Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Закономерности проявления триацилглицероллипазной активности у холерных вибрионов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Закономерности проявления триацилглицероллипазной активности у холерных вибрионов"

На правах рукописи

АГАФОНОВА ВИКТОРИЯ ВЛАДИСЛАВОВНА

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПРОЯВЛЕНИЯ ТРИАЦИЛГЛИЦЕРОЛЛИПАЗНОЙ АКТИВНОСТИ У ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ставрополь - 2009

003472061

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения Ростовском-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Телесманич Наталья Робертовна.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Буравцева Нина Пантелеймоновна;

доктор медицинских наук Яговкин Эдуард Александрович.

Ведущая организация:

ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора.

Защита диссертации состоится « » 2009 г.

в ^/с/. часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.256.09 в Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корп. 2, комн. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета

Автореферат разослан « »__2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

И.В. Ржепаковский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В соответствии с основными критериями, определяющими вероятность использования микроорганизмов в качестве биологического оружия, возбудитель холеры отнесен к категории В - высокоприоритетных патогенов (Онищенко Г.Г., 2000; Кутырев В.В., 2007; Ломов Ю.М., 2007, 2008). В этой связи продолжает оставаться актуальным вопрос о факторах, определяющих патогенность и эпидзначимость холерных вибрионов, методах их выявления, разработка которых требует углубленного и всестороннего изучения биологии возбудителя холеры. Попадая в макроорганизм, патоген сталкивается с защитными структурами мембран клеток в виде белков, углеводов и липидов. И в то время как хорошо изучены белковый и углеводный обмены возбудителя холеры, механизмы преодоления липидных барьеров продолжают оставаться неизученными. В настоящее время способность продуцировать липазы установлена и изучена у целого ряда патогенных и непатогенных микроорганизмов. Однако существующие данные по изучению микробных липаз часто являются отрывочными и несопоставимыми, т.к. получены на различных субстратах, отличающихся разной степенью дисперсности (Брокерхофф X. с соавт., 1978). В нашей работе мы обратились к вопросу изучения липазной активности холерных вибрионов, учитывая то обстоятельство, что присутствующие в клетках возбудителя холеры ферменты с липолитической активностью рассматриваются в качестве возможных факторов патогенности (Fiore Е., 1997; Ogierman М.А., 1997). Установлено, что ген, ответственный за продукцию липазы, характерен для всех микроорганизмов, относящихся к Vibrio cholerae (Fiore Е., 1997; Harris J.R., 2002). Также была установлена (Casanova Т.В., 1995) высокая степень гомологии липазы Pseudomonas spp. с геном липазы холерных вибрионов, обозначенным (hlyC или lipA), на основании чего сотрудниками РостНИПЧИ (Телесманич Н. Р.с соавт, 2006) были разработаны методы ее выявления у холерных вибрионов: серологическая детекция липазы с помощью антилипазного полимерного диагностикума, сконструированного на основе иммуноглобулинов к липазе Pseudomonas spp. фирмы «Sigma», и бактериологическое выявление липазной активности с применением жиров в питательной среде. Были определены корреляционные связи липазной и гемолитической активностей холерных вибрионов эльтор, выделенных из объектов окружающей среды, предложена возможность дифференциации токсигенных и атоксигенных вариантов. Однако результатов проведенных исследований недостаточно для общего понимания закономерностей проявления липазной активности, так как объектами в экспериментах служили холерные вибрионы только биоварианта эльтор и штаммы, выделенные исключительно из объектов окружающей среды. При этом липазная активность вибрионов классического биовара, 0139 серо-группы, а также холерных вибрионов не Ol/не 0139 серогрупп с различными генетическими характеристиками формулы эпидзначимости, выделенных из различных источников, остается не изученной, в то время как разнообразие геноти-пических форм, свойственное возбудителю холеры, может определять неодинаковое фенотипическое проявление липазной активности у разных вариантов холерных вибрионов, что обусловливает актуальность нашего исследования.

Цель работы: изучение закономерностей проявления триацилглицеролли-пазной активности холерных вибрионов 01 серогруппы биоваров эльтор и классического, вибрионов 0139 и не 01/не 0139 серогрупп.

Задачи исследования.

1. Приготовление новых серий антилипазного диагностикума на основе иммунных сывороток, полученных в результате применения различных схем иммунизации животных, позволяющих повысить чувствительность диагностического препарата.

2. Изучение способности холерных вибрионов 01 серогруппы классического биовара и эльтор, вибрионов 0139 и не 01/не 0139 серологических групп продуцировать липазу, выявляемую с помощью антилипазного диагностикума в РАО.

3. Выявление липазной активности холерных вибрионов различных биоваров и серологических групп на питательных средах с добавлением различных жиров.

4. Изучение закономерностей проявления гидролазной активности холерных вибрионов различных серологических групп по отношению к глицерину как составляющей триацилглицероллипазной активности.

5. Конструирование питательной среды с использованием в качестве стандартного субстрата глицерина для гидролазной активности, как составляющей глицероллипазной активности холерных вибрионов.

6. Изучение возможности стандартизации бактериологического метода дифференциации токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов на основе гидролазной активности по отношению к глицерину.

Научная новизна. Впервые с помощью бактериологического метода выявлена липазная активность вибрионов 0139 серогруппы, в то время как в серологическом методе РАО с помощью антилипазного диагностикума показано, что продуцируемая этим вариантом возбудителя холеры липаза серологически не гомологична липазе Pseudomonas spp. и вибрионов эльтор. Впервые показано, что способность к продукции липазы холерных вибрионов эльтор (токсигенных и атоксигенных) через 24 часа является дифференциальным признаком между вибрионами Ol классического и эльтор биоваров.

Впервые выявлена зависимость проявления липазной активности от состава питательных сред, содержащих определенные добавки. Показано, что добавление глицерина 3% в бульон Мартена способствует увеличению продукции липазы холерными вибрионами, что позволяет достичь наиболее точных результатов в изучении способности холерных вибрионов к продукции липазы, выявляемой серологическим методом РАО. Впервые определено, что продукция липазы гемолитическими вибрионами эльтор более активно проявляется при выращивании штаммов в триптоновой среде без ионов железа или с минимальной концентрацией FeCb, что подтверждает корреляционные связи липазной и гемолитической активностей холерных вибрионов эльтор. Впервые для идентификации холерных вибрионов эльтор предложен полимерный диагностический препарат, позволяющий выявлять гемолитические атоксигенные штаммы вибрионов эльтор на этапе скрининга подозрительных колоний.

Впервые липазная активность холерных вибрионов разных биоваров и серо-групп была изучена на питательных средах, содержащих широкий спектр жиров различного происхождения. Показано разнообразие проявления ацилгидро-лазной активности у различных групп холерных вибрионов различной эпидемической значимости в ответ на находящийся в питательной среде субстрат. Впервые изучена гидролазная активность холерных вибрионов по отношению к глицерину. Показана возможность дифференциации гемолитических и негемолитических штаммов холерных вибрионов эльтор и 0139 серогруппы на основе проявления ими гидролазной активности. Впервые предложен стандартный субстрат - глицерин - для конструирования дифференциальной среды, предназначенной для выявления гемолитических вариантов холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп на основе проявления ими гидролазной активности. Впервые при помощи бактериологического и серологического методов показана корреляционная связь триацилглицероллипазной, гидролазной (в отношении глицерина) и гемолитической активностей холерных вибрионов эльтор, 0139 серогруппы и вибрионов различных не 01/не 0139 серогрупп.

Теоретическая и практическая значимость результатов исследований.

Изучение триацилглицероллипазной активности расширило наши познания в сфере липидного обмена и биологии возбудителя холеры. Были выявлены отличия по липолитической активности между различными вариантами холерных вибрионов, выделенными из различных источников, на основании которых возможно дифференцировать атоксигенные гемолитические варианты вибрионов от токсигенных негемолитических.

Установлено, что липазы вибрионов эльтор, классического биовара и 0139 серогруппы являются серологически различными. С помощью антилипазного полимерного иммуноглобулинового диагностикума, сконструированного с применением биотехнологических подходов на основе чужеродного, но высокогомологичного антигена липазы Pseudomonas spp. (степень гомологии 93,7%), показано, что последний не образует в РАО иммунобиологического комплекса антиген-антитело с липазой вибрионов классического биовара и 0139 серогруппы, что свидетельствует о возможной различной их аминокислотной последовательности. При этом липазная активность холерных вибрионов классического биовара и 0139 серогруппы проявляется при культивировании на средах с добавлением жировых субстратов и глицерина.

Установлено, что гемолитичные (атоксигенные) холерные вибрионы эльтор, выделенные от человека, продуцируют липазу через 4 часа культивирования в мясопептонном бульоне, в то время как негемолитичные не проявляют липаз-ной активности через данный промежуток времени, что дает возможность дифференцировать штаммы эльтор по продукции липазы в РАО на гемолитичные и негемолитичные, независимо от источника выделения (человек или ООС). Показано, что гемолитичные (атоксигенные) и негемолитичные (токсигенные) штаммы холерных вибрионов эльтор, независимо от источника выделения, способны продуцировать липазу через 24 часа культивирования в мясопептонном бульоне, выявляемую в РАО с применением антилипазного Pseudomonas spp. диагностикума. Определены добавки - глицерин и гидролизат казеина - в

жидкие питательные среды для культивирования холерных вибрионов с целью выявления липазы в РАО с помощью антилипазного иммуноглобулинового Pseudomonas spp. диагностикума, которые позволяют повысить чувствительность серологического метода при выявлении гемолитических штаммов вибрионов эльтор. Выявлены корреляционные изменения гемолитической активности и продукции липазы холерных вибрионов при культивировании их в средах с различным содержанием ионов железа. Показана возможность использования метода РАО с применением антилипазного диагностикума в схеме идентификации холерных вибрионов на этапе скрининга подозрительных на холеру колоний под контролем агглютинации с 01-холерной сывороткой.

Показана возможность выявления гидролазной активности у гемолитических штаммов холерных вибрионов при культивировании на плотной питательной среде с добавлением глицерина в качестве субстрата. Показана возможность дифференциальных свойств гидролазной активности холерных вибрионов, проявляющейся на среде с добавлением глицерина. Предложено стандартизировать бактериологический метод дифференциации токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов Ol и 0139 серогрупп на основе различной способности гемолитических и негемолитических штаммов к гидролизу глицерина, являющегося стандартным субстратом в сравнении с жирами.

Установлено, что экспрессия липолитических свойств атоксигенных гемолитических холерных вибрионов эльтор более выражена и обнаруживается в более короткие сроки культивирования в жидких и на плотных питательных средах, чем у токсигенных негемолитических вариантов, что имеет важное диагностическое и дифференциальное значение.

Усовершенствована схема получения антилипазной сыворотки к липазе Pseudomonas spp. с целью дальнейшего конструирования полимерного диагностического иммуноглобулинового препарата для выявления гемолитических штаммов холерных вибрионов в РАО. Разработан режим лиофилизации антилипазного диагностикума, обеспечивающий стабильность препарата при хранении без снижения его активности в течение двух лет.

Показаны корреляционные связи ацилглгидролазной и гемолитической активностей холерных вибрионов, выявленные с помощью комплексного методического подхода, включающего серологический и бактериологический методы, которые открывают перспективы дальнейшего совершенствования дифференциальной диагностики. Данные методы, предназначенные для обнаружения и изучения триацилглицероллипазной активности холерных вибрионов, можно применять в лабораторной практике при проведении исследований с различными вариантами возбудителя холеры, с целью более глубокого изучения биохимических особенностей вибрионов, а также в системе эпиднадзора за холерой.

Метод РАО с применением антилипазного диагностикума включен в методический документ «Серологические методы в диагностике холеры» (дополнение к МУ 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры»), утвержденные в 2008 г. Главным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко. Получен патент на изобретение «Способ выявления атоксигенных гемолитичных штаммов холерных вибрионов» (№2261444, от 27 сентября 2005 г.). Оформлена и утверждена директором инсти-

тута «Инструкция по изготовлению и контролю диагностикума антилипазного иммуноглобулинового полимерного сухого для выявления в РАО гемолитичных штаммов холерных вибрионов» (протокол №1 от 13.01.05). Депонирован в ГКПВ «Микроб» штамм холерных вибрионов Ol V. cholerae КМ 254 в качестве тест-штамма, который предложено использовать как положительный контроль в реакции агломерации объемной. Получена справка № 2008117194 о приоритете в оформление патента «Способ дифференциации атоксигенных штаммов холерных вибрионов от токсигенных на основе гидролазной активности».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Липаза холерных вибрионов биовара эльтор, выявляемая в реакции агломерации с помощью антилипазного диагностикума, серологически отличается от липазы вибрионов 0139 серогруппы. Отсутствие у классических вибрионов продукции липазы, гомологичной липазе Pseudomonas spp. и вибрионов эльтор, определяет возможность дифференциации биоваров.

2. Холерные вибрионы способны проявлять липазную активность по отношению к широкому спектру жиров различного происхождения на питательных средах. Однако проявления триацилгидролазной активности у холерных вибрионов разных биоваров, серологических групп и токсигенности различаются, что обусловливает разные критерии ее оценки у разных групп холерных вибрионов.

3. Гемолитические холерные вибрионы способны проявлять гидролазную активность на питательной среде с добавлением глицерина, что обусловливает его использование в качестве стандартного субстрата для дифференциации токсигенных и атоксигенных штаммов холерных вибрионов бактериологическим методом.

4. Гемолитические холерные вибрионы не Ol/не Ol39 различных серогрупп способны продуцировать липазу, гомологичную липазе Pseudomonas spp. и вибрионов эльтор, выявляемую серологическим методом РАО, а также проявлять триацилгидролазную активность при культивировании штаммов на питательной среде с жирами и глицерином.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 13 научных конференциях: Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы», (Ростов-на-Дону, 2004-2008 гг.); Всероссийская научно-практическая конференция «Медицинская микробиология - XXI век», (Саратов, 2004 г.); IV Межвузовская международная конференция «Обмен веществ при адаптации и повреждении», (Ростов-на-Дону, 2005 г.); VII Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников СНГ», (Оболенск, 2006 г.); Научно-практическая конференция «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России», (Ставрополь, 2007 г.); IX съезд Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, (Москва, 2007 г.); Международная конференция «Vibrio 2007», (Париж, 2007 г.); VII Межвузовская международная конференция с международ, участ. «Обмен веществ при адаптации и повреждении»,

(Ростов-на-Дону, 2008 г.); IX Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников СНГ», (Волгоград, 2008 г.). Получены акты внедрения в лабораторную практику разработанного антилипазного диагностического препарата от ФГУЗ «ЦГиЭ» Свердловской обл.; ФГУЗ Иркутский ПЧИ Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора; ФГУЗ ПЧЦ Роспотребнадзора.

Публикации результатов исследований. По теме диссертационного исследования опубликована 21 работа, в том числе две из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени, получен один патент на изобретение и «Инструкция по изготовлению и контролю».

План диссертационной работы утвержден на заседании Ученого совета ФГУЗ РостНИПЧИ Роспотребнадзора 27.06.07 (протокол №3). Исследования выполнены в рамках плановых научных тем: № 0120.0 507857 «Триацилглице-роллипазная активность холерных вибрионов 01»; № 01. 2. 007 07281 «Ли-пазная и адгезивная активности холерных вибрионов не 01 серогруппы»

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 197 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4-х глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 156 работ отечественных и 144 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 21 рисунком.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В работе проведено комплексное изучение липазной активности у 608 штаммов холерных вибрионов: V. cholerae cholerae (41 штамм), V. cholerae eltor (365 штаммов) и V. cholerae 0139 (64 штамма) с различной генотипической характеристикой, V. cholerae non-01/0139 (138 штаммов); 58 штаммов представителей рода Vibrio: V. metschnikovi, V. parahaemolyticus, V. mimicus, V. vulnificus, V.fluvialis, V.furnissii, V. alginolyticus, а также 49 штаммов энтеробактерий: Proteus vulgaris, Proteus morganii, Salmonella tiphi, Shigella dispar, Shigella sonni, Shigella paradesenteria, Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia krietensenii, Yersinia intermedia, Yersinia frederiksen, 7 штаммов Pseudomonas spp. Все культуры получены из коллекции музея живых культур ФГУЗ РостНИПЧИ.

