Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление и прогнозирование мутагенной активности химических соединений окружающей среды

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Выявление и прогнозирование мутагенной активности химических соединений окружающей среды"



На правах рукописи

АБИЛЕВ Сернкбай Каримович

ВЫЯВЛЕНИЕ И ПРОГНОЗИРОВАНИЕ МУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

03.00.15- Генетика 03.00.16- Экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА 2003

Работа выполнена в Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН и в НИИ по биологическим испытаниям химических соединений Минмедпрома

Научный консультант

доктор биологических наук, профессор В А.Тарасов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Д.Н.Кавтарадзе

доктор медицинских наук, профессор Г.Н. Засухина

доетор биологических наук С.П. Синеокий

Ведущее учреждение:

ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им А.Н. Сысина РАМН

Защита состоится «____»_2004 г, в_часов

диссертационного совета Д. 501.001.55 при Москсг- .. .. сч

университете им. МЛ. Ломоносова по адресу: 11^' . лшнскяе

горы, Биологический факультет, аудитория 3 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ по адресу: 119992 Москва, Ленинские горы Ки"- гаческий факультет

Автореферат разослан «_»_2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Карташева Н.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди комплекса проблем, связанных с загрязнением окружающей среды, одной из актуальных и вместе с тем наименее разработанной является проблема оценки потенциальной генетической опасности химических соединений. Возникающие мутации могут привести к увеличению наследуемых генетических патологий и лежать в основе злокачественных новообразовании и других соматических патологий, в частности, многочисленных заболеваний, связанных с нарушениями обмена веществ.

Сам факт, что химические соединения — загрязнители окружающей среды, также как и ионизирующая радиация, представляют реальную генетическую опасность для человека был осознан немногим более 30 лет тому назад вначале научным, а вслед за этим и всем обществом. В результате возникло новое направление в генетике — генетическая токсикология, основной задачей которой является создание методологии для классификации химических соединений по степени их потенциальной генетической опасности для человека, с целью осуществления различных регулирующих действий, направленных на предотвращение или уменьшение возможных генетических последствий воздействия химических соединений.

Вторая проблема генетической токсикологии связана с необходимостью постоянного тестирования большого числа химических соединений. В настоящее время число зарегистрированных в международном регистре (CAS - Chemical Abstract Service, http : /Av ww.ca s,org) соединений составляет более 19 миллионов химических веществ. Это число увеличивается каждый день примерно на тысячу соединений. Понятно, что большая часть вновь синтезируемых соединений не попадает в среду в качестве реальных загрязнителей, однако, число «новых» загрязнителей среды также оказывается достаточно велико и составляет величину порядка 3500 в год, то есть примерно 10 соединений в день. Это обусловливает необходимость создания достаточно оперативной и экономичной системы тестирования химических соединений в отношении их потенциальной генетической опасности для человека.

Невозможность экспериментального исследования генетической активности химических соединений у человека обусловила создание и использование для этих целей различных тест систем. Результаты, получаемые при использовании тест-систем, представляют интерес не сами по себе, а лишь их прогностическая эффективность в отношении генетических последствий воздействия на человека исследуемых соединений.

За время существования генетической токсикологии созданы сотни тест-систем, однако немногие из них в результате длительных валидных исследований включены в национальные системы оцанкн дитеицишьний мутагенной или канцерогенной опасности химических с эединен14^Йрв5«ж

фонд «trre&srfpj

юлндизащт теста, включающий в себя развитие протокола его использования, расширение баз данных, содержащих результаты использования теста для изучения мутагенной активности широкого спектра веществ, и оценку прогностической значимости этих результатов для разных классов химических соединений, был и остается одной из основных задач, стоящих перед генетической токсикологией.

На первом этапе развития генетической токсикологии основное внимание уделялось исследованиям краткосрочных и экономичных тест-систем in vitro, главным образом, бактериальных. В процессе развития генетической токсикологии было показано, что мутационный процесс, индуцированный химическими соединениями, в значительно большей степени, чем в случае ионизирующего излучения, зависит от особенностей метаболизма в клетках-мишенях и распределения соединения и их метаболитов по органам и тканям многоклеточного организма. Это определяет относительно низкую прогностическую эффективность тест-систем in vitro и обуславливает необходимость комплексного подхода при оценке потенциальной генетической опасности химических соединений. В результате возникает необходимость использования батарей тестов, а также, наряду с биотестированием, применение внеэкспериментальных методов, основанных на анализе связи между структурой и мутагенной активностью химических веществ. Все это в свою очередь определяет необходимость введения единого количественного критерия для оценки эффективности исследований потенциальной генетической опасности химических соединений и определения степени этой опасности по результатам тестирования для человека.

Шли и задачи работы. Цель работы состояла в разработке формализованной количественной системы оценки эффективности анализа мутагенной активности химических соединений, включая биотестирование и исследование связи между структурой и активностью, и достигаемого в ходе испытаний уровня доказанности генетической опасности.

Для достижения цели работы решались следующие задачи:

1.Проведение валидных исследований бактериальных тест-систем, направленных на увеличение их прогностической эффективности, включая усовершенствование протокола тестирования химических соединений на мутагенную активность и разработку критериев оценки полученных результатов.

2.Расширение базы данных по мутагенной активности лекарственных препаратов путем оценки их активности в тесте Эймса и исследование потенциальной мутагенной опасности сложных смесей на примере промышленных стоков Байкальского целлюлозно-бумажного комбината.

3.Углубленные исследования особенностей мутагенного действия препаратов, широко используемых в медицине и в практике научно-исследовательских работ.

4.0боснование и апробация, на примере шести широко используемых в практике биотестирования методов, селективной информации в качестве количественной меры для оценки прогностической эффективности отдельных тестов и их сочетаний.

5.Разработка системы количественной оценки потенциальной мутагенной опасности химических соединений по результатам их биотестирования.

6.Исследование связи между структурой и мутагенной активностью нитроаромэтических соединений с использованием экспериментальных и статистических методов анализа.

Научная новизна. Открыты новые классы химических мутагенов: хииоксалиновые соединения, к которым относятся антибактериальные препараты диоксидин и хиноксалин, и диазапирены, к которым относятся ДДДТДП и его аналоги. Исследованы механизмы мутагенного и генотоксического действия диоксидина, ДДДТДП и бромида этидия. Установлено, что генетическая активность диоксидина зависит от парциального давления кислорода и проявляет оргапоспецифическую генотоксичность in vivo, вызывая повреждения ДНК в клетках легких мышей, ДЦДТДП относится к бифункциональным агентам, а бромид этидия активируется цитохромом Р-448.

В работе теоретически обоснован и применён количественный критерий, позволяющий проводить оценку эффективности не только отдельных тестов, но и их батарей, - как в среднем, так и для каждого получаемого в ходе тестирования результата в отдельности. В качестве этого критерия выступает селективная информация наличия (или отсутствия) мутагенных свойств у испытуемых соединений. Для построения шкалы потенциальной мутагенной опасности испытанных химических соединений использована специально введённая функция веса (уровня) доказанности, однозначно связанная со значениями полной информации, достигаемой при проведении би отести рован ия.

Установлены закономерности связи между мутагенной активностью в тесте Эймса и структурными особенностями нитроаром этических соединения от бифенила до полициклических соединений - пиренов и его гетероциклических аналогов. Показано, что мутагенная активность этих соединений коррелирует с пара-положением нитрогруппы и фрагменты структуры, способствующие планарной конформации молекулы, увеличивают ее мутагенность. Впервые показано, что увеличение числа атомов кислорода или внедрение его в молекулу в качестве гетероатома в пиреновые структуры приводит к росту мутагенных свойств соединения. Впервые на примере этих соединений для статистического анализа связи между мутагенной активностью и химической структурой использована модель нейронной сети и показано, что эта модель обладают большей прогностической эффективностью, по сравнению с таковой для множественной регрессии.

Практическая значимость. Результаты валидных исследований теста Эймса и внесенные изменения в протокол его проведения легли в основу материалов, включенных в Методические указания по использованию бактериальных тест-систем для выявления мутагенной активности химических загрязнителей сред, разработанных по заданию Секции генетических аспектов проблемы «Человек и биосфера» МНТС при ГК СМ СССР по науке и технике (1977, 1983, 1985 г.г.), а также в Методические рекомендации по проверке мутагенных свойств у новых лекарственных препаратов, утвержденных МЗ СССР (1985 г.).

Результаты первичной оценки расширили базу данных по мутагенной активности лекарственных препаратов. Результаты изучения мутагенной активности диоксидина вошли в материалы о генотоксичности этого препарата, на основании которых Фармакологический комитетет СССР принял решение ограничить применение диоксидина на детях.

Результаты, полученные при 6-летнем мониторинге мутагенной активности сточных вод Байкальского целлюлозно-бумажного комбината легли в основу обоснования необходимости усиления контроля за технологическими процессами очистки сточных вод Байкальского ЦБК.

Разработанные системы количественной оценки эффективности тестирования и определения потенциальной мутагепиой опасности позволяют оптимизировать процедуру тестирования и устранить субъективизм при ее организации и классификации химических соединений по степени потенциальной мутагенной опасности.

Полученные в работе математические модели структура-активность могут быть использованы для внеэкспериментаяыюго прогноза мутагенной активности химических соединений бифенилыгого ряда.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации представлялись на IV Всесоюзном съезде фармакологов (Ленинград, 1976), на IV собрании Ассоциации мутагенных обществ (Гернроде, ГДР, 1976), на Ш-съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им, Н.И. Вавилова (Ленинград, 1977), на XIV Международном генетическом конгрессе (Берлин, 1978), на заседаниях секции «Генетические аспекты проблемы «Человек и биосфера» госкомитета по науке и технике СССР (Москва, 1975, Киев, 1977, Алма-Ата, 1978, 1989, Караганда, 1990, Ашхабад, 1982), на III конференции по теоретическим вопросам мутагенеза (Вильнюс, 1980), на Всесоюзной конференции «Актуальные проблемы оценки фармакологической активности химических соединений» (Ногинск, 1981), на Всесоюзном симпозиуме «Объем и методы генотокснческой оценки и побочных эффектов биологически активных веществ» (Ленинград, 1989), на Всесоюзном симпозиуме «Микробиологоя охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия» (Челябинск, 1990), на межведомственном рабочем совещании «Мутагены и канцерогены в окружающей среде; Новые подходы к оценке риска для здоровья (Санкт-Петербург, 1997), на ^-съезде ВОГИС (Санкт-Петербург, 2001), на Международной конференции «Новые

технологии б защите биоразнообразия в водных экосистемах» (Москва, 2002), на конференции «Химический мутагенез», посвященной 90-летию со дня рождения И.А.Рапопорта (Москва, 2002) и др.

По теме диссертации опубликованы 38 статей, получены 4 авторских свидетельств на изобретение. Материалы диссертационной работы были использованы при составлений 7 Методических указаний и рекомендаций.

Личный вклад автора. Экспериментальные результаты получены автором лично и совместно с коллегами из Института по биологическим испытаниям химических соединений, Биологического и Химического факультетов МГУ и других институтов, а также аспирантами, работавшими под руководством диссертанта. Соискателю принадлежит разработка программы исследования, схема основных экспериментов, теоретическое обобщение полученных результатов.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 320 страницах и состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, списка литературы (410 наименований) и 7 приложений. Работа написана в монографическом плане и материалы и методы исследований вынесены в приложение, включает 66 таблиц и 26 рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Развитие и апробация методов регистрации мутагенной активности химических соединений с помощью бактериальных тест-систем

1.1. Тест Эймса Salmoneila/микросом

Нами в течение более чем десяти лет проводились валидные исследования теста Эймса, которые заключались в апробировании индикаторных штаммов S.typhimurium по мере их появления к в усовершенствовании протокола проведения эксперимента.

Результаты сравнительного изучения ответа тест-штаммов S.typhimurium к действию мутагенов, имеющих полициклическую структуру, позволили нам рекомендовать штаммы с мутацией rfa н несущие плазмиду рКМ 101 в качестве индикаторов мутагенной активности химических соединений в тесте Эймса.

Исследования факторов, влияющих на эффективность системы метаболической активации in vitro показали, что для выявления с помощью теста Эймса промутагенов необходимо применение S-9 с индуцированными микросомными монооксигеназами. Для индукции последних возможно применение фенобарбитала и 3-метилхолантрена, индуцирующих различные изоформы штохрома Р-450. Установлено, что совол, представляющий собой промышленную смесь полихлорированных бифенилов, является индуктором микросомных монооксигеиаз широкого спектра действия. Это позволило рекомендовать использование в тесте Эймса S-9 печени крыс,

предобработаиных соволом в дозе 300 мг/кг {однократно, внутрибрюшшшо) за 5 суток до забоя.

Проведенные исследования в связи с необходимостью применения разных концентрации S-9 в зависимости от класса тестируемых соединений привели к внесению изменений в протокол проведения теста Эймса, Нами было рекомендовано использовать 0,1 мл S-9 в 1 мл активирующей смеси (10%) в случае тестирования полициклических ароматических соединений и 0,3 мл (30%) - в случае тестирования других групп соединений.

Показано, что при использовании теста Эймса для изучения мутагенной активности химических соединений и сложных смесей концентрация НАДФ должна быть не менее 4 мМ, а концентрация глюкозо-б-фосфата — от 3 до 5 мМ.

Установлено, что тест с прединкубацией имеет преимущество перед стандартной методикой при изучении промутагенов, относящихся к классу алкилированных нитрозаминов.

Показано, что более точная количественная оценка прямого мутагенного и промутагеннош эффектов может быть достигнута при параллельном тестировании химического соединения с использованием полной и неполной микросомальной активирующей смеси (ПМАС и НМАС). Предложенная нами модификация теста Эймса вошла в Методические указания по применению теста Эймса для выявления мутагенности загрязнителей среды.

