Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Защита организма от окислительного стресса карнозином

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Стволинский, Сергей Лейбович, Москва

Государственное учреждение научно-исследовательский институт неврологии Российская Академия медицинских наук

На правах рукописи

СТВОЛИНСКИЙ Сергей Лейбович

ЗАЩИТА ОРГАНИЗМА ОТ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА КАРНОЗИНОМ: ЭКОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЙ ПОДХОД

Специальности: 03.00.16 - экология 03.00.04 - биохимия

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени

Президиум ВАК России

(решение от Н " г., N

присудил ученую степень ДОКТОРА

___ dtUPU ■__наук

ачальник управления ВАК России

Моск-ва=-~2ДО6--

Работа выполнена в лаборатории биохимии ГУ НИИ неврологии РАМН

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор

Доктор биологических наук, профессор

Доктор биологических наук, профессор

АРХИПЕНКО Юрий Владимирович КОДБНЦОВА Вера Митрофановна ОРЛОВА Валентина Сергеевна

Ведущая организация: Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук

Защита состоится 8 июня 2006 года в 14-00 на заседании

Специализированного совета Д.212.203.17 при Российском университете дружбы народов

по адресу: 113093, г. Москва, Подольское шоссе, д. 8/5, Экологический факультет РУДН, ауд. 302.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.б

Диссертация в виде научного доклада разослана 04 -МжЛ,_2006 г.

Ученый се ■гарь

Специал7 «энного Совета № Д.212.203.17

доктор ; чских наук, профес • ___Чижов А.Я.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение механизмов поддержания гомеостаза многоклеточного организма является одной из важнейших проблем современной экологии. Целостность и само существование организма обусловлены точностью регуляции гомеостаза, позволяющей тканям и клеткам организма согласованно осуществлять приспособительные реакции, сохраняя при этом свои специфические свойства. Клеточный гомеостаз подвергается в процессе жизнедеятельности организма воздействию повреждающих факторов эндогенного и экзогенного происхождения. Для защиты от них в клетках существуют механизмы, способные минимизировать изменения внутриклеточной среды, сохраняя клеточный метаболизм на оптимальном уровне. Эти механизмы, обеспечивающие стабильность внутренней среды организма, могут быть отнесены к компетенции внутренней экологии (эндоэкологии) и должны рассматриваться ка стыке ряда естественнонаучных дисциплин, среди которых наиболее важными являются экология, биохимия и физиология.

В последние десятилетия XX века исследованиями многих отечественных и зарубежных научных коллективов сформировано представление об участии активных форм кислорода (АФК) в нарушении клеточного гомеостаза и развитии многих патологических процессов в организме [Владимиров, Арчаков. 1972; Halliwell, Gutteridge, 1985; Yu, 1994; Козлов, 1973, 2000; Болдырев, 1995, 1999]. Особенностью АФК является то, что эти высокореакционные соединения образуются в ходе нормальных физиологических и метаболических процессов и выполняют функцию сигнальных молекул (вторичных мессенджеров) [Скулачев, 2001; Болдырев, 1999, 2003]. Для регуляции их уровня клетки обладают многокомпонентной системой. Она включает в себя как низкомолекулярные соединения (такие как аскорбат, глутатион, витамин Е, fi-каротин, трансферин, мочевая кислота), способные инактивировать АФК и образующиеся при их участии вторичные радикалы, так и «антиоксидантные» ферменты супероксиддисмутазу, каталазу, глутатионпероксидазу, а также некоторые лилолитические и протеолитические ферменты, разрушающие модифицированные окислением клеточные липиды и белки. Совокупная активность низкомолекулярных и ферментативных антиоксидантов, а также активно действующая в живых организмах система апоптоза, устраняющая необратимо измененные клетки [Скулачев, 2005], обеспечивают сохранение внутренней среды организма и поддержание его основных функций.

