Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимосвязь фотосинтеза и дыхания у хлорофилльных мутантов гороха

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Взаимосвязь фотосинтеза и дыхания у хлорофилльных мутантов гороха"

к-9 и 9 ?

С|Ш^ПЕГ£ТБУРГСКНП ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На 1?равах рукописи УЖ 681.132:591.12

ВАЙ1Ш ОЛЬГА борисовна

ВЗАИМОСВЯЗЬ 40г0сикгеза и дыхания у хлороодшшх иутакгов гороха

специальность 03.00.12 - фнэнояогия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на сокскдннэ учёноЯ степени кандидата биояогипэских нлуп

САШ ПЕТЕРБУРГ - 1992'

1'вбота выполнена в лаборатории фотосинтеза научно-исследовательского. института биологии и биофизики Томского государственного университета «'■

Нлучныэ руководители: кандидат биологически паук,ст.н.с.

Т.П.АСТАФУРОМ

кандидат биэлопгсгсмк наук,ст.н.с. . В.А.СОКОЛОВ

Спиральные оппонента: доктор биояогачаеких наук

0.Д.БУКОВ

кандидат Спологпзэсгл». нпух,с?.зг.с.

н.с.илшмм

Вэдуцов учрегдеине: Институт почвоведения и фотоекитеза Российской Дкадекии Наук

Защита диссертация состоятся года а

-— час. «а заседании специализированного совета К.063.57. 12 по защите диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологически наук в Санкт-Петербургском государст-1/я!Шоа университете ( 199164, Санкт-Петербург, Университет-с ля набережная, 7/9).

Г- диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского университета

$ /v " »

Автореферат разослан 1992 года.

Учёный•секретарь специализированного совета, л

•^■щидат биологических наукВ.Ермилова

■ ."" ff л ci > "КГ, "

" ~ ГОСГДАРСТ вВДНАЯ ' г--!

ОБЩАЯ ХВЖШШДОА РАБОТЫ..... ~ '—

Актуальность гтроблрин. Среди работ по изучению физиолого-биохимических аспектов продуктивности растений вопрос о взаимосвязи фотосинтеза и дахвлия в йссюшлнрупцей клетке остаётся слабо изученным.Решение данной проблемы осложняется тем,что до конца не ясно,как работают отдельные этапы дыхания в освещенных листьях растений.Если функционирование цикла Кребса считается доказанный (Верхотурова,1977;Kent,19?9; Заленский и др.,I9PI),то вопрос о работе других этапов дыхательного ыетаболиома-глхколиаа,окислительного пентозофосфатного пути.электрснтранспортноЯ цепи остаётся дискуссионны« (Lawtor , I987j3aehia et al. ,1968; Pancer, ар Наев. 1989;!1амуинна к др., 1991).Исследования передних лет показали многообразие внутриклеточных иеханизмов регуляции дыхания как на уровне ыетаболизьа, так и взаимодействия органелл в условиях,опти-дальних для фотосинтеза.Интересным является открытие явления « ohlororsepiration "(Räbers , 1983).регуяиругецвго действия фрукто-зо-2,6-йисфосфа?яPlack et al. ,1937),доказательство кодирования иитохондриальной ДНК больной оуб-ьедникцы Ру&$-кярбоЕСилазу( Douce, Eauburgar ( ¡969) п "переноса гемоз из хлоропластов в митохондрии, а кэ !л«озондрнЯ-э ядро(Уинчвняо,Дудар9га,1990),а тагав обнаруне-нка а пластидах тэг их фзригнтоа гливояиза я ОП*П( Kelly,Latsho, 1979; Савр,Роиз1оя ( 1Ш5; Stitt.ap Rtea, 1969,.

Оздахо нахопяекиыг п настояаегу врешни фактов недостаточно, птсЗи с фо jr-rj-т^р о ваг ь .обцуа коицегщиэ'о rax&mmtax взаимосвязи фотосинтеза и дгшнкя а асскагилирущей метко я оценить вклад а тих процессов а докечнуэ. продуктивность. Поэтов «вобходик поиск ко si к подходов дхл репен»« данной проблей* на раэлшгаа урокиях организации растзкиЯ.Перспевтнанни э этой плана является изучение аоно-rst6p!t®icro геуероэиса,полученного на основе норцадышх и иутант-нгос растек;:/?,поскольку изучение ьгеханизиов компенсаторных реакций со с т., роим дыхания на кедостатоз хлорофилла у цутантов и насл едования sa у гкЗрйдбп позволяет* приблизиться,с одной стороны,я пони-кан»яэ взаимосвязи фотосинтеза и гаания,а с другой. с?ороны-к вн~ " лскениз физнояого-бкохкмичесвагх причин высокой продуктивности гибридных растений.

Цель и задачи исследования. Цель настоя,;, "Й р^боты-изучение реакций дахатвл.<:ного иетвболизиа у расгзннй с изменённым фотоскн-тегкчееккы аппаратом к иеханизиов взаимосвязи данных процессов с фотосинтезон.В соответствии с этим были поставлены задачи:

I.Описать структурно--функцнональнш изменения фотосинтетп-

чаского аппарата разнопродуктивш растений гороха.

2Л1аучить активность ключевых ферментов отдельных отапов дыхательного шгтаболиэма.

3.Определить содержание основных метаболитов.

