; 5 и 30 мин наблюдается повышение светопоглощения в максимумах как ультрафиолетовой, так и видимой части спектра, связанное с экспонированием хромофоров ароматических аминокислот в растворитель и реакцией реокисления меди.

9. Воздействие лазерного излучения в течение 5, 10 и 30 мин приводит к увеличению кажущейся молекулярной массы церулоплазмина на 9,7; 4,4 и 5 % соответственно, данный параметр не изменяется при действии излучения в течение 1, 20 и 60 мин, что свидетельствует об обратимости процессов сворачивания и разворачивания молекулы гликопротеида.

10. При облучении церулоплазмина светом лазера в течение 5, 10 и 30 мин зарегистрировано увеличение содержания белка в электрофоретиче-ской фракции, соответствующей апоцерулоплазмину, что указывает на выход Си I типа из состава молекулы церулоплазмина.

11. Воздействие излучения гелий-неонового лазера приводит к повышению функциональной (оксидазной и супероксиддисмутазной) активности церулоплазмина, при этом более фотолабильной оказалась супероксид-дисмутазная активность, увеличение которой составило 15 63 % в зависимости от времени действия лазерного луча.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние ультрафиолетового излучения на спектральные и функциональные свойства церулоплазмина человека / В.Г. Артюхов, О.В. Башарина, H.A. Добротина, C.B. Рязанцев // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: Межрегиональный сборник научных работ. Выпуск 2. - Воронеж: ВГУ, 2000. - С. 16-22.

2. Спектральные свойства церулоплазмина человека, облученного излучением гелий-неонового лазера / В.Г. Артюхов, C.B. Рязанцев, О.В. Башарина, H.A. Добротина // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: Межрегиональный сборник научных работ. Выпуск 3. - Воронеж: ВГУ, 2001. - С. 17-20.

3. Действие лазерного и ультрафиолетового излучений на функциональную активность церулоплазмина человека / В.Г. Артюхов, C.B. Рязанцев, О.В. Башарина, H.A. Добротина // Матер. IV съезда по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность). -Москва, 20-24 ноября 2001.-Т. З.-С. 801.

4. Действие низкоинтенсивного лазерного (632,8 нм) и ультрафиолетового излучений на спектральные свойства и функциональную активность церулоплазмина человека / В.Г. Артюхов, О.В. Башарина, H.A. Добротина, C.B. Рязанцев // Радиационная биология. Радиоэкология. — 2002. — Т. 42, №2.-С. 188-195.

5. Влияние ультрафиолетового излучения на некоторые показатели ан-тиоксидантной системы крови / В.Г. Артюхов, О.В. Башарина,

B.В. Гусинская, Е.А. Рамильцева, C.B. Рязанцев // Циклы природы и общества. Матер. IV междунар. конф. - Ставрополь, 21-29 октября 2002. — Ч. 4. —

C. 23-28.

6. Рязанцев C.B. Влияние церулоплазмина и УФ-излучения на перокси-дазную активность лимфоцитов человека / C.B. Рязанцев, В.Г. Артюхов, О.В. Башарина // III Международный Конгресс "Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине". — Санкт-Петербург, 1-4 июля 2003. — T. 1.-С. 60-61.

7. Рязанцев C.B. Влияние церулоплазмина и УФ-излучения на уровень пероксидного окисления липидов мембран лимфоцитов человека / C.B. Рязанцев // 7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века". - Пущино, 14-18 апреля 2003. - С. 73.

8. Гель-хроматографические свойства церулоплазмина человека, модифицированного УФ-излучением / C.B. Рязанцев, В.Г. Артюхов, О.В. Башарина, М.В. Брагин // Матер, междисциплинарной конф. с междунар. участием "Новые биокибернетические и телемедицинские технологии 21 века для диагностики и лечения заболеваний человека". — Петрозаводск, 2325 июня 2003.-С. 72.

9. Анализ действия излучения He-Ne лазера на структурные свойства церулоплазмина человека / C.B. Рязанцев, О.В. Башарина, М.В. Брагин, В.Г. Артюхов // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. №2. - 2003. - С. 172-174.

10. Рязанцев C.B. Изучение влияния излучения He-Ne лазера на элек-трофоретические свойства церулоплазмина человека / C.B. Рязанцев, О.В. Башарина, М.В. Брагин // III съезд биофизиков России — Воронеж, 24-29 июня 2004. - Т. 1. - С. 97-98.

Статьи №4, 9 опубликованы в изданиях, соответствующих списку ВАК РФ.

Тираж 100 экз. Заказ № 164. Объем 1,5 п.л. Формат 60х84'/1б.

Отпечатано в типографии ИПЦ ВГУ

с готового оригинала-макета 394000, г. Воронеж, ул. Пушкинская, 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рязанцев, Сергей Вячеславович

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Церулоплазмин: строение и функции

1.1. Структура молекулы церулоплазмина

1.2. Функции церулоплазмина, его физиологическая роль

ГЛАВА 2. Современные представления о механизмах действия оптического излучения на биосистемы

2.1. Влияние УФ-излучения на белковые макромолекулы и имунокомпетентные клетки

2.2. Воздействие лазерного излучения на биообъекты

ГЛАВА 3. Объекты и методы исследования

3.1. Объекты исследования

3.2. Методы исследования

3.2.1. Лазерное облучение исследуемых образцов

3.2.2. Облучение объектов ультрафиолетовым излучением

3.2.3. Регистрация электронных спектров поглощения растворов церулоплазмина человека

3.2.4. Методика проведения гель-фильтрации

3.2.5. Методика проведения качественной реакции на гексозы

3.2.6. Методика проведения электрофореза

3.2.7. Хемилюминесцентный метод определения супероксиддисмутазной активности плазмы крови

3.2.8. Методика дефибринирования крови

3.2.9. Получение лимфоцитов

3.2.10. Определение чистоты клеточных суспензий 59 3.2.И. Определение жизнеспособности лимфоидных клеток 60 3.2.12. Метод люминолзависимой хемилюминесценции

3.2.13. Определение естественной пероксндазной активности лимфоцитов

3.2.14. Определение оксидазной активности растворов церулоплазмина

3.2.15. Определение ферроксидазной активности церулоплазмина в плазме крови

3.2.16. Определение супероксиддисмутазной активности церулоплазмина

3.2.17. Определение ферментативной активности каталазы и супероксиддисмутазы эритроцитов крови человека

3.2.18. Статистическая обработка результатов 67 РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 4. Влияние УФ-излучения на структурные характеристики и функциональные свойства молекул церулоплазмина человека

4.1. Влияние УФ-излучения на спектральные свойства растворов церулоплазмина

4.2. Гель-хроматографические свойства церулоплазмина человека, модифицированного УФ-излучением

4.3. Электрофоретические свойства нативного и УФ-облученного церулоплазмина человека

4.4. Активность церулоплазмина в норме и при патологии (гломерулонефрит)

4.5. Воздействие УФ-света на функциональные свойства церулоплазмина и кинетику оксидазной реакции

4.6. Влияние УФ-облучения на супероксиддисмутазную активность плазмы крови

ГЛАВА 5. Проявление защитных свойств церулоплазмина по отношению к лимфоцитам и его модификация аскорбиновой кислотой в условиях УФ-облучения

5.1. Проявление лимфоцитами естественной пероксидазной активности в условиях УФ-облучения

5.2. Влияние церулоплазмина на уровень ПОЛ в мембранах нативных и УФ-модифицированных лимфоцитов

5.3. Сочетанное действие УФ-излучения и аскорбиновой кислоты на спектральные свойства церулоплазмина человека

ГЛАВА 6. Изменение структурно-функциональных свойств церулоплазмина при действии лазерного излучения

6.1. Спектральные характеристики растворов церулоплазмина, модифицированного излучением гелий-неонового лазера

6.2. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на гель-хроматографические свойства церулоплазмина человека

6.3. Действие излучения гелий-неонового лазера на электрофоретические характеристики церулоплазмина

6.4. Действие излучения гелий-неонового лазера на функциональную активность церулоплазмина 120 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 124 ВЫВОДЫ 128 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

1ХЛ - интенсивность хемилюминесценции

АМК - активные метаболиты кислорода

АОС - антиоксидантная система

АУФОК - аутотрансфузия УФ-облученной крови

АФК - активные формы кислорода

ВЛОК - внутривенное лазерное облучение крови

ВПМС - внешний примембранный слой

ЕПА - естественная пероксидазная активность

КУФ - коротковолновое УФ-излучение

ЛПНП - липопротеиды низкой плотности

НИЛИ - низкоинтенсивное лазерное излучение

НСТ - нитросиний тетразолиевый

ПОЛ - пероксидное окисление липидов

ПФО - пероксидное фотоокисление

СОД - супероксиддисмутаза

ТМБ - тетраметилбензидин

УФОК - ультрафиолетовое облучение крови

УФ-свет - ультрафиолетовый свет

ХЛ - хемилюминесценция

ЦП - церулоплазмин

ЭЛОК - эндоваскулярное лазерное облучение крови ЭП - электрофоретическая подвижность

