Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности межмолекулярного взаимодействия в системе антибактериальный антибиотик эремомицин - полимерные сорбенты

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Закономерности межмолекулярного взаимодействия в системе антибактериальный антибиотик эремомицин - полимерные сорбенты"

На правахрукописи

ПОЛЯКОВА ИРИНА ВАЛЕРИЕВНА

ЗАКОНОМЕРНОСТИ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В СИСТЕМЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЙ АНТИБИОТИК ЭРЕМОМИЦИН - ПОЛИМЕРНЫЕ СОРБЕНТЫ

03.00.02 — биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2004

Работа выполнена в Санкт-Петербургском политехническом университете на факультете медицинской физики и биоинженерии

Научный руководитель:

кандидат химических наук, ст. н. с. Писарев О.А. Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, ст. н. с. Тимковский А.Л. кандидат химических наук, доцент Глазова Н.В.

Ведущая организация:

Научно-исследовательский технологический институт антибиотиков и ферментов медицинского назначения

Защита состоится «л/ 2004 г. в '7 часов на заседании

диссертационного совета Д. 212. 229. 25 при Санкт-Петербургском государственном политехническом университете по адресу: ул.Хлопина, 5 Санкт-Петербургский политехнический университет, факультет медицинской физики и биоинженерии.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского политехнического университета.

Автореферат диссертации разослан 2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук, доцент

Власова О.Л.

Актуальность темы. Совершенствование лечебно-диагностических процессов является наиболее актуальной задачей в области медицинских наук. Решение данной задачи связано с использованием высокоэффективных лекарственных средств, к числу которых относятся антибиотики нового поколения. В настоящее время они являются важнейшими противоопухолевыми и антибактериальными средствами, широко используемыми в практической медицине.

Антибактериальный антибиотик эремомицин— новый представитель группы полициклических гликопептидов, для которой характерна высокая бактерицидная активность в отношении грамположительных бактерий, а также медленная адаптация к ним микроорганизмов. Являясь структурным аналогом известного антибактериального антибиотика ванкомицина, эремомицин по химиотерапевтическим свойствам превосходит его в 2—10 раз, и, одновременно, менее токсичен. Связывание эремомицина с бактериальной клеткой представляют собой сложный спектр физико-химических сорбционных взаимодействий цвиттериона антибиотика с пептидогликаном бактериальной клетки. Аминосахара инициируют первичное связывание и участвуют в формировании гидрофобного кармана, ингибирующего рост бактериальной клетки. Кроме того, углеводы значительно улучшают растворимость эремомицина в воде. Атом хлора в ^концевой части гептапептида стабилизирует этот участок и способствует прочности комплекса антибиотик— фрагмент D-Ala-D-Ala пептидогликана микробной клетки. Исследование химио-терапевтической эффективности продуктов деградации эремомицина показало, что дегликозилирование эремомицина и элиминирование атома хлора приводят к значительному снижению антимикробной активности антибиотика.

В настоящее время в основе технологии получения эремомицина лежит биосинтез с последующей многостадийной экстракционной очисткой с использованием органических растворителей. При этом наблюдается разрушение нативной структуры лекарственной субстанции, что приводит к ухудшению фармакологических свойств эремомицина.

Поэтому создание щадящей технологии получения и очистки эремомицина, максимально сохраняющего свою нативную структуру и, следовательно, обладающего высокой химиотерапевтической эффективностью, является актуальной задачей. Данная задача связана с систематическим изучением закономерностей физико-химического поведения органического цвиттериона эремомицина в модельных сорбцион-ных системах, а также с экспериментальным выбором характеристик последних по принципу их подобия природным сорбционным системам — клеточным стенкам бактерий.

Цели и задачи исследования. Целью работы являлось изучение закономерностей равновесия, кинетики и динамики межмолекулярных взаимодействий в модельных сорбционных системах с участием антибактериального антибиотика эремомицина и полимерных сорбентов и разработка на этой основе физико-химических условий осуществления эффективного хроматографического метода получения антибиотика с высокой нативной антибактериальной активностью.

Для реализации указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследование закономерностей межмолекулярного взаимодействия в системе антибактериальный антибиотик эремомицин — полимерные сорбенты различного типа и структуры на основе представлений о физико-химических взаимодействиях антибиотика с пептидогликаном бактериальной клетки.

2. Изучение равновесных и кинетических параметров сорбции эре-момицина с полимерными сорбентами в условиях, при которых реализуется полифункциональные взаимодействия, обеспечиваемые нативной структурой антибиотика. Исследование физико-химических условий специфического равновесного межфазного переноса эремомицина в растворе биополимеров и его зависимости от кинетического фактора.

3. Исследование динамики межмолекулярного взаимодействия эремомицина с карбоксильными катионитами. Определение оптимальных физико-химических условий образования резких границ концентрационного профиля антибиотика.

4. Разработка физико-химических условий одноактного высокоселективного препаративного динамического процесса выделения эремо-мицина, при котором сохраняется его нативная структура. Расчет параметров масштабирования.

Научная новизна. На основе представлений о межмолекулярных взаимодействиях антибактериального антибиотика эремомицина с пеп-тидогликаном грамположительных бактерий выявлены закономерности полифункционального связывания антибиотика с полимерными сорбентами различного типа и структуры и установлен превалирующий вклад электровалентных и гидрофобных сил взаимодействия. Установлено, что карбоксильные гетеросетчатые полиэлектролитные системы, являющиеся структурно устойчивыми при изменении степени ионизации фиксированных групп и ионной силы окружающего раствора, способствуют наиболее полному связыванию цвиттериона эремомицина. В совокупности эти свойства позволяют сравнивать карбоксильные полимерные сорбенты с биологическими мембранами, особенно клеточной стенкой бактерий, и, следовательно, использовать их в моделировании биологических сорбционных систем.

Впервые изучены равновесные, кинетические и динамические закономерности межмолекулярного взаимодействия эремомицина с полимерными сорбентами. Установлен внутридиффузионный характер инклюзии эремомицина в структуру полимерных сорбентов и природа распределения антибиотика в зернах катионитов, соответствующая теоретической модели «оболочка-ядро». Исследованы условия обострения концентрационного профиля в регулярном динамическом режиме взаимодействия эремомицина с карбоксильными катеонитами и механизм перераспределения вкладов сил межмолекулярного взаимодействия в системе сорбат — сорбтив.

Практическая значимость. На основании проведенных исследований и теоретической обработки полученных экспериментальных данных по равновесию, кинетике и динамике межмолекулярного взаимодействия эре-момицина с полимерными сорбентами различной молекулярной структуры установлены оптимальные физико-химические условия реализации эффективного динамического процесса получения лекарственной субстанции антибиотика, сохраняющей свою нативную структуру и высокую антибактериальную активность. Проведено масштабирование параметров эффективного одноактного высокоселективного препаративного хроматографи-ческого метода получения эремомицина. Установлена целесообразность использования карбоксильных катионитов в процессе моделирования биологических сорбционных систем.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на межвузовской научной конференции «XXIX неделя науки СПбГТУ» (Санкт-Петербург, 2000, 2001), на 10-й международной конференции студентов и аспирантов «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений» (Вторые Кирпичниковские чтения, Казань, 2001), на Втором конгрессе молодых ученых «Научная молодежь на пороге XXI века» (Томск, 2001), на 25-й Международной конференции по высокоэффективным жидко-фазным разделениям (Голландия, 2001), на Международном симпозиуме по ионному обмену и хроматографии (Воронеж, 2001), на научно-практической конференции «Формирование технической политики инновационных наукоемких технологий» (Санкт-Петербург, 2001, 2003), на Международной конференции по препаративной и индустриальной хроматографии «SPICA 2002» (Heidelberg, 2002), на Всесоюзных симпозиумах "Структура и динамика молекулярных систем" (Яльчик 2002, 2003 г), на 3-ем Международном симпозиуме по разделениям в бионауках (Москва, 2003).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Закономерности и основные виды межмолекулярных взаимодействий в системе антибактериальный антибиотик эремомицин— поли-

мерные сорбенты различной молекулярной структуры на основе представлений о связывании антибиотика с бактериальной клеткой. Анализ равновесно-кинетических параметров и особенности поглощения полимерными сорбентами органического цвиттериона эремомицина.

2. Оценка динамических параметров взаимодействия эремомицина с полимерными сорбентами различной молекулярной структуры с целью разработки эффективного метода получения лекарственной субстанции с сохранением ее нативной структуры.

3. Расчет параметров масштабирования одноактного высокоселективного препаративного хроматографического процесса получения эре-момицина.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных экспериментальных данных, а также их математической обработки, выводов, списка литературы, включающего 123 работы отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 115 страницах, содержит 28 рисунков и 10 таблиц.

Материалы и методы.

Основным объектом исследования являлся эремомицин - антибактериальный антибиотик, выделенный во ВНИИ по изысканию новых антибиотиков АМН СССР из культуральной жидкости актшюмицета ИНА-238. По своей структуре эремомицин относится к группе полициклических гликопептидов (далбагептидов). Эта группа объединяет антибиотики, в которых углеводы связаны с линейным гептапептидом, включающим трифенокситриаминотрикарбоновую (ванкомициновую) и дифенилдиаминодикарбоновую кислоты, что придает антибиотикам характерную полициклическую структуру. Молекулярная масса эремомицина (С7зН89Кю02оС1) — 1540. В своей структуре эремомицин содержит ионогенные группы: концевую карбоксильную (рКа 3.1), три амин-ных (рК'а16.9, рК2„17.9, рК3а19.0) и три фенильных (рК1^ 9.7, рК^д 10.4, рК3^ 11.35).