4,Выявить особенности взатаосвяэи фотосинтеза и дыхания у нормальных,нутантнъсс и гибридных растений.

5.Разработать принципы отбора родительских пор на гетероэис-ноо по: мство по фиэиолого-биохиыическим тестам.

Научная новизна.В отличие о г предыдущих исследований, которыа основывались на использования ызчеиык субстратов,ингибиторного анализа,газообмена,изменении физиологических условий,в данной работе впервые пр;шенён едгашй комплексный фиэиолого-генеткческий подход к изучении причш различной фотосинтеткческой и дыхательной активности,а такке взаимосвязи зтст процессов у гибридные и кутантных растений гороха.

Впервые проанализировано влиянии структурно-^шционаяькьк изменений фотосннгетического аппарата на отдельные этапы тскиово-го дыхания у растений,различающихся по продуктивности.

Установлено,что низкопродуктивный ¡.¡утаит 2014 характеризуется низкоэнерги'лгческкм типом обмена,а высокопродуктивный гибрид 2004ХТ-ыаксимальньми скоростями первичных реакций фотосинтеза и высокой активностью ключевых ферментов не только фоюсгагтетнчес-еого.но и дыхательного метаболизма.

Пршщипиально вазаазл для понимания мех&низмоз саморегулирования жизнедеятельности растений является заключение о том, чш вошмообуслоалегетсть донорно-акцепторгих отношений фотосинтеза

дыхания в асснмилирупдей клетке ^'танткш; растений кгиясл'сл тг— "•' .л образо14,что в условиях лонигеиноЯ фотомытеимеской 'Сункцин г-?"чппа становится дополнительным нстсчиллсм АТ4,СОо,восстй1{02И- ■ /-:ля и ниопоколекуяярннх соедкяеш1й,кеобход!шх;: для бкссиигсти-Ч2ских процессов. '

Практическая значимость .Получскчыз рсзу&ндои г&гуг бсгь использованы в качества разработки тестов ио^ протооз1фовашэ гегеро-зисного эффекта на ранних стадия;; развития растений.Суцзствошиио качвствзнньк компенсаторных изкоиоиий о даздтельиш кстабслксиз у Ы 2004 и наследование юс гибридами позволяет рекомендовать для получения продуктивных фор»! подбирать родительские пары чаша образом,чтобы в гибридных клэтяах высокие фотоскнтетическая и длительная активности соотносились как 1:1.

|Апробвлил работы.Материалы диссертации докладывались-и обсув-

дались на научных семинарах отдела молекулярной биологии НИИ биологии и биофизики Томского гойуниверситега, отдела фотобиотегнологии Института, почвоведения и фотосинтеза РАН (г.Пущино), на заседании кафедры физиологии растений Санкт-ГТетербургского госуниверситета; на региональной (Уфа,1987) и III,1У Всесоюзных конференциях молодых учёных (Петрозаводск, 1988;№шск, 1990); на I Всесоюзном совещании "Использование изогенных линий в селекционно-генетических экспериментах" (Новосибирск,1990); на У Международной школе-конференции "Регуляция метаболизма в растениях" (Варна,-1990); на II съезде B0SP (Минск,1990); на Международной конференции "Фотосинтез и фотобиотехнология" (Цущино,1991).

Публикации.По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объём диссертации.Диссертация состоит из введения, четырёх глав, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 300 наименований, приложения. Работа представлена на 205 страницах машинописного текста, включает 23 таблицы и 22 рисунка .

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I представляет собой обзор литературы, обобщающий данные по функционированию и регуляции гликолиза, О ГШ, цикла Кребса и злектронтранспортной'цепи в зелёных листьях растений, а также рассмотрены физйолого-биохимические и молекулярно-генетические аспекты взаимосвязи фотосинтеза и дыхания.

Глава II содержит описание материала и методик исследования. В работе использовали хлорофилльныз мутанты из коллекции К.К.Сидоровой (г.Новосибирск), индуцированные под действием этиленими-на из гороха сорта Торсдаг. Гибриды М2004ХТ получали, опыляя кастрированные цветки мутанта пыльцой нормальных растений. Урожай зерна составлял-у М 2014 3-5$ от'контроля, у -И 2004 '- 20-30$, у гибрида'- 120-140^. Полевые опыты проводили на экспериментальном участка Сибирского Ботанического сада в 1988-91 гг. согласно arpo- ■ техническим требованиям при закладке селекционно-ге». ических эксперйгентов. В лабораториях условиях растения выращивали в поч- . венной культуре при интенсивности освещения 40 • Ю эрг • см"^с с Ю-часота фстояерйбдсм." Для анализа брали одновозрастные развер- • нугзииеся лгстьп пэртгчзго междоузлия в 10 часов утра.

Содержание хлорофилла определяли в 100$ ацетоне( Lichtenther-lsr,{/ellbuxn ,1933), разделение каротиноидов-методом тонкослойной громатографии (Паклавуни,1978). Флуоресценции хлорофилла она- ■ визировали на установке ври-2 (Ладыгин,1986), спектры ЭПР - на

радиоспектрометре "FyßitH РЭ-1306" (Четвериков, 1983). Скорость циклического, нециклического фотофосфорил{1рования и реакции Хилла регистрировали потенциометрически (Nlshimuxe,1962; Заботил,1970),

Мезоструктуру листьев изучали при микроскопировании ыдцератос (Ыокроносов и др,,1980). С02~газообмен измеряли на газоанализаторе s>infralit-4", О^-газообман - на полярографе (Закржевский и др., 1987). Выделение клеточных структур проводили из свеаих листьев при +4°С методом дифференциального центрифугирования (Eathnan, Edwardа ,1975), чистоту фракций контролировали на фазово-контраст-ном микроскопе 1ЕБАУ-42.