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ структурно-функциональных изменений церулоплазмина человека в растворе и в составе крови при действии УФ- и лазерного излучений"

К настоящему времени накоплены экспериментальные данные о влиянии на биообъекты различных диапазонов длин волн электромагнитных излучений. Для терапевтических целей в основном используют НИЛИ с длинами волн 632 нм и 830-888 нм, которое дают гелий-неоновые и углекислот-ные лазеры. Низкоинтенсивное лазерное излучение не вызывает видимых деструктивных изменений в тканях, однако, поглощаясь биологическими структурами, оказывает на них фотохимическое действие. Разнообразные биологические эффекты, проявляющиеся при действии НИЛИ на молекулярном, клеточном, тканевом и организменном уровнях, обусловливают широкий диапазон медицинских эффектов: противоотечный, противовоспалительный, обезболивающий, бактерицидный, иммуномодулирующий и др. [48, 55, 66]. Биологический эффект связан в первую очередь с акцепцией квантов света ферментами, имеющими в составе металлосодержащие про-стетические группы. Акцепторами НИЛИ, запускающими клеточный ответ, являются церулоплазмин, супероксиддисмутаза [17, 31, 103], каталаза, глута-тионпероксидаза, дегидрогеназы, фосфатазы и др. [13,44, 106, 158].

Аутотрансфузия УФ-облученной крови в настоящее время также широко используется при лечении гнойно-септических, сердечно-сосудистых и других заболеваний [51]. При проведении экспериментальных и клинических исследований выявлен противовоспалительный, дезинтоксикационный, иммуномодулирующий эффект действия УФ-света [83, 93], его роль в структурно-функциональных модификациях ферментов антиоксидантной системы защиты организма: супероксиддисмутазы, каталазы, пероксидазы и др. [4, 10, 76].

Характерной особенностью механизмов действия видимого и длинноволнового УФ-света на молекулярно-клеточном уровне является их зависимость от присутствия кислорода, что указывает на ведущую роль реакций фотоокисления [46, 222]. Механизм "кислородной зависимости" эффектов УФ-облучения связан со способностью О2 выступать в роли акцептора первичных восстановительных радикалов реакций фотолиза Н20 с образованием активированных кислородных метаболитов (АКМ), в частности, синглетного кислорода ('СЬ), супероксидного анион-радикала (О2Х гидроксильного радикала (ОН*) и пероксида водорода (Н202). Кроме того, АКМ могут образовываться в результате поглощения квантов света белками. Эти реакционно-способные продукты зарегистрированы при облучении видимым монохроматическим (лазерным) и полихроматическим светом различных клеток человека и животных in vitro [144, 153, 212]. В связи с этим большой интерес представляют данные о состоянии антиоксидантпой системы в условиях лазерного и УФ-облучения.

В литературе практически отсутствуют сведения о влиянии низкоинтенсивного лазерного и ультрафиолетового излучений на один из важнейших глобулинов крови - церулоплазмин (ЦП), который, во-первых, является основным белковым антиоксидантом плазмы крови, проявляя как специфическую, так и неспецифическую активность, связанную со снижением уровня АКМ; во-вторых, обладает оксидазной активностью, окисляя различные субстраты, в том числе и Бе (ферроксидазная активность); в-третьих, является основным медь-транспортным белком и, в-четвертых, относится к "белкам острой фазы", поэтому уровень его активности в плазме крови служит критерием при диагностике и прогнозе течения воспалительных заболеваний.

С целью выявления механизмов действия оптического излучения представляется необходимым изучение влияния ультрафиолетового и низкоинтенсивного лазерного излучений на структурно-функциональные свойства церулоплазмина. Исследование фотоиндуцированных процессов на биофизическом и биохимическом уровнях способствует выявлению молекулярных механизмов, лежащих в основе эффектов биологического действия излучения на организм. Это позволит теоретически обосновать практическое применение методов АУФОК и ЭЛОК в клинической практике.

В связи с этим перед нами стояли следующие задачи:

Впервые исследовано влияние широкого диапазона доз (151 4530 Дж/м ) интегрального потока (240-390 нм) УФ-излучения на спектральные, хроматографические и электрофоретические свойства церулоплазмина человека. Наблюдаемые изменения спектральных характеристик ЦП свидетельствуют о значительных структурных перестройках молекулы глико-протеида. Зарегистрированное методом гель-хроматографии снижение кажущейся молекулярной массы ЦП после действия максимальных доз УФ-света позволяет высказать предположение о возможных нарушениях структуры молекулы, затрагивающих микроокружение активного центра фермента, что приводит к снижению оксидазной активности вследствие затруднения кон-формационных взаимодействий субстрата (донора электронов) и атомов меди в составе активного центра ЦП.

Показано повышение супероксиддисмутазной активности церулоплазмина после УФ-облучения его растворов; УФ-модификация плазмы крови приводит к аналогичному, но менее выраженному эффекту.

Исследования, посвященные изучению влияния видимого света (632,8 нм), подтверждают обратимый характер процессов разворачивания и сворачивания молекул гликопротеида, о чем свидетельствуют фотоиндуци-рованные изменения хроматографических и спектральных свойств ЦП. Изменения электрофоретических свойств указывают на потерю холоцеруло-плазмином меди и переходом части молекул белка в форму апоЦП, что сопровождается разворачиванием глобулы вследствие разрыва водородных связей между доменами 1 и 6.

Выявлено, что инкубация лимфоцитов с церулоплазмином приводит к понижению уровня пероксидного окисления липидов (ПОЛ) мембран клеток, при УФ-модификации клеточных суспензий защитный эффект фермента понижается.

Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы расширяют современные представления о структурно-функциональных изменениях одного из антиоксидантных ферментов - церулоплазмина при действии на него излучения ультрафиолетовой и видимой областей спектра электромагнитных колебаний.

Эксперименты с применением широкого диапазона доз низкоинтенсивного лазерного и УФ-излучения выявляют динамику фотоиндуцирован-ных превращений молекул ЦП и позволяют установить закономерности связи между дозой облучения и наблюдаемым эффектом. Полученные результаты дополняют представления о механизмах, лежащих в основе модифицирующего действия оптического излучения на сложные белки. Это вносит вклад в раскрытие сущности процессов, обусловливающих положительные эффекты ЭЛОК и АУФОК или других видов фототерапии. Результаты проведенных модельных экспериментов можно использовать для подбора оптимальных доз облучения при лечении различных заболеваний.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 6 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения: л

1. УФ-излучение (240-390 нм) в дозах 151-^4530 Дж/м индуцирует модификацию спектральных, хроматографических, электрофоретических и функциональных свойств церулоплазмина человека, обусловленную обратимыми процессами восстановления и реокисления Си I типа.

2. Воздействие аскорбиновой кислоты на нативный и предварительно облученный УФ-светом в дозах 15К4530 Дж/м церулоплазмин способствует обратимому восстановлению Си I типа. Аскорбат проявляет фотопротекторные свойства по отношению к церулоплазмину, более выраженные при предварительной инкубации с гликопротеидом.

4. Схема возможных процессов в молекуле церулоплазмина, приводящих к изменению структуры и основных функциональных свойств глико-протеида при его фотомодификации УФ-светом и низкоинтенсивным лазерным излучением.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Рязанцев, Сергей Вячеславович

128 ВЫВОДЫ

1. Установлено, что УФ-облучение в диапазоне доз (151-4530 Дж/м") вызывает модификацию спектральных свойств церулоплазмина человека: происходит обратимое экспонирование хромофоров ароматических аминокислот в растворитель, Си I типа подвергается процессам восстановления и реокисления.

2. Обнаружено, что УФ-облучение растворов церулоплазмина в дозах 2265 и 4530 Дж/м приводит к уменьшению кажущейся молекулярной массы белка на 18 и 20 % соответственно. Это изменение не связано с отрывом углеводного компонента церулоплазмина, кроме того, не обнаружены белковые фрагменты, свидетельствующие о разрывах связей в полипептидной цепи, то есть УФ-свет индуцирует компактизацию белковой глобулы.

3. Исследование электрофоретических свойств показало, что церу-лоплазмин разделяется на три белковые фракции. Первая и вторая фракции были идентифицированы как холоцерулоплазмин, а третья фракция соответствует апобелку. УФ-облучение в дозах 151 - 1359 Дж/м не приводит к изменениям электрофоретической подвижности всех трех фракций; увеличение дозы до 2265 и 4530 Дж/м вызывает уменьшение ее у всех фракций.

4. Обнаружен эффект фотоактивации церулоплазмина: УФ-свет (151 -4530 Дж/м ) вызывает увеличение супероксиддисмутазной активности

-л белка; минимальная доза УФ-излучения (151 Дж/м ) приводит к повышению оксидазпой активности церулоплазмина.