В качестве полимерных сорбентов использовались: полисорб (неио-ногенный макропористый сорбент — сополимер стирола и дивинилбен-зола); полидекстран — Т70 (продукт взаимодействия растворимого дек-страна с эпихлоргидрином); «Сферон» — сополимер метакриловой кислоты и глицидилметакрилата, синтезированный в Институте Макромо-лекулярной Химии ЧАН; АВ-17 х 8 — высокоосновный анионит на основе сополимера стирола и дивинилбензола; катиониты группы БДМ, полученные в ИВС РАН путем радикальной сополимеризации метакри-ловой кислоты (МАК) и диметакрилата этиленгликоля (ДМЭГ); сорбен-

ты MN-200 и MN-500 (сульфированные изопористые сополимеры стирола и дивинилбензола, полученные в присутствии циклогексана как порообразователя. Синтезированы в ИНЭОС РАН).

Потенциометрическое титрование сорбентов проводили методом отдельных навесок, предложенным Грегором. В основу метода положено эмпирическое уравнение Гендерсона-Гассельбаха:

рН = рКв+«1§-^-, (О

1 -а *

где рК„— кажущаяся константа диссоциации функциональных групп сорбента, а — степень ионизации функциональных групп, п— константа, зависящая от строения полимерной матрицы и природы проти-воина. По физическому смыслу величина п представляет собой меру отклонения системы от идеальности при ионизации полиэлектролита.

Равновесные и кинетические параметры сорбции эремомицина были исследованы в статических условиях спектрофотометрическим методом, основанным на способности эремомицина поглощать ультрафиолетовый свет с максимумом поглощения при А, = 280 нм. Для определения равновесной концентрации антибиотика использовали предварительно построенные калибровочные кривые £>280™ ~Л.С), которые носили линейный характер вплоть до С = 0.3 мг/мл. Сорбционную емкость сорбента по антибиотику находили по формуле:

где С, Срам— начальная и равновесная концентрации эремомицина соответственно, мгмл"1; V— объем раствора, мл; тя— масса навески сорбента, г.

Математическая обработка экспериментальных данных по кинетике взаимодействия эремомицина с сорбентами производилась: 1. по модели Бойда:

5 = 0.0871^ р Л2 (3)

где £> — эффективный коэффициент д и ф ф у и^и ^р-а д и у с зерна ионита в набухшем состоянии, мкм; р — угол наклона линейного

участка зависимости степень достижения равно-

весия сорбции за время

Среднее время сорбции рассчитывали следующим образом:

7=| (4)

В случае внутридиффузионной кинетики в сферическое зерно сорбента:

2. по модели "оболочка-ядро":

где Х—эффективный сорбционный слой, мкм; р - относительный радиус.

Динамику взаимодействия эремомицина с карбоксильными катио-нитами группы БДМ исследовали на лабораторных колонках различных размеров. Исследовали влияние скорости подачи раствора эремомицина и десорбирующего раствора на характер динамических режимов взаимодействия антибиотика с сорбентом.

Результаты и их обсуждение.

Равновесие взаимодействия эремомицииа с полимерными сорбентами

Изучение равновесия взаимодействия биологически активных молекул и полимерных сорбентов различного типа и структуры позволяет более подробно интерпретировать природу поведения этих молекул в сложных биологических системах. На рисунке 1а. показано взаимодействие карбоксильных катионитов группы БДМ с цвиттерионом эремо-мицина. В данной сорбционной системе прослеживается связь между емкостью сорбции, с одной стороны, и количеством мостикообразую-щего агента в ионите или набухаемостью, с другой стороны. Наличие сорбционной емкости в кислой среде (при рН ~3.5), в которой карбоксильные группы катионитов практически недиссоциированы, свидетельствует о необменном, скорее всего, гидрофобном взаимодействии антибиотика с сорбентами, причем величина сорбционной емкости падает с понижением коэффициента набухания. Восходящий участок кривых соответствует постепенному переходу катионитов в диссоциированное состояние, при котором они вступают в электровалентное взаимодействие с ионами и ассоциатами эремомицина. Максимальное значение сорбционной емкости по эремомицину достигается в области значений рН, близких к нейтральным. При этом, в зависимости от количе-

ства сшивающего агента, наблюдается смещение максимума сорбции: от слабокислых рН для структурно гелевых сорбентов (БДМ-1 и БДМ-3) к нейтральным рН для структурно сегрегированных сорбентов (БДМ-9 и БДМ-12). Понижение сорбционной емкости до нуля в сильно щелочной области рН дает основание полагать, что специфика взаимодействия эремомицина с карбоксильными катионитами на нисходящем участке кривых определяется переходом амино- и фенильных групп антибиотика в недиссоциированное состояние.

Исследование физико-химических свойств карбоксильных катиони-тов группы БДМ показало, что в зависимости от степени сшивки в вод-иых растворах эффективная константа диссоциации сорбентов имеет порядок величины 10"5+ 10"7.

* 4 I I Г I * 11 рН 141«Г«»10 11

Рис. 1а. Сорбция эремомицина Рис. 16. Влияние рН на сорбцию

на карбоксильных катионитах группы эремомицина сорбентами БДМ с разной степенью сшивки с различной молекулярной

в зависимости от рН внешнего раствора. структурой

т — сорбционная емкость по эремоми-цину. Цифра в названии сорбента соответствует содержанию сшивающего агента ДМЭГ в мольных %

Достаточно прямолинейный характер кривых на рис. 1б, характеризующих постоянство величин сорбционных емкостей полидекстрана и анионита АВ-17 в отношешш эремомицина при различных значениях рН, указывает на необменное гидрофобное взаимодействие эремомицина с данными сорбентами. С молекулярными сорбентами «Сфероном» и «Полисорбом» эремомицин также вступает в гидрофобные взаимодействия за счет ярко выраженной агликоновой (циклопептидной) части молекулы, которая формирует гидрофобный карман в результате связывания антибиотика с пептидогликаном бактериальной клетки.

Иная картина наблюдается при сорбции эремомицина на сульфока-тионите М^500. Поскольку энергия отрыва иона водорода в сульфо-группах значительно меньше, чем в карбоксильных группах, а диссоциация сульфогрупп существенно не зависит от концентрации ионов водорода в широком интервале значений рН, то уже при рН ~3.5 наблюдается высокая сорбционная емкость. Понижение величины сорбцион-ной емкости в нейтральной области рН, по всей видимости, обусловлено ограничением проницаемости внутрисетчатого пространства изопо-ристого сульфокатионита по отношению к ассоциатам эремомицина и усугубляется электростатическим отталкиванием ионизированной карбоксильной группы антибиотика от сульфогрупп. Рост рН в сторону щелочных значений способствует переходу основных групп антибиотика в неионизированное состояние и понижению ассоциатообразования. Это выражается в росте сорбционной емкости в результате превалирования преимуществешю гидрофобного взаимодействия над электростатическим.

Большинство клеток отрицательно заряжено по отношению к внешней среде. Кроме того, в молекулярную структуру муреина (пептидог-ликана бактериальной клетки) входят карбоксильные группировки, вступающие не только в ион-ионные взаимодействия с биологическими молекулами, но также индуцирующие дипольный момент в незаряженных молекулярных структурах. Это позволяет взаимодействовать физиологически активным субстанциям в биологических сорбционных системах по сложному полифункциональному механизму. Изучение взаимодействия эремомицина с карбоксильными катеонитами продемонстрировало первичное электровалентное связывание аминогрупп антибиотика и дальнейшую реализацию полифункциональных взаимодействий в модельной системе. Необходимо отметить, что первичное связывание эремомицина с муреином также инициируют аминосахара антибиотика, а дальнейшее взаимодействие гидрофобного агликонового фрагмента молекулы эремомицина со стенкой бактериальной клетки способствует образованию гидрофобного кармана.

Варьирование физико-химических условий позволяет более подробно интерпретировать виды взаимодействия в сорбционной системе.

С ростом ионной силы при постоянной концентрации антибиотика во внешнем растворе, равной 1.0 мгмл"1, выбранной с учетом содержания эремомицина в культуральной жидкости, наблюдается уменьшение сорбщюнной емкости, т.к. подавляется диссоциация ионогенных групп антибиотика (см. табл.1). Введение органического растворителя, прежде всего, способствует подавлению гидрофобных взаимодействий. Также понижается диэлектрическая постоянная раствора, а следовательно понижается подвижность диссоциированных ионов и молекул. В иссле-

дуемой сорбционной модели наблюдается экстремальная зависимость емкости сорбции от количества органического растворителя во внешнем растворе. Протекание сорбции в статических условиях при достаточно больших концентрациях изопропанола свидетельствует о сверхэквивалентной сорбции антибиотика.