Применение для статистической обработки первичных данных метода множественного сравнения по Даннету позволило установить, что в 90% и более случаях значимый мутагенный эффект достигается при превышении числа ревертантов в опыте над контролем для штаммов ТА 1535 и ТА 1538 в 2,2 раза, для штамма ТА 98 в 2 раза, для штамма ТА 100 в 1,8 раз. Применение этих показателей для регистрации значимого мутагенного эффекта позволяет избежать значительного числа ложных результатов, особенно в тех случаях, когда мутаген относится к группе слабых и нет выраженной зависимости от дозы,

Результаты валидных исследований теста Эймса были использованы для разработки ряда методических указаний и рекомендаций по его применению для оценки потенциальной мутагенной активности загрязнителей среды (См. список опубликованных работ по теме диссертации).

1.2. Ree- тест

Результаты сравнительного изучения мутагенной активности в тесте Эймса и ДНК-повреждающей активности в суспензионном Rec-теете 86 фармакологически активных соединений показали, что в большинстве случаев наблюдается совпадение положительных и отрицательных результатов, полученных в обоих тестах. Из 86 испытанных веществ мутагенную активность обнаружили 26 препаратов, а ДКК-повреждающую активность - 27. При этом в 19 случаях имело место совпадение результатов, полученных в обоих тестах. В 7 случаях вещества, обнаружившие

мутагенную активность, не проявили ДНК-повреждающей активности. Большинство этих случаев приходится на противоопухолевые препараты (тиофосфамид, фопурин, сарколизин, ронгерон). 8 веществ для которых было характерно наличие ДНК-повреждающего действия, не обнаружили мутагенной активности. В основном это характерно для комплексных соединений платины и палладия. Вероятно, повреждения ДНК, индуцируемые этими соединениями, приводя к летальному исходу, не реализуются в мутационные события.

Таким образом, обнаружено, что результаты тестирования химических соединений на мутагенную активность в тесте Эймса и на ДНК-повреждающую активность в Яес-тесте не всегда совпадают и это зависит от класса химических соединений. Тест может быть использован в специальных случаях на этапе предварительного этапа скрининга химических соединений.

13. Тест на индукцию SOS-ответа (SOS-хромотест)

Проведенный анализ эффективности ароматических соединений (бифенилы, флуореноны, фенантренхиноны) в индукции SOS-огвета и мутаций сдвига рамки считывания показали, что наличие мутагенной и SOS-индуцирующей активностей коррелировал у производных флуоренона. Среди производных фенантренхинона SOS-ответ индуцировал только соединения с сильной мутагенной активностью.

Ни один из производных дифенила, независимо от наличия мутагенной активности, не индуцировал SOS-ответа. Эти данные позволили нам сделать заключение о том, что только те из изученных мутагенов, химическая структура которых позволяет ковалентное взаимодействие с ДНК, могут индуцировать SOS-функции. Другой отличительной особенностью соединений, индуцирующих SOS-ответ, является наличие копланарной дифенильной структуры. Некопланарные структуры нитрированных дифенилкарбоновых кислот, их амидов и эфиров не обладают способностью индуцировать SOS-ответ, несмотря на наличие у некоторых из них значительной мутагенной активности.

Таким образом, при оценке гекотоксичности химических соединений с использованием бактериальных тест-систем следует учесть, что для некоторых классов веществ отсутствие положительного результата в SOS-хромотссте не является показателем отсутствия у них мутагенной активности. Примером могут служить мутагены - производные дифенила. Однако SOS-хромотест может служить полезным дополнением к традиционным и широко распространенным тест-системам. Кроме того, последнее время показано, что SOS-хромотест, в отличие от теста Эймса, проявляет высокую специфичность (Rosenkranz et.al., 1999), и это делает перспективным его применение при позитивном отборе, который используется при выявлении потенциальных канцерогенов.

2. Исследование мутагенной активиости химических факторов окружающей среды

2.1. Первичная оценка мутагенности фармакологически активных соединений с помощью теста Salmonella/микросомы

Первичная оценка играет основную роль в определении дальнейшего хода исследования мутагенной активности химического соединения. Начиная с 1973 года до конца 80-х годов, нами систематически проводилось исследование мутагенной активности большого количества как известных, так и вновь синтезированных химических соединений с помощью теста Эймса Sal топе 11 а/микросомы. Дшшая работа проводилась по плану НИР НИИ по биологическим исследованиям химических соединений,

В результате проведения первичной оценки потенциальной мутагенной активности с помощью теста Эймса у 17 соединений из 71 фармакологически активного препарата выявлена способность индуцировать мутации у тест-штаммов S.typhimurium. Результаты этих исследований расширили базу данных по мутагенной активности фармакологически активных препаратов и были использованы при составлении Каталога мутагенов {Ред. Пшеничное Р.А., Свердловск. УО АН СССР. 1997. Т. 1-9).

Впервые была выявлена мутагенность антибактериальных средств диоксидииа и хиноксидина, а также нибитона и препаратов ОГ-034 и ОГ-018, синтезированных в качестве перспективных лекарственных веществ. Нибитон, исследуемый как перспективный противогрибковый препарат, индуцировал мутации как замены оснований, так и сдвига считывания. Нибитон отличался сильной мутагенной активностью и индуцировал мутации в клетках штамма ТА 153 8 в дозе ниже 0.01 мкг/чашку, что на два порядка ниже порога мутагенной активности 2-нитрофлуорена, стандартного мутагена для этого штамма. Препарат ОГ-ОЭ4, синтезированный в качестве потенциального иммуносупрессора, индуцировал мутации типа замены пар оснований.

Обнаружена способность противоопухолевых средств фотрина, фопурина, проспидина, тифосфамида, циклофосфана, сарколизина и антибактериальных препаратов фурацилина, фуразолидона, фурадонина и солафура индуцировать генные мутации у микроорганизмов. Для фотрина, фопурина, проспидина, фурадонина и солафура такая способность показана впервые. Показано, что мутагенная активность циклофосфана и тиофосфамида усиливается системой метаболической активации in vitro.

Выявлен новый мутаген ДДДТДП (2,7-диамино-4,9-диокси-5.10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазопирен), способный индуцировать мутации типа сдвига рамки считывания, и предложен в качестве позитивного контроля для тест-штаммов S.typhimuruim ТА 1538 и ТА 98. На ДДЦТДП получено авторское свидетельство на изобретение {№ 1172268 от 08 августа 1985).

Таблица 2.1. Мутагенная активность лекарств и перспективных препаратов на тест-штаммах 5.1урЫгшпит.

Название, шифр препарата Результаты определения мутагенной активности на штаммах 8.1урЫтипит

ТА 1950 (ТА 1535) ТА 1538

НМАС ПМАС НМАС ПМАС

1.0Г-018 +

2.ДДДТДП ++

3. Нитрозоморфолш - ++(+++)

4. ГГроспидин ++ -н- -- -

5. Циклофосфан ± +(+++) - -

6. Фотрин + + - -

7, Диоксидин + + + ±

8. Хиноксидип + + - -

9. Нибитон + + +++ +++

10. ОГ-ОЭ4 + + - -

11. Тиофосфамид ++ +++ - -

12. Фопурин +++ +++ - -

13. Фурацилин + + - _

14. Сарколизин ++ ++ — —

15.5-Нитротриптамин + + - --

16. Фуразолидон -и- -Н- - -

17. Солафур -н- -н- - -

18. Фурадонин -н- ++ - -

Значения индексов: «--« - отсутствие активности; «+» , «++», и «++-Ь> - наличие

слабой, средней, сильной мутагенной, соответственно.

Для 80 процентов соединений, для которых удалось обнаружить сведения об их испытаниях на млекопитающих, получены идентичные результаты как в тесте Эймса, так и в тестах на лабораторных грызунах.

2.2. Углубленное исследование особенностей мутагенной активности биологически активных соединений

2.2.1. Диоксидин

Диоксидин-1,4-ди-К-окись 2,3-ди (оксиметил) хиноксалина является антимикробным препаратом широкого спектра действия.

Учитывая отсутствие данных о мутагенной активности диоксид ина, а также его значение в медицинской практике, нами было проведено

исследование особенностей его мутагенного действия на бактерии и органоспецифичности ДНК-повреждающей активности в условиях in vivo.

Особенности мутагенного действия диоксидина на_. .бактерии. Количественные эксперименты с использованием S-9 фракции печени крыс и тест-штаммов S.typhimurium позволили установить, что мутагенная активность диоксидина не зависит от функционирования системы микросомного окисления. Эти же эксперименты показали наличие связи между мутагенными и бактерицидными эффектами диоксидина и физиологическим состоянием индикаторных бактерий. Наиболее высокую мутагенную активность диоксидина показал на штамме с мутацией ría, повышающей проницаемость бактериальной стенки.

Эксперименты на изогенных штаммах E.coli К-12, отличающихся по генам uvrA и гесА показали, что при равной выживаемости у пггамма дикого типа и штамма uvrA наблюдается сходный уровень индуцированных мутаций, тогда как на штамме гесА диоксидин не проявляет мутагенной активности. Полученные результаты подтвердили наше предположение о том, что диоксидин-индуциро ванный мутагенез является следствием ошибочной гесА-зависимой репарации и диоксидин относится к группе мутагенов, действие которых зависит от гена гесА.

ДНК-повреждающее действие диоксидина in vivo. Для исследования генетической активности диоксидина использовали самцов мышей СВА, которым однократно внутрибрюшинно или подкожно вводили исследуемые препараты. Мышей забивали через 2,5-4 ч. после введения исследуемых соединений, извлекали печень, почки и легкие, которые разрезали на кусочки для последующего получения суспензии клеток, лизиса клеток и элюции ДНК (Petzold, Swenberg, 1978). Количество ДНК в элюатах определяли флуорометрическим методом. Полученные результаты представлены в таблице 2.2. Видно, что метилметансульфонат (ММС) вызывает повреждения ДНК во всех органах дозозависимым образом. При этом не наблюдается существенных различий по органам, что свидетельствует о равной степени аякилированностн ДНК. В отличие от ММС, N-нитрозоморфолин (НМ) показал высокую генетическую активность только в клетках печени. Так, НМ в дозе 50 мг/кг вызывал разрывы ДНК в печени в такой же степени, как ММС в дозе 200 мг/кг. Это свидетельствует о высокой органоспецифичности генетического действия НМ. НМ вызывал повреждения ДНК в клетках почек и легких, однако в меньшей степени, чем в клетках печени.

4-НХО, в отличие от ММС и НМ, вовсе не проявил ДНК-повреждающей активности в печени. Его активность была наиболее выражена в легких. Диоксидин проявил активность в легких в дозе 100 мг/кг, а в других органах только в наивысшей дозе 200 мг/кг. По-видимому, главной причиной органоспецифичности ДНК-повреждающего действия диоксидина и 4-НХО

в клетках легочной ткани является насыщенность этого органа кислородом, что способствует генерации этими соединениями свободных радикалов.

Таблица 2,2. Результаты изучения ДНК- повреждающей активности диоксидина ¡n vivo

Химическое соединение* Доза, мс/кг Количество (%) оставшейся на фильтре ДНК из клеток

печени почек легких

Метклмеггансуль-фонат 0 77,4±2,7 87.1+2,4 89,4±1,2

100 51.0±4,0 68,6±1,5 73,6+1,0

200 16,3±1,6 18,2+4,7 15,3±1,6

N-нитрозо-морфолин 0 93.0±1,2 88,6i1,4 87,8±1,9

50 27,4±0,9 66,2±3,2 77,2+0,9

100 19,4±2,4 S5,3±3,0 68,1 ±1,0

200 4,0±1,2 54,7±1,8 52,5±3,6

4-Нитрохинолин-1 -оксид 0 85,8±4,7 88,641,3 85.2+1,8

50 86,2+1,3 80,1+1,0 72,6±2,2

100 85,0±4,8 77,8+4,0 63,9±1.9

Диоксидин 0 86,2+3,9 82,3±3,6 79,5±1,5

50 87,9±2,6 60,6±1,4 82,8±2,1

100 85,2±2,6 75,6±3,0 73,4±3,6

200 77,2+1,1 74,3±3,9 69,0+2,9

* 4-НХО вводили подкожно, остальные соединения вкутрибрюшинно. ДНК для анализа на наличие разрывов выделяли через 4 ч после введения ИМ и диоксидина или через 2,5 ч после введения ММС и 4-ЯХО.

2.2.2, Бромид эткдия.

Особенности метаболической активации_в тесте Эймса.

Использование в тесте Эймса 8-9 фракции печени крыс, которым для индукции микросом вводили фенобарбитал или 3-метилхолентарек, позволило установить, что бромид этидия (БЭ) активируется монооксигеназами, связанными с цитохромом Р-448 и индуцируемыми 3-металхолаитреном. Мутагенный эффект БЭ усиливается как с повышением концентрации 8-9 в активируюшей смеси, так и с увеличением его дозы. При использовании для метаболической активации 8-9 печени беспородных и линейных (Вистар, ВАГ, Август) крыс БЭ проявляет повышенную

мутагенную активность при использовании 8-9 крыс ВАГ, получавших индуктор микросом.

Специфичность мутагенного действия. Сравнительное изучение мутагенной активности БЭ, 2-аминоантрапена и 9-аминоакридина на штаммах З.^Ьпттиш, ревертнрующих к дикому типу в результате точечных делеций или вставок показало, что БЭ и 2-аминоантрацен проявляют высокую мутагенную активность на штамме 8.1урЫтипш11 с фрейм шифт-мутацией типа -1 (делеция). Результаты, полученные на штаммах ТА 1538 и ТА 100, выявили, что плазмида рКМ 101 не влияет на мутагенную активность БЭ, в отличие от 2-аминоантрацена. Таким образом показано, что БЭ является высокоспецифичным мутагеном, вызывающим сдвиг рамки считывания,

ДНК-повреждаюшая активность в культуре клеток. Для изучения ДНК-повреждатощего действия БЭ на мышиные клетки Ь использовали метод щелочной элюции ДНК. БЭ и 9-аминоакридин, в отличие от МКНГ и 4-НХО, проявили слабую ДНК-повреждающую активность, ДНК-повреждающий эффект БЭ в высокой концентрации соответствовал эффекту 4-НХО в низкой концентрации (таблица 2.3).