7. Воздействие аскорбиновой кислоты на нативный и предварил тельно облученный УФ-светом в дозах 151 + 4530 Дж/м церулоплазмин способствует обратимому восстановлению ионов Си I типа. Предварительная инкубация церулоплазмина с аскорбиновой кислотой способствует проявлению последней фотопротекторных свойств.

11. Воздействие излучения гелий-неонового лазера приводит к повышению функциональной (оксидазной и супероксиддисмутазной) активности церулоплазмина, при этом более фотолабильной оказалась супероксид-дисмутазная активность, увеличение которой составило 15 -^-63 % в зависимости от времени действия лазерного луча.

130

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С помощью методов спектрофотометрии, гель-хроматографии, вертикального диск-электрофореза, определения ферментативной активности изул чено действие УФ-излучения (240-390 нм, 15К4530Дж/м) и низкоинтенсивного лазерного излучения (632,8 нм) на структурно-функциональные свойства церулоплазмина человека; использование методов люминолзависи-мой хемилюминесценции и определения каталитической активности ряда ферментов позволило исследовать влияние УФ-света и церулоплазмина на состояние мембран лимфоцитов крови доноров, также изучено сочетанпое действие УФ-излучения и аскорбиновой кислоты на спектральные характеристики церулоплазмина.

УФ-излучение с длиной волны 240-390 нм, поглощаемое белковым компонентом молекул, индуцирует конформационные перестройки как в апобелке, так и в активном центре ЦП. Данные изменения приводят к модификации функциональной активности гликопротеида - повышению суперок-сидцисмутазной и неоднонаправленным изменениям оксидазной активностей. Сольватированный электрон, "выбитый" из ароматической аминокислоты, может участвовать во многих фотохимических реакциях. Вышеуказанные процессы описаны в некоторых схемах фотохимических превращений белков [8, 18, 58, 76]. Анализ спектральных данных (рис. 10, кривые 3-5) свидетельствует о процессе восстановления меди, в котором, по всей вероятности, могут участвовать сольватированные электроны. В литературе имеются данные о том, что Тгр-669, находящийся на поверхности домена 4, играет важную роль в связывании субстратов (биогенных аминов) и дальнейшем

Рис. 51. Схема возможных фотофизических и фотохимических процессов, протекающих в молекуле церулоплазмина переносе электронов к Си 1А или Си 1В [115]. УФ-индуцированное снижение оксидазной активности может быть вызвано конформационными изменениями белковой части фермента, приводящими, по-видимому к ухудшению связывания доноров электронов с Тгр-669 и нарушениям в цепи переноса электронов к активному центру церулоплазмина.

Нами также высказано предположение, что в повышении супероксид-дисмутазной активности церулоплазмшш, модифицировавшего УФ-излучением, значительную роль играют изменения в апобелке, приводящие к усилению взаимодействия иона Си 1В, не входящего в состав активного центра, с супероксидными радикалами.

Излучение гелий-неонового лазера (632,8 нм), поглощаемое медью в составе ЦП, вызывает повышение функциональной активности белка. Это происходит, на наш взгляд, двумя путями: непосредствешю за счет реокис-ления меди и в результате изменения конформации активного центра. Ранее некоторым авторам удалось зарегистрировать активацию молекул металло-ферментов низкоэнергетическим красным светом. Так, была показана реактивация супероксиддисмутазы излучением гелий-неонового лазера [31]. Кроме того, фотомодификация активного центра белка вызывает, вероятно, локальные конформациопные превращения в апобелке, приводящие к изменению окружения второго "голубого" иона, который вносит определенный вклад в повышение супероксиддисмутазной активности ЦП.

Нами показано, что добавление аскорбиновой кислоты к нативному и предварительно облучешюму УФ-светом церулоплазмину способствует обратимому восстановлению меди I типа. Этот процесс, как известно, имеет место при функционировании ЦП в качестве оксидазы; донором электронов, вызывающих восстановление меди, служит аскорбат, окисляющийся до дегидроа-скорбата. Фотопротекторные свойства АК более выражены в случае предварительной инкубации с белком: УФ-облучение ЦП, модифицированного аскорбиновой кислотой, приводит к незначительному восстановлению меди только при действии максимальных доз УФ-света. Этот защитный эффект мы связываем именно с накоплением в растворе продукта оксидазной реакции церулоплазми-на - дегидроаскорбата - формы АК, проявляющей антиоксидантные свойства. Однако, перенося данный процесс на целостный организм, необходимо учитывать тот факт, что в плазме обнаруживается очень низкая концентрация дегидроаскорбата, это связано с высокой активностью клеточных механизмов восстановления аскорбиновой кислоты [227].

Нами исследовано сочетанное влияние церулоплазмина и УФ-излучения на состояние мембран лимфоцитов крови человека. Показано, что инкубация ЦП с лимфоцитами приводит к уменьшению продукции активных форм кислорода, а, следовательно, к ослаблению процессов ПОЛ, снижению пероксидазной активности мембран и внутриклеточной СОД-активности. Это необходимо принимать во внимание при проведении курсов АУФОК, так как именно накопление АФК и инициация пероксидного окисления липидов являются основными процессами, влияющими на структурно-функциональное состояние биомембран клеток при УФ-облучении. Нами продемонстрировано защитное действие церулоплазмина на лимфоци-тарные мембраны в условиях УФ-облучения. Для фотомодифицированных клеток, предварительно инкубированных с ЦП, характерно снижение продукции АФК, уменьшение пероксидазной активности мембран, и, как следствие, ослабление процессов ПФОЛ; при этом не наблюдается снижения жизнеспособности лимфоцитов.

Полученные данные способствуют установлению закономерностей действия низкоинтенсивного лазерного и ультрафиолетового излучений на сложные белковые системы, которые могут быть использованы для объяснения механизмов клинического эффекта применения церулоплазмина в качестве лекарственного препарата, а также АУФОК и ЭЛОК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рязанцев, Сергей Вячеславович, Воронеж

1. Антиоксидантное и иммуномодулирующее воздействия церулоплазмина при экспериментальной гриппозной инфекции / Н.К. Берлинских и др. // Бюллетень экспер. биол. и мед. 1994. - Т. 118, №9. - С. 285-287.

2. Антитела. Методы / Под ред. Д. Кэтти: В 2-х кн. М.: Мир, 1991. — Кн. 2.-380 с.

3. Антонов М.П. Особенности определения активности церулоплазмина с я-фенилендиамином в качестве субстрата / М.П. Антонов, Л.А. Антонова, Т.В. Лапутина // Лаб. дело. 1985. - № 6. - С. 335-338.

4. Артюхов В.Г. Активация молекул супероксиддисмутазы под влиянием УФ-облучения / В.Г. Артюхов, О.В. Башарина, Ф.А. Филипцов // Биофизика. 1992.-Т. 37, № 1.-С. 13-16.

5. Артюхов В.Г. Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами / В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина. Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 2000. - 296 с.

6. Артюхов В.Г. Биофизика / В.Г. Артюхов, Т.А. Ковалева, В.П. Шмелев. -Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 1994. 336 с.

7. Артюхов В.Г. Фотохимия и фотофизика сложных белков / В.Г. Артюхов // Вестник Воронежского государственного университета. Серия 2. -1993.-№ 1.-С. 20-35.

8. Артюхов В.Г. Гемопротеиды: закономерности фотохимических превращений в условиях различного микроокружения / В.Г. Артюхов. Воронеж: Изд-во ВГУ, 1995. - 280 с.

9. Арцишевская P.A. Десорбция гликопротеинов с поверхности лимфоцитов периферической крови человека после облучения коротковолновыми УФ-лучами / P.A. Арцишевская, А.П. Миронова, К.А. Самойлова // Цитология. 1984. - Т. 26, № 2. - С. 209-214.

10. Большая медицинская энциклопедия / Под ред. Б.В. Петровского: В 30-ти т. М.: Сов. энцикл., 1975. - Т. 2. - С. 783-788.

11. Брилль Г.Е. Гуанилатциклаза и NO-синтаза возможные первичные акцепторы энергии низкоинтенсивного лазерного излучения / Г.Е. Брилль, А.Г. Брилль // Лазерная медицина. - 1997. - Т. 1, № 1. - С. 39-42.

12. Васильев В.Б. Различия в каталитических свойствах фрагментов молекулы церулоплазмина / В.Б. Васильев, C.B. Кононова // Биохимия. -1987. Т. 52, № 3. - С. 387-396.

13. Васильев В.Б. Дисмутирование супероксидных радикалов церулоплаз-мином детали механизма / В.Б. Васильев, A.M. Качурин, Н.В. Сорока // Биохимия. - 1988. - Т. 53, № 12. - С. 2051-2058.

14. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. М.: Наука, 1972. - 252 с.

15. Владимиров Ю.А. Три гипотезы о механизме действия лазерного облучения на клетки и организм человека / Ю.А. Владимиров // Эфферентная медицина. М.: ИБМХ РАМН, 1994. - С. 51-67.

16. Владимиров Ю.А. Физико-химические основы фотобиологических процессов / Ю.А. Владимиров, А.Я. Потапенко. М.: Высш. шк., 1989. - 199 с.

17. Владимиров Ю.А. Хемилюминесценция животных клеток / Ю.А. Владимиров, М.П. Шерстнев // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. 1989. - Т.24. - 176 с.

18. Влияние ионизирующего излучения на стабильность и ферментативную активность лакказы Coriolus hirsutus / A.A. Ревина и др. // Радиац. биология. Радиоэкология. 1998. - Т. 38, № 2. - С. 156-163.

19. Влияние коротковолнового УФ излучения на жизнеспособность и некоторые иммунологические особенности Т-лимфоцитов человека /

20. B.А. Крыленков и др. // Фотобиология животной клетки. Л., 1979.1. C. 227-231.

21. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на функциональный потенциал лейкоцитов / Г.И. Клебанов и др. // Бюллетень эксперим. биол. и мед. 1997. - Т. 123, № 4. - С. 395-398.

22. Влияние низкоэнергетического лазерного излучения на интенсивность перекисного окисления липидов / Т.Н. Зырянцова и др. // Вестник дерматологии и венерологии. 1990. - № 2. - С. 31-32.

23. Влияние УФ-облучения в терапевтических дозах на экспрессию некоторых маркеров поверхности лимфоцитов крови доноров / К.А. Самойлова и др. // Тезисы III Всесоюзного съезда гематологов и трансфузиоло-гов.-М., 1991.-Т. 2.-С. 416-417.

24. Влияние УФ-облучения на функциональную активность нейтрофилов крови доноров / В.Г. Артюхов и др. // Бюллетень эксперим. биол. и мед. 2005. - Т. 139, № 3. - С. 291-293.

25. Влияние церулоплазмина на иммуноциты в норме и при патологии / О.Ф. Сешок и др.//Биохимия.- 1994.-Т.59,№ 10.-С. 1503-1510.

26. Влияние эндогенных фотосенсибилизаторов на лазер-индуцированный прайминг лейкоцитов крови / Г.И. Клебанов и др. // Биол. мембраны. -1998.-Т. 15, № 3. С. 273-285.

27. Волгарева Е.В. Влияние УФ-облучения в терапевтической дозе и УФ-облученной крови на пролиферативную и рецепторную активность ау-тологичных лимфоцитов / Е.В. Волгарева // Цитология. 1991. - № 9. -С. 59.

28. Волгарева E.B. Влияние УФ-облучения и УФ-облученной аутологичной крови на функциональное состояние лимфоцитов периферической крови человека / Е.В. Волгарева, А.П. Волгарев, К.А. Самойлова // Цитология.- 1990.-№ 12.-С. 1217-1223.

29. Гамова И.М. Изменение экспрессии мембранных рецепторов иммуно-компетентпых клеток крови, индуцированные различными методами фотомодификации крови / И.М. Гамова, К.Д. Оболенская, К.А. Самойлова//Цитология. 1991.-№ 9.-С. 63.

30. Горбатенкова Е.А. Реактивация супероксиддисмутазы излучением гелий-неонового лазера / Е.А. Горбатенкова, O.A. Азизова, 10.А. Владимиров // Биофизика. 1988. - № 4. - С. 717-718.

31. Гусинская В.В. Анализ УФ-индуцированных структурно-функциональных изменений белков системы комплемента и эритроци-тарных мембран: дисс. . канд. биол. паук / В.В. Гусинская. Воронеж, 1995.- 173 с.

32. Двурекова Е.А. Структурно-функциональное состояние иммуноцитов при их взаимодействии с гуморальными факторами иммунной системы в условиях УФ-облучения: дисс. . канд. биол. наук / Е.А. Двурекова. -Воронеж, 2005. 208 с.

33. Дмитриев Е.В. Модуляция структурно-функциональных изменений мембран Т- и B-лимфоцитов крови человека некоторыми химическими и физическими агентами: дисс. . канд. биол. наук / Е.В. Дмитриев. -Воронеж, 2003 161 с.

34. Дубинина Е.Е. Антиоксидантная система плазмы крови / Е.Е. Дубинина//У кр. биохим. журнал. 1992.-№ 2.-С. 3-15.

35. Дубинина Е.Е. Некоторые особенности функционирования ферментативной антиоксидаптной защиты плазмы крови человека / Е.Е. Дубинина // Биохимия. 1993. - Т. 58, № 2. - С. 268-273.

36. Дубинина Е.Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состояниях окислительного стресса / Е.Е. Дубинина // Вопр. мед. химии. 2001. - Т. 47, № 6. - С. 561 -581.

37. Егоров К.Н. Классификация способов лазеротерапии / К.Н. Егоров // Материалы XIV Международной научно-практической конференции "Применение лазеров в медицине и биологии". Харьков, 16-19 мая 2000 г.-С. 45-47.

38. Емельянов Д.Н. Влияние внутривенного лазерного облучения крови на общую активность церулоплазмина у больных хроническими диффузными заболеваниями печени / Д.Н. Емельянов, В.В. Скворцов, Р.Г. Мязин // Гепатология. 2004. - № 3. - С. 37-39.

39. Зверева К.В. Отрицательные эффекты низкоинтенсивной лазерной терапии при ревматоидном артрите / К.В. Зверева, Е.А. Грунина // Тер. Архив. 1996.-№ 5.-С. 22-24.

40. Зенков Н.К. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах / Н.К. Зенков, Е.Б. Меныцикова // Успехи соврем, биологии. -1993.-№3.-С. 286-296.

41. Зенков Н.К. Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты / Н.К. Зенков, В.З. Лапкин, Е.Б. Меныцикова. М.: МАИК "Наука / Интерпериодика", 2001. - 343 с.

42. Зубкова С.М. О механизме биологического действия излучения гелий-неонового лазера / С.М. Зубкова // Биологические науки. 1978. -№7.-С. 30-37.

43. Изменение поверхности активации циркулирующих лейкоцитов при ау-тотрансфузии УФ-облученной крови / К.А. Самойлова и др. // Вестник хирургии. 1990.-Т. 144, №6.-С. 99-105.

44. Изменения экспрессии мембранных маркеров и количества мононук-леаров крови человека после ее облучения in vivo и in vitro видимым и инфракрасным светом в терапевтических дозах / H.A. Жеваго и др. // Цитология. 2003. - Т. 45, № 2. - С. 179-194.

45. Илларионов В.Е. Основы лазерной терапии / В.Е. Илларионов. М.: Респект, 1992.- 122 с.

46. Илларионов В.Е. Техника и методики процедур лазерной терапии / В.Е. Илларионов. М., 1994,- 178 с.

47. Иммунологический статус, критерии его оценки, принципы назначения иммунокорригирующих препаратов: Методические указания / A.M. Земсков и др. Воронеж, 1988. - С. 11-26.

48. Инактивация активных форм кислорода, генерируемых миелоперокси-дазой, сывороточными белками / Н.Ю. Говорова и др. // Доклады АН СССР. 1986. - Т. 290, №2. - С. 480-483.

49. Карандашов В.И. Ультрафиолетовое облучение крови / В.И. Каранда-шов, Е.Б. Петухов. М.: Медицина, 1997. - 224 с.

50. Кару Т.Й. Клеточные механизмы низкоинтенсивной лазерной терапии / Т.Й. Кару // Усп. совр. биологии. 2001. - Т. 121, № 1. - С. 110-120.

51. Кинетическое исследование оксидазной реакции церулоплазмина / E.JT. Саенко и др. // Биохимия. 1986. - Т. 51, № 6. - С. 1017-1022.

52. Клебанов Г.И. Клеточные механизмы прайминга и активации фагоцитов / Г.И. Клебанов, Ю.А. Владимиров // Успехи соврем, биол. 1999. -Т. 119, №5. -С. 462-475.

53. Козлов В.И. Лазеротерапия / В.И. Козлов, В.Н. Буйлин М.: Медицина, 1993.- 149 с.

54. Коломийченко М.А. Изменение физико-химических и биологических свойств белков, облученных рентгеновыми и ультрафиолетовыми лучами / М.А. Коломийченко // Действие ионизирующих излучений на животный организм: Тез. докладов. Киев, 1960. - С. 53-58.

55. Колотилова А.И. Витамины (Химия, биохимия и физиологическая роль) /

56. A.И. Колотилова, Е.П. Глушанков JL: Изд-во Лени игр. ун-та, 1976, -248 с.

57. Конев C.B. Фотобиология / C.B. Конев, И.Д. Волотовский. Минск; Изд-во БГУ, 1979.-383 с.

