Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие флуоресцентных красителей с полиэлектролитными микрокапсулами. Разработка флуоресцентных хемо- и биосенсоров

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие флуоресцентных красителей с полиэлектролитными микрокапсулами. Разработка флуоресцентных хемо- и биосенсоров"

На правах рукописи

КАЗАКОВА ЛЮБОВЬ ИГОРЕВНА

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ КРАСИТЕЛЕЙ С ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫМИ МИКРОКАПСУЛАМИ. РАЗРАБОТКА ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ХЕМО- И БИОСЕНСОРОВ.

03.01.02 - биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 ,'.Г.L-b.iL

Пущино - 2012

005018306

005018306

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Пущинский государственный естественнонаучный институт на базе сектора Физической химии биополимеров Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, г. Пущино.

Научные руководители: кандидат биологических наук

Шабарчина Людмила Ивановна

кандидат физико-математических наук Сухорукое Глеб Борисович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Орлов Николай Яковлевич

доктор химических наук Марквичева Елена Арнольдовна

Ведущая организация: Национальный исследовательский Саратовский

государственный университет имени Н.Г. Чернышевского

Защита диссертации состоится апреля 2012 г. п /Ь^ЗОл. заседании совета

Д 002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН г. Пущино

Автореферат разослан 2012 г.

Ученый секретарь совета Д 002.093.01 кандидат физико-математических наук

Ланина Н. Ф.

Актуальность темы. Тема разработки нано- и микроконтейнеров для капсулирования различных веществ широко представлена в научно-исследовательских проектах разных стран и обусловлена общей тенденцией развития наукоемких технологий к универсализации и миниатюризации. Задачи, связанные с созданием, изучением и использованием нано- и микроконтейнеров актуальны для реализации ряда важных разработок в области медицины, косметологии, биотехнологии, тонкой химической технологии и т.д. Существует несколько стратегических направлений их решения, одним из которых является применение полиэлектролитных нано- и микрокапсул, получаемых методом поочередной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов на коллоидные частицы нано- и микроразмеров с последующим разрушением этих частиц. Функциональность полиэлектролитных капсул определяется назначением помещенного в них агента. Их используют в качестве систем доставки биологически активных соединений к клеткам и тканям, для создания пролонгированных лекарственных препаратов. Привлекательной является идея создания на основе полиэлектролитных капсул новых средств для качественного и количественного определения биологически значимых веществ, в частности метаболитов. В настоящее время капсулы с включенными в них ферментами используют для определения концентрации низкомолекулярных метаболитов спектрофотометрическими или электрохимическими методами, что влечет за собой введение извне специфических реагентов, индикаторов продуктов каталитической реакции, или использование электродов сравнения. Поэтому актуальной является задача одновременного включения в капсулу фермента и вещества, выполняющего роль трансдьюсера, способного генерировать аналитический сигнал пропорциональный содержанию анализируемого метаболита. Такая конструкция капсулы удовлетворяет понятию «сенсор» и может быть использована для разработки новых диагностических средств для определения широкого спектра низкомолекулярных веществ.

Целью данной работы является изучение взаимодействия флуоресцентных красителей с полиэлектролитными микрокапсулами и разработка на основе полиэлектролитных микрокапсул флуоресцентных сенсоров для определения биологически значимых ионов и низкомолекулярных метаболитов.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать ультраструктурную организацию полиэлектролитных микрокапсул, сформированных с использованием минеральных и биоминеральных ядер.

2. Изучить влияние состава полиэлектролитной оболочки капсул и рН среды на внутриобъемное распределение инкапсулированных белков.

3. Изучить взаимодействие флуоресцентных красителей с полиэлектролитными микрокапсулами на примере амфифильного зонда мероцианина540. Предложить способы включения флуоресцентных индикаторов в полиэлектролитные капсулы.

4. Разработать хемо- и биосенсоры для определения биологически значимых ионов и метаболитов на основе содержащих флуоресцентные красители полиэлектролитных микрокапсул. Продемонстрировать функционирование сенсоров в водной среде.

Научная новизна. Методом трансмиссионной электронной микроскопии изучена ультраструктурная организация содержащих и несодержащих белки полиэлектролитных микрокапсул, сформированных на минеральных частицах СаСОз и биоминеральных ядрах СаС03/белок. Определено количество полиэлектролитных слоев, оптимальное для формирования регулярной полиэлектролитной оболочки на поверхности таких частиц. На примере амфифильного зонда мероцианина540 показано связывание флуоресцентных красителей с с полиэлектролитной оболочкой капсул посредством электростатических и гидрофобных взаимодействий. Предложены варианты иммобилизации флуоресцентных красителей в содержащие и несодержащие белки полиэлектролитные капсулы. На основе содержащих флуоресцентные индикаторы полиэлектролитных микрокапсул разработаны хемосенсоры для количественного определения ионов Са2+ и кислорода. Впервые получены содержащие ферменты полиэлектролитные капсулы, в оболочку которых встроены флуоресцентные красители - индикаторы каталитической реакции. На их основе разработаны биосенсоры для количественного определения глюкозы, мочевины, лактата. Получены калибровочные кривые для определения соответствующих аналитов в водной среде методом флуоресцентной спектроскопии. Показана принципиальная возможность определения концентрации аналита с помощью одной сенсорной капсулы.

Научно-практическая значимость. Данные электронно-микроскопических исследований расширяют представления о структуре и свойствах оболочки

полиэлектролитных микрокапсул, ее влиянии на инкапсулированный материал. Они могут быть полезны для прогнозирования результатов капсулирования различных биологически активных веществ. Предложенные варианты иммобилизации флуоресцентных красителей в полиэлектролитные капсулы могут использоваться при создании оптических хемо- и биосенсоров для качественного и количественного определения аналитов. Разработанные сенсоры позволяют определять физиологические концентрации Са2+, глюкозы, мочевины, лактата и могут найти применение в клинико-биохимической практике. Результаты привлекательны для научно-исследовательских работ: рассматривается возможность использования одиночных сенсорных капсул для определения концентрации аналитов в живых клетках. Исследование может стать шагом к созданию новых неинвазивных способов определения состава внутренней среды организма и приблизить к воплощению в жизнь идею непрерывного мониторинга метаболитов, лекарственных препаратов и белков in vivo. Предпосылками для этого являются миниатюрность предложенных сенсоров и дистанционный характер регистрации их работы.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на симпозиумах и конференциях: I региональной конференции «Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем (Крестовские чтения)», 2006, Иваново; Всероссийской молодежной школе-конференции «Современная биотехнология - защите окружающей среды», 2006, Пущино; четвертой международной конференции «Нанобио- и другие новые и перспективные биотехнологии», 2007, Пущино; международной конференции «Современные проблемы науки о полимерах», 2007, С.-Петербург; конференции «Биология - наука XXI века», 2007, Пущино; школе-конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Биомедицинская инженерия - 2007», Пущино; «Экспериментальная и теоретическая биофизика», 2009, 2011, Пущино; Summer School Max Planck Institute of Colloids and Interfaces, 2010, Greece, Create, Rethymnon; V Российского симпозиума «Белки и пептиды», 2011, Петрозаводск.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 4 статьи.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на _

страницах машинописного текста с использованием _ рисунков и _ таблиц.

Работа включает разделы «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Библиография содержит_ссылку на работы отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микросферолиты СаСОз и биоминеральные частицы СаСОз/белок получали согласно методике (Volodkin et al., 2004). Для получения биоминеральных ядер использовали белки бычий сывороточный альбумин (БСА), ферритин, ферменты уреазу, глюкозооксидазу, лактатоксидазу, пероксидазу.

Полиэлектролитные микрокапсулы получали методом поочередной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов полистиролсульфоната (ПСС) и полиаллиламина (ПАА) на частицы СаСОз или биоминеральные ядра СаС03/белок. После формирования определенного числа полиэлектролитных слоев минеральную составляющую ядер удаляли раствором этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), рН=7,4. Полученные капсулы использовали для проведения эксперимента или хранили в виде суспензий в воде при температуре 4°С.