Активность карбоксидирующих,ферментов и анаэробных дегндроге-иао определяли без специально!! очистки (Сарсенбаев, 1988) по иэие-нешю-оптической плотности при длине волны 340 нм (Астафурова, 1932;Юцбеков,1990). Содержание Сахаров измеряли ыикрсмэтодоы (Ермаков, 1972) , ашиокнелот-на автократическом анализаторе Т-339, бел-ка-по Брэдфорду, малата, лактата, пируьата - энзкмат1гчески( Cook, Laia;:reoht;,'j9?d)iiohorBt ,1970). Результаты исследования обработаны статистически с использованием критерия Стыоданта. Достоверными приняты различил при величина Р, не превьшапцей 0,05.

I')!ana III содержи? результаты окспвриментпльной рйботц и ышз-чавт два раздела. Раздел III Л • поссадгн описанию структурно-фунх-цноналших изменений фотосинтаткческого аппарата нораалыгыг, цу-тантних и 1Ч1йр:-дних растений гороха.

Измерение содержания пигментов показало, что светла-золёная окраска листьев мутантов обусловлена снижением содержания как суоми оорофидлов а и в, так и карогиноидов (табл.1).

Таблица I.

Содэраание Пигментов в лйстыяс гороха

Показатели Хд(а+в) кг на 1г Каротиноиаы сирой шссы ß -каротин ... __ В.юлак- СННТ.ИН____ от суц:х;

Торсдаг 1,88+0,03 0,59+0,04 32,9 ."18,7

Цуга...' 2004 1,45ТО,01 0,44+0,02 15,5 30,8

Мутант 204 ■ I,0b+0,03 0,31+0,л1 22,7 21,7

Гибрэд М2004ХТ 1,87+0,02. 0,59+0,01 26,1 .22,6

Более дета, ное изучение пигментного фонда выявило наличие у изучаемых вариантов всех известных спектральных форм хлорофиллов пигмент-белковых комплексов. Результаты исследования ниэкотемпера-

ШТ&ГГ 2014 ГИБРВД 2004 X ТОРСДАГ

к

»

§

м

о

е> &

г»

Й

ТОРСДАГ ЮТАНТ 2004

■ - о

Рис. 1.Спз:ггри низкотемпературной флуоресценции хяорофгма (-.-'о С)

лкстьез города

туркьк споктроз излучения ф,т/оресце!щж: показал:-! позягуи идентичность спектров гкбрвджд л ¡¡оитролыак растения (рпс,1). Однако э спектра И 2004 обнаружены оглкчия от кснтр' чя:осноина« полоса флуоресценции £С I (735 ну) сиещсиа а коротковолновую область на 7 км, п такзе увеличено её соечение. Изучение тонкой организации хлоропластов выявило чёткуа до. О риентацию гран у М 2004 вследствие рвдуцирсппннк агранальных тилиюидов, в то время как ультраструи-гуря глоропластоа гибрида и К? -.314 существенно не изменена по от-

3 I 3 4

iРис.2. Схематическое

"■ ■■.'.'■'■•J i '4''; ,

■ ■ <-• ' •'- - - - - •• изображение попереч-

vi с» (f Л5сг>_

''л НИХ срезов листьев

- ;v f>? ¿'-Ч v'^-^oX гороха: 5 TCFCДЛГ^ 6I-верхний эпидермис;

5 1ША1П 2004 2-нкжний эпидермис;

3-устьица;

4-столбчатая паренхима;

5-губчатая паренхима;

6-межклетники

ноаению к исходной форме. На основании этих фактов можно предполагать специфическое нарушение в структуре К I в хлоропластах М 2004, несмотря на то, что мегсдем гель-электрофореза было установлено наличие полного спектра хлорофилл-содержащих полос у всех вариантов. Спектр излучения флуоресценции Форш 2014 почти не отличается от кошеля, за исключением увеличения свечения полос 686 нм и 697 нм, принадлежащих фотосистеме II. Это может бить вызвано резким снижением содержания хлорофилла, а также нарушением взаимодействия светосборщика л реакционных центров.

Несмотря на сохранение всех пигмент-белковых комплексов в хлоропластах мутантов, Число реакционных центров у них значительно снижено по отношении к контроля, что коррелирует с уменьшением содержания ^-каротина (табл. 1,2). Гибридниё растения характеризуют-сп тенденцией к увеличению числа центров обета фотосистем к наибо-лй.-> сбалансированным соотношением их числа. Уменьшение числа реляционных центров $С I и iC II у ъ^утантов вызвало изменение в скорости первичных реакций фотосинтеза. Так,оказалось, что в изолированных хлоропластах мутантов скорость переноса электронов по цяк- . лкческому пути (Ц'й) снижается по сравнению с контроле».!,, но-при этом дефицит фотосинтегического АТФ частично компенсируется за счёт увеличения скорости нециклического фотсхфосфорилированип(НЦФФ), Отношение Р/2ё в хлоропластах М 2014, превышающее единицу, даёт основание предполагать у него существование дополнительных сопрягающих центров фосфорилирования.