58. Кошелев В.Н. Лазер в лечении ран / В.Н. Кошелев. Саратов: Изд-во СГУ, 1980.- 125 с.

59. Крыленков В.А. Деструктивные изменения внешних примембранных слоев (гликокаликса) клеток асцитной гепатомы Зайдела при действии УФ-излучения / В.А. Крыленков, К.А. Самойлова, C.B. Левин // Цитология. 1979. - №5. - С. 594-601.

60. Крыленков В.А. Электронно-микроскопическое исследование поверхности необлученных и УФ-облученных лимфоцитов крови человека /

61. B.А. Крыленков, М.С. Брудная, Я. 10. Комиссарчик // Цитология. -1983.-№4.-С. 476-479.

62. Лазеры в экстренной хирургии органов брюшной полости / Ю.И. Калиш и др. //Хирургия. 1994. -№ 11. - С. 44-45.

63. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М. : Высшая школа, 1990. - 351 с.

64. Лисиенко В.М. Альтерация биологических жидкостей при лазеротерапии у хирургических больных / В.М. Лисиенко, Г.И. Минц,

65. C.А. Скопионов // Тез. докл. межд. симп. "Применение лазеров в хирургии и медицине". М., 1989. - С. 529-530.

66. Лушников Л.А. Денситометрия / Л.А. Лушников, И.К. Стромгин // Лаб. дело. 1980. - № 6. - С. 336-338.

67. Ляндрес И.Г. Механизмы биостимуляции низкоинтенсивного лазерного излучения / И.Г. Ляндрес. Минск, 1998. - 185 с.

68. Мальстрем Б.Г. .Некоторые аспекты структуры и функции медьсодержащих оксидаз / Б.Г. Мальстрем // Итоги и перспективы развития биоорганической химии и молекулярной биологии.-М., 1978.-С. 169-181.

69. Меныцикова Е.Б. Окислительный стресс при воспалении / Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков // Успехи соврем, биологии. 1997. - №2. -С. 155-170.

70. Методы изучения и механизм действия лазерного излучения на эритроциты с участием молекулярного кислорода / С.Д. Захаров и др. // Методы лазерной биофизики и их применение в биологии и медицине. Под ред. O.K. Скобелкина. Тарту, 1989. - С. 59-92.

71. Механизм антиоксидантного действия церулоплазмина / А.И. Ярополов и др. //Доклады АН СССР. 1986. - Т. 291, № 1. - С. 237-241.

72. Налбандян P.M. Медьсодержащие оксидазы / P.M. Налбандян // Окислительно-восстановительные металлоферменты и их модели. Теоретические и методические аспекты. Часть 1. Черноголовка, 1982. - С. 62-73.

73. Новиков Д.К. Оценка иммунного статуса / Д.К. Новиков,

74. B.И. Новикова. М.: Медицина, 1996. - 282 с.

75. О механизме действия излучения гелий-неонового лазера на кровь и ее компоненты / Т.Ю. Яковлева и др. // Междунар. копферен. "Лазеры и медицина": тез. докл., ч.1.-Ташкент, 10-13 октября 1989-С. 127-128.

76. Облученная ультрафиолетовым светом кровь: фотохимия, иммунологическое действие / В.А. Крыленков и др. // ДАН СССР. 1983. - № 5.1. C. 242-246.

77. Оболенская К.Д. Увеличение экспрессии мембранных маркеров имму-нокомпетентных клеток после УФ-облучения крови в терапевтической дозе и ретрансфузии УФ-облученной крови / К.Д. Оболенская, И.И. Га-мова, К.А. Самойлова // Цитология. 1991. - №9. - С. 91.

78. Олигомерные белки: структурно-функциональные модификации и роль субъединичных контактов / В.Г. Артюхов и др.. Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та., 1997. - 264 с.

79. Погосян Г.Г. Ингибирование липидной пероксидации супероксиддис-мутазой и церулоплазмином / Г.Г Погосян, P.M. Налбандян // Биохимия. 1983. - Т. 8, № 7. - С. 1129-1134.

80. Полифункциональность церулоплазмина, обоснование применения / H.A. Добротина и др. // Успехи соврем, биологии. 1999. - Т. 119, №4.-С. 375-379.

81. Попов В.Д. Современные аспекты квантовой теории в клинической медицине / В.Д. Попов. Киев, 1996. - 133 с.

82. Рощупкин Д.И. Основы фотобиофизики / Д.И. Рощупкин, В.Г. Артюхов. Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 1997. - 116 с.

83. Рощупкин Д.И. Фотобиологические процессы в биомембранах при действии ультрафиолетового излучения на клетки, ткани и органы животных / Д.И. Рощупкин, М.А. Мурина // Биофизика. 1993. - Т. 38, № 6. -С. 1053-1068.

84. Рубин А.Б. Биофизика / А.Б. Рубин. М.: Высшая школа, 1987. - 303 с.

85. Рязанцева JI.T. Особенности функционирования нейтрофилов крови человека в условиях лазерного облучения: дисс. . канд. биол. наук / JI.T. Рязанцева. Воронеж, 2002. - 156 с.

86. Саенко E.JI. Рецепция церулоплазмина на эритроцитах человека / E.JI. Саенко, В.В. Басевич, А.И. Ярополов // Биохимия. 1988. - Т. 53, № 8. - С. 1310-1315.

87. Самойлова К.А. Выход веществ из лимфоцитов периферической крови человека, облученных коротковолновыми УФ-лучами / К.А. Самойлова, А.П. Миронова, P.A. Арцишевская // Цитология. 1984. - Т. 26, № 1. -С.102-108.

88. Сапежинский И.И. Сенсибилизированное фотоокисление белков и других веществ. Возможное значение этих процессов в фотобиологии / И.И. Сапежинский // Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения. М., 1988. - С. 92-101.

89. Сасина JI.K. Изучение локализации и внутриклеточного перемещения новосинтезированного рецептора церулоплазмина в культивируемых фибробластах человека / JI.K. Сасина, JI.B. Пучкова, B.C. Гайцхоки // Биохимия.-1998.-Т. 63,№ 10.-С. 1377-1384.

90. Смит К. Молекулярная фотобиология / К. Смит, Ф. Хэнеуолт. М.: Мир, 1972.-272 с.

91. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования / Под ред. Е.А. Кост. М.: Медицина, 1968. - С. 70-73.

92. Стимулирующее действие УФ-излучения на активность антител и комплемента крови человека / К.А. Самойлова и др. // Механизмы влияния облученной ультрафиолетовыми лучами крови на организм человека и животных. JI., 1986. - С. 226-237.

93. Стресс-модулирующие эффекты лазеротерапии у больных ишемической болезнью сердца / O.JI. Барбараш и др. // Тер. Архив. 1996. - № 12. -С. 50-53.

94. Супероксиддисмутазная активность плазмы крови человека; влияниел,комплексных соединений Си / Е.Е Дубинина и др. // Укр. биохим. журнал. 1986. - Т. 58, №3. - С. 31-37.

95. Тен Э.В. Экспресс-метод определения активности церулоплазмина в сыворотке крови /Э.В. Тен //Лаб. дело. 1981. -№ 6. - С. 334-335.

96. Турпаев К.Т. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии генов / К.Т. Турпаев // Биохимия. 2002. - Т. 67, № 3. - С. 339-352.

97. Ультрафиолетовая фотомодификация функционального состояния лейкоцитов / Е.Б. Жибурт и др. // Эфферентная терапия. 1995. - Т. 1, № 3. - С. 56-58.

98. Утц С.Р. Низкоинтепсивная лазеротерапия в дерматологии / С.Р. Утц, В.А. Волнухин. Саратов: Изд-во Саратовского ун-та, 1998. - 92 с.

99. Физико-химические механизмы биологического действия лазерного излучения / Н.Д. Девятков и др. // Успехи совр. биол. 1987. - Т. 103, № 1.-С. 31-43.

100. Фотодинамическая терапия злокачественных опухолей основных локализаций с препаратами фотогем и фотосенс (результаты трехлетних наблюдений) / В.В.Соколов и др. // Вопр. онкологии. 1995. - Т. 41, № 1.-С. 134-138.

101. Фотомодификация иммунокомпетентных клеток крови человека / В.А. Крыленков и др. // Бюллетень эксперим. биол. и мед. 1987. -№5.-С. 600-603.

102. Фотореактивация церулоплазмина как один из механизмов действия гелий-неонового лазера на кровь / М.С. Жуманкулов и др. // Лазеры и медицина. М., 1989. - С. 73-74.

103. Холмогоров В.Е. Первичные фотопроцессы в крови и ее компонентах при действии оптического излучения / В.Е. Холмогоров, В.А. Крылен-ков, М.А. Османов // Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения. -М., 1988.-С. 164-177.

