Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие энхансеров, промоторов и инсуляторов в модельных системах на основе мобильных элементов Drozophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие энхансеров, промоторов и инсуляторов в модельных системах на основе мобильных элементов Drozophila melanogaster"

% ск

Л На правах рукописи

4 , V УДК 575.22:595.773.4

ч»

ГАУЗЕ Мария Георгиевна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЭНХАНСЕРОВ, ПРОМОТОРОВ И ИНСУЛЯТОРОВ В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ НА ОСНОВЕ МОБИЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ОгоюрИПа теЫпо^ет.

Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1998

Работа выполнена в лаборатории регуляции генетических процессов Института биологии гена РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук П.Г.Георгиев.

Официальные оппоненты:

чл.-корр. РАН, доктор медицинских наук, профессор Л.И.Корочкин, доктор биологических наук, профессор В.Г.Митрофанов.

Ведущая организация:

Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится «. .й.» ..ШП&Ж..... 1998 года в «.7.!с.м часов на заседании

Диссертационного совета Д.200.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, Москва, ул.Вавилова 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им.В. А.Энгельгардта РАН по адресу. 117334, Москва, ул.Вавилова 32

Автореферат разослан «. и .» ... .. 1998 года

Ученый секретарь Диссертационного совета канд. фарм. наук

Грабовская Л.С.

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Гены эукариот имеют сложно устроенные регуляторные области, содержащие большое количество регуляторных элементов. Энхансер и промотор гена взаимодействуют между собой, находясь иногда на больших расстояниях друг от друга, часто превышающих сотни тысяч пар нуклеотидов. Несмотря на такие дистанции, энхансер специфически активирует промотор только «своего» гена и не взаимодействует с близлежащими промоторами других генов. Существенным фактором, обеспечивающим правильное взаимодействие между энхаисером и промотором, является взаимная специфичность белков, которые с ними связываются. Кроме того, способствовать изоляции промотора от чужеродных энхансеров может наличие в геноме эукариот инсуляторных элементов.

Инсулятор - это цис-регуляторный элемент, который блокирует взаимодействие между энхансером и промотором, если он расположен между ними. При этом ни энхансер, ни промотор сами по себе не теряют своей функциоанльной активности. Характерным свойством инсуляторных последовательностей является их способность делать экспрессию гена в конструкции, фланкированной инсуляторами, независимой от места инсерции конструкции в геном.

В настоящее время наиболее изученным инсулятором является 5и(Н\у)-связывающий район, который входит в состав ретротранспозона мдг4 Ого^оркИа melanogaster. 8и(Нш)-связывающий район состоит из 12 октамерных сайтов связывания для белка зи(Н\у); уменьшение числа сайтов связывания приводит к ослаблению инсуляторной функции. Было показано, что введение мутации зи(Нк') приводит к супрессии мутантного фенотипа, из чего следует, что белок ответствен за мутаптный фенотип, возникающий вследствие внедрения

инсулятора. Другим белком, участвующим в работе инсулятора, является mod(mdg4). Хотя оба белка клонированы и определена их структура, не существует единого мнения о возможном механизме действия su(Hw)-HHcynaTopa. Поэтому создание удобных генетических моделей для изучения свойств инсулятора in vivo является актуальной задачей.

В данной работе были получены адекватные генетические модели, позволившие выявить новые аспекты взаимодействия энхансеров с промотором, а также уточнить механизм действия инсуляторных элементов.

Цель и задачи исследования. Основной целью настоящего исследования являлось изучение взаимодействия между регуляторными элементами, находящимися на больших расстояниях друг от друга с помощью модельных систем на основе мобильных генетических элементов.

В работе были поставлены следующие задачи:

1) изучить взаимодействие между энхансером и промотором в системе, где энхансер удален от промотора и между ними находятся два других гена;

2) показать участие регуляторных белков zeste и е(у)2 в организации взаимодействия между энхансером и промотором на больших дистанциях;

3) изучить влияние мутаций в генах zeste, е(у)1 и е(у)3 на инсуляторные свойства su(Hw)-CBH3bmaioi4ero района;

4) молекулярно и генетически охарактеризовать систему нестабильности в локусе yellow на основе мобильного элемента hobo;

5) изучить влияние мутаций в генах su(Hw) и mod(mdg4) на фенотипическое Проявление производных, полученных в системе hobo нестабильности.

Научная новизна н практическое значение работы. Впервые показано, что энхансер локуса scute D.melanogaster может активировать промотор своего гена, даже находясь в локусе yellow, т.е. когда между «своими» энхансером и промотором оказываются промоторы двух других генов.

Показано участие белков zeste и е(у)2в организации взаимодействий менаду энхансером гена scute и промотором гена scute. На примере базового аллеля se0' мы продемонстрировали, что мутации в генах zeste, efy)l и е(у)3 частично супрессируют иясуляторные свойства su(Hw)-CBH3biBaioiuero района, что. позволило предположить вероятную зависимость инсуляции от присутствия этих белков.

Были изучены мутации в гене yellow, индуцированные инсерцией мобильного элемента hobo. Впервые показано, что частым событием при этом является дупликация района, расположенного между двумя однонаправленными hobo элементами.