Сравнительное изучение мезоструктуры листа показало, что у цутаитов число хлорофиллоносных клеток и число хлоропластою в вди-шще площади листа ниже контроля (табя.2;рис.2). По-видимому, это

Таблица 2.

Струптурпо-с^юцяопальная характеристика фотосинтетического аппарата листьев гороха.

клтель

Торсдаг Мутант 2004 Мутант 20.14

.Гибрид 2004КГ

Число реавд.итрсз '1-1 на 1г сир.ыассы

Число ргакл.^лтрзи =3 ИхЮ1^ Цзхлж^иос' •¿о-гс.р-уз, мхшоль АТЗ.кг Хл^"*

Нехргалжсскоз фотс5-:ге, -н -"

Реакция Хилла, :.ш«оль Зц-иг Хл^"1 Отношение Р/2з

11,00 9,24 353,4+18,3 329,1+8,1 571,4+21,3 0,58

3,78 ' 5,29 111,2+17,8 560,4+14,7 634,8+18,5 0,91

3,80 2,47 125,3+9,8 686,9+19,4 628,5+17,3 1,10

11,88 11,05 450,4+12,1 388,7+11,8 835,1+22,4 0,48

Число клеток, тыс.» см-^ о

Обгём клетки,тыс.шаг Число хлоропдастов в клетке

палисадная ткань 53,2+2,1

губчатая ткань 81,4+3,9

палисадная ткань 21,4+1,3

губчатая ткань 8,3+0,5

палисадная ткань 18,0+0,5

губчатая ткань 9,9+0,2 „ _о

Число -хлоропластоз в единице площади листа,гялн«си .

палисадная ткань 9,5+0,4

губчатая ткань 7,5+0,2

33,7+0,9 58,2+2,7 13,370,2 10,1+0,6 29,0+1,9 15,0+0,8

10,1+0,6 8,'6+0,4

36,8^2,9 58,1X2,2 24,1+1,4 9,8+0,7 15,1+0,4 9,6+0,2

5,3«),I 4,5+0,1

54,4+3,5 100,9+5,I 17,6+1,5 10,0+0,8 20,2+0,5 13,1+0,2

11,2+0,5 13,3+0,6

Активность РуБФ-карбоксилазы,Е на 1г сир.массы 5,54+0,24 10,19+0,33 8,87+0,43 6,1+0,19

ГАВД-НАД®2 -я -в -я 24,2+1,4 72,9^2,5 9,8+1,8 38,4+4,5

-я ФЕП-карбокеилази -я -3 1,15+0,08 2,44^0,13 1,83+0,09

_» -«вдг-ндданг -а -» 2,1+0,08 9,ОТО,И 4,4^0,02" 3,2+0,06

М2004ХТ является основной причиной снижения содер-ТОРСДАГ жания хлорофилла. Уве-

2004

личение числа реакционных центров у гибридов, максимальные скорости первичных реакций фотосинтеза,веро-

М 2014 ятно, можно объяснить

большей насыщенностью, по сравнению с контролем, хлоропластпмн единицы асеимилирупцей

-!>0-&-оО

интенсивность света,клк

поверхности. Это достигается наследованием

Рис.3.Световые кривые фотосинтеза листьев со стороны исходного

количества хлоропластов в них. Полученные данные о степени насыщенности хлоропластами единицы поверхности листа хорошо согласуются с повышением у гибрида и понижением у мутантов плато световой кривой фотосинтеза (рис.3). Слезет отметить, что уже при низком уровне освещённости у гибрида начинается поглощение &то может быть связано с активной работой ферментов фотосинтетического метаболизма (табл.2). У мутантов, по-пидимоцу, потенциальная карбок-силирукщая активность высока, но у М 2014 она не может быть реализована из-за дефицита фотопродуктов. У Ы 2004 активную работу ГАФД и МДГ, вероятно, можно объяснить существованием.дополнительных механизмов, поставляющих АГф и НАДХН.

Высокая карбоксилируицая активность РуБФ-карбоксилапы в листьях мутантных растений находится п противоречии с пониженными значениями основных фотосинтетических параметров. Возникает вопрос: каг ч образом поддерживается активность этого ключевого фермента цикла Кальвина?-.По-влдимому, для поддержания работы РуБФ-карбокси-лазы включаются различные механизмы регуляции, обеспечивающие подачу СО2 к центрам карбоксилирования. В свете идей о донсрно-ак-цепторных взаимоотношениях фотосинтеза и дыхания логично предположить, что наиболее вероятным источником, поставляющим АТФ и восстановитель в цикл Кальвина, являются реакции дыхательного

нормальных, мутантных и гибридных растений гороха

сорта нормального числа клеток, а от мутанта 2004 - повышенного

-Ю-

метаболизма.

Раздел II1.2 посвящен изучению дыхательного мотаболизма в листьях нормальных, мутантнь-х и гибридных растения гсроха.