Алкилирующий агент диметилсульфат проявил умеренную активность. Цитостатики фопурин и томизин не вызывали разрывов ДНК при использованных нами условиях эксперимента.

Проведенные исследования с использованием культуры клеток показали, что бромид этидия проявляет слабую ДНК-повреждающую активность только в высокой концентрации ] О"1 М.

Таблица 2.3. Результаты изучения ДНК-повреждающей активности БЭ и других биологически активных соединений в культуре клеток Ь

Мутаген ДНК (%), оставшаяся на фильтре, при концентрации мутагена

Ю^М ю'м 10"4М Ю^М

мннг 90,5±2,1 55,6±1,2 6.0±1,3 Токсичен

4-НХО 81,8+1,6 4б,4±2,б 14,4±1,4 Токсичен

Диметилсульфат Н.о. Н.о. 76,6±2Л 50±2,8

9-Аминоакридин 92,9±1,6 94,6±2,1 87,1±2Д Н.о,

Бромид этидия 93,4±0,8 86,6+2,1 81,4±3,0 77,9±2,4

Фопурин 91,3±1,2 92,1±1,4 90,0±1,5 92,6±1,7

Томизин 91,б±0,4 93,4±3,1 91Д±0,6 И.о.

Примечание. В контроле процент оставшейся на фильтре ДНК составил

92,8±2,6. Н.о. - не определяли.

Роль алкильной группы бромида этидия в его мутагенной активности. БЭ имеет особую химическую структуру. Фенантрлдиновый каркас в пара-позициях 3 и 8 содержит аминогруппы, одна из которых может подвергнуться гндроксилпрованию в результате михросомного окисления и дальнейшие пути метаболизма БЭ будут сходны с этапами биотрансформации ароматических аминов. Сравнительное изучение мутагенной активности БЭ и димидиум бромида, который является аналогом БЭ и отличается от него метильной группой вместо этильной, показало, что димидиум бромид является более сильным мутагеном, чем БЭ. Это можно объяснить эффектом укорочения алкидной цепи и, соответственно, большей возможностью доступа электрофнлыгого азота к нуклеофильным сайтам ДНК. По-видимому, электрофильный азот фенантридина и электрофильный азот, образующийся в результате микросомного окисления одной из аминогрупп, являются якорями интеркаляции. Если бы электрофильный азот фенантридина не играл никакой роли в мутагенной активности БЭ, то его мутагенные эффекты на штаммах S.typhimurium не отличались бы от мутагенных эффектов аддухтообразующих метаболитов ароматических аминов таких, как 2-аминоантрацен.

2.2.3. ДДДТДП

Мутагенная активность на тест-штаммах S. tvphimurium. Установлено, ДДДТДП является мутагеном, вызывающим у индикаторных бактерий сдвиг рамки считывания, и мутагенная активность которого не зависит от проницаемости клеточной стенки тест-шгамма и модифицируется (снижается) системой метаболической активации in vitro.

ДНК-повреждающая активность в культуре клеток in vitro. Для изучения ДНК-повреждающего действия ДДДТДП на мышиные клетки линии L использовали метод щелочной эдюции ДНК. Полученные результаты приведены в таблице 2.4.

Наиболее сильную ДНК-повреждающую активность проявили N-метил-№-нитро-К-нитрозогуакидин (МННГ). Активность ДДДГДД была сравнима с активностью 4-НХО. В отличие от них, 4-броммети л-7-метоксикумарин показал слабую активность, а мутаген в тесте Эймса 2 - нитроимидазол не проявил ДНК-повреждающего эффекта.

Отсутствие ДНК-повреждающей активности N-гадроксисукцинамида показывает, что наличие таковой у ДДДТДП не обусловлено только фрагментом 0=C-N-0H молекулы. Решающий вклад вносит, по-видимому, фрагмент, включающий ароматический цикл. В этом случае можно найти аналогию с возможным промежуточным метаболитом 4-НХО -гидроксиламинохинолин-1-оксидом. В этой связи нами было проведено сравнительное изучение ДНК-повреждающей активности 4-НХО и ДДДТДП.

Еыло обнаружено, что при обработке клеток Ь этими мутагенами в концентрации 10"* М уровень индукции разрывов зависит от продолжительности времени обработки, 4-НХО был более эффективен, чем ДДДТДП (Рисунок 2.1),

Таблица 2,4. Результаты изучения ДНК-повреждающей активности ДДДТДП в культуре клеток

Мутаген ДНК (%), остав при концент шаяся на фильтре, рации мутагена

10*М Ю°М 10"<М ю'м

МННГ 90,5±2,1 55,6+1,2 6,0±1,3 Токсичен

4-НХО 81,8±1,6 4б,4±2,6 14,4±1,4 Токсичен

ДДДТДП 89,2±1,4 49,5+2,0 21,2±2Д И.о.

4-Бромметил-7-метоксикумарин 93,4±0,8 86,6±2,1 81,4±3,0 Н. о.

2-Нитроимидазол И.о. 94,6±1,4 93,0±1,5 92,6±1,7

>Г-гидрокси-сукцинамид 94,6+0,4 91,4+3,1 91,2+0,6 Н.о.

Примечание. В контроле процент оставшейся на фильтре ДНК составил 92,$±2, б.

Однако изучение кинетики восстановления повреждений ДНК после отмывки клеток от мутагенов показало, что ДДДТДП вызывает больше нерепарируемых или плохо репарируемых повреждений, чем 4-НХО.

Лоодомттжть оБрайотки клеток, ч

Рисунок 2.1. Индукция разрывов ДНК в клетках Ь 4-НХО (1) и ДДЦТДП(2).

Если через 6 ч постинкубации наблюдается полное восстановление повреждений ДНК, вызванных 4-НХО> то часть ДДДТДП-индуцированных повреждений остается не восстановленной. Природа этого феномена не ясна. Однако, исходя из структуры молекулы ДДДГДП, можно считать его бифункциональным мутагеном.

23. Изучение суммарной мутагенной активности сложных смесей.

Исследование сточных вод Байкальского целлюлозно-бумажного комбината (ЦБЮ. На Байкальском ЦБК для достижения глубокой очистки отработанных вод функционирует 5-ступенчатая система очистных сооружений, включая внутрицеховую локальную очистку, а затем биологическую, химическую, механическую стадии очистки и каскад прудов-аэраторов, из которых (согласно техническим условиям) сточные воды после разведения в 20 раз поступают в Байкал (Ветров, Бейм, 1983).

Нами совместно с сотрудниками кафедры генетики и селекции и кафедры биофизики Биологического факультета Московского государственного университета им.М.В.Ломоносова в течение б лет 1982-1987 гт) проводились комплексные исследования биологической активности некоторых потоков сульфатного производства целлюлозы и сточных вод Байкальского целлюлозно-бумажного комбината (ЦБК). Оценку мутагенности стоков Байкальского ЦБК проводили с помощью теста Эймса.

Мы проводили систематический анализ сточных вод на стадиях отбелки целлюлозы хлорированием, "белого" и "черного" потоков (условное название суммарных внутрицеховых производственных стоков), после биологической очистки, после химической очистки, а также окончательно очищенных сточных вод.

В таблице 2.5 приведены данные одного типичного эксперимента по анализу мутагенности сточных вод Байкальского ЦБК (на примере проб, отобранных 16 сентября 1985 г.) из которых видно, что только образец стока после хлорирования проявлял мутагенную активность на штамме ТА 100 и повышал уровень спонтанного мутирования в 4,4 раза. В присутствии фракции Б-9 из печени мутагенная активность уменьшалась. 2-Аминоантрацен и бенз(а)пирен, использованные в качестве контрольных веществ на эффективность системы метаболической активности, проявили высокую мутагенную активность в варианте ПМАС.

Систематический анализ мутагенности образцов сточных вод, отобранных на разных стадиях производства и очистки (1983-1987 гг), показали, что большинство проб сточных вод, за исключением стоков после этапа хлорирования, не проявляют мутагенного эффекта.

Таким образом, результаты 6-летнего исследования мутагенной активности сточных вод Байкальского ЦБК показали, что сточные воды цеха по отбелке целлюлозы хлорированием проявляют мутагенную активность в тесте Эймса.

Таблица 2.5. Результаты анализа мутагенной активности сточных вод стоков Байкальского ЦБК в тесте Эймса

Вариант Доза на чашку Среднее количество ревертаятов на чашке со штаммом S.typhimurium

ТА 98 ТА 100

ПМАС НМАС ПМАС НМАС

Диметилсульфоксид 0,1 мл 26 16 108 107

(контроль)

2-Аминоантрацен 0,5 мкг 506 21 1653 148

Бенз(а)пирен 5,0 мкг 398 20 745 120

Образцы стоков 0,4 мкг 25 24 247 477

после хлорирования

"черный" поток 0,4 мкг 13 14 140 125

"белый" поток 0,4 мкг 24 18 139 109

после химической 0,4 мкг 22 19 130 121

очистки

пруд-аэратор 0,4 мкг 23 24 115 139

Полученные результаты позволили уточнить режимы химической и биологической очистки и разбавления, обеспечивающие снижение мутагенной активности сточных вод до уровня контрольной. Эти результаты позволили нам обосновать необходимость включения теста на мутагенность в комплексную программу биомониторинга за эколого-токсикологическим состоянием различных производств Байкальского ЦБК. Такой биомониторинг в конце 80-х годов осуществлялся Институтом экологической токсикологии Министерства лесной, целлюлозно-бумажной и деревообрабатывающей промышленности СССР в г. Байкапьске.

3. Количественная оценка эффективности тестирования и потенциальной генетической опасности химических соединений

3.1.Ретроспективный анализ

Способность химических соединений индуцировать мутации, в отличие от ионизирующего излучения, является не постоянным свойством, а обусловлена видо, поло-, и тканеспецифичными признаками организма. Это определяется в основном различиями в процессах биотрансформации и фармакокинетики хим11ческих соединений. Кроме того, когда речь идёт о системах in vitro, на эффективность тест-систем могут влиять такие факторы, как, например, взаимодействие химических соединений с культуральноЙ средой, когда в качестве тест-объектов выступают клетки млекопитающих, культивируемые in vitro. В результате, между ответами в тест-системах и интересующими нас мутагенными последствиями у млекопитающих существует только вероятностная, корреляционная связь.

Для оценки прогностической эффективности тест-систем обычно применяется ретроспективный анализ с использованием выборки химических соединений, у которых, с одной стороны, изучена их генетическая активность у млекопитающих, а с другой - есть данные по тест-системам, которые предполагаются исследовать,

Бейсовское приближение позволяет получить значение апостериорной вероятности при позитивном и негативном исходе испытаний:

р,р(+/т) д6р(+/пт) р(+) =-——----- д(+) =

Р„ р( + Щ + Ч,Р(+ /пт) ря р(+/т) + дср(+ /пт)

Р. Р(~ /т) Я. Р( ~ /пт)

р(~> = —гт^—~-: =--- -

р„р(-/т) + Яер(~/пт) р,р(~/м) +

где р(+), р(-) — вероятности наличия мутагенности в случаях позитивного и негативного исхода испытаний.

<](+), д(-) - вероятности отсутствия мутагенности в случаях позитивного и негативного исхода испытаний.

р0 и Ць ~ априорные вероятности наличия или отсутствия, соответственно, мутагенных свойств у испытуемого соединения.

р(+/т), р(-/т), р(+/пт), р(-/пт) - вероятности получения позитивного и негативного результатов для мутагенов и немутагенов, соответственно.

Последние вероятности определяются в ходе ретроспективного анализа как доли мутагенов и немутагенов, давших правильный и ложный результат, а именно:

р(+/т) = П]/П1, р(-/т) = «;/«;, р(-/пт) =п2/п2, р(+/пт) = пц/п2 где, П] [ и п22 - число правильных позитивов и правильных негативов, соответственно.

П12 и п^ - число ложных негативов и ложных позитивов, соответственно.

П) — число мутагенов, п? - число немутагенов.

п(+) - число соединений, показавших позитивный результат

п(-) - число соединений, показавших негативный результат

Видно, что каждый исход испытаний характеризует две вероятности; вероятность мутагенности и вероятность немутагенности тестируемых соединений. Формула БеЙса устанавливает связь между априорными и апостериорными значениями вероятности наличия или отсутствия мутагенной активности у испытуемых соединений. Однако при вероятностном описании результатов тестирования остаётся неясным, каким образом количественно определить результаты тестирования, то есть оценить информацию, полученную в ходе тестирования.

Для решения этой проблемы, мы перешли от вероятностного к информационному описанию процедуры тестирования, которое было предложено В.А.Тарасовым в 1994 г. В основе этого подхода лежит понятие неопределённости, или энтропии;

где pi — вероятности пшотсз.

Неопределённость характеризует в целом, интегрально, наши знания до и после проведения испытаний, В первом случае речь идёт об априорной неопределённости (Но), во втором — об апостериорной неопределённости (Н(А,)) при разных исходах испытаний, В результате мы заменяем набор вероятностей1 [рь р2..,рп] одним значением неопределённости (Н), где п -число рассматриваемых возможностей (гипотез), а р!( рз.-.р„ - вероятности этих гипотез, соответственно. При этом информация, точнее - селективная информация, как её определили Винер и Шеннон, является мерой изменения неопределённости. В данном случае она равна разности между априорной и апостериорной неопределённостью:

1Ш = Н0-H(A¡)

При этом средняя информация, получаемая в среднем при всех исходах испытаний, равна:

hr=Zp(A№>)

Средняя информация необходима при оптимизации процедуры тестирования с учётом затрат на его проведение,

3.2, Формирование выборки химических соединений.