Применили нескольких схем иммунизации животных (взрослых кроликов) коммерческим препаратом липазы Pseudomonas spp. и охарактеризовали иммунные сыворотки, на основе которых получили новые серии специфичного и чувствительного полимерного антилипазного диагностикума. Определение количества белка в сыворотках и в выделенных иммуноглобулинах проводили согласно методу Лоури (1951). Антилипазные антитела из иммунной сыворотки

выделяли методом Dubert. Реакцию преципитации в геле ставили по методу О. Ouchterlony (1965). Дот-блот проводили согласно методике H. Towbin (1984).

Выявление антигена липазы у исследуемых штаммов проводили в реакции агломерации объемной (РАО) с иммобилизированными на микросферах (ла-тексных частицах) антителами к липазе Pseudomonas spp. Для постановки реакции агломерации 18-24-х часовую агаровую культуру холерных вибрионов засевали в бульон. Через 4 и 24 часа подращивания культуры холерных вибрионов в при 37 °С ставили реакцию. В лунки планшета для иммунологических реакций разливали 50 мкл 1% раствора нормальной кроличьей сыворотки (НКС). В первую лунку ряда вносили по 50 мкл исследуемой бульонной культуры вибрионов и титровали двукратно до 6-ой лунки включительно. Затем в каждую лунку добавляли по 25 мкл антилипазного диагностикума. Положительный результат «+» - образование «зонтика» - указывает на наличие в бульонной культуре антигена липазы. Отрицательный результат - диагностикум выпадает в осадок на дно лунки - свидетельство того, что исследуемый штамм не обладает липазной активностью. Реакция сопровождается двумя контролями на отсутствие спонтанной агломерации. В качестве положительного контроля использовали препарат липазы Pseudomonas spp. и бульонную культуру депонированного в Государственной коллекции патогенных вибрионов института «Микроб» штамма холерных вибрионов Ol Vibrio cholerae KM № 254.

Для выявления липазной (триацилглицероллипазной, триацилгидролазной) активности холерных вибрионов бактериологическим методом применяли сконструированные нами питательные среды с добавлением субстратов и индикатора. В питательную среду агар Мартена pH 9,0±0,1 в качестве субстрата вводили жиры (куриный и индюшиный жиры, подсолнечное, оливковое, кукурузное, льняное, облепиховое, сливочное, камфорное, скипидаровое, вазелиновое масла) в конечной концентрации 1,0-1,5% (1,0-1,5 мл/100 мл среды), детергент - «Прогресс» 0,1мл/100 мл среды и индикатор Нильский голубой сульфат 1,0-1,2 мг/100 мл среды. Для проявления гидролазной активности холерных вибрионов в агар Мартена pH 9,0±0,1 в качестве субстрата вводили глицерин в конечной концентрации 2,5% (2,5 мл/100 мл среды) и индикатор Нильский голубой сульфат 1,0-1,2 мг/100 мл среды. В соответствии с методикой C.B. Быр-дарова (1965) в модификации Н.Р. Телесманич (2006), наличие липазной активности у холерных вибрионов при росте на средах с жирами оценивают через 48 часов роста культур по образованию плотного с восковым налетом непрозрачного микрогазона; отсутствие липазной активности характеризует нежный диффузно-расплывшийся рост культур голубого цвета.

Результаты исследований и их обсуждение

Сравнительный анализ иммунных сывороток к липазе Pseudomonas spp., используемых для получения антилипазного полимерного диагностикума

для РАО. В связи с расширением спектра изучаемых групп холерных вибрионов первым этапом нашей работы явилось получение новых серий антилипазного диагностикума и возможность повышения чувствительности препарата за счет подбора оптимальной схемы иммунизации животных. Полученные нами сыворотки содержали специфические антитела, выявленные в реакции преци-

питации с коммерческим препаратом липазы. Из полученных данных имму-ноблотинга следует, что наибольшей активностью (титр антител против липазы псевдомонад - 1/6400) при высокой специфичности обладали сыворотки, полученные при использовании препарата «Тактивина» в иммунизации животных, который позволяет увеличить продукцию специфических антител и повысить чувствительность диагностического препарата.

Изучение способности холерных вибрионов разных биоваров и серо-групп продуцировать липазу, выявляемую в РАО. В работе показано, что у гемолитических атоксигенных вибрионов эльтор, выделенных от человека, сохраняется тенденция к продукции липазы, которая выявляется в реакции агломерации (РАО) через 4 часа культивирования штаммов в бульоне, как было выявлено ранее Н.Р. Телесманич (2006 г.) у холерных вибрионов, выделенных из объектов окружающей среды (ООС). В то же время у токсигенных вариантов продукция липазы выявляется только через 24 часа. При этом нами определено, что все штаммы вибрионов эльтор (365 штаммов), выделенные из различных источников (человек или ООС), независимо от токсигенности и гемолитично-сти, продуцируют липазу, выявляемую в РАО через 24 часа культивирования. В то же время у представителей классической холеры при сходных условиях культивирования антилипазный диагностикум не выявлял липазу, серологически идентичную липазе вибрионов эльтор, что позволяет дифференцировать вибрионы 01 внутри вида по принадлежности к биовару классическому и эльтор. При этом, возможность выявления липазы у гемолитических штаммов эльтор через 4 часа культивирования является основой для внутривидовой дифференциации токсигенных и атоксигенных вариантов холерных вибрионов эльтор, в отличие от липазы негемолитических штаммов, выявление которой возможно через 24 часа, что позволяет дифференцировать биовары классический и эльтор (рис. 1). Полученные нами данные позволяют дифференцировать классические и эльтор вибрионы первоначально по способности к гемолизу эритроцитов барана, а теперь по выявлению липазы у эльтор вибрионов с применением серологического метода - РАО при культивировании их в течение 24-х часов и по отсутствию способности к проявлению липазной активности у классических штаммов. В серологическом тесте РАО мы определили, что антилипазный Pseudomonas spp. диагностикум не выявлял липазу у холерных вибрионов 0139 независимо от токсигенности и гемолитичности штаммов. При этом нами не исключается, что штаммы классического биовара и вибрионы 0139 се-рогруппы все же способны продуцировать липазу, но серологически отличную от липазы эльтор вибрионов, что обусловило продолжение наших исследований.

Изучение возможности использования метода РАО с антилипазным диа-гностикумом на этапе выделения холерных вибрионов. С целью расширения диагностических возможностей метода РАО с антилипазным диагностику-мом была изучена возможность применения его на стадии выделения культуры возбудителя холеры.

4 часа 1

культивиро- 2

вания 3

4

12 часов 1

культивиро- 2

вания 3

4

24 часа 1

культивиро- 2

вания

3

4

Рисунок 1 - Выявление липазы у холерных вибрионов эльтор и классического биовара с помощью антилипазного диагностикума в РАО.

Цифрами 1 и 2 обозначены вибрионы классического биовара; 3 - токсигенный негемолитический штамм биовара эльтор; 4 - атоксигенный гемолитический штамм биовара эльтор. Результат реакции в случае классических вибрионов (№ 1, 2) отрицательный.

В связи с этим был проведен подбор питательных сред для подращивания холерных вибрионов с дальнейшей постановкой РАО, и изучена специфичность метода РАО в реакции с близкородственными холерным вибрионам микроорганизмами. Корреляционные изменения проявления липазной и гемолитической активностей холерных вибрионов эльтор, зависящие от состава жидких питательных сред, позволили нам определить спектр стандартных жидких сред -мясопептонный бульон, бульон LB, и сред с добавками - бульон Мартена с гид-ролизатом казеина (5%) и бульон Мартена с глицерином (3%), при культивировании в которых мы отмечали высокий уровень продукции липазы гемолитическими холерными вибрионами эльтор при сохранении возможности дифференциации токсигенных и атоксигенных вибрионов эльтор. Добавление глицерина в бульон для культивирования штаммов с дальнейшей постановкой РАО способствует повышению продукции липазы гемолитическими холерными вибрионами, что увеличивает процент выявления гемолитических штаммов при постановке реакции агломерации с антилипазным диагностикумом. При этом для постановки РАО глицерин в составе жидкой питательной среды увеличивает продукцию липазы у гемолитических холерных вибрионов эльтор, а в бактериологическом методе, являясь стандартным субстратом, дает возможность дифференциации токсигенных и атоксигенных штаммов вибрионов эльтор и 0139 серогруппы. Полученные данные об отсутствии перекрестной реакции антилипазного препарата со штаммами энтеробактерий и нехолерных вибрионов при постановке реакции агломерации с 4-часовыми бульонными культурами свидетельствуют о высокой специфичности метода в отношении гемолитических штаммов холерных вибрионов эльтор. Возможное выявление липазы у некоторых представители рода Vibrio и рода Pseudomonas при выращивании

штаммов в бульоне в течение 24 часов не препятствует специфической дифференциальной диагностике гемолитических штаммов холерных вибрионов эль-тор. Таким образом, нами определено, что метод РАО специфически выявляет гемолитические холерные вибрионы в 100% исследуемых проб при работе с 4-х часовыми бульонными культурами. С применением искусственно созданных экосистем было показано, что метод РАО с антилипазным диагностикумом можно применять для выявления гемолитических штаммов вибрионов эльтор на этапе отбора подозрительных колоний под контролем 01-холерной сыворотки, что позволяет получить ориентировочный ответ о видовой принадлежности и одновременно эпидемической значимости выделенной культуры через 6 часов от начала исследования.

Выявление липазной активности холерных вибрионов бактериологическим методом на питательных средах с добавлением различных видов жиров и глицерина. Нами показано, что проявления триацилглицероллипазной активности у холерных вибрионов разных биоваров, серогрупп и токсигенности отличается, что обусловливает разные критерии ее оценки у разных групп холерных вибрионов. Изучение липазной активности у холерных вибрионов эльтор, выделенных из различных источников, бактериологическим методом показало, что атоксигенные гемолитические штаммы, продуцирующие липазу, выявляемую в РАО, проявляют липазную активность на средах с различными жирами (рост в виде плотных с восковым налетом колоний). В свою очередь ток-сигенные негемолитические варианты вибрионов эльтор вырастают в виде нежных голубых колоний (пленок), что является показателем отсутствия фенотипи-ческого проявления липазной активности в соответствии с предложенными ранее критериями оценки (Телесманич Н.Р., 2006) (рис. 2А).

Культуры холерных вибрионов классического биовара испытывали значительное подавление роста, вплоть до полного его отсутствия, на секторах агара с жирами. Часть штаммов вырастали в виде единичных колоний, не проявляя липолитической активности, т.е. образовывали голубые полупрозрачные колонии (рис. 2Б). В результате, критерием определения липазной активности штаммов классического биовара при данных условиях культивирования служит соответственно их способность к росту на средах с добавлением жиров. Полученные данные согласуются с результатами невозможности серологического выявления продукции липазы с помощью антилипазного диагностикума у представителей классической холеры.

Токсигенные представители 0139 серогруппы также испытывали ингибиру-ющее влияние масел в составе питательной среды, аналогично вибрионам классического биовара. В то же время установлено, что гемолитические атоксигенные холерные вибрионы 0139 серогруппы способны проявлять триацилглице-роллипазную активность в отношении различных жиров, что характеризуется специфическим ростом (образование плотного с восковым налетом микрогазона) на дифференциальных средах (рис. 2В). Следовательно, выявление липазной активности у гемолитических штаммов 0139 серогруппы бактериологическим методом на питательной среде и невозможность регистрации ее продукции в РАО с антилипазным диагностикумом свидетельствует о том, что гемоли-

тические вибрионы 0139 все же способны продуцировать липазу, но, возможно, серологически отличную от липазы вибрионов эльтор. Таким образом, нами определены следующие критерии оценки гидролиза жиров для каждого из вариантов холерных вибрионов, приведенные в таблице 1 (рост и активный гидролиз субстрата, рост без активного гидролиза субстрата и подавление роста): 1) для гемолитических штаммов вибрионов биовара эльтор (с1х'Н1у+) характерен рост с активным гидролизом жиров; для токсигенных негемолитических (с1х+Н1у') штаммов характерен рост, но без активного гидролиза жиров; 2) для вибрионов классического биовара характерно ингибирование роста на средах с жирами или образование единичных колоний без гидролиза субстрата; 3) для гемолитических вибрионов 0139 серогруппы (с1х"Н1у+) характерен рост с активным гидролизом жиров; для токсигенных негемолитических штаммов 0139 (йх +Н1у') свойственно подавление роста.

С целью совершенствования дифференциальной диагностики холерных вибрионов бактериологическим методом в нашей работе рассматривается возможность замены жиров на глицерин, который можно использовать в качестве стандартного субстрата. Глицерин является трехатомным спиртом, составляющим «остов» липидов - триглицеридов, которые служат субстратами для липолити-ческих ферментов микроорганизмов. При этом и сам глицерин в неэтерифици-рованном состоянии может стать субстратом, направленный гидролиз которого происходит в а, ^-положениях. Нами установлено, что гемолитические холерные вибрионы (с1х"Н1у+) биовара эльтор и 0139 серогруппы способны проявлять гидролазную активность на питательной среде с добавлением глицерина, что обусловливает его использование в качестве стандартного субстрата в питательной среде. При этом гемолитические штаммы эльтор и 0139 образовывали на секторах агара плотные белесого цвета микрогазоны, что свидетельствовало о проявлении штаммами а, /?-гидролазной активности в отношении глицерина, в то время как негемолитические токсигенные штаммы вырастали в виде полупрозрачных пленок. Нами установлено, что проявление а, /3-гидролазной активности в отношении глицерина атоксигенными штаммами коррелирует с проявлением ими триацилглицероллипазной активности по отношению к жирам, ге-молитичностью штаммов в пробе Грейга, а также с выявлением липазы в методе РАО с применением антилипазного диагностикума (у штаммов эльтор). Следовательно, на средах с жирами мы наблюдаем триацилглицероллипазную активность, а на среде с глицерином - гидролазную активность в отношении глицерина, выявление которой именно у гемолитических штаммов вибрионов эльтор и 0139 серогрупп позволяет использовать глицерин для конструирования дифференциальных питательных сред, и может заменить липиды, не искажая результатов реакции (рис. 2Г).

Учитывая корреляционную связь липазной и гемолитической активностей вибрионов эльтор, в работе были изучены штаммы V. ско1егае поп-01/0139, представленные культурами, выделенными от человека (токсигенными и атоксигенными) и из объектов окружающей среды. Отмечено, что холерные вибрионы не 01, выделенные от человека, только в 50% случаев обладают гемолитической активностью, полностью коррелирующей с продукцией липазы.

д ■ ш II 1г

1 . ... и ¡л 14 1Г к

К1 Ка.| К}

,\'>

В

» II - ' ^

[ п О ,Г . ■, и

, га -\г

- ■ ■ ■-'*'

■ 3 г Ж4 2

б

и /0 # 9 I м

Рисунок 2 - Дифференциальный характер роста штаммов V. сЬо1егае на средах с субстратами.

Характер роста холерных вибрионов эльтор на среде с добавлением льняного масла (А) и глицерина (Г): токсигенные негемолитические штаммы (с1х+Н1у") образуют нежную пленку; атоксигенные гемолитические штаммы (с1:х"Н1у+) образуют плотный с восковым налетом микрогазон; подавление роста холерных вибрионов классического биовара (Б) и токсигенных вибрионов 0139 серогруппы (В) на среде с кукурузным маслом.

Таблица 1 - Критерии оценки липазной активности холерных вибрионов при культивировании на питательных средах, содержащих жиры

Рост и активный гидролиз жиров (образование плотных колоний с восковым налетом) Рост без активного гидролиза жиров (образование голубых полупрозрачных колоний) Подавление роста

Вариант холерных вибрионов Характеристика штаммов Вариант холерных вибрионов Характеристика штаммов Вариант холерных вибрионов Характеристика штаммов

V. сИо1егае еког йх' 1:ср" Н1у+ V. сИо1егае еког йх+ Шу"

V. сИокгае еког йхЧср+ Н1у+ V. ско1егае сНо1егае йх+ Н1у" V. с1ю1егае сИо1егае йх+ Н1у

V. ско1егае 0139 йх' Н1у+ V. сИо1егае 0139 йх+ Н1у

Отсутствие липазиой и гемолитической активности может свидетельствовать о наличии у штамма гена холерного токсина, что является значимым при диагностике ОКИ, вызванных вибрионами не 01/не 0139. Показано, что у гемолитических вибрионов не 01/не 0139 различных серологических групп, выделенных из различных источников, сохраняется тенденция выявления липазы в РАО через 4 часа культивирования, и все штаммы, вне зависимости от объектов выделения и токсигенности, способны продуцировать липазу, выявляемую в РАО через 24 часа, аналогично холерным вибрионам эльтор. Определено, что триа-цилглицероллипазная активность вибрионов не 01/не 0139 серогрупп, выявляемая бактериологическим методом на средах с жирами, не зависит от токсигенности штаммов, но полностью коррелирует с проявлением гидролазной активности в отношении глицерина в среде культивирования, гемолитической активностью в пробе Грейга и продукцией липазы, выявляемой в РАО.