Дисбаланс между образованием АФК и их нейтрализацией компонентами антиоксидантной системы приводит к увеличению стационарного уровня радикальных соединений. Такое состояние называется «окислительным стрессом». Распространенным средством подавления окислительного стресса все чаще становятся синтетические антиоксиданты, применение которых

нарушает сигнальную роль АФК и ухудшает адаптационные возможности организма. На основе вышеизложенного актуальным является систематическое исследование таких природных антиоксидантов, как альфа-токоферол, аскорбиновая кислота, каротиноиды, карнозин, которые способны регулировать внутриклеточный уровень АФК, создавая условия, необходимые для поддержания клеточного гомеостаза и обеспечения эндоэкологической безопасности организма.

Карнозин ((З-аланил-Ь-гистидин) был впервые описан в составе мышечной ткани российскими биохимиками [Gulevitch, Amiradzhibi, 1900]. В организме человека и других млекопитающих он и родственные ему соединения обнаруживаются в больших количествах в скелетных мышцах, сердце, специфических отделах мозга (обонятельной луковице). В 1935 г. был впервые описан терапевтический эффект этого дипептида [Фролов и соавт., 1935], но только 1962 г. в России была зарегистрирована первая лекарственная форма (инъекционный раствор), применяемая как препарат общеукрепляющего действия. В 1969 г. появился первый патент на его медицинское применение в качестве препарата антимикробного действия [Elton et al.s 1971], а в 1990 г.~ новая отечественная лекарственная форма - «глазные капли». В течение нескольких десятилетий появлялись отдельные попытки применения карнозина в качестве общеукрепляющего средства, основанные на описанных в литературе терапевтических эффектах карнозина: антиревматическом [Фролов и соавт., 1935; 1936]; гипотензивном [Исиченко и соавт., 1939; Нормарк и соавт., 1940; Роднянский, 1941]; иммунорегуляторном [Nagai, 1986; Мальцева и соавт., 1991; антиаллергическом [Адо и соавт., 1977; Шарпань, 1984]; ранозаживляющем [Nagai, 1976; Шехтер и соавт., 1991]; противоопухолевом [Nagai, 1987]; антикатарактальном [Boldyrev etal., 1987].

Относительно слабый резонанс в использовании карнозина в медицинской практике был, однако, вызван тем обстоятельством, что механизмы действия карнозина на клеточном уровне оставались невыясненными, что ограничивало его исследование на организменном и тканевом уровне. Новый импульс исследованиям карнозина придало выявление у этого дипептида антиоксидантных свойств [Северин и соавт., 1984; Дупин, Стволинский, 1986; Boldyrev et al., 1987; Дупин и соавт., 1987]. Появились основания полагать, что карнозин (а, возможно, и его производные) может служить природным регулятором окислительного стресса на клеточном и тканевом уровне.

Целью настоящей работы явилась эндоэкологическая (биохимическая и физиологическая) характеристика роли окислительного стресса, вызванного воздействием на организм экзогенных и эндогенных повреждающих факторов, в развитии нарушений гомеостаза организма в целом и мозга, как наиболее чувствительного к воздействию АФК органа, и изучение способности природного антиоксиданта карнозина сохранять и восстанавливать биохимические параметры внутренней среды, важные для

обеспечения функциональной активности мозга и жизнедеятельности организма в целом.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Осуществить поиск биологических моделей, позволяющих изучать динамику развития окислительного стресса на уровне как целого организма, так и мозга, клеточных систем, субклеточных структур и систем in vitro.

2. Разработать комплекс биохимических и физиологических методов, позволяющих количественно оценивать степень проявления окислительного стресса, индуцированного экзогенными повреждающими факторами.

3. Оценить антистрессорные эффекты карнозина при воздействии экзогенных повреждающих факторов, провоцирующих развитие окислительного стресса в организме животных.

4. Оценить вклад в развитие старческих изменений организма дефицита антиоксидантных систем, развивающегося с возрастом, и возможности его коррекции методами антиоксидантной профилактики и терапии с помощью карнозина.

5. Охарактеризовать физиологические и биохимические изменения состояния мозга, вызванные воздействием экзогенных и эндогенных стрессорных факторов, и разработать профилактические и терапевтические подходы к применению карнозина для антиоксидантной защиты мозга при нарушениях его гомеостаза.