Таблица 1

Влияние различных факторов на сорбцию эремомицина на карбоксильных катионитах с разным содержанием сшивающего агента

Факторы, влияющие на сорбцию БДМ-5 БДМ-12

т, мгт"1 В,% т, мг-г"1 В,%

I.M (С= 1 мгмл"1 ) 0 975 97.5 936 95.5

0.1 856 85.6 788 81.2

0.2 460 60 392 62

0.4 86 8.9 84 8.9

А,% СI = 0.2М) (С= 1мг* мл"1) 0 458 52.5 390 50.7

10 595 54.3 600 60.6

25 750 79.5 635 65.5

50 156 16 618 61.2

70 199 19 460 54

m — сорбционная емкость сорбента, мгг"1; I— ионная сила внешнего раствора, М; С— концентрация эремомицина, мгмл"1; А — процентное содержание изопропилового спирта во внешнем растворе; В — процент

сорбированного эремомицина, В = —^-£2£L. ЮО %, где mр11ВН — масса эремомицина в равновесном растворе, мг; — масса эремомицина в начальном растворе, мг.

Кинетика взаимодействия эремомицина с полимерными сорбентами.

Одним из основных факторов, влияющих на кинетику взаимодействия органических компонентов с сорбентом, является размер частиц сорбента. При уменьшении размера частиц кинетические кривые сорбции эремомицина катионитами группы БДМ (рис. 3) в координатах F —Jit112) показывают улучшение кинетических параметров: увеличение угла наклона начального участка, характеризующего скорость насыщения, tgP, и времени полунасыщения /0.j, при котором F — 0.5. Так измельчение ионитов до величины Л~80 мкм увеличивает скорость диффузии практически на порядок и более (см.табл.2). Одновременно с

этим очевиден внутридиффузионный характер поглощения эремомици-на, о чем свидетельствует достаточно протяженный начальный прямолинейный участок кинетических кривых в координатах

Рис. 3. Влияние размеров частиц сорбента на кинетику взаимодействия эремомицина с БДМ-12. рН=6.9,1=0.2М; F— степень заполнения сорбента эремомицином; / — время, сек

При равномерном распределении органических ионов в объеме частиц сорбента обработку кинетических экспериментальных данных традиционно осуществляют по модели Бойда. Рассчитанные в результате такой математической обработки параметры: эффективный коэффициент диффузии, £>, и среднее время сорбции, Т, не соответствуют полученной экспериментально закономерности, т.е., по расчетным дашшм не прослеживается наблюдаемое экспериментально улучшение кинетических параметров на фракциях частиц сорбентов среднего размера (130 -г- 358 мкм) (см.табл. 2). Это указывает на неравномерное распределение органического цвиттериона эремомицина в полимерных носителях, возникающее в результате диффузии, идущей внутри ограниченной глубины каналов или пустот, по которым движутся ионы от периферии зерна к центру. Такой характер диффузии приводит к постепенному затуханию процесса перемещения сорбируемых молекул. Поэтому для адекватной оценки кинетических экспериментальных данных была использована модель, учитывающая неоднородное распределение органических ионов в фазе сорбента — модель «оболочка — ядро».

Таблица2

Кинетические параметры взаимодействия эремомицина с карбоксильными катионитами

Эксперимент. данные из кинетических кривых Расчетные дан- Расчетные дан-

Сорбенты Размер частиц, Д-104, см ные по модели БоЙда ные по модели "оболочка-ядро"

1еЭ А).5> мин Я • 10®, см^сек'1 мин £> • 109, см^сек"1 мин

БДМ-3 7.0 358 0.028 6.02 31.99 16.24 3.02 9.36

130 0.043 1.60 9.98 6.89 6.34 4.19

80 0.085 0.27 14.72 1.76 21.92 1.38

БДМ-5 6.2 238 0.026 10.83 11.31 18.84 2.34 11.01

130 0.040 2.5 7.99 7.96 4.70 5.16

80 0.072 1.07 9.80 2.46 14.60 1.92

БДМ-9 4.8 238 0.036 3.04 18.30 9.82 3.77 5.74

130 0.043 1.36 7.79 6.90 4.93 4.20

80 0.178 0.15 50.35 0.40 74.98 0.31

БДМ-12 5.5 238 0.034 2.80 17.81 11.00 3.64 6.44

130 0.045 2.02 9.36 6.29 5.91 3.79

80 0.227 0.10 89.67 0.25 133.5 0.19

Для расчетов кинетических параметров взаимодействия эремомицина с карбоксильными катионитами группы БДМ по модели «оболочка-ядро» была установлена толщина сорбционного слоя, Ь. Для этого были исследованы зависимости сорбционных емкостей ионитов БДМ-5 и БДМ-12 от среднего радиуса частиц. Максимальная сорбционная емкость как для гелевого БДМ-5, так и для гетеросетчатого сорбента БДМ-12 наблюдалась в практически одинаковом диапазоне размеров частиц (рис. 4). Средний радиус 20 мкм был принят приблизительной величиной сорбционного слоя Ь. При данной величине частиц исходная структура сорбента все еще сохраняется, и все типы взаимодействия эремо-мицина с катионитами реализуются. При дальнейшем измельчении сорбентов имеет место разрушение структуры сшитого полимера под воздействием механических сил, приводящее к ухудшению сорбционных параметров сорбентов. Величина сорбционной емкости катеонитов с радиусом частиц ~ от 80 мкм и выше имеет практически постоянную величину, что в совокупности с хорошими механическими характеристиками среднедисперсных сорбентов делает их наиболее подходящими для осуществления препаративных хроматографических процессов.

Рис. 4. Зависимость сорбционной емкости катионитов БДМ-5 (1) и БДМ-12 (2) по отношению к эремомицину от размера частиц сорбента (сорбция из 0,2 М ац.-амм. буфера, рН = 6.9)

Исследование кинетических параметров взаимодействия эремоми-цина с БДМ-12 в различных условиях протекания диффузии дало возможность дополнительно интерпретировать факторы, влияющие на неравномерное распределение антибиотика в объеме сорбента. Введение сильного электролита во внешний раствор частично подавляет электровалентные взаимодействия между антибиотиком и катионитом, и, следовательно, отражает вклад молекулярного, с превалированием гидрофобного, связывания в диффузионную миграцию органического цвит-териона. Колебательный характер кривых (рис. 5а.) на участке неравновесной сорбции с превышением степени насыщения Б=1 можно интерпретировать как доннановское исключение адсорбтива из сорбционной системы. При достижении сорбционного равновесия кривые носят прямолинейный характер. При подавлении электровалентных взаимодействий эремомицина с БДМ-12 незначительное улучшение кинетических параметров наблюдалось на самой крупной фракции (238 мкм), поскольку в структуре сорбента удельное содержание гидрофобных компонентов больше, чем в более мелких фракциях.

При введении во внешний раствор изопропилового спирта (рис.5б) создаются условия подавлении гидрофобных взаимодействий, одновременно с этим наблюдается превалирование ионообменной и молекулярной сорбции. Причем на самой крупной фракции (238 мкм) наблюдается значительное ухудшение кинетических параметров (эффективный коэффициент диффузии уменьшается практически на два порядка в

сравнены! с более мелкими фракциями), по причине более затрудненного доступа к сорбционным центрам сорбента.

Рис.5б. Кинетика взаимодействия эремомицина с БДМ-12 из 50% раствора изопропанола в 0.2М ац.-амм. буфера при рН = 6.9

Рис.5а. Кинетика взаимодействия эремомицина с БДМ-12 с разным средним размером частиц из 02 М ац.-амм.буфера в присутствии 0.4 М при рН = 6.9

Таким образом, изучение кинетики взаимодействия продемонстрировало неоднородное распределение и полифункциональное связывание эремомицина на карбоксильных катионитах в зависимости от физико-химических условий сорбции.

Динамика взаимодействия эремомицина с карбоксильным катио-нитом БДМ-12

Исследование динамики межмолекулярного взаимодействия в модельных сорбционных системах необходимо для подробной интерпретации механизма квазиравновесного связывания, характерного для биологических сорбционных систем. Одновременно с этим, в ходе эффективных динамических процессов создаются условия для получения лекарственных субстанций, проявляющих наиболее эффективную химио-терапевтическую избирательность. Поэтому целью данного раздела работы являлась разработка схемы эффективного динамического процесса выделения эремомицина, сохраняющего свою нативную структуру. Для этого решалась одна из основных задач препаративной фронтальной динамической сорбции — исследование условий, при которых границы концентрационного профиля выделяемой физиологически активной субстанции не размываются, а динамический процесс протекает в регулярном режиме, обеспечивающем полноту полифункционльного связывания.

Использование 0.2 М ацетатно-аммониевого буфера со щелочным рН в качестве десорбирующего раствора (в соответствии с равновесными экспериментами) позволило осуществить полную десорбцию эремо-мицина с карбоксильных катионитов. На рисунке 6 элюционные кривые демонстрируют постепенное обострение стационарного концентрационного фронта эремомицина по мере перехода рН элюирующего раствора в сторону более щелочных значений. При рН=10.5 наблюдается максимальное концентрирование.

Рис. 6. Десорбция эремомицина с катионита БДМ-12. Элюент — 0.2М щелочной ацетатно-аммониевый буфер. Сорбция осуществлялась из 0.2М ац.-амм. буфера с рН = 6.4 при начальной концентрации эремомицина 1 мг/мл. Скорость сорбции — десорбции 0.5 мл/мин; размер колонкиЭУ-Н- 10X 70мм

Осуществление эффективной динамики взаимодействия, при котором реализуется максимальное концентрирование физиологически активного компонента, зависит как от скорости протекания многокомпонентного раствора по колонке, так и от скорости протекания десорби-рующего раствора. Понижение величины скоростей протекания растворов по колонке, как правило, способствует формированию стационарного концентрационного профиля.