О (функционировании'того или иного пути метаболизма сулят по многим показателям, в том число по содер*Анип субстратов и актиь-ности ключевых ферментов, по локализации энзима в определенном клеточном кокпартменте, где наблюдается его максимальная активность. Специальные исследования показали, что к числу маркёров гликолиза относятся фосфофруктокиняза, глицеральдогидфосфатдегидрогснапа (ГАФД) и пируваткинпза (ПК); окислительного пентозс|осфатного пути -глюкозо-б-фосфатдегндрогеназа (Р5ДГ) и б-/*юс|оглгконатдоглярор<:'иа-за; цикла Кребса-изоцитрлтдегндрогонаэа .ИДП ,сукцинатдегидрог<'ма-за и ыалатдегндрогьнаэа (МДГ).

Изучение активности ферментов дыхательного метаболизма показало высокую активность П'ДГ в листьях цутантных и гибридных растений, что свидетельствует о возможности функционирования- ОПГП при одновременно идущем ,?«тссинтезо (табл.З). Что касается гликолиза, то, судя по активности ГА2Д и ГЕС, ок активно работает у У 2С04 и гибрида. В листьях М 2014,несмотря на то,что ГА1Д активнее, чем в контроле, ¿уккционирсвание ПК, спределящей скорость потока углерода на терминальном участке гликолитической цепи, ниг»о. ПоЕ>яр|ша скорости работы лактатдегидрогенязы у М 2С.4 и ллкогольдегидрогена-зы у гибрида коррелирует с активным протеканием промежуточных этапов гликолиза, что обеспечивается за счёт регенерирования НАД п реакциях преррячсння пирувата в этанол и лактат. Слелуст отметить, что у ниэкопрояуктивной фермы 2014 регенерация НАД идёт, вероятно, по более короткому, лактатдегидрогенаэнсцу пути.

Исследование активности ИДГ, являющейся первым пунктом контроля скорости работы ЦГК,показало активную работу как НАД-, так и НАД2-зависимогр фермента у К 2004 (табл.3). Существование в цикле Кребса двух аллее тернческнх ферментов, катализирующих одну и -у же реакцию, связано с их взаимозаменяемостью. Так, снижение пропускной способности ЦГК, судя по падению активности НДГ-НАД у М 2014, частично компенсируется за счёт повышения активности ИДГ-НА15. Детальное исследование активности этого фермента выявило, что у М 2004 и гибрида увеличение скорости работы ИД -НАДФ в гомогенате коррелирует с гевьгвением активности в митохондриальной, ядерной и цитоплазматической фракциях (табл.4). У М 2014 это увеличение происходит в основном за счёт цигэплазматической фракции.Вынос цитрата из митохондрии в цитоплазму и его декарбоксилнрование является

Таблица 3.

Активность ферментов дыхательного метаболизма в . листьях растений гороха, Е на I г сырой массы

Фермент Торсдаг Мутант 2004 Мутант 2014 Гибрид 2004ХТ ■

Глзжоэ о-6-фссфатдегид-рогеназч 3,9+0,2 11,8+0,3 18,2+0,4 6,370,1

Глицеральдегидфосфат-дегидрогеназа 1,5+0,03 2,9+0,07 4,1+0,1 2,2+0,09

Пируваткгагаза 0,62+0,02 1,06+0,03 0,427;.01 0,84+0,02

Лакта тде гидрогеназй 0,64+0,02 0,89+0,02 1,3870,04 0,6270,01

Алкогольдепщрогеназа 9,2+0,3 8,1+0,02 7,670,2 10,870,4

Изоцитратдегидрогеназа

НАД 4,3+0,08 20,ЭТО,92 2,770,09 19,670,84

Из оиитратдегвдрогеназа НАД« 'II,9+0,33 50,9+1;84 24,5+0,59 41,471,13

Малатдегндрогеназа. ад ■ .55,0+1,8 44,5+1,7 22,1+0,9 55,771,3

Малатдегидрогеназа,

ИАДН 78,1+0,86 149,1+5,9 270,479,3 97,6+1,7

1!алик-знзим,НАДФ 0,91+0,03 1,08+0,04 4,1070,09 0,6970,02

Таблица 4.

Активность нзоцйтрагдегидрогеказьг-НДЦФ в субклеточных фракциях листьев гороха, Е ш. I г сырой массы

). арианты

Митохондрии -Хлоропласт« Ядра'- Цитоплазма

'> ■■¡•■„■паг П-1онг 2004 Чутант 2014 Гибрид 2004X1

7,570,2 16, КО,5 7,0+0,1 10,2+0,2

5,2+0,2 5,87-0,2 4;з+о,г 8,8+0,2

Л, 1+0,1 10,8+0,3 3,5+0,1 7,6+0,2

17,3+0,4 '35,8+1,2 . 26,7+0,9 ■33,5+0,8

дополнительным источником СО2 и НАДЯН' и имеет .важное зиаченш для поддержания работы цикла Кальвина у мутантов. гибридн:!:-: растении наблюдается также активация этого фермента во фракции югороплас-тов, что облегчает доступ экзогенного С0£ к центрам карбоксняиро-ваиия. Другой ключевой фермент в ЦГК - ИЛД-завасикая цаяатдегндро-геназа, определяющая работу цикла на последней стадии. Система МДГ является уникальной Для изучения связи между органеллами, пос-