Научная новизна исследования

1. Предложены новые биологические модели и комплекс физиологических и биохимических тестов, предназначенные для изучения механизмов воздействия окислительного стресса на организм и роли антиоксидантной системы в поддержании гомеостаза.

2. В модельных экспериментах in vitro впервые показано прямое действие карнозина на активность ряда регуляторных ферментов (5-липоксигеназы, тирозингидроксилазы, миелопероксидазы, НАДФ-Н оксидазы).

3. Впервые показано, что карнозин может прямо взаимодействовать с первичными продуктами перекисного окисления липидов, нейтрализуя их, что может объяснить наблюдающуюся при интенсивной работе убыль карнозина в мышечной ткани.

4. Впервые описаны радиопротекторные свойства карнозина, обусловленные регуляцией соотношения уровней эндогенных радиотоксинов и радиопротекторов и активацией пролиферативной активности кроветворных стволовых клеток.

5. Впервые продемонстрирована эффективность карнозина как средства, повышающего устойчивость организма к переохлаждению и гипоксии.

6. Впервые описаны способность карнозина защищать мозг ог гипоксии и ишемии и его ноотропное действие.

7. Впервые охарактеризовано геропротекторное действие карнозина.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Продемонстрировано регулирующее влияние карнозина на активность ферментов, влияющих на гомеостаз организма в условиях развития окислительного стресса: 5 -липоксигеназы, обеспечивающей метаболизм арахидоновой кислоты по пути синтеза лейкотриенов; тирозингидроксилазы, регулирующей уровень катехоламинов; миелопероксидазы и НАДФН-оксидазного комплекса, ответственных за образование АФК фагоцитами. Выявлена способность карнозина повышать устойчивость эритроцитов к кислотному и окислительному гемолизу.

2. На препаратах изолированных мышц и субклеточных структур (саркоплазматического ретикулума) показано, что карнозин поддерживает высокую эффективность мышечных сокращений благодаря прямому взаимодействию с первичными продуктами перекисного окисления липидов, образующихся при усиленной мышечной работе. Наряду с этим в экспериментах с повышенной двигательной нагрузкой на организм установлено, что введение животным карнозина препятствует накоплению лактата в мышечной ткани, защищая ее от ацидоза. Таким образом, карнозин оказывает комплексное воздействие на мышечную ткань, способствуя поддержанию ее гомеостаза при физической нагрузке.

3. Установлены радиопротекторные свойства карнозина, обеспечивающие повышение выживаемости и средней продолжительности жизни экспериментальных животных, снижение уровня эндотоксина - гистамина на фоне повышения уровня эндогенного радиопротектора - серотонина, а также обусловливающие эффективность восстановления системы кроветворения за счет стимуляции пролиферативиом активности стволовых клеток.

4. Изучен процесс развития окислительного стресса, вызванного воздействием на организм переохлаждения и гипобарической гипоксии, и выявлена способность карнозина повышать выживаемость животных и обеспечивать поддержание гомеостаза мозга в условиях индуцированного этими повреждающими факторами окислительного стресса.

5. На моделях ишемии мозга в условиях развития окислительного стресса продемонстрированы антиишемические свойства карнозина, обусловливающие сохранение жизнеспособности животных, снижение тяжести неврологических нарушений, сохранение когнитивных функций. Показано, что карнозин не только препятствует образованию АФК, но и регулирует активность ферментов, ответственных за функциональное состояние мозга.

6. Установлено, что карнозин тормозит развитие процессов старения, обусловленные возрастным дефицитом антиоксидантных систем организма. Введение карнозина поддерживает антиоксидантный статус организма, улучшает физиологические н неврологические характеристики стареющих животных.

7. Карнозин повышает выживаемость и облегчает неврологическую симптоматику, развивающуюся при введении животным нейротоксинов 3-нитропропионата и М-метил-4-фенил-1,2,3,б-тетрагидропиридина на фоне гипоксии, ишемии или возрастного дефицита антиоксидантных систем.