Полые полиэлектролитные капсулы получали методом поочередной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов полианиона ПСС и поликатиона полидиаллилдиметиламмония (ПДАДМА) на сферические частицы оксида кремния диаметром 4,8 мкм (Skirtach et al., 2005). Растворение ядер производили с применением 0,3 М плавиковой кислоты (HF).

Спектрофотометрические измерения проводили на спектрофотометре Сагу 100 (Varian Inc.) при температуре 20° С.

Спектрофлуориметрические измерения проводили на спектрофлуориметре Сагу Eclipse (Varian Inc.) с при температуре 20° С и постоянном перемешивании.

Получение и исследование срезов полиэлектролитных микрокапсул проводили

4

совместно с сотрудниками Лаборатории Ультраструктуры нейрона (ИТЭБ РАН, Пущино) по методике (Мошков Д. А., 1985). Просмотр срезов осуществляли в трансмиссионный электронный микроскоп Тесла БС-500 (Чехословакия) при ускоряющем напряжении 90 кВ и увеличении 10000, 14000 и 24000 раз. Негативы морфометрировали, используя фотоувеличитель «Микрофот» (ГДР) при фиксированном 6,5- и 9-кратном увеличении.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия капсул с иммобилизированными красителями выполнена на конфокальном микроскопе Leica Confocal Laser Scanning Microscope TCS SP. Для визуализации использовали инвертированный иммерсионный объектив с увеличением * 100.

Исследование взаимодействия мероцианина540 (МЦ540) с полиэлектролитами ПАА, ПСС, их интерполиэлектролитным комплексом (ИПЭК) и полиэлектролитными микрокапсулами проводили спектрофлуориметрическим титрованием водного раствора красителя растворами полимеров или суспензией капсул. Исследования проводили совместно с сотрудниками Лаборатории Новых методов в биологии Пермяковым С.Е. и Емельяненко В.И. (ИБП РАН, Пущино). Значения константы (KJ и стехиометрии связывания (п) МЦ540 с ПАА определяли путем варьирования в соответствии с экспериментальными значениями интенсивности флуоресценции в рамках схемы: МЦ 540 + пИПЭК < "« > Комплекс „

Подгонка экспериментальных данных проводилась с помощью программы FluoTitr v.1.2 (ИБП РАН, Пущино).

Константу диссоциации (KJ) кальция и флуоресцентного красителя Calcium Green-1 определяли на основании данных спектрофлуориметрического титрования раствора красителя ионами Са2+ в соответствии с уравнением (Roger Tsien et al., 1989):

[Ca-'J = Kj*[(F-F„,J/(Fmax-F)J,

где Fmi„ - интенсивность флуоресценции красителя в отсутствие Са2+, Fmax -интенсивность флуоресценции при насыщении красителя кальцием, F -интенсивность флуоресценции красителя в присутствии Са2+.

Константу ассоциации (Ка) Н+ и ратиометрического флуоресцентного красителя 8^11Р-1 определяли на основании данных спектрофлуориметрического титрования раствора красителя Н+. Расчет значения К„ производился в соответствии с уравнением Гендерсона-Хассельбаха, используя отношение значений интенсивности флуоресценции красителя на длинах волн 580 и 640 нм С\¥Ы1акег й а1., 1991):

где Я = ^ - ; а - _

1ш(Ьаж) * 1ш(аасИс) ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Исследование ультраструктурной организации полиэлектролитных микрокапсул, сформированных с использованием минеральных и биоминеральных ядер, методом трансмиссионной электронной микроскопии

На рис. 1 представлена фотография среза полой полиэлектролитной микрокапсулы, сформированной на сферической частице 8Ю2 диаметром 4,8 мкм. Такие капсулы представляют собой полые образования с хорошо выраженной полиэлектролитной оболочкой, повторяющей поверхность частиц, использованных для

На рис. 2 представлены фотографии ультратонких срезов микрокапсул с числом полиэлектролитных слоев от 6 до 10, сформированных на сферических частицах СаС03 и биоминеральных ядрах СаС03-БСА диаметром 4,5-5 мкм. Микрокапсулы, сформированные на СаС03 ядрах, состоят из интерполиэлектролитного комплекса ПСС/ПАА, локализованного во всем объеме капсул (рис. 2, верхний ряд). Это возможно, благодаря пористому строению частиц СаСОз (Уо1ос1кт й а1, 2004), адсорбция противоположно заряженных полиэлектролитов в порах частиц приводит к формированию внутри них интерполиэлектролитного комплекса (матрикса). После растворения минеральной основы пространственное

их формирования.

Рис. I. Фотография ультратонкого среза полой

полиэлектролитной микрокапсулы. Архитектура оболочки (ПАА/ПСС)з.

положение комплекса сохраняется. Формирование оболочки на поверхности СаС03 ядер происходит при 9 полиэлектролитных слоях после заполнения пор минеральной частицы полиэлектролитами.

Обнаруживается различие ультраструктурной организации несодержащих белок капсул, формирование которых начинали с полиэлектролитов ПАА или ПСС (рис. 2, верхний ряд А, Г или Б, В, соответственно). Оно проявляется в более рыхлом строении и наличии полостей в матриксе капсул, для формирования которых первым использовали ПСС.

Полиэлектролитная оболочка на поверхности биоминеральных ядер СаСОз-БСА формируется уже при 6 стадиях адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов (рис. 2, нижний ряд). Расположение полиэлектролитов на поверхности частиц обусловлено строением биоминеральных частиц СаС03-БСА: поры СаСОз в них заполнены белком, что препятствует проникновению полиэлектролитов в процессе адсорбции вглубь сферолита. Хорошо выраженная регулярная оболочка капсул наблюдается при 9 полиэлектролитных слоях (рис. 2, нижний ряд, В).

Рис. 2. Ультраструктура полиэлектролитных микрокапсул с числом полиэлектролитных слоев: А - 6, Б — 7, В - 9, Г- 10 слоев.

Верхний ряд: капсулы сформированы на пористых минеральных частицах СаС03. Нижний ряд: капсулы сформированы на биоминеральных ядрах СаС03-БСА.

С помощью морфометрического анализа изображений была определена

толщина полиэлектролитной оболочки капсул. Ее значение для содержащих и

несодержащих белок микрокапсул зависит от количества стадий адсорбции

противоположно заряженных полиэлектролитов на ядра (табл. 1).

7

Таблица 1. Значение толщины полиэлектролитной оболочки микрокапсул, сформированных с использованием СаСОз и биоминеральных СаС03-БСА ядер.

Общее число Архитектура Толщина полиэлектролитной оболочки,

полиэлектролитных оболочки нм

слоев СаС03 ядра Биоминеральные ядраСаСОз-БСА

6 (ПАА/ПСС)3 - 36,9 + 3,3

7 (ПСС/ПАА)3ПСС - 46,1+3,0

8 (ПАА/ПСС)4 - 58,4 ± 2,8

9 (ПСС/ПАА)4ПСС 46,1+2,7 66,1+7,7

10 (ПАА/ПСС)5 41,5 + 3,1 61,5 + 3,2

11 (ПСС/ПАА)5ПСС 66,0 ± 2,5 61,5 + 3,1

Таким образом, морфология полиэлектролитных микрокапсул обусловлена структурой ядер, использованных для их формирования.

Изучение распределения белка в полиэлектролитных микрокапсулах

Влияние заряда внутреннего полиэлектролитного слоя оболочки на распределение белков внутри полиэлектролитных капсул было изучено методами

трансмиссионной и конфокальной микроскопии.

