Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности функционирования углеводородокисляющих микроорганизмов при биоремедиации нефтяных загрязнений

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Закономерности функционирования углеводородокисляющих микроорганизмов при биоремедиации нефтяных загрязнений"

Жуков Дмитрий Вячеславович

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ БИОРЕМЕДИАЦИИ НЕФТЯНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ

03 00 23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2007

ооз

003163980

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им М В Ломоносова

Научный руководитель

доктор химических наук, ведущий научный сотрудник, профессор Калюжный Сергей Владимирович

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Нина Борисовна Градова кандидат химических наук Скляр Владимир Ильич

диссертационного совета Д 501 001 59 по химическим наукам при Московском государственном университете им M В Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им M В Ломоносова

Автореферат разослан АСЩ-опа

Ученый секретарь диссертационного совета,

Ведущая организация

Институт микробиологии РАН, Москва

Защита состоится

в 16 часов на заседании

кандидат химических наук

Сакодынская И К

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы Одними из наиболее опасных загрязнителей на Земле являются нефть, нефтепродукты и нефтесодержащие отходы, ежегодное попадание которых в окружающую среду оценивается в сотни миллионов тонн

В настоящее время биологические методы восстановления загрязненных углеводородами природных объектов (микробиологическая и фиторемедиации) справедливо признаны наиболее безопасными для окружающей среды и экономически целесообразными В России и во всем мире предложено много различных микробиологических препаратов-деструкторов углеводородов Одним из самых эффективных является препарат «Родер», состоящий из двух штаммов R ruber Ас-1513-D и R erythropohs Ac-1514-D, который имеется нашей лаборатории Он был создан для ликвидации свежих аварийных разливов нефти и довольно успешно испытывался в различных регионах России и за рубежом для микробиологической очистки водных поверхностей и грунтов от загрязнений углеводородами нефти В настоящее время востребованы биологические методы обезвреживания нефтяных шламов, в том числе отходов НПЗ, железнодорожных шламов, территорий, загрязненных мазутом Интересным представлялось применение препарата «Родер» для биоремедиации такого рода загрязнений

Кроме того, в начале 90-х полностью прекратилось производство сырья (белково витаминный комплекс), которое использовалось для полупромышленного получения препарата «Родер» по ранее разработанному Регламенту (1994 г) Поэтому встал вопрос о поиске новой сырьевой базы и разработке нового регламента для получения препарата «Родер»

И наконец, очень злободневным, является разработка методов, которые позволили бы доказать, что в процессе биоремедиации работают именно микроорганизмы препаратов-деструкторов углеводородов, а не аборигенная микрофлора, активизированная внесением удобрений и применением агротехнических мероприятий Все изложенное являлось предпосылкой для проведения исследований, осуществленных в данной диссертационной работе

Цели и задачи исследования Целью данной работы являлось исследование различных биотехнологических аспектов аэробной деградации углеводородных загрязнений под действием биопрепарата «Родер» и некоторых других микроорганизмов

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

1) оптимизировать условия для наработки биопрепарата «Родер» в промышленных количествах,

2) исследовать биоразлагаемость различных углеводородных загрязнений (мазут, нефтешламы) под действием биопрепарата «Родер»,

3) изучить кинетические закономерности биодеградации ряда алифатических и ароматических углеводородов (УВ) штаммами, входящими в биопрепарат «Родер» (R ruber Ac-1513-D и R erythropolis Ac-1514-D), выявив тем самым трудноразлагаемые для данных штаммов субстраты,

4) провести скрининг микроорганизмов, выделить, идентифицировать и изучить культуру, способную более активно разлагать полиароматические углеводороды (ПАУ), чем штаммы препарата «Родер»,

5) изучить кинетические закономерности биодеградации различных классов углеводородов консорциумом, состоящим из R ruber и R erythropolis и новой культуры,

6) разработь методику для количественного определения штаммов R ruber и R. erythropolis в жидких средах и в почве с помощью твердофазного иммуноферментного анализа

Научная новизна работы В результате выполнения работы была проанализирована эффективность деградации углеводородных загрязнений (мазут, железнодорожный шлам) препаратом «Родер» Были изучены кинетические закономерности биодеградации различных классов углеводородов нефти штаммами, входящими в биопрепарат «Родер» и было вьиснено, что данные штаммы не обладают высокой активностью по отношению к ПАУ Был проведен скрининг микроорганизмов, и была выделена культура, обладающая более высокой активностью к данному классу загрязнителей Методами молекулярной биологии выделенная культура охарактеризована как Pseudomonas aeruginosa Было показано, что данная культура не оказывает отрицательного влияния на рост R ruber и R erythropolis, а при совместном использовании трех культур биоразлагаемость ПАУ возрастает за счет присутствия Р aeruginosa Таким образом, была показана принципиальная возможность использования консорциума трех штаммов при биодеградации загрязнений, содержащих повышенное количество ПАУ Также была разработана методика для количественного определения штаммов R ruber и R erythropolis в жидких средах и в почве с помощью твердофазного иммуноферментного

анализа

Практическая значимость работы В результате проведенных исследований были оптимизированы условия для наработки биопрепарата «Родер» в промышленных количествах Кроме того, была показана возможность усовершенствования запатентованного биопрепарата «Родер» за счет добавления к имеющемуся консорциуму штамма Р aeruginosa, проявляющего повышенную активность по отношению к ПАУ, что позволит в дальнейшем проводить более полную и быструю биодеградацию углеводородных загрязнений Разработанная в работе методика количественного определения штаммов R ruber и R erythropolis в жидких средах и в почве с помощью твердофазного иммуноферментного анализа в дальнейшем позволит исследовать взаимодействия используемых в биопрепарате штаммов друг с другом и с аборигенной микрофлорой, присутствующей в природных объектах, загрязненных нефтью и нефтепродуктами Таким образом, данные, полученные в работе, могут служить основой для будущих исследований биодеградации нефтяных загрязнений в лабораторных, пилотных и полевых условиях

Апробация работы Результаты работы были доложены на следующих конференциях III Московский Международный Конгресс «Биотехнология Состояние и перспективы развития» (10-14 ноября 2003, Москва), IV Московский Международный Конгресс «Биотехнология Состояние и перспективы развития» (12-16 марта 2005, Москва), Международная Конференция «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (14-16 сентября 2005, Саратов), Всероссийский симпозиум с международным участием (памяти акад РАН Е Н Кондратьевой) «Автотрофные микроорганизмы» (21-24 декабря, 2005, Москва)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ Объем и структура работы Диссертация состоит из списка сокращений, введения, литературного обзора, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 129 источников Общий объем работы - 122 страницы, включая 69 рисунков и 20 таблиц

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение и литературный обзор

В настоящее время нефть по-прежнему является одним из наиболее востребованных

источников энергии в мире, и проблема очистки водных и почвенных ресурсов от загрязнения нефтью и нефтепродуктами продолжает оставаться весьма острой Россия в этом плане не является исключением В результате интенсивного транспорта нефти к местам ее потребления, а также в условиях сурового климата, характерного для мест ее добычи и приводящего к быстрому износу и порывам нефтепроводов и емкостей для хранения, аварии и масштабные разливы нефти стали уже привычным явлением В результате таких аварий на почву и болота ежегодно выливается от нескольких десятков до сотен тысяч тонн нефти Миллионы тонн нефти ежегодно попадают в моря и океаны

Повышенные концентрации нефти и нефтепродуктов в почве и воде нарушают дыхательную активность почвы и микробное самоочищение почвенных и водных ресурсов Изменяя соотношения между отдельными группами почвенных микроорганизмов, крупные нефтяные загрязнения меняют направление почвенного метаболизма, подавляют процессы дыхания, азотфиксации, нитрификации, биодеградации целлюлозы, приводят к накоплению трудно-окисляемых продуктов

Для очистки загрязненных природных поверхностей используются различные технологии, в том числе с применением специализированной техники, которые подразделяют на техническую и биологическую рекультивации Техническая рекультивация применяется немедленно после аварийного разлива нефти для максимального снижение риска распространения загрязнения за пределы первичного очага

При концентрации загрязняющего вещества ниже 20%, наиболее перспективным является биологический способ очистки, а именно, метод биоремедиации, основывающийся на использовании свойств ряда микроорганизмов окислять нефтяные углеводороды в процессе своей жизнедеятельности Под действием уникальных ферментных систем, которыми обладают такие микроорганизмы, углерод из нефти переходит в углекислый газ и воду, гумус почвы, а также используется клетками бактерий в качестве источника энергии и строительного материала Из литературных данных известно, что наиболее легко потребляются углеводороды алифатического ряда, другие углеводороды, в том числе полиароматические, несколько хуже подвержены биодеградации, при этом ПАУ являются наиболее опасными, благодаря их повышенному канцерогенному и мутагенному влиянию на живые организмы Поэтому поиск микроорганизмов-активных деструкторов различных трудноразлогаемых углеводородов является важной задачей, интересующей исследователей всего мира

Объекты исследования

Исследования проводились с препаратом-нефтедеструктором «Родер» и индивидуальными штаммами, из которых состоит этот препарат (Rhodococcus ruber Ас-1513 D и Rhodococcus erythropolis Ac-1514 D), выделенных в начале 90-х годов XX века, из сырой нефти и песка, загрязненного нефтью, соответственно

Кроме того, использовались накопительные культуры, выделенные из различных образцов почвы, загрязненных нефтью и хранимые в музее нашей лаборатории на скошенном мясопептонном агаре

В качестве субстратов в работе использовались

- смесь нормальных жидких парафинов, содержащая (об %) СпНи -7,5, СнНзо -24,0, С,5Н32-30,6, С16Н34-24,2, С,7Н36-11,2, примеси - 2,5,

- дизельное топливо,

-гексадекан,

- ПАУ нафталин, антрацен, фенантрен, пирен (использовались в различной концентрации в зависимости от проводимых экспериментов)

Результаты исследования и их обсуждение

Оптимизация состава питательных компонентов для культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов препарата «Родер»

Проанализировав используемые на данный момент среды для культивирования бактерий, в качестве оптимизируемой среды была выбрана среда Самойленко, которая создавалась для выращивания бактерий рода Rhodococcus В состав этой среды входят пептон (10 г/л), дрожжевой автолизат (50 мл/л), глюкоза (10 г/л), гидрофосфат натрия (4 г/л) и дигидрофосфат калия (1г/л) Было решено оптимизировать только питательные субстраты, входящие в состав среды, так как используемые фосфаты необходимы лишь для создания требуемой буферной емкости (их потребление на рост биомассы -незначительно) Для оптимизации были проведены полные факторные эксперименты (ПФЭ) для обоих штаммов препарата «Родер», в ходе которых варьировались концентрации пептона, автолизата и глюкозы Используемые концентрации представлены в таблице 1, а целевыми параметрами были общее накопление биомассы и концентрация УВО

В результате проведенных экспериментов с использованием ПФЭ3 было установлено, что наибольшее количество накопленной биомассы как для одного, так и для другого штамма наблюдается в том случае, когда в среде присутствует наибольшая из взятых концентраций автолизата (75 мл/л) (табл 1 случаи 2, 6, 8) Таким образом, можно сделать вывод, что автолизат наиболее значимо влияет на рост данных культур Напротив, концентрации пептона и глюкозы в заметно меньшей мере оказывали влияние на данный процесс При этом в наших экспериментах в случае R erythropolis потребление глюкозы происходит примерно на 10%, а в случае R ruber - на 87% в случае минимальной концентрации глюкозы и на 60% в случае максимальной концентрации (в обоих случаях) Поэтому в целях экономии было решено использовать в качестве среды для культивирования среду № 6 (табл 1), но без пептона В результате потребление глюкозы штаммом R erythropolis увеличилось до 38%, а штаммом R ruber - до 88% При этом численность углеводородокисляющих микроорганизмов осталась на том же (высоком) уровне Таким образом, найденная минимальная среда (дрожжевой автолизат (75 мл/л), глюкоза (15 г/л), гидрофосфат натрия (4 г/л) и дигидрофосфат калия (1 г/л)) была включена в регламент по производству препарата «Родер» и использовалась нами в дальнейших опытах для культивирования углеводородокисляющих бактерий, входящих в препарат «Родер»

Таблица 1. Результаты ПФЭ, проведенного в целях подбора среды для культивирования штаммов препарата «Родер»

N Автолизат, мл/л Пептон, г/л Глюкоза, г/л R. ruber (36ч) R. erythropolis (28ч)

Биомасса, г/л

1 25 2,5 5 2,0 2,1

2 75 2,5 5 2,7 2,8

3 25 7,5 5 2,1 2,2

4 75 7,5 5 3,1 3,1

5 25 2,5 15 2,7 2,7

6 75 2,5 15 5,1 3,8

7 25 7,5 15 4,4 3,1

8 75 7,5 15 5,0 3,3

9 50 5 10 3,1 2,5

На выбранной среде было наработано 10 кг сухого препарата, который использовался в дальнейших полевых экспериментах.

Применение препарата «Родер» для очистки реальных природных объектов

Следующим этапом данной работы стало исследование способности препарата «Родер», полученного в соответствии с регламентом, деградировать различные типы нефтяных загрязнений .В качестве таких субстратов были выбраны реальные почвенные загрязнения нефтью, мазутом и нефтешламами. Результаты экспериментов представлены на рис. 1 и табл. 2.

Как показали проведенные

исследования, препарат «Родер» проявил

высокую эффективность по снижению

концентраций алифатических (91-97%)

углеводородов. Несколько хуже

происходило потребление ароматических

соединений (48-64%). Концентрацию

смолисто-асфальтеновых соединений

препарат снижал на 0-49% в зависимости

от типа загрязнения.

Таким образом, практически во всех

случаях (наряду с высокой

биодеградацией алифатической

составляющей субстрата), наблюдалась

значительно более слабая деградацию

полиароматической и смолисто-

асфальтеновой фракций (которая также

содержит большое количество

Рис. 1. Деградация компонентов конденсированных ароматических

застарелого мазута (а), железнодорожного

шлама (б) в процессе биоремедиации соединений), что является довольно препаратом «Родер» загрязненной почвы

(ось абсцисс: время обработок в сутках). серьезной проблемой, в связи с высокой

токсичностью этих фракций.

р 10 х

ш

I 6

о

4,7

эт 6,6 . :

□ Окисленные в-ва

□ Асфальтены

□ Ароматические УВ 13 Алифатические УВ

24

2,5 0,6 0,5

2,2 2,4

1.9: 1,5 0,3

48 72

80 70 60 50 40 30 20 10 0

40,4

®2Г"

□ Окисленные в-ва

»,9

□ Асфальтены

□ Ароматические УВ 14,5 -18 □ Алифатические УВ

12,2 8,9

12,2

17,2.

24 48

5,2 7,5

72

Поэтому, было решено более детально изучить кинетические закономерности биодеградации отдельных составляющих нефти (алифатических и ароматических УВ) каждым штаммом отдельно и в консорциуме в лабораторных условиях

Таблица 2. Сравнение эффективности деградации препаратом «Родер» различных загрязнений почвы и грунта____

Параметры Мазут ж/д шлам

Начальное содержание УВ, г/кг 20,5 71,5

% деградации

УВ 77 61

Алифатическая фракция 97 91

Ароматическая фракция 64 48

Смолисто-асфальтеновая фракция 49 0

Кинетические закономерности биодеградации алифатических углеводородов штаммами R. ruber (Ac-1513-D) и R. ervthropohs (Ac-1514-D)

Результаты изучения кинетики деградации нормальных алифатических углеводородо (С13-Сп) индивидуальными штаммами R ruber и R erythropohs представлены на рис 2 табл 3 Биоразложение субстрата составило 34% для R ruber и 79% для R erythropoli после чего процесс деградации углеводородов практически остановился Сведение баланс по углероду показало, что эквимолярного преобразования субстрата в углекислый газ экспериментах не наблюдается Наблюдаемый факт можно объяснить тем, что в результа адсорбции субстрата на клеточной стенке при его транспортировке и накоплении внутр клеток, он перестает быть доступным для экстракции

По расположению кривых накопления биомассы и потребления субстрата (рис 2 видно, что в течение лаг-периода происходит потребление субстрата клетками штамма ruber, которые, сначала накапливают его, и только затем деградируют Для штамма erythropohs такого эффекта не наблюдается - заметное снижение концентраци углеводородов происходит только после завершения лаг-фазы Основываясь на эти наблюдениях, можно предположить, что эти два штамма используют различны механизмы захвата углеводородов

а

■ [С] * Белок

О 50 100 150 200 Время,час

6

7 o,oi

О о

О 50 100 150 200

Время, час

в

О 50 100 150

Вре мя, час

Рис. 2. Кииетические кривые потребления субстрата и накопления биомассы, при росте R. erythropolis (а), R. ruber (б) и консорциума (в) на смеси жидких парафинов в качестве единственного источника углерода.

Клетки R. ruber, по всей видимости, производят прямой захват неполярных молекул субстрата одновременно с синтезом необходимых ферментов, и уже затем начинается их расщепление. Клетки R. erythropolis, напротив, в течение лаг-фазы синтезируют необходимые ферменты и ПАВ, после чего эмульгируют субстрат, и начинается его активная деградация. Наблюдаются отличия и в характере роста клеток штаммов, так, если R erythropolis легко образует суспензию в водной фазе, то R. ruber растет, прикрепляясь к поверхности раздела фаз субстрат-водная среда, или же к стенкам сосуда.

Наблюдаемое различие в способе захвата молекул субстрата клетками каждого из штаммов можно объяснить разным составом их клеточной стенки и, очевидно, ее большей липофильностью у клеток штамма R. ruber. Так как действие клеток этих двух штаммов на субстрат различается, то, возможно, вместе эти два штамма будут более успешно утилизировать углеводородный субстрат. Для проверки этого предположения был проведен также эксперимент по изучению биоразложения жидких парафинов консорциумом этих двух штаммов (рис. 2в).

И, действительно, из полученных данных по удельной активности видно (табл 3), что два штамма в консорциуме более активно потребляют парафины, чем каждый из штаммов по отдельности Таким образом, наблюдается синергическое взаимодействие штаммов, составляющих биопрепарат «Родер» Тем не менее, несмотря на то, что штамм R ruber имеет значительно меньшую активность, проявляемые активности обоих штаммов по отношению к н-алканам находятся на довольно высоком уровне (Табл 3)

Таблица 3 Кинетические характеристики процессов биодеградации исследуемых субстратов

Штаммы

Субстрат

Потребление субстрата

Уд. скорость роста ji, час"'

Уд. активность q, ммоль[С]/г/час

R erythropohs

Смесь парафинов

79%

0,032 ±0,003

24,6 ±2,1

R ruber

Смесь парафинов

34%

0,074 ± 0,008

9,8 ± 1,3

R erythropohs + R ruber

Смесь парафинов

85%

0,041 ± 0,005

30,0 ± 2,9

Таким образом, проведя эксперименты с более или менее простыми субстратами, содержащим в основной своей части относительно легкобиоразлагаемые нормальные алифатические соединения, на следующем этапе работы было бы логичным выяснить, как поведут себя изучаемые штаммы при росте на таком токсичном и трудноразлагаемом субстрате как полиароматические углеводороды (ПАУ)

Изучение биодеградации ПАУ штаммами R. ruber и R. erythropohs

Кинетические кривые потребления смеси ПАУ (пирена, антрацена, фенантрена и нафталина) штаммами R ruber и R erythropohs приведены на рис 3 Из приведенных данных видно, что по отношению к нафталину оба штамма проявляют высокую активность, а по отношению к остальным ПАУ она находится на довольно низком уровне (табл 6) по сравнению с литературными данными

S

sc: S

о"

100 200

Время,час

300

1000

800

S 600

s

о" 400

200

0

-Пирен -Нафталин

-Фенантрен -Антрацен

100 200

Время,час

300

Рис. 3. Кинетические кривые потребления смеси ПАУ (нафталина, антрацена, фенантрена и пирена) штаммами R. ruber (а) и R. erythropolis (б).

Скрининг эффективных биодеструкторов ПАУ

В связи с тем, что активность по отношению к Г1АУ (за исключением нафталина) штаммов R. ruber и R. erythropolis оставляет желать лучшего (табл. 6), дальнейшим шагом наших исследований была попытка найти более активный деструктор этих соединений. Для этого был проведен скрининг имеющегося в нашей лаборатории музея микроорганизмов, выделенных из различных нефтезагрязненных природных объектов (табл. 4). Как видно из полученных результатов наибольшей активностью по отношению к смеси ПАУ обладала накопительная культура 2ПЗ. Эта культура была выбрана для дальнейших исследований биодеградации ПАУ.

Таблица 4. Результаты скрининга музея микроорганизмов по оценке способности расти на среде Раймонда, содержащей ПАУ (антрацен, пирен, нафталин, фенантрен в концентрации 50 мкМ). - слабый рост или его отсутствие; + стабильно детектируемый

Номер Культура Рост Номер варианта Культур Рост клеток

варианта клеток а

1 R. ruber - 14 1зпз -

2 R. erythropolis - 15 2ПЗ +++

3 1.3 - 16 5-5 Коми ++

4 4 Potl кон - 17 27 -

5 2П2Х15,13 - 18 1-3 -

6 26 - 19 4П -

7 33 - 20 Грин ++

8 3,8Kevm + 21 4-11 -

9 15МГУ - 22 1П2 -

10 4-4 Коми - 23 4МГУ -

11 Potl - 24 5МГУ -

12 SmL ++ 25 1ПЗ -

13 5ПЗ -

Выделение чистой культуры из накопительной культуры 2ПЗ и ее идентификация

На следующем этапе работы было решено проверить, какие именно штаммы в культуре 2ПЗ отвечают за биодеградацию ПАУ Для решения этой задачи культура 2ПЗ была высеяна на твердую селективную среду, содержащую ПАУ Некоторые из выросших колоний были отобраны и помещены в жидкую минеральную среду Раймонда с ПАУ и гексадеканом в качестве косубстрата Среди отобранных вариантов для дальнейшей работы были выбраны те, в которых наблюдалось наиболее активное потребление ПАУ В конце концов, нами была выделена чистая культура микроорганизмов, проявляющая высокую биодеградирующую активность по отношению к ПАУ Степень деградации ПАУ выделенной культурой приближалась к 100% (табл 5)

Таблица 5. Степень деградации ПАУ чистой культурой, выделенной из 2ПЗ (косубстрат-гексадекан)____

ПАУ Нач. конц., мкМ Биодеградация, % Время, сут

Нафталин 430 100 5

Фенантрен 275 96 5

Пирен 240 95 5

Для того, чтобы точно идентифицировать выделенную культуру (и более уверенно убедиться в ее чистоте), был выбран метод анализа последовательности гена, кодирующего рибосомальную 16s РНК Анализ полученной нуклеотидной последовательности показал 99% гомологию с аналогичными последовательностями штаммов Pseudomonas aeruginosa На основании этой последовательности было построено филогенетическое дерево, представленное на рисунке 4

Shewanella sedimrrus HAWEB3

86

45

96

94

rL

Pseudomonas syrangae pv phaseolwola 1440 Pseudomonas svrmgae pv syrmgae B720

Pseudomonas fluorescens Pf-5 Pseudomonas synngae DC3000

95

> Pseudomonas fluorescens PfO-1

Pseudomonas pubda KT2440 Pseudomonas putida Fl Pseudomonas entomophila IM Pseudomonas mendocma утр - Pseudomonas stufaen A1501

-EL

Pseudomonas aeruginosa РЛ7

Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14 ^ i Pseudomonas aeruginosa PAOl

-HZn

Pseudomonas sp

Рис. 4. Филогенетическое положение штамма, (отмечено красным) выделенного из культуры 2ПЗ

Таким образом, было установлено, что выделенный нами штамм относится к виду Pseudomonas aeruginosa

Характеристики культуры Р aeruginosa при росте на различных углеводородах.

С выделенной чистой культурой Р aeruginosa были проведены кинетические исследования по деградации ПАУ без добавления какого-либо косубстрата Результаты этого эксперимента приведены в таблице 6 Из полученных данных видно, что, наиболее активной деградации подвергается нафталин, остальные ПАУ потребляются несколько хуже, но, тем не менее, выделенная культура Р aeruginosa проявляет заметно большую активность по отношению к фенантрену, антрацену и пирену, чем штаммы R ruber и R erythropolis (табл 6)

Таблица 6. Потребление ПАУ при росте штаммов Р aeruginosa, R ruber и R erythropohs на минеральной среде без добавления ко-субстратов ____

ПАУ R. ruber R erythropohs P. aeruginosa

Нафталин Активность, мкмоль[С]/г(белка)/ч 49,6 ± 9,5 40,9 ±6,1 36,2 ± 7,2

Биодеградация4, % 96 95 97

Фенантрен Активность, мкмоль[С]/г(белка)/ч 3,4 ±0,5 3,1 ±0,5 12,5 ±2,1

Биодеградация*, % 13 10 31

Антрацен Активность, мкмоль[С]/г(белка)/ч 3,2 ± 0,4 1,9 ±0,3 9,1 ± 1,4

Биодеградация*, % 22 11 27

Пирен Активность, мкмоль [С]/г(белка)/ч 3,9 ±0,7 4,8 ± 0,6 8,5 ± 1,5

Биодеградация*, % 15 16 34

* за 300 ч эксперимента

Таким образом, выделенная нами чистая культура Р aeruginosa является перспективной для ликвидации нефтяных загрязнений, содержащих повышенные концентрации ПАУ, которые зачастую остаются недоступными для потребления другими микроорганизмами при проведении биоремедиационных работ

Так как ПАУ в реальных загрязнениях обычно присутствуют совместно с алифатическими УВ, то следующим этапом нашей работы стало изучение биодеградации штаммом Р aeruginosa гексадекана как типичного представителя этих УВ Кинетические кривые потребления гексадекана, накопления углекислого газа и накопления биомассы показаны на рис 5 Как видно из полученных данных, процесс биодеградации гексадекана штаммом Р aeruginosa идет с довольно высокой активностью (в пересчете на эквивалентное количество углерода) (табл 7), сравнимой с активностью биодеградации жидких парафинов штаммом R ruber (9,8 ммоль[С]/г(белка)/час), но все же заметно хуже, чем при биодеградации жидких парафинов штаммом R erythropohs (24,6 ммоль[С]/г(белка)/час, табл 3 )

1,2

1 j

0,81 s

0,6-^ 2

0,4— О 0,2"

50 100 150

Время,час

200

50 100 150 200

Время,час

Рис. 5. Кинетические кривые потребления субстрата (а), накопление углекислого газа (а), накопления биомассы (б) при росте P. aeruginosa на гексадекане в качестве единственного источника углерода.

Таблица 7. Кинетические характеристики биодеградации гексадекана штаммом Р.

Штамм Субстрат Потребление субстрата Уд. скорость роста ц, ч"' Уд. активность, q, ммоль[С]/г(белка)/ч

P. aeruginosa Гексадекан 94% 0,035 ± 0,007 5,2 ±0,5

Исследование влияния P. aeruginosa на рост R. ruber и R. erythropolis

Для того чтобы проверить, как повлияет присутствие штамма P. aeruginosa на биодеградацию алифатических и полиароматических углеводородов штаммами R. ruber и R. erythropolis, были проведены эксперименты, в которых производилось культивирование консорциумов состоящих из смеси двух (R. ruber и R. erythropolis) и трех (P. aeruginosa, R. ruber и R. erythropolis ) штаммов в среде, содержащей антрацен, фенантрен и пирен - в качестве ПАУ и гексадекана - в качестве алифатической составляющей. Полученные результаты представлены на рис. 6., 7. и в табл. 8.

Видно (табл. 8), что консорциум трех штаммов проявляет почти в 2 раза большую активность по отношению ко всем используемым ПАУ, чем консорциум штаммов R. ruber и R. erythropolis, что указывает на первостепенную роль P. aeruginosa в этом процессе. Кроме того, в течение 240 часов эксперимента при росте консорциума трех штаммов степень биодеградации ПАУ составило 87 - 90 %, а при совместном культивировании штаммов R. ruber и R. erythropolis всего 52-61 %.

17

Рис. 6. Кривые: (а) -потребления ПАУ (Ж - антрацена, ♦ - фенантрена, ■ -пирена); (б) - потребления гексадекана (♦) и накопления биомассы (■); при росте консорциума штаммов R. ruber и R. erythropolis на минеральной среде, содержащей смесь ПАУ и гексадекана.

Рис. 7. Кривые: (а) -потребления ПАУ (А - антрацена, ♦ - фенантрена, ■ -пирена); (б) - потребления гексадекана (♦) и накопления биомассы (■); при росте консорциума штаммов R. ruber, R. erythropolis и P. aeruginosa на минеральной среде, содержащей смесь ПАУ и гексадекана.

Стоит отметить, что добавление в консорциум штамма P. aeruginosa приводит к небольшому падению активности по отношению к гексадекану, но, тем не менее, она остается на довольно высоком уровне.

Таблица 8. Кинетические характеристики потребления полиароматических и алифатических субстратов при росте двух консорциумов микроорганизмов на минеральной среде, содержащей смесь ПАУ и гексадекана__

Субстрат R ruber+ R erythropolis R. ruber+ R erythropolis + Р aeruginosa

Фенантрен Активность, мкмоль[С]/г(белка)/ч 5,3 ± 0,5 10,5 ± 1,3

Биодеградация, % 61 90

Антрацен Активность, мкмоль[С]/г(белка)/ч 4,8 ± 0,4 8,6 ± 2 0

Биодеградация, % 52 86

Пирен Активность, мкмоль[С]/г(белка)/ч 4,7 ± 0,7 8,5 ± 1,7

Биодеградация, % 53 87

Гексадекан Активность, ммоль[С]/г(белка)/ч 15,3 ± 1,4 11,1 ±2,6

Биодеградация, % 95 92

Таким образом, было показано положительное влияние штамма Р aeruginosa на биодеградацию ПАУ в консорциуме трех штаммов, что дает возможность в перспективе использовать подобный консорциум для борьбы с загрязнениями, содержащими повышенное количество ПАУ

Определение концентрации клеток родококков методом ИФА

Одной из проблем, с которой сталкиваются исследователи при проведении биоремедиационных процедур, также является идентификация используемых микроорганизмов (как качественная, так и количественная) В нашей работе мы попытались разработать подход, который позволил бы нам количественно идентифицировать штаммы, входящие в препарат «Родер» в реальных загрязненных объектах Для этого была разработана методика их иммунологического определения

На рис 8 показаны результаты титрования антисывороток на иммобилизованных клетках исследуемых культур Видно, что антисыворотки имели достаточно высокие титры (превышение над фоном было семикратным) на своих антигенах, однако

19

проявляли также перекрестную реактивность к антигенам родственного штамма, Что позволяет предположить наличие общих антигенных детерминант у обоих штаммов

Однако, как видно на рис 8, клетки исследуемых штаммов обладают и специфическими антигенными детерминантами, для которых надо было выделить соответствующие антитела Поскольку известно, что в первые дни (через 3-4 дня после иммунизации) иммунного ответа преимущественно идет образование иммуноглобулинов класса М, но в процессе дальнейшего развития иммунного ответа появляются антитела G класса, которые, как считается, обладают более высокой специфичностью, мы путем градиентной преципитации попытались отделить антитела IgG класса от остальной сыворотки Как видно из представленных результатов (рис 9), IgG-фракции, выделенная из антисывороток против клеток штаммов R ruber и R erythropolis, обладает строгой специфичностью по отношению к одному конкретному штамму Эти результаты в целом соответствуют представлениям, что появляющиеся первыми антитела IgM взаимодействуют, в основном, с антигенами клеточной стенки и, по-видимому, именно они адсорбируются цельными клетками при истощении антисывороток перекрестно реагирующими микроорганизмами Поэтому IgG-фракции использовались в дальнейших исследованиях по идентификации и определению численности клеток штаммов R ruber и R erythropolis, поскольку стояла задача их идентификации в почве в присутствии других микроорганизмов

Далее нами были проведены эксперименты по определению численности родококков в модельных и реальных образцах почвы и сравнение с результатами классических микробиологических методов В таблице 9 представлены результаты эксперимента на песке как модели почвьг по апробации метода ИФА для идентификации и определения численности родококков, входящих в состав препарата «Родер» Видно, что наблюдается довольно высокая сходимость в численности родококков, определенная методом ИФА и классическими микробиологическими методами Таким образом, была показана возможность использования иммуноферментного метода для оценки количества клеток на жидких средах и в почве

Разработанная методика была апробирована в эксперименте по биодеградации загрязненной нефтью почвы при трехкратной обработке ее суспензией клеток штамма R erythropolis Результаты этого эксперимента представлены на рисунке 10

а

Разведение (кратность) б

3 2,5

0,5 * о

30 270 2400 28000 Разведение (кратность)

Рис. 8. Взаимодействие антисывороток к R. ruber (а) и R. erythropolis (б) с интактными клетками (▲ взаимодействие антисыворотки к одному штамму с иммобилизованными клетками того же штамма; ■ - взаимодействие антисыворотки к одному штамму с иммобилизованными клетками другого штамма (перекрестная реактивность); ♦ -взаимодействие неимунной сыворотки с иммобилизованными клетками одного из штаммов).

0,7

0,6 Л

J0'4 \

ол """"^Tb^i é i^t

0 --Т--

30 270 2430 21870 Разведение (кратность)

б

30 270 2430 21870 Разведение (кратность)

Рис. 9. Взаимодействие IgG-фракции, выделенной из антисыворотки к штамму R. ruber (а) и R. erythropolis (б) с интактными клетками (А-

взаимодействие IgG-фракции к одному штамму с иммобилизованными клетками того же штамма; взаимодействие IgG-фракции к одному штамму с иммобилизованными клетками другого штамма (перекрестная реактивность); ♦ -взаимодействие неимунной сыворотки с иммобилизованными клетками одного из штаммов).

Таблица 9. Результаты определения численности клеток родококков двумя методами в модельном эксперименте на песке__

Варианты Внесено, кл/г Выделено, кл/г

Классич.метод ИФА Классич. метод ИФА

К. гиЬег (1,1 ±0,5) *108 (1,5±0,1)*108 (9,0 ± 0,4) *108 (5,4 ± 0,2)* 107

Д. егуЛгороИз (1,2 ± 0,3) *108 (5,4 ± 0,1)* 1О^ (1,5 ± 0,3) *108 (6,2 ± 0,1)*107

«Родер» (8,5±0,3)*108 (4,4 ± 0,2)* 10? (Я. егу^гороШ) + (7,3 ± 0,1)*107 (К. гиЬег) (1,5 ±0,4) *108 (3,2 ± 0,1)* 107 (Я. егуЛгороШ) + (4,8 ± 0,2)* 107 (д. гиЬег)

Как видно из рис. 10, в течение 50 суток, концентрация углеводородов снижалась на 17 %, при этом общая численность УВО микроорганизмов увеличивалась, причем именно за счет внесения и роста клеток Я. егуЛгороИя, которые присутствовали в довольно высокой концентрации. Этот факт говорит о том, что именно клетки егуЛгороШ (а не аборигенная УВО микрофлора) осуществляли биодеградацию загрязнения.

600

400

20 40

Время, сутки

10

3 8

о

т

9 б

ш 4

го 2

60

■ Р. егу^гороИэ □ УВО

0 10 22 36 50 Время, сутки

Рис. 10. (а) Динамика снижения нефтяного загрязнения при действии штамма Л. егу1кгороШ\ (б) концентрация клеток штамма К. егу1кгороШ (по данным ИФА) и общая концентрация углеводородокисляющих микроорганизмов (метод предельных разведений) в ходе биодеградации.

Выводы

1 Оптимизирован состав питательных компонентов для масштабного культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов препарата «Родер», выход биомассы на оптимизированной среде стал в 1,5 раза больше по сравнению с исходной

2 Показано, что в результате биодеградации нефтяных загрязнений почвы препаратом «Родер» практически полностью потребляются алифатические углеводороды, а в остатке находятся в основном смолисто-асфальтеновая и полиароматическая составляющие загрязнителя

3 Были получены кинетические характеристики процесса биодеградации углеводородов (алифатических и полиароматических) штаммами R ruber и R. erythropolis, входящими в состав препарата «Родер»

4 В результате скрининга накопительных культур микроорганизмов, выделенных из различных образцов почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, была выбрана культура (2ПЗ), обладающая повышенной активностью по отношению к ПАУ Из накопительной культуры 2ПЗ был выделен чистый штамм, который методами молекулярной биологии идентифицирован как относящийся к виду Pseudomonas aeruginosa

5 Были получены кинетические характеристики процесса биодеградации углеводородов (алифатических и полиароматических) штаммом Pseudomonas aeruginosa Было установлено, что выделенный штамм обладал в 3 - 4 раза большей активностью по отношению к ПАУ

6 Было показано, что штамм Р aeruginosa не оказывает отрицательного влияния на рост штаммов R ruber и R erythropolis и при совместном использовании трех штаммов активность к ПАУ возрастает в 2 раза за счет присутствия штамма Р aeruginosa Таким образом, была показана принципиальная возможность использования консорциума трех штаммов при биодеградации загрязнений, содержащих повышенное количество ПАУ

7 Разработана методика для количественного определения штаммов R ruber и К erythropolis в жидких средах и в почве с помощью твердофазного иммуноферментного анализа

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Жуков Д В., Мурыгина В П, Калюжный С В Механизмы деградации углеводородов нефти микроорганизмами // Успехи современной биологии - 2006 -Т 126 - № 3 - с 285-296

2 Natalia A Yemashova, Valentina Р Murygina, Dmitry V. Zhukov, Arpenik A Zakharyantz, Marina A Gladchenko, Vasu Appanna, Sergey V Kalyuzhnyi Biodetenoration of crude oil and oil derived products a review // Reviews in Environmental Science and Biotechnology, 2007, V 6 p 315-337

3 Жуков Д. В., Мурыгина В П, Калюжный С В Изучение кинетических закономерностей биодеградации алифатических углеводородов бактериями Rhodococcus ruber и Rhodococcus erythropolis II Прикладная биохимия и микробиология - 2007 -Т 43 - № 6 - с 657-663

4 Zhukov D.V, Murygina V P , Kalyuzhnyi S V Kinetics of n-alkanes biodégradation by Rhodococcus ruber and Rhodococcus erythropolis In A E Kuznetsov and G E Zaikov (Eds) New Research on the Environment and Biotechnology, Nova Science Publisher, Inc 2006, p 93-97

5 Жуков Д В., Мурыгина В П, Калюжный С В Кинетические закономерности биодеградации н-алканов штаммами Rhodococcus ruber и Rhodococcus erythropolis II Материалы III Московского международного Конгресса «Биотехнология Состояние и перспективы развития», часть 2, 14-18 марта 2005, Москва, С 105

6 Жуков Д.В., Мурыгина В П, Калюжный С В Изучение биодеградации углеводородов нефти штаммами рода Rhodococcus II Материалы Международной Конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», 14-16 сентября 2005, Саратов, С 22

7 Жуков Д.В., Мурыгина В П, Калюжный С В Изучение биодеградации МТБЭ бактериями биопрепарата «Родер» // Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (памяти акад РАН E H Кондратьевой), 21-24 декабря 2005, Москва, С 90

8 Белова О M, Жуков Д В., Калюжный С В Выделение штамма - активного деструктора полиароматических углеводородов (ПАУ), и изучение его кинетических характеристик // Материалы IV Московского международного Конгресса «Биотехнология Состояние и перспективы развития», часть 2, 12-16 марта 2007, Москва, С 263

9 Тумасянц А И , Мурыгина В П, Янкевич M И , Жуков Д.В , Калюжный С В Биоремедиация застарелого мазута и железнодорожного шлама препаратом-нефтедеструктором «Родер» (полевые испытания) // Материалы IV Московского международного Конгресса «Биотехнология Состояние и перспективы развития», часть 2, 12-16 марта 2007, Москва, С 132

Подписано в печать 27 декабря 2007 г Объем 1,0 п л Тираж 100 экз Заказ № 1484 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д 37

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Жуков, Дмитрий Вячеславович

Список сокращений

1. Введение

2. Литературный обзор

2.1. Углеводородные загрязнения окружающей среды

2.1.1. Состав углеводородных загрязнителей: нефти, мазута, нефтешламов

2.1.2. Восстановление почв, загрязненных углеводородами

2.1.2.1. Методы восстановления природных объектов при нефтяных загрязнениях

2.1.2.2. Биологическая очистка почв

2.2. Свойства и применение бактерий рода Rhodococcus в биоремедиации 18 2.2.1 .Общая характеристика микроорганизмов рода Rhodococcus

2.3. ПАУ-разлагающие микроорганизмы

2.4. Механизмы биодеградации углеводородов

2.'4.1. Механизмы биодеградации алифатических углеводородов 25 2.4.2. Механизмы расщепления ароматических УВ 28 2.4.2.1. Расщепление ароматической структуры 28 2.4.2.2 Механизмы биодеградации полиароматических углеводородов (ПАУ)

2.5. Идентификация микроорганизмов в почве 41 2.5.1. Иммунохимические методы идентификации микроорганизмов с акцентом на родококки

2.5.1.1. Реакция иммуноагглютинации

2.5.1.2. Иммунодиффузия

2.5.1.3. Иммуноэлектрофорез (ИЭФ)

2.5.1.4. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

2.5.1.5. Иммуноферментный анализ (ИФА)

3. Материалы и методы

3.1. Объекты исследования

3.1.1. Оптимизация состава питательных сред для масштабированного культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов препарата «Родер»

3.1.2. Полевые испытания препарата «Родер» (сухой формы) для биоремедиации почв, загрязненных углеводородами

3.2. Условия проведения лабораторных экспериментов

3.2.1. Адаптация штаммов к исследуемому субстрату

3.2.2. Изучение закономерности потребления смеси парафинов и дизельного топлива в качестве единственного источника углерода

3.2.3. Проведение скрининга культур микроорганизмов

3.2.4. Выделение чистых культур

3.2.5. Изучение способности клеток сорбировать ПАУ

3.2.6. Изучение закономерности потребления ПАУ в качестве единственного источника углерода и в присутствии косубстрата

3.2.7. Изучение закономерности потребления алифатических углеводородов культурой Pseudomonas sp.

3.2.8. Испытания разработанного ммунохимического анализа штаммов R. ruber и R, erytropolis

3.3. Методы

3.3.1. Гравиметрический анализ почвенных проб

3.3.2. Определение содержания летучих жирных кислот (ЛЖК)

3.3.3. Определение содержания алканов

3.3.4. Определение концентрации ПАУ

3.3.5. Определение концентрации растворимого белка

3.3.6. Определение СОг в газовой фазе

3.3.6. Проведение окраски по методу Грама

3.3.7. Расчет кинетических параметров биодеградации углеводородов

3.3.8. Определение численности микроорганизмов классическим микробиологическим методом

3.3.9. Определение клеток R. ruber и R erythropolis методом ИФА

3.3.9.1. Получение антисывороток против R. ruber и R. erythropolis

3.3.9.2. Сорбция клеток на планшете

3.3.9.3. Тестирование антисывороток

3.3.9.4. Построение калибровочной кривой

3.3.10. Выделение ДНК

3.3.11. Амплификация фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК

3.3.12. Детектирование продуктов ПЦР

3.3.13. Очистка ПЦР-фрагментов

3.3.14. Секвенирование ПЦР-фрагментов и анализ нуклеотидных последовательностей

4. Результаты и обсуждение

4.1. Оптимизация состава питательных компонентов для культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов препарата «Родер»

4.2. Применение препарата «Родер» для очистки реальных природных объектов

4.2.1. Биоремедиация препаратом «Родер» почвы, загрязненной застарелым мазутом (Обуховский завод, участки №1 и №2)

4.2.2. Биоремедиация препаратом «Родер» железнодорожного шлама

4.2.3. Биоремедиация препаратом «Родер» почвы, загрязненной нефтью

4.2.4. Сравнительный анализ результатов деградации углеводородных загрязнений препаратом «Родер»

4.3. Кинетические закономерности биодеградации алифатических углеводородов штаммами R. ruber (Ac-1513-D) и R. erythropolis (Ac-1514-D)

4.3.1. Кинетические закономерности биодеградации жидких парафинов адаптированными штаммами R. ruber (Ac-1513-D) и R. erythropolis (Ac-1514-D) 87 '

4.3.2. Кинетические закономерности биодеградации углеводородов дизельного топлива адаптированными штаммами R. ruber (Ac-1513-D) и R. erythropolis (Ac-1514-D)

4.4. Изучение биодеградации полиароматических углеводородов (ПАУ)

4.4.1.Изучение биодеградации ПАУ штаммами R. ruber и R. erythropolis

4.4.2. Скрининг эффективных биодеструкторов ПАУ

4.4.3. Выделение чистой культуры из накопительной культуры 2ПЗ и ее идентификация

4.4.4. Кинетические свойства культуры Pseudomonas aeruginosa при росте на различных углеводородах

4.5. Исследование влияния Р. aeruginosa на рост R. ruber и R. erythropolis

4.6. Совместное потребление ПАУ и гексадекана консорциумом трех штаммов

4.7. Определение концентрации клеток родококков методом ИФА

5. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Закономерности функционирования углеводородокисляющих микроорганизмов при биоремедиации нефтяных загрязнений"

В настоящее время, проблемы охраны окружающей среды и рационального природопользования, а также повышения уровня экологической безопасности, рассматриваются как первостепенные в общемировом масштабе. Одними из наиболее опасных загрязнителей практически всех компонентов природной среды (поверхностных и подземных вод, почв, растительного покрова и атмосферного воздуха) являются нефть, нефтепродукты и нефтесодержащие отходы - нефтешламы.

Ежегодно в мире образуются миллионы тонн жидких и твердых отходов нефтяной и нефтеперерабатывающей промышленности. Места хранения таких отходов представляют серьезную опасность для окружающей среды, а многочисленные аварии при добыче, переработке и транспортировки нефти и нефтепродуктов являются причиной масштабных загрязнений природных объектов. Попадая в окружающую среду, ископаемые углеводороды, в частности нефть и продукты ее переработки, не только губят флору и фауну, но и наносят прямой вред здоровью человека (например, некоторые компоненты нефти проявляют канцерогенную активность). При этом самоочищение загрязненных территорий без вмешательства человека длится десятками лет, кроме того, естественная способность окружающей среды к самовосстановлению с каждым годом снижается. Как следствие, остро встает вопрос о необходимости проведения максимально эффективной очистки загрязненных территорий с учетом состава загрязнителей, экономических и экологических и факторов.

Среди всего спектра методов устранения последствий углеводородных загрязнений, биологические методы справедливо признаны в мире наиболее безопасными для окружающей среды и экономически целесообразными. Особенно перспективным является метод биоремедиации, основанный на использовании микроорганизмов, способных утилизировать углеводороды в процессе своей жизнедеятельности. В процессе биоремедиации углерод из нефти и нефтепродуктов частично преобразуется в углекислый газ, частично переходит в биомассу клеток, и частично трансформируется в гумус и закрепляется в почве. В настоящее время изучению этой проблемы посвящено большое число научных исследований, и интерес к этой тематике растет. Научные лаборатории всего мира продолжают разрабатывать препараты-нефтедеструкторы, действие которых основано на использовании уникальных возможностей углеводородокисляющих микроорганизмов, входящих в их состав. Тем не менее, при использовании микроорганизмов в биоремедиации возникает ряд проблем.

Например, микробам, часто, и самим нужна определенная помощь, так как в местах сильных загрязнений значительно нарушен необходимый для жизнедеятельности микроорганизмов баланс углерода, азота, фосфора и других питательных компонентов. Для смягчения этой проблемы вместе с препаратами вносятся минеральные и органический удобрения (состав которых специально разрабатывается для конкретного препарата и загрязнения), раскислители почвы (в случае почв с пониженным рН), ПАВы, сорбенты, а также производится периодическая вспашка очищаемых участков для улучшения массообмена.

Кроме того, зачастую препараты проявляют требуемую активность только для загрязнения определенного состава, и присутствие некоторых компонентов нефти в большей концентрации пагубно влияет на общее действие препарата: в качестве примера можно привести загрязнения нефтепродуктами, содержащими повышенное количество смол, асфальтенов, полиароматических углеводородов, которые являются очень токсичными для микроорганизмов. В этом случае для достижения положительных результатов целесообразно использовать методы биоаугментации, т.е., дополнительного внесения микроорганизмов, обладающих повышенной активностью именно к таким компонентам.

Также встает вопрос о том, какое влияние оказывают вносимые с препаратами добавки удобрений на аборигенные сообщества микроорганизмов, так как существуют технологии очистки природных объектов от нефтяных загрязнений, которые основаны на биоремедиации без привлечения микробных препаратов, но использующие активизацию различными способами аборигенной микрофлоры. Поэтому поведение вносимых с препаратом микроорганизмов на фоне аборигенных микроорганизмов и вклад их в процесс биодеградации загрязнения также является важной проблемой. Для ее решения в мире разрабатываются различные методы идентификации и контроля микроорганизмов в почве.

Имеющийся в нашей лаборатории препарат «Родер», состоит из штаммов R. ruber Ac-1513-D и R. erythropolis Ac-1514-D. Он был разработан для ликвидации свежих аварийных разливов нефти и довольно успешно испытывался в различных регионах России для микробиологической очистки водных поверхностей и грунтов от загрязнений углеводородами нефти. В настоящее время востребованы биологические методы облагораживания нефтяных шламов, в том числе отходов НПЗ, железнодорожных шламов, территорий, загрязненных мазутом. Интересным представлялось применение штаммов препарата «Родер» для биоремедиации такого рода загрязнений, изучение самого процесса биоремедиации, его эффективности.

Кроме того, в начале 90-х годов практически полностью прекратилось производство сырья, которое использовалось для полупромышленного получения препарата «Родер» по Регламенту, разработанному в 1994 г. Поэтому встал вопрос о поиске новой сырьевой базы и разработке нового регламента для получения препарата «Родер».

Очень злободневным, в первую очередь для нефтяников, является разработка методов, которые позволили бы доказать, что работают именно микроорганизмы препаратов при ликвидации последствий аварийных разливов нефти, а не аборигенная микрофлора, активизированная внесением удобрений и применением агротехнических мероприятий. Все изложенное выше стало основой исследований, проведенных в настоящей диссертационной работе.

В процессе выполнения диссертационной работы была выявлена недостаточно высокая эффективность деградации ПАУ штаммами препарата «Родер», поэтому встал вопрос о поиске эффективных деструкторов ПАУ для повышения биодеградации нетрадиционных углеводородных загрязнений.

2. Литературный обзор

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Жуков, Дмитрий Вячеславович

5. Выводы

1. Оптимизирован состав питательных компонентов среды для масштабного культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов препарата «Родер», выход биомассы на оптимизированной среде стал в 1,5 раза больше по сравнению с исходной.

2. Показано, что в результате биодеградации нефтяных загрязнений почвы препаратом «Родер» практически полностью потребляются алифатические углеводороды, а в остатке находятся в основном смолисто-асфальтеновая и полиароматическая составляющие загрязнителя.

3. Были определены кинетические характеристики процесса биодеградации углеводородов (алифатических и полиароматических) штаммами R. ruber и R. erythropolis, входящими в состав препарата «Родер».

4. В результате скрининга накопительных культур микроорганизмов, выделенных из различных образцов почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, была выбрана культура (2ПЗ), обладающая повышенной активностью по отношению к ПАУ. Из накопительной культуры 2ПЗ был выделен чистый штамм, который методами молекулярной биологии был идентифицирован как Pseudomonas aeruginosa.

5. Были определены кинетические характеристики процесса биодеградации углеводородов (алифатических и полиароматических) штаммом Pseudomonas aeruginosa. Было установлено, что выделенный штамм обладал в 3 раза большей удельной метаболической активностью по отношению к ПАУ, чем штаммы препарата «Родер».

6. Было показано, что штамм Р. aeruginosa не оказывает отрицательного влияния на рост штаммов R. ruber и R. erythropolis и при совместном использовании трех штаммов активность к ПАУ возрастает в 2 раза за счет присутствия штамма Р. aeruginosa. Показана принципиальная возможность использования консорциума трех штаммов при биодеградации загрязнений, содержащих повышенное (выше 50%) количество ПАУ.

7. Разработана методика для количественного определения штаммов R. ruber и R. erythropolis в жидких средах и в почве на основе твердофазного иммуноферментного анализа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Жуков, Дмитрий Вячеславович, Москва

1. Мурыгина В.П., Войшвилло Н.Е., Калюжный С.В. "Биопрепарат "Родер" для очистки почв, почвогрунтов, пресных и минерализованных вод от нефти и нефтепродуктов". Патент РФ № 2174496. -2001.

2. Методы и средства борьбы с нефтяным загрязнением вод Мирового океана //Под. ред. Нестеровой М.П. JI.: Гидрометеоиздат. - 1989. - 208 с.

3. Вылкован А.И., Венцюлис Л.С., Зайцев В.М, Филатов В Д. Современные методы и средства борьбы с разливами нефти // Санкт-Петербург: Центр-Техинформ. - 2000. - 204 с.

4. Другов Ю.С., Родин А.А. Экологические анализы при разливах нефти и нефтепродуктов. // Практическое руководство.- Санкт-Петербург. 2000. - 250 с.

5. Rosenberg Е., Ron E.Z. Bioremediation of Petroleum Contamination. // Bioremediation: principles and applications. Cambridge University Press. New York. USA. 1996. - P. 100-124.

6. Десяткин, А.А. Разработка технологии утилизации нефтяных ш'ламов: Дис. канд. тех. наук. Уфа: Уфимский государственный нефтяной технический университет. - 2007 . -183 с.

7. Баннов П.Г. Процессы переработки нефти. М.: ЦНИИТЭ Нефтехим. - 2000. - 224 с.

8. Peneda-Flores G., Mesta-Howard A.M. Petroleum asphaltenes: generated problematic and possible biodegradation mechanisms // Microbiología. 2001. - V.3. - P: 143-150.

9. Арчегова И.Б. Рекультивация земель на Севере. Рекомендации по рекультивации земель на Крайнем Севере // Вып. 1, Изд. второе (дополненное). Сыктывкар: УрО РАН. -1997.- 34 с.

10. Гарейшина А.З., Ахметшина С.М., Гараев И.Х. Комплексная технология ликвидации нефтяных загрязнений с дальнейшей рекультивацией почвы.// Нефтяное х-во. 1998. - № 2. - С. 69 - 70. .

11. Wild J.R., Varfolomeyev S.D., Scozzafava A. Perspectives in bioremediation: technologies for environmental improvement // NATO Science Partnership Sub-series 3: High Technology, Kluwer Academic Publishers Group. 1997. - V. 19. - 140 p.

12. Шульгин А.И. Эффективная технология рекультивации нарушенных земель // Экология и промышленность России. 2000. - №. 3. - С. 29 - 32.

13. Alexander M. Biodégradation and Bioremediation. San Diego: Academic Press. - 1994. -302 p.

14. Orszulik S.T. Environmental technology in the oil industry New York: Blackie Academic & Professional. - 1997. - 401 p.

15. Bioremediation: principles and applications / Ed. Crawford R.L., Crawford D.L.; New York: Cambridge University Press. 1996. - 412 p.

16. Brusseau M.L., Miller R.M., Zhang Y., Wang X., Bai G.Y. Biosurfactant- and cosolvent-enhanced remediation of contaminated media // Surfactant Enhanced Subsurface Remediation, ACS Symposium Series 594, American Chemical Soc. 1995. - 594 p.

17. Мурыгина В.П., Аринбасаров М.У., Калюжный C.B. Очистка водной поверхности и грунтов от нефтяных загрязнений биопрепаратом "Родер" // Экология и промышленность России. 1999 - № 8. - С. 16-19.

18. Valentina P. Murygina, Maria Y. Markarova, and Sergey V. Kalyuzhnyi. Application of biopreparation "Rhoder" for remediation of oil polluted polar marshy wetland in Komi Republic // Environment International. 2005. - V. 31. - P. 163-166.

19. Murygina, V., Markarova M., Kalyuzhnyi S. Experience of preparation "Rhoder" applications for bioremediation of oil-polluted polar marshy wetland in Komi Republic // Proc. 8th Int. Biorem. Symp. Baltimore, USA. - 6-9 June 2005. - V. 1. - P. 290 - 294.

20. Ouyang Wei, Liu Hong, Murygina V., Yu Yongyong, Xiu Zengde, Kalyuzhnyi S. Comparison of bio-augmentation and composting for remediation of oily sludge: A field-scale study in China // Proc. Biochem. 2005. - V. 40. - P. 3763-3768.

21. Коронелли T.B., Комарова Т.И., Игнатченко A.B. Взаимодействие псевдомонад и микобактерий в смешанной культуре при окислении углеводородов // Микробиология. -1984. Т. 53. - №. 2. - С. 213 - 217.

22. Гусев М.В., Коронелли Т.В., Королев Ю.Н. Изучение динамики накопления и утилизации углеводородов клетками Mycobacterium paraffinicum с помощью ИК-спектроскопии // Микробиология. 1978. - Т. 47. - №. 6. - С.1025 - 1029.

23. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Игнатченко А.В. Роль эмульсификаторов в адсорбции углеводородов клетками Pseudomonas aeruginosa II Микробиология. 1983. - Т. 52. - №. 1. - С. 94 - 97.

24. Коронелли Т.В., Калюжная Т.В. Изменение в структуре сапрофитных микобактериальных клеток под действием изоназидов // Микробиология. 1983. - Т. 52. -№. 2. - С. 278 - 282.

25. Golovleva L.A., Aliyeva R.M., Naumova R.P., Gvozdyak, P.I. Microbial bioconversion of pollutants // Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 1992. - V. 124. - P. 41 -78.

26. Скрябин Г. К., Головлева JI. А. Биотехнология очистки окружающей среды от ксенобиотиков. //Изв. АН СССР: Сер. Биологическая. 1986. - № 6. - С. 805 - 813.

27. Ротмистров М.Н., Гвоздяк П.И., Ставская С. С. Микробиологическая очистка воды. -Киев: Наук. Думка. 1978. - 266 с.

28. Квасников Е. И., Клюшникова Т. М. Микроорганизмы деструкторы нефти в водных бассейнах. - Киев: Наук, думка. - 1982. - 132 с.

29. Goodfellow М. Numerical taxonomy of some nocardioform bacteria // J. Gen. Microbiol. 1971.-V. 69.-№. l.-P. 33 80.

30. Broughton R. E., Wilson H. D., Goodman N. L. Septic arthritis and osteomyelitis caused by an organism of the genus Rhodococcus II J. Clin. Microbiol. 1981. - V. 13. - P. 209 - 213.

31. Нестеренко О. А., Ногина Т. M., Квасников Е. И. Циклы развития некоторых коринеподобных и нокардиоподобных бактерий // Микробиология. 1978. Т. 49. - № 6. -С. 952 - 959.

32. Rowbotham Т. J., Cross Т. Rhodococcus coprophilus sp. no v.: an aerobic nocardioform actinomycete belonging to the rhodochrous complex II J. Gen. Microbiol. 1977. - V. 100. - P. 123 - 138.

33. Красильников H. А., Коронелли Т. В., Калюжная Т. В. Окрашенные парафинокисляющие микобактерии // Микробиология. 1972. - Т. 41. - № 3. - С. 513 - 516.

34. Daisuke Кота, Yuichi .Sakashita, Kenzo Kubota, Degradation of car engine oil by Rhodococcus sp. NDKK48 and Gordonia sp NDKY76A // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003. -V. 67.-№. 7.-P. 1590-1593.

35. Pommier M.T., Mishael G. Isolation and characterization of an O-methylglucose-containing lipopolysaccharide produced by Nocardia otitidis-caviarum // J. Gen. Microbiol. 1986. - V. 132.-№. 9.-P. 2433 -2441.

36. Rapp P., Bock H., Wrai V., Wagner F. Formation, isolation and characterization of trehalose dimycolates from R. erythropolis grown on n-alkanes // J. Gen. Microbiol. 1979. - V. 115. - P. 491 -503.

37. Батраков С.Г., Мухитдинова О.А., Бергельсон Л.Д., Коронелли Т.В. Липиды микобактерий. Аналог корд-фактора с нормальными С12 С16 -жирными кислотами из Mycobacterium paraffinicum II Биоорган. Химия. - 1979. - Т. 5. - С. 1495 - 1503.

38. Luz М., Paje F., Neilan В.A., Couperwhite I. A Rhodococcus species that thrives on medium saturated with liquid benzene 11 Microbiology. 1997. - V. 143. - P. 2975-2981.

39. Квасников E. И., Нестеренко О. А., Романовская В. А., Касумова- С. А. Микроорганизмы родов Nocardia и Micobacterium, использующие природные и индивидуальные газообразные углеводороды // Микробиология. -1971. Т. 40. - № 2. - С. 280-288.

40. Steffen Т., Hatakka A., Hofrichter М. Degradation of benzoa.pyrene by the litter-decomposing basidiomycete Stropharia coronilla: role of manganese peroxidase. // American Society for Microbiology. 2003. - V. 69. - №. 7. - P. 3957-3964.

41. Habe H., Omori T. Genetics of Polycyclic Aromatic hydrocarbon metabolism in diverse bacteria. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003. V. 67. P. 225-243.

42. Grund E., Denecke В., Eichenlaub R. Naphthalene degradation via salicylate and gentisate by Rhodococcus sp. Strain B4 // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V. 57. - P. 3462-3469.

43. Muller J.G., Chapman P.J., Pritchard P.H. Isolation and characterization of a fluoranthene-utilizing strain of Pseudomomas paucimibilis II Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56. - №. 6.-P. 1079-1086.

44. Weissinfels W.D., Beyer M., Klein J. Degradation of phenanthrene, fluorine and fluoranthene by pure bacterial cultures. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. - V. 32. - P. 479484.

45. Komatsu T., Omori T., Kodama T. Microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons acenaphthene and acehaphthylene by a pure bacterial culture // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1993. - V. 57. - P. 864-865.

46. Ellis B., Harold P., Kronberg H. Bioremediation of a creosote contaminated site // Environ. Technol. 1991. -V.12. - P. 447-459.

47. Holt J., Ilothem S., Howerlon H., Larson R. 9,10-Phenanthrenequinone Photoautocatalyzes its Formation from Phenanthrene, and Inhibits Biodégradation of Naphthalene // J. Environ. Quality. 2005. - V. 34. - P. 462-468.

48. Barclay C. D., Farquhar G. F., Legge R. L. Biodégradation and sorption of polyaromatic hydrocarbons by Phanerochaele chrysosporium 11 Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. - V. 42. -P. 958-963.

49. Bouchez M., Balanchet D., Besnainou B. Kinetic studies of biodégradation of insoluble compounds by continuous determination of oxygen consumption. // J. Appl. Microbiol. 1997. -V. 82.-P. 310-316.

50. Jonathan W. C. Wong, Min Fang, Zhenyong Zhao, Baoshan Xing. Effect of surfactants on solubilization and degradation of phenanthrene under thermophilic conditions. // J. Environ. Quality. 2004. - V. 33. - P. 2015-2025.

51. Stefan J. Grimberg, William T. Stringfellow, Michael D. Aitken. Quantifying the biodégradation of phenanthrene by Psendomonas stutzeri P16 in the presence of a nonionic surfactant. //Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V. 62. - №. 7. - P. 2387-2392.

52. Boonchan S., Margaret L. B., Grant A. S. Degradation and mineralization of high-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by defined fungal-bacterial cocultures. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. - V. 66. - №. 3. - P. 1007-1019.

53. Sepic E., Bricelj M., Leskovsek H. Biodégradation studies of polyaromatic hydrocarbons in aqueous media. //J. Appl. Microbiol. 1997. - V. 83. - P. 561-568.

54. Heath D.J., Lewis C.A., Rowland S.J. The use of high temperature gas chromatography to study the biodégradation of high molecular weight hydrocarbons // Org. Geochem. 1997. - V. 26. - №. 11-12. - P. 769-785.

55. Setti L., Lanzarini G., Pifferi P.G., Spagna G. Further research in the aerobic degradation of n-alkanes in a heavy oil by a pure culture of Pseudomonas sp. // Chemosphere. 1993. - V. 26. -№. 6.-P. 1151 - 1157.

56. Sharma S.L., Pant A. Biodégradation and conversion, of alkanes and crude oil by a marine Rhodococcus sp II Biodégradation. 2000. - V. 11. - P. 289 - 294.

57. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий. M.: "Мир". - 1982. - 310 с.

58. Maeng J.H., Sakai Y., Tani Y., Kato N. Isolation and characterization of a novel oxygenase that catalyzes the first step of n-alkane oxidation in Acinetobacter sp. strain M-l // J. Bacteriol. -1996. V. 178. - №. 13. - P. 3695 - 3700.

59. Vasu R. Parekh, Traxler R. W., Sobek J. M. N-Alkane oxidation enzymes of a Pseudomonas II Appl. Environ. Microbiol. 1977. - V. 57. - №. 4. - P. 881 - 884.

60. Sutherland J.B., Selby A.L., Freeman J.P., Evans F.E. Metabolism of phenanthrene by Phanerochaete chrysosporium II Appl. Environ. Microbiol. 1991. - V. 57. - №. 11. - P. 3310 -3316.

61. Chi Ming So, Young L.Y. Initial reactions in anaerobic alkane degradation by a sulfate reducer, Strain AK-01 // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. - №. 12. - P. 5532 - 5540.

62. Young L.Y., Phelps C.D. Metabolic biomarkers for monitoring in situ anaerobic hydrocarbon degradation // Environmental Health Perspectives. 2005. - V. 113. - №. 1. - P. 62 - 67.

63. Cheng Q., Thomas S.M., Kostichka K., Valentine J.R., Nagarajan V. Genctic Analysis of a Gene Cluster for Cyclohexanol Oxidation in Acinetobacter sp. Strain SE 19 by In Vitro Transposition // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - №. 17. - P. 4744 - 4751.

64. Tadashi F., Tatsuya N., Koji T., Junichi K. Biotransformation of various alkanes using the Escherichia coli expressing an alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF6 // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2004. - V. 68. -№. 10. - P. 2171 - 2177.

65. Bugg T.D.H., Winfield C.J. Enzymatic cleavage of aromatic rings: mechanistic aspects of the catechol dioxygenases and later enzymes of bacterial oxidative cleavage pathways // Nat. Prod. Rep. 1998.-V. 15. - №. 5. - P. 513 - 530.

66. Asturias J.A., Timmis K.N. Three different 2,3-dihydroxybiphenyl 1,2-dioxygenase genes in the gram-positive polychlorobiphenyl-degrading bacterium Rhodococcus globerulus P6 // J. Bacteriol. 1993.-V. 175.-P. 4631 -4640.

67. Bumpus J.A., Tien M., Wright D., Aust S.D. Oxidation of persistent environmental pollutants by a white rot fungus // Science. 1985. - V. 228. - №. 21. - P. 1434 - 1436.

68. Cerniglia C.E., Freeman J.P., White G.L., Heflich R.H., Miller D.W. Fungal metabolism and detoxification of the nitropolycyclic aromatic hydrocarbon 1-nitropyrene // Appl. Environ. Microbiol. 1985. - V. 50. №. 3. - P. 649 - 655.

69. Cerniglia C.E., White G.L., Heflich R.H. Fungal metabolism and detoxification of polycyclic aromatic hydrocarbons // Arch. Microbiol. 1985. - V. 143. №. 2. - P. 105 - 110.

70. Haak B, Fetzner S., Lingens F. Cloning, nucleotide sequence, and expression of the plasmid-encoded genes for the two-component 2-halobenzoate 1,2-dioxygenase from Pseudomonas cepacia 2CBS // J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - №. 3. - P. 667 - 675.

71. Haemmerli S.D., Leisola M.S.A., Sanglard D., Fiechter A. Oxidation of benzo(a)pyrene by extracellular ligninase of Phanerochaete chrysosporhm II J. Biol. Chem. 1986. - V-. 261. - P. 6900 - 6903.

72. Mason J. R., Cammack R. The electron-transport proteins of hydroxylating bacterial dioxygenases // Annu. Rev. Microbiol. 1992. - V. 46. - P. 277 - 305.

73. Massey V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins // J. Biol. Chem. -1994. V. 269. - №. 36. - P. 22459 - 22462.

74. Nakatsu C.H., Wyndham R.C. Cloning and expression of the transposable chlorobenzoate-3,4-dioxygenase genes of Alcaligenes sp. strain BR60. // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59. -№ 11.-P. 3625-3633.

75. Neidle E.L., Hartnett C., Ornston L.N. Characterization of Acinetobacter calcoacelicus catM, a repressor gene homologous in sequence to transcriptional activator genes // J. Bacteriol. 1989. -V. 171,-№ 10.-P. 5410 - 5421.

76. Van der Meer J.R. Evolution of novel metabolic pathways for the degradation of chloroaromatic compounds // Antonie van Leeuwenhoek. 1997. - V. 71. № 1 - 2. - P. 159 - 178.

77. Rabus R., Kube M., Beck A., -Widdel F., Reinhardt R. Genes involved in the anaerobic degradation of ethylbenzene in a denitrifying bacterium, strain EbNl // Arch. Microbiol. 2002. -V. 178. №. 6. - P. 506- 516.

78. Kanaly R.A., Harayama S. Biodégradation of high-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by bacteria // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - №. 8. - P. 2059-2067.

79. Loh K.C., Chua S.S. Ortho pathway of benzoate degradation in Pseudomonas putida: induction of meta pathway at high substrate concentrations // Enzyme Microb. Technol. 2002. -V. 30. - P. 620 - 626.

80. Dagley S. A biochemical approach to some problems of environmental pollution // Essays Biochem. 1975. - Y. 11. - P. 81 - 138.

81. Davies J.I., Evans W.C. Oxidative metabolism of naphthalene by soil pseudomonads. The ring-fission mechanism // Biochem. J. 1964. - V. 91. - P. 251-261.

82. Ensley B.D., Gibson D.T. Naphthalene dioxygenase: purification and properties of.a terminal oxygenase component// J. Bacteriol. 1983. - V. 155. - №. 2. - P. 505-511.

83. Ensley B.D., Gibson D.T., Laborde A.L. Oxidation of naphthalene by a multicomponent enzyme system from Pseudomonas sp. strain NCIB 9816 // J. Bacteriol. 1982. - V. 149. - №. 3. - P.948-954.

84. Grund E., Denecke B., Eichenlaub R. Naph- other carriers for encapsulation of microbial cells thalene degradation via salicylate and gentisate by Rhodococcus sp. strain B4 // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V. 58. - №. 6. - P. 1874-1877.

85. Monticello D. J., Bakker D., Schell M., Finnerty W. R. Plasmid-borne Tn5 insertion mutation resulting in accumulation of gentisate from salicylate // Appl. Environ. Microbiol. -1985,-V. 49.-№.4.-P. 761-764.

86. Jimenez J.I., Miñambres B., García J.L., Díaz E. Genomic analysis of the aromatic catabolic pathways from Pseudomonas putida KT2440. // Environ. Microbiol. 2002. - V. 4. - №. 12. - P. 824-841.

87. Dean-Ross D., Moody J.D., Freeman J.P., Doerge D.R., Cerniglia C.E. Metabolism of anthracene by a Rhodococcus species // FEMS Microbiol. Lett. 2001. - V. 204. - P. 205-211.

88. Samanta S.K., Chakraborti A.K., Jain R. K. Degradation of phenanthrene by different bacteria: evidence for novel transformation sequences involving the formation of 1-naphthol. // Appl Microbiol Biotechnol. 1999. - V. 53. - №. 1. - P. 98-107.

89. Heitkamp M.A., Freeman J.P., Miller D.W., Cerniglia C.E. Pyrene degradation by a Mycobacterium sp.: identification of ring oxidation and ring fission products. // Appl. Environ. Microbiol. 1988. - V. 54. - №. 10. - P. 2556-2565.

90. Van Hamme D. J., Singh A., Ward O.P. Recent advances in petroleum microbiology. // Microbiology and Molecular. Biology Reviews. 2003. - V. 67. - №. 4. - P. 503-549.

91. Cerniglia C.E., Althaus J.P., Evans F.E., Freeman J.P. Fungal metabolism of acenaphthene by Cunninghamella elegcms. II Chem. Biol. Interact. 1983. - V. 44. - №. 1-2. - P. 119-132.

92. Cerniglia C.E., Campbel W.L., Freeman J.P., Fu P.P. Evans F.E. Stereoselective fungal metabolism of methylated anthracenes. // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56. - №. 3. - P. 661-668.

93. Cerniglia C.E., Yang S.K. Enantiomeric composition of the ¿rcms-dihydrodiols produced from phenanthrene by fungi // Appl. Environ. Microbiol. 1984. - V. 47. - №. 1. - P. 119-135.

94. Field J.A., de Jong E., Feijoo Costa G., de Bont J.A.M. Biodégradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by new isolates of white-rot fungi. // Appl. Environ. Microbiol. 1992. -V. 58.-№.7.-P. 2219-2226.

95. Hammel K.E., Gai W.Z., Green В., Moen M.A. Oxidative degradation of phenanthrene by the ligninolytic fungus Phanerochaete chrysosporium. II Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V. 58. -№. 6. - P. 1832.

96. Muyzer G., Brinkhoff N., Nubel U., Santegoeds C., Shaffer H Wawer C. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) in microbial ecology. In.: Molecular microbial ecology manual. Kluver Academic Publishers. The Netherlands. - 1997. - P. 1 - 27.

97. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментпого анализа. М.: Изд. Высш. Шк. - 1991. - 288 с.

98. Ившина И. Б. Экспрессные методы диагностики углеводородокисляющих родококков // Экология, человек и проблемы охраны природы. УНЦ АН СССР. - 1983. - С. 44 - 56.

99. Ouchterlony О. Gel Diffusion Techniques. // In: Immunological methods. Oxford, Blackwell, London. - 1964. - V. 16. - P. 55-78.

100. Mancini G., Carbonara A., Heremans G. Immunological quantitation of antigens by single radial immunodiffusion. // Immunochemistry. -1965. -V. 2. № 3. - P. 235-254.

101. Колычев Н.М., Госманов Р.Г. Ветеринарная микробиология и иммунология. М.: Изд. Колосс. - 2003. - 432 с.

102. Ившина И.Б., Кеворков Н.Н., Коблова И.В. Идентификация бактерий рода Rhodococcus, используя метод иммунодиффузии // Микробиология. 1982. - Т.51. - №. 4. -С. 636 - 641.

103. Ившина И.Б., Коблова И.В., Безматерых Г.И. Идентификация бактерий рода Rhodococcus с помощью метода иммунодиффузии // Микробиол. Журн. 1986. - Т.48. - № 2.-С. 8- 13.

104. Ившина И.Б., Пшеничнов Р.А., Кеворков Н.Н. Антигенная структура родококков, культивированных на различных средах // Микробиология. 1985. - Т. 54. - №. 2. - С. 290 -292.

105. Ившина И.Б., Гвоздяк О.Р., Богомягкова О.А., Шкаруба В.В. Использоваение метода иммунодиффузионного анализа для определения штаммов микрококков // Микробиология. 1995. - Т. 64. - №. 1. - С 78-82.

106. Gillis Т.Р., Thompson J.J. Double-Label Fluorescence Immunoassay of Bacteria // J. Clin. Microbiol. 1978. - V. 8. - № 3. - P. 351-353.

107. Барбан П.С., Пшеничков P.A., Пантюхина A.H., Ившина И.Б. Иммунофлуоресцентный анализ. Свердловск: УрО РАН. - 1988. - 175 с.

108. Плешакова Е.В., Матора Л.Ю., Никифоров Н.В. Интродукция нефтеокисляющих микроорганизмов в почву // Материалы Международной Конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», Россия. 14-16 сентября 2005.-С. 87-88.

109. Brigmon R.L., Bitton G., Zam S.G., O'Brien В. Development and application of a monoclonal antibody against Thiothrix spp. II Appl Environ. Microbiol. 1995. -V. 61. - № 1. -P. 13-20.

110. Watanabe K., Hino S. Identification of a functionally important population in phenol-digesting activated sludge with antisera raised against isolated bacterial strains // Appl Environ. Microbiol. 1996. -V. 62. - № 10. - P. 3901-3904.

111. Рыбак Б.М. Анализ нефти и нефтепродуктов. М.: Гостоптехиздат. 1962. - 888 с.

112. Скляр В. И. Биокаталитические системы получения водорода и метана: Дис. канд. хим. наук. Фрунзе: Институт органической химии АН Киргизской ССР. - 1987. - 154 с.

113. Р. Дорсон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. Справочник биохимика. М.: Мир. -1991.- 543 с.

114. С. Д. Варфоломеев, С.В. Калюжный. Биотехнология: Кинетические основы микробиологических процессов. М.: Высш. Шк. - 1990. - 295 с.

115. Birnboim НС, Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA //Nucleic Acids Res. 1979. - V. 7. - №. 6. - P. 1513-1523

116. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing. Nucleic acid techniques in bacterial systematics. -chichester UK: Academic Press. 1991. - P. 115-175.

117. Sanger F., Nicklen S., Coulsen A.R. DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. 1977. - V. 74. - P. 5463-5467.

118. Незлин P.C. Строение и биосинтез антител. М.: Наука. - 1969. - С. 65-93.

119. Опытно-промышленный регламент на производство препарата-нефтедеструктора Родер 7113020480 11- 05. Москва 2005 г.