Показано, что взаимодействие между su(Hw)-cBfl3biBaioniHMH районами может приводить к нарушению инсуляции. Изучение производных позволило сделать новые выводы о механизмах действия белков su(Hw) и mod(mdg4).

Полученные результаты предполагают, что инсулятор может действовать автономно. Это позволяет использовать 5и(Нш)-инсулятор в качестве последовательности, обеспечивающей независимую экспрессию трансгена в генно-инженерных конструкциях не только у дрозофилы, но и в других органи змах.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 36-й Конференции по дрозофиле (36th Annual Drosophila

Research Conference 1995), на межлабораторном семинаре (1996) ИБГ РАН, а также на двух конкурсах научных работ ИБГ РАН 1997 и 1998.

Публикации. По теме диссертации опубликовано четыре печатные работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на ........... страницах,

включая таблиц, рисунков и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы из............наименований.

Результаты исследования.

Обе исследованные нами системы возникли на основе линии y2scD!w"a. Мутация у2 вызвана внедрением мобильного элемента МДГ4 перед геном yellow, отвечающим за пигментацию у дрозофилы. Инсерция МДГ4 произошла между промотором и энхансерами, отвечающими за специфическую активацию транскрипции гена в кутикуле тела и крыловых пластинках. МДГ4 содержит su(Hw) инсулятор, который блокирует действие вышеуказанных энхансеров, что определяет желтую окраску тела и крыловых пластинок у2 аллеля. Мутация scD1 также вызвана инсерцией МДГ4 между геном scute, отвечающим за развитие сенсорных органов, и его энхансерами.

I. Анализ Аобо-ицдуцированных мутаций в локусе yellow у4" , базовый аллель системы, содержит «и(Нж}-связываю1Ций район, окруженный инсерциями двух йо&нэлементов. Базовый аллель уМ1 спонтанно возник из линии y2scD1waa в результате дополнительной инерции двух мобильных элементов hobo в район гена yellow (Рис. 1). По сравнению с родительским аллелем у2 у мух с фенотипом ум наблюдалась слабая

пигментация крыловых щетинок, а также мугантная окраска грудных и ножных щетинок (Табл.1).

ТАБЛИЦА 1. Фенотипы yellow аллелей, полученных в систем hobo нестабильности, влияние мутации su(IIw).

Пигментация

у аллели Тело Крылья Щетинки

Гр II Кр Кр

2

У

ydh* yrh*

mh32 уI»*

У1'1

y2hl31 y2hl 15

1(5) 1(5) 5(5)

4 3(5) О

КО

1(5) 2(5) 5(5) 4 3(5) О 1(2)

5 2 2 2 2 О 2

Щетинки разделены на грудные (Гр), ножные (Н), крыловые (Кр), и брюшные (Бр). Числа в скобках показывают, какое дейслзие оказывает на фенотип у аллелей мутантная комбинация su(Hw)v/ su(Hw)-. Для определения фенотипа yellow уровень пигмептацин в различных тканях взрослых мух оценивали визуально на 3-5 дневных самцах, развивавшихся при 25°С.

dh* , dkl dhl2 dh¡9 dh2¡ dh24. lh*. Ihll Ihli 1M4 IhlS lhl7. rh* У (У , У . У , У : У ). У (У • У , У .У .У ), У , rhl rh2 rh3 rh7 rh9.

(y ,y ,y ,y ,y )■

Классификация аллелей у представлена в работах (GEORGIEV et al 1992; GEORGIEV ei al. 1997). у аллели одного фенотипа обозначены одинаковым набором букв в надстрочнике. Буквы в надетрочгапсе обозначают: "h", аллель был получен в системе hobo нестабильности; "2",

2 „.,„„,„ „ „„

пигментация тела крыльев у мух такого аллеля такая же как у мух у ; а "Г, m , г -пигментация крыльев у игух соответствует уровню 2+, 3+, 4+ п 5+, соответственно. Числа в

надстрочнпке аллеля объясняют его происхождение. Например, аллель является

Ihll

производным аллеля_у

В результате клонирования с последующим секвенированием мы выяснили, что один hobo элемент, обозначенный как hobo-l (yellow проксимальный), встроился в интрон гена yellow в позиции +875 по отношению к сайту начала транскрипции (Geyer and Corees 1987; Martin et al. 1989). Снижение пигментации грудных и ножных щетинок может являться результатом частичной инактивации энхансерного элемента, отвечающего за экспрессию гена yellow в щетинках и находящегося в районе инсерции hobo элемента. Второй hobo

(yellow дистальный), встроился в позиции -2464 в район энхацсера, отвечающего за экспрессию в крыловых пластинках (Geyer and Corees 1987; Martin et al. 1989). В обоих случаях 2.2 тпн hobo элементы имеют одинаковую делецию и фланкированы 8 пн дупликациями, СТТТАТАС и ATATCTAG соответственно. hobo элементы имеют одинаковую ориентацию, которая противоположна направлению транскрипции гена yellow (Рис. 1).

hobo 2 hobo 1

wing blade enhancer body cuticle enhancer <2? bristle enhancer

i_i 1kb

Рис. 1. Структура локуса yellow в аллеле

Два экзона геиа yellow показаны более жирными черными линиями. Стрелка определяет направление и место начала транекгащии. Мобильный элемент gypsy встроился в -700пн от сайта начала транафипцшг. Стрелки в прямоугольниках соответствуют ДКП мобильного элемента gypsy, показано их направление. Окружности черного цвета соответствуют Su(Hw)-связывающему району. Энхансеры гена yellow обозначены при помощи овалов. Жирными стрелками показаны hobo элементы и их направление. R,£eoRJ; Н,Ни<Ш1; G,BgHl; X,Xho\; B.BawHI; S,SaIi; "N,Ncol. Фрагмент геномной ДНК, использованные в качестве зондов, обозначены закрашенной линией.