0 О § 4 1 О

© д © А Трт Б ТрггГ О О А 4 рт и

Рис. 3. Верхний ряд: электронно-микроскопические изображения содержащих ферритин полиэлектролитных микрокапсул при различных значениях рН среды. Архитектура полиэлектролитной оболочки (ПАА/ПСС)3. А) рН 2, Б) рН 3, В) рН 4, Г) рН 5.

Нижний ряд: конфокальные изображения содержащих ФИТЦ-меченый альбумин полиэлектролитных микрокапсул при различных значениях рН среды. Архитектура полиэлектролитной оболочки (ПАА/ПСС)А) рН 2, Б) рН 3, В) рН 4, Г) рН 5.

Для этого были закапсулированы белки с близкими значениями изоэлектрических точек - электронно-плотный белок ферритин (pl=4,7) и ФИТЦ-меченый БСА (pl=4,8). На рис. 3 (верхний ряд) показана зависимость расположения ферритина в полиэлектролитных микрокапсулах, внутренний полиэлектролитный слой которых представлен поликатионом ПАА, от рН среды.

Подобная зависимость обнаруживалась методом конфокальной микроскопии для полиэлектролитных микрокапсул, содержащих флуоресцентно меченый альбумин (рис. 3, нижний ряд). При значениях рН среды, близких значению изоэлектрической точки белка, белок локализуется преимущественно около оболочки капсул (рис. 3, В, Г). Вблизи изоэлектрической точки молекулы белка в целом электронейтральны, и его взаимодействие с полиэлектролитной оболочкой может носить гидрофобный характер. При смещении рН среды в область кислых значений, наблюдается распределение белка по всему объему капсул (рис. 3, А, Б). В кислой среде белок приобретает положительный заряд, что, вероятно, вызывает электростатическое отталкивание его молекул от внутренней поверхности полиэлектролитной оболочки, представленной поликатионом (рис. 3, А, Б).

В случае если в качестве первого слоя при формировании оболочки был использован полианион ПСС, белок при всех значениях рН в исследованном интервале располагался в пристеночном пространстве (данные представлены в диссертации). Таким образом, распределение белков внутри полиэлектролитных микрокапсул зависит от взаимного влияния заряда внутреннего полиэлектролитного слоя и заряда белка. Эти данные полезны для прогнозирования результатов капсулирования различных веществ в полиэлектролитные микрокапсулы.

Изучение взаимодействия мероцианина540 с полиэлектролитными микрокапсулами и составляющими ее полиэлектролитами

Взаимодействие полиэлектролитных капсул и составляющих их полиэлектролитов с флуоресцентными красителями было исследовано на примере анионного амфифилыюго зонда мероцианина540 (рис. 4, А). Спектральные свойства МЦ540 зависят от свойств микроокружения: в гидрофобном микроокружении зонд существует в виде мономеров, полярное микроокружение вызывает ассоциацию молекул красителя, причем флуоресцируют только мономеры зонда (Sikurova and Cunderlikova, 1997).

о

V „,(СНЛ-СН,

N

(CHjb-SO,'

0 J

(CHJj-C

-CH2""CH—CH2~CH—CH2— —СН2""^Н-СН2~СрН-СН2"' ^Aw СН2 СН2

PO ^

SO3- Б

в

Рис. 4. Структура амфифилъного флуоресцентного зонда мероцианина540 (А), полиэлектролитов ПСС (Б) и ПАА (В).

Было исследовано влияние полиэлектролитов ПСС (70 кДа) и ПАА (70 кДа) и их эквимолярного интерполиэлектролитного комплекса (ИПЭК) на спектральные свойства МЦ540 в водных растворах. ПСС не взаимодействует с МЦ540 в силу их одноименного отрицательного заряда (рис. 4 А, Б) и не оказывает влияния на спектральные свойства красителя (данные представлены в диссертации). Присутствие ПАА вызывает изменения спектральных свойств красителя, характерные для образования его агрегатов (Sato et al., 2000): смещение спектра поглощения МЦ540 в коротковолновую область и тушение флуоресценции зонда без изменения положения максимума спектров флуоресценции (рис. 5, А, Б, кривые 1 и 2). Вероятно, что наблюдаемые эффекты являются следствием электростатического взаимодействия между отрицательно заряженными молекулами красителя и аминогруппами поликатиона (рис. 4 А, В). Возможно также, что электростатические силы вызывают адсорбцию МЦ540 на цепи ПАА и его концентрационное тушение вследствие образования слабо флуоресцирующих агрегатов.

щ 0,16 Н 0,14

л- 0.12

Ö о.ю о

3= 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00

О

с с к га

ъ: О а) т s

Ё -0.02 О 300 350

А Ч«1 565

\з

475 ^ f ^

щ 400

Е

0

1 300 ZS

I

с

'S" 200

л

6

о

100

600 650

5?5 /Т\

Б

/ I \ / \3

371 \ J\ \

\ /у—О41

520 540

560 580 600 620 длина волны, нм

640 66С

400 450 500 550 длина волны, нм

Рис. 5. А) 1 - спектры поглощения МЦ540 в воде (6,1* Iff7М), Д- соответствует длине волны поглощения димеров красителя в воде, М-мономеров зонда в воде; 2-е присутствии ПАА (2,3* Ш7 М); 3-е присутствии эквимолярного интерполиэлектролитного комплекса ПСС/ПАА (5,7*KT6 М).

Б) 1 - спектры флуоресценции МЦ540 в воде (6,1* 1 (Т7 М); 2-е присутствии ПАА (2,3*lff'° М); 3 - эквимолярного интерполиэлектролитного комплекса ПСС/ПАА (5,7*1 ff6 М), Лехс - 535 нм.

Зависимость интенсивности флуоресценции зонда от концентрации ПАА представлена на рис. 6А, кривая 1. В координатах Штерна-Фольмера зависимость изменения интенсивности флуоресценции МЦ540 от концентрации мономеров ПАА имеет линейный вид (рис. 6 Б, кривая 1), значение константы Штерна-Фольмера составило К5У = 2,6* 106 М"1. Аппроксимацией тех же экспериментальных данных в рамках модели связывания МЦ540 и мономеров ПАА определено значение эффективной константы их ассоциации Ка= 4*106М"' и коэффициента стехиометрии 11=1,05.

1,2 1,0 0,8

о 0,6

Ц.

2 0.4 0.2

0,0

0 5 10 15 20 25 0 20 40 60 80 100 120 140

[ПААИМЦ540] [ПМ]*10-7М

Рис. б. А) Зависимость интенсивности флуоресценции МЦ540 от молярного соотношения концентраций мономеров ПАА и МЦ540. Кривая 1 - тушение флуоресценции МЦ540 при титровании ПАА; кривая 2 - тушение флуоресценции МЦ540 при титровании растворами ИПЭК малых концентраций. Р0 -интенсивность флуоресценции раствора МЦ540 (6,1*10-'М), I' — интенсивность флуоресценции МЦ540 в присутствии полимера, [ПАА] - молярная концентрация мономеров ПАА, А*хс = 535 нм, Лет = 571 нм.

Б) Тушение флуоресценции МЦ540 (6,1*1(Т7М) в растворах ПАА (кривая 1) и в растворе ИПЭК, представленное в координатах Штерна-Фольмера, Л,,т = 571 нм.

Для получения интерполиэлектролитного комплекса (ИПЭК) использовали одинаковые молярные концентрации ПАА (70 кДа) и ПСС (70 кДа), однако комплекс не стехиометричен, В нем преобладают мономеры ПАА, так как в одной молекуле ПАА содержится около 1200 мономеров, а в такой же молекуле ПСС - 380 мономера, то есть на один мономер ПСС приходится около 3 мономеров ПАА.

На рис. 7 А кривая 1 имеет участки падения и роста интенсивности флуоресценции. Участок кривой, соответствующий тушению флуоресценции, представлен на рис. 6 А кривая 2 в виде зависимости изменения интенсивности флуоресценции зонда от концентрации несвязанных в ИПЭК мономеров ПАА.

0,2 0,4 3,0 6,0 9,0

[ИПЭК]/[МЦ540]

200 400 600

капсулы/мл

Рис. 7. А) Изменение интенсивности флуоресценции (,кривая 1) и положения максимума спектра флуоресценции (кривая 2) водного раствора МЦ540 (6,1*1(17 М) от соотношения молярных концентраций ИПЭК и МЦ540. F - интенсивность флуоресценции зонда в присутствии ИПЭК или капсул, F0 -интенсивность флуоресценции водного раствора МЦ540, Лехс = 535 нм, Хет-584 нм. Б) Изменение интенсивности флуоресценции (кривая 1) и положения максимума спектра флуоресценции (кривая 2) водного раствора МЦ540 (6,1* Ш9 М) от концентрации полиэлектролитных микрокапсул с ПАА на внешнем слое полиэлектролитной оболочки. Хехс — 535 нм, Хет=584 нм.

Эта зависимость в координатах Штерна-Фольмера представлена на рис. 6 Б (кривая 2), значение константы составило KSv = 3,1* 106 М'1. Значение эффективной константы взаимодействия ПАА-МЦ540 составило Ка = 9,1*105 М"1 и коэффициента стехиометрии п=1,9. Сопоставление кривых тушения флуоресценции МЦ540 при титровании ПАА и при низких концентрациях ИПЭК (рис. 6 А, Б), и соответствующих значений констант ассоциации дает представление, что тушение флуоресценции в растворах ИПЭК малых концентраций (рисунок 7 А, кривая 1) связано с электростатическим взаимодействием МЦ540 со свободными мономерами ПАА, не входящими в состав интерполиэлектролитных структур.

При увеличении концентрации ИПЭК в процессе титрования происходит смещение спектров поглощения и флуоресценции красителя в длинноволновую область и увеличение интенсивности флуоресценции по сравнению с водным раствором зонда (рис. 5 А, Б, кривые 3 и рис. 7 А, Б). Наблюдаемые спектральные изменения характерны для перехода молекул зонда из полярного в гидрофобное микроокружение (Sato et al., 2000), в котором МЦ540 существует преимущественно в мономерной форме (Sikurova and Cunderlikova, 1997). Поэтому вероятно, что рост интенсивности флуоресценции при увеличении концентрации ИПЭК (рис. 7 А, кривая 1) связан с мономеризацией агрегатов красителя вследствие

перераспределения молекул зонда по гидрофобным сайтам связывания.

Определение концентрации полиэлектролитов в микрокапсулах является крайне сложной задачей, поэтому количественно охарактеризовать взаимодействие МЦ540 с полиэлектролитными микрокапсулами не представлялось возможным. Было произведено качественное сравнение кривых изменения интенсивности и положения максимума спектров флуоресценции МЦ540, полученных в режиме спектрофлуориметрического титрования красителя растворами ИПЭК и суспензией полиэлектролитных капсул. Они имели сходный вид (рис. 7 А, Б). То есть связывание амфифильного зонда МЦ540 с полиэлектролитными микрокапсулами происходит, по крайней мере, по двум направлениям: с положительно заряженными нескомпенсированными фрагментами ПАА на поверхности капсул, и с гидрофобными участками интерполиэлектролитных структур в оболочке капсул. Аналогичным образом представляется возможным включать в полиэлектролитные капсулы заряженные гидрофобные красители.

Способы включения флуоресцентных красителей в полиэлектролитные микрокапсулы

Включение флуоресцентных молекул в полиэлектролитные микрокапсулы можно производить непосредственно внесением раствора красителя в водную суспензию капсул, или предварительно, на стадии формирования оболочки. В последнем случае, раствор индикатора в соответствии с зарядом флуоресцентных молекул следует добавлять к раствору поликатиона или полианиона, и использовать полиэлектролит с интеркалированным красителем для формирования оболочки капсул. Другим способом включения флуоресцентных молекул в полиэлектролитные микрокапсулы является использование их конъюгатов с высокомолекулярными веществами (белками, полимерами) для формирования ядер путем совместной копреципитации с неорганическими компонентами и последующей процедурой формирования полиэлектролитной оболочки.

Полученные таким образом капсулы обладают потенциалом применения в биологии, медицине, физике. В рамках данной работы, полиэлектролитные капсулы с иммобилизированными красителями использовали для создания новых сенсорных средств с флуоресцентной системой регистрации для определения биологически значимых ионов и метаболитов. Функционирование полиэлектролитной капсулы в

качестве сенсора возможно благодаря полупроницаемости ее мембраны: она проницаема для низкомолекулярных веществ и непроницаема для высокомолекулярных (Donath et al., 1999). Загрузка капсул флуоресцентными индикаторами, чувствительными к определенным ионам и молекулам, ведет к созданию хемосенсоров, а их комбинация с биологическими компонентами, например, ферментами - биосенсоров.

Для создания хемосенсоров целесообразна иммобилизация флуоресцентных индикаторов в полиэлектролитные капсулы, сформированные с применением пористых ядер СаС03 Их объем, как показано выше, заполнен разветвленным интерполиэлектролитным матриксом, позволяющим создавать внутри капсул высокие локальные концентрации индикаторов. Капсулы, сформированные с применением биоминеральных ядер, предоставляют возможность одновременного функционального использования их полости для загрузки ферментами и оболочки для включения флуоресцентных индикаторов. Таким образом, на основе полиэлектролитных микрокапсул возможно конструировать биосенсоры для определения различных метаболитов.

Разработка хемосенсоров на основе полиэлектролитных микрокапсул Хемосенсор для определения кислорода

В качестве аналитического элемента хемосенсора был выбран положительно заряженный гидрофобный краситель tris(4,7-diphenyl-l,10-phenanthroline)ruthenium(II) dichloride (Ru(dpp)). Полиэлектролитные микрокапсулы были получены поочередной адсорбцией поликатиона ПАА и полианиона ПСС с интернированными молекулами Ru(dpp) на сферические частицы СаС03 диаметром 4 - 4,5 мкм с последующим разрушением этих частиц в растворе 0,2 М ЭДТА, рН=7,4. Было подобрано соотношение молекул Ru(dpp) и мономеров ПСС 1:2500. Калибровка полученных капсул производилась спектрофлуориметрически, Хехс = 440 нм. Различные концентрации кислорода в водной суспензии капсул создавали смешением азота и кислорода и контролировали с помощью кислородного электрода Кларка.

Увеличение концентрации кислорода в среде вызывает тушение флуоресценции Ru(dpp), не сопровождающееся изменением положения максимума спектра флуоресценции красителя (рис. 8, А).

1

I

длина волны, нм концентрация кислорода, ммоль/л

Рис. 8. А — спектры флуоресценции содержащих Ru(dpp) капсул при увеличении концентрации кислорода, Лехс = 440 нм. Б - линеаризованный вид зависимости тушения флуоресценции от концентрации растворенного кислорода, где F0 -интенсивность флуоресценции капсул в отсутствие кислорода, F - интенсивность флуоресценции капсул при заданной конг^нтрации кислорода, Хет = 600 нм.

На рис. 8 Б приведен линеаризованный вид зависимости тушения флуоресценции содержащих Ru(dpp) капсул от концентрации растворенного кислорода. Таким образом, с помощью содержащих Ru(dpp) полиэлектролитных

! капсул возможно определение содержания растворенного в воде кислорода.

i

\ Хемосенсор для определения ионов кальция

' 2+

Предварительные эксперименты по включению индикаторов Ca в

полиэлектролитные микрокапсулы, сформированные с применением СаС03 частиц,

показали нецелесообразность использования этого типа ядер для создания сенсора

вследствие сильного воздействия минеральной основы на флуоресценцию

красителей. Поэтому для формирования сенсорных капсул использовались

сферические частицы оксида кремния SiC>2 диаметром 4,8 мкм. В качестве

| аналитического элемента хемосенсора был выбран флуоресцентный краситель Calcium Green- 1-dextran (70 кДа). Водный раствор индикатора вносили в суспензии готовых капсул. После взаимодействия, окрашенные капсулы подвергались 3-х

! кратной промывке деионизированной водой. Содержание индикатора в капсулах составило 100 пг/шт. Спектры флуоресценции капсул в CaEGTA буфере (рН=7,2, Invitrogen Inc.) с концентрацией свободных ионов Са2+ 0,017-39 мкМ представлены на

I

рис. 9, А.