Таким образом, с применением нескольких методических подходов нами проведено комплексное изучение липазной активности и выявлены закономерности ее фенотипического проявления у различных групп холерных вибрионов. Выявление липазы с помощью антилипазного диагностикума у вибрионов эльтор и невозможность ее серологической детекции у классических вибрионов позволяет дифференцировать штаммы биоваров классического и эльтор по данному признаку. Определено, что проявление триацилглицероллипазной активности на питательных средах, содержащих жиры и глицерин, у вибрионов эльтор совпадает с гемолитичностью штаммов и выявлением продукции липазы в РАО. В то же время у штаммов 0139 серогруппы выявить липазу с помощью антилипазного диагностикума не удалось. Однако нами показано, что триацил-гидролазную активность у атоксигенных вариантов 0139 возможно выявить бактериологическим методом на дифференциальных средах с жирами и глицерином, и установлена корреляция триацилглицероллипазной активности с их гемолитичностью в пробе Грейга, что лежит в основе дифференциации токси-генных и атоксигенных штаммов 0139 серогруппы. Вибрионы классического биовара по проявлению липазной активности занимают особое место. Липазная активность этой группы возбудителя холеры остается не выявленной ни серологическим методом с применением антилипазного диагностикума, ни бактериологическим методом, что может являться закономерным, т.к. отсутствие липазной активности у классических холерных вибрионов согласуется с негемо-литичностью штаммов в отношении эритроцитов барана, на чем основана дифференциальная диагностика вибрионов классического и эльтор биоваров.

ВЫВОДЫ

1. Холерные вибрионы эльтор гемолитичные (атоксигенные) и негемолитич-ные (токсигенные), независимо от источника выделения, продуцируют липазу, выявляемую в РАО с применением антилипазного Pseudomonas spp. диагностикума через 24 часа культивирования, продукция которой отсутствует у вибрионов классического биовара, на основании чего возможно дифференцировать вибрионы эльтор от вибрионов классического биовара по продукции липазы через 24 часа культивирования.

2. Холерные вибрионы классического биовара не проявляют липазную активность на питательных средах с добавлением жиров, что согласуется с отрицательными результатами в реакции объемной агломерации.

3. Выявление липазной активности холерных вибрионов различных серогрупп на питательных средах, содержащих добавки жиров, позволило определить разные критерии оценки липазной активности у возбудителей холеры 01 и 0139: 1) для атоксигенных гемолитических (ctx'Hly+) вибрионов 01 эльтор и 0139 серогруппы характерен рост с активным гидролизом субстрата (образование плотных колоний); 2) для негемолитических токсигенных (ctx+Hly") вариантов эльтор характерен рост на средах с субстратами без активного гидролиза жиров с образованием на агаре голубых пленок; 3) для вибрионов классического биовара и токсигенных (ctx+Hly') вариантов 0139 серогруппы характерно подавление роста (возможное наличие единичных колоний).

4. Применение глицерина в качестве субстрата в среде культивирования позволило стандартизировать бактериологический метод для дифференциации атоксигенных гемолитических и токсигенных негемолитических вариантов вибрионов эльтор и 0139 серогруппы по проявлению гидролазной активности в отношении глицерина, что является значимым в диагностическом отношении.

5. Добавление глицерина (3%) в жидкую среду культивирования для выявления липазы в реакции агломерации стимулирует продукцию липазы гемолитическими вариантами холерных вибрионов эльтор и не влияет на продукцию липазы у токсигенных вариантов, что позволяет повысить чувствительность РАО при выявлении гемолитических штаммов.

6. Продукция липазы гемолитическими вариантами холерных вибрионов, выявляемая в РАО, более активна при культивировании штаммов в агаре Мартена с добавлением казеина (5%), а также в триптоновой среде с минимальной концентрацией ионов железа. Повышение уровня продукции липазы в среде с низким содержанием ионов железа подтверждает корреляционные связи липазной и гемолитической активностей холерных вибрионов эльтор.

7. Холерные вибрионы не 01/не 0139 различных серогрупп, независимо от наличия генов патогенности, способны продуцировать липазу, гомологичную липазе Pseudomonas spp. и V. cholerae eltor, выявляемую серологическим методом РАО, а гемолитические варианты способны проявлять липазную и гидролазную активности, соответственно при культивировании штаммов на питательной среде с жирами и глицерином.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Телесманич, Н.Р. Новые подходы к дифференциации токсигенных и аток-.сигенных штаммов холерных вибрионов эльтор на основе липазной активности / Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов, А.Н. Терентьев, В.В. Агафонова и др. // Проблемная комиссия. «Холера и патогенные для человека вибрионы». - Ростов н/Д, 2004. - Вып. № 17. - С. 32-33.

2. Телесманич, Н.Р. Триацилглицероллипазная активность холерных вибрионов как основа для разработки методов определения эпидемиологической значимости штаммов / Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов, В.В. Агафонова и др. // Меди-

цинская микробиология - XXI век: Всеросс. научно-практ. конф. - Саратов, 2004.-С. 219-220.

3. Патент на изобретение № 2261444 РФ Способ выявления атоксигенных ге-молитичных штаммов холерных вибрионов / Н.Р. Телесманич, Е.В. Безугло-ва, Г.Л. Карбышев, В.В. Агафонова. - Опубл. 27.09.2005. - Бюл. № 27.

4. Телесманич, Н.Р. Изучение липазной активности холерных вибрионов / Н.Р. Телесманич, В.В. Агафонова // Обмен веществ при адаптации и повреждении: Труды IV Межвуз. Междунар. конф. - Ростов н/Д, 2005. - С. 16-18.

5. Телесманич, Н.Р. Инструкция по изготовлению и контролю диагностикума ан-тилипазного иммуноглобулинового полимерного сухого для выявления в РАО гемолитичных штаммов холерных вибрионов / Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов,

A.Н. Терентьев, В.В. Агафонова // Проблемная комиссия. «Холера и патогенные для человека вибрионы». - Ростов н/Д, 2005. - Вып. № 18. - С. 163.

6. Телесманич, Н.Р. Конструирование антилипазного иммуноглобулинового полимерного диагностикума для выявления штаммов холерных вибрионов эльтор, обладающих гемолитической и липазной активностью / Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов, В.В. Агафонова и др. // Журн. микробиол., эпиде-миол. и иммунобиол. - 2006. - №1. - С. 57-60.

7. Телесманич, Н.Р. Некоторые фенотипические свойства СТХ" ТСР+ штаммов Vibrio cholerae eltor / Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов, A.B. Колякина,

B.В. Агафонова // Проблемная комиссия. «Холера и патогенные для человека вибрионы». - Ростов н/Д, 2006. - Вып. № 19. - С. 48-51.

8. Ломов, Ю.М. Новый серологический тест для идентификации эпидемически значимых штаммов холерных вибрионов / Ю.М. Ломов, Н.Р. Телесманич, В.В. Агафонова и др. // Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». - Ростов н/Д, 2006. - Вып. № 19. - С. 56-62.

9. Ломов, Ю.М. Новые технологии в системе эпиднадзора за холерой / Ю.М. Ломов, Н.Р. Телесманич, Л.С. Подосинникова, В.В. Агафонова и др. // Матер. VII Межгосударственной научно-практ. конф. государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарной охране территорий государств-участников СНГ». - Оболенск, 2006. - С. 43-44.

10. Колякина, A.B. Характеристика биологических свойств Vibrio cholerae eltor с генотипом СТХ' ТСР+ / A.B. Колякина, Е.М. Курбатова, В.В. Агафонова // Матер. VII Межгосударственной научно-практ. конф. государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарной охране территорий государств-участников СНГ». - Оболенск, 2006. - С. 107-109.

11. Ломов, Ю.М. Выявление липазы у Vibrio cholerae Ol серогруппы в реакции объемной агломерации / Ю.М. Ломов, Н.Р. Телесманич, В.В. Агафонова и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2007. - № 1. - С. 74-77.

12. Агафонова, В.В. Зависимость продукции липазы холерными вибрионами эльтор от состава среды культивирования / В.В. Агафонова, М.В. Акулова, Н.Р. Телесманич // Современные аспекты эпидемиологического надзора за

особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России: Матер, научно-практ. конф. - Ставрополь, 2007. - С. 12-14.

13. Агафонова, В.В. Липазная активность холерных вибрионов 01 и 0139 се-рогрупп. / В.В. Агафонова, Н.Р. Телесманич, М.В. Акулова // Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России: Матер, научно-практ. конф. - Ставрополь, 2007.-С. 14-16.

14. Ломов, Ю.М. Перспективы использования новых диагностических методов в системе эпидемиологического мониторинга за холерой / Ю.М. Ломов, Н.Р. Телесманич, Л.С. Подосинникова, В.В. Агафонова и др. // Матер. IX съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва, 2007. - С. 59-60.

15. Агафонова, В.В. Ацилгидролазная активность холерных вибрионов Ol и 0139 серогрупп / В.В. Агафонова, Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов и др. // Проблемная комиссия. «Холера и патогенные для человека вибрионы». -Ростов н/Д, 2007. - Вып. № 20. - С. 59-63.

16. Агафонова, В.В. Влияние питательных сред различного состава на продукцию липазы холерными вибрионами / В.В. Агафонова, М.В. Акулова Н.Р. Телесманич, и др. // Проблемная комиссия. «Холера и патогенные для человека вибрионы». - Ростов н/Д, 2007. - Вып. № 20. - С. 94-97.

17. Telesmanich, N. The construction of the anti-lipase immunoglobulin polymeric diagnosticum for differentiation of Vibrio cholerae Eltor / N. Telesmanich, Y. Lomov, V. Agaphonova // Vibrio 2007: The Second Conference on the Biology of Vibrios. - Paris, 2007. - P. 106.

18. Агафонова, В.В. Разработка современных иммунобиологических препаратов. Определение специфичности иммуноглобулинового антилипазного полимерного Pseudomonas spp. диагностикума / В.В. Агафонова, М.В. Акулова, Н.Р. Телесманич и др. // «Холера и патогенные для человека вибрионы»: Матер, совещания и пробл. комиссии. - Ростов н/Д, 2008. - Вып. №21. - С. 121-125.

19. Агафонова, В.В. Определение специфичности иммуноглобулинового антилипазного полимерного диагностикума /В.В. Агафонова, М.В. Акулова, Н.Р. Телесманич и др. // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционным болезнями на тер. государств-участников СНГ: Матер. IX Межгосуд. науч-практ. конф. государств-участников СНГ. - Волгоград, 2008. - С.17-18.

20. Агафонова, В.В. Изучение способности к гидролизу жиров у холерных вибрионов Ol и 0139 серогрупп / В.В. Агафонова, Н.Р. Телесманич, М.В. Акулова // Обмен веществ при адаптации и повреждении (дни мед. лаб. диагностики): Матер. VII Межвуз. конф. с междунар. участ. - Ростов н/Д, 2008. -С.11-15.

21. Агафонова, В.В. Липазная активность Vibrio cholerae, выявляемая серологическим методом, при культивировании штаммов на средах различного состава / В.В. Агафонова, М.В. Акулова, Н.Р. Телесманич // Обмен веществ при адаптации и повреждении (дни мед. лаб. диагностики): Матер. VII Межвуз. конф. с международ, участ. - Ростов н/Д, 2008. - С. 8-11.

АГАФОНОВА ВИКТОРИЯ ВЛАДИСЛАВОВНА

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПРОЯВЛЕНИЯ ТРИАЦИЛГЛИЦЕРОЛЛИПАЗНОЙ АКТИВНОСТИ У ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ставрополь - 2009 г.

Подписано к печати 21.04.09 г. Сдано в печать 27.04.09 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная.Печать цифровая. Объем 1,15 усл. печ. л. Тираж 150. Заказ № 33/04.

Отпечатано в типографии ООО «Диапазон». 344010, г. Ростов-на-Дону, ул. Красноармейская, 206. Лиц. ПЛД № 65-116 от 29.09.1997 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Агафонова, Виктория Владиславовна

ВВЕДЕНИЕ. Актуальность проблемы.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Липазы. Классификация, распространение липаз в природе.

1.2. Механизм действия, субстратная специфичность и некоторые физико-химические свойства липаз микроорганизмов.

1.3. Методические подходы изучения липазной активности микроорганизмов.

1.4. Гемолитическая и липазная активность холерных вибрионов.

СОБСТЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Микроорганизмы, используемые в работе.

2.2. Коммерческие препараты, химические реактивы.

2.3. Питательные среды.

2.4. Сыворотки.

2.5. Методы

2.5.1. Бактериологические методы.

2.5.1.1. Метод определения гемолитической активности.

2.5.1.2. Метод выявления триациглицероллипазной и гидролазной активностей.

2.5.2. Серологические методы

2.5.2.1. Реакция агглютинации.

2.5.2.2. Реакция агломерации объёмная (РАО).

2.6. Получение иммунных сывороток к липазе Pseudomonas spp., их характеристика.

2.6.1. Количественное определение белка в сыворотках и иммуноглобулинах.50,

2.6.2. Диффузная иммуно-преципитация по Оухтерлони.

2.6.3. Метод постановки иммуноблотинга.

2.6.4. Метод выделения иммуноглобулинов из сывороток.

2.6.5. Конструирование иммуноглобулиновых диагностических антилипазных препаратов.

2.7. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ИММУННЫХ СЫВОРОТОК К ЛИПАЗЕ Pseudomonas spp., ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ

ПОЛИМЕРНОГО АНТИЛИПАЗНОГО ДИАГНОСТИКУМА ПРИ ИЗУЧЕНИИ ПРОДУКЦИИ ЛИПАЗЫ

У ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ В РАО.

3.1. Получение иммунных сывороток к липазе Pseudomonas spp., схемы иммунизации животных.

3.2. Характеристика сывороток по белку.

3.3. Изучение специфичности сывороток в реакции преципитации.

3.4. Изучение чувствительности сывороток в иммуноблотинге.

3.5. Изучение чувствительности диагностических препаратов, сконструированных на основе иммуноглобулинов к липазе Pseudomonas spp.

3.6. Лиофилизация диагностических препаратов.

ГЛАВА 4 ИЗУЧЕНИЕ СПОСОБНОСТИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ РАЗНЫХ БИОВАРОВ И СЕРОГРУПП ПРОДУЦИРОВАТЬ ЛИПАЗУ, ВЫЯВЛЯЕМУЮ В РЕАКЦИИ АГЛОМЕРАЦИИ (РАО).

4.1. Выявление продукции липазы у штаммов холерных вибрионов

01 серогруппы биовара эльтор.

4.2. Изучение способности к продукции липазы у штаммов холерных вибрионов классического биова ра.7(

4.3. Выявление продукции липазы у штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы различного происхождения.

4.4. Выявление липазы у штаммов холерных вибрионов не Ol/не 0139 серогрупп с различными генетическими характеристиками.

ГЛАВА 5 ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА

РАО С АНТИЛИПАЗНЫМ ДИАГНОСТИКУМОМ НА ЭТАПЕ ВЫДЕЛЕНИЯ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ.

5.1. Зависимость продукции липазы холерными вибрионами от условий культивирования штаммов.

5.2. Определение специфичности метода РАО с использованием имму-ноглобулинового антилипазного диагностнкума.

5.2.1 Выявление липазы, гомологичной липазе Pseudomonas spp. и холерных вибрионов эльтор, у представителей рода Vibrio.

5.2.2. Выявление липазы, гомологичной липазе Pseudomonas spp. и холерных вибрионов эльтор, у представителей семейства Enterobacteriaceae.

5.3. Изучение возможности применения метода РАО с полимерным им-муноглобулиновым антилипазным диагностикумом в схеме идентификации холерных вибрионов.

ГЛАВА 6 ВЫЯВЛЕНИЕ ЛИПАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ХОЛЕРНЫХ

ВИБРИОНОВ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИМ МЕТОДОМ НА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ С ДОБАВЛЕНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ

ЖИРОВ И ГЛИЦЕНРИНА.