104. Хомутовский O.JI. Структура и функция примембранных слоев клеток (гликокаликс) / O.J1. Хомутовский. Киев: Наук. Думка, 1984. - 160 с.

105. Чудновский В.М. О первичных биологических фотоакцепторах излучения гелий-неонового лазера / В.М. Чудновский, И.Р. Бондарев, С.В. Оратовская // Материалы конференции "Лазеры и медицина". М., 1989.-Ч. 1.-С. 142-143.

106. Шанин Ю.Н. Антиоксидантная терапия в клинической практике (теоретическое обоснование и стратегия проведения) / Ю.Н. Шанин, В.Ю. Шанин, Е.В. Зиновьев. Санкт-Петербург: ЭЛБИ-СПб., 2003. -128 с.

107. Шаронов Б. Л. Окисление церулоплазмина гипохлоритом. Потеря голубой окраски и сохранение оксидазной активности / Б.Л. Шаронов, Я.Ю. Говорова // Биохимия. 1990. - Т. 55, № 6. - С. 1012-1015.

108. Элементарный учебник физики / Под ред. Г.С. Ландсберга: В 3-х т. М.: Наука, 1970.-Т. 3.-С. 161-164.

109. A key structural role for active site type 3 copper ions in human ceruloplas-min / P. Vachette et al. // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277, № 43. -P. 40823-40831.

110. A possible mechanism of low-level laser-living cell interaction / R. Lubart et al. // Laser Theor. 1990. - Vol. 2, № 1. - P. 65-68.

111. Aceruloplasminemia: molecular characterizationof this disorder of iron metabolism / Z.L. Harris et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. -Vol. 92.-P. 2539-2543.

112. Al-Timimi D.J. The inhibition of lipid autoxidation by human caeruloplas-min/ D.J. Al-Timimi, T.L. Dormandy // Biochem. J. 1977. - Vol. 168. — P. 283-288.

113. Amdjadi K. Ultraviolet light-induced stimulation of the JNK mitogen-activated protein kinase in the abcence of Src family tirosine kinase activation / K. Amdjadi, B. Sefton // J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275. -P. 22520-22525.

114. An X-ray crystallographic study of the binding sites of the azide inhibitor and organic substrates to ceruloplasmin, a multi-copper oxidase in the plasma / Zaitsev V.N. et al. // J. Biol. Inorg. Chem. 1999. - Vol. 4. - P. 579-587.

115. An X-ray structural study of human ceruloplasmin in relation to ferroxidase activity / Lindley P.F. et al. // J. Biol. Inorg. Chem. 1997. - Vol. 2. -P. 454-463.

116. Bast A. Oxidants and antioxidants: State of the art / A. Bast, G.R.M.M. Haenen, C.J.A. Doelman // Amer. J. Med. 1991. - Vol. 91, Suppl. 3C.-P. 2S-13S.

117. Basu-Modak S. Singlet oxygen: a primary effector in the ultraviolet A/near-visible light induction of the human heme oxygenase gene / S. Basu-Modak, R.M. Tyrell // Cancer Res. 1993. - Vol. 53. - P. 4510-4550.

118. Brown J.M. Structural studies on hemocyanin active site. 1. Extended X-ray absorption fine structure (EXAFS) analysis / J.M. Brown, L. Powers, B. Kin-caid // J. Am. Chem. Soc. 1980. - Vol. 102. - P. 4210-4216.

119. Brown M.A. Identification of catalytically important amino acids in human ceruloplasmin by site-directed mutagenesis / M.A. Brown, L.M. Stenberg, A.G. Mauk // FEBS Letters. 2002. - Vol. 520. - P. 8-12.

120. Calabrese L. Presence of coupled trinuclear copper cluster in mammalian ceruloplasmin is essential for efficient electron transfer to oxygen / L. Calabrese, M. Carbonaro, G. Musci // J. Biol. Chem. 1989. - Vol. 264. -P. 6183-6187.

121. Carver F.J. The effect of albumin, ceruloplasmin, and other serum constituents on Fe(II) oxidation / F.J. Carver, D.I. Färb, E. Frieden // Biol. Trace Element Res. 1982. - Vol. 4. - P. 1-19.

122. Ceruloplasmin ferroxidase activity stimulates cellular iron uptake by a trivalent cation-specific transport mechanism / Z.K. Attieh et al. // J. Biol Chem. 1999.-Vol. 274. - P. 1116-1123.

123. Ceruloplasmin promotes iron uptake rather than release in BT325 cells / Z.M. Qian et al. // Exp. Brain Res. 2001. - Vol. 140. - P. 369-374.

124. Cha M.K. Ceruloplasmin has a distinct active site for the catalyzing glu-tathione-dependent reduction of alkyl hydroperoxide / M.K. Cha, I.H. Kim // Biochemistry. 1999. - Vol. 38. - P. 12104-12110.

125. Characterization, mapping, and expression of the human ceruloplasmin gene / F.Yang et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1986. - Vol. 83. -P. 3257-3261.

126. Cohen A. Vitamin C and iron overload / A. Cohen, E. Schwartz // New Engl. J. Med. 1981.-Vol. 304.-P. 1108.

127. Cousins R.J. Absorption, transport, and hepatic metabolism of copper and zinc: special reference to metallothionein and ceruloplasmin / R.J. Cousins // Physiol. Rev. 1985. - Vol. 65. - P. 238-309.

128. Curzon G. The effects of inhibitor mixtures and the specific effects of different anions on the oxidase activity of caeruloplasmin / G. Curzon, B.E. Speyer // Biochem. J. 1968. - Vol. 109. - P. 25-34.

129. Curzon G. The inhibition of caeruloplasmin bt azide / G. Curzon // Biochem. J. 1966. - Vol. 100. - P. 295-302.

130. Direct detection of circulating free radicals in the rat using electron spin resonance spectrometry / X. Wang et al. // Free Radical Biol. And Med. -1992.-Vol. 12.-P. 121-126.

131. Dougherty T.J. Use of hematoporphyrin in photodynamic therapy / T.J. Dougherty // Photochem Photobiol. 1993. - Vol. 58. - P. 895-900.

132. Ehrenwald E. Intact human ceruloplasmin oxidatively modifies low density lipoprotein / E. Ehrenwald, G.M. Chisolm, P.L. Fox // J. Clin. Invest. -1994.-Vol. 93.-P. 1493-1501.

133. Ehrenwald E. Role of endogenous ceruloplasmin in low density lipoprotein oxidation by human U937 monocytic cells / E. Ehrenwald, P.L. Fox // J. Clin. Invest. -1996. Vol. 97. - P. 884-890.

134. Erel O. Automated measurement of serum ferroxidase activity / O. Erel // Clinical Chemistry. 1998. - Vol. 44, № 11. - P. 2313-2319.

135. Ernst E. Low-dose laser therapy: critical analysis of clinical effects / E. Ernst, V. Fialka // Schweiz-Med-Wochenschr. 1993. - Vol. 123. - P. 949-954.

136. Fleming R.E. Induction of ceruloplasmin gene expression in rat lung during inflammation and hyperoxia / R.E. Fleming, I.P. Whitman, J.D. Gitlin // Am. J. Physiol. 1991. - Vol. 260. - P. 68-74.

137. Frick G. Fibel der Ultraviolettbestrahlung des Blutes / G. Frick. München: Hans Muller Verlag, 1993. - 89 S.

138. Frieden E. Ceruloplasmin: the copper transport protein with essential oxidase activity / E. Frieden, H.S. Hsieh // Adv. Enzymol. 1976. - Vol. 44. -P. 187-236.

139. Gamaley I.A. Roles of reactive oxygen species: signaling and regulation of cellular function / I.A. Gamaley, I.V. Klyubin // Int. Review. Cytol. 1999. -№ 188.-P. 203-255.

140. Gene expression in regenerating and acute-phase rat liver / J. Milland et al. // Am. J. Physiol. 1990. - Vol. 259. - P. 340-347.

141. Genetic analysis of gormon-sensitive adenylate cyclase / G.L. Johnson et al. // Advances in Cyclic Nucleotide Research. New-York, Raven. -1980.-Vol. 9.-P. 171-206.

142. Gitlin J.D. Transcriptional regulation of ceruloplasmin gene expression during inflammation / J.D. Gitlin // J. Biol. Chem. 1988. - Vol. 263.-P. 6281-6287.

143. Grossman N. 780 nm low power diode laser irradiation, stimulates proliferation of ceratiocyte cultures: involvement of reactive oxygen species / N. Grossman // Lasers Surg. Med. 1998. - Vol. 22. - P. 212-218.

144. Gunnarson P.-O. Inhibition of ceruloplasmin by inorganic anions / P.-O. Gunnarson, U. Nylen, G. Pettersson // Eur. J. Biochem. 1972. -Vol. 27.-P. 572-577.