I

15

Было определено значение константы диссоциации кальция и иммобилизованного в капсулы красителя Ка= 336 нМ (рис. 9 Б). Оно практически не отличалось от константы диссоциации для свободного красителя (Ка = 330 нМ), что говорит об отсутствии влияния полиэлектролитной составляющей капсул на способность красителя связываться с ионами кальция.

Рис. 9. А - Спектры флуоресценции капсул, содержащих Calcium Green-1 dextran (70 кДа), в CaEGTA буфере (pH=7,2) с концентрацией свободных ионов Ca' в диапазоне 0,017-39 мкМ. F0 -интенсивность флуоресценции капсул в отсутствие Са"+, F -интенсивность флуоресценции капсул при заданной концентрации свободных ионов Са2+, Хехс = 488 нм, Хет = 530 нм.

Б — Линеаризованный вид кривой насыщения иммобилизованного в полиэлектролитные микрокапсулы Calcium Green-1, полученный для расчета К^ красителя согласно уравнению Рендерсона-Хассельбаха. Хеш = 530 нм.

,0 -7,5 -7,0 -6,5 -6,0 -5,

log[Ca2+]free _ (М)

500 520 540 560 580 600 длина волны, ни

Рис. 10. Конфокально-микроскопические изображения полиэлектролитных микрокапсул, содержащих Calcium Green-1 dextran (70 кДа): А - в EGTA буфере (рН=7,2); Б - в CaEGTA буфере с концентрацией Ca2* 0,35 мкмолъ; В - в CaEGTA буфере с концентрацией Ca' 39 мкмолъ. Хехс = 488 нм, Хет = 500 - 600 нм.

При одной и той же концентрации свободных Са2+ капсулы в пределах ошибки

16

10% имели одинаковую интенсивность флуоресценции, о чем свидетельствуют данные конфокальной микроскопии (рис. 10). Таким образом принципиально возможно определение концентрации Са:' с помощью одиночных сенсорных капсул.

Биосенсор для определения глюкозы

Известно, что реакция разложения глюкозы ферментом глюкозооксидазой происходит с поглощением кислорода:

глюкозооксидаза

Р-В-глюкоза + 02 + Н20 _> Р-0-глюконо-1,5-лактон + Н202

Для регистрации убыли кислорода в ходе ферментативной реакции использовали флуоресцентный краситель (Яи(с1рр)), флуоресценцию которого кислород тушит. Включение красителя в полиэлектролитную оболочку капсул производилось на стадии адсорбции полиэлектролитных слоев. Соотношение молекул Яи(ёрр) и мономеров ПСС составляло 1:2500. Были сформированы капсулы с архитектурой полиэлектролитной оболочки (ПСС/ПАА)4ПСС. Конфокальное изображение полученных микрокапсул представлено на рис. 11.

Рис. 11. Изображение полиэлектролитных микрокапсул, содержащих в полости фермент глюкозооксидазу и флуоресцентный краситель Яи(с1рр) в оболочке. Конфокальная флуоресцентная микроскопия. Хехс = 488 нм, Хе,„ = 560 - 700 нм.

Калибровка сенсорных капсул производилась спектрофлуориметрически. В суспензию капсул в 0,05 М буферном растворе Трис-НС1 (рН=7,4) вносили растворы глюкозы в том же буфере. При возрастании концентрации глюкозы, увеличивается поглощение кислорода в ходе ферментативной реакции, в результате чего наблюдается возгорание флуоресценции сенсорных капсул (рис. 12 А). Время с момента добавления субстрата до снятия спектров составляло 10 мин. Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации глюкозы имела линейный вид и может быть использована в качестве калибровочной кривой (рис. 12 Б).

Рис. 12. А - Изменение спектров флуоресценции сенсорных капсул в 0,05 М Трис-НС1 буфере (рН=7,4) с увеличением концентрации глюкозы 0-10 мМ, Лехс = 440 нм. Б - Калибровочная кривая для определения концентрации глюкозы с помощью сенсорных капсул в 0,05 М Трис-НС1 буфере (рН=7,4). -интенсивность флуоресценции капсул в отсутствие субстрата, - после добавления глюкозы, Хет = 600.

О 2 4 6 8 10 12 концентрация глюкозы, мМ

0,0

600 650 700 750 В00 длина волны,нм

Биосенсор для определения лактата

Предложено определение лактата с помощью содержащих лактатоксидазу и пероксидазу полиэлектролитных микрокапсул согласно следующей схеме:

лактатоксидаза

лактат —-*■ пируват + Н202

пероксидаза

Н2Ог + дигидрородаминШ -родамин123 + Н20

В качестве источника аналитического сигнала была использована нефлуоресцирующая форма красителя дигидрородамин123 (ВНЮ23). Она окисляется пероксидом водорода во флуоресцирующую форму родамин 123 в присутствии пероксидазы. Включение красителя в полиэлектролитные капсулы производилось на стадии формирования полиэлектролитной оболочки. Соотношение молекул ОЖ123 и мономеров ПСС составило 1:400. Калибровка полученных сенсорных капсул производилась спектрофлуориметрически в 50 мМ Трис-НС1 буфере (рН=7,4), Хехс =450 нм.

Зависимость изменения интенсивности флуоресценции капсул от концентрации лактата имеет линейный характер (рис. 13) и может быть использована в качестве калибровочной кривой для измерения концентрации лактата в водной среде.

я 100

Рис. 13. Калибровочная кривая для определения лактата с помощью сенсорных капсул в 0,05 М Трис-НС1 буфере (рН=7,4).

Кхс - 450 нм, 1ет = 530 нм.

~ехс

•ет

о

0 2 4 6 8 10 12

концентрация лактата, мМ

Биосенсор для определения мочевины

Каталитическое разложение мочевины происходит со смещением рН среды в область щелочных значений:

Этот процесс может быть зарегистрирован с применением рН-чувствительного флуоресцентного красителя 81ЧА11Р-1. Методом копреципитации, были получены микрочастицы СаС03, содержащие фермент уреазу и 8КАКР-1-с1ех1гап (70 кДа). После адсорбции на такие частицы девяти полиэлектролитных слоев ПСС и ПАА, карбонатная основа была удалена. Таким образом были получены полиэлектролитные капсулы, содержащие одновременно фермент и флуоресцентный индикатор.

Были получены спектры флуоресценции капсул в 0,05 М ТРИС-малеатном буфере в диапазоне рН 5,5 - 9, А,ехс = 540 нм. Для расчета значения константы ассоциации Н+ и индикатора в уравнении Гендерсона-Хассельбаха в качестве зависимого параметра использовалось отношение интенсивностей флуоресценции на двух длинах волн: 580 нм, соответствующей кислой среде, и 640 нм - щелочной. Значение рКа составило 7,25.

Для установления зависимости рН, создаваемого в капсулах в ходе ферментативной реакции, от концентрации мочевины, к водной суспензии капсул добавляли растворы мочевины (рис. 14, А). Спектры флуоресценции фиксировались на 20 минуте после добавления субстрата. Значения отношений интенсивностей флуоресценции на длинах волн 580 и 640 нм использовались для расчета рН, достигаемого в капсуле в ходе ферментативного разложения мочевины. Полученные расчетные значения использовались для построения калибровочной кривой (Рис. 14,

СО(1ЧН2)2 + Н20 С02 + 2 Ш:

S 200

капсулы в воде 10"® моль мочевины 10"3 моль мочевины 0,1 моль мочевины

560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 длина волны, нм

!og(Cw

3

мочевина'

Рис. 14. А - Спектры флуоресценции сенсорных капсул в воде в присутствии мочевины в концентрации от 1СГ6 до 10'' М.

Б - Калибровочная кривая для определения мочевины с помощью сенсорных капсул.

Таким образом, для определения неизвестной концентрации мочевины в растворе необходимо получить значения интенсивности флуоресценции капсул в этом растворе, используя уравнение Гендерсона-Хассельбаха и значение рКа = 7,25 рассчитать значение рН, достигаемое в капсуле в ходе ферментативного разложения мочевины, и сравнить найденное значение с калибровочной кривой. Возможность использования для анализа одной капсулы была исследована с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа (Рис. 15).

Рис. 15. Конфокальные микроскопические изображения полиэлектролитных микрокапсул, содержащих уреазу и рН-чувствительный флуоресцентный краситель БЫАЯР-1 А) в воде; Б) в 0,1 Мрастворе мочевины. Хехс = 543 нм, Хе„, - 600 - 680 нм. В) Отношение интенсивностей флуоресценции десяти сенсорных капсул после и до добавления мочевины.

Из диаграммы (рис. 15 В) видно, что каждая из представленных на фотографии капсул в пределах погрешности 10 % демонстрировала близкие результаты анализа.

Выводы

1. Показано, что при использовании пористых сферолитов СаС03 в качестве ядер для формирования полиэлектролитных микрокапсул, внутренняя структура получаемых капсул представляет собой интерполиэлектролитный матрикс, а регулярная оболочка формируется после 8 полиэлектролитных слоев. Применение биоминеральных ядер приводит к формированию содержащих белок капсул с упорядоченной оболочкой уже при 6 полиэлектролитных слоях.

2. Показано, что расположение белка в полости полиэлектролитной микрокапсулы зависит от взаимного влияния зарядов белка и внутреннего полиэлектролитного слоя капсулы и возможно в двух вариантах: равномерное распределение белка в объеме капсулы или концентрирование его агрегатов вблизи оболочки. Установлено, что при значениях pH, близких значениям изоэлектрической точки белка, белок располагается вблизи оболочки микрокапсулы.

3. Установлено, что связывание амфифильного флуоресцентного красителя мероцианина540 с полиэлектролитными капсулами происходит благодаря его электростатическим и гидрофобным взаимодействиям с интерполиэлектролитными структурами оболочки капсулы. Предложено производить включение амфифильных и заряженных гидрофобных флуоресцентных красителей в содержащие и несодержащие белки полиэлектролитные капсулы двумя способами: I) на стадии формирования капсул, используя комплексы полиэлектролитов с интеркалированным красителем; 2) добавлением раствора красителя к водной суспензии капсул.

4. Разработаны флуоресцентные хемосенсоры на основе полиэлектролитных микрокапсул, содержащих индикаторы Ru(dpp) и Calcium Green-1, для определения кислорода и ионов кальция соответственно. Впервые показана принципиальная возможность определения концентрации аналита с помощью одной сенсорной капсулы.

5. Впервые сформированы полиэлектролитные микрокапсулы, содержащие одновременно ферменты и флуоресцентные индикаторы каталитического разложения метаболитов. Разработаны биосенсоры для определения глюкозы, мочевины и лактата в водной среде. Показана возможность определения концентрации метаболита с помощью одной сенсорной капсулы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Казакова Л.И.. Дубровский А.В., Мошков Д.А., Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И, Электронно-микроскопическое исследование структуры полиэлектролитных микрокапсул, содержащих и не содержащих белок. Биофизика, 2007, т.52, вып.5., с.850-854.

2. Дубровский А.В., Казакова Л.И.. Гужвина Д.В, Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И. Структура и свойства полиэлектролитных нано- и микрокапсул, содержащих транспортные белки крови. Альманах клинической медицины, 2008, т. XVII, часть 2, с. 325-328.

3. Lvubov I. Kazakova. Lyudmila I. Shabarchina, Gleb B. Sukhorukov. Co-encapsulation of enzyme and sensitive dye as a tool for fabrication of microcapsule based sensor for urea measuring. Physical Chemistry Chemical Physics, 2011, v. 13, p. 1111011117.

4. Л.И. Казакова. A.B. Дубровский, И.М. Санталова, Д.А. Мошков, Н.В. Аполонник, Л.И. Шабарчина. Распределение белка внутри полиэлектролитных микрокапсул в зависимости от рН среды. Биоорганическая химия, 2012, т. 38, № 1, с. 64-69.

Тезисы:

1. Дубровский А.В., Мошков Д.А., Казакова Л.И.. Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И. Изучение интерполиэлектролитных комплексов в составе микрокапсул, содержащих белки, методом электронной микроскопии. Труды I региональной конференции «Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем (Крестовские чтения)», Иваново, 2006, с. 76.

2. Казакова Л.И., Мошков Д.А., Дубровский А.В., Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И. Электронно-микроскопические исследования структуры полиэлектролитных микрокапсул, содержащих и не содержащих белки. Тезисы Всероссийской молодежной школы-конференции «Современная биотехнология - защите окружающей среды»; представлены в сборнике докладов конференции в электронном варианте, 2006, Пущино.

3. Дубровский A.B., Казакова Л.И., Мошков Д.А., Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И. Исследование ультраструктурной организации содержащих и не содержащих белок полиэлектролитных микрокапсул. Материалы четвертой международной конференции «Нанобио- и другие новые и перспективные биотехнологии», 2007, Пущино, с. 48-51.

4. Л.И. Казакова. Ю.А. Ким, Л.И. Шабарчина, Б.И. Сухоруков. Исследование структуры и динамических параметров нанослоевых оболочек полиэлектролитных микрокапсул с помощью амфифильного флуоресцентного зонда. Материалы четвертой международной конференции «Нанобио- и другие новые и перспективные биотехнологии», Пущино, 2007, с. 90-93.

5. Дубровский A.B., Мошков Д.А., Казакова Л.И.. Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И. Исследование ультраструктурной организации содержащих и не содержащих белок полиэлектролитных микрокапсул методом электронной микроскопии. Материалы третьей Санкт-Петербургской международной конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах», 2007, С.-Петербург, с 72.

6. Казакова Л.И., Дубровский A.B., Ким Ю.А., Сабурова Е.А., Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И. Структура и динамические параметры мультислойных полиэлектролитных микрокасул, содержащих и не содержащих белок, по данным их взаимодействия с флуоресцентным зондом мероцианином. Материалы третьей Санкт-Петербургской международной конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах», С.-Петербург, 2007, с. 69.

7. Гужвина Д.В., Казакова Л.И.. Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И. Разработка технологии получения полых и содержащих биологически активные вещества полиэлектролитных нано- и микрокапсул. Сборник тезисов 11-ой Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», 2007, Пущино, с. 193.

8. Казакова Л.И., Гужвина Д.В., Ким Ю.А., Сухоруков Б.И. Использование флуоресцентных зондов для изучения структуры и свойств полиэлектролитных нано-и микрокапсул и создания на их основе микродиагностикума с флуоресцентной системой регистрации. Сборник тезисов 11-ой Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», 2007, Пущино, с. 204205.

9. Казакова Л.И., Гужвина Д.В., Ким Ю.А., Сухоруков Б.И. Изучение структуры

полиэлектролитных нано- и микрокапсул и создание на их основе микродиагностикума с флуоресцентной системой регистрации. Материалы школы-конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Биомедицинская инженерия - 2007», Пущино, с. 50.

10. Казакова Л.И. Флуоресцентные исследования связывания мероцианина540 с полиаллиламином, полистиролсульфонатом и их интерполиэлектролитным комплексом в водных растворах. Сборник работ молодых ученых ИТЭБ РАН «Экспериментальная и теоретическая биофизика-09», Пущино, с. 40-42.

11. Liubov Kazakova. Multifunctional Polyelectrolyte Microcapsule - a Sensor for Measuring the Concentration of Urea. Max Planck Institute of Colloids and Interfaces, Summer School, 2010, Greece, Create, Rethymnon, p. 43.

12. Шабарчина Л.И., Дубровский A.B., Санталова И.М., Казакова Л.И.. Мошков Д.А., Аполонник Н.В. Распределение белка внутри полиэлектролитных микрокапсул в зависимости от pH среды. Материалы V Российского симпозиума «Белки и пептиды», 2011, Петрозаводск, с. 207.

Заказ № 113-П/03/2012 Подписано в печать 23.03.2012 Тираж 80 экз. Усл. пл. 1,25

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 Ц^Эу ; www.cfr.ru; e-maihinfo%cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Казакова, Любовь Игоревна, Пущино

61 12-3/905

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук

На правах рукописи

КАЗАКОВА ЛЮБОВЬ ИГОРЕВНА

Взаимодействие флуоресцентных красителей с полиэлектролитными микрокапсулами. Разработка флуоресцентных хемо- и биосенсоров.

03.01.02 - биофизика ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

кандидат биологических наук Шабарчина Людмила Ивановна

кандидат физико-математических наук Сухоруков Глеб Борисович

Пущино -2012

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ.....................................

...............................................................................................6

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................

.........................*...........................................................о

2.1. методы экспресс-анализа в клинжо-лабораторной диагностике и место в них сенсорных технологий..............................................................................................™

2.2. применение нано- и микроносителей в создании сенсоров* .1. ...........................13

2.2.1. Типы нано-и микрочастиц, применяемых для создания сенсоров............................14

2.2.2. Способы иммобилизации биологического материала на нано- и микроносителях 15 2.2,5. Оптические сенсоры на основе нано- и микрочастгщ i у

2.3. полиэлектролитные нано- и микрокапсулы.........................^......................................21

2.3.1. Образование, строение и свойства интерполиэлектролитныхколтлексов...........21

2.3.2. Получение, строение и свойства полиэлектролитных пленок на плоских подложках.........................................

2.3.3. Формирование полиэлектролитных капсул................................. .............................."24

2.3.4. Ядра для формирования полиэлектролитных капсул................................................2б

2.3.5. Способы включения флуоресцентных красителей в полиэлектролитные капсулы28

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................................

•••••••••••••••••••••••♦•••••«••«••»♦в»»»»»»»» «JJL

3.1. Материалы и реактивы......................................

3.2. Получение микросферолитов CaC03..Z"'*'"'I*'"............................................................32

3.3. Получение биоминеральных ядер СаС03/белок............................................................32

3.4. Формирование полиэлекттолитных микрокапсул'н1'^ошеролит^ СаСоГи

биоминеральных ядрах........................................................................................^а^мз и

3.5. Формирование 1голиэлектр(ъчишькмш<1ч^ .......

ОКСИДА кремния..............................................................................................ц

3.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ШШКОв'в ЮШСУЛАХ^^. ........................................34

3.7. определение ферментативной активности уреазы ................................................34

3.8. Сканирующая электронная мшо>оскошшполучешь]х'микрок1псул иядер.........

использованных для их формирования......

3.9. Трансмиссионная элгшронная микрос1юпия! Получшше ^ьтратоши^ отвов''

полиэлектролитных микрокапсул..............................................................ов

3.10. спектрофотометрическиеисследования.................................................................36

3.11. флуориме1рические исследования...............................................................................3 6

3.12. Конфокальная лазерная сканирующая мивуоскопгш полиэ^ .........

микрокапсул.........................................

3.13. Определение параметров взаимодейстогш 1№роци

3.14. Определение константы диссоциацю! с^';'и СаьсюмGreen-1...............................37

3.15. Определение константы ассоциации Н+ и SNARF-1 ..............................37

3.16. Измерение интенсивности флуоресценции одиночных пожэлЕк^олиттк......

капсул...........................

3.17. Статистические расчеты......... ..................................................................................ц

.................................................................................

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..........................................................................................................................................39

4.1. Исследование ультраструктурной организации полиэлектролитных шкрокапсул, сформированных с использованием минеральных и биоминеральных

уЦ-Х&Г......................

.....................................................................................

4.1.1. Морфология ядер Si02, СаС03 и биоминеральных ядер СаСО^БСА~'''~.39

4.1.2. Ультраструктурная организщия капсул, сформированных на ядрах Si02............39

4.1.3. Ультраструктурная организация капсул, сформированных на микросферолитах СаСОз........................................................................................................................................40

4.1.4. Ультраструктурная организация капсул, сформированных на ядрах СаС03-БСА.44

4.1.5. Распределение белков внутри полиэлектролитных микрокапсул............................45

4.2. Изучение взаимодействия амфифильного флуоресцентного зонда

мероцианина540 с полиэлек1ролишыми микрокапсулами.............................................49

4.2.1. Предварительные эксперименты, выбор флуоресцентного зонда..........................49

4.2.2. Взаимодействие мероцианина540 с полистиролсульфонатом................................50

4.2.4. Взаимодействие мероцианина540 с полиаллиламином..............................................51

4.2.5. Взаимодействие мероцианина540 с интерполиэлектролитным комплексом........56

4.2.6. Взаимодействие мероцианина540 с полиэлектролитными микрокапсулами.........60

4.3. Иммобилизация флуоресцентных красителей в полголектролитные микрокапсулы............................................................................................................................62

4.4. Разработка хемосенсоров на основе полиэлектролишых микрокапсул...............63

4.4.1. Разработка хемосенсора для определения концентрации растворенного кислорода....................................................................................................................................

4.4.2. Разработка хемосенсора для определения ионов кальция.........................................68

4.5. Разработка биосенсоров на основе полиэлектролитных микрокапсул..................72

4.5.1. Разработка биосенсора для определения глюкозы.....................................................72

4.5.2. Разработка биосенсора для определения лактата...................................................74

4.5.3. Разработка биосенсора для определения мочевины..................................................80

5. ВЫВОДЫ......................................................................................................................................

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................................

БЛАГОДАРНОСТИ.......................................................................................................................

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БАВ- биологически активные вещества

БСА - бычий сывороточный альбумин

ИПЭК - интерполиэлектролитный комплекс

МФ -частицы — меламинформальдегидные частицы

МЦ540 - мероцианин540

ПАА - поли(аллиламин)гидрохлорид

ПАП - последовательная адсорбция полиэлектролитов

ПДАДМА - поли(диаллилдиметиламмоний)хлорид

ПСС - поли(стиролсульфонат)

ПС-частицы - полистирольные частицы

ПЭ - полиэлектролит, полиэлектролитный

ПЭМК - полиэлектролитные микрокапсулы

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия

ТРИТЦ - Тетраметилродамин изотиоцианат

ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия

ФИТЦ - флуоресцеин изотиоцианат

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

1. ВВЕДЕНИЕ

Тема разработки нано- и микроконтейнеров для капсулирования различных веществ широко представлена в научно-исследовательских проектах разных стран и обусловлена общей тенденцией развития наукоемких технологий к универсализации и миниатюризации. Задачи, связанные с созданием, изучением и использованием нано- и микроконтейнеров актуальны для реализации ряда важных разработок в области медицины, косметологии, биотехнологии, тонкой химической технологии и т.д. Существует несколько стратегических направлений их решения, одним из которых является применение полиэлектролитных нано-и микрокапсул, получаемых методом поочередного наслаивания противоположно заряженных полиэлектролитов на коллоидные частицы нано- и микроразмеров с последующим разрушением этих частиц.