6.1. Изучение липазной активности холерных вибрионов 01 серогруппы бновара эльтор бактериологическим методом.

6.2. Изучение липазной активности холерных внбрионов Ol серогруппы классического биовара на питательных средах.

6.3. Изучение липазной активности холерных вибрионов 0139 серогруппы, выделенных из различных источников, бактериологическим методом.

6.4. Изучение гидролазной активности холерных вибрионов Ol и 0139 серогрупп по отношению к глицерину.

6.5. Изучение липазной активности холерных вибрионов не Ol/не серогрупп с различными генетическими характеристиками бактериологическим методом.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Закономерности проявления триацилглицероллипазной активности у холерных вибрионов"

Актуальность проблемы

В соответствии с основными критериями, определяющими вероятность использования микроорганизмов в качестве биологического оружия, возбудитель холеры отнесен к категории В - высокоприоритетных патогенов (Онищенко Г.Г., 2000; Кутырев В.В., 2007; Ломов Ю.М., 2007, 2008). В этой связи продолжает оставаться актуальным вопрос о факторах, определяющих патогенность и эпидзначимость холерных вибрионов, методах их выявления, разработка которых требует углублённого и всестороннего изучения биологии возбудителя холеры. Попадая в макроорганизм, патоген сталкивается с защитными структурами мембран клеток в виде белков, углеводов и липи-дов. И в то время как хорошо изучены белковый и углеводный обмены возбудителя холеры, механизмы преодоления липидных барьеров продолжают оставаться неизученными. В настоящее время способность продуцировать липазы установлена и изучена у целого ряда патогенных и непатогенных микроорганизмов. Однако существующие данные по изучению микробных липаз часто являются отрывочными и несопоставимыми, т.к. получены на различных субстратах, отличающихся разной степенью дисперсности (Бро-керхофф X. с соавт., 1978). В нашей работе мы обратились к вопросу изучения липазной активности холерных вибрионов, учитывая то обстоятельство, что присутствующие в клетках возбудителя холеры ферменты с липолитиче-ской активностью рассматриваются в качестве возможных факторов пато-генности (Fiore Е., 1997; Ogierman М.А., 1997). Установлено, что ген, ответственный за продукцию липазы, характерен для всех микроорганизмов, относящихся к Vibrio cholerae (Fiore Е., 1997; Harris J.R., 2002). Также была установлена (Casanova Т.В., 1995) высокая степень гомологии липазы Pseudomo-nas spp. с геном липазы холерных вибрионов, обозначенным (ЫуС или НрА), на основании чего сотрудниками РостНИПЧИ (Телесманич Н.Р.с соавт, 2006) были разработаны методы её выявления у холерных вибрионов: серологичеекая детекция липазы с помощью антилипазного полимерного диагностику-ма, сконструированного на основе иммуноглобулинов к липазе Pseudomonas spp. фирмы «Sigma», и бактериологическое выявление липазной активности с применением жиров в питательной среде. Были определены корреляционные связи липазной и гемолитической активностей холерных вибрионов эльтор, выделенных из объектов окружающей среды, предложена возможность дифференциации токсигенных и атоксигенных вариантов. Однако результатов проведённых исследований недостаточно для общего понимания закономерностей проявления липазной активности, так как объектами в экспериментах служили холерные вибрионы только биоварианта эльтор и штаммы, выделенные исключительно из объектов окружающей среды. При этом липазная активность вибрионов классического биовара, 0139 серогруппы, а также холерных вибрионов не 01/не 0139 серогрупп с различными генетическими характеристиками формулы эпидзначимости, выделенных из различных источников, остаётся не изученной, в то время как разнообразие генотипиче-ских форм, свойственное возбудителю холеры, может определять неодинаковое фенотипическое проявление липазной активности у разных вариантов холерных вибрионов, что обусловливает актуальность нашего исследования.

Цель работы

Изучение закономерностей проявления триацилглицероллипазной активности холерных вибрионов 01 серогруппы биоваров эльтор и классического, вибрионов 0139 и не 01/не 0139 серогрупп.

Задачи исследования

1. Приготовление новых серий антилипазного диагностикума на основе иммунных сывороток, полученных в результате применения различных схем иммунизации животных, позволяющих повысить чувствительность диагностического препарата.

2. Изучение способности холерных вибрионов 01 серогруппы классического биовара и эльтор, вибрионов 0139 и не 01/не 0139 серологических групп продуцировать липазу, гомологичную липазе Pseudomonas spp., выявляемую с помощью антилипазного диагностикума в РАО.

3. Выявление липазной активности холерных вибрионов различных био-варов и серологических групп на питательных средах с добавлением различных жиров.

4. Изучение закономерностей проявления гидролазной активности холерных вибрионов различных серологических групп по отношению к глицерину, как составляющей триацилглицероллипазной активности.

5. Конструирование питательной среды с использованием в качестве стандартного субстрата глицерина для гидролазной активности, как составляющей глицероллипазной активности холерных вибрионов.

6. Изучение возможности стандартизации бактериологического метода дифференциации токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов на основе гидролазной активности по отношению к глицерину.

Новизна исследований

Впервые с помощью бактериологического метода выявлена липазная активность вибрионов 0139 серогруппы, в то время как в серологическом методе РАО с помощью антилипазного днагностикума показано, что продуцируемая этим вариантом возбудителя холеры липаза серологически не гомологична липазе Pseudomonas spp. и вибрионов эльтор. Впервые показано, что способность к продукции липазы холерных вибрионов эльтор (токсигенных и атоксигенных) через 24 часа является дифференциальным признаком между вибрионами 01 классического и эльтор биоваров.

Впервые выявлена зависимость проявления липазной активности от ■ состава питательных сред, содержащих определённые добавки. Показано, что добавление глицерина 3% в бульон Мартена способствует увеличению продукции липазы холерными вибрионами, что позволяет достичь наиболее точных результатов в изучении способности холерных вибрионов к продукции липазы, выявляемой серологическим методом РАО. Впервые определено, что продукция липазы гемолитическими вибрионами эльтор более активно проявляется при выращивании штаммов в триптоновой среде без ионов железа или с минимальной концентрацией FeCb, что подтверждает корреляционные связи липазной и гемолитической активностей холерных вибрионов эльтор. Впервые для идентификации холерных вибрионов эльтор предложен полимерный диагностический препарат, позволяющий выявлять гемолитические атоксигенные штаммы вибрионов эльтор на этапе скрининга подозрительных колоний.

Впервые липазная активность холерных вибрионов разных биоваров и серогрупп была изучена на питательных средах, содержащих широкий спектр жиров различного происхождения. Показано разнообразие проявления ацилгидролазной активности у различных групп холерных вибрионов различной эпидемической значимости в ответ на находящийся в питательной среде субстрат. Впервые изучена гидролазная активность холерных вибрионов по отношению к глицерину. Показана возможность дифференциации гемолитических и негемолитических штаммов холерных вибрионов эльтор и 0139 серогруппы на основе проявления ими гидролазной активности. Впервые предложен стандартный субстрат - глицерин - для конструирования дифференциальной среды, предназначенной для выявления гемолитических вариантов холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп на основе проявления ими гидролазной активности. Впервые при помощи бактериологического и серологического методов показана корреляционная связь триацилглицерол-липазной, гидролазной (в отношении глицерина) и гемолитической активностей холерных вибрионов эльтор, 0139 серогруппы и вибрионов различных не Ol/не 0139 серогрупп.

Теоретическая и практическая значимость

Изучение триацилглицероллипазной активности расширило наши познания в сфере липидного обмена и биологии возбудителя холеры. Были выявлены отличия по липолитической активности между различными вариантами холерных вибрионов, выделенными из различных источников, на основании которых возможно дифференцировать атоксигенные гемолитические варианты вибрионов от токсигенных негемолитических.

Установлено, что липазы вибрионов эльтор, классического биовара и 0139 серогруппы являются серологически различными. С помощью антили-пазного полимерного иммуноглобулинового диагностикума, сконструированного с применением биотехнологических подходов на основе чужеродного, но высокогомологичного антигена липазы Pseudomonas spp. (степень гомологии 93,7%), показано, что последний не образует в РАО иммунобиологического комплекса антиген-антитело с липазой вибрионов классического биовара и 0139 серогруппы, что свидетельствует о возможной различной их аминокислотной последовательности. При этом липазная активность холерных вибрионов классического биовара и 0139 серогруппы проявляется при культивировании на средах с добавлением жировых субстратов и глицерина.

Установлено, что гемолитичные (атоксигенные) холерные вибрионы эльтор, выделенные от человека, продуцируют липазу через 4 часа культивирования в мясопептонном бульоне, в то время как негемолитичные не проявляют липазной активности через данный промежуток времени, что даёт возможность дифференцировать штаммы эльтор по продукции липазы в РАО на гемолитичные и негемолитичные, независимо от источника выделения (человек или ООС). Показано, что гемолитичные (атоксигенные) и негемолитичные (токсигенные) штаммы холерных вибрионов эльтор, независимо от источника выделения, способны продуцировать липазу через 24 часа культивирования в мясопептонном бульоне, выявляемую в РАО с применением ан-тилипазного Pseudomonas spp. диагностикума. Определены добавки - глицерин и гидролизат казеина - в жидкие питательные среды для культивирования холерных вибрионов с целью выявления липазы в РАО с помощью анти-лииазного иммуноглобулинового Pseudomonas spp. диагностикума, которые позволяют повысить чувствительность серологического метода при выявлении гемолитических штаммов вибрионов эльтор. Выявлены корреляционные изменения гемолитической активности и продукции липазы холерных вибрионов при культивировании их в средах с различным содержанием ионов железа. Показана возможность использования метода РАО с применением антилипазного диагностикума в схеме идентификации холерных вибрионов на этапе скрининга подозрительных на холеру колоний под контролем агглютинации с 01-холерной сывороткой.

Показана возможность выявления гидролазной активности у гемолитических штаммов холерных вибрионов при культивировании на плотной питательной среде с добавлением глицерина в качестве субстрата. Показана возможность дифференциальных свойств гидролазной активности холерных вибрионов, проявляющейся на среде с добавлением глицерина. Предложено стандартизировать бактериологический метод дифференциации токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп на основе различной способности гемолитических и негемолитических штаммов к гидролизу глицерина, являющегося стандартным субстратом в сравнении с жирами.

Установлено, что экспрессия лпполитических свойств атоксигенных гемолитических холерных вибрионов эльтор более выражена pi обнаруживается в более короткие сроки культивирования в жидких и на плотных питательных средах, чем у токсигенных негемолитических вариантов, что имеет важное диагностическое и дифференциальное значение.

Усовершенствована схема получения антилипазной сыворотки к липазе Pseudomonas spp. с целью дальнейшего конструирования полимерного диагностического иммуноглобулинового препарата для выявления гемолитических штаммов холерных вибрионов в РАО. Разработан режим лиофилизации антилипазного диагностикума, обеспечивающий стабильность препарата при хранении без снижения его активности в течение двух лет.

Показаны корреляционные связи ацилглгидролазной и гемолитической активностей холерных вибрионов, выявленные с помощью комплексного методического подхода, включающего серологический и бактериологический методы, которые открывают перспективы дальнейшего совершенствования дифференциальной диагностики. Данные методы, предназначенные для обнаружения и изучения триацилглицероллипазной активности холерных вибрионов, можно применять в лабораторной практике при проведении исследований с различными вариантами возбудителя холеры, с целью более глубокого изучения биохимических особенностей вибрионов, а также в системе эпи-днадзора за холерой.

Метод РАО с применением антилипазного диагностикума включён в методический документ «Серологические методы в диагностике холеры» (дополнение к МУ 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры»), утвержденные в 2008г. Главным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко. Получен патент на изобретение «Способ выявления атоксигенных гемолитичных штаммов холерных вибрионов» (№2261444, от 27 сентября 2005г.). Оформлена и утверждена директором института «Инструкция по изготовлению и контролю диагностикума антилипазного иммуноглобулинового полимерного сухого для выявления в РАО гемолитичных штаммов холерных вибрионов» (протокол №1 от 13.01.05). Депонирован в ГКПВ «Микроб» штамм холерных вибрионов 01 V. cholerae КМ 254 в качестве тест-штамма, который предложено использовать как положительный контроль в реакции агломерации объёмной. Получена справка № 2008117194 о приоритете в оформление патента «Способ дифференциации атоксигенных штаммов холерных вибрионов от токсигенных на основе гидролазной активности».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Липаза холерных вибрионов биовара эльтор, выявляемая в реакции агломерации с помощью антилипазного диагностикума, серологически отличается от липазы вибрионов 0139 серогруппы. Отсутствие у классических вибрионов продукции липазы, гомологичной липазе Psendomonas spp. и вибрионов эльтор, определяет возможность дифференциации биоваров.

2. Холерные вибрионы способны проявлять липазную активность по отношению к широкому спектру жиров различного происхождения на питательных средах. Однако проявления триацилгидролазной активности у холерных вибрионов разных биоваров, серологических групп и токсигенности различаются, что обусловливает разные критерии её оценки у разных групп холерных вибрионов.

3. Гемолитические холерные вибрионы способны проявлять гидролазную активность на питательной среде с добавлением глицерина, что обусловливает его использование в качестве стандартного субстрата для дифференциации токсигенных и атоксигенных штаммов холерных вибрионов бактериологическим методом.

4. Гемолитические холерные вибрионы не Ol/не 0139 различных серог-рупп способны продуцировать липазу, гомологичную липазе Pseudomonas spp. и вибрионов эльтор, выявляемую серологическим методом РАО, а также проявлять триацилгидролазную активность при культивировании штаммов на питательной среде с жирами и глицерином.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 13 научных конференциях: Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы», (Ростов-на-Дону, 2004-2008гг.); Всероссийская научно-практическая конференция «Медицинская микробиология — XXI век», (Сара-,, тов, 2004г.); IV Межвузовская международная конференция «Обмен веществ при адаптации и повреждении», (Ростов-на-Дону, 2005г.); VII Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников СНГ», (Оболенск, 2006г.); Научно-практическая конференция «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России», (Ставрополь, 2007г.); IX съезд Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, (Москва, 2007г.); Международная конференция «Vibrio 2007», (Париж, 2007); VII Межвузовская международная конференция с международ, участ. «Обмен веществ при адаптации и повреждении», (Ростов-на-Дону, 2008г.); IX Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников СНГ», (Волгоград, 2008г.). Получены акты внедрения в лабораторную практику разработанного антилипазного диагностического препарата от ФГУЗ «ЦГиЭ» Свердловской обл.; ФГУЗ Иркутский ПЧИ Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора; ФГУЗ ПЧЦ Роспотребнадзора.План диссертационной работы одобрен Ученым советом Ростовского НИПЧИ и утвержден директором института 27.06.07 (протокол №3). Исследования выполнены в рамках плановых научных тем: № 0120.0 507857 «Триацилглицероллипазная активность холерных вибрионов 01»; № 01. 2. 007 07281 «Липазная и адгезивная активности холерных вибрионов не 01 серогруппы»

Публикации результатов исследований. По теме диссертационного исследования опубликована 21 работа, в том числе две из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени, получен один патент на изобретение и «Инструкция по изготовлению и контролю».

План диссертационной работы утверждён на заседании Ученого совета ФГУЗ РостНИПЧИ Роспотребнадзора 27.06.07 (протокол №3). Исследования выполнены в рамках плановых научных тем: № 0120.0 507857 «Триа-цилглицероллипазная активность холерных вибрионов 01»; № 01. 2. 007 07281 «Липазная и адгезивная активности холерных вибрионов не 01 серогруппы»

Структура работы. Диссертация изложена на 197 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4-х глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 156 работ отечественных и 144 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 21 рисунком.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Агафонова, Виктория Владиславовна

ВЫВОДЫ

1. Холерные вибрионы эльтор гемолитичные (атоксигенные) и негемолитичные (токсигенные), независимо от источника выделения, продуцируют липазу, выявляемую в РАО с применением антилипазного Pseudomonas spp. диагностикума через 24 часа культивирования, продукция которой отсутствует у вибрионов классического биовара, на основании чего возможно дифференцировать вибрионы эльтор от вибрионов классического биовара по продукции липазы через 24 часа культивирования.

2. Холерные вибрионы классического биовара не проявляют липазную активность на питательных средах с добавлением жиров, что согласуется с отрицательными результатами в реакции объёмной агломерации.