8. Применение карнозина в условиях действия на организм эндо- и экзоэкологических факторов, провоцирующих развитие окислительного стресса, обеспечивает поддержание гомеостаза организма в целом и мозга, как наиболее чувствительного к окислительному стрессу органа.

9. Полученные результаты служат экспериментальным обоснованием целесообразности применения карнозина в качестве средства, характеризующегося комплексным механизмом защитного действия и целесообразного для применения в условиях воздействия на организм окислительного стресса различного генеза.

Теоретическая значимость работы. Полученные в работе результаты доказывают, что неврологические нарушения, наблюдающиеся при атаке на организм таких различных повреждающих факторов как переохлаждение, гипоксия, ишемия, ускоренное старение и воздействие нейротоксинов имеют в своей основе нарушения гомеостаза внутренней среды организма, вызванные развитием окислительного стресса и обусловленного им повреждения клеточных структур. В работе продемонстрирована эффективность антиоксидантной профилактики и терапии окислительных повреждений мозга с помощью дипептида карнозина, способного контролировать параметры гомеостаза организма.

Практическая значимость работы. При выполнении настоящего исследования были получены 3 авторских свидетельства на способ определения токсического действия водных сред и опубликовано методическое пособие «Эколого-токсикологический анализ на основе биологических мембран»; издано практическое руководство для студентов ВУЗов «Биологические мембраны»; получены патент на изобретение «Глазные капли для лечения катаракты» и патенты на изобретения, защищающие организм от воздействия неблагоприятных факторов: переохлаждения («Безалкогольный напиток «Морозко») и алкогольной интоксикации («Биологически активная пищевая добавка для алкогольных напитков»); проведены клинические испытания и доказана эффективность применения капель, содержащих карнозин, для лечения аллергических риноконъюктивитов; получено разрешение на производство разработанной на основе карнозина биологически активной пищевой добавки «СЕВИТИН», продемонстрирована ее эффективность для применения в спортивной медицине и начаты ее клинические испытания в качестве дополнительного препарата при лечении неврологических заболеваний. Взятые в совокупности результаты исследования доказывают возможность широкого применения карнозина в качестве профилактического и терапевтического средства при различных патологиях, сопровождающихся развитием окислительного стресса.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на следующих международных и российских научных конференциях: Болгаро-Советский симпозиум «Свободные радикалы и биоантиоксиданты» (София, 1987); «Биохимия - медицине. Молекулярные механизмы формирования патологических состояний» (Ленинград, 1988); IV Всесоюзная конференция по биохимии мышц (Тбилиси, 1989); Всесоюзное совещание «Физиологическое и клиническое значение регуляторных пептидов» (Пущино, 1990); VI (Martin, Slovakia, 1993), VII (Kurashika, Japan, 1995), X (Firenze, Italy, 2001) и XI (Martin, Slovakia, 2003) International Symposia "New frontiers in the biochemistry and biophysics on the diagnosis and treatment of stroke, neurotrauma and other neurological diseases"; Российская научная конференция «Антигипоксанты и актопрогекторы». (С.-Петербург, 1994); International Symposium on natural antioxidants: molecular mechanisms and health effects (Beijing, China, 1995); I Дальневосточная региональная конференция «Новые медицинские технологии на Дальнем Востоке» (Хабаровск, 1996); Первый Российский конгресс по патофизиологии "Патофизиология органов и систем: типовые патологические процессы" (Москва, 1996); VIII, IX International Congresses of the Czech and Slovak Neurochemical Societies (Martin, Slovakia, 1996, 1998); International Workshop "Oxidative stress: molecular mechanisms and pathophysiological consequences of oxidative damage in membranes and lipoproteins" (Styria, Austria, 1996); II съезд Биохимического общества (Пущино, 1997); III International Congress of the Polish Neuroscience Society (Lodz, Poland, 1997); II Национальный конгресс Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (Москва, 1998); III International Congress of Pathophysiology (Lahti, Finland, 1998); II Научная конференция «Актуальные вопрос