Характер динамических кривых, изображеных на рисунке 7а, свидетельствует о формировании стационарного концентрационного профиля эремомицина при подаче раствора в колонку со скоростью порядка 0.2 мл/мин. Режим сорбции при скорости подачи раствора равной 3.5 мл/мин является неравновесным. Остальные динамические кривые соответствуют переходному режиму, близкому к равновесному.

Исследование влияния скорости десорбции эремомицина с катиони-та БДМ-12 на форму элюционных кривых (рис. 7б) свидетельствуют о протекании равновесной десорбции в достаточно широком диапазоне скоростей, а при скоростях десорбции 0.3-5-0.7 мл/мин происходит концентрирование антибиотика в 30+40 раз, что является существенным при масштабировании процесса.

Рис.7а. Влияние скорости протекания раствора эремомицина

на динамику взаимодействия эремомицина с БДМ-12. Сорбция из 02 М ац.-амм. буфера с рН = 72; размер колонки О ХН= 10x70мм

Рис.76. Влияние скорости протекания десорбирующего раствора

на режим элюции эремомицина с БДМ-12. Сорбция из 02 М ац.-амм. буфера при рН = 7.2; элюент - 02 М ац.-амм. буфер с рН = 10.5; размер колонки £> X Н = 10 X 70мм

Изменение ионной силы десорбирующего раствора способствует перераспределению вкладов сил межмолекулярного взаимодействия в системе сорбат-сорбтив. При этом может наблюдаться как уширение, так и раздвоение концентрационных профилей. На рис.8 показано влияние ионной силы и содержания органического компонента на форму концентрационного профиля, формирующегося при десорбции эремоми-цина с катионита БДМ-12. Очевидно, что вследствие уменьшения экранировки ионогенных центров, понижение ионной силы десорбирующе-го раствора способствует увеличению времени задержки органического иона. Введение 30% изопропилового спирта в 0.1 М ацетатно - аммониевый буфер способствует большему уширению пика и увеличению времени задержки на колонке. В динамических условиях введение 30% изопропанола в десорбирующий раствор (0.1М ацетатно-аммониевый буфер с рН = 10.5) способствует удержанию эремомицина с катионитом по мере продвижения элюционного фронта по колонке и концентрационный фронт размывается. С ростом ионной силы от 0.1 М до 0.2 М при десорбции щелочным ацетатно-аммониевым буфером все взаимодействия эремомицина с катионитом подавляются и формируется более узкий и высокий стационарный концентрационный профиль.

5-]С, иг/мл

V, мл

Рис. 8. Влияние ионной силы на динамику десорбции эремомицина на БДМ-12. Сорбция протекала из 02 М ац.-амм. буфера при рН = 7.2, с начальной концентрацией эремомицина в растворе 1 мг/мл. Десорбция производилась щелочным ац.-амм. буфером с рН = 10.5 при различной ионной силе; размер колонки /?Х Н= 10 X 70мм

Размер колонки, также является одним из основных факторов, влияющих на формирование границ элюционного фронта. В процессе сорбции эремомицина на колонке малого размера

был выявлен механизм динамического связывания антибиотика с ка-тионитом.

С, мгУил

V, ил

Рис. 9. Динамика взаимодействия эремомицина с БДМ-12 на колонке ОХН= 8ммX 15мм; сорбция осуществлялась из 0.2М ац.-амм. буфера (рН = 6.9) при начальной концентрации эремомицина в растворе 1 мг/мл; скорость десорбции Удее01)б=1 мл/мин; пик I - элюция 0.2М ац.-амм.буфер при рН = 6.9, пик II — элюция 0.2М ац.-амм.буфер при рН - 10.5

На рис. 9 широкие пики I, соответствуют десорбции антибиотика под воздействием 0.2 М буфера, из которого протекала сорбция. Выход эремомицина составляет порядка 85-5-90% от общей массы. Оставшийся антибиотик (10*15 %) десорбируется только при подавлении ион-ионных взаимодействий щелочным буфером (пик II). Дробление пика I, скорее всего, объясняется тем, что при увеличении скорости сорбции до 0.5 мл/мин большее количество антибиотика задерживается непосредственно у выхода из колонки.

Таким образом, исследование динамики сорбции эремомицина на карбоксильном катионите БДМ-12 позволило детально исследовать условия формирования элюционного фронта и показало целесообразность использования этого катионита для разработки селективного хромато-графического выделения эремомицина, сохраняющего свою нативную структуру и химиотерапевтическую эффективность.

Масштабирование процесса хроматографического выделения эремомицина.

Для реализации оптимальных физико-химических условий крупномасштабного получения физиологически активных субстанций в условиях производства проводят масштабирование динамических сорбционных процессов. С этой целью рассчитывают критериальный параметр X;, который характеризует режимы динамических процессов сорбции.

где Г/— равновесный коэффициент распределения ьтого компонента; £) „ (см^сек'1) — эффективный коэффициент диффузии ¡-того компонента; с", (см)— диаметр набухших частиц; ф — фазовое отношение хроматографической колонки:

ф = (1-а)/сс (10)

где а—доля свободного объема колонки, которая для карбоксильных ка-тионитов группы БДМ составляет~03, соответственно ф=2.3; О,(мин"1) — приведенная скорость подвижной фазы:

где V— объем раствора, мл; V— скорость протекания подвижной фазы по колонке, мл/мин.

При внутридиффузионной кинетике в ограниченный слой частиц сорбента условие регулярности режима имеет вид:

Л, = X, (1+р+ рг)/(1+Зр+ бр^р1) »1, (12)

где р — относительный радиус несорбирующего "ядра".

По полученным равновесным, кинетическим и динамическим параметрам взаимодействия эремомицина с катионитом БДМ-12 был рассчитан критерий Л, демонстрирующий наличие регулярного режима протекания динамических процессов (Л »1) в широком диапазоне скоростей подачи раствора в колонку. На основании полученных величин Л были рассчитаны допустимые величины скоростей протекания подвижной фазы через колонки различных объемов (см.табл.З).

Таблица 3

Масштабированные параметры динамики взаимодействия эремомицина с карбоксильным катионитом БДМ-12

Л =30.3 Л*= 14 9 Л =6.4

V, л V, л/ч К л V, л/ч К л V, л/ч

0 005 5 10 0 007 1.89 3.78 0 005 5 10 0.018 4 66 9.35 0.005 5 10 0.042 11.10 21.91

V— объем колонки, л; V — скорость протекания раствора антибиотика по колонке, л/ч.

Так как критерий значительно превышает 1 в широком диапазоне величин, то это позволяет использовать высокие скорости подачи раствора антибиотика в колонку, особенно при (табл. 3). При этом устанавливается регулярный режим сорбции, способствующий высокой концентрации целевого компонента на выходе разделительной системы. Понижение критерия до значений, близких к единице, способствует увеличению скорости протекания подвижной фазы. В этом случае режим сорбции остается квазиравновесным, однако, происходит значительное размывание концентрационного профиля антибиотика в колонке и, соответственно, падает как производительность процесса, так и чистота целевого компонента. Таким образом, адекватная оценка равновесно-кинетических характеристик, влияющих на критерий Л, способствует расчету и созданию наиболее оптимальных физико-химических условий реализации масштабируемого динамического разделительного процесса в условиях промышленного производства.

Выводы

1. Исследованы межмолекулярные взаимодействия в системах с участием антибактериального антибиотика эремомицина и полимерных сорбентов различной молекулярной структуры. Показано, что карбоксильные катиониты наиболее селективно связываются с эремомицином, и могут быть использованы для моделирования процессов взаимодейст-

вия в сложных биологических сорбционных системах с участием органических цвиттерионов.

2. Установлено, что максимум поглощения эремомицина карбоксильными катионитами осуществляется в области нейтральных значений рН. Показано, что поливалентный цвиттерион эремомицина в результате преобладания в его структуре основных групп, в большей степени проявляет свойства катиона, которые, прежде всего, определяются величиной общего положительного заряда. Установлена полная обратимая сорбция эремомицина на карбоксильных катионитах в условиях перехода основных групп в неионизированную форму.

3. Экспериментально-теоретический анализ данных по кинетике взаимодействия эремомицина с полимерными сорбентами позволил:

установить внутридиффузионное (гелевое) лимитирование процесса сорбции;

показать значительное улучшение сорбционно-кинетических характеристик при уменьшении размера зерен катионитов до 80 мкм;

определить в условиях максимальной сорбции эффективный коэффициент диффузии (~10~8- 10"9 см2,сек-1), что позволяет осуществлять равновесную динамическую сорбцию антибиотика при высоких скоростях подвижной фазы;

установить неоднородное распределение эремомицина в зёрнах карбоксильных катионитов группы БДМ и определить размер эффективного сорбционного слоя (~20 мкм). Для адекватной математической обработки кинетических экспериментальных данных использована модель «оболочка-ядро».