3. Выявление липазной активности холерных вибрионов различных серогрупп на питательных средах, содержащих добавки жиров, позволило определить разные критерии оценки липазной активности у возбудителей холеры 01 и0139: 1) для атоксигенных гемолитических (ctx"Hly+) вибрионов 01 эльтор и 0139 серогруппы характерен рост с активным гидролизом субстрата (образование плотных колоний); 2) для негемолитических токсигенных (ctx+Hly") вариантов эльтор характерен рост на средах с субстратами без активного гидролиза жиров с образованием на агаре голубых плёнок; 3) для вибрионов классического биовара и токсигенных (ctx+Hly-) вариантов 0139 серогруппы характерно подавление роста (возможное наличие единичных колоний).

4. Применение глицерина в качестве субстрата в среде культивирования позволило стандартизировать бактериологический метод для дифференциации атоксигенных гемолитических и токсигенных негемолитических вариантов вибрионов эльтор и 0139 серогруппы по проявлению гидролазной активности в отношении глицерина, что является значимым в диагностическом отношении.

5. Добавление глицерина (3%) в жидкую среду культивирования для выявления липазы в реакции агломерации стимулирует продукцию липазы гемолитическими вариантами холерных вибрионов эльтор и не влияет на продукцию липазы у токсигенных вариантов, что позволяет повысить чувствительность РАО при выявлении гемолитических штаммов.

6. Продукция липазы гемолитическими вариантами холерных вибрионов, выявляемая в РАО, более активна при культивировании штаммов в агаре Мартена с добавлением казеина (5%), а также в триптоновой среде с минимальной концентрацией ионов железа. Повышение уровня продукции липазы в среде с низким содержанием ионов железа подтверждает корреляционные связи липазной и гемолитической активностей холерных вибрионов эльтор.

7. Холерные вибрионы не Ol/не 0139 различных серогрупп, независимо от наличия генов патогенности, способны продуцировать липазу, гомологичную липазе Pseudomonas spp. и V. cholerae &ltor, выявляемую серологическим методом РАО, а гемолитические варианты способны проявлять липазную и гидролазную активности, соответственно при культивировании штаммов на питательной среде с жирами и глицерином.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как известно, бактерии рода Vibrio обладают широким набором ферментативных систем, обеспечивающих им выживаемость в объектах окружающей среды и их патогенность для макроорганизма. Липолитические ферменты у холерных вибрионов изучены мало, в то время как данные по ферментам белкового и углеводного обменов представлены в большом количестве публикаций. Для оценки липазной активности холерных вибрионов, условий и закономерностей её продукции необходимо было оптимизировать методические приёмы, направленные на её выявление. Одним из этапов исследования являлось конструирование и использование для этих целей им-муноглобулинового диагностикума. Ранее не существовало препаратов для серологического выявления липазы у микроорганизмов, в том числе и холерных вибрионов. С целью конструирования иммуноглобулинового полимерного диагностического препарата для выявления продукции липазы холерными вибрионами сотрудниками Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института (Телесманич Н.Р. с соавт., 2006) была предпринята попытка использовать коммерческий препарат липазы Pseudomonas spp. фирмы «Sigma». Оригинальность исследования заключалась в использовании препарата липазы Pseudomonas spp. — высокогомологичного (93,7% гомологии), но чужеродного антигена для холерных вибрионов. Данный методический подход был обусловлен сложностью получения высокоочищенных препаратов ферментов и токсинов холерных вибрионов в лабораторных условиях. Кроме того следовые количества липополисахарида и других примесей, присутствующие в препаратах, полученных в лабораторных условиях, существенно влияют на специфичность и активность полученных на их основе диангостикумов. Проведённые эксперименты открыли нам возможности для исследования ранее малоизученного фермента холерных вибрионов, его роли в биологии возбудителя и возможность использования в диагностике холеры. Однако возникло множество вопросов, связанных с закономерностями продукции липазы различными вариантами холерных вибрионов, способах её выявления, определением стандартного субстрата в среде для обнаружения липазной активности, определением возможности использования полученных данных в дифференциальных и диагностических целях при идентификации возбудителя холеры.

В связи с расширением спектра изучаемых групп холерных вибрионов первым этапом нашей работы явилось получение новых серий антилипазного диагностикума и одновременного повышения чувствительности препарата за счёт подбора оптимальной схемы иммунизации животных. Для получения иммунных сывороток использовали беспородных кроликов и применили несколько схем иммунизации. В результате применения четырёх схем иммуни-заций животных нами были получены иммунные сыворотки против липазы Pseudomonas spp., которые были охарактеризованы по некоторым параметрам: количество белка, чувствительность, специфичность. Результаты исследования свидетельствуют о том, что полученные нами сыворотки содержали специфические антитела, способные связываться в реакции преципитации с антигеном липазы псевдомонад и холерных вибрионов, представленного как в виде коммерческого препарата, так и содержащегося в среде культивирования гемолитических холерных вибрионов. Из полученных данных иммуноблотинга следует, что наибольшей активностью (титр антител против липазы псевдомонад - 1/6400) обладали сыворотки № 517, 1948 и 1949, которые проявили специфическую активность в реакции преципитации (титр преципити-нов против препарата липазы Pseudomonas spp. - 1/32). Остальные сыворотки № 518, 519 и 1950 показали значительно меньшую активность в пределах от 1/400 до 1/800 титра антител против липазы псевдомонад. Показано, что предварительная иммуностимуляция животных препаратом ««Тактивина», который мы использовали во II и IV схемах иммунизации, позволяет повысить продукцию специфических антител, что является важным моментом с практической точки зрения при получении препаративных количеств полимерного диагностикума для выявления у холерных вибрионов липазы, гомологичной липазе псевдомонад. Определены параметры проведения лиофиль-ной сушки, которые способствуют сохранности специфической активности и чувствительности диагностического препарата в высушенном состоянии в течение 2-х лет.

С применением нескольких методических подходов нами проведено комплексное изучение фенотипического проявления гемолитической и липазной активностей холерных вибрионов. В результате были выявлены закономерности проявления липазной активности у различных вариантов холерных вибрионов, коррелирующие с гемолитичностью и токсигенностью штаммов. Показана возможность дифференциации токсигенных и атоксигенных вариантов вибрионов эльтор, независимо от источника выделения, основанной на сравнительном выявление способности штаммов к продукции липазы при культивировании штаммов в течение 4-х и 24-х часов. Таким обра/ зом, изучение штаммов, выделенных от людей и из объектов окружающей среды, с различными генетическими характеристиками показало, что вибрионы эльтор независимо от источника выделения и токсигенности способны продуцировать липазу при выращивании в течение 24-х часов. Это положение согласуется с результатами бактериологических и молекулярнобиологи-ческих исследований, свидетельствующих о липазной активности холерных вибрионов как о видовом признаке (Williams S.G. et al., 1991, 1993). При этом, выявление липазы у гемолитических штаммов возможное через 4 часа культивирования является основой для внутривидовой дифференциации холерных вибрионов эльтор, в отличие от липазы токсигенных вариантов, выявляющейся через 24 часа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Агафонова, Виктория Владиславовна, Ростов-на-Дону

1. Авдеева, Е.П. Характеристика эитеропатогениых холерных вибрионов не Ol/не 0139 серогрупп, выделенных в Узбекистане / Е.П. Авдеева, Б.Л. Мазрухо, Л.Г. Воронежская // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2005.-№3.-С. 80-82.

2. Адамов, А.К. Методика дифференцирования патогенных и апатоген-ных вибрионов Эль Тор / А.К. Адамов, Н.Ф. Быстрый, Д.Л. Шмеркевич, В.Г. Середин // Пробл. особо опас. инф. Саратов, 1971. - Вып. 1. - С. 116-123.

3. Адамов, А.К. Холерные вибрионы / А.К. Адамов, М.С. Наумшина. -Саратов, 1984. 328 с.

4. Андрусенко, И.Т. Действие энтеротоксина Vibrio cholerae на микроорганизмы / И.Т. Андрусенко, Н.А. Пастернак, Е.А. Ведьмина // Журн. микробиол., эпидемиол., и иммунобиол. 1984. - № 10. - С. 52-55.

5. Андрусенко, И.Т. Изучение биологического действия холерного энтеротоксина холерного вибриона / А.К. Адамов, Э.А. Яговкин, А.П. Шепелев // Сборник науч. трудов. Новороссийск, 1994. - Вып. 1. - С. 173-175.

6. Андрусенко, И.Т. Исследование факторов, влияющих на вирулентность холерных вибрионов и разработка новых методов ее определения: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. Саратов, 1991.-43 с.

7. Антонов, А.С. Об уточнении систематического положения некоторых морских бактерий методом гибридизации ДНК-ДНК / А.С. Антонов, Г.Ф. Леванова, Л.С. Попов // Журн. микробиол., эпидемиол., и иммунобиол. -1975. -№ 1.- С. 94-96.

8. Аренде, И.М. Биосинтез липолитических ферментов культурой гриба Aspergillus awamori: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Москва, 1971. - 20 с.

9. Аренде, И.М. Использование липазы для удаления липидов из культурной жидкости Penicillinum nigricans / И.М. Аренде, Т.Г. Борисова, О.Н. Выборных // Прикладная биохимия и микробиология. 1968. - Т. 4, №3. - С. 240.

10. Бабёнышев, Б.В. К генетической пластичности Vibrio cholerae / Б.В. Бабёнышев, В.Н. Савельев, С.И. Винокурова // Матер. IX съезда Всерос. на-уч.-практ. об-ва эпидемиол., микробиол. и паразитол. Москва, 2007. - Том 2. -С. 210.

11. Бароян, О.В. Холера эльтор / О.В. Бароян. М.: Медицина, 1971. - 256 с.

12. Басина, С.Б. Биология водных вибрионов р. Дона. Ростов-на Дону, 1929.-49 с.

13. Биологическая безопасность. Реферат, сб. / Под ред. чл.-корр. РАМН, д-ра. мед. наук. проф. В.В. Кутырева. Саратов, 2007. - Вып. 7. - 64 с.

14. Биохимия / Под ред. Е.С. Северина. 2-е изд. М.: ГЭОТАР-МЕД., 2004. -784 с.

15. Богословская, Е.П. Изв. АН СССР, сер. биол. 1976. - №2, 250 (Патент. Швейцария кл. С11: 3138, № 540335, 1973)

16. Бондаренко, В.М. Гемолизины энтеробактерий и их связь с вирулентностью возбудителя / В.М. Бондаренко, А.В. Голубев // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1988. - №11. - С. 103-109.

17. Бондаренко, В.М. Секретируемые факторы патогенности энтеробактерий / В.М. Бондаренко, А.Р. Мавзютов, Е.Н. Голкочева // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2002. - №1. - С. 84-90.

18. Бондаренко, В.М. Типы секреции и регуляции функциональной активности молекул, ассоциированных с патогенностью энтеробактерий / В.М. Бондаренко, А.Р. Мавзютов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2002. - №5. - С. 86-91.

19. Борисов, Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / Л.Б. Борисов. М., 2005. - 734 с.

20. Брокерхоф X. Липолитические ферменты / X. Брокерхоф, Р. Дженсен. -М.: Мир, 1978.-396 с.

21. Бургасов, П.Н. Вибрионы / П.Н. Бургасов, И.В. Домарадский, А.Е. Ли-бинзон // Большая мед. энциклопедия. Изд. 3-е. М., 1976. Т. 4. — С. 184186.

22. Бырдаров, С.В. Экспериментальная микробиология. София: Медицина и физкультура. - 1965. - С. 372.

23. Вертиев, Ю.В. Токсин-опосредованная обусловленность инфекционных заболеваний / Ю.В. Вертиев // Мол. структура бактериал. токсинов и ге-нетич. контроль их биосинтеза: Тез. 1-й Всесоюз. конф. -М., 1985. С. 28-30.

24. Власов, В.П. Гемолизин Vibrio cholerae El Tor: клонирование и экспрессия генов в Е. coli. / В.П. Власов, Е.В Монахова, И.Е. Ушакова // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1992. - №7-8. - С. 27-31.

25. Воронежская, Л.Г. Определение степени сходства холерных и НАГ-вибрионов / Л.Г. Воронежская // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммуноби-ол. 1985.-№10.-С. 11-15.

26. Воронежская, Л.Г. Серовары НАГ-вибрионов, выделенные от людей и из внешней среды, и возможность распространения их водным путем / Л.Г. Воронежская, А.Г. Сомова, Г.М. Мединский // Патол. физиол. особо опас. инф. Саратов, 1981.-С. 118-123.

27. Воронежская, Л.Г. Холерные вибрионы не 01 группы (биологическая характеристика): Дис. в форме науч. докл. . д-ра мед. наук. Саратов, 1994. -65 с.

28. Воронежская, Л.Г. Эколого-географическое распространение НАГ-вибрионов различных сероваров / Л.Г. Воронежская, А.Г. Сомова, Г.М. Мединский // Эпидемиол. и эпизоотол. чумы. Саратов, 1980. - С. 74-78.

29. Гальцева, Г.В. О некоторых вибрионах различного происхождения / Г.В. Гальцева, А.Г. Сомова, A.M. Зайденов // Технология производства сухих диагност, питат. сред. Махачкала, 1974. - Вып. 5. — С. 101-105.

30. Гальцева, Г.В. Таксономия и идентификация холерных и других вибрионов: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1973. — 21 с.

31. Гальцева, Г.В. Холероподобный гастроэнтерит, обусловленный вибрио флювиалис / Г.В. Гальцева, A.M. Зайденов, Э.Л. Черноусова // Сборник науч. трудов. Новороссийск, 1994.-Вып. 1.-С. 129-132.

32. Ганин, B.C. К вопросу о вибрионах открытых водоемов г. Иркутска / B.C. Ганин, А.С. Марамович, А.А. Вейде // Вопр. краевой инфекционной па-тол. Восточной Сибири. Иркутск, 1975. - С. 253-260.

33. Ганин, B.C. Серологическое типирование не агглюти-нирующихся 01-холерной сывороткой вибрионов, выделенных на территории СССР / B.C. Ганин, Л.Я. Урбанович, А.Г. Сомова // Журн. микробиол., эпидемиол и им-мунобиол. 1978. - №4. - С. 49-54.

34. Гинцбург, А.Л. Изучение полиморфизма штаммов холерного вибриона разного происхождения методом геномной дактилоскопии / А.Л. Гинцбург, Г.М. Грижебовский, О.Н. Токарская // Генетика. 1989. - Т. XXV. - №7. - С. 1320-1324.

35. Гинцбург, А.Л. Организация и клонирование структурных генов энте-ротоксина Vibrio cholerae eltor RV 79 / А.Л. Гинцбург, Н.В. Янишевский, В.Л. Мотин // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1984. - №9. - С. 12-18.

36. Грижебовский, Г. М. Холера на Кавказе (теоретические и прикладные вопросы эпидемиологии): Автореф. дис. в виде науч. доклада . д-ра мед. наук. — Саратов, 1997. 78 с.

37. Данилкина, Е.Б. Совершенствование методов выделения и идентификации патогенных для человека вибрионов: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1995. - 16 с.

38. Джапаридзе, М.Н. Оральная химическая вакцина из гипертоксигенныхштаммов КМ-76 Инаба и КМ-68 Огава возбудителя холеры / М.Н. Джапаридзе, А.В. Наумов, Г.П. Никитина // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммуно-биол. 1991. - №4. - С. 31-33.

39. Дуванова, О.В. Способность расщеплять твин 20 как дифференциальный тест для вибрионов 0139 серовара различного происхождения / О.В. Дуванова, Н.Я. Шиманюк, Б.Н. Мишанькин // Клин. лаб. диагностика. 2000. -№ 5. - С. 48-49.

40. Евлахова, С.П. Протеолитическая и лецитиназная активность холерных вибрионов 0139 серовара / С.П. Евлахова, Б.Н. Мишанькин // Пробл. сан.-эпид. охраны территории стран СНГ: Тез. докл. междунар. науч.-практ. конф. -Саратов, 1998.-С. 154-155.

41. Ермольева, З.В. Свойства и патогенетическое значение НАГ-вибрионов / З.В. Ермольева, Е.А. Ведьмина, Н.И. Гивенталь // Пробл. особо опасн. инф. -Саратов, 1973. -№3.- С. 16-22.