Проведение ретроспективного анализа требует формирования выборки химических соединений, у которых, с одной стороны, изучена мутагенная активность в половых клетках грызунов, а с другой — известны результаты их испытаний в исследуемых тест-системах. Источником информации при создании такой выборки служили компьютерные базы данных: GAP, NTP, Gene-Tox, а также база данных, созданная в лаборатории изменчивости генома ИОГен РАН. В результате было сформировано две группы химических соединений: мутагены и немутагены. Критерием наличия ши отсутствия мутагенной активности у химических соединений служит результаты, полученные в 3-х тест-системах: в тесте по учёту наследуемых транслокаций, в тесте по учёту генных мутаций в специфических локусах и в тесте по учёту хромосомных аберраций е половых клетках грызунов. В отобранную таким образом выборку химических соединений, содержащую группу мутагенов и немутагенов, включались данные по тестированию этих соединений в 6 тест-системах: тест Эймса (Эймс), тесты по учету хромосомных аберраций в культуре клеток in vitro (XA) и цитогенетических нарушений in vivo (Цит), тест по учету доминантных летальных мутаций у мышей (ДЛМ) и тест по учету рецессивных сцепленных с полом летальных мутаций у дрозофилы (ДРЛ). В

1 В данном случае состоящий из двух альтернативных возможностей, однако, число рассматривающихся возможностей может быть и больше, в том случае, когда существует большее число гипотез, например, мы хотим сделать выбор между трансвидовымн. трансполовыми, сайтспецнфячными канцерогенами н неканцерогенами.

18

результате, была сформирована выборка, состоящая из 105 химических соединений (в том числе 63 мутагена и 42 немутагена).

3Л. Оценка эффективности тестирования

Одиночные тесты. В настоящее время при оценке эффективности тест-систем, как правило, используют конкордантный анализ. Конкордантность (С) определяется как доля «правильно» определённых в ходе тестирования химических соединений. Конкордантность функционально связана с двумя другими параметрами тест-систем, которые характеризуют её эффективность и широко используются в настоящее время. Этими параметрами являются чувствительность (а) и специфичность (fi). Чувствительность тест-системы представляет собой долю правильно определённых в ходе тестирования мутагенов, и по сути дела она является условной вероятностью позитивного результата р(+/т) испытаний в том случае, когда мы имеем дело с мутагенами. Специфичность тест-системы является долей «правильных» негативных результатов при тестировании немутагепов и равна условной вероятности негативного результата р(-/ш), когда речь идёт о немутагенах.

Значение конкордантностя связано со значениями чувствительности и специфичности следующим образом: С=роа+(1-Ро)р,

где а и Р - значения чувствительности и специфичности данного теста.

В работе при оценке эффективности тестирования отдельных тест-систем использованы как традиционные методы проведения такой оценки, о которых говорилось выше, так и селективная информация (таблица 3.2).

Данные, приведенные в таблице 3.2. показывают, что в случае одиночных тест-систем традиционные и предложенные нами методы оценки эффективности тестирования совпадают. Показано, что максимальной эффективностью обладает тест по учёту доминантных летальных мутаций у грызунов (ДЛТ). Это характерно как для негативного, так и для позитивного результата испытаний, а также для средней информации. Тест по учёту рецессивных летальных мутаций у дрозофилы (ДРЛ) показал относительно низкую эффективность. Эффективность этого теста существенно ниже не только теста по учёту цитогенетических нарушений in vivo (Цит), но и теста по учёту хромосомных аберраций in vitro (XA). В связи с тем, что до недавнего времени тест ДРЛ, наряду с тестом ДЛТ, использовался на втором этапе тестирования, полученные нами результаты ставят под сомнение представление о высокой эффективности теста по учёту рецессивных летальных мутаций у дрозофилы. Неожиданным явился результат о низкой эффективности теста Эймса и в меньшей степени теста по учёту генных мутаций в клетках млекопитающих in vitro. Эти тесты широко используются на первом этапе тестирования практически во всех странах.

Таблица 3.2. Критерии оценки эффективности тест-систем

Тесты а Р С ро=0,5 К+) Ро=0,5 !(-) р<г=0,5 1ср Ро=0,5

Тест Эймса 0,72 0,47 0,6 0,02 0,05 0,03

Генные мутации in vitro <Ш) 0,84 0,33 0,59 0,01 0,1 0,03

Хромосомные аберрации in vitro (ХА) 0,86 0,38 0,62 0,02 0,17 0,06

Цатогенетикз in vivo (Цит) 0,75 0,71 0,73 0,14 0,17 0,15

Дрозофила рецессивные летали (ДРЛ) 0,7 0,68 0,69 0,1 0,11 0,1

Доминантные летали у грызунов (ДЛТ) 0,86 0,77 0,82 0,26 0,38 0,32

Значения как традиционных, так и введенных нами параметров, характеризующих эффективность тест-систем, зависит от величины априорной вероятности наличия у испытуемых соединений мутагенной активности у млекопитающих. Величина априорной вероятности отражает уровень наших знаний до проведения испытаний, когда анализируемые соединения представлены одной группой, представляют собой вероятность того, что любое вещество в анализируемой выборке окажется мутагеном Количественные значения априорной вреоятности оказываются равны доли мутагенов в выборке. После проведения испытаний общая выборка распадается на 2 подвыборки — на соединения показавшие позитивный результат и на соединения, показавшие отрицательный результат. Доля мутагенов в каждой из 2-х подвыборок характеризуются значениями апостериорных вероятностей р(+/т) и р(-/т).

При этом ра=р(+)р(+/т) + р(-)р(+/т), где р(+) -доля соединений показавших позитивный результат, р(~)~ доля соединений показавших отрицательный результат, р(+/т)- доля мутагенов в группе соединений, показавших позитивный результат, р(-/т) - доля мутагенов в группе соединений, показавших отрицательный результат.

На рисунке 3.1 представлена зависимость полученной информации от величины априорной вероятности для одиночных тест-систем. Видно, что при одних значениях априорной вероятности полученная информация может быть положительной, а при других - отрицательной. Это наблюдается для всех тест-систем, как для позитивного, так и для негативного исхода испытаний. В том случае, когда полученный в ходе испытаний результат противоречит нашим априорным знаниям об активности химического соединения, апостериорная неопределённость может оказаться больше по

сравнению с априорной неопределенностью, и в этом случае селективная информация оказывается отрицательной.

Однако, в среднем мы никогда не имеем отрицательных значений информации, поскольку, если при негативном исходе испытаний информация оказывается отрицательной, то при позитивном исходе испытаний она непременно положительна, и — наоборот.

Негативный исход испытаний. Позитивный исход испытаний.

Средняя информация

Рисунок 3. ]. Зависимость полученной информации от величины априорной вероятности.

В целом, полученные результаты показывают, что используемые в настоящее время тесты, за исключением теста ДЛТ, обладают относительно низкой эффективностью, и их использование не позволяет решить основную проблему, стоящую перед генетической токсикологией, а именно: не допустить проскальзывание мутагенов в группу соединений, показавших в ходе тестирования отрицательный результат.

Батареи тестов. Для увеличения эффективности тестирования в

настоящее время используются не одиночные тесты, а батареи тестов, когда на каждом этапе параллельно используется несколько тестов. В этом случае

оказываются непригодными критерии оценки эффективности тестирования, развитые для одиночных тестов, такие как чувствительность, специфичность и конкордантность. Действительно, при использовании батарей тестов наряду с однозначными позитивными и негативными возникают и неоднозначные результаты, когда один тест показывает позитивный, а другой негативный результат. Определение чувствительности и специфичности непосредственно связано с понятиями правильных и ложных результатов. В случае батарей тестов остаётся неясным, к какой из категорий отнести неоднозначные результаты. Понятно, что использование селективной информации в качестве критерия оценки эффективности не имеет этих ограничений.

Таблица 3.3. Значения полученной информации для батарей из

двух тестов

Однозначные негативные А результаты. ^ Однозначные позитивны» результаты

Сочетания тс стоя Ответы Сочетания тестов Ответы

... . Р, »0,5 Р, • 0.1 Р. -0,5

ДПТ+ХА 0,47 1,00 ДЛТ+Цнт 0,46

лптч1»г о,м ДПТ+Эйис •ОЯ 0,42

дгтдрл «« 0.« ДПТ+ХА 0.34

ппгти о.м М1 ЦмпИ •о.» 0,34

ДПГ+ЭЙМС «л о,н длт>врл 4,44 0,30

ЦипХА 0.31 о,м дпт+гм 0.29

ДОММт ОД) 0.31 ДРЛ»ЦиТ ■ОМ 0,2Г

1Ы+ЭЙМС № од ДРЛ+Эйис ■0.» 0,22

Эимс+ХА ол Цит+Эйис ■ел о,и

ЦитГИ 0,24 0.(0 дргмм 4,33 0,15

ДРП*ХА «л 0,14 дртхл -0,Л 0,1 (

ДРЛ-ГМ 0.1» 0.« Цит+ГЙ -0,24 0,10

Эй««.™ М( № ГМ»ХА -0,11 0.04

™»ХА 0,4 0,0$ ЭймсХА -0,15 0,1+

дртэймс | о.и 0.0* Э«и:+ГМ -0,09 0,01

1_I Неоднозначные результаты Средняя информация й

Сочетания тктм Отмгы Огмты

Р. =0,1 Ра ■ 0,5 Р» - 0,1 Р, * 0.5

Ш1Т+™ о,м о.п длт+цнт 0,15 0,3!

ДРЛ+ЭЙМС 0.2« 0.22 ДПТ*ХА 0.11 0,34

0,22 0,15 ШГГ*ДРЛ 0.11 0,»

ДРЛ»ГМ о.» 0.14 дпт*™ 0.10 ол

Ц*Т+ХА <>#> 0.11 ДПТ+Эймс 0,11 о,я

Цит*Ш 0,11 0,1» ЦкмХА ».09 0.23

0.17 0,09 ДРЛ*Цит 0,07 0,20

прл»х* о,*т 0,00 ЕРЛ.Эиис 0,09 0,17

дпт+хл 0,1» 0.07 врл+гы 0.0«

ДЛТ+Цкт 0,09 0,01 Цмт*Эйцс 0,05 0,14

Цит*Эйме 0,09 о.ог Ш=Л*ХА ш 0.14

ЭЙмс*ХА о,оо 0.01 Цит+ГМ «,04 0.11

дпт+дрл 0,05 0,0* ГМ*ХА 0,02 0.07

ДРЛ+Цит 0.02 0,00 ЭЙЖ+ХА 0.01 0.05

Эймс+ГМ 0.03 9,00 Э»мс*ГМ 0,01 0,02

В таблице 3.3 показаны величины полученной информации при двух значениях априорной вероятности 0,1 и 0,5. Эта значения априорной вероятности были выбраны, поскольку в настоящее время нет единого мнения о том, какая доля химических соединений — загрязнителей окружающей среды является мутагенами или канцерогенами.

Обращает на себя внимание, что при однозначном негативном результате для пары тестов ДЛТ и ХА in vitro полученная информация достигает максимума, т,е. равна 1 биту при ро = 0,5. При ро = 0,1 полученная информация оказывается меньше, однако это связано не с тем, что при этом значении ро эффективность тестирования ниже, а с тем, что при ро = 0,1 априорная неопределенность равна 0,47, а не 1 биту. Она полностью устраняется при негативном однозначном исходе испытаний для этой пары тестов, как и в предыдущем случае, когда априорная вероятность равна 0,5.

Наибольшую эффективность, как и следовало ожидать, показывают пары тестов, содержащие тест ДЛТ. Второй вывод, который следует из этих данных, заключается в том, что широко использующиеся в настоящее время тесты на 1-ом этапе тестирования — тест Эймса, тест по учету генных мутаций in vitro, тест по учёту хромосомных аберраций in vitro -характеризуются низкой эффективностью.

В целом, полученные результаты показывают, что величина информации может служить критерием при оценке эффективности отдельных тестов и их батарей - как в среднем, так и для каждого полученного в ходе тестирования результата.

3.4. Учет степени изученности химических соединений при оценке их потенциальной мутагенной опасности

При проведении количественных оценок основной проблемой в настоящее время является недостаточная развитость существующих баз данных. Использование Бейсовского приближения опирается на полную матрицу результатов без пропусков, которая содержит данные о мутагенной активности в половых клетках грызунов и результаты испытания в исследуемых тестах. В реальности, число таких соединений уменьшается по мере увеличения числа тестов, входящих в оцениваемую батарею тестов. В этой связи возникает проблема использования неполных матриц результатов тестирования. Она может быть решена ( по-крайней мере, частично ) при использовании дискриминантного анализа, который позволяет представить результаты испытаний в каждой тест-системе, входящей в батарею, в форме вероятности получения позитивного результата. При позитивном и негативном исходе испытаний эта вероятность оказывается равной 0 или 1, соответственно, а при отсутствии испытаний эта вероятность может быть представлена её правдоподобной оценкой.

При проведении анализа конкретной выборки возможна прямая оценка доли химических соединений показавших позитивный результат для данной

тест-системы. В общем случае для выборок характеризующихся различным соотношением между мутагенами и немутагенами вероятность получения позитивного результата оказывается равной: р(+)=раа + (1-Рй)р, где а и значения чувствительности и специфичности данного теста. Первый член этого равенства представляет собой долю правильных позитивных результатов, 2-й член — долю ложных позитивных результатов. Рассчитанные таким образом значения р(+) использовались в качестве правдоподобных оценок отсутствующих данных в анализируемой нами выборке.

Опенка эффективности тестов и их батарей. Используя уже полную матрицу результатов тестирования нами с помощью дискриминантного анализа было получено каноническое уравнение дискриминантной функции и рассчитаны значения апостериорной вероятности для каждого соединения Имея значения апостериорной вероятности легко можно рассчитать, значения полученной информации для каждого соединения и в среднем для разных вариантов тестирования (анализа). Полученные значения рассчитанной таким образом средней информации для каждой тест-системы и их батерей представлены в таблице 3.4. Эти значения средней информации отражают эффективность тест-систем и их батарей.