4. Показано преобладание электровалентного и гидрофобного видов взаимодействия эремомицина с полимерными сорбентами. В условиях квазиравновесного динамического взаимодействия эремомицина с карбоксильным катионитом БДМ-12 выявлен механизм перераспределения сил связывания антибиотика с сорбентом при протекании раствора по колонке. Установлены физико-химические условия элюции, способствующие обострению концентрационного профиля целевого компонента: оптимальным элюируюгцим раствором является 0.2М ацетатно-аммониевый буфер с

5. При использовании безразмерного критерия Л проведен расчёт параметров масштабирования динамического процесса получения эре-момицина, сохраняющего свою нативную структуру. Показана возможность использования высоких скоростей подвижной фазы для осуществления регулярного динамического режима сорбции с выходом высококонцентрированного и очищенного целевого продукта.

6. Результаты работы показывают, что использованные модельные сорбционные системы достаточно адекватны природным системам и могут использоваться при исследовании других биологических объектов.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Изучение равновесия, кинетики и динамики сорбции антибактериального антибиотика эремомицина на полимерных хроматографи-ческих носителях различной структурной организации. //Материалы межвузовской научной конференции «XXIX неделя науки СП6ТТУ». Санкт-Петербург, 2000. С. 106-108 (соавт. Коликов В.М.).

2. Особенности структурной организации полимерных сеток на основе ионогенного мономера и дивинильного сшивающего агента. //Материалы 10-ой международной конференции студентов и аспирантов «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений». Вторые Кирпичниковские чтения. Казань, 2001. С. 99 (соавт. Тощевикова А.Ю.).

3. Экспериментальное исследование условий оптимизации получения нового антибактериального антибиотика эремомицина. //Материалы второго конгресса молодых ученых «Научная молодежь на пороге XXI века». - Томск, 2001. С. 57-58.

4. Process Innovations in Antibiotic Chromatography. //Materials of the 25th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques. Amsterdam, Holland. 2001. P. 22 (соавт. Писарев OA, Тощевикова А.Ю., Коликов В.М.).

5. Исследование ключевых параметров равновесия сорбции антибактериального антибиотика эремомицина на карбоксильных катиони-тах. //Материалы научно-практической конференции и школы-семинара «Формирование технической политики инновационных наукоемких технологий», Санкт-Петербург, 2001. С. 155-159. (соавт. Коликов В.М., Писарев О.А.).

6. Особенности сорбции эремомицина карбоксильными катиони-тами. //ЖПХ, 2002. Т.75, № 4. С. 549-553 (соавт. Коликов В.М., Писарев О.А.).

7. Mass Transfer Effects in Preparative Chromatography of Antibacterial Antibiotic Eremomycin on Polymeric Sorbents. // J.Chromatogr.A. 2003. V. 1006 N1-2. P. 251-260 (соавт. Коликов В.М., Писарев О.А.).

8. Sorption Equilibrium and Kinetics Parameters of Eremomycin on Different Structure Carboxylic Resins. //26th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques «HPLC 2002». Montreal, 2002. (соавт. Коликов В.М., Писарев О.А.).

9. The New Approach to Constructing of the Grain Network Polymers With Ionogenic Groups on Surface Layer.// 4th International Symposium «Molecular Order and Mobility in Polymer Systems». St.Petersburg, 2002. P. 232 (соавт. Ежова Н.М., Гаркушина И.С., Тощевикова А.Ю., Писарев О.А.).

10. Study of Interactions of Antibacterial Antibiotic Eremomycin With Polymeric Crosslinked Sorbents. // "100 Years of Chpomatography", 3rd International Symposium on Separation in Biosciences. (SBS 2003). Moskow. P. 515 (соавт. Коликов В.М., Писарев О.А.).

11. Автоколебательные процессы сорбции антибиотиков на полимерных карбоксильных катионитах // Структура и динамика молекулярных систем. Сб. статей, г. Яльчик. 2002. С. 172-175 (соавт. Тощевикова А.Ю., Писарев О.А., Ежова Н.М.).

12. Динамика взаимодействия антибактериального антибиотика эремомицина с карбоксильным катионитом БДМ-12. //10 Всероссийская конференция «Структура и динамика молекулярных систем», г. Яльчик. 2003. С. 236 (соавт. Тощевикова А.Ю., Писарев О.А.).

13. Динамика взаимодействия антибактериального антибиотика эремомицина с карбоксильным катионитом БДМ-12. // Структура и динамика молекулярных систем. Сб. статей, г. Яльчик. 2003. Т.2. с. 173175 (соавт. Тощевикова А.Ю., Писарев О.А.).

14. Условия избирательного взаимодействия органического цвит-териона эремомицина с карбоксильными катеонитами группы БДМ. // VII Всероссийская конференция по проблемам науки и высшей школы «Фундаментальные исследования в технических университетах». Санкт-Петербург 2003. С. 284.

На правах рукописи

ПОЛЯКОВА Ирина Валериевна

ЗАКОНОМЕРНОСТИ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В СИСТЕМЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЙ АНТИБИОТИК ЭРЕМОМИЦИН — ПОЛИМЕРНЫЕ СОРБЕНТЫ

03.00.02 — биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 16.03.2004. Объем в п.л. 1,5. Тираж 100. Заказ 226.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства СПбТПУ 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29.

Отпечатано на ризографе RN-2000 ЕР. Поставщик оборудования — фирма "Р-ПРИНТ". Телефон: (812) 110-65-09. Факс:(812)315-23-04.

P11313

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Полякова, Ирина Валериевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Структура и свойства полимерных сорбентов для хроматографии биологически активных веществ.

1.1.1. Сорбенты на основе неорганических материалов.

1.1.2. Сорбенты на основе органических материалов.

1.1.2.1. Методы полимеризации, используемые для получения

Ь органических носителей.

1.1.2.2. Сорбенты, синтезированные на основе полисахаридов.

1.1.2.3. Полиакриламидные сорбенты.

1.1.2.4. Сорбенты на основе поливинила.

1.1.2.5. Сорбенты, синтезированные на основе акрилатов и метакрилатов.

1.1.2.6. Сорбенты для перфузионной хроматографии.

1.1.2.7. Мембраны.

1.1.2.8. Монолитные сорбенты.

1.2. Равновесие и кинетика сорбционных процессов.

1.2.1. Равновесие ионообменной сорбции.

1.2.1.1. Пористость, проницаемость и набухание.

1.2.1.2. Избирательность межмолекулярных взаимодействий органических ионов с полимерными сорбентами, изотермы сорбции.

1.2.2. Кинетика сорбции.

1.2.2.1. Диффузионный поток и движущие силы диффузии.

1.2.2.2. Лимитирующие стадии сорбционных процессов.

1.2.2.3. Модель пленки Нернста-Планка.

1.2.2.4. Диффузия внутри зерна ионита (гелевая кинетика).

1.3. Основы препаративного хроматографического разделения многокомонентных смесей.

1.3.1. Динамика сорбции как гетерогенный процесс.

1.3.2. Классификация методов динамики сорбции и хроматографии.

1.3.3. Препаративная хроматография биомолекул.

1.3.3.1. Фронтальный метод сорбции, используемый в препаративной хроматографии биологически активных веществ.

1.3.3.2. Образование резких границ хроматографических зон.

1.3.4. Приемы, используемые в масштабировании колоночной жидкостной препаративной хроматографии.

1.3.4.1. Увеличение объема загружаемого материала.

1.3.4.2. Повторные циклы.

1.3.4.3. Увеличение нагрузки на колонку и многократная подача.

1.3.4.4. Увеличение диаметра колонки.

1.3.4.5. Увеличение размера колонки по константе отношения высоты к диаметру.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Структура и свойства антибактериального антибиотика эремомицина.

2.1.2. Полимерные сорбенты, используемые в работе.

2.1.3. Определение равновесной концентрации эремомицина.

2.1.4. Исследование кислотно-основных свойств сорбентов.

2.1.5. Исследование зависимости равновесных параметров сорбции от рН.

2.1.6. Исследование влияния начальной концентрации антибиотика, ионной силы и диэлектрической постоянной внешнего раствора на равновесные параметры взаимодействия эремомицина с карбоксильными катионитами.

2.1.7. Равновесные десорбционные опыты.

2.1.8. Определение коэффициента распределения эремомицина между подвижной и неподвижной фазами хроматографического носителя.

2.1.9. Методика проведения экспериментов по кинетике взаимодействия эремомицина с полимерными сорбентами.

2.1.10. Математические модели, использованные для обработки и интерпретации экспериментальных данных по кинетике взаимодействия эремомицина с карбоксильными катионитами.

2.1.11. Методики проведения экспериментов по динамике взаимодействия эремомицина с полимерными сорбентами.

2.1.12. Методика проведения ВЭЖХ-анализа эремомицина.

2.1.13. Масштабирование препаративного хроматографического процесса выделения эремомицина из нативного раствора.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3. РАВНОВЕСИЕ И КИНЕТИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЭРЕМОМИЦИНА С ПОЛИМЕРНЫМИ СОРБЕНТАМИ РАЗЛИЧНОЙ СТРУКТУРЫ.

3.1. Исследование факторов, влияющих на кислотные свойства карбоксильных катеонитов.

3.1.1. Влияние степени пересеченности полимерных сорбентов на кислотность карбоксильных катионитов.

3.2. Исследование равновесных параметров взаимодействия эремомицина с полимерными сорбентами различной структуры.

3.2.1. Влияние степени ионизации катионитов на сорбцию эремомицина.