42. Ерошенко, Г.А. Молекулярное типирование штаммов Vibrio cholerae не Ol/не 0139, выделенных на территории Российской Федерации и другихстран СНГ от больных людей / Г.А. Ерошенко // Проблемы особо опас. инф. Саратов, 2005. - Вып. 2. - С. 64.

43. Заболотный, Д.К. Морфология, биология и распознавание холерных вибрионов. Холерная эпидемия 1908-1909 гг. в Петербурге / Д.К. Заболотный, С.И. Златогоров, Г.С. Кулеша, В.И. Яковлев // СПб., 1910. С. 33-44.

44. Заднова, С.П. Механизмы секреции грамотрицательных бактерий. / С.П. Заднова, Ю.В. Лозовский // Пробл. особо опас. инф. Саратов, 2005. -Вып.2. - С. 11-16.

45. Златогоров, С.И. К вопросу о диагностике холерного вибриона. Экспериментальные данные к эпидемиологии холеры / С.И. Златогоров // Русский врач. 1908. - №2. - С. 806-812.

46. Зыкин, Л.Ф. Современное состояние вопроса о лабораторной диагностике холеры / Л.Ф. Зыкин // Микробиол. и иммунол. особо опас. инфекций. -Саратов, 1968. С. 391-395.

47. Коробкова, Е.И. Микробиология и эпидемиология холеры. М., 1959.-304 с.

48. Костромитина, Е.А. Молекулярно-генетические свойства штаммов холерного вибриона с различной эпидемической значимостью: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 2004. - 22 с.

49. Лабораторная диагностика холеры: Методические указания. МУК 4.2.2218-07. М., 2007. - 87с.

50. Леванова, Г.Ф. Дифференциация бактерий рода Aeromonas от других представителей семейства Vibrionaceae на основе изучения их ДНК / Г.Ф. Леванова, В.М. Лавровская, Ю.П. Швецов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1980.- №8. -С. 13-15.

51. Ленинджер, А. Основы биохимии /А. Ленинджер. Москва, 1985. - Т. 1. - 365с.

52. Лобанов, В.В. Актуальные проблемы изучения продукции и биологических свойств холерного токсина: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. — Ростов-на-Дону, 1994.-37с.

53. Лобанов, В.В. Современные подходы к оценке способности холерных вибрионов продуцировать холероген / В.В. Лобанов, В.П. Власов, Е.В. Монахова // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. — 1990. №1. — С. 101102.

54. Ломов, Ю. М. Выявление липазы у Vibrio cholerae 01 серогруппы в реакции объёмной агломерации / Ю.М. Ломов, В. В. Агафонова, Н. Р. Телесманич // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2007, Т. 1. - С. 74-77.

55. Ломов, Ю.М. Изучение динамики выделения и характеристика фено- и генотипических свойств штаммов холерных вибрионов, изолированных в процессе мониторинга из водных объектов окружающей среды г. Ростова-на

56. Дону / Ю.М. Ломов, Б.Л. Мазрухо, В.Д. Крутиков // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2007. - Вып. 20. -С. 16-22.

57. Ломов, Ю.М. Пандемии холеры и эволюция возбудителя / Ю.М. Ломов // Холера: Матер. 8-ой Рос. науч. практ. конф. - Ростов-на-Дону, 2003. - С. 13-23.

58. Ломов, Ю.М. Характеристика современного этапа в развитии 7 пандемии холеры / Ю.М. Ломов, Г.Г. Онищенко, Э.А. Москвитина, Л.С. Подосин-никова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. - № 6. - С. 3942.

59. Ломов, Ю.М. Холера и проблема биотерроризма / Ю.М. Ломов, Э.А. Москвитина, Л.С. Подосинникова, Ю.М. Федоров // Матер. IX съезда Всерос. науч.-практ. об-ва эпидемиол., микробиол. и паразитол. Москва, 2007. - Том З.-С. 122-123.

60. Ломов, Ю.М. Холера как постоянная угроза эпидемических осложнений / Ю.М. Ломов, // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2008. - Вып. 21. - С. 8-13.

61. Ломов, Ю.М. Эволюция возбудителя холеры и прогноз по этой инфекции на ближайшее будущее / Ю.М. Ломов // Журн. эпидемиол. и инфекционные болезни. 2004. - № 1. - С. 7-12.

62. Ломов, Ю.М. Эпидемиология холеры, экология холерных вибрионов и эпиднадзор / Ю.М. Ломов, Ю.М. Фёдоров, Л.С. Подосинникова, Н.Р. Теле-еманич // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». -Ростов-на-Дону, 2007. Вып. 20. - С. 10-13.

63. Ломов, Ю.М. Эпидемически опасные холерные вибрионы нового серо-вара 0139 «Бенгал» / Ю.М. Ломов, Б.Л. Мазрухо, Л.Г. Воронежская // Сборник науч. трудов. Новороссийск, 1994. - Вып. 1. - С. 92-97.

64. Мазрухо А.Б. Изучение продукции и свойств энтеротокси на холерных вибрионов О-139 серовара: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1997. -20с.

65. Мазрухо, Б.Л. Перспективы серодиагностики холеры, обусловленной холерными вибрионами 0139 «Бенгал» / Б.Л. Мазрухо, Ю.М. Ломов, Л.Г. Воронежская // Сборник науч. трудов. Новороссийск, 1994. - Вып.1. - С. 123-124.

66. Мари Р. Биохимия человека / Р. Мари, Д. Греннер, П. Мейес, В. Роду-элл. М.: Мир. - 1993. - Т. 1. - 384 с.

67. Мединский, Г.М. Диарейные заболевания, вызываемые холерными вибрионами не 01 группы / Г.М. Мединский, Л.Г. Воронежская, А.Г. Сомова

68. Актуал. вопр. микробиол., лаб. диагност, и профилакт. холеры: Тез. Всесо-юз. науч. конф. Ростов-на-Дону, 1988 - С. 276-279.

69. Мединский, Г.М. Случаи пищевых токсикоинфекций, вызванных НАГ-вибрионами / Г.М. Мединский, A.M. Зайденов, P.M. Саямов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1976. -№7. - С. 131-134.

70. Мединский, Г.М. Эпидемиологические аспекты холеры eltor в Ростовской области / Г.М. Мединский, Ю.М. Ломов, Г.И. Кулов // Холера. Вопр. эпидемиол., микробиол. и лаб. диагност.: Матер. Рос. науч. конф. — Ростов-на-Дону, 1992.-С. 16-20.

71. Меньшикова, Е.А. Гемолитическая активность и токсигенность V. cholerae различных серогрупп / Е.А. Меньшикова, Л.С. Подосинникова, А.В. Миронова, О.И. Сальникова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2002.-№5.-С. 7-11.

72. Меньшикова, Е.А. Гемолитическая активность токсигенных и атоксигенных штаммов V. cholerae и V. cholerae 0139 серогрупп / Е.А. Меньшикова, Л.С. Подосинникова, А.В. Соколенко // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2004. - № 5. - С. 106-108.

73. Меньшикова, Е.А. Гемолитическая активность токсигенных и нетокси-генных штаммов холерных вибрионов различных серогрупп: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Ростов-на-Дону, 2004. - 18 с.

74. Мишанькин, Б.Н. Нейраминидазная активность у вибрионов различной серопринадлежности / Б.Н. Мишанькин, Ю.М. Ломов, Н.Я. Шиманюк // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». — Ростов-на-Дону, 2000. Вып. 13. - С. 78-80.

75. Монахова, Е.В. Видоспецифичный зонд для идентификации Vibrio cholerae / Е.В. Монахова, В.П. Власов, В.Н. Вуцан // Мол. генетика, микробиол. ивирусол. 1993.-№4.-С. 8-11.

76. Москвитина, Э.А. Современные тенденции в развитии седьмой пандемии холеры / Э.А. Москвитина // Журн. проблемы особо опасных инфекций. 2008. - Вып. 95. - С. 22-26.

77. Оленичева, Л.С. Очистка и характеристика секреторного гемолизина холерных вибрионов / JI.C. Оленичева, JT.H. Лобанова, Е.И. Евтеева // Бактериальные токсины: Всесоюз. Конф: Тезисы. Юрмала, 1989. - 94 с.

78. Оленичева, Л.С. Секреторные белки холерных вибрионов / Л.С. Оленичева, О.П. Фецайлова, Н.Б. Непомнящая // Регуляция микроб, метаболизма: Всесоюз. конф. Пущино, 1989. - С. 79.

79. Омариев, Э.Я. Некоторые аспекты НАГ-инфекции в Дагестане / Э.Я. Омариев, Ш.Г. Алиев, С.Н. Чернышев // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2000. — Вып. 13. - С. 87-88.

80. Онищенко, Г. Г. Боитерроризм как национальная глобальная угроза / Г. Онищенко, Л.С. Сандахчиев, С.В. Нетёсов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2000. - №6. - С. 83-85.

81. Онищенко, Г. Г. Холера, обусловленная Vibrio cholerae Ol ctxAB" tcpA+ / Г. Г. Онищенко Ю. М. Ломов, Э.А. Москвитина и др. // Жури, микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. — 2004. №1. - С. 29-34.

82. Онищенко, Г.Г. Вибрионы не 01 серологической группы и их значение в патологии человека / Г.Г. Онищенко, B.C. Ганин, Е.П. Голубинский. — М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2001. 384 с.

83. Онищенко, Г.Г. Холера в начале XXI века. Прогноз / Г.Г. Онищенко, Ю.М. Ломов, Э.А. Москвитина // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2005. - №3. - С. 44-48.

84. Онищенко, Г.Г. Холерные вибрионы серогрупп не Ol, выделенные в Узбекистане в 1987-1990 гг.: ретроспективный VNTR-анализ / Г. Онищенко, Б.Н. Мишанькин, А.С. Водопьянов // Эпидемиол. и инф. болезни 2003. -№6.-С. 25-29.

85. Онищенко, Г.Г. Эпидемиологическая обстановка в Чеченской Республике / Г. Онищенко, Г.М. Грижебовский, В.И. Ефременко // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2001. - Приложение 6. - С. 5-9.

86. Онищенко, Г.Г. Эпидемиологический надзор за холерой: обоснования к оценке его эффективности / Г. Онищенко, Ю.М. Ломов, Э.А. Москвитина // Пробл. особо опас. инф. Саратов, 2005. - Вып.1. - С. 5-9.

87. Определитель бактерий Берджи. М.: Мир, 1997. - Т. 1. - С. 199-200;

88. Осауленко, О.В. Изучение стабильности гемолитического теста уштаммов Vibrio cholerae eltor различной вирулентности / О.В. Осауленко,

89. А.С. Марамович, А.А. Вейде // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1983.-№ П.- С. 100-101.

90. Осауленко, О.В. Лецитиназная активность холерных и не агглютинирующихся 01-холерной сывороткой вибрионов / О.В. Осауленко, А.Ф. Пини-гин // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1987. - №2. - С. 15-18.

91. Подосинникова, Л.С. Холерные вибрионы, выделенные на территории СССР в период седьмой пандемии: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. Саратов, 1993.-44 с.

92. Покровский, В.И. Клиника, патогенез и лечение холеры / В.И. Покровский, В.В. Малеев, А.К. Адамов. Саратов, 1988.- 272 с.

93. Покровский, В.И. Холера / В.И. Покровский, В.В. Малеев. М.: Медицина, 1978.-232 с.

94. Рис, Э. От клеток к атомам / Э. Рис, М.М. Стернберг. М.: Мир, 1988. -144 с.

95. Рубан, Е. JI. Микробные липиды и липазы. Москва, 1977

96. Савельев, В.Н. Распространение и свойства холерных вибрионов, выделенных от людей и из объектов внешней среды на территории Предкавказья и Закавказья / В.Н. Савельев, А.Д. Антоненко, Г.М. Грижебовский, В.И. Ефременко. Ставрополь, 2007. - 416 с.

97. Савельев, В.Н. К микробиологии, клинике и эпидемиологии неэпидемической формы холеры / В.Н. Савельев, Г.М. Грижебовский, И.В. Савельева* // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». — Ростов-на-Дону, 2006. Вып. 19. - С. 25-27.

98. Савельев, В.Н. Этиология холеры эльтор / В.Н. Савельев, Г.М. Грижебовский, А.Ф. Брюханов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1998. №1. - С. 21-24.

99. Семиотрочев, B.JI. Группы V. cholerae, имеющие различную эпидемическую значимость / B.JI. Семиотрочев // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1990. - №4. - С. 61-67.

100. Семиотрочев, B.JI. Селекция клеток холерного вибриона Ol, лишенных1гемолитических свойств / B.JI. Семиотрочев, С.Н. Бабицин, А.О. Цитцер // Матер, обл. науч.-практ. конф. Гурьевской ПЧС по профилакт. ООИ. — Гурьев, 1989.-С. 192-194.

101. Смоликова, Л.М. Сезонная динамика численности вибрионов и родственных микроорганизмов в реке Дон / Л.М. Смоликова, А.Г. Сомова, Г.М. Мединский // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. — 1977. №2. -С. 29-33.

102. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс К. -М.: Мир, 1991.-544с.

103. Телесманич, Н.Р. Механизмы реализации гемолитической активности холерных вибрионов / Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов, Л.С. Подосинникова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2007. - №4. - С. 85-92.

104. Телесманич, Н.Р. К вопросу о природе гемолитической активности холерных вибрионов / Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2005. - Вып. 18. -С. 59-64.

105. Телесманич, Н.Р. Лабораторная диагностика холеры (проблемы и пути усовершенствования) / Н.Р. Телесманич // Пробл. комиссия «Холера и патоген. для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2008. - Вып. 21. - С. 18-24.

106. Телесманич, Н.Р. Механизмы гемолитической активности холерных вибрионов: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. — Ростов-на-Дону, 2006. — 38с.

107. Телесманич, Н.Р. Способ выявления атоксигенных гемолитичных штаммов холерных вибрионов / Н.Р. Телесманич, Е.В. Безуглова, Г.Л. Карбышев, В .В. Агафонова // Патент №2261444. Опубл. 27.09.2005г. - Бюл. № 27.

108. Телесманич, Н.Р. Способ дифференциации атоксигенных штаммов холерных вибрионов от токсигенных / Н.Р. Телесманич, Н.И. Винокур // Патент на изобретение № 2257415.

109. Телесманич, Н.Р. Триацилглицероллипазная активность гемолитических холерных вибрионов / Н.Р. Телесманич // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2004. - №2. - С. 11-14.

110. Титов, В.Н. Жирные кислоты, липиды (транспортные формы жирных кислот) и аполипопротеины (липидпереносящие макромолекулы) единая функциональная система /В.Н. Титов //Клин. лаб. диагностика, 2006. - №9. -С. 3-10.

111. Турова, Т.П. Сходство полинуклеотидных последовательностей ДНК холерных и так называемых неагглютинирующихся вибрионов / Т.П. Турова, А.С. Антонова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1977. — №7. - С. 47-50.

112. Усвяцов, Б.Я. Взаимодействие бактерий и эритроцитов / Б.Я. Усвяцов, Е.А. Ханина, О.В. Бухарин // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2005.-№4.-С. 89-95.

113. Ушакова, И.Е. Гемолитическая активность холерных вибрионов: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1993. - 22с.

114. Ушакова, И.Е. Клонирование и экспрессия генов гемолизина Vibrio cholerae eltor / И.Е. Ушакова, В.П. Власов, Н.К. Михась, Е.В. Монахова // Генетика и биохимия вирул. возб. особо опас. инф. Тез. докл. Рос. науч. конф. -Волгоград, 1992. С. 66.

115. Фейгин, Г.С. Некоторые особенности образования антител в процессе гипериммунизации кроликов антигенами кишечной палочки / Г.С. Фейгин, Н.М. Ландсман, Л.А. Громова, В.М. Смирнова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1971. - №2. - С. 29-33.

116. Фениксова, Р.В. Получение концентрированных ферментных препаратов. ЦИНТИ, Пищепром. Москва, 1960.

117. Фецайлова, О.П. Иммуногенность гемолизина холерных вибрионов / О.П. Фецайлова, B.C. Уралева // I съезд иммунологов России: Тез. докл. -Новосибирск, 1992. С. 495-496.

118. Цитцер, А.О. Характеристика свойств цитолизина холерного вибриона / А.О. Цитцер, О.В. Красильникова, Д.Н. Муратхаджаев, В.Л. Семиотрочев // Холера. Вопр. эпидемиол., микробиол. и лаб. диагност.: Матер. Рос. науч. конф. Ростов-на-Дону, 1992. - С. 78.