Таблица 3.4. Э< >фективность тестов и их батарей

Тесты in vitro ЬР Тесты in vifrcri- Цит

Эймс 0,02 Эймс+Цит 0,16

гм 0,02 ГМЩиг 0,15

ХА 0,04 ХА+Цит 0,2

Эймс+ГМ 0,04 Эймс+ГМ+Цнт 0,J6

Эймс+ХА 0.06 Эймс+ХА+Цит 0,2

ГМ+ХА 0.06 ГМ+ХА+Цит 0,21

Эймс+ГМ+ХА 0.06 Эймс+ГМ+ХА+Цит 0,21

Тесты in vivo Тесты in vitro+ДЛТ

Цит 0,15 Эймс+ДЛТ 0,3

длт 0,29 гм+длт 0,3

Цит+ДДТ 0,33 ХА+ДЛТ 0,31

Тесты in vitro + in vivo Эймс+ГМ+ДЛТ 0,34

Эймс+ГМ+Цит+ДЛТ 034 Эймс+ХА+ДЛТ 0,32

Эйм с+ХА+Цит+ДЛТ 0,36 ГМ+ХА+ДЛТ 0,33

ГМ+ХА+Цнт+ДЛТ 0,36 Эймсн-ГМ+ХА+ДЛТ 0,32

Эймс+ПМ+ХА+Цит+ДЛТ 036

Анализ информативности тестов и их батарей по отношению к прогнозированию мутагенной активности химических соединений в половых

клетках млекопитающих, приведенных в таблице 3.4 показал, что эффективность батареи почти не зависит от количества тестов, включенных в нее.

Важными оказались качественные характеристики тестов, например, тесты на клетках млекопитающих in vitro (XA, ГМ), более эффективны, чем бактериальный тест Эймса. Тесты in vivo, более эффективны, чем тесты in vitro. Тест на доминантные летали более эффективен, чем тест на цитогенетические нарушения в соматических клетках.

Классификация химических соединений по степени их потенциальной мутагенной опасности. Дискриминантный анализ, как было показано выше, позволяет определить значения апостериорной вероятности принадлежности химических соединений к классу мутагенов или к классу немутагенов. При этом принято считать, что соединения для которых апостериорная вероятность >0,5 относятся к классу мутагенов и, напротив, при апостериорной вероятности < 0,5 соединения относятся к классу немутагенов. В этой связи в рамках дискриминантного анализа вводится понятие веса классификации, который позволяет проводить такого рода оценку для соединений с неизвестной активностью в половых клетках и без проведения для этого случая всей процедуры дискри штатного анализа. Используя классификационные функции нами была получена классификационная матрица для нашей выборки из 105 соединений.

При этом из 42 немутагенов для половых клеток грызунов определены как немутагены 31 и как мутагены 11 соединений, то есть процент правильных ответов составил 73,8. Из 63 мутагенов определены как мутагены 46 и как немутагены 17 соединений (73,0 % правильных ответов). Конкордантность такого прогноза составила 73,4 процента.

Таким образом, при качественном разбиении имеют место две категории предсказания: правильные и неправильные. Это свидетельствует о том, что фактически батареи тестов в данном случае могут быть охарактеризованы в привычных терминах чувствительности, специфичности и конкордантности.

3.5. Количественная оценка потенциальной генетической опасности химических соединений

Как уже отмечалось, основной проблемой генетической токсикологии является оценка потенциальной генетической опасности химических соединений. В настоящее время в качестве критерия, меры этой опасности используется вес доказанности или уровень доказанности того, что химическое соединение является мутагеном или канцерогеном для млекопитающих. Однако при этом используется качественная классификация, ранжирование. Считается, что соединение, отнесённое к более высокому рангу, обладает большей генетической опасностью по сравнению с соединением более низкого ранга. При этом остаётся

неопределённой величина различий между уровнями потенциальной генетической опасности химических соединений, относящихся к разным рангам. Присвоение того или другого ранга опасности происходит на экспертном уровне. В рамках нашей модели вес доказанности (уровень доказанности) мутагенных мутагенных свойств у соединений количественно характеризуется величиной полной информации, которая равна сумме априорной информации и информации, полученной в ходе тестирования -

1и = 1о + 1.

Эта функция имеет два максимальных значения при ро ~ 1 и ро = 0 и одно минимальное значение, равное 0, в том случае, когда апостериорная вероятность равна 0,5. Во всех прочих случаях каждому значению полной информации.

Априорная вероятность, ро

Рис. 4. Зависимость полной информации от величины априорной вероятности (Использованы данные по тесту ДЛТ)

соответствуют два значения р0. Для того, чтобы избежать этой неоднозначной связи между информацией и вероятностью нами введена функция и', названная функцией веса (уровня) доказанности наличия мутагенной активности:

_ 1 +/(■^^(.40-0,5

При оценке мутагенной активности химических соединений нас интересует уровень доказанности отсутствия этой активности для млекопитающих, для того, чтобы классифицировать соединения как безопасные и исключить их из дальнейшей процедуры тестирования. Легко показать, что в случае функции веса (уровня) доказанности немутагенности мы имеем следующее

н^-WW^O-O.S нли UI(Ai)Sígn(0¿-pW 2 2

Для относительных значений сумма веса доказанности немутагенов и мутагенов равна I.

И>*Ш + Н'нмШ = 1

Значения уровня доказанности мутагенной активности для химических соединений. Используя значения апостериорной вероятности, полученные с помощью дискриминантного анализа, и формулы, приведенные выше, нами были рассчитаны значения полученной в ходе тестирования информации и достигаемые при этом уровни доказанности наличия или отсутствия мутагенной активности для анализируемой нами выборки химических соединений. При этом для упрощения расчета были созданы служебные компьютерные программы.

Анализируемая выборка состоит из 105 химических соединений с известной мутагенной активностью в половых клетках грызунов и тестированных хотя бы в одной из 5 тест-систем. Кроме того, в эту выборку были включены дополнительно 6 соединений, для которых нет данных об их мутагенной активности в половых клетках, а также контрольное вещество X, которое не исследовано ни в одном из тестов на мутагенную активность.

В таблице 3.5 приведены уровни доказанности (и*) мутагенной активности в отношении половых клеток для химических соединений анализируемой выборки. Эти расчеты сделаны по результатам тестирования в 5 рассматриваемых нами тест-систем (Эймса, ХА, ГМ, Цит и ДЛТ) и при рй=0,5. Видно, что более 50% мутагенов сконцентрированы в области высоких значений к>, тогда как немутагены - в области низких значений W. Наряду с этими двумя группами существует третья группа соединений с промежуточными уровнями и*=0,5 (0,45-0,55). В эту группу входят и мутагены и немутагены, то есть те соединения для которых в ходе тестирования не удалось получить достаточных доказательств принадлежности их к классу мутагенов или к классу немутагенов. Соединения, мутагенная активность которых в половых клетках не определена прямыми экспериментами, распределились по уровням доказанности в зависимости от их изученности и активности в 5 тест-системах. Диоксидин и фотрин, которые проявляют мутагенную активность в тестах как in vivo и in vitro, находятся в группе соединений с высоким уровнем доказанности (и> =0,84). Соединение X, которое не исследовано ни в

одном из тестов, имеет уровень доказанности 0,5, то есть его нельзя отнести ни к мутагенам, ни к немутагенам. К этой же группе отнесен и 5-нитро-2-фурилакриламид, который испытан только в тесте Эймса.

Таблица 3.5. Уровень доказанности мутагенной активности в отношении половых клеток для химических соединений._

Ур.док. Кол-во соединений Примеры из выборки

0,84 4 Этилнитрозомочевина, 4-НХО, диоксидин, фотрин

0,82 18 Мелфалан, каптан, ММС, фуросемцд

0,79 5 Нафтиламин, ацетальдепщ, прокарбазип

0,77 2 Пропилметансульфонат, этиленоксид

0,73 3 Бензидин, блеомицин

0,65 1 Трихлорфенол

0,63 1 Дибромхорпропап

0,62 1 Нитрозоэтилуретан

0.61 3 Гидроксид метилртути

0,6 1 Формальдегид

0,59 1 Тио-ТЭФ

0,57 3 Тирам, хлорамбуцил

0,56 1 Нитрофурантоин, нитрозоморфолин

0,55 1 Сульфат хрома

0,54 2 Циклофосфамид

0,52 2 Этанол, бензпирен

0,5 9 Акрифлавин, диметилнитрозамип, соединения кадмия, акриламид, соединение X

0,49 б ДДТ, пропилнирозомочевина, фурациллин

0,48 2 Цитарабин, бис(2-хлорэтил) эфир

0,47 3 Сахарин, бензантрацен

0,45 б Дисульфид углерода, цирам,

0,43 2 Беномил, цисплатин

0,39 1 Метилтиофонат

0,37 2 Акрилонитрил, адриамицин

0,29 1 Метилп аратион

0,27 4 Дихлофос, паратион, морфолин

0,25 2 бета-Пропиолактон, азидотимидин

0,23 7 Цикламат натрия, глицидол, диазенам

0,19 5 2,4,5-Т, р-хлор-о-толуидин, хлорид хрома

0,1 3 6-меркаптопурин, фенилбутазон

0,09 1 Бутилгидрокситолуол

Таким образом, сформирована количественная шкала для оценки потенциальной генетической опасности химических соединений. С помощью этой шкалы количественно определена потенциальная мутагенная опасность химических соединений, которые исследованы с использованием изученных в работе тест-систем.

4. Изучение взаимосвязи между мутагенной активностью и структурой химического соединения

4.1. Качественный экспериментальный анализ

Исследование в тесте Эймса мутагенной активности 60 полициклических ароматических соединений (ПАС) в порядке возрастания количества ароматических циклов (производные бифенила с двумя неконденсированными кольцами, производные флуорена и фенантренхинона с тремя конденсированными кольцами, замещенные пирены и гетероциклические аналоги пирена с четырьмя конденсированными кольцами) позволило выявить некоторые закономерности во влиянии отдельных структурных особенностей на их мутагенную активность.

1. Влияние заместителей в пара-положении. Как показывают полученные данные, существует прямая связь между мутагенной активностью и наличием заместителей в пара-положении, особенно это относится к нитрогруппам или одной нитро, а другой электроно-акцепторной (например, карбоксильной) группе. Пара-положение является ответственным за мутагенные эффекты исследованных производных бифенила (БФ), флуоренона (Ф), фенантренхинона (ФХ), пирена (П) и гетероциклических аналогов пирена (ГАП). Если в молекуле БФ два ароматических кольца являются подвижными друг относительно друга и их вращение могут увеличивать заместители в орто-положении, сводя на нет влияние пара-ничрогрупп (как в молекулах 4,4'-ДН-2'-КБФ; 4,4'-ДИ-2,2'-ДКБФ), то для молекул с конденсированными ароматическими кольцами влияние заместителей в других положениях на пара-иитрогруппы не настолько радикально (молекулы 2-НФ-5-КК; 2,7-ДНФ-5-КК; 2,7-ДНФ-5-КАд; 2-НФ-5,7-ДКК; 2,4-ДНФ-5,7-ДКК являются активными фреймшифт-мутагенами). Нужно отметить, что ранее эффект орто-заместителей в молекуле БФ был показан только для нитрогрупп (Шгауата е1 а!., 1986), в кашей работе установлено, что аналогичным эффектом обладают и карбоксильные группы. Причем, так же, как и в случае с нитрогруппами это влияние не распространяется на тетранитрозамещенные производные БФ.

В молекулах ацетщширена (АцП) и ацетиламинопирена (АцАП) перенос ацетил- и нитрогруппы из пара-позиции в другую приводит к уменьшению мутагенной активности, причем, чем дальше от пара-положения удаляются заместители, тем меньше наблюдаемая мутагенная активность.

Для электроно-донорной ацетиламино- и нитрогруппы характерны те же тенденции: 1-АцА-6-НП активнее, чем 1-АцА-8-НП,

Для ГАП показано, что наличие нитрогрунп в пара-положении придает молекуле мутагенные свойства, в то время, как две нитрогруппы в положениях 1, б и даже четыре нитрогруппы в положениях 1, 3, 6, 8 не приводят к появлению мутагенной активности. Этот эффект, видимо, имеет место для любой трансформируемой в активный интермедиат группы, что следует из сравнения действия активного фреймшифт-мутагена 2,7-диМНг-ДТДП и неактивного 1,6-диШгДТДП.

Возможным объяснением ключевой роли пара-положения в молекулах с конденсированными ароматическими кольцами может служить изменение конформации молекулы при сближении заместителей (мета- и орто-положения).

Полученные нами данные показывают, что резонансно-индукционный эффект существует в молекулах нитропроизводных Ф, АцП, АцАП. Впервые показано более сильное индукционное влияние карбоксильной группы на нитрогруппу у нитропроизводных Ф, Например, 2-НФ-5,7-ДКК в несколько раз активнее, чем 2,7-ДНФ-5-КК (таблица 4.1.)

2. Влияние классической нитроредуктазы на метаболическую активацию нитро-ПАС. Основным путем метаболической активации молекул большинства нитро-ПАС является восстановление нитрогруппы внутриклеточными ферментами, в том числе «классической» нитроредуктазой. Исследование мутагенной активности гетероциклов показывает, что другие заместители (ОН, ЫНз, СЗ, Вг, I) не сообщают молекулам мутагенных свойств, сравнимых с активностью нитрозамещенных ГАП. Оценка вклада «классической» нитроредуктазы в восстановление нитрогруппы в штаммах 5. 1урЫтипшп ТА98Ж и ТА10С№ позволяет определить и участие других ферментов в этом процессе. Данные, полученные нами, показали, что метаболическая активация исследованных молекул происходит с участием различающихся ферментов при индукции мутаций замены пар оснований и при индукции сдвига рамки считывания. Если мутагенность нитропроизводных Ф и ФХ в ТАЮОШ, дефектном по «классической» нитроредуктазе, снижается фактически до спонтанного уровня, то их активность в ТА9 Г сохраняется на высоком уровне (таблица 4.1). Для индукции замены пар оснований этими соединениями достаточно восстановления нитрогруппы «классической» нитроредуктазой, а для индукции сдвига рамки считывания необходимо участие в биотрансформации других ферментов. Нитрозамещенные ГАП сохраняют высокий уровень мутагенной активности в ТА98ЫТ и в ТА100№, причем, зависимость от «классической» нитроредуктазы при индукции замены пар оснований гораздо меньше (то есть количество ферментов, участвующих в этом процессе больше), чем при индукции сдвига рамки считывания. Каждое соединение имеет отличный механизм активации, в зависимости от своих

структурных особенностей. Так, индукция фреймшифт- мутаций 2,7-диМОг-ДЦТДП зависит от «классической» нитроредуктазы в большей степени, чем 2,7-диКОгДДП. Точно так же, как и 2,4-ДНФ-5,7-ДКК теряет в TA98NÎ значительно больший процент активности, чем другие производные Ф.