3.2.2. Влияние начальной концентрации эремомицина, ионной силы и диэлектрической постоянной внешнего раствора на равновесные параметры взаимодействия эремомицина с карбоксильными катионитами.

3.2.3. Изучение изотерм сорбции эремомицина на сорбентах с различной структурой.

3.3. Исследование кинетических параметров взаимодействия эремомицина с полимерными сорбентами различной структуры.

3.3.1. Влияние размера частиц на кинетические параметры взаимодействия эремомицина с карбоксильными катионитами группы БДМ и выбор математической модели для интерпретации экспериментальных данных.

3.3.2. Определение размера сорбционного слоя катионитов группы БДМ для эремомицина. Исследование неравномерного характера распределения антибиотика на данных сорбентах при различных физико-химических условиях.

4. ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЭРЕМОМИЦИНА

С КАРБОКСИЛЬНЫМ КАТИОНИТОМ БД М-12.

4.1. Выбор элюента для осуществления фронтальной десорбции эремомицина с карбоксильного катионита БДМ-12.

4.2. Исследование влияния скорости десорбции на режим десорбции.

4.3. Исследование влияния высоты хроматографической колонки на протекание динамического сорбционного процесса.

4.4. Исследование влияния скорости подачи раствора эремомицина на колонку на динамику взаимодействия антибиотика с катионита БДМ-12.

4.5. Влияние ионной силы на динамику десорбции эремомицина на катеоните БДМ-12.

4.6. Масштабирование процесса хроматографического выделения эремомицина.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Закономерности межмолекулярного взаимодействия в системе антибактериальный антибиотик эремомицин - полимерные сорбенты"

Совершенствование лечебно-диагностических процессов является наиболее актуальной задачей в области медицинских наук. Решение данной задачи связано с использованием высокоэффективных лекарственных средств, к числу которых относятся антибиотики нового поколения. В настоящее время они являются важнейшими противоопухолевыми и антибактериальными средствами, широко используемыми в практической медицине.

Антибактериальный антибиотик эремомицин - новый представитель группы полициклических гликопептидов, для которой характерна высокая бактерицидная активность в отношении грамположительных бактерий, а также медленная адаптация к ним микроорганизмов. Являясь структурным аналогом известного антибактериального антибиотика ванкомицина, эремомицин по химиотерапевтическим свойствам превосходит его в 2-10 раз, и, одновременно, менее токсичен.

Связывание эремомицина с бактериальной клеткой представляют собой сложный спектр физико-химических сорбционных взаимодействий цвиттериона антибиотика с клеточной стенкой бактерии. Аминосахара инициируют первичное связывание и участвуют в формировании гидрофобного кармана, ингибирующего рост бактериальной клетки. Кроме того, углеводы значительно улучшают растворимость эремомицина в воде. Атом хлора в N-концевой части гептапептида стабилизирует этот участок и способствует прочности комплекса антибиотик -фрагмент D-Ala-D-Ala пептидогликана микробной клеточной стенки. Исследование химиотерапевтической эффективности эремомицина показало значительное снижение антимикробной активности продуктов деградации антибиотика по сравнению с его нативной структурой.

Так как в настоящее время в основе технологии получения эремомицина лежит биосинтез с последующей многостадийной экстракционной очисткой с использованием органических растворителей, то часто наблюдается разрушение нативной структуры лекарственной субстанции, что приводит к ухудшению фармакологических свойств эремомицина.

Поэтому создание щадящей технологии получения и очистки эремомицина, максимально сохраняющего свою нативную структуру и, следовательно, обладающего высокой химиотерапевтической эффективностью, является актуальной задачей. Данная задача связана с систематическим изучением закономерностей физико-химического поведения органического цвиттериона эремомицина в модельных сорбционных системах, а также с экспериментальным выбором характеристик последних по принципу их подобия природным сорбционным системам - клеточным стенкам бактерий.

Целью работы являлось изучение закономерностей равновесия, кинетики и динамики межмолекулярных взаимодействий в модельных сорбционных системах с участием антибактериального антибиотика эремомицина и полимерных сорбентов и разработка на этой основе физико-химических условий осуществления эффективного хроматографического метода получения антибиотика с высокой нативной антибактериальной активностью.

Для реализации указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследование закономерностей межмолекулярного взаимодействия в системе антибактериальный антибиотик эремомицин - полимерные сорбенты различного типа и структуры на основе представлений о физико-химических взаимодействиях антибиотика с пептидогликаном бактериальной клетки.

2. Изучение равновесных и кинетических параметров сорбции эремомицина с полимерными сорбентами в условиях, при которых реализуется полифункциональные взаимодействия, обеспечиваемые нативной структурой антибиотика. Исследование физико-химических условий специфического равновесного межфазного переноса эремомицина в растворе биополимеров и его зависимости от кинетического фактора.

3. Исследование динамики межмолекулярного взаимодействия эремомицина с карбоксильными катионитами. Определение оптимальных физико-химических условий образования резких границ концентрационного профиля антибиотика.

4. Разработка физико-химических условий одноактного высокоселективного препаративного динамического процесса выделения эремомицина, при котором сохраняется его нативная структура. Расчет параметров масштабирования.

Данная диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Глава I представляет собой литературный обзор, в котором на основании проведенных научных исследований как отечественных, так и зарубежных ученых дано краткое описание физико-химических свойств сорбентов, используемых в хроматографии БАВ и способов их получения, а также области применения этих сорбентов. Кроме того, в данной главе описаны виды хроматографических сорбционных методов, а также ключевые равновесные, кинетические и динамические параметры межмолекулярных взаимодействий в сорбционных системах, включающих БАВ. В главе II представлена экспериментальная часть, в которой описаны материалы и методы, использованные при проведении данной диссертационной работы. Раздел диссертации "Результаты и обсуждение" состоит из двух глав. Эти главы (III и IV) включают в себя результаты, полученные при исследовании равновесно -кинетических и динамических параметров взаимодействия эремомицина с полимерными сорбентами различной молекулярной структуры, а также их обсуждение. Выводы являются изложением основных полученных результатов, представляющих интерес в области исследования межмолекулярных взаимодействий в сложных сорбционных системах. Список литературы отражает научные источники, к которым обращался автор данной диссертационной работы в ходе исследований и анализа полученных экспериментальных данных.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Полякова, Ирина Валериевна

6. Результаты работы показывают, что использованные модельные сорбционные системы достаточно адекватны природным системам и могут использоваться при исследовании других биологических объектов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Полякова, Ирина Валериевна, Санкт-Петербург

1. Хиггннс И., Бест Д., Джонс Дж. // Биотехнология. М.: Мир. 1988. 298 с.

2. Бердникова Т.Ф., Ломакина Н.Н., Олсуфьева Е.Н. и др. Структура и антимикробная активность продуктов частичной деградации антибиотика эремомицина. // Антибиотики и химиотерапия. 1991. Т.36. № 6. С.28-31.

3. Braznikova M.G. Eremomycin: a new polyciclic glycopeptide antibiotic. // Chem. and Biotech.of Biological. Active Natural Products. 4th Int. Conf., Budapest. 1987. P. 169 -186.

4. Гаузе Г.Ф., Бражникова М.Г., Лайко A.B. Структура и физико-химические свойства антибактериального антибиотика эремомицина. // Антибиотики и мед. биотехнология. 1987. Т.32. № 8. С.571-576.

5. Г.В.Самсонов, А.Т.Меленевский. Сорбционные и хроматографические методы физико-химической биотехнологии. // Л.:Наука. 1986. 230 с.

6. Самсонов Г.В., Тростянская Е.Б., Елькин Г.Э. Ионный обмен. Сорбция органических веществ. // Л.: «Наука». 1969. 336 с.

7. Leonard М. New packing materials for protein chromatography. // J.Chromatogr. B. 1997. V.699. № 1. P.3-27.

8. Buchmeiser M. New synthetic ways for the preparation of high-performance liquid chromatography supports. // J. Chromatogr. A. 2001. V.918. № 2. P. 233-266.

9. Afeyan N.B., Fulton S.P., Gordon N.F. and al. Perfusion chromatography: an approach to purifying biomolecules. // J. Chromatogr. A. 1990. V.8. № 2. P.203-206.

10. Petro M., Berek D., Gemeiner P. Dextran-grafted silica gel for high-performance size-exlusion chromtography of proteins. // J. Chromatogr. A. 1994. V.665. № 1. P.37- 45.

11. Novae L, Berek D. Structural inhomogeneities in wide pore silica gels. // J. Chromatogr. A. 1994. V.665. № 1. P. 33-36.

12. Dunlap C.J., Carr P.W., McCormic A.V. // Chromatographic 1996. V.42. № 2. P.273.

13. Sun L., Annen M.J., Lorenazano-Porras F., Carr P.W. Synthesis of porous zirconia » spheras for HPLC by polymerization induced colloid aggregation (PICA). // J.Colloid.1.terface Sci. 1994. V.163. № 2. P.464-473.

14. Candau F., Leong Y.S., Pouyet G., Dawans F. Microlatex in a continuous oil phase and its use. // Ger. Offen. DE. 1983 (3,312, 711) 21 p.

15. Гельферих Ф. //Иониты. M.: Изд-во иностр.лит. 1962.490 с.