Для уточнения роли мобильных элементов hobo в экспрессии гена yellow мы исследовали мух yihl, несущих комбинацию мутаций su(Нw)7su(Hw)\ которая практически полностью инахтивирует ген su(Hw) (Harrison et а!. 1993). У мух уЛ!; su(Hwfls\x(Hw)'1 наблюдался уровень пигментации дикого типа в

кутикуле и крыловых пластинках, но сохранялась мутантаая окраска грудных и ножных щетинок (Табл. 1). Из этого следует, что в аллеле уш su(Hw)-micynnTop продолжает блокировать знхансеры тела и крыльев. Инсерция двух hobo элементов приводит к слабой активация экспрессии гена yellow в крыльях и репрессирует в грудных и ножных щетинках.

Дойо-иидуцированные перестройки часто ассоциированы с дупликациями между двумя hobo элементами. Следующей задачей данного исследования был анализ перестроек, индуцированных hobo элементом. Мобилизацию hobo элемента проводили путем скрещивания ут самцов, содержащих много hobo элементов, с C(l)RM,yf самками, которые не имеют hobo элемента. В F2 поколении после исходного скрещивания были получены два основных класса производных аллелей (Табл. 1 ): у"' (полная инактивация гена yellow) и у1' (нормальная окраска кутикулы и крыловых пластинок, мутантный фенотип грудных и ножных щетинок).

у1Н аллели представляли собой делецию внутренних последовательностей гена yellow, в результате чего экспрессия гена yellow была полностью инактивирована.

Шесть независимо полученных аллелей у'к по результатам Саузерн блот анализа имели одинаковое строение. Один из аллелей, y'hl, был проклонирован. Аллель у'м возник в результате дупликации района, расположенного между двумя hobo элементами (Рис. 2). Все повторяющиеся элементы в аллеле у'1'1 и других мутациях, связанных с дупликациями, пронумерованы в проксималыш-дисталыюм направлении по отношению к гену yellow (hobo-l, 2 и 3; gypsy-1 и 2 и тд.).

ДНК мух линии уг>'7 отличалась по результатам Саузерн блот анализа от других аллелей y'h. Аллель у,м имеет делецию, начинающуюся от hobo-З и

частично захватывающую gypsy-2, оставляя 5и(Н\у)-связывающий район последнего без изменений (Рис. 2). PCR-клонирование концов делеции с использованием праймеров из hobo (hi) и gypsy (gl), сопровождавшееся секвенированием, показало, что делегированы последовательности между 5' концом hobo-З элемента и сайтом 3428 последовательности gypsy, в соответствии с картой gypsy, представленной Marlor et al. (1986).

Таким образом, дупликация района, фланкированного двумя hobo элементами, является основным мутационным событием в системе.

Потеря инсуляции в аллелях. y'h. Как было показано выше, в аллелях у'к дупликация, затрагивающая hobo-2, энхансеры тела и крыльев, gypsy мобильный элемент и промотор гена yellow, приводит к восстановлению нормальной экспрессии гена yellow. При введении гетерозиготы su(Hw)2lsu(Hw)' не происходит заметного изменения фенотипа (Табл. 1). Таким образом,

дупликация позволяет каким-то образом преодолеть su(Hw)-3aBnciiMyio инсуляцию гена yellow.

У мух у'1'7 делегированы дистаяьные энхансеры гена yellow. Следовательно, при наличии только проксимальных энхансеров тела и крыловых щетинок может восстанавливаться транскрипция гена yellow в присутствии двух 5и(Н\у)-связывающих доменов и двух промоторов. Этот результат может быть объяснен либо потерей инсуляции в определенном структурном контексте, либо тем, что происходит инициация транскрипции с дистального промотора гена yellow (ур2) при помощи проксимальных энхансеров, которые не изолированы от промотора su(Hw)-cmnj,maroimiM районом.

Для того, чтобы выяснить, которое из объяснений более правильно, мы проверили, насколько правильно активируется промотор гена yellow в нашей системе. Был проведен анализ мРНК гена yellow. Мы показали, что мРНК линий yrh? и Oregon, выделенная из куколок, находившихся на трех различных стадиях, имеет идентичный размер и количество, что свидетельствовало о том, что в мутантной линии ген yellow транскрибируется с нормального промотора и активируется своими собственными энхансерными элементами.

Другим доказательством экспрессии гена с проксимального промотора (ypl) является структура аллеля ymhl"(Рис. 3).

Мухи утШ имели близкую к дикому типу пигментацию тела и крыльев (Табл.1). В этом аллеле энхансер тела и часть крылового энхансера, фланкированные двумя 5и(Н\у)-связывающими районами, изолированы от промотора гена yellow (ypl) (Рис. 3). Таким образом, транскрипция гена yellow может начинаться только с промотора, отделенного от своих энхансеров 5и(Н\у)-связьгаающим

доменом. Некоторое снижение пигментации у мух утН'2 можно объяснить делецией части энхансера крыловой пластинки.

Рис. 3. Структура аллеля у"*3-.

Стрелками показано направление транскрипции генов yellow, seme, achaete и ¡'seule. Остальные обозначения как на Рис. 1.

Вышеизложенные результаты подтверждают предположение о том, что активация транскриции гена yellow в теле и крыльях действительно происходит за счет потери инсуляции в присутствии двух мобильных элементов gypsy.

Генетический и молекулярный анализ производных аллеля у'к. Для получения производных аллеля yh самцов из трех независимо полученных линий ум, y'h2 и ьyrhS> скрещивали с самками C(l)RM,yf. Большая часть из полученных производных аллелей распределилась по четырем следующим классам: у"1

(полная инактивация гена yellow); уа' (фенотип, идентичный родительскому

ihK lh ,

аллелю у ); у (желтая окраска грудных и ножных щетинок и промежуточная степень пигментации теяа и крыльев) и y2h (желтая окраска кутикулы и крыловых пластинок, идентичная у ).

Аллели у,н были связаны с делецией внутренних последовательностей гена yellow между hobo элементами, все аллели у1"' имели структуру, идентичную базовому аллелю уш. В аллелях y"h произошла делеция дупликации, а также прилежащих последовательностей гена yellow. У этих аллелей существуют

gypsy 2

небольшие фенотипические различия, которые зависят от размера делении. Класс мутаций у"' был изучен более подробно.

Природа мутаций уа. У мух с фенотипом у"' наблюдается желтая окраска грудных и ножных щетинок и промежуточный уровень пигментации кутикулы к крыловых пластинок (Табл. 1). Один из аллелей, у"'!\ был проклонирован, и его структура приведена на Рис. 4. Мутация ylh" возникла путем рекомбинации между 5-ДКП gypsy-2 и J'-ДКП gypsy-1, в результате чего hobo-2 и последовательности гена yellow, находившиеся между hobo элементами, были делегированы. Согласно результатам Саузерн блот гибридизации, все аллели у"1 имели такую же структуру. Введение гетерозиготы su(JIw)2lsu(HwJ ' приводило к супрессии мутантного фенотипа аллелей ylh (Табл. 1), Таким образом, в у"' аллелях зи(Ни)-связывающие районы не полностью, а лишь частично бломгруют эпхансеры тела и крыльев.

hobo 2 hobo 1

Рис. 4. Структура аллелей уШ1\ у~н'п и у-М31. Стрелками показан размер делений в аллелях у11". Остальные обозначения как на Рис.1.

Чтобы выяснить, какой регуляторный район отвечает за активацию

транскрипции гена yellow в аллелях уш, мы получили ряд производных из аллеля

ли У •

т, 2hl¡5 2hl31

В полученных нами мутантных аллелях у ну кутикула и крыловые пластинки не были пигментированы (Табл. 1). Гибридизация по Саузерну показала наличие делений размером 7 тпн (y2l'us) и 8 тпн (y:h,SI), затрагивающих район, прилежащий к элементу hobo-2. В делегированный район входили энхансеры, отвечающие за пигментацию в кутикуле и крыловых пластинках, а также внутренние последовательности gypsy (Рис. 4). Введение гетерозиготы su(Hw)2hu(Hw)" в линии у21'"5 и у2"131 очень слабо усиливало пигментацию только крыловых пластинок. Таким образом, в аллелях ул именно энхансеры тела и крыльев ответственны за частичную активацию экспрессии гена yellow, несмотря на тот факт, что они отделены от промотора двумя su(Hw)-связывающими районами.

П. Мутации, индуцированные перемещением мобильного элемента jockey.

Частичная реверсия мутантного sc фенотипа в ПНП щетинках связана с изменениями в локусе yellow. Было обнаружено, что некоторые ревертанты у+. полученные из линии y2scD!, такие как y:p>9scD' (Geyer et al. 1988a) и y+2MCscD> (Georgiev el al. 1990), частично супрессируют мутантный scale фенотип: ПНИ щетинки у таких_мух присутствуют в 70-90% случаях (табл. 2; рис. 5).

Мутантный фенотип scD1 полностью супрессируется сильной мутацией в гене su(Hw). В этом аллеле белок su(Hw) блокирует те энхансеры гена scute, которые инсерция мобильного элемента МДГ4 отделяет от промотора, в частности, энхансер ПНП щетинок. Таким образом, в ревертантах y+2MCscD1 и должно сохраняться негативное действие 5и(Н\¥)-связывающего домена на экспрессию ПНП щетинок в гене scute. Возникновение у+2МС и у2#±9

ревертантов связано со встраиванием мобильного элемента jockey в область sn(Hw)-CBfl3bmaioinero района, что сопровождается одновременной потерей последовательностей МДГ4 (Geyer et al. 1988; Georgiev et al. 1990; Gerasimova et al. 1995). В линии убыла также найдена короткая 25 нуклеотидная последовательность из локуса scute (Geyer et al. 1988).

ТАБЛИЦА 2. Влияние аллелей у и мутаций е(у)2Н* от ■Р^ на образование

ТТТТГТ D1

ПНП щетинок в аллеле sc

Генотип + Орб , ..ul

_L__efy>2

_Процент образования ГОШ щетинок_

2 + 100(100) 100 (100) 100(100)

/SD1 1 (2) 0 (0) 0 (0)

+1МС D1 1(1) 0(0) 0(0)

Тзмс Dl 0 (1) 0 (0) 0 (0)

J2MC D1 74(90) 38(77) 29(51)

2+9 Dl 83 (92) - 20 (40)

V sc v '

В каждом случае было проанализировано от 200 до 400 самцов и самок. Числа представляют процент самцов и самок (значения в скобках) с ПНП щетинками [(общее число ПНП щетинок в проанализированных мухах/2 делили на число проанализированных мух) х 100%]. Фенотип мух дикого.типа принимался за 100%.

Рис. 5. Структура yellow-achaete-scute генетического комплекса по данным Campuzano et al. (1985).

Толстыми стрелкам показано направление транскрипции генов yellow, achaete и scute. Кружками обозначен su(Hw)-CBí3biBa:roimiü район gypsy. Вертикальные линии соотаетствугот сантам инсерции мобильных элементов gypsy и jockey. Не закрашенные прямоугольники соответствуют дуплицированному 1.8 тпн району локуса seine, который совпадает с локализацией энхансера ПНП_щешнок._

Восстановление образования ПНП щетинок в линиях y*2UCscDI и y2n+9scD1 не связано с делецией 5и(Н«-)-связывающего района гена yellow, потому что два

+ 1-ШС DI +ЗМС D1

других изученных нами у ревертанта у ser и у se , в которых произошла делеция МДГ4 и осталось только по одному ДКП, имели такой же scute фенотип, что и мухи из линии y2scD1. Следовательно, восстановление мутантного se фенотипа в ПНП щетинках зависит либо от дополнительной инсерция jockey в локус yellow, либо от каких-то изменений в районе achaeie-scute генетического комплекса. Для решения этого вопроса мы провели детальный

« +2МС DI 2tt+9 DI

молекулярный анализ мутации у se и у se .

Молекулярный анализ аллелей у+ы>с$с01 и yW+'sc01 показал, что в локусе yellow присутствует дуплицированный энхансер ПНП щетинок. С помощью Саузерн-блот-анализа мы сравнили ДНК из исходной линии и двух ревертантов и установили, что изменения в этом локусе происходят , но затрагивают только область, заключенную между мобильными элементами МДГ4 и жокеем. В обоих мутациях появляется по одной дополнительной полосе, при сохранении исходной, после гибридизации с ДНК фага Àsc 14 или ее HindUl-EcoRl фрагментом. Этот результат позволяет предположить, что соответствующий участок локуса scute не изменяется, но подвергается дупликации.

Для того, чтобы понять природу дупликации, мы проклонировали фрагменты ДНК, соответствовавшие по молекулярной массе дополнительным полосам, появлявшимся при переваривании ДНК линии y*2McscD1 рестриктазой ЕсоК\ (фрагмент длиной 14.5тпн) или ДНК линии y2#+9sc" рестриктазой ВатШ (фрагмент размером 12.9тпн). Подробные рестрикционные карты полученных клонов представлены на Рис. 5,6, (2, 3).

XGO P X x H HH P N XGO PX ВНР GH P

[J I I I I и I I ^IJ 11 111_L!_

SH G HP HTR8

-U-1 L !

yellow etTanp

XGO R HHP N P ^HG^^HBXPr ...oXGO

yj 1 1 !-f 1 <1 , Mil-ULJj4^g¿.5..LTR

tp т—-- ---~

-ltrWí

jockey

XGCbn AMP PX BHP GH P

2 D1

Рис. 6. Рестрикциопная карта и схематическое изображение аллеля у sc и полученных из него ревертантов y+^MCscDl д у

(1) Лсясусы yellowu scute в районе мутаций^ и sc^^ представлены по Campusano et al. 1985; Parkhurst and Corees 1986, карга gypsy no Marlor et al. 1986.

(2) y+2MC мутация в локусе yellow (Georgiev et al. ¡990; this wotk). (3мутация в локусеуеНоw (Geyer et al. 1988; this work).

Рестрикционные сайты обозначены следующим образом: В, Ba/nllV, G, BgЛТ; Н, HindIII; N, A'col; P, Pstl; R, ЕсоШ; S, Salí-, X, Xbal; O, Xho\. Закрашенными кружками обозначены (Hw)-связывающие районы; жирной стрелкой - jockey и его направление; тонкими стрелками - ДКП мобильного элемента gypsy и их направление; стрелками в прямоугольниках - душщцировашше последовательности гена scute и их направление; районы, кпонировашаде в этой работе, подчеркнуты. Районы, использованные в качестве зондов, показаны при помощи более толстой линии.

Реверсия у*2мс вызвана удалением небольшой области МДГ4, включающей сайт связывания белка su(Hw), и встраиванием на его место jockey й всего отрезка локуса scute, заключенного между jockey и 5'ДКП мдг4 в мутации scD!; длина отрезка 1,8 тпн. Ориентация фрагмента scute и мобильного элемента jockey

в локусеyellow по отношению к 5-ДК11 МДГ4 противоположна их ориентации в локусе scute (Рис. 6).