Таблица 4.1. Влияние Nf мутации на мутагенную активность нитропроизводных флуоренона в тест-штаммах S. typhimurium.

Соединение Доза, Количество Ыз*-ревертантов на чашку

нмоль/ч ТА98 TA98NÎ ТА 100 TAlOONf

2-НФ-5-КК 0 23 16 163 150

3,8 62 39 1240 186

7,6 82 29 3986 202

15,2 142 18 4844 176

30,4 248 34 9112 254

76,0 985 68 13541 273

2.7-ДНФ-5-КК 3,8 165 44 130 253

7,6 437 81 128 230

15,2 662 118 220 217

30,4 1756 364 206 198

76.0 3370 650 309 183

2,7-ДНФ-5-КАд 3,8 3733 1830 944 285

7,6 7453 5139 1741 330

15,2 13146 6802 3378 409

30,4 26380 8060 5413 616

76,0 30000 21300 8604 S98

2-НФ-5.7-ДКК 3,8 1022 312 233 196

7,6 2392 535 316 161

15,2 2919 828 424 226

30,4 4720 1406 849 249

76,0 6320 2737 1040 207

2,4-ДНФ-5,7-ДКК 3,8 3954 555 233 187

7,6 5354 624 272 166

15,2 10824 1625 443 144

30,4 14549 2521 648 133

76,0 10421 6712 1529 48

3. Роль атомов кислорода в молекулах ГАП. Сравнивая данные по мутагенной активности в ряду ГАД нами впервые установлено, что увеличение числа атомов кислорода или внедрение его в молекулу в качестве гетероатома приводит, как правило, к росту и мутагенных, и токсичных свойств соединения (мутагенная активность 2,7-диЫН2-ДДТДП > мутагенной активности 2,7-диЫНг-ДТДП; мутагенная активность 2,7-ди>Ю2-ДДП >

31

мутагенной активности 2,7-диМОг-ДДТДП), Вероятно, кроме основного, существует еще один путь активации указанных соединений, приводящий к образованию не только мутагенных, но и токсичных интермедиатов, Можно предположить, что это вызвано влиянием свободных радикалов кислорода (СРК).

Увеличение в молекуле атомов кислорода приводит к сдвигу равновесия между нигросоединением, гидроксиламином и соответствующим имином в сторону окисленной формы с образованием при этом СРК. Поскольку для аминопроизводных ГАП характерно такое же влияние атомов кислорода, можно предположить, что даже в отсутствии экзогенной метаболической активации аминозамещенные ГАП образуют соответствующие производные гидроксиламина. При этом, для ГАП не способных к образованию производных гидроксиламина, таких как 2,7-диОН-ДТДП и 2,7-диОН-ДЦТДП, зависимости мутагенных и токсических свойств от степени окисления молекулы не наблюдается.

4. Влияние на мутагенную активность плазмидных генов шисАВ. При изучении мутагенных свойств производных Ф, ФХ, ГАП было показано, что эти соединения не могут индуцировать мутации замены пар оснований в бесплазмидном штамме ТА1535, однако при наличии генов ошибочной репарации тисАВ они становятся высокоактивными индукторами мутаций этого типа.

16000 -оз 14000 -1 12000 -£ 10000 -| 8000 -I 6000 -

5 4000 ■ т 2000 -о -

1 2 3 4 5 6 7 S Соединения фпуоренона и фемантренхинона

Iota шв эта 98 ита 1537 шта 97

________ ■— _i

Рисунок 4,1. Влияние плазмиды pKMIOl на индукцию мутации соединениями флуоренона и фенантренхинона: 1-2-НФ-5-КК; 2-2,7-ДНФ-5-КК; 3- 2,7-ДНФ-5-КАд; 4- 2- НФ-5,7-ДКК; 5- 2,4-ДНФ-5,7-ДКК; 6- 2-НФХ; 7- 2,7-ДНФХ; 8- 2,3,7-ТНФХ. (Штаммы S. typhimimum ТА 1538, ТА 98, ТА 1537 и ТА 97).

Экстремально высокую мутагенную активность в ТА100 показал 2-НФ-5-КК (13541 ревертант/чашку при дозе 50 мкгУчашку), но в отсутствии «классической» нитроредуктазы (в ТАЮОИО он теряя свои мутагенные свойства. Можно предположить, что активным метаболитом этого соединения, способным образовывать аддукт с основаниями ДНК, является 2-гидроксилам ян о флу оренои-5-карбоновая кислота, образованная в результате восстановления нитрогруппы «классической» нтроредуктазой. Вероятно, один из аддуктов этого метаболита с ДНК (вероятнее всего с М2 атомом гуанина) узнается ферментами ошибочной репарации и отвечает за замену пар оснований (но не за сдвиг рамки считывания, так как 2-НФ-5-КК практически неактивен в ТА1538).

Влияние плазмидных генов тисАВ на индукцию сдвига рамки считывания не столько однозначно. Как правило, для всех молекул нитро-ЛАС, исследованных нами, характерно снижение мутагенной активности в плазмидном штамме ТА98 по сравнению с бесплазмидным ТА1538 (рис.4.1). Обычно это снижение не более, чем в два раза, но у одного соединения - 2-НФ-5,7-ДКК уменьшение мутагенного эффекта составляет порядок. Здесь надо отметить вклад карбоксильной группы в 7-ом положении в этот процесс, именно она меняет характер активации и взаимодействия с ДНК (ср. 2,7-ДНФ-5-КК и 2-НФ-5,7-ДКК, рис.4.1), вероятно, из-за стерических факторов.

5. Связь между мутагенной активностью и планарностью молекул. Обобщение данных по мутагенной активности различных молекул вскрывает еще одну важную особенность структуры, ответственной за повышение его активности, - планариость молекулы. Совершенно очевидно, что пленарные молекулы лучше интеркалируют между основаниями ДНК, что приводит к увеличению их способности индуцировать мутации типа +1 фреймшифт. Но основная часть исследуемых соединений индуцирует мутации сдвига рамки считывания за счет образования аддуктов, а не в результате простой интеркаляции, хотя возможен и смешанный механизм возникновения мутаций.

Вероятнее всего, основным фактором, приводящим к увеличению мутагенных эффектов планарных молекул, является их большее сродство к нитроредуктазам и, возможно, другим ферментам, участвующим в метаболизме.

Из сравнения данных по мутагенной активности производных БФ с аналогичными производными ФХ и Ф, видно, как циклизация молекул приводит к превращению неактивных структур в активные в результате закрепления ароматических колец в одной плоскости (рис.5.2).

Характер заместителей также оказывает влияние на планарные свойства молекулы, что особенно хорошо видно в ряду производных БФ. Так, орто-

заместители увеличивают вращение вокруг связи С-С и, тем самым, уменьшают планарную конформацию и снижают мутагенность соединения.

спш агя юЛ //у У ю? О ссш

оосн ахн J—^ у—Щ ю, 0 О

оэон соан юг<^ V—\ У~ЫОг О 0 ЩУ—

Немутагены и слабоактивные Сильные

мутагены мутагены

Рисунок 5Л. Примеры влияния циклизации на мутагенную активность нитро-ПАС.

4.2. Количественный статистический анализ

ЬМодели на основе квантовохим н ческих и подструктурных дескрипторов. Для проведения количественного статистического анализа зависимости структура- мутагенная активность 60 ПАС использовали экспериментальные данные изучения их активности в тесте Эймса и программные комплексы ЭММА (Эффективное Моделирование Молекулярной Активности) и NASA (Neural Approach to Structure-Activity), разработанные на Химическом факультете МГУ под руководством академика Н.С. Зефирова (Баскин, 1993).

На первом этапе с помощью программного комплекса ЭММА, который обеспечивает полный цикл процедур по вводу химической структуры, расчету квантовохимическкх параметров, выделению подструктурных фрагментов, был проведен линейный множественный регрессионный анализ результатов изучения мутагенной активности замещенных бифенилов в тесте Эймса с целью установления количественной зависимости структура-активность. Были получены математические модели на основе подструктурных и квантовохимических дескрипторов этих соединений с высокими значениями коэффициента корреляции между предсказанными и экспериментальными значениями показателя мутагенной активности (R=0,95). Такие же математические модели, описывающие зависимость структура — активность, были получены и для других групп соединений.

Объединение выборок с различными базовыми структурами привело к увеличению числа дескрипторов в математической модели. Кроме того, уровень корреляции между предсказанными и экспериментальными значениями мутагенной активности для соединений объединенной выборки была ниже (R= 0,863), чем для отдельных выборок (R>0,95). В этой связи нами была опробована методология нейронных сетей, позволяющая учесть нелинейные зависимости между структурой и активностью.

Введение объединенной выборки из 60 соединений в NASA с разбивкой на обучающую (54 соединения) и контрольную (6 соединений, отобранных программой случайным образом) выборки позволило получить обученную нейронную сетью. При этом последовательно строили нейроссти, входной слой которых содержал 9, 11, 15 наиболее часто встречающихся квантовохимических и подструктурных дескрипторов. Наиболее приемлемые результаты были получены при использовании 9 следующих дескрипторов:

- минимальная электронная плотность LUMO;

- минимальная электронная плотность HOMO на атомах углерода;

- минимальная нуклеофильная суперделокализуемость на атомах углерода;

- максимальная нуклеофильная суперделокализуемость на атомах кислорода;

-подструктурныефрагменты frs, &б, frg, fr9 и frt0. При этом коэффициент корреляции между предсказанной и экспериментальной величинами числа ревертантов для соединений в обучающей выборке R=0.932 (St=0.850; S¥=0.803).

Таким образом, для выборки из 60 неродственных соединений нейросетевые модели обладают лучшей прогнозирующей способностью (R=0,932), чем линейно-регрессионные (R=0,863),

2. Модели на основе дескрипторов, отобранных путем экспертного анализа. Полученные нами математические модели структура-активность хорошо прогнозируют мутагенную активность химических соединений, входящих в исследуемую выборку, однако отобранные дескрипторы не

являются информативными с точки зрения представлений о механизмах мутагенного действия этих соединений. Поэтому нами была проведена работа по построению математических моделей с использованием тех же экспериментальных данных, но с помощью дескрипторов, отобранных экспертным путем в соответствии с гипотезами о механизме действия нитроароматических соединений и эмпирическими заключениями о влиянии элементов структуры на мутагенную активность.

Принципы отбора дескрипторов. Исходная выборка включала в себя 54 производных бифенила, флуорена и гетероциклических аналогов пирена я фенантрена. .Для включения в математические модели в качестве дескрипторов мы вначале рассмотрели основные факторы, определяющие или влияющие на мутагенную активность нитроароматических соединений. Все эти факторы были подробно обсуждены выше (см. раздел 4.1). Известно, что основным путем биотрансформации нитроаренов, приводящим к образованию мутагенных, канцерогенных и токсичных метаболитов, является восстановление нитрогруппы нитроредуктазами клетки (McCoy et al., 1983). Способность к восстановлению нитроаренов коррелирует с таким параметром, как энергия низшей незанятой молекулярной орбитали Ец:мо (дескриптор dj) (Дьячков, 1990). Кроме того, в модель были включены 2 квантовых параметра, которые могут охарактеризовать состояние атомов азота и кислорода в молекулах: уровень максимального заряда на атоме азота (дескриптор d2) и уровень максимального заряда на атоме кислорода (дескриптор dj). В качестве дескриптора ¿4 в модель был включен коэффициент распределения октанол-вода logP (гидрофобность), характеризующий способность молекулы достигать сайтов взаимодействия в живом организме.

Наибольшую активность в экспериментах показали соединения с пара-положением нитрогруппы, гетероциклические аналоги пиреиа с пара-положением аминогруппы, тогда как наличие заместителей в орто- и мета-положениях снижало активность. Поэтому в качестве подструктур! шх дескрипторов в модель были введены следующие дескрипторы: наличие нитрогруппы в пара-положении - dj; наличие аминогруппы в пара-положении - наличие мета- и орто-заместнтелсй - ¿7. Мутагенная активность исследуемых соединений выражена как логарифм числа his1"-ревертантов в дозе, относящейся к середине линейного участка кривой доза-эффект.

Линейно-регрессионный анализ. С помощью программного комплекса "EMMA" была получена серия линейно-регрессионных уравнений. При построении модели выборка из 54 соединений была произвольно разбита на обучающую — 49 и контрольную - 5 соединений- Нужно отмстить, что дескрипторы соединений контрольной выборки не участвуют в построении модели, но на основании найденных уравнений для них рассчитывается мутагенная активность (логарифм числа hîs+ ревертантов). Лучшее из полученных линейно-регрессионных уравнений включало 3 дескриптора -

Ещмо> и структурный дескриптор (наличие нитрогруппы в пара-положении):

ВД^) = -1.77(3!-0.22(34 + 0.90^-0.52 (1)

К = 0.75; ^ = 1.45; = 1.94; Р = 18.80, где 5, - среднеквадратичная ошибка воспроизведения числа ревертантов для соединений обучающей выборки; — среднеквадратичная ошибка предсказания числа ревертантов для соединений контрольной выборки; Л -коэффициент корреляции между предсказанной и экспериментальной величинами числа ревертантов для соединений обучающей выборки; Р -критерий Фишера.

Для того, чтобы повысить коэффициент корреляции и, следовательно, предсказательную ценность модели в рамках заданных дескрипторов, общая выборка из 54 соединений была разбита на 2 подвыборки структурно-родственных соединений.