16. Kitchener J.A. // Ion exchange resins. L. - N.Y. 1957. 109 p.

17. Ласкорин Б.Н., Ионишани П.Г., Никульская Г.Н. и др. Синтез новых ионитов. //В кн. Ионообменные сорбенты в промышленности. М. 1971. С.21-31.

18. Ваншейдт АА., Динабург В.А., Генендер К.М. и др. Способ получения монофункциональных ионообменных смол. // Авт.свид. СССР № 168427. Бюл. изобр. 1965. №4. С.59.

19. Динабург В.А., Самсонов Г.В., Генендер К.М., Пасечник В.А. и др. Синтез и изучение свойств макросетчатых ионообменных смол с N, N'-алкилендиметакриламидами в качестве сшивающих агентов. // ЖПХ. 1968. Т.41. №4. С.891-897.

20. Millar J.R., Smith D.G., Kressman T.R. Solvent-modified polymer networks. Styrene-divinylbenzene copolymers made in presence of non-solvating diluents. // J.Chem.Soc. 1965 (Jan.). P.304-310.

21. Шатаева Л.К., Кузнецова H.H., Елькин Г.Э. Карбоксильные катиониты в биологии. // Л.: Наука. 1979. 288 с.

22. Gustavsson Р.Е., Larsson P.O. Superporous agarose, a new material for chromatography. // J. Chromatogr. A.1996. V.734. № 2. P.231-240.

23. Hjerten S., Mohammad J., Nakazato K. Improvment in flow properties and pH stabillity of compressed continuous polymer beads for high-performance liquid chromatography. //J.Chromatogr. A. 1993. V.646. № 2. P.121-128.

24. Liao J.L., Zhang R. Simple approach to eliminating caused by the presence of salts. // J.Chromatogr. A. 1994. V.684. № l. P. 143-148.

25. Seubert A., Klingenberg A. Sulfoacylated macroporous polystyrene-divinylbenzene: a new type of cation exchanger for the analysis of multivalent metal cations. // J.Chromatogr. A 1997. V.782. № 2. P.149-157.

26. Murakami R., Hachisako H.,Yamada K., Motozato Y. Gel permeation chromatographic properties of poly(vinyl alcohol) gel particles prepared by freezing and thrawing. // J. Chromatogr. A. 1994. V.678. № 2. P.180 -182.

27. Arshady R., Basata M., Corain B. Et al. Preparation of isociano polymer supports and their complexes with catalytically relevant transition metal centers. // J. Mol. Catal. 1989. V. 53. №1. Ill -128.

28. Kalghatgi K., Horvath C. Rapid peptide mapping by high-performance liquid chromatography. //J.Chromatogr. A 1988. V.443. № 2. P.343-354.

29. Lloyd L.L.,Warner F.P. Preparative high-performance liquid chromatography on an unique high-speed macroporous resin. // J. Chromatogr. 1990. V.512. № 2. P.365-376.

30. Torre M-, Cohen M.E., Corzo N. and al. Perfusion liquid chromatography of whey proteins. // J. Chromatogr. A. 1996. V.729. № 1. P.99-111.

31. Regnier F.I., Chicz R.M. Ion-exchange chromatography. // Chromatogr. Sci. 1990. V.51. №.1. P. 77-92.

32. Buchmeister M.R., Sinner F. //Austrian Pat.Appl. A960/99 (310599).

33. Calmon C., Kressman T.R.E. Ion exchangers in organic and biochemistry. // N.Y. 1957. 76lp.

34. Самсонов Г.В. Сорбция и хроматография антибиотиков. // M.-JL: АН СССР. 1960. 176 с.

35. Тагер А.А. Растворы высокомолекулярных соединений. // M.-JL: Госхимиздат. 1951.208 с.

36. Либинсон Г.С. Физико-химические свойства карбоксильных катионитов. // АН СССР. М.: Наука. 1969. 112 с.

37. Либинсон Г.С., Савицкая Е.М., Брунс Б.П. // Высокомол. Соед. 1960. №2. С.1500.

38. Самсонов Г.В., Веденеева В.В. Обмен анионов пенициллина с другими анионами в неводных растворах. // Труды ЛХФИ. 1962. №15. С.81-93.

39. Ваггег R.V., Falconer D. Ion-exchange in felspathoids as a solid state reaction. // Proc.Roy.Soc. 1956. V. 236A. P.227-249.

40. Gregor H.P., Belle J., Marcus R.A. Studies on ion-exchange resins. Selectivity coefficients on quaternary base anion exchange resins toward univalent anions. // J.Amer.Chem.Soc. 1955. V.77. P.2713-2719.

41. Bean R.S., Shepherd W.C., Kay R.E. and al. Spectral changes a cationic dye due to interaction with macromolecules. III. Stoichiometry and mechanism of complexing reaction. // J.Phys.Chem. 1965. V.69. P.4365-4379.

42. Kokotob Ю.А., Золотарев П.П., Елькин Г.Э. Теоретические основы ионного обмена. //Л.: Химия. 1986. 281 с.

43. Helfferich F. Ion-exchange kinetics. Experimental test of the theory of particle -diffusion-controlled ion exchange. // J.Phys. Chem. 1962. V.66. P. 39-44.

44. Helfferich F., Plesset M.S. Ion-exchange kinetics non-linear diffusion problem. // J.ChemJPhys. 1958. V. 28. P.418-424.

45. Кричевский И.Р. Понятия и основы термодинамики. // М.: Химия. 1970. 439 с.

46. Helfferich F.G., Models and physical realities in ion-exchange kinetics. // Reactive polymers. 1990. №. 13. P.191-194.

47. Храмцов Ю.И., Николаев Н.И. О диффузии в ионите при изменении объема. Теория и практика сорбционных процессов. // Воронеж. 1975. Вып.10. С.5-9.

48. Кузьминых В.А., Шамрицкая И.П., Мелешко В.П. Кинетика ионообмена на карбоксильных катионитах из растворов высокой концентрации при изменении объема ионита. // Теория и практика сорбционных процессов. Воронеж. 1975. Вып. 10. С. 10-14.

49. Николаев Н.И., Эфендиев А.А., Шахтахтинская А.Т. Кинетика сорбции ионов меди комплексообразующими карбоксильными ионообменниками. //ДАН СССР. 1977. Т.236. №2. С.398-401.

50. Lu Ya., Bulow М. Analysis of Diffusion in Hollow Geometries. // Adsorption. 2000. № 6. P. 125 136.

51. Pereira C.J., Hegedus L. Extrudat und Katalysator mit einer hohen geometritischen Oberflache. // EP 0, 141. 997 Al, EP 0,141, 998 Al, W.R. Grace & Co. 1985.

52. Seki Y., Ose S., Kodama H. Manufacture of Microporous Ceramic Articles. II Jpn. Kokai Tokkio JP 01, 172,238. Agency of Industrial Sciences and Technology. 1989.

53. Horwath C.G., Preiss B.A., Lipsky S.R Fast liquid chromatoraphy: an investigation of operating parameters and separation on nucleotides on pellicular ionexchangers. // Analit.Chem. 1967. V. 39. P. 1422-1428.

54. Kirkland I.I. High-speed liquid chromatography with controlled-surface-porosity support. //J.Chromatogr.Sci. 1969. V. 7. P.361-372.

55. Horvath C.G. Pellicular ion exchange resins in chromatography. // In: Ion exchange and solvent extraction. New York. 1973. V. 5. P.207-261.

56. Самсонов Г.В., Елькин Г.Э., Воробьева В.Я. Смешанная кинетика сорбции окситетрациклина сульфокатионитами с непроницаемым ядром. // ЖФХ. 1973. Т.47. №6. С. 1542-1544.

57. Елькин Г.Э., Самсонов Г.В. Кинетика и динамика сорбции ионитами с поверхностным сорбирующим слоем. Иониты и ионный обмен. // Ленинград. 1975. С.102-107.

58. Белая С.Ф., Огороднова И.М., Коломейцев О.П. и др. Кинетика десорбции лизина из ионитов с поверхностным сорбирующим слоем. // ЖПХ. 1978. Т.51. №5. С.1006-1010.

59. Кокотов Ю.А., Пасечник В.А. Равновесие и кинетика ионного обмена. // Л.: Химия. 1970. 336 с.

60. Туницкий Н.Н. Диффузия и случайные процессы. // Новосибирск. 1970. 116 с.

61. Рачинский B.B. Введение в общую теорию динамики сорбции и хроматографии. //АН СССР. М.: Наука. 1964.135 с.

62. Адам Н.К. Физика и химия поверхностей. // M.-J1.: Гостехиздат. 1947. 332 с.

63. Брунауэр С. Адсорбция газов и паров. // М.: ИЛ. 1948. 244 с.

64. Райди Э.К. Химия поверхностных явлений. // Л.: ОНТИ. 1936. 157 с.

65. Салдадзе К.М., Пашков А.Б., Титов B.C. Ионообменные высокомолеклярные соединения. // М.: Госхимиздат. 1960. 356 с.

66. Colowik S.P., Kaplan N.O. Methods in Enzymology. // N.Y. Academic Press. 1955. V. 1.987 p.

67. Sivaram P., Deutscher M.P. Free fatty acids associated with the high molecular weight aminoacyl tRNa synthetase complex influence. Its structure and function. // J.Biol. Chem. 1990. V. 265. P.5774-5779.

68. Blanche C., Collins P. A chromatography system for use in development and scale-up of pharmaceutical biomolecules. // Am. Lab. 1988. №20. P.126-135.