145. Gutteridge J.M.C. Caeruloplasmin: physiological and pathological perspectives / J.M.C. Gutteridge, J. Stocks // CRC Crit. Rev. Clin. Lab. Med. -1981.-Vol. 14.-P. 257-329.

146. Halliwell B. The antioxidants of human extracellular fluids / B. Halliwell, M. Vasil, M. Grootveld //Arch. Biochem. and Biophys. 1990. - Vol. 280. -P. 1-8.

147. Harris Z.L. The biology of ceruloplasmin / Z.L. Harris, H. Morita, J.D. Gitlin // In Multi-Copper Oxidases (A. Messerschmidt, ed.). World Scientific: Singapore, 1997. - P. 285-305.

148. Hillesberg R. van. Current Status of Photodynamic Therapy in Oncology / R. van Hillesberg, W.J. Kost, J.H.P. Wilson // Drugs. 1994. - Vol. 48, №4.-P. 510-524.

149. Holtzman N.A. Studies on the rate of release and turnover of ceruloplasmin and apoceruloplasmin in rat plasma / N.A. Holtzman, B.M. Gaumnitz // J. Biol. Chem. 1970. - Vol. 245. - P. 2354-2363.

150. Human ceruloplasmin / O. Farver et al. // J.Biol. Chem. 1999. -Vol. 274.-P. 26135-26140.

151. Identification of the prooxidant site of human ceruloplasmin: A model for oxidative damage by copper bound to protein surfaces / C.K. Mukhopadhyay et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94. - P. 11546-11551.

152. In vivo effects of low-level laser irradiation at 660 nm on peripheral blood lymphocytes / I. Stadler et al. // Lasers Surg. Med. 2000. - Vol. 27. -P. 2555-2561.

153. Inhibition of superoxide and ferritin-dependent lipid peroxidation by ceru-loplasmin / V.M. Samokyszyn et al. // J. Biol. Chem. 1989. - Vol. 264. -P. 21-26.

154. Iskra M. Activities of copper,zinc-superoxide dismutase in erythrocytes and ceruloplasmin in serum in chronic ischemia of lower limbs / M. Iskra, W. Majewski // Int. J. Clin. Lab. Res. 1999. - Vol. 29. - P. 64-67.

155. Itzkan I. Laser wound healing can be explained by the photodissociation of oxyhemoglobin / I. Itzkan, S. Tang // Lasers in Surgery and Medicine. -1988.-№ 8.-P. 175.

156. Karu T. Long-term and short-term responses of human lymphocytes to He-Ne laser irradiation / T. Karu, N. Smolyaninova, A. Zelenin // Laser in Life Sci. -1991. Vol. 4, №3.- P. 167-178.

157. Karu T. Primary and secondary mechanisms of action of visible and near infra red radiation on cells / T. Karu // J. Photochem. Photobiol. 1999. -Vol. 49, № l.-P. 1-17.

158. Kim I. G. Requirement of intact human ceruloplasmin for the glutathione-linked peroxidase activity / I.G. Kim, S.Y. Park // FEBS Letters. 1998. -Vol. 437, №3.-P. 293-296.

159. Kinetic studies of ceruloplasmin-azide interaction / T. Manabe et al. // FEBS Letters. 1971. - Vol. 16, № 3. - P. 201-203.

160. Klomp L.W.J. Expression of the ceruloplasmin gene in the human retina and brain: implications for a pathogenic model in aceruloplasminemia / L.W.J. Klomp, J.D. Gitlin // Hum. Mol. Genet. 1996. - Vol. 5. -P. 1989-1996.

161. Kulms D. Ultraviolet radiation inhibits IL-2-induced tyrocine phosphorylation and the activation of STAT5 in T lymphocytes / D. Kulms, T. Schwarz // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276. - P. 12849-12855.

162. Kulms D. Ultraviolet radiation-indused IL-6 release in HeLa cells is mediated via membrane events in a DNA damage independent way / D. Kulms, B. Poppelman, T. Schwarz // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol. 275. - P. 1506015066.

163. Lamb D.J. Acidic pH enables caeruloplasmin to catalyse the modification of low-density lipoprotein / D.J. Lamb, D.S. Leake // FEBS Letters. 1994. -Vol. 338.-P. 122-126.

164. Lovstad R.A. A study on ascorbate inhibition of ceruloplasmin ferroxidase activity / R.A. Lovstad // BioMetals. 1997. - Vol. 10. - P. 123-126.

165. Low power laser irradiation induces leukocyte priming / G.I. Klebanov et al. // Gen. Physiol. Biophys. 1998. - Vol. 17, № 4. - P. 365-376.

166. Magdoff-Fairchild B. An X-ray crystallographic study of ceruloplasmin. Determination of molecular weight / B. Magdoff-Fairchild, F.M. Lovell, B.W. Low // J. Biol. Chem. 1969. - Vol. 244. - P. 3497-3499.

167. May J.M. Ascorbic acid recycling enhances the antioxidant reserve of human erythrocytes / J.M. May, Z.-C. Qu, R.R. Whitesell // Biochemistry. 1995. -Vol. 34.-P. 12721-12728.

168. Mechanisms of copper incorporation into human ceruloplasmin / N.E. Hell-man et al. // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277, № 48. - P. 46632-46638.

169. Messerschmidt A. The blue oxidases, ascorbate oxidase, laccase and ceruloplasmin / A. Messerschmidt, R. Huber // Eur. J. Biochem. 1990. -Vol. 187.-P. 341-352.

170. Miley G.P. Ultraviolet blood irradiation. A history and guide to clinical application (1933-1997). / G.P. Miley, R.C. Olney, H.T. Lewis. Maryland: The Foundation for blood irradiation Inc, Silver Spring, 1997. - 253 p.

171. Mondovi B. Ascorbic oxidase / B. Mondovi, L. Avigliano // In Copper Proteins and Copper Enzymes (L. Lontie, ed.). CRC Press: Boca Raton, FL, USA, 1984.-Vol.3.-P. 101-118.

172. Morgan E.H. Studies on the mechanism of iron release from transferring / E.H. Morgan // Biochim. Biophys. Acta. 1979. - Vol. 580. - P. 312-326.

173. Mukhopadhyay C.K. Role of ceruloplasmin in cellular iron uptake / C.K. Mukhopadhyay, Z.K. Attieh, P.L. Fox // Science. 1998. - Vol. 279. -P. 714-717.

174. Musci G. The multifunctional oxidase activity of ceruloplasmin as revealed by anion binding studies / G. Musci, G.C. Bellenchi, L. Calabrese // Eur. J. Biochem. 1999. - Vol. 265. - P. 589-597.

175. Musci G. The state of the copper sites in human ceruloplasmin / G. Musci, M.C. Bonaccorsi di Patti, L. Calabrese // Arch. Biochem. Biophys. 1993. -Vol. 306.-P. 111-118.

176. Niki E. Action of ascorbic acid as a scavenger of active and stable oxygen radicals / E. Niki // Amer. J.Clin. Nutr. 1991. - Vol. 54. - P. S1119-S1124.

177. Nohmi M. Ultraviolet light activates blocking actions of dantrolene on intra1. SJ Icellular Ca release in bullfrog sympathetic neurones / M. Nohmi, K. Kuba, S. Hua // J. Biol. Chem. 1991. - Vol. 266. - P. 22254-22259.

178. Obolenskaya K.D. Increase in the expression of membrane markers of immunocompetent cells after UV-irradiation (UV I) of blood in therapeutic doseand its retransfusion (UV IBR) / K.D. Obolenskaya, I.M. Gamova, K. A.th

179. Samoilova // Book of abstracts of the 4 Congress of the European Society for Photobiology. Amsterdam, 1991. - P. 96.

180. On the lability and functional significance of the type 1 copper pool in ceru-loplasmin / G. Musci et.al. // J. Biol. Inorg. Chem. 1999. - Vol. 4. -P. 441-446.

181. Osaki S. Kinetic studies of ferrous ion oxidation with crystalline human fer-roxidase (ceruloplasmin) / S. Osaki // J. Biol. Chem. 1966. - Vol. 241.-P. 5053-5059.

182. Osaki S. The possible significance of the ferrous oxidase activity of ceruloplasmin in nonnal human serum / S. Osaki, D.A. Johnson, E. Frieden // J. Biol. Chem. 1966. - Vol. 241. - P. 2746-2751.

183. Oxidation-related analytes and lipid and lipoprotein concentrations in healthy subjects / W.Y. Craig et al. // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1995. -Vol. 15.-P. 733-739.

184. Pacht E.R. Decreased ceruloplasmin ferroxidase activity in cigarette smokers/ E.R. Pacht, W.B. Davis // J. Lab. Clin. Med. 1988. - Vol. 111. -P. 661-668.

185. Pass H.I. Photodynamic therapy in oncology. Mechanism and clinical use / H.I. Pass // J. Natl. Cancer Inst. 1993. - Vol. 85, № 6. - P. 443-456.