Реверсия в y2e^9scD: также связана с потерей последовательностей МДГ4, причем в этом случае теряется большая часть МДГ4, и сохраняется только 5-ДКП и примерно половина 5-ДКП. На место МДГ4 внедряется jockey и отрезок локуса scute, идентичный описанному выше. Ориентация сегмента scute и мобильного элемента jockey в этом случае совпадает с их ориентацией в локусе scute. ДКП МДГ4, 1,8 тпн фрагмент scute и jockey расположены в том же порядке

2#+9 Di DI т --

и имеют одну и ту же ориентацию в у se и se мутациях. Таким образом,

^ + ~ 2 DI +1МС D1

единственное отличие обоих у ревертантов от линии у se и у se состоит в том, что они содержат последовательность jockey и 1.8 тпн seule фрагмент в локусе yellow. Недавно было показано, что энхансер, отвечающий за экспрессию гена scute в ПНП щетинках, находится внутри дуплицированного 1.8 тпн фрагмента (Gomez-Skarmeta et al. 1995). Именно ПНП щетинки появляются у

2ft+9 +2МС

у и у ревертантов.

Гипоморфная мутация в локусе е(у)2 и точечная мутация (z°f6) в локусе zeste частично супрессируют образование ПНП щетинок в линиях y2n+>scn' и y+McscDi. g описанной нами системе произошла транспозиция энхансера ПНП щетинок. Энхансер оказался на расстоянии 35-40тпн от контролируемого им промотора, отделенным от промотора гена scute по крайней мере двумя промоторами других генов. Мы предположили, что гены, принимающие участие в организации дальнодействия (Pirrotta 1990; Georgiev 1994), могут влиять на работу перемещенного энхансера. Для проверки этого предположения мы изучили влияние мутаций в генах zeste, е(у)1, е(у)2 и е(у)3 на процесс формирования ПНП щетинок. Оказалось, что многие из этих мутаций также оказывают влияние на экспрессию гена scute в линии y2scD1.

Т, 2D I +ШС Dl +3MC DJ , , ,«/ „„,

В линиях y se ,у se или у se мутации е(у)2 и z°?6 не оказывали влияния на scD1 фенотип. С другой стороны в комбинации y2n+9scD1 или y+2McscD1 с мутациями е(у)2"' или z0p6 процесс формирования ПНП щетинок был существенно супрессирован. Принимая во внимание, что мутации е(у)2"' и г°р6 не влияют на мутантпый фенотип аллелей se2 и se6, связанных с делениями регуляторных последовательностей гена seule (Campuzano et al. 1985; Gomez-Skarmeta et al. 1995), наш результат предполагает участие белков е(у)2 и zeste непосредственно в работе дуплицированного ПНП энхансера.

Мутации в генах е(у) 1, е(у)3 и zeste могут влиять на процесс инсуляции в гене scute через $и(Н\\)-спязыва1ощий домен. Мутации в локусах е (у) 1 и е(у)3 супрессируют мутантный фенотип seD1, причем у самок этот эффект выражен значительно сильнее, чем у самцов (Табл. 3). Следует отметить, что влияние мутации е(у)3"' на scDI фенотип не ограничено ПНП щетинками; происходит также частичное восстановление передних орбитальных щетинок.

ТАБЛИЦА 3. Влияние мутаций z е(у) f\ е(у)з"^ и комбинаций этих

D1

мутаций на образование щетинок в аллеле se

Генотип линии _Процент образования щетинок

AOR PV OC ANP se H\V

D1 se 0(0) 0(0) 0(0) 1 (2) 12(16) -

Dl . ,.ul se е(у)1 0(0) 0(0) 0(0) 9 (37) 11(17) -

Dl . .Ml se e(y)3 8(11) 24 (32) 40 (54) 12(52) 32 (64) -

Dl v77h se z 12(16) 5(8) 14 (24) 27 (54) 30(71) +

Dl v77h , ,m1 se z e(y)l 11(14) 8(17) 11(25) 31 (60) 35 (76) +

Dl v77h , .Ml se z e(y)3 28 (56) 39 (46) 48 (82) 42 (80) 46 (89) +

Обозпачеши такие же как в таблице 4, Н\У (+) - 1-3 дополнительные щетинки появляются на потуме гомозиготных самок. Ни» (-) - отсутствие дополнительных тце-пгнок. Передние орбитальные (А(Ж), поствентральные (РУ), оцелярные (ОС), пд>едние нотоплевральные (АКР), скутегарные (БС).

Мутация z77h, являющаяся нулевой мутацией по локусу zeste, также супрессирует scD1 фенотип: частично восстанавливается образование ПНП, оцелярных, пост-вентральных и скутелярных щетинок (Табл. 3). Мутация z77h также индуцирует слабый Hw фенотип: от одной до трех дополнительных щетинок появляется на нотуме мух, несущих мутацию scD1. Мутации е(у)3"' и z77h оказывают аддитивный супрессируюгций эффект на мутантный фенотип самки с такой комбинацией мутаций имеют близкое к норме число ПНП, скутелярных, оцелярных щетинок и около 50% поствентральные и передних орбитальных щетинок (Табл. 3). Мутации е(у)Г1, е{у)3"! и z7'h не влияют на фенотип аллелей se2, scs или se6, связанных с делениями регуляторной области гена scute.

Обсуждение результатов.

I. Система нестабильности с перемещением мобильного элемента hobo.

Перестройки, индуцированные hobo элементом, часто связаны с дупликацией последовательности, заключенной между hobo элементами.

Предшествующие генетические и молекулярно-биолошческие исследования показали, что hobo элементы часто вызывают хромосомные перестройки. (Lim 1988; Sheen et al. 1993). Lim предположил, что за такие перестройки ответственна внутрихромосомная рекомбинация между hobo элементами. Тип таких перестроек зависит от ориентации мобильного элемента (Lim and Simmons 1994; Eggleston et al. 1996). В том случае когда два hobo элемента находятся в одной ориентации, часто происходят делеции с потерей всего материала между ними, а в точке разрыва остается единичная копия hobo элемента. Lim and Simmons (1994) предложили модель, согласно которой hobo элементы вызывают хромосомные перестройки путем гомологичного спаривания с последующей рекомбинацией между элементами.

В аллеле ydM обе копии hobo элементов находятся в одной и той же ориентации, и делеция последовательностей между ними должна приводить к полной инактивации гена yellow. Неожиданно нами было обнаружено, что hobo перестройки часто приводят к появлению фенотипа у'", связанного с дупликацией геномных последовательностей, находящихся между hobo элементами. Похоже, что такое событие происходит за счет рекомбинации между сестринскими хроматидами.

Наиболее вероятно, что дупликации, вызванные hobo элементом, являются обычным событием, но в изучавшихся ранее системах hobo индуцированные перестройки, приводящие к дупликации района между hobo элементами, не оказывали влияния на фенотип и, следовательно, не были замечены.

Новые аспекты механизма действия su(H\v)-niicyjmn>pa. Мы показали, что два мобильных элемента hobo, один из которых встроился в интрон гена yellow, а другой в его 5- регуляторную часть (аллель у1"'), позволяют частично преодолеть инсулирующий эффект su(Hw)-cBH3bmaioinero района, разрешая энхансерам тела и крыльев частично активировать промотор гена yellow. Одно из возможных объяснений состоит в том, что эктопическое спаривание между hobo элементами нарушает su(Hw)-3aBncnMyio инсуяяцшо. Роль спаривания между гомологичными элементами хорошо просматривается на примере аллелей _v"\ в которых происходит частичная супрессия s u (Нw)-зави си м о й инсуляции. В этих аллелях промотор гена yellow изолирован от энхансеров тела и крыловой пластинки двумя копиями gypsy. Согласно предыдущим исследованиям, увеличение числа su(IЫ)-связывающих районов приводит к более эффективной инсуляции. Однако, в случае аллеля у"1 дупликация 5и(Н\у)-связывающего района оказывает противоположный эффект: энхансеры тела и крыловой пластинки

становятся способны частично активировать промотор гена yellow. Возможно, таким образом, что спаривание между гомологичными последовательностями gypsy или взаимодействие между 5и(Н\у)-связывающими районами частично нейтрализует эффект по блокировке энхансера. Вероятно, что и в случае аллеля y'h эктопическое внутрихромосомное спаривание между двумя элементами gypsy, либо взаимодействие между белками su(Hw) может супрессировать инсуляцию, что позволяет энхансерам, расположенным между двумя gypsy элементами, активировать транскрипцию гена yellow.

В настоящее время наиболее распространена модель, согласно которой инсуляторы являются границами транскрипционных доменов (Schedl and Grosvrld 1995; Gerasmova and Corees 1996). Такая граница между доменами препятствует взаимодействию между регуляторными элементами путем создания хроматиновых структур высшего порядка таким образом, что повышается вероятность взаимодействия между регуляторными элементами внутри домена и снижается между доменами (Vazquez and Schedl 1994). Тот факт, что инсупированные энхансеры сохраняют всю свою активность, также позволяет представить, что белок su(Hw) воздействует на энхансерную функцию путем создания доменной границы (Scott and Geyer 1995).

Согласно другой гипотезе 5и(Н«г)-связывающий район функционирует в качестве "гибкого" регуляторного элемента, модулирующего взаимодействие между энхансерами и промотором в составе сложных генетических комплексов (Cai and Levine, 1995; Georgiev and Kozycina 1996). Geyer (1997) предположила, что белки, собирающиеся на инсуляторном комплексе, способны вовлечь энхансер в непродуктивные взаимодействия, т.к. инсулягор не обладает промоторной функцией, в результате чего не происходит транскрипция (модель ловушки). Результаты, полученные в нашей работе, лучше всего объясняются с

точки зрения этой модели. Эктопическое внутрихромосомное спаривание между двумя элементами gypsy или же взаимодействие между белками su(Hw), связанными с двумя зи(Над)-связывающими районами, может препятствовать организации непродуктивного комплекса между белками suflhv) и белками, связывающимися с знхансерами, супрессируя инсуляцию и позволяя энхансерам, расположенным между двумя элементами gypsy, активировать транскрипцию гена yellow.

П. Система нестабильности с перемещением мобильного элемента jockey

Механизм транспозиции мобильного элемента jockey и дупликация энхансера ПНП щетинок гена scute. Мобильный элемент jockey часто встраивается в яи(Н\у)-снячьтающий район, что в некоторых случаях приводит к потере последовательностей последнего. Ревертанты у+2МС и у2№+9 произошли из аллеля у" вследствие инсерции мобильного элемента jockey, сопровождавшейся одновременной потерей либо su(Hw)-cB23bmaioi4ero района, либо всех внутренних последовательностей gypsy. В нашей работе мы показали, что в локус yellow произошла транспозиция целого сегмента из локуса scute, размером 1.8 тпн, расположенного между мобильными элементами seule и jockey в аллеле sé1. Это позволяет объяснить механизм транспозиции как процесс рекомбинации с участием последовательностей jockey, 1.8 тпн сегмента локуса scute, 5'-ДКГ1 или 3 -ДКП мобильного элемента gypsy, находящегося в локусе yellow (ут*9) или 5-ДКП в случае аллеля у+2МС.

Новые последовательности, появившиеся в локусе yellow, оказывали влияние на экспрессию гена scute в аллеле sé". В у+ ревертантах произошла транспозиция энхансера, отвечающего за образование ПНП щетинок, в локус yellow, где он более не инсулирован su(Hw)-cbíi'sub;íjouihm районом. Наиболее вероятным объяснением полученных результатов может быть то, что ПНП

энхансер, находящийся в локусе yellow, активирует промотор гена scute, находясь от него на достаточно большом расстоянии, 35-40 тпн. Напомним, что район между активным энхансером гена scute и его промотором содержит по крайней мере два промотора других генов (yellow и seule), которые могли бы помешать активации промотора гена scute.

Таким образом, либо инсуляториые элементы отсутствуют между генами yellow и scute, либо инсуляция преодолевается за счет других факторов.

Правильный выбор энхансером своего промотора может происходить за счет высокой специфичности знхансерно-промоторных взаимодействий. Было описано несколько генов, способствующих образованию более тесных контактов между энхансерами и промоторами. Среди них гены zeste , е(у)1, е(у)2 и е(у)3 (Georgiev 1994). Из всех генов е(у) только один ген е(у)2 принимает участие в организации взаимодействий между дуплицированным энхансером гена scute и промотором гена scute. Точечная мутация гена zeste, z0p&■ также частично блокирует образование ПНП щетинок у мух с дуплицированным scute энхансером. Комбинация мутаций е(у)2"', г°р6 оказывает аддитивное действие.

Мутации в генах zeste, е(у)1 и е(у)3 частично супрессируют инсуляториые свойства su(Hw)-CBfl3biBaK>iuero района. Мутации в генах, принимающих участие в организации дальнодействия, нарушают инсуляцию в базовом аллеле scDJ. По крайней мере две из протестированных мутаций являются нулевыми аллелями, z"?7h и е(у)Г'. Из этого следует, что инсуляция в системе зависит от присутствия белков zeste, е(у)1 и, возможно, е(у)3. В случае гена yellow мутации в генах zeste, е(у) 1 и е(у)3 оказывают влияние на 4и(Ну/)-опосредованную инсуляцию только в одном специфическом положении зи(Н\у)-связывающего района. Возможно, влияние мутаций е(у)Ге(у)3"' и z'm на инсуляцию, опосредованную su(Hw)-связывающим районом, зависит от расстояния между энхансером и промотором

и, таким образом, может изменяться в присутствии чужеродных последовательностей, таких как мобильные элементы gypsy и jockey.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что энхансер гена settle способен активировать экспрессию гена scute, находясь в локусе yellow. В этом случае между энхансером и промотором гена scute присутствуют промоторы двух других генов. Таким образом, граница транскрипционного домена не блокирует взаимодействие между энхансером и промотором, которое определяется специфичностью белков, связывающихся с энхансером и промотором.

2. Показано, что мутации в генах zeste, е(у) 1 и е(у)3 оказывают влияние на su(Hw)-3aBHCHMyio инсуляцюо в achaete-scute комплексе.

3. Показано, что два hobo элемента, находящихся в одной ориентации, с высокой частотой индуцируют дупликации района, расположенного между ними.

4. Впервые показано, что дупликация su(IÍ\v)-HHcy:i;-nopa и МДГ4 последовательности позволяет изолированным энхансерам активировать транскрипцию гена. Полученные результаты подтверждают модель о механизме действия инсуляторов как «ловушке энхансеров».

Список работ, опубликованных по теме диссертации. 1. M.Gause, S.Georgieva, P.Georgiev, Phenolipíc revertion of the g>p.r>'-induced mutation sc0' of Drosophila melanogaster by replicative transposition of a sc enhancer to the yellow gene and by mutations in the enhancer of yellow and zeste loci. MGG (1996) V. 253, p370-376.

2. Гаузе М.Г., Георгием С.Г., Энхансер гена scute может активировать промотор, находясь в другом локусе. ДАН (1998) т.358, №1, стр. 119-121.

3. Георгиева С.Г., Гаузе М.Г., Белковые продукты генов zeste, е(у)1 и е(у)3 могут влиять на процесс инсуляции. ДАН (1998) т.358, №2, стр. 260-262.

4. Gause М.., Hovhanaisyan Н., Кап Т., Kuhfittig S., Mogila V., Georgiev P., Аойо-mduced rearrangements in the yellow locus influence the insulation effect of the gypsy su(Hw)-binding region in Drosophila melsnogaster. Genetics (in press).