69. Jungbauer A. Preparative chromatography of biomolecules. // J. Chromatogr. A. 1993. V. 693. №1. P.3-16.

70. Обзор чехословацких материалов для химии. //Под редакцией О. Микеша. Прага:ЛАХЕМА. 1989. 22 с.

71. Бреслер С.Е., Егоров А.И. Хроматография, ее теория и применение. // АН СССР. М. 1960.

72. Samsonov G.V., Pisarev О.A. High Capacity Reversible Sorption and Effective Chromatographic Preparative Bioseparation at Low Pressure. // Isolation & Purification. 1996. № 2. P.93-102.

73. Samsonov G.V. Ion Exchange Sorption and Preparative Chromatography of Biologically Active Molecules. // Plenum Press Co. N.Y. London. 1986.

74. Писарев O.A., Кручина-Богданов И.В., Глазова H.B., Быченкова О.В. Кинетическое регулирование селективности сорбции в жидкостной хроматографии низкого давления. //ДАН. 1998. V. 362. № 3. С.365-367.

75. Fulton S., Gordon N.F., Afean N.D. Large-scale processing and high throughput perfusion chromatography. // Biotechnology. 1992. V.10. P.635-639.

76. Johansson B.L., Ahnsberg. Column lifetime of Superose-6 at 37°C and basic pH. // J.Chromatogr. A. 1986. V. 351. № 2. P.136-139.

77. Snyder L.R., Cox G.B. Preparative and process-scale HPLC. A quantitative picture for isocratic separations. // LC and GC. 1988. V. 6. P.894-909.

78. Ghodbane S., Gulochon G. Optimization of concentration overload in preparative liquid chromatography. //J.Chromatogr. A.1988. V. 444. № 2. P.275-291.

79. Dolan J.W. Mobile phase proportioning problems: a case study. // LC and GC. 1988. V. 7. P. 18-24.

80. Cox G.B., Antele P.E., Snyder L.R. Preparative separation of peptide and protein samples by high-performance liquid chromatography with gradient elution. Experimenyal examples compared with theory. // J.Chromatogr. A. 1988. V.444. № 2. P.325-344.

81. Golay M.J.E. Frit profiles for packed chromatographic column terminations. // J.Chromatogr. A. 1982. V.240. № 2. P.l80-183.

82. Schmuck M.N., Gooding K.N., Gooding D.L. Analysys of proteins with new, mildly hydrophobic high-performance liquid chromatography packing materials. // J. Liq. Chromatogr. A. 1984. V.296. № 1. P.107-114.

83. Гаузе Г.Ф., Бражникова М.Г., Ломакина H.H. и др. Модификация эремомицина по аминным группам. // Антибиотики и химиотер. 1989. Т.34. № 5. С.348 -352.

84. Кобрин М.Б., Федорова Г.Б., Катруха Г.С. Исследование процесса дегликозилирования некоторых антибиотиков ванкомициновой группы. // Антибиотики и химиотер. 1988. Т.ЗЗ. № 5. С. 331 -335.

85. Harris С.М., Cannan R., Kopeska H. et al. The role of the chlorine substituents in the antibiotic vancomycin; preparation and characterization of mono- and didechlorovancomycin. // J.Am. Chem. Soc. 1985. V.107. № 23. P. 6652 6658.

86. Лурье А.А. Сорбенты и хроматографические носители. // М.: Химия. 1972. 320 с.

87. Davankov V.A., Tsurupa М.Р. Structure and properties of porous hypercrosslinked polystyrene sorbents "Styrosorb". // Pure and Appl.Chem. 1989. V.61. № 10. P. 1881 -1888.

88. Gregor H.P., Luttinger L.B., Loeble E.M. Titration of polyacrylic acid with quaternary ammonium basis. // J.Amer.Chem.Soc. 1954. V. 76. P. 5879 5880.

89. Либинсон Г.С. Сорбция органических соединений ионитами. // М.: Медицина. 1979. 182 с.

90. Самоснов Г.В., Писарев О.А., Муравьева Т.Д. и др. Новый подход к препаративной хроматографии низкого давления и суперочистка антибиотиков антрациклиновой группы. // Доклады АН СССР. 1991. Т.319. № 12. С.408 412.

91. Альтшулер Г.Н. Исследование в области термодинамики обмена органических ионов на синтетических ионитах. // Автореф. докт. Дисс. Томск. 1974. 26 с.

92. Полякова И.В., Коликов В.М., Писарев О. А. Особенности сорбции эремомицина карбоксильными катеонитами. //ЖПХ. 2002. Т.75, № 4, с. 549-553.

93. Писарев О.А., Добродумов А.В., Денисов В.М. и др. Вторичная пористость и состояние воды в гетеросетчатых карбоксильных полиэлектролитах. // Высокомолекуляр. соединения. 1987. Т.29Б. №1. С.4 8.

94. Писарев О.А., Самсонов Г.В., Богданова Л.П. Ионно-гидрофобное взаимодействие эремомицина с сетчатыми структурно сегрегированными биосорбентами. //ЖПХ. 1993. Т.66. №12. С.2825 -2828.

95. Богданов А.П., Каверзнева Е.Д., Рассулин Ю.А. и др. Синтез и некоторые свойства катеонита КБ-51-2, пригодного для выделения и очистки протеаз. // АН СССР. Сер.хим. 1969. № 2. С.469 -473.

96. Polyakova I.V., Kolikov V.M., Pisarev О.А. Mass Transfer Effects in Preparative Chromatography of Antibacterial Antibiotic Eremomycin on Polymeric Sorbents. // J.Chrom.A. 2003. V. 1006. № 2. P.251-260.

97. Gregor H.P., Hamilton M.J., Becker J. at al. Ion-exchange resins titration capacity and swelling of methacrylic acid resins. // J.Phys.Chem. 1955. V.59. 874-881.

98. Gregor H.P., Hamilton M.J., Oza R.J., Berstein F. Ion-exchange resins. Selectivity coefficients of methacrylic acid resins toward alcalimetal cations. // J. Phys. Chem. 1956. V. 60. P. 263-267.

99. Табидзе 3.C., Яхонтова Л.Ф., Брунс Б.П. и др. //Пласт, массы. 1963. №3. С.ЗЗ.

100. Gregor Н.Р. Gibbs-Donnan equilibria in ion-exchange resin systems. // J.Amer.Chem.Soc. 1951. V. 73. P. 642-650.

101. Гурьянова E.H., Гольдштейн И.П., Ромм И.П. // Донорно-акцепторная связь. М.: 1973.

102. Кранов К.С., Воробьева Н.К., Годнее И.Н. и др. // Физическая химия. Строение вещества. Термодинамика. М.: Высшая школа. 2001. 512 с.

103. Писарев О. А., Муравьева Т.О., Самсонов Г.В. Энергетическая неравноценность ионогенных групп сшитых гетерогенных полиэлектролитов. // Высокомолек. соед. 1986. Т. 28 Б. № 4. с 262 264

104. Самсонов Г.В., Писарев О.А. Новые принципы препаративной ионообменной хроматографии и их применение для выделения, очистки и суперочистки антибиотиков. // Прикл.биохимия и микробиол. 1992. Т.28. № 1. С.5-7.

105. D. J.Greenland, RH.Laby, J.P.Quirk. Adsorption of amino acids and peptides by montmorillonite and illite cation exchange and proton transfer. // Trans. Faraday Soc. 1965. V.61. P.2013-2023.

106. M. Seno, T. Yamabe. Ion-exchange behavior of some neutral amino acids. //Chem. Soc. Japan, 1960. V.33. P. 1532-1536.

107. Селезнева А.А., Дубинина Н.И, Лукницкая О.Ф. и др. Особенности сорбции белков карбоксильными катионитами. // Коллоид, журн. 1975. Т.37. №6. С. 1138 -1142.

108. Kirkland I.I. // Modern size-exclusion liquid chromatography. Practice of gel permeation and gel filtration chromatography. N.Y. 1979. 476 c.

109. Яскович Г.А., Кознева Е.П., Елькин Г.Э. и др. Кинетика сорбции дезоксирибонуклеазы Actinomyces Streptomycini из нативного раствора карбоксильным катионитом КМТ. // Хим.-фармацевт.журн. 1974. Т. 8. №10. С.47 -51.

110. Елькин Г.Э., Бабенко Г.Э., Селезнева А.А. и др. Кинетика сорбции белков ионообменными смолами. Сорбция химотрипсиногена карбоксильными катионитами. // Коллоид, журн. 1972. Т. 34. № 2. С. 208 212.

111. Тощевикова А.Ю., Писарев O.A., Полякова И.В. и др. Автоколебательные процессы сорбции антибиотика на полимерных карбоксильных катионитах. // Структура и динамика молекулярных систем. Сб. статей. Яльчик. 2002. С. 172-175.

112. Полякова И.В., Тощевикова А.Ю., Писарев О.А. Динамика взаимодействия антибактериального антибиотика эремомицина с карбоксильным катионитом БДМ-12 // Структура и динамика молекулярных систем. Сб. статей. Яльчик. 2003. С. 236.

113. Елькин Г.Э. Концепция регулярности режима сорбции в теории и практике ионного обмена органических ионов. // Межвузовский сборник: Ионный обмен и инометрия. 1990. Вып.7. С.3-15.