Для выборки из 33 гетероциклических аналогов пирена и фенантрена и замещенных флуоренонов (обучающая выборка состояла из 30, а контрольная - из 33 произвольно выбранных соединений) были получены следующие уравнения:

ЬОД») = -1.05(11 + 1 -84^ - 0.34<Ь + 1.04 (2)

И = 0.75; = 1.24; = 1.21; Р = 11.25

= -2.64(1! - 1.10а2 - $.93(3з + 1.34(15 + 0.89^ - 0.67<1т -3.93 (3)

И = 0.80; 5,= 1.21; 8У = 1.34; V = 6.68

Для замещенных бифенилов (обучающая выборка - 19 соединений, а контрольная - 2 произвольно выбранных) лучшим было уравнение: 1п(ЫЫ5+) = -2.14(11 - 0.57(1, - 0.13 (4)

К = 0.82; 8, = 1.52; = 1.12; Р = 16.37

Сравнивая между собой полученные уравнения, можно заметить, что дескриптор Ещмо выступает в роли основного, способного характеризовать мутагенную активность как молекул с конденсированными бензольными кольцами, так и производных бифенила. Чем энергия низшей свободной орбитапи меньше, тем стабильнее соответствующие активные метаболиты, в частности, первый в цепи восстановления нитрогруппы - анион-радикал, тем больше мутагенная активность. Вторым по значению дескриптором, характеризующим положение нитрогрупп, является <3д, прямо пропорциональный мутагенной активности. Влияние мета- и орто заместителей, уменьшающее планарность молекулы и ее активность, оказалось более важным для молекул с конденсированными бензольными кольцами, чем для бифенилов, что следует из уравнений 2, 3 и 4. Показатель гидрофобности присутствует в уравнениях 1,4 и отсутствует при описании активности производных с конденсированными бензольными кольцами. Поскольку для этих производных может быть членом уравнения, а может и не быть, точно так же как и для бифенилов, вероятно, гидрофобность играет второстепенную роль в определении мутагенной

активности рассматриваемых соединений. Включение ее в уравнение определяется значимостью других дескрипторов в уравнении.

На примере уравнений 1 и 2 для производных пирена, фенантрена и флуоренона можно видеть, как в результате добавления в уравнение новых членов - дескрипторов dit d3, d^, увеличивается коэффициент корреляции, а, следовательно, и точность прогноза. При этом наличие аминогруппы в пара-положении (tie) способствует увеличению мутагенной активности, что соответствует экспериментальным данным, а уровень максимального заряда на атоме азота (di) и уровень максимального заряда на атоме кислорода (dj) уменьшают ее.

Нейрос^тевой анализ. На базе дескрипторов, рассчитанных и отобранных методом линейной регрессии, была обучена нейронная сеть (программа NASA). Так же как и при линейно-регрессионном анализе выборки соединений произвольно разделяются на обучающую и контрольную, входной слой нейронной сети содержит соответствующее число дескрипторов (для выборки производных пирена, фенантрена, флуоренона использовались дескрипторы из уравнения 2. Как видно из данных, приведенных в таблице 5.2, удалось повысить коэффициенты корреляции и уменьшить ошибку прогноза для всех трех вариантов выборки. Но наилучший эффект был достигнут для замещенных бифенилов, представляющих собой единый массив структурно-родственных соединений, действующих по одному механизму.

Таблица 4.2. Параметры обученной нейронной сети

Выборка соединений Дескрипторы входного слоя Показатели прогноза

R s, Sv

Производные пирена, фенантрена, флуоренона d1( dj, d3, d5, di, d7 0.90 0.76 0.96

Замещенные бифенилы dbdt 0.97 0.59 0.13

Все соединения d], d*, di 0.78 1.30 1.57

где Я - коэффициент корреляции между предсказанной и экспериментальной величинами числа ревертантов для соединений обучающей выборки; ^ — среднеквадратичная ошибка воспроизведения числа ревертантов для соединений обучающей выборки; 5, -среднеквадратичная ошибка предсказания числа ревертантов для соединений контрольной выборки.

Для объединенной выборки соединений показатели прогноза практически остались на уровне предсказания с помощью линейно-регрессионных уравнений.

Используя методологию нейронных сетей, можно значительно улучшить показатели прогноза, если параметризовать мутагенную активность по дискретной шкале (1 — активное соединение; 0 - неактивное). Так, для выборки из 33 гетероциклических аналогов пирепа, фенантрена и замещенных флуоренонов коэффициент корреляции был увеличен до К =

38

0.998. При этом во входном слое нейронной сети содержались только подструктурные дескрипторы:

- наличие нитрогруппы в пара-положении;

- наличие аминогруппы в пара-положении;

- наличие других заместителей в пара-положении;

- наличие орто-СООН групп;

- число групп =МОН в орто-положеши;

- число других орто-заместителей.

Таким образом, показано, что нелинейные зависимости структура-активность, полученные с помощью методологии нейронных сетей, позволяют улучшить качество прогноза. Точность прогноза тем выше, чем выше структурное родство соединений в выборке. При переходе от непрерывной шкалы активности {доза в середине линейного участка кривой доза-эффект) к дискретной (активное соединение, неактивное) характеристики предсказания также улучшаются. Кроме того, примененный нами подход, основанный на введении в модель дескрипторов, отобранных экспертным путем, может быть использован для проверки выдвинутой гипотезы о механизме действия группы структурно-родственных соединений. Полученные уравнения могут быть использованы для предварительного прогноза мутагенной активности новых соединений, которые по своей химической структуре близки к соединениям в анализируемой выборке.

ВЫВОДЫ

1. Исследование эффективности теста Эймса в зависимости от класса химических соединений позволило оптимизировать протокол его проведения и учета наблюдаемых мутагенных эффектов. Определены оптимальные концентрации 8-9 и кофакторов, режимы тестирования с и без метаболической активации, предложены мутагены для позитивного контроля и критерии регистрации значимого мутагегагого эффекта.

2. Сравнительный анализ ЗОЭ-хромотеста, К.ес-теста и теста Эймса показал отсутствие однозначной связи между ДНК-повреждающим и мутагенным действием химических соединений. Полученные результаты позволили сделать заключение о необходимости использования для первичной оценки потенциальной генетической активности химических соединений батарею из тестов на мутагенность и на ДНК'ПОВреждающую активность.

3. С использованием теста Эймса впервые была выявлена мутагенная активность антибактериальных средств диоксидина и хиноксидина и препаратов нибитон, ОГ-034, ДЦДТДП, синтезированных в качестве

перспективных лекарственных веществ. Обнаружена способность противоопухолевых средств фотрина, фопурина, проспидина, тиофосфамида, циклофосфана, сарколизипа и антибактериальных препаратов фурацилина, фуразолидона, фурадонина и солафура индуцировать генные мутации у микроорганизмов. В случае ДДДТДП показана его способность специфически индуцировать мутации типа сдвига рамки считывания, что в дальнейшем позволило рекомендовать его в качестве позитивного контроля в тесте Эймса.

4. При комплексном использовании микробиологических методов и методов анализа ДНК в клетках млекопитающих in vivo и in vitro показаны особенности мутагенного действия диоксвдина, бромида этидия и ДДДТДП. Установлено, что мутагенный эффект диоксвдина является RecA-зависимым и органоспецифическим. В случае бромида этидия показано, что его мутагенный эффект является результатом окисления цитохромом Р-448 и интеркаляции образовавшегося при этом метаболита в молекулу ДНК. Анализ кинетики восстановления повреждений ДНК, индуцированных ДДДТДП, свидетельствует в пользу того, что он относится к классу бифункциональных мутагенов.

5. В результате 6-летнего мониторинга установлено, что мутагенная активность сточных вод Байкальского ЦБК связана с хлорированием при отбелке целлюлозы. Уточнены режимы химической и биологической очистки и разбавления, обеспечивающие снижение мутагенной активности сточных вод до уровня контрольной, и обосновать необходимость включения теста на мутагенность в комплексную программу биомониторинга за эколого-токсикологическим состоянием различных производств Байкальского ЦБК.

6, Проведенный экспериментальный анализ связи структура- активность ддя нитроароматических соединений позволил установить взаимосвязь между мутагенной активностью и пара-позицией нитрогруппы, планарностью кон формации молекулы к электронодонорными или акцепторными свойствами других заместителей. Впервые обнаружено более сильное, чем у нитрогруппы, влияние карбоксильной группы в пара-положении на мутагенную активность производных флуоренона. Впервые установлено, что увеличение числа атомов кислорода или внедрение его в молекулу в качестве гетероатома в пиреновые структуры приводит к росту мутагенных свойств соединения.

7, При проведении исследования эффективности статистических линейно-регрессионных и нейросетевых моделей QSAR на примере 60 соединений бифенильного ряда показано, что последние обладают лучшей прогнозирующей способностью по сравнению с линейно-регрессионными моделями.

8. Показано, что включение в анализ дескрипторов, отобранных экспертным путем на основе их вероятного механизма участия в мутагенной активности, позволяет улучшить предсказательную способность математической модели, а также количественно определить их вклад в

мутагенную активность в рамках рассматриваемой модели. Таким путем обнаружено, что энергия низшей незанятой орбитали Ещмо и наличие нитрогруппы в пара-позиции вносят основной вклад в мутагенную активность исследованных соединений.

9. Показана целесообразность использования селективной информации в качестве количественной меры эффективности тестирования как для отдельных тестов, так и их батарей. Использование функции уровня (веса) доказанности, являющейся производной полной информации, позволяет оценивать генетическую опасность химических соединений по результатам их тестирования.

10. Созданная компьютерная база данных и специальные служебные программы позволили провести количественную оценку эффективности батарей для 6 наиболее использующихся в настоящее время тест-систем. Показана низкая эффективность тестов in vito), как при применении отдельно, так и в составе батарей. Установлено, что эффективность тестирования связана не с увеличением числа тестов, входящих в батарею, а с включением тестов in vivo на видах, филогенетически близких к человеку. При этом существенно большую эффективность по отношению к другим тестам показал тест по учету доминантных летальных мутаций у мышей.

II. На основе дискриминапгного анализа разработан метод, позволяющий оценивать потенциальную мутагенную опасность химических соединений с учетом числа использованных тестов и результатов их испытаний. Для выборки включающей в себя 105 химических соединений, у которых известна мутагенная активность в половых клетках грызунов и результаты тестирования хотя бы в одном из 5 тестов (из 6 исследованных в работе) поведена количественная оценка уровня доказанности мутагенной опасности для млекопитающих.

Список основных публикаций по теме диссертации

Книги:

1. Абилев С.К., Порошенко Г.Г. Ускоренные методы прогнозирования мутагенных и бластомогенных свойств химических соединений // Итоги науки и техники. Сер.« Токсикология», Т.14, М. ВИНИТИ, 1986.170 с.

2. Порошенко Г.Г., Абилев С.К. Антропогенные мутагены и природные антимутагены// Итоги науки и техники. Сер. «Общая генетика», Т. 12. М., ВИНИТИ, 1988. 208 с.

3. Шигаева М.Х., Ахматулина Н.Б., Абилев С.К. Мутагены и комутагены окружающей среды// -Алматы; Гылым., 1994. -255 с.

Методические указания и рекомендаций:

1. Фонштейн J1.M, Калинина Л.М., Полухина Г.Н., Абилев С.К., Шапиро A.A. Тест-система оценки мутагенной активности загрязнителей среды на Salmonella (Методическое указание). М., 1977.36 с.

2. Фонштейн Л.М., Абилев С.К., Облапенко Н.Г., Бобринев Е.В., Калинина Л.М., Полу хина Г.Н. Методические рекомендации по применению теста Эймса Salmonella/микросомы. МЗ СССР, М., 1983.27с.

3. Фонштейн Л.М., Абилев С.К., Бобринев Е.В., Калинина Л.М., Облапенко Н.Г., Подольная М.А., Полухина Г.Н., Седышева Н.Ю., Шапиро A.A. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем. (Методическое указание). ГКНТ СССР, М„ 1985,34с.

4. Журков B.C., Красовский НГ., Жолдакова З.И., Фонштейн Л.М.. Абилев С.К., Бобринев Е.В., Подольная М.А., Облапенко Н.Г., Дуган А.М. Методические указания по изучению мутагенной активности химических веществ при обосновании их ПДК в воде. МЗ СССР. Главное санитарное управление, М., 1986.26с.

5. Абилев С.К., Фонштейн Л.М., Дуган А.М. Статистическая обработка данных тестирования на мутагенность методом Эймса Salmonella/ микросомы // Статистическая обработка данных тестирования на мутагенность (Методическое указание). Вильнюс, 1989. С.б-11.

6. Методические рекомендации по проверке мутагенных свойств у новых лекарственных препаратов. МЗ СССР, Управление по внедрению новых лекарственных средств и медицинской техники МЗ СССР, Фармакологический комитет МЗ СССР, М., 1981.86с.

7. Белицкий Г.А., Ревазова 10.А., Абилев С.К, Арзамасцев Е.В., Верстакова О.Л., Гуськова Т.А., Дурнев А.Д., Журков B.C., Ингель Ф.И., Куничан А.Д., Мизгирев И.В., Сычева Л.П., Танирбергенов Т.Б., Хрипач Л.В., Худолей В.В., Юрченко В.В., Цуцман Т.Е. Прогноз канцерогенности фармакологических средств и вспомогательных веществ в краткосрочных теста (Методические рекомендации) // Ведомости Фармакологического Комитета, 1999, Xsl. С.18-31

Изобретения:

1.Устройство для испытания химических соединений на мутагенную активность. Авторское свидетельство N654683 от 7 декабря 1978 г. Приоритет от 7 декабря 1976 г. Авторы: Абилев С.К., Пирузян Л .А., Колокольцев И.Я., Комаров В.Д., Скибенко В.В., Фонштейн Л.М.

2.УстроЙство для испытания химических соединений на мутагенную активность. Авторское свидетельство N745947 от 14 марта 1980 г. Приоритет от 29 ноября 1977 г. Авторы: Абилев С.К., Пирузян Л.А., Колокольцев И.Я., Комаров В.Д., Скибенко В.В., Фонштейн Л.М.