119. Челядинова, И.В. Изучение биологических свойств холерных вибрионов 0139 серогруппы: Автореф. дис. . канд. мед наук. Ростов-на-Дону, 2000J.- 18с.

120. Черепахина, И.Я. Антигенная изменчивость холерных вибрионов, выделенных в период седьмой пандемии холеры: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. Ростов-на-Дону, 2000 - 43с.

121. Черепахина, И.Я. Некоторые экологические аспекты антигенной вариабельности холерных вибрионов / И.Я. Черепахина, Б.Н. Мишанькин, О.С. Бурлакова // Холера: Матер. VIII Рос. науч.-практ. конф. по пробл. «Холера». -Ростов-на-Дону, 2003. С. 169-172.

122. Шевченко, Л.А. Фоефотазная активность у представителей V. cholerae 0139 «Бенгал» / Л.А. Шевченко, Е.С. Филякина, Б.Н. Мишанькин // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». — Ростов-на-Дону, 1999.-Вып. 12.-С. 77-78.

123. Шиманюк, Н.Я. Нейраминидаза холерных вибрионов 0139 серовара «Бенгал» / Н.Я. Шиманюк, О.В. Дуванова, Б.Н. Мишанькин // Матер, науч.-практ. конф., посвящ. 100-лет. образован, противочумной службы России. -Саратов, 1997.-Т.2. С. 151-152.

124. Шиманюк, Н.Я. Уреазная активность V. cholerae 0139 «Бенгал» / Н.Я. Шиманюк, М.В. Шишияну, О.В. Дуванова, Б.Н. Мишанькин // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». Ростов-на Дону, 1999. — Вып. 12. - С.75-76.

125. Albert, M.J. Characterization of Aeromonas trota strains that cross-react with Vibrio cholerae 0139 Bengal / M.J. Albert, M. Ansaruzzaman, T. Shimada // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol.33, №12. - P. 3119-3123.

126. Albert, M.J. Epidemiology and molecular biology of Vibrio cholerae 0139 Bengal / M.J. Albert // Indian J. Med. Res. 1996. - Vol.104. - P. 14-27.

127. Albert, M.J. Large outbreak of clinical cholera due to V. cholerae non 01 in Bangladesh / M.J. Albert, A.K. Siddique, M.S. Islam // Lancet. 1993. - Vol.341, №8846.-P. 704.

128. Aldova, E. Isolation of non-agglutinable vibrio from an enteritis outbreak in Czechoslovakia / E. Aldova, K. Laznickova, E. Stepankova, J. Lietava // J. Infect. Dis.- 1968.-Vol.118.-P.25-31.

129. Ali, A. Mutations in . extracellular protein secretion pathway genes (eps) / A. Ali, J.A. Johnson, A.A. Franco // Infect. Immun. 2000. - Vol. 48, №4. - P. 1967-1974.

130. Anderson, R.S. Deoxyribonucleic acid relationships among marine Vibrios / R.S. Anderson, E.T. Ordal // J. Bacteriol. 1972.- Vol. 109, №2.- P. 696-706.

131. Aubert, G. Isolation of Vibrio strains in French coastal waters and infection with Vibrio cholerae non 01/non0139 / G. A. Aubert, Garricajo, R. Vermesch // Presse Med. 2001 - Vol.30, № 13. - P. 1631 -1633.

132. Barrett, T. J. Epidemiological usefulness of changes in hemolytic activity of Vibrio cholerae biotype ELTor during the seventh pandemic / T. J. Barrett, P. A. Blake//J. Clin. Microbiol.-1984.-Vol. 13, №1.-P. 126-129.

133. Bernard, P. L hemolyse par le vibrion El Tor et par son hemolysine / P. Bernard, J. Guillerm, J. Gallut // Compt. Rend. Soc. Biol.- 1939.- Vol. 130.- P. 147-148.

134. Bik, E.M. Global climate infectious disease: the cholera paradigm / E.M. Bik, R.R. Colwell // Science. 1996. - Vol. 274, №5295. - P. 2025-2030.

135. Bik, E.M. Genesis of the novel epidemic Vibrio cholerae 0139 strain: evidence for horizontal transfer of genes involved in polysaccharide synthesis / E.M. Bik, A.E. Bunschoten, R.D. Gouw, F.R. Mooi // EMBO Journal. 1995. - Vol. 14, №2.-P. 209-216.

136. Bitter, W. Formation of oligomeric rings by XcpQ and PilQ, which are involved in protein transport across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa / W. Bitter, M. Koster, M. Latijnhouwers, H. De Cock // Mol. Microbiol. 1998. -Vol.27.-P. 209-219.

137. Bojic, I. Diseases caused by bacteria and rickettsia in biological warfare andbioterrorism /1. Bojic, J. Vukadinov, S. Minic //Med. Pregl. 2007. - Vol.60, №3-4.-P. 195-197.

138. Brady, D. Spherenzymes: a novel structured self-immobilisation enzyme technology / D. Brady, J. Jordaan , C. Simpson , A. Chetty , C. Arumugam , F.S. Moolman .// BMC Biotechnol. 2008. - Vol. 8. - P. 8.

139. Casanova, T.B. The Vibrio cholerae hlyC gene encodes a protein that is related to lipases of pseudomonas species / T.B. Casanova, K.M. Peterson // DNA Seq. -1995. Vol. 5, №3. P. 181-184.

140. Chattopadhyay, K. Unfolding of Vibrio cholerae hemolysin induces oligomeri-zation of the toxin monomer / K. Chattopadhyay, K.K. Banerjee // J Biol Chem. -2003. Vol. 278, № 40. - P. 38470-38475.

141. Christenson, B. Septicemia due to a non-01/non-0139 Vibrio cholerae / B. Christenson, L.M. Souchet, L. Nieves, M. Soler // Bol. Asoc. Med. P.R. 1997. -Vol.89, №1.-P.31-32.

142. Chung, C.W. Export of recombinant proteins in Escherichia coli using ABC transporter with an attached lipase ABC transporter recognition domain (LARD) / C.W. Chung, J. You , K. Kim, M. Yoon , H. Kim , J.H. Ahn I I Microb. Cell Fact. -2009.-P. 8-11.

143. Citarella, R.V. Polyphasic taxonomy of the genes Vibrio: polynucleotide sequence relationship among selected Vibrio species / R.V. Citarella, R.R. Colwell // J Bacteriol. 1970. - Vol. 104, №2. - P. 434-442.

144. Colwell, R.R. Global climate infectious disease: the cholera paradigm / R.V. Citarella // Science. 1996. - Vol. 274, №5295. - P. 2025-2030.

145. Dakin, W.P.H. Gastroenteritis due to non-agglutinable (non-cholera) vibrios / W.P.H. Dakin, D.J. Howell, R.G.A. Sutton // Med. J. Aust. 1974. - Vol.2, №13. -P. 487-490.

146. De, S.N. The haemolytic activities of Vibrio cholerae and related vibrios / S.N. De, K. Bhattacharyya, P.K. Roychaudhury // J. Pathol. Bacteriol. 1954. -Vol. 67.-P. 117.

147. Dodin, A. Laboratory methods for the diagnosis of cholera vibrio and other vibrios / A. J. Dodin, M. Fournier // Unite Cholera et vibrions Institute Pasteur. -Paris, 1992. 148p.

148. Faruque, S.M. Distribution of zonula occludens toxin (zot) gene among clinical isolates of Vibrio cholerae Ol from Bangladesh and Africa / S.M. Faruque, L. Comstock, J.B. Kaper, J. Albert //J. Diar. Dis. Res. 1994. - Vol. 12, № 3. - P.222-224.

149. Finlai, B.B. Common themes in microbial pathogenicity revisited / B.B. Fin-lai, S. Falkow//Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997. - Vol. 61. - P. 136-169.

150. Fiore, E. Cloning, characterization, and chromosomal mapping of a phos-pholipase (lecithinase) produced by Vibrio cholerae / E. Fiore, J. Michalski, R. Russel // Infect. Immun. 1997. - Vol. 65, № 8. - P. 3112-3117.

151. Fournier, J.M. Laboratory methods for the diagnosis of cholera vibrio and other vibrios / J.M. Fournier // Unite Cholera et vibrions Institute Pasteur. Paris, 1992.

152. Fraga, S.G. Environment and virulence factors of Vibrio cholerae strains isolated in Argentina / S.G. Fraga, M. Pichel, M. Costagliola // J. Appl. Microbiol. -2007. Vol.103, №6. - P.2448-2456.

153. Fujii, R Directed evolution of Pseudomonas aeruginosa lipase for improved amid-hydrolyzing activity / R Fujii, Y. Nakagawa, J. Hiratake // Protein Eng Des Sel.-2005.-Vol. 18, №2.-P. 93-101.

154. Gallut, J. Complete analysis of the specific antigen of the cholera vibrio and its practical applications / J. Gallut // Bull. Wold. Hlth. Org. 1949. - Vol.2. -P.39.

155. Gallut, J. Взаимодействие вибрионов классической холеры биотипа Эль Тор и вибрионов НАГ / J. Gallut, J. Quiniou // Бюлл. ВОЗ 1971. - Т. 42, № 3. - С. 480-482.

156. Ganguly, R. Haemolysis in vibrios / R. Ganguly, A. K. Ghosh, S. P. De // Indian. J. Med Rec. 1966.- Vol. 54. - P. 15-23.

157. Gatti-Lafranconi, P. Unscrambling thermal stability and temperature adaptation in evolved variants of a cold-active lipase. / P.S. Gatti-Lafranconi, M. Caldarazzo , A. Villa , L. Alberghina , M. Lotti // FEBS Lett. 2008 - Vol. 582, №15.-P. 2313-2318.

158. Gaur, R. Protein-coated microcrystals of Pseudomonas aeruginosa PseA lipase / R. Gaur, G.N. Gupta , M. Vamsikrishnan, S.K Khare // Appl. Biochem. Biotechnol. 2008 Vol. 151, №2-3.-P. 160-166.

159. Gilboa-Garber, N. Pseudomonas aeruginosa lectins as a model for lectin production, properties, applications and functions / N. Gilboa-Garber // Zbl. Bakt. Hyg. 1988. - Vol. 270, № 1-2. - P. 3-15.

160. Goldberg, S.L. Cloning and characterization of the hemolysin determinants from Vibrio cholerae RV 79 (Hly +), RV 79 (Hly and 569B / S.L. Goldberg, J.R. Murphy // J. Bacteriol. 1985. - Vol. 162, № 1. - P. 35-41.

161. Goldberg, S.L. Molecular cloning of the hemolysin determinant from Vibrio cholerae El Tor / S.L. Goldberg, J.R. Murphy // J. Bacteriol. 1984. - Vol. 160, № l.-P. 239-244.

162. Gopal, S. The occurrence of Vibrio species in tropical shrimp culture environments; implications in food safety / S. Gopal, S.IC. Otta, S. Kumar // J. Food

163. Microbiol. 2005. - Vol.102, №2. - P. 151-159.

164. Gotschlich, F. Uber cholera und cholera-ahnliche Vibrionen unter den aus Mekka zurtickkehrenden Pilgern / F. Gotschlich // Zschr. Hyg. Infektkr.-1906. - Bd. 53. - H. 2. - S. 281-304.

165. Gotschlich, F. Vibrions choleriques isoles au campement de Tor. Retour du pelerinage de l'annee 1905. Rapport adresse au president du Conseil quarantenaire d'Egypte, Alexandria/F. Gotschlich //Bull. Inst. Pasteur. 1905.- Vol. 3.- P. 726.

166. Gupta, N. Single-step purification of lipase from Burkholderia multivorans using polypropylene matrix / P. Gupta, N. Rathi, R. Singh // Apl. Microbiol. Bio-technol. 2005. - Vol. 67, №5. - P. 648-53.

167. Gupta, R. Bacterial lipase: an overview of production, purification and biochemical properties / N. Gupta, P. Rathi // Appl. Microbial. Biotechnol. 2004. -Vol. 64, №6. -P. 763-781.

168. Hales, L. M. Legionella pneumophila contains a type II general secretion pathway required for growth in amoebae as well as for secretion of the Msp protease / L. M. Hales, H. A. Shuman // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67. - P. 36623666.

169. Hardeman, F. Metagenomic approach for the isolation of a novel low-temperature-active lipase from uncultured bacteria of marine sediment. / F. Hardeman, S. Sjoling. // FEMS Microbiol Ecol. 2007. - Vol. 5, № 2. - P. 524534.

170. Harris, J.R. Interactin of the Vibrio cholerae cytolysin (VCC) with cholesterol, some cholesterol esters, and cholesterol derivatives: а ТЕМ study / J.R. Harris, S. Bhakdi, U. Meisner // J. Struct. Biol. 2002. - Vol. 139, №2. - P. 122135.

171. Hasanuzzaman, M. Isolation, identification, and characterization of a novel, oil-degrading bacterium Pseudomonas aeruginosa T1 / M. Hasanuzzaman, К M. Umadhay-Briones, SM. Zsiros // Curr Microbial. 2004. - Vol. 49, №2. - P. 108114.

172. Hase, C.C. Cloning and nucleotide sequence of the Vibrio cholerae hemag-glutinin/protease (HA/protease) gene and construction of an HA/protease-negative strain / C.C. Hase, R. A. Finkelstein // J. Bacteriol. 1991. - Vol. 173. - P. 33113317.

173. Heidelberg, J.F. DHA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae / J.F. Heidelberg, J.A. Eisen, W.C. Nelson et al. // Nature. -2000. Vol. 406, № 6795. - P. 477-483.

174. Henderson, I.R. Virulence functions of autotransporter proteins / I.R. Henderson, J.P. Nataro // Infect. Immunol. 2001. - Vol. 69, №3. - P. 1231-1243.

175. Hilton, S. Action of a microbial lipase/acyltransferase on phospholipid monolayers / S. Hilton, J.T. Buckley // Biochemistry. 1991. -Vol.18, №30. - P. 6070-6074.

176. Hugh, R. A comparison of the neotype strain and 119 isolates of Vibrio eltor Pribram 1933 / R. Hugh // Indian. J. Med. Res. 1966. - Vol. 54, №9. - P. 839-848.1kigai,

177. Ikigai, H. Two forms of Vibrio cholerae Ol El Tor hemolysin derived from identical precursor protein / H. Ikigai, Т. Ono, T. Nakae // Bioch. Bioph. Acta. -1999.-Vol. 1415, №5.-P. 297-305.

178. Ingole, K.V. Study of proteases and other enzymes of Vibrio cholerae Ol El Tor and 0139 serotypes isolated in Yavatmal (Maharashtra) / K.V. Ingole, S.V.

179. Jalgaonkar, R.P. Fule // Indian J. Pathol. Microbiol. 1998. - Vol. 41, №4. - P. 419-422.

180. International travel and health. Situation as on 1 January, 2005//WHC), Geneva, 2005. 202 p.

181. Johnson, J.A. Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal is closely related to Vibrio cholerae El Tor but has important differences / J.A. Johnson, C.A. Salles, P. Pa-nigrahi // Infect. Immun. 1994. - Vol. 62, № 5. - P. 2108-2110.

182. Kaper, J.B. Molecular approaches to the study of infectious diseases / J.B. Ka-per, //Mar. Technol. Soc. J. 1981. - Vol. 15, № 2. - P. 41-44.

183. Kaper, J.B. Molecular epidemiology of Vibrio cholerae in the United States Gulf Coast / J.B. Kaper, H.B. Bradford, N.C. Roberts, S. Falkow // J. Clin. Microbiol. -1982. Vol. 16, № 1. - P. 129-134.

184. Kaper, J.B. Numerical taxonomy of vibrios isolated from astuarine environments / J.B. Kaper, H. Lockman, E.F. Remmers // Int. J. Syst. Bact. 1983 -Vol.33, №2.-P.229-255.

185. Kienn, E.D. Characterization and relatedness of marine Vibrios pathogenic to fish: deoxyribonucleic acid homology and base composition / E.D. Kienn, R.E. Pacha//J. Bacteriol. 1969. - Vol. 100, №3. - P. 1248-1255.

186. Kim, K.R. Purification, refolding and characterization of recombinant Pseudomonas fluorenscens lipase / K.R. Kim, D.Y. Kwon, S.H. Yoon // Protein Expr Purif. 2005. - Vol. 39, №1. - P. 124-9.