186. Patel B.N. A novel glycosylphosphatidylinositol-anchored form of ceruloplasmin is expressed by mammalian astrocytes / B.N. Patel, S. David // J.Biol. Chem. 1997. - Vol. 272. - P. 20185-20190.

187. Patel B.N. Alternative RNA splicing generates a glycosylphosphatidylinosi-tol-anchored form of ceruloplasmin in mammalian brain / B.N. Patel, R.J. Dunn, S. David // J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275. - P. 4305-4310.

188. Percival S.S. Copper transport from ceruloplasmin: characterization of the cellular uptake mechanism / S.S. Percival, E.D. Harris // Am. J. Physiol. -1990.-Vol. 258.-P. 140-147.

189. Photodynamic generation of hydroxyl radicals by hematoporphyrin derivates and light / J. van Stevenick et al. // Photochem. Photobiol. 1986. -Vol. 44, №6.-P. 711-716.

190. Pulsed electron paramagnetic resonance studies of types I and II copper in Rhus vernicifera laccase and porcine ceruloplasmin / B. Mondovi et al. // Biochemistry. 1977. - Vol. 16. - P. 4198-4202.

191. Qian Z. M. Expression of iron transport proteins and excessive iron accumulation in the brain in neurodegenerative disorders / Z.M. Qian, Q. Wang // Brain Res. Rev. 1998. - Vol. 27. - P. 257-267.

192. Ran-2, a glial lineage marker, is a GPI-anchored form of ceruloplasminm / J.L. Salzer et al. // J. Neurosci. Res. 1998. - Vol. 54. - P. 147-157.

193. Ravin H. A. An inproved colorometric enzymatic assay of ceruloplasmin / H.A. Ravin //J. Lab. Clin. Med. 1961. - Vol. 58. - P. 161-168.

194. Reinhammar B. Laccase / B. Reinhammar // In Copper Proteins and Copper Enzymes (L. Lontie, ed.). CRC Press: Boca Raton, FL, USA, 1984. -Vol.3.-P. 1-35.

195. Relative roles of albumin and ceruloplasmin in the formation of homocystine, homocysteine-cysteine-mixed disulfide, and cystine in circulation / S. Sen-gupta et al. //J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276. - P. 46896-46904.

196. Reunanen A. Serum ceruloplasmin level and the risk of myocardial infarction and stroke / A. Reunanen, P. Knekt, R.-K. Aaran // Am. J. Epidemiol. -1992.-Vol. 136.-P. 1082-1090.

197. Rice-Evans C. Erythrocytes, oxygen radicals, and cellular pathology / C. Rice-Evans // Oxygen Radicals: Systemic Events and Disease processes. Basel: Karger, 1990. P. 1-25.

198. Ryden L. Ceruloplasmin / L. Ryden // In Copper Proteins and Copper Enzymes (L. Lontie, ed). CRC Press: Boca Raton, FL, USA, 1984. - Vol. 3. -P. 37-100.

199. Ryden L. Evidence for proteolytic fragments in commercial samples of human ceruloplasmin / L. Ryden // FEBS Lett. 1971. - Vol. 18. - P. 321 -325.

200. Ryden L. Reinvestigation of some physicochemical and chemical properties of human ceruloplasmin (ferroxidase) / L. Ryden, I. Bjork // Biochemistry. -1976.-Vol. 15.-P. 3411-3417.

201. Sang Q.A. Specific proteolysis of ceruloplasmin by leukocyte elastase / Q.A. Sang//Biochem. Mol. Biol. Int. 1995. - Vol. 37. - P. 573-581.

202. Sato M. Mechanisms of copper incorporation during the biosynthesis of human ceruloplasmin / M. Sato, J.D. Gitlin // J. Biol. Chem. 1991. -Vol. 266.-P. 5128-5134.

203. Screening for Wilson's disease in patients with liver diseases by serum ceruloplasmin / E. Cauza et al. // J. Hepatol. 1997. - Vol. 27. - P. 358-362.

204. Serum ferritin and ceruloplasmin as coronary risk factors / M. Manttari et al.// Eur. Heart J. -1994. -Vol. 15.-P. 1599-1603.

205. Seshadri V. Dual role of insulin in transcriptional regulation of the acute phase reactant ceruloplasmin / V. Seshadri, P.L. Fox, C.K. Mukhopadhyay // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. - P. 27903-27911.

206. Solomon E.I. Structural and functional aspect of metal sites in biology / E.I. Solomon, U.M. Sundaram, T.E. Machonkin // Chem. Rev. 1996. -Vol. 96.-P. 2563-2605.

207. Spectroscopic and magnetic studies of human ceruloplasmin: identification of a redox-inactive reduced type 1 copper site / T.E. Machonkin et al. // Biochemistry. 1998. - Vol. 37. - P. 9570-9578.

208. Spectroscopic studies of ceruloplasmin. Electronic structures of the copper sites / J.H. Dawson et al. // J. Am. Chem. Soc. 1979. - Vol. 101. -P. 5046-5053.

209. Stimulation of reactive oxygen species production by an antidepressant visible light source / D.A. Oren et al. . // Biol. Psychiatry. 2001. - Vol. 49. -P. 464-467.

210. Structural studies of asparagine-linked sugar chains of human ceruloplasmin / K. Yamashita et al. // J. Biol. Chem. 1981. - Vol. 256.-P. 1283-1289.

211. Sunderman F.W. Measurement of human serum ceruloplasmin by its p-phenylenediamine oxidase activity / F.W. Sunderman, S. Nomoto // Clin. Chem.- 1970.-Vol. 16.-P. 903-910.

212. Swain J.A. Peroxynitrite releases copper from caeruloplasmin: implications for atherosclerosis / J.A. Swain, V. Darley-Usmar, J.M.C. Gutteridge // FEBS Letters. 1994. - Vol. 342. - P. 49-52.

213. Targeted gene disruption reveals an essential role for ceruloplasmin in cellular iron efflux / Z.L. Harris et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. -Vol. 96.-P. 10812-10817.

214. The effect of high ascorbic acid supplementation on body iron stores / J.D. Cook et al. // Blood. 1984. - Vol. 64. - P. 721-726.

215. The reaction of CN" with the binuclear copper site of Neurospora tyrosinase: its relevanse for a comparison between tyrosinase and hemocyanin active sites / M. Beltramini et al. // Biochim. Biophys. Acta. 1990. -Vol. 1040.-P. 365-372.

216. The relative contribution of vitamin E, urate, ascorbate, and proteins to the total peroxyl radical-trapping antioxidant activity of human blood plasma / D.D.M. Wayner et al. // Biochim. And Biophys. Acta. 1987. - V01. 924. -P. 408-419.

217. The X-ray structure of human serum ceruloplasmin at 3.1 A: nature of the copper centres /1. Zaitseva et al. // J. Biol. Inorg. Chem. 1996. - Vol. 1. -P. 15-23.

218. Tuner J. Laser therapy in dentistry and medicine / J. Tuner, L. Hodl. Prima Books AB.- 1996.- 156 p.

219. UVA-induced immunosuppression / G.M. Halliday et al. // Mutation Research / Fundamental and Molecular Mechanism of Mutagenesis. 1998. -Vol. 422, №9. -P. 139-145.

220. Vitamin C at concentrations observed in premature babies inhibits the fer-roxidase activity of caeruloplasmin / H.J. Powers et al. // Free Rad. Res. -1995.-Vol. 22.-P. 57-65.

221. Weber K. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sul-fate-polyacrilamide gel electrophoresis / K. Weber, M. Osborn // J. Biol. Chem. 1969. - Vol. 244, № 16. - P. 4406-4412.

222. Weiss J.J. Oxygen ischemia and inflammation / J.J. Weiss // Acta Physiol. Scand. 1984. -Suppl. 548. - P. 9-57.

223. X-ray crystal structure of the blue oxidase ascorbate oxidase from zucchini. Analysis of the polypeptide fold and a model of the copper sites and ligands / A. Messerschmidt et al. // J. Mol. Biol. 1989. - Vol. 206. - P. 513-529.

224. Xu D.P. a-Lipoic acid dependent regeneration of ascorbic acid from dehy-droascorbic acid in rat liver mitochondria / D.P. Xu, W.W. Wells // J. Bio-energ. And Biomembrane. 1996. - Vol. 28. - P. 77-85.

225. Young S.N. A method for obtaining linear reciprocal plots with caeruloplasmin and its application in a study of the kinetic parameters of caeruloplasmin substrates / S.N. Young, G. Curzon // Biochem. J. 1972. - Vol. 129. -P. 273-283.

Информация о работе

Рязанцев, Сергей Вячеславович
кандидата биологических наук
Воронеж, 2007
ВАК 03.00.02

Диссертация

Анализ структурно-функциональных изменений церулоплазмина человека в растворе и в составе крови при действии УФ- и лазерного излучений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы