Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности формирования резистентности к антибиотикам тетрациклинового ряда у урогенитальных микоплазм, персистирующих в организме человека

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тараскина, Анастасия Евгеньевна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы. Адаптационные потенции урогенитальных микоплазм к антибактериальным препаратам.

1.1. Общая характеристика микоплазм урогенитального тракта.

1.1.1. История открытия, филогенетическое положение микоплазм и классификация.

1.1.2. Структурно-функциональные особенности молликут.

1.1.2.1. Морфологическая характеристика.

1.1.2.2. Возможности метаболизма (биосинтетические свойства).

1.1.2.3. Некоторые аспекты геномики молликут.

1.1.2.4. Феномен антигенной изменчивости микоплазм.

1.1.3. Распространенность молликут в природе.

1.1.3.1. Микоплазменные заболевания человека.

1.1.3.2. Урогенитальные микоплазмы - как условно-патогенные микроорганизмы.

1.2. Феномен антибиотикорезистентности микроорганизмов в клинической практике.

1.2.1. Механизмы возникновения устойчивости к основным группам антимикробных агентов, используемых для элиминации молликут.

1.2.1.1. Некоторые аспекты появления тетрациклиновой резистентности у микоплазм.:.

1.2.1.2. Формирование антибиотической сопротивляемости в отношении препаратов MLS-группы и фторхинолонового ряда.

1.3. Микробиоценоз урогенитального тракта - как динамически лабильная система.

1.3. [.Функциональное значение основных групп микроорганизмов, потенциально регистрируемых в профиле микрофлоры половых путей.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Клиническая характеристика обследованных женщин.

2.2. Особенности методики исследования.

2.3. Антибактериальные препараты.

2.4. Схема выделения в культуре клинических изолятов урогенитальных микоплазм.

2.5. КультивированиеМ.кот1т$.

2.6. Культивирование и.игеЫуИсит.

2.7. Бактериологический анализ.

2.8. Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК).

2.9. Культивирование клеток линии McCoy.

2.10. Выделение ДНК из культур микроорганизмов, колонизирующих урогенитальный тракт человека.

2.11. Определение различных фрагментов конъюгативного транспозона Тп916 с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.12. ПЦР-анализ идентификации М.hominis и U.urealyticum.

2.13. Анализ аллельного полиморфизма tetM детерминанты.

2.14. Метод определения полиморфизма ДНК при амплификации с произвольным праймером (RAPD).

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Феномен резистентности к антибактериальным препаратам клинических изолятов Mycoplasma hominis, установленный среди пациенток Санкт-Петербурга.

3.2. Характеристика аллельного полиморфизма (мозаичности) гена tetM клинических изолятов М.hominis, устойчивых к антибактериальным агентам тетрациклинового ряда.

3.3. Определение основных закономерностей дрейфа tetM детерминанты (in vivo) в микробиоценозе урогенитального тракта с участием микоплазм при действии антимикробного агента тетрациклинового ряда.

3.3.1. Общие тенденции трансформации микробиоценоза урогенитального тракта при действии тетрациклинов.

3.3.2. Основные предпосылки переноса tetM детерминанты в клетки молликут.

3.3.3. Случаи (феномены) формирования резистентности к воздействию тетрациклинов in vivo за счет механизмов, альтернативных генетическому переносу tetM детерминанты.

3.4. Особенности адаптации микоплазм к воздействию тетрациклинов in vitro при разных условиях культивирования.

3.5. Оценка изменчивости генома M.hominis при длительной персистенции микоплазм в организме человека.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Закономерности формирования резистентности к антибиотикам тетрациклинового ряда у урогенитальных микоплазм, персистирующих в организме человека"

Актуальность проблемы. Молликуты (микоплазмы) - самые малые из известных микроорганизмов, способных к самостоятельному воспроизведению, наиболее просто организованные прокариоты. Все микоплазмы, встречающиеся в природе, являются комменсалами или паразитами человека, животных, насекомых и растений. По уровню структурной организации микоплазмы можно было бы поместить между вирусами и бактериями, но таксономически микоплазмы отнесены к бактериям (класс Mollicutes). В отличие от большинства бактерий микоплазмы лишены клеточной стенки и не способны синтезировать ее биохимические предшественники. В процессе эволюции молликуты приспособились к тесному сосуществованию с клетками высших эукариот, паразитируя как на мембране, так и в цитоплазме клеток. Микоплазмы располагают, вероятно, минимальным для бактерии количеством генетической информации и, соответственно, минимальным количеством метаболических путей, что определяет их зависимость от клеток высших организмов. Несколько видов микоплазм являются патогенами человека. Они ассоциированны с рядом физиологических расстройств и заселяют, главным образом, слизистые поверхности урогенитального и респираторного трактов. При некоторых состояниях организма человека микоплазмы способны вызывать выраженные патологические изменения воспалительного характера с формированием персистирующей инфекции, которой часто присуще бессимптомное (торпидное) течение с выраженными аутоиммунными осложнениями (Christiansen G. et al., 1997; Razin S. et al., 1998; Раковская И.В. и др., 2000).

В практике акушерства и гинекологии наиболее часто встречаются два вида микоплазм - Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis. Все молликуты урогенитального тракта человека относятся к условно патогенным. В настоящее время доказана этиологическая роль данных микроорганизмов при таких патологических процессах как хронические неспецифические заболевания урогенитального тракта (негонококковые уретриты, вагиниты) (Taylor-Robinson D., Furr P.M., 1997; Прозоровский С.В. и др., 1995). При лечении вагинозов, ассоциированных с присутствием урогенитальных микоплазм, «антибиотиками выбора» традиционно считаются препараты тетрациклинового ряда. Эти антимикробные агенты являются наиболее эффективными, приносящими минимальный вред организму человека побочным действием, и широко используются в терапии микоплазмозов.

За последнее десятилетие возросло относительное количество клинических изолятов урогенитальных микоплазм, устойчивых к антибиотикам тетрациклинового ряда. Кроме того, возросла минимальная ингибирующая концентрация (МИК) тетрациклина, доксициклина и клиндамицина для клинических изолятов M.hominis и U.urealyticum (Cumming М.С., McCormack W.M., 1990; Roberts M.C., 1990; Цой Е.Г. и др., 1999).

Приобретение микоплазмами (как и другими микроорганизмами) резистентности к антибиотикам тетрациклинового ряда исследователи до настоящего времени объясняют естественной трансформацией микоплазм -горизонтальным переносом детерминанты резистентности tetM в составе конъюгативного транспозона Тп916 от устойчивых к тетрациклинам бактерий-доноров. Продукт гена tetM связывается с ЗОБ-субъединицей рибосомы, предотвращая взаимодействие с ней тетрациклина, но при этом не мешает взаимодействию аминоацил-тРНК со специфическим участком рибосомы -таков один из известных молекулярных механизмов возникновения устойчивости бактерий к тетрациклинам. Конъюгативный транспозон Тп916 широко распространен среди разных микроорганизмов, таких как стрептококки и бактероиды, и обнаружен также у вибрионов и энтеробактерий. В экспериментальных условиях он передаётся от клеток доноров к реципиентам с высокой частотой: 10"4- 10"5 на клетку на поколение (Poyart C.et al., 1995; Rice L.B., 1998). Известно, что микоплазмы также способны приобретать tetM детерминанту в составе Тп916 в результате их совместного культивирования с бактериями вида Enterococcus faecalis (Roberts M.C., Kenny G.E., 1987; Dybvig K., 1990). He все виды микроорганизмов могут выступать в роли доноров из-за ряда функциональных особенностей. Некоторые бактерии акцептируют в свой геном tetM без участков, ответственных за транспозиционые функции. Соответственно, они не имеют потенциальной возможности к дальнейшему распространению конъюгативных элементов.

Ранние исследования формирования резистентности к действию тетрациклинов у молликут заключались в следующем. В условиях in vitro определялись условия конъюгативного переноса транспозона Тп916 от бактерий доноров к реципиентам, в результате скрещивания (полового процесса), или изучалась трансформация клеток микоплазм плазмидами, содержащими транспозон Тп916, с использованием полиэтиленгликоля. Рассмотрение вопросов возникновения устойчивости к тетрациклинам в клинической практике были сведены только к скрининговым исследованиям распространенности tetM детерминант в урогенитальном тракте женщин или к определению МИК для клинических изолятов М.hominis или U.urealyticum.

Следует отметить, что эксперименты in vitro не позволяют оценить все факторы, влияющие на процесс передачи гена tetM, ответственного за возникновение толерантности к тетрациклинам, в клетки микоплазм, которые встречаются в естественных физиологических условиях (в микробиоценозе женщин). К числу таких факторов относятся: количество бактерий - доноров детерминант устойчивости, наличие воспалительного процесса на эпителиальных тканях, pH среды и другие возможные факторы. Кроме того, клинические наблюдения за исходом лечения, позволяют констатировать, что антибиотикотерапия, приводящая к клиническому выздоровлению, часто не связана с элиминацией возбудителя из организма, и следовательно, лишь способствует переходу острой формы инфекции в латентную.

Таким образом, предпосылки возникновения резистентности к антибактериальным препаратам тетрациклинового ряда у микоплазм, персистирующих в организме человека, не изучены в полной мере, поэтому их изучение продолжает быть актуальным. Мы предполагаем, что проведение мониторинга за персистирующими штаммами молликут в ходе антибиотикотерапии в условиях in vivo (в вагинальном биоценозе) позволит определить основные факторы формирования толерантности этих микроорганизмов к антимикробному воздействию.

Цель исследования: изучение закономерностей формирования резистентности к антимикробным агентам тетрациклинового ряда у Mycoplasma hominis in vivo.

В связи с этим необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить резистентность клинических изолятов M.hominis, выделенных от пациенток НИИ АГ им.Отта г.Санкт-Петербурга, к антибактериальным препаратам (тетрациклинового, фторхинолонового ряда и MLS-группы), наиболее широко используемых для элиминации микоплазм.

2. Охарактеризовать аллельный полиморфизм teiM (мозаичность гена tetM) у клинических изолятов M.hominis и выявить микроорганизмы-доноры конъюгативного транспозона, носителя гена teiМ.

3. Исследовать перенос teíM детерминанты в клетки урогенитальных микоплазм на фоне структурных изменений микробиоценоза вагины при лечении пациентов доксициклином.

4. Установить корреляцию между возрастанием минимальной ингибирующей концентрации (МИК) к препаратам тетрациклинового ряда и изменениями параметров культивирования клинических изолятов M.hominis в условиях in vitro.

5. Оценить изменчивость геномов M.hominis при длительной персистенции микоплазмы в организме человека с использованием метода определения полиморфизма геномной ДНК при амплификации с произвольным праймером (RAPD).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Тараскина, Анастасия Евгеньевна

выводы.

1. Выделены и охарактеризованы 138 клинических изолятов M.hominis. Феномен резистентности к антибактериальным препаратам широко распространен среди них: 19,6% - резистентны к тетрациклину, 5,1% -устойчивы к доксициклину, 36,9% - к спирамицину, 2,2% - к ципрофлоксацину и 2,9% - к азитромицину. Выявлено 10 случаев (7,2%) мультирезистентности. Адаптация микоплазм к более сильным агентам какой-либо (определенной) группы антибиотиков приводит к толерантности в отношении других препаратов этой группы.

2. Частота встречаемости изолятов M.hominis, несущих tetM детерминанту, обуславливающую резистентность к препаратам тетрациклинового ряда, составила 10,1% от общего числа изученных клинических образцов (138 случаев).

3. Изучен аллельный полиморфизм 13 tetM генов клинических изолятов M.hominis. Установлено, что tetM детерминанта, выделенная у данных молликут не похожа ни на один из описанных в литературе вариантов этого гена и имеет оригинальную (новую) мозаичность. Какой-либо определенный вид микроорганизма, выступающего в роли донора соответствующего транспозона для микоплазм, обнаружить не удалось.

4. Основные условия, при которых происходит перенос tetM детерминанты в клетки микоплазм в условиях in vivo (в биоценозе влагалища женщин, инфицированных M.hominis) состоят в следующем:

А - наличие в изучаемом микробиоценозе большого количества потенциальных доноров tetM детерминанты (22,0% - 42,2% от общего количества микроорганизмов вагинальной аутофлоры);

В - присутствие эукариотных клеток, с повышенной адгезией в отношении прокариот.

134

5. 80,95% персистирующих изолятов урогенитальных микоплазм, выделенных после лечения пациентов тетрациклинами, не содержали tetM. В связи с этим можно предположить возможность формирования устойчивости изучаемых микоплазм к тетрациклинам с участием других механизмов, альтернативных генетическому переносу детерминанты tetM.

6. При разных условиях культивирования in vitro показано, что присутствие эукариотных клеток - важный фактор возникновения резистентности к действию тетрациклинов у M.hominis. Действие этого фактора наиболее эффективно при полной зависимости метаболизма микоплазменной клетки от эукариотной.

7. У клинических изолятов M.hominis, выделенных в ходе наблюдения за пациентами с хронической инфекцией, при длительном персистировании в 75,0% случаев были зарегистрированы генетические вариации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тараскина, Анастасия Евгеньевна, Москва

1. Абрамычева Н.Ю., Вахрушева Т.В., Говорун В.М. 1999. Изменение свойств плазматической мембраны Acholeplasma laidlawii при действии тетрациклина. Антибиотики и химиотерапия. 44 (2): 8-12.

2. Абрамычева Н.Ю., Говорун В.М. 2000. Участие транспортно-барьерных функций плазматической мембраны в развитии резистентности к фторхинолонам (ципрофлоксацину) у Acholeplasma laidlawii. Антибиотики и химиотерапия. 5: 17-20.

3. Андреева Е.А., Васильев В.А. 2001. Изменчивость микроорганизмов в условиях гипербарической среды. Тезисы IV Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье». СПб: 10-11.

4. Анкирская А.Е. 1995. Бактериальный вагиноз. Акуш. и гинек. 6: 13-16.

5. Башмакова М.А. 1991. Микоплазменные инфекции генитального тракта человека. Вестник АМН., М., "Медицина". 6: 13-16.

6. Борисенко К.К., Тоскин И.А., Кисина В.И. 1999. О значении колонизации мочеполовых органов Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum. ИППП 3:28-31.

7. Борхсениус С.Н., Чернова О.А. 1989. Микоплазмы: молекулярная и клеточная биология, патогенность, диагностика. Л: Наука.

8. Вульфович Ю.В. 1991. Артригенность микоплазм и микоплазменные артриты человека. Вестник АМН., М., "Медицина". 6: 6-9.

9. Говорун В.М., Гущин А.Е., Ладыгина В.Г., Абрамычева Н.Ю, Тополь Ю.Ю. 1998. О формировании резистентности к фторхинолонам у М.hominis и A.laidlawii. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 3:16-19.

10. Каган Г.Я., Раковская И.В. 1968. Микоплазма инфекция в культуре ткани. М: Медицина.

11. Каменева С.В. 1998. Конъюгативные транспозоны бактерий. Генетика 34(1): 23-31.

12. Кира Е.Ф. 1994. Клиника и диагностика бактериального вагиноза. Акуш. и гинекол. 2: 32-35.

13. Клицунова Н.В., Быковский А.Ф., Смирнова Т.Д. и др. 1976. Вестн. АМН СССР. 5: 81-86.

14. Кононенко В В., Руденко А.А., Кругликова В.Т., Жаркова Л.Д. 1987. Роль микоплазмы пневмонии при менингитах и менингоэнцефалитах. Врач.дело. 3: 108-111.16