кольку различные -и высокоспецифичные формы этого фермента находятся почти в каждом клеточном компартменте. Сравнительное исследование активности МДГ-НАД показало значительное снижение у М 2014,что соответствует показанному ранее падению активности ИДГ-11ДЦ(табл.3). У М-2004 и гибрида МДГ-НДД остается на уровне контроля.Вероятно,на терминальном участке цикла поддерживается определённый уровень ок-салоацетата для конденсации с ацетил-Ко А, избыток которого регулируется с помощью ВДГ-НДДН, восстанавливающей ЩУК до малата. Кроме того, существует конкуренция за малат между ВДГ-НАД и малик-энзимом (МЗ), декарбоксилиругацим яблочную кислоту с образованием пирувата. Изучение активности этих ферментов в гомогенате показало существенное превышение активности МДГ-НАДН и МЭ у мутантов, у гибридных растений ВДГ-НЛДН незначительно превышает уровень контроля, а для МЗ характерно падение пктибности. Анализ МЦГ-НЛДН в клеточных фракциях показал,.что в штохондриальном компартменте стабильная работа цикла Кребса обеспечивается за счет повышения активности МДГ-НАДН, причём у линии 2014 обращение конечной реакции цикла протекает наиболее интенсивно. Активация МДГ-НДЦН у 1-5'2014, по-видимому, обеспечивает накопление малата, который активирует работу анаплеротнчеекого фермента МЭ, восполняющего недостаток глико-литического пирувата в'цитоплазме этой линии.

Активность изученных ферментов коррелирует с содержанием ключевых-метаболитов. Так, уменьшение количества сахпроп в листьях мутантнкх и гибридных растений может быть .связано с т активной утилизацией в 0ПФП и гликолизе (табл.5).

. . ' Таблица 5.

Содержание некоторых метаболитов в листьях растений гороха Метаболит . Торсдаг Мутант 2004 Мутант 2014 Гибрид

Редуцируящие сахара, мг на I г сырой массы

10,3+0,27 9,7+0,16 9;1+0,31 7,1+0,23

Сахарова, 9,8+0,33 6,1+0,25. 5,4+0,11 6,2+0,29

ЛируВиГ, ?'Д коль на I г сырой массы

0,67+0,02 1,27+0,04 0,53+0,01 1,60+0,03

Лактат, 0,12+0,005 0,09+0,003 0,26+0,004 0,08+0,002

Малат, 1,37+0,04 1,23+0,05 2,15+0,08 0,78+0,02

Аспартат, 19,9+0,61 25,8+0,75 39,1+1,42 10,870,38

Алании, 42,7+1,61 10,0+0,47 12,6+0,98 10,1+0,97

Серии, 26,8+1,1 9,6+0,38 54,2+2,1 18,6+0,88

ГлИЦШ!, 1,28+0,07 1,95+0,09 0,79+0,03 1,2470,08

ГГролин, -я-и 1,09+0,06 3,28+0,15 3,55+0,16 4,43+0,11

Активная работа лактатдегидрогеназы у М 2014 соответствует.повышенному содержанию лактата, накопление пирувата в листьях М 2004 и гибрида может быть связано, с одной стороны, с активацией ПК,с другой стороны, это коррелирует с уменьшением количества аминокислот семейства пирувата - аланина и валина. Высокое содержание пролина, являющегося конечной аминокислотой в цепочке превращений ,^-кетоглу-тарага, можно объяснить повышенной активностью ВДГ-НАДО у изученные форм гороха. С ферментами мьлетной lистемы хорошо коррелирует содержание яблочной кислоты.Так, М 2014 характеризуется повышенным содержанием малата как в гомогенате, так и в митохондриях,наряду с увеличением активности МДГ-НАДИ и МЭ.Причиной снижения содержания малата у гибрида может быть ускоренное выведение из ЦГК и вовлечение его в биосинтетические процессы. Повышение количества ас-партата в листьях М 2QI4 согласуется с высоким содержанием малата, процесс взаимопревращения которых характеризует уровень восстанов-лешости в клетке.Снижение содержания других аминокислот семейства аспартата у М 2014 - лизина и треонина свидетельствует о преимущественном превращении аспартата и малата. В листьях гибрида наблюдается противоположная тенденция. Увеличение содержания серина при уменьшении глицина у М 2014, скорее всего, связано .с реакциями фотодыхания и может являться дополнительным источником С09 в клетке.

Изучение Og-газообмена выявило незначительное увеличение скорости поглощение у мутантиых растений по сравнению с контрольными, однако скорость поглощения 0g изолированными митохог.дрилми мутанта 2004 существенно превышает контроль, что хорошо согласуется с высокой скорость» работы ЦГК. Интересно отметить, что у М 2004 оценка интенсивности дыхания по выделение COg находится в противоречии с данными по -газообмену: замедление скорости выделения СО^ свидетельствует о торможении дыхательньтс процессов, там на ыенез активация ЦШ и большая скорость поглощения Og митохондриями говорит об обратном. Вероятно, в листьях линии 2004 происходит рергеи-миляция СО2 дыхательного происхождения в цикле Кальвина.

Таким образом,полученные результаты показывают, сю б листьях мут<- гов и гибридов дыхательный метаболизм в целом протекает интенсивно. Но если у М 2014 значительная чя^ть сахароъ отвлекается ъ 0ПФЛ, то у М 2004 это происходит с меньшей скоростью. Гликолиз работает у обоих мутантов таете интенсивно, но у формы 2014 заключительный его этап заторможен. Цикл Кребса у Ы 2004 функционирует с больной скоростью, а у линии 2014 его пропускная способность ограничена. Для гибрида характерно ускорение дыхательного метаболизм.'»

I 1

фазы онтогенеза

* У

О гЭ

о *

9 и.

V. и

а I

23

10

1 и п"

£ра5ы онтогенеза

'м '.СЭ - с

-н

X и Г

в »— •г !03 -

2 £

0 О. X

¡5 0 8 а;

а.

3 0 <<•

Я

сра:ы смгоганел

фазы с«?, .•.■<••_•>

1 а к

фазы онтогенеза.

с!

I

с!

/

/

/>

о—

__у

I I к

фагы снтог'нгэа.

Рис.4.Дкна!гика некоторой фс т о с т гг е т :> га е с кнх и дихатолыгкх параметров листьев гороха в онтогенеза: о—о—о -Торсдаг; а—©—<» -цутант 2004;

-мутант 2014

на уровне, промежуточном междо исходной формой и М 2004.

Глава 1У содержит результаты исследования динамики некоторых показателей фотосинтетической й дыхательной деятельности листьев гороха в процессе онтогенеза. Изучение проводили на трёх стадиях развития: 1-ювенильной, П-цветения, Ш-плодоношения.

Оказалось, что такие фотосинтетические параметры, как содержание хлорофилла, сахарозы, активность ГАФД, чистая продуктивность фотосинтеза (ЧПФ), скорость фстофосфорилирования-сохранявт закономерность отличия мутантов от контроля в течение всего вегетационного периода (рис.4; на рисунке приводятся лишь некоторые из них). Для большинства изученных параметров характерен нарастающий ход кривых с максимумом в фазе цветения, падение скорости ЦФФ ко II фазе связано, вероятно, с активацией реакций, идущих с образованием восстановителя. Это, в свою очередь, может являться причиной увеличения содержания сахарозы и повышения активности ГАФД при переходе в генеративную фазу. Несмотря на то, что динамика кривых ЦФФ и ЧПФ находится в противогазах, тем не менее эти показатели чётко коррелируют на всех стадиях онтогенеза.

Сравнительный анализ некоторых реакций дыхательного метаболизма показал, гго содержание редуцирующих Сахаров и малата возрастает к фазе цветения, в то время как активность катаболических ферментов, в частности, ГФДГ и ИДГ-НДЦ - падает. Однако высокая активность на этой стадии ферментов малатной системы свидетрльст-вучт о возможности активации реакций темнового дыхания. Высокое ■ содержание малата у М 2014 соответствует повышенной активности МДГ-НАД! и МЭ, а снижение малата у Н 2004 объясняет низкую активность МЭ на всех стадиях онтогенеза. *

Таким образом, выявленная корреляция урожая семян с' отдельны-физиологическими параметрами на данной конкретной модели позволяет рекомендовать их в качестве тестов ранней диагностики потенциальной продуктивности растений. Условная оценка физиологического состояния растений даёт возможность в целом оценить картину обмена веществ у исследуемых- объектов (табл.6).Скорость функционирования фотосинтеза и дыхания у исходной формы принимали за единиц/ и по- отношению к ней проводили сравнение других вариантов.

В листьях ыутантных растений уменьшение "К" связано.с окислительной направленностью метаболизма. У М 2004 повреаднщез действие мутации частично компенсируется за счёт увеличения числа хло-ропластов в клетке и компенсаторного повышения скорости реакций дыхательного метаболизма, однако возможности фотосинтеза ограни-

Таблица 6.

Условная оценка физиологического состояния растений

Варианты Фотосинтетическая активность . Дыхательная активность К" Зерновая продуктивность

Торсдаг + 4- + + + + I 1002

Мутант 2004 + +• + + + + 0,5 ■ 20-30%

! Мутант 2014 + + + + 0,3 3-Ъ%

Гибрид 2004ХТ + 4- + + + + +■ I 120-1407,

"К - соотношение фотосинтетической и днхателиной активности; оцен!:а в баллах

гтены вследствие ».утации, и продуктивность снижается (К<1), У М 2014 подобный компенсаторный эффект отсутствует, поэтому низкая фотосинтетнческая активность, наряду с окислительной направленность!!) метаболизма, приводит к резкоиу падению уродая сзмян (К«1). У гг.брвда "К" такяе, как и у исходной формы, равен единице, однако это достигается более высоким стационарным уровнем фотосинтеза и дехания. В клетке гибридного растения, оидшо, создаётся новый уровень обмена вс~еств, определяема нормальной структурой Фото-скнтоткческого аппарата контрольна растений и снятием ограничения со сторсни дчхзния, и .следуемым от ^тенгд 2004. Высокая урс-каР-нозть гибрида обеспечивается'за счёт ^«"яюй реализации ткт. возможностей £отоспнтетичсского аппарата, определяемой усилением запроса со сторсгш д'-гс^ння. В итоге, путём максимального исполь-зозаняя продухтей Фотосютеза в иетаболичеоких процессах,у гибрида увеличивается доля рспродуктиЕН!лс органон по сравнен™ с вегв-тативничи.

ВЫВОДЫ'

Т.С^д-:'":тельное изучение фотосинтвткческого аппарата мутант-иик и растения повеояияо обнаружить особен"-, "сти его ор-

ганизации, с^'глгпипгг?:» различиуп функциональную активность. У " 2014 сиг. -т'о содсрпзяиз пигментов, число реакционных центров "¿0 I и 5С II. .у •-«•даева- скорость ЩФ и поглощения С02, но увеличена скорость п реакции Хилла при поекпеши отношения Р/25. У !! 2004 также енг-лио содержите пигментов, уменьшено' число ре-ахцноияык центре? преимущественно I 5С, замедлена скорость Цй& и поглощения С02, увеличена скорость НЦФЗ. Гибрид характеризуется содержанием пип.'зктов па уровне контроля, увеличением числа реакционных центрез обшгс фотосистем, а такле каксималыюй ско-

ростью поглощения COg и первичных реакций фотосинтеза.

2. Снижение функциональной активности у М 2014 коррелирует с уменьшением числа хлоропластов в единице ассимилирующей поверхности. УМ 2004 снижение числа хлоропластов сопровождается качественными изменениями в структуре ФС I, о чём можно судить по смещению полосы флуоресценции 735 нм в коротковолновую область и по нарушению агранальных тилакоидов. У гибрида функциональная способность фотосинтетического аппарата обеспечивается большим, по сравнении о контролем, насыщением хлоропластами единицы площади листа.

3. Отличия в фотосинтетической активности приводят к изменению в дыхании у изученных форм гороха. В ответ на депрессирующве влияние хлорофилльной цутации в листьях кутан тных и гибридных растений включаются компенсаторные реакции, основанные на донорно-акцепторных отношениях фотосинтеза и дыхания.

4. У М 2014 активируется 0Г№П и начальные этапы гликолиза,но угнетаются пируваткиназа и ферменты цикла кребса. У Ы 2004 и гибрида увеличивается скорость всех этапов теынового дыхательного метаболизма.

5. Активация дыхательного обмена, наследуемая гибридси о? U 2004, снимает ограничивающие составляйте потенциальных возмознос-тей фотосинтеза и выводит обмен гибридных растений на более вько-кий, по сравнению с контролем, уровень.

б.Основнк* различия между мутантньыи и гибридкши растениями, выявленные на первой стадии развития, сохраняется в терние всего онтогенеза.

7. Изучение фотосинтеза и дыхания у ыутантных и гибридных растений, механизмов их взаимосвязи позволяют разработать физиолсго-биохимические тесты условной оценки потенциальной продуктивности растений на ранних стадиях развития. Существование качественны*: компенсаторных изменений в дыхательном метаболизм у U 2004 к наследование их гибридом позволяет рекомендовать для получения продуктивных форм подбирать родительские пари таким образом, чтобы в гибридных клетках высокие фотосиитеткческап и дыхат.лькая активное и соотносились как 1:1.

Список публикаций по теме диссертации.

1.Ьайиля 0.Б.Соотношение фотосинтеза и дь.сания у норыаяьтк:

и мутантных растений гороха/Дезисы докл.III Всесоюзной конф.молодых учёных до фгяиологии раст.клетки.-Петрозаводск,1988.-С.62.

2.Вайшля 0.Б.Изучение компенсаторное реакций метаболгизка у цу-тантных растений гороха/Дез йен докл. 1У Бсесовзной конф.молодых

ynswcx по физиологии раст.клетки.-Минек,1930.-С,40.

3.АсТафурова Т.П.,Вайгаля 0.В.,Ладыгин В.Г..Соколов В.А. Физиологические особенности мутантов гороха, различающихся по про-дуктигзиости//Мзтериалы I Всесоюзного совещания "Использование изо -генных линий в селекционно-генетических экспериментах",Новосибирск. -1990. -C.I2I-I23.

4.Ва!!шля О.Б. ,Астахова Т.П. .Зайцева. Т.Л. .Соколов В.А.'*о-табодические изменения в листьях нормальных и мутаитных растения города при действии экстремальных фа»торов//№атериалы I Всесоюзного совещания "Использование изогеннык линий в селекцнонно-гене-TtPieciuvг экспериментах",Новосибирск.-1990.-С..II8-I20,

б.Лздагин В.Г.,Вайшля О.Б. „Семёнова Г.А. ,Аст«.фурова Т.П. .Соколов В.Д.Характеристика фотосистем и структуры хлорс-иластов хло-рофилльних мутантов гороха/Дам ае.-СЛ24-125.

6. Vayshle. О.Б. The physiological study of pea hsberoais // Y^*1 International youth nympoaiuB on plant motabolian regulation. Abstracts» 0-15 October, Verna.—199Й. —P.17.

7.Вайшяя O.B. ,Ладыгин В.Г.,Соколов В.Л. ,Лс*гафурова Т.П.Мезо-;";тьтр?.струк?ура 15 функциональные особенности фотосинтеттесгсого аппарата хлорофиялыме мутантов 1'ороха//Тезиеы док л. Меядунар. яонф,-"Фотосинтез и фотсб!ютехнология".-Путцшо,1991.-С.88-89.

б.Астафурова Т.П.,Вайзля О.Б.Влияние гипоксического стресса иа метаболизм хлорофилльных »утантов гороха//Гёэисы докл.Междунар. конф. "Фотосинтез и фотобиотехнологнп1'. -Пущино, 1991.-С. 07-88.

9.Калашников Ю.Е..Вайгаля О.Б. ,Балахнина Т.И., Закрасевский Д. А. Фотосинтетические реакции и ферменты защиты у пигментных мутан-тоз гороха при аэрагии и гипоксии//Цитология.-1991.-Т.ЗЗ,!?5.-С. 104.