Полиэлектролитная капсула - это система с большими возможностями. Ее функциональность определяется назначением помещенного в нее агента. Возможность включения различных веществ в полиэлектролитные капсулы вызвала в последнее десятилетие нарастающую волну интереса к этим объектам как в нашей стране, так и во всем мире. Их используют в качестве систем доставки биологически активных компонентов к клеткам и тканям [1-4], для создания пролонгированных лекарственных средств [5-7], в качестве сенсорных систем для определения низкомолекулярных веществ в многокомпонентных средах [8-10]. Разработка на основе полиэлектролитных микрокапсул миниатюрных портативных систем для качественного и количественного определения биологически значимых веществ могла бы стать шагом к созданию новых неинвазивных способов определения состава внутренней среды организма и приблизить к воплощению в жизнь идею непрерывного in vivo мониторинга метаболитов, лекарственных препаратов и белков. Поэтому особый интерес представляет одновременное включение в полиэлектролитную капсулу фермента и вещества, выполняющего роль трансдьюсера, способного генерировать аналитический сигнал, величина которого пропорциональна содержанию анализируемого компонента. Такая конструкция капсулы удовлетворяет определению «сенсор» и может бьггь использована для создания новых диагностических средств для определения широкого спектра низкомолекулярных веществ. Настоящая работа направлена на решение проблемы иммобилизации чувствительных компонентов в полиэлектролитные микрокапсулы и демонстрации возможности создания на их основе оптических сенсоров с флуоресцентной системой регистрации.

Цель работы:

изучение взаимодействия флуоресцентных красителей с полиэлектролитными микрокапсулами и разработка на основе полиэлектролитных микрокапсул флуоресцентных сенсоров для определения биологически значимых ионов и низкомолекулярных метаболитов.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать ультраструктурную организацию полиэлектролитных микрокапсул, сформированных с использованием минеральных и биоминеральных ядер.

2. Изучить влияние состава полиэлектролитной оболочки капсул и рН среды на внутриобъемное распределение инкапсулированных белков.

3. Изучить взаимодействие флуоресцентных красителей с полиэлектролитными микрокапсулами на примере амфифильного зонда мероцианина540. Предложить способы включения флуоресцентных индикаторов в полиэлектролитные капсулы.

4. Разработать хемо- и биосенсоры для определения биологически значимых ионов и метаболитов на основе содержащих флуоресцентные красители полиэлектролитных микрокапсул. Продемонстрировать функционирование сенсоров в водной среде.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Методы экспресс-анализа в клинико-лабораторной диагностике и место в них сенсорных технологий

Клинико-лабораторные методы исследования являются одним из основных инструментов в общем комплексе контроля состояния здоровья. Они позволяют судить о течении обменных процессов, правильно оценивать функциональное состояние организма, степень тех или иных отклонений, являются основой для постановки клинического диагноза и назначения адекватного лечения. Проводимые в динамике, они позволяют следить за течением заболевания, за эффективностью проводимых реабилитационных и профилактических мероприятий, изучать направленность обменных процессов путем определения специфических промежуточных продуктов обмена в крови, моче и других средах. Основным источником информации о состоянии организма являются показатели углеводного, азотистого и жирового обменов, сведения о гормонах, витаминах и водно-электролитном составе. В зависимости от характера исследования все методы лабораторной диагностики делятся на качественные - обнаружение искомого вещества в пробе биологической жидкости или ткани, и количественные - определение или измерение его содержания. Среди методов, применяемых в медицинской лабораторной практике, выделяют физико-химические (оптические и электрохимические), биохимические (иммунохимические, молекулярные), методы микроскопии. Их использование, как правило, ограничено условиями клинической лаборатории, что связано с длительностью, сложностью и трудоемкостью операций, соблюдением условий стерильности, необходимостью использования специального оборудования, посуды и измерительных приборов. [11]. В связи с этим особое место в диагностике заняли методы экспересс-анализа, позволяющие пациенту самостоятельно осуществлять контроль состояния своего здоровья и вовремя обращаться к помощи квалифицированных специалистов.

On-site анализы - термин аналитической химии, обозначающий комплекс аналитических методов, позволяющих проводить определение веществ вне стационарных лабораторий [12]. Их целью является быстрая и простая оценка присутствия и/или содержания химических веществ в образце и осуществляется с помощью тест-систем, химических и биохимических сенсоров. Общим принципом создания тест-систем является использование реакций и реагентов в условиях и формах, обеспечивающих получение визуально наблюдаемого или легко регистрируемого эффекта. Разработки в этой области являются одной из основных тенденций развития аналитической химии и обусловлены потребностями не только медицинской направленности, но и в таких сферах деятельности

человека, как контроль технологических процессов, качества пищевых продуктов, криминалистике, космических исследованиях.

Тест-системы представляют собой портативные, легкие и дешевые аналитические средства и соответствующие экспрессные методики для обнаружения и определения веществ [12]. Их отличительными чертами и одновременно достоинствами являются:

- максимальная приближенность выполняемого анализа к пациенту;

- отсутствие сложного аппаратурного оформления;

- невысокие требования к квалификации исполнителя;

- существенное сокращение или отсутствие этапов преаналитической подготовки образцов;

- малый объем жидкости, требуемой для анализа (от нескольких микролитров);

- простота и скорость выполнения анализа (секунды, минуты);

- высокая надежность и специфичность тестов;

- длительная стабильность при правильном хранении.

Среди прочно вошедших в диагностическую практику можно отметить тест-средства на основе «сухой химии». Методы «сухой химии» используют готовые формы реактивов для микроанализа и миниатюрные приборы для качественной и количественной оценки полученных с помощью этих реактивов результатов анализа. Особенностью этой технологии является сочетание в одном аналитическом элементе необходимых реактивов для проведения реакции обнаружения или определения исследуемого компонента с возможностью детекции результата вплоть до создания аналитических систем.

Однако на практике чаще всего реализуется подход построения тест-системы, в котором оценка результата анализа производится визуально. Принципиальная схема «сухих» тест-систем представлена на рис. 1, демонстрирующем, по крайней мере, три ее основных компонента: носитель, реагенты или их последовательность и индикатор, соответствующий конечному продукту реакции. При данном способе анализа все необходимые реактивы химически или физически иммобилизированы на вспомогательном носителе (бумага, нитроцеллюлоза, силикагель, пенополиуретан и т.п.), обеспечивающим беспрепятственное прохождение образца аналита по всем слоям тест-средства. Запуск реакции производится после воздействия образца биологической жидкости и растворения ею сухих реактивов, иммобилизированных на носителе аналитического элемента. Оценка результата производится по интенсивности окраски индикаторной зоны, ее площади или высоты. Классическим примером могут являться индикаторные порошки, таблетки, колонки, тест-полоски, слайды. Основным недостатком методов «сухой химии» можно считать

субъективность визуальной оценки результата, и, соответственно, невысокую надежности анализа и точности измерения.

Рис. 1. Принципиальная схема тест-средства, реализованного в виде слайда, для анализа биологической жидкости на основе технологии «сухой химии».

Однако не всегда тест-системы предполагают визуализацию результата. В настоящее

время в среде поставщиков диагностической продукции термин «тест-системы» часто

употребляется для обозначения диагностических наборов, выработанных в заводских

условиях и готовых для применения в анализе. При этом используют довольно сложные

методы иммуноферментного анализа, иммуноблота, полимеразной цепной реакции и т.д.

Они обладают рядом неоспоримых преимуществ, таких как высокая специфичность,

точность и управляемость реакций, однако возвращают проведение анализа в лабораторные

условия. Компромиссом в решении этой проблемы стало развитие сенсорных технологий анализа.

Сенсор (от англ. sensor - датчик, sensus - восприятие, чувство, ощущение) - термин обозначающий устройство, преобразующее входное воздействие любого физического, химического или биохимического процесса в сигнал, удобный для дальнейшего использования [13]. Эти устройства состоят, как правило, из чувствительного (рецепторного) компонента и физического преобразователя (трансдьюсера), которые находятся в непосредственном прямом контакте (рис. 2).

Рис.