187. Kisiel, M. The case of infection Vibrio cholerae non Ol поп 0139 in Warsaw / M. H. Kisiel, Zacharska, M. Czerniawska-Ankiersztejn, D. Rudal // Przegl. Epidemiol. 2006. - Vol.60, №4. - P. 779-787. ■

188. Kontkanen, H. Characterization of steryl esterase activities in commercial lipase preparations / H. M. Kontkanen, Tenkanen, R. Fagerstrom // J. Biotechnol. -2004. Vol. 108, № 1. - P. 51 -59.

189. Krasilnikov, O.V. The mode of action of Vibrio cholerae cytolysin. The influences on both erythrocytes and planar lipid bilayers / O.V. Krasilnikov, J.N.

190. Muratkhodjaev, A.O. Zitzer // Biochim. Biophys. Acta. 1992. - Vol. 1111, № 1. -P. 7-16.

191. Krzeslak, J. Lipase expression in Pseudomonas alcaligenes is under the control of a two-component regulatory system. / J. Krzeslak, G. Gerritse , R. van Merkerk , R.H. Cool , W.J. Quax . // Appl. Environ. Microbiol. 2008 - Vol. 74, №5.-P. 1402-1411.

192. Loghem, J J. van. Der El Tor Vibrio / J .J. van. Loghem // Z. Hyg. Infekt. Kr. 1932.-Bd. 114. - S. 20.

193. Loghem, J.J. van. Un vibrion ElTor pathogene isole aux Indes Neerlandaises / J.J. van. Loghem // Bull. Off. Int. Hyg. Publ. 1938. - T. 30, № 8. - P. 1520-1523.

194. Lowry, O.H. Protein measurement with the folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosenbrough, A.L. Fair, R.J. Randall //J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193, № l.-P 265-275.

195. Manning, P.A. Cloning of the structural gene (hly) for the hemolysin of Vibrio cholerae El Tor strain 07 / P.A. Manning, M.H. Brown, M.W. Heusenroeder //Gene. 1984.-Vol. 31, № 1-3.-P. 225-231.

196. Matsumiya, Y. Isolation and characterization of a lipid-degrading bacterium and its application to lipid-containing wastewater treatment / Y. Matsumiya, D. Wakita, A. Kimura // Japan. J Biosci Bioeng. 2007. - Vol. 103, №4. - P.325-30.

197. McCardell, B.A. Isolation and characterization of a cytolysin produced by Vibrio cholerae serogroup lion Ol / B.A. McCardell, l.M. Madden, D.B. Shah // Canad. J.

198. Microbiol.- 1985. -Vol. 31, №8. P. 711-720.

199. McCardell, B.A. Two-step purification and partial characterization of a variant of the Vibrio cholerae non 01 hemolysin / B.A. McCardell, M.H. Kothaiy, J.M. Madden//FEMS Microbiol. Lett. 1999. - Vol. 180, № 2. - P. 177-182.

200. Mechow, S. Mapping of a gene that regulates hemolysin production in Vibrio cholerae / S. Mechow, A.B. Vaidya, M.G. Bramucci // J. Bacterid.- 1985. -Vol. 163, №2.-P. 799-802.

201. Medina, R.B. Determination of estsrolytic and lipolytic activities of lactic acid bacteria / R.B. Medina, M.B. Katz, S. Gonzalez // Methods Mol Biol. 2004. -Vol. 268.-P. 465-470.

202. Mekalanos, J.J. Cholera toxin genes: nucleotide sequence, deletion analysis and vaccine development / J.J. Mekalanos, D.J. Swartz, Y.D. Pearson //Nature. 1983. - Vol. 306, № 5943. - P. 551-557.

203. Mekalanos, J.J. Cholera: Molecular basis for emergence and pathogenesis / J.J. Mekalanos, E.U. Rubin, M.K. Waldor // FEMS Immunol. Med. Microbiol.1997.-Vol.18.-P.241-248.

204. Mekalanos, J.J. Cholera: Molecular basis for emergence and pathogenesis / J.J. Mekalanos, M.K. Waldor, E.Y. Rubin // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1997. - Vol. 18, № 4. - P. 241-248.

205. Morris, T.G. Cholerae and other virioses in the United States / T.G. Moms, R.E. Black //N. Engl. J. Med. 1985. - Vol. 312, №6. - P. 343-350.

206. Morris, T.G. Non-Ol group Vibrio cholerae: a look at the epidemiology of occasional pathogen // Epidemiol. Rev. 1990. - Vol. 12. - P. 179-191.

207. Morris, T.G. Experimental non-Ol group Vibrio cholerae gastroenteritis in humans / T.G. Morris, T. Takeda, B.D. Tail // J. Clin. Invest. 1990. - Vol.85. -P. 697-705.

208. Mukhopadhyay, A.K. Molecular epidemiology of reemergent Vibrio chlerae Bengal in India / A. Basu, P. Garg / A.K. Mukhopadhyay // J. Clin. Microbiol.1998. Vol. 36, №7. - P. 2149-2152.

209. Nardiello, S. Cholera: recent acquisitions / S. Nardiello, A. Ilario, F.M. Fus-co, G. Cuomo // Infez. Med. 2007. - Vol.15, №2. - P.85-92.

210. Norton, R. Vibrio cholerae non Ol facial cellulitis in a North Queensland, Australian child / R. Norton, M. Vucak, H. Stalewski // Pediatr. Infect. Dis. J. -2001. Vol. 20, №5. - P. 550-551.

211. Noureddini, H. Immobilized Pseudomonas cepacia lipase for biodiesel fuel production from soybean oil / H. Noureddini, X. Gao, RS. Philkana // Bioresour Technol. 2005. - Vol. 96, №7. - P. 769-77.

212. Ogierman, M.A. Characterization of the Vibrio cholerae eltor lipase operon lip AB and a protease gene down-stream of the hly region / M.A. Ogierman, A. Fallarino, T. Riess // J. Bacteriol. 1997. - Vol. 179, № 22. - P. 7072-7080.

213. Olson, R. Vibrio cholerae cytolysin is composed of an alpha-hemolysin-like core / R. Olson, E. Gouaux // Protein Sci. 2003. - Vol. 12, № 2. - P. 379-383.

214. Otero, C. General characterization of non commercial microbial lipase in hydrolytic and synthetic reactions / C. Otero, MA. Berrendero, F. Cardenas // Apl. Biochem Biotechnol. 2005. - Vol. 120, №3. - P. 209-24.

215. Ouchterlony, O. Gel diffusion techniques / O. Ouchterlony // Immunoche-mie-Berlin, Heidelberg, New-York. 1965. - P. 13-35.

216. Palomo, J.M. Use of immobilized lipase for lipase purification via specific lipase-lipase interactions / J.M. Palomo, C. Ortiz, M. Fuentes // J. Chromatogr. A. 2004. - Vol. 1038, №1-2. - P. 267-273.

217. Prabhakar, H. Outbreak of gastroenteritis due to a new strain of non О group-1 Vibrio cholerae, in Ludhiana in May August 1993. / H. Prabhakar, M. Lai, H. Kaur // Indian. J. Med. Res. - 1994.- Vol. 99, № 3.- P. 107-108.

218. Prim, N. Esterase EstA6 from Pseudomonas sp. CR-611 is a novel member in the utmost conserved cluster of family VI bacterial lipolytic enzymes / N. Prim, C. Bofill, F.I. Pastor, P. Diaz. // Biochimie. 2006. - Vol. 88, № 7. - P. 859-867.

219. Qadri, F. Enterotoxigenic Escherichia coli and Vibrio cholerae diarrhea, Bangladesh, 2004 / F. Qadri, A.I. Khan, A.S. Faruque // Emerg. Infect. Dis. 2005.-Vol. 11, №7. -P. 1104-1107.

220. Rahman, R.N. S5 Lipase: an organic solvent tolerant enzyme. / R.N. Rahman, S.N. Baharum , A.B. Salleh , M. Basri .// J. Microbiol. 2006. - Vol. 44, № 6.-P. 583-590.

221. Rahman, R.N, High-yield purification of an organic solvent-tolerant lipase from Pseudomonas sp. strain S5 / R.N. Rahman, S.N Baharum, M. Basri // Anal Biochem. 2005. - Vol. 342, №2. - P. 267-74.

222. Ramamurthy, T. Emergence of novel strain of Vibrio cholerae with epidemic potential in southern and eastern India / T. Ramamurthy, S. Garg, R. Sharma // Lancet. 1993. - Vol. 341, №8846. -P.703-704.

223. Ramamurthy, T. Health impairments arising from drinking water resources contaminated with Vibrio cholerae / T. Ramamurthy, S. Chakraborty, G.B. Nair, S.K. Bhattacharya // Schriftenr. Ver. Wasser, Boden, Lufthyg. 2000. - Vol. 105. -P. 29-34.

224. Richardson, K. Hemolysin production and cloning of two hemolysin determinants from classical Vibrio cholerae / K. Richardson, J. Michalski, J. Kaper // Infect. Immun. 1986. - Vol. 54, № 2. - P. 415-420.

225. Roh, C. Isolation of a low-temperature adapted lipolytic enzyme from uncultivated micro-organism / C. Roh, F. Villatte // J. Appl Microbiol. 2008 - Vol. 10, №1. - P. 116-123.

226. Roy, C. Haemolytic and nonhaemolytic El Tor vibrios / C. Roy, S. Mukerjee, S. Tanamal // Ann. Biochem. Exp. Med. 1963. - Vol. 23, № 12. - P. 553-558.

227. Roy, D. Structural features of a cold-adapted Alaskan bacterial lipase. / D. Roy, S. Sengupta // J. Biomol Struct Dyn. 2007. - Vol. 24, № 5. - P. 463-470.

228. Royo, G. Bacteriemia рог Vibrio cholerae no Ol / G. Royo, C. Martin, E. Fuentes // Enferm. Infecc. у microbiol. Clin. 1993. - Vol. 11, №4. - P.228.

229. Sakaguchi, M. Случай септицемии с циррозом печени, (вызванный) Vibrio cholerae, не относящимися к серотипу Ol / М. Sakaguchi, N. Itagaki, М. Funauchi // J. Jap. Assoc. Infect. Dis. 1992. - Vol.66, №5. - P. 653-656.

230. Saminathan, M. Blue native electrophoresis study on lipases. / M. Samina-than, K.T. Muthukumaresan , S. Rengarajan , N. Muthukrishnan , P. Gautam . // Anal Biochem. 2008/ - Vol. 37, №2/ - P. 270-281.

231. Sandkvist, M. Biology of type II secretion / M. Sandkvist // Mol. Microbiol. 2001. - Vol. 40. - P. 271-283.

232. Sandkvist, M. Direct interaction of the EpsL and EpsM proteins of the general secretion apparatus in Vibrio cholera / M. Sandkvist, L. P. Hough, M. M. Bagdasarian, M. Bagdasarian//J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181. - P. 3129-3135.

233. Sandkvist, M. General secretion pathway (eps) genes required for toxin secretion and outer membrane biogenesis in Vibrio cholerae / M. Sandkvist, L. O. Michel, L. P. Hough // J. Bacteriol. 1997. - Vol. 179. - P. 6994-7003.

234. Sandkvist, M. Interaction between the autokinase EpsE and EpsL in the cytoplasmic membrane is required for extracellular secretion in Vibrio cholera / M. Sandkvist, M. Bagdasarian, S. P. Howard, V. J. DiRita // EMBO J. 1995. Vol. 14.-P. 1664-1673.

235. Sen, R. A note on designating strains as Vibrio cholerae biotype El Tor / R. Sen, D.L. Shrivastava//Indian. J. Med Rec. 1970. - Vol. 58, № 2. - P. 174-178.

236. Sen, R. Observations on the haemolytic character of Vibrio cholerae in a medium containing glycerol / R. Sen // Indian. J. Med Rec. 1971. - Vol. 59, №7. -P. 1019-1024.

237. Shimada, Т. Outbreak of Vibrio cholerae non 01 in India and Bangladesh / T. Shimada, G.B. Nair, B.B. Deb //Lancet. 1993. - Vol. 341. - P. 1347.

238. Singh, R. A simple activity staining protocol for lipases and esterases. / R. Singh, N. Gupta, V.K. Goswami, R. Gupta .// Appl Microbiol Biotechnol. 2006. - Vol. 7, № 6. - P. 679-682.

239. Suankratay, C. Non-serogroup 01 Vibrio cholerae bacteremia and cerebritis / C. Suankratay, K. Phantumchinda, W. Tachawiboonsak, H. Wilde // Clin. Infect. Dis.-2001.-Vol. 32, №7.-P. 117-119.

240. Tison, D.L. Vibrio species of medical importance / D.L. Tison, M.T. Kelly // Diagn. Microbiol. Inf. Dis. 1984. - Vol. 2 - P. 263-276.

241. Towbin, H. Electroforetic transfer of proteins from poliacrilamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications / H. T. Towbin, Stachelin, J. Gordon // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol. 76, №9. - P. 4350-4354.

242. Trucksis, M. The Vibrio cholerae genome contains two unique circular chromosomes / M. J. Trucksis, Michalski, Y.K. Deng // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1998. Vol. 95, №24. - P. 14464-14469.

243. Vargas, V.A. Lipase-producing microorganisms from a Kenyan alkaline soda lake / V.A. Vargas, O.D. Delgado, R. Hatti-Kaul // Biotechnol. Lett. 2004. -Vol. 26, №2.-P. 81-86.

244. Waldor, M.K. Lysogenic conversion by a filamentous phage en coding cholera toxin / M.K. Waldor, J.J. Mekalanos // Science. 1996. - Vol. 272, №5270. - P.1910-1914.

245. Waldor, M.K. Regulation, replication and integration functions of the Vibrio cholerae CTX phi are encoded by region RS 2 / M.K. Waldor, J.J. Mekalanos, H. Kimsey // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 24, №5. - P. 917-926.

246. Waldor, M.K. Regulation, replication and integration functions of the Vibrio cholerae CTXcp are encoded by region RS2 / M.K. Waldor, E.J. Rubin, D.N. Gregory // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 24. - P. 917-926.

247. Waldor, M.K. ToxR regulates virulence gene expression in non-Ol strains of Vibrio cholerae that cause epidemic cholera / M.K. Waldor, J.J. Mekalanos // Infect. Immun. 1994. - Vol. 62, №1. - P. 72-78.

248. West, P.A. Identification and classification of Vibrionaceae an overview / B.C. West, R.R. Colwell // Vibrios in the Environment. - 1984. - P. 285-363.

249. West, P.A. The human pathogenic vibrios a public althea update with environmental perspectives / B.C. West // Epidemiol. Infect. 1989. - Vol. 103, №1. -P. 1-34.

250. Williams, S.G. The transcriptional activator HlyU of Vibrio cholerae: nucleotide sequence and role in virulence gene expression / S.G. Williams, S.R. Attridge, P.A. Manning // Mol. Microbiol. 1993. - Vol. 9, №4. - P. 751-760.

251. Williams, S.G. Transcription of the Vibrio cholerae haemolysin gene, hlyA, and cloning of a positive regulatory locus, hlyU / S.G. Williams, P.A. Manning // Mol. Microbial. 1991. - Vol. 5, №8. - P. 2031-2038.

252. Wong, H.C. Incidence of toxigenic vibrios in foods available in Taiwan / H.C. Wong, S.H. Ting // J. Appl. Bacteriol. 1992. - Vol. 73, №3. - P. 197-202.

253. Yamamoto, K. Hemolysins of Vibrio cholerae: homology of non Ol hemolysin to Eltor hemolysin and its enterotoxicity / K. Yamamoto, N. Nakasone, M. Tanabe // Jap. J. Med. Sci. Biol. 1985. - Vol. 38. - P. 263.

254. Yamamoto, K. Identity of hemolysins produced by Vibrio cholerae non Ol and Vibrio cholerae Ol biotype El Tor / K. Yamamoto, Y. Ichinose, N. Nakasone //Infect. Immun. 1986.-Vol. 51.-P. 927-931.

255. Yamamoto, K. Non 01 Vibrio cholerae hemolysin: purification, partial characterization and immulogical relatedness to El Tor hemolysin / K. Yamamoto, M. Al-Omani, T. Honda // Infect. Immun. 1984. - Vol. 45, №1. - P. 192-196.

256. Zitzer, A. Mode of primary binding to target membranes and pore formation induced by Vibrio cholcrae cytolysin (hemolysin) / A. Zitzer, M. Palmer, U. Weller//Eur. J. Biochem. 1997. - Vol. 247, №1. - P. 209-216.