3.Способ получения мутаций типа сдвига рамки считывания генетического кода. Авторское свидетельство N1172268 от 8 апреля 1985 г.

Приоритет от 10 октября 1983 г. Авторы: Абилев С.К., Мигачев Г.И. Седышева Н.Ю., ФоиштеЙи Л.М., Шапиро A.A.

4.Способ получения мутантов у спорообразующнх бактерий Streptomyces и Clostridium acetobutylicum. Авторское свидетельство N 1645301 от 3 января 1991 г. Приоритет от 4 октября 1988 г. Авторы; Ломовская Н.Д., Чиненова Т.А., Клочкова O.A., Бирюкова И.В., Емельянова Л.К., Воейкова Т.А., Мкртумян Н.М., Абилев С.К.

Статьи:

1. Фонштейн JIM., Шапиро АЛ, Абилев С.К. Микроорганизмы как индикаторы мутагенной активности химических соединений // Изв. АН СССР, сер биол., 1975, №5. С.671-681.

2. Ревазова Ю.А., Золотарева Г.Н., Шапиро A.A., Абилев С.К., Журков B.C., Фонштейн Л.М. Изучение мутагенной активности мажептила //Цитология и генетика, 1975, №5. С.400-403.

3. Фонштейн JIM., Абилев C.JC, Зехнов A.M., Шапиро A.A. Изучение эффекта мутагенной метаболической активации N-шпрозоморфолииа на микроорганизмах //Генетика, 1976, №5. С. 119-125.

4. Фонштейн JI.AZ, Абилев С.К, Акиньшина JIM., Зехнов А.М. Изучение мутагенного действия некоторых лекарственных препаратов на индикаторные бактерии //Хим.-фарм. ж., 1978, Xsl. С.39-44.

5. Шапиро A.A., Абилев С.К., Брацлаеский В.А., Мексин В.А., Ревазова Ю.А., Фонштейн Л.М. Изучение мутагенного действия хиноксидина на Salmonella typhimurium и Drosophila melanogaster // Хим.- фарм. ж., 1978. №3, С.28-32.

6. Фонштейн Л.М., Ревазова Ю.А.,Золотарева Г.Н., Абилев С.К., Акиньшина Л.П„ Брацлаеский В.А., Искахова Э.Н., Мексин В.А., Радченко Л.У., Шапиро АЛ. Изучение мутагенной активности диоксидина//Генетиха, 1978, №5. С.900-908.

7. Шапиро A.A., Мексин В.А., Абилев С.К., Акиньшина Л.П., Фонштейн Л.М. Изучение мутагенной активности противотуберкулезных препаратов; гидразида изоникотиновой кислоты и его аналогов //Цитология и генетика, 1978, №4. С.343-348.

8. Фонштейн Л.М., Абилев С.К, Акиньшина ЛП Изучение метаболической активации химических соединений с помощью микроорганизмов. Сообщение I. Эффект индукторов микросомальных систем //Генетика, 1978,№9. C.1564-I570.

9. Абилев С.К, Сурайтна Т.И., Фонштейн Л.М. Изучение инактивирующего и мутагенного действия диоксидина на внеклеточный бактериофаг Т4 и индикаторные бактерии Escherichia coli //Хим.- фарм. ж., 1978,№10. С. 18-22,

10. Фонштейн Л.М., Абилев С.К., Акиньшина Л.П., Захарова H.A., Иванова H.A., Облапенко Н.Г., Седышева Н.Ю., Сурайкина Т.Г. Исследование

генетических эффектов лекарственных веществ и других биологически активных соединений в тестах на мутагенез и ДНК-повреждающее действие // Хим.-фарм. ж., 1982, №10. С.11-16,

11. Степанова JIM, Глазер В.М., Абилее С.К., Котелеецев C.B., Каган Б.Е., Бейм А.М., Козлов ЮЛ. Тест-система для биоиндикации сточных и природных вод на базе монооксигеназ печени рыб.// В кн. Методы биоиндикации и биотестирования природных вод. 1987. Ленинград. С.12-18

12. Глазер В.М., Каган В.Е„ Абшев С.К., Савов В.М., Бейм A.M., Козлов Ю.П. Тест-системы для биомониторинга на основе мембрано-связанных ферментных комплексов. Ш. Оценка генотоксического действия промышленных стоков в тест-системе Эймса с метаболической активацией микросомальнымимонооксигеназами//Биол. науки, 1983, № 9. С.91-101.

13. Глазер В.М.,Саввов В.М., Абшев С.К., Шестерин С.И., Бе им A.M., Каган В.Е. Тест-системы для биомониторинга на основе мембрано-связанных ферментных комплексов. IY. Оценка генотоксического действия промышленных стоков в тест-системе Эймса с метаболической активацией микросомальными моноокскгеназами из печени рыб// Биол. науки, 1984, №5. С.85-89.

14. Глазер В.М.,Степанова Jl.ll., Абшев С.К, Котелеецев C.B., Каган В.Е., Бейм A.M., Козлов Ю.П. Тест-система для индикации сточных и природных вод на базе монооксигеназ рыб, осуществляющих метаболическую активацию ксенобиотиков // В кн, «Методы биоипдикации и биотестирования природных вод». 1985. Ростов-на-Дону. 1985. С.97-102.

15. Абшев С.К. Метаболическая активация химических мутагенов //Итоги науки и техники. Общая генетика, ВШШТИ, 1986. Т.9. С.5-96.

16. Абшев С.К. Основные классы химических соединений, мутагенное действие которых связано с активностью их метаболитов //Итоги науки техники. Общая генетика, ВИНИТИ, 1986. Т.9. С.197-201.

17. Танирбергенов Т.Е., Абшев С.К. Штаммы Salmonella typhimurîum, используемые при изучении мутагенов окружающей срсды //Цитология и генетика, 1989, №6. С.47-56.

18. Абшев CA'., Калинина Л.М., Шапиро АЛ. Перспективные методы обнаружения мутагенов// В кн. «Современные проблемы генетических последствий загрязнения окружающей среды и охраны генофонда», Алма-Ата, 1989. С.93-108.

19. Васильева C.B., Танирбергенов Т.Е., Абшев С.К. Сравнительный анализ мутагенной и SOS-индуцирующей активности у химических соединений 3-х классов //Генетика, 1989, Ks 10. С.1740-1746.

20. Глазер В.М., Котелеецев C.B., Степанова Л.И., Абшев С.К., Буееич Г.В., Бейм A.M. Оценка на мутагепность в тесте Эймса сточных вод и производствешщх потоков Байкальского целлюлозно-бумажного комбината. //Биол, науки, 1990,№1. С.10Ы09.

21. Абилев С.К., Абдразаков ММ. Изучение ДНК-повреждающей активности мутагенного производного ДДДТДП // Генетика, 1990, №9. С.1686-1689.

22. Абилев С.К., Абдразаков М.М. Изучение органоспецифичности ДНК-повреждающего действия методом щелочной элюции //В кн. «Методические и методологические вопросы генетики». Томск, 1990- С.103-106.

23. Дугам А.Ы., Журков B.C., Абилев С.К Критерии учета мутагенных эффектов в тесте Эймса//Цитология и генетика, 1990, №6. С.41-45.

24. Vasilieva S., Tamrbergenov Т., Abilev S., Migachev G., Huttune M.T. A comparative srudy of mutagenic and SOS inducing activity of bifenils, phenanthrenquinones and fluorenes//Mutation Res. 1990. V.244, P.321-329.

25. Абилев C.K., Абдразаков MM. Органосиецифичность ДНК-поврсждающего действия диоксидина//Генетика, 1991, №11. С.2039-2041.

26. Абилев С.К, Любимова И.К., Мигачев ГМ. Зависимость мутагенной активности гетероциклических аналогов пирена сгг их химической структуры // Генетика, 1992. № 8. С. 52-59.

27. Абилев С.К., Любимова И.К., Мигачев Г.И. Влияние структурных особенностей нитропроизводных флуоренона и бифенила на фреймшифт-мутагенез в тестерных штаммах Salmonella typhimurium // Генетика, 1993, №10. С 1640-1645

28. Баскин 11.И., Любимова И,К, Абилев С.К., Палюлин В.А., академик Зефиров Я.С. Исследование количественной связи между мутагенной активностью химических соединений и их структурой. Замещенные бифенилы // Доклады АН, 1993, Т. 332, № 5. С.587-589

29. Баскин И.И., Любимова И.К., Абшев С.К., Палюлин В.А., Зефиров Н.С. Количественная связь между мутагенной активностью гетероциклических аналогов пирена и фенантрена и их структурой // Доклады АН, 1994, Т.339 № 1.С. 106-108

30. Любимова И.К., Абилев С.К, Мигачев Г.И. Взаимосвязь между мутагенной активностью и химической структурой в ряду производных бифенила // Генетика, 1995, № 2. С. 268-272.

31. Любимова И.К, Абилев С.К., Мигачев Г.И Влияние некоторых структурных особенностей в молекулах производных пирена и его гетероциклических аналогов на мутагенную активность // Генетика, 1995. №1.С. 128-132.

32. Abilev S.K., Lyubimova IK., Baskin II., Halberstam N.M., Palyulirt V.A. Structure-Genotoxic Activity Relationships of Aromatic Hydrocarbons: Comparison of Results from Experimental Assay and Computerized Analysis// Karadeniz Journal of Medical Sciences, 1995. V.8. N 4.P. 227-228.

33. Абилев C.K., Любимова И.К. Метод QSAR и его роль в общей процедуре тестирования генотоксичности / В кн.: Мутагены и канцерогены в окружающей среде: Новые подходы к оценке риска для здоровья // СПб. 1998. С.117-126.

34. Тарасов В.Л., Асланыt М.М., Абшев С.К. Принципы формализованной количественной оценки генетической активности химических соединений для человека //Генетика, 1999, № 11. С, 1585-1599.

35. Любимова И.К, Абшев С.К, Гальберстам Н.М., Баскин И.И., Палюлин В.А., Зефиров Н.С. Компьютерное предсказание мутагенной активности замещенных полициклических соединений // Известия АН. Сер.биол., 2001, №2. С. 180-186.

36. Нифантьев Н.Э., Кашулин И.А., Багров В. В., Абшев С.К., Любимова И.К. Синтез и исследование мутагенной активности ди(индено[2,1-Ь]индолил)-, ди(индено[2,1-Ь]пирролил)мстанов и диметилсиланов //Известия АН. Сер. Химическая, 200] ,№5. С.1369-1375.

37. Тарасов В.А., Абшев С.К,. Велибеков P.M., Асланян М.М., Эффективность батарей тестов при оценке потенциальной мутагенной опасности химических соединений //Генетика, 2003, №.10. С.1406-1417.

38. Абшев С.К. Современное состояние использования краткосрочных тестов для выявления мутагенов и канцерогенов окружающей среды //В сб, «Современные проблемы биологии и медицины». Вып.2. Иркутск, 2003, С.45-47.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Химические соединения:

БЭ - бромид зтидия БФ • бифенил Фл - флуорен Ф -флуореноп ФХ - фенактренхянон П -пирен

ПАС - полициклкческие ароматические соединения ГАП - гетероциклический аналог пирена ГАФ - гетероциклический аналог фенантрева АцП - ацетилпирен АцАП • ацетилам инопирен 4-НХО - 4-нитрахинолин-1-оксид МШ1Г- И'-нитро-Н-нитрозогуавидин 4,4'-ДН-2'-КБФ - 4,4'-динитро-2'-карбоксибифенил 4,4'-ДН-2Д'-ДККФ • 4,4'-динитра-2,2'-дикарбоксибифснил 2-НФ-5-КК - 2-нитрофл>'оренон-5-карбоиовая к-та

2,7-ДНФ-5-КК - 2,7-дннигрофлуоренон-5-карбоновая к-та 2,7-ДНФ-5-КАд - 5-амид-2,7-дннитрофлуоренон карболовая к-та 2-НФ-5,7-ДКК - 2-нитрофлуоренон-5,7-дикарбоновая к-та 2,4-ДНФ-5,7-ДКК - 2,4-дишггрофлуоренон-5,7-дикарбоновая к-та ДЦП - 5,]0-диоксо-4,9-диокса1шрен

ДТДП - 5,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазапирен

ДДТДП - 4,9-диокеи-5,10-диоксо-4,5,9,10- тетрагидро-4,9-даазапирен

ДДДТДП - 2,7-диамико-4,9-диокси-5,10-диоксо4,5,9,1 0-тетрагндро-4,9-диазоп крен 2-НФХ - 2-нитрофенантренхинон

2,7-ДНФХ - 2,7-Д1ШИгрофенантренхинон 23,7-ТНФХ - 2,3,7-тринитрофенашрешшнон

Тесмистемы: Эймс - тест Эймса Salmons[Ымикросомы ГМ - тест но учёту генных мутаций in vitro XA - тест по учёту хромосомных аберраций in viiro Цит - тест по учёту цитогенетических нарушений in vivo

ДРЛ—тест по учёту рецессивных, сцепленных с полом, летальных :*утаций у дрозофилы ДЛТ - тест по учйту доминантных лета;гьных мутаций у грызунов

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия 1ЗДМа00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 15,12.2003 г. Формат 60x90 1/]б. Усл.печл, 3,0. Тираж 150 экз. Заказ 936. Тел. 939-3890, 939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891, 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова,

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Абилев, Серикбай Каримович

Введение.

Глава 1. Проблемы оценки потенциальной генетической опасности химических соединений для человека

1.1.История вопроса.

1.2. Особенности действия химических генотоксикантов.

1.2.2. Отдаленность последствий.

1.2.1. Необратимость мутаций.

1.2.3. Одноударность действия. Зависимость доза-эффект.

1.2.4 Статистический характер действия.

1.3.11еобходимость тестирования большого числа химических соединений.

1.4. Организация процедуры тестирования.

1.4.1 .Тест-системы и их классификация.

1.4.2. «Золотой стандарт» в генетической токсикологии.

1.4.3. Два основных направления в генетической токсикологии.

1.4.4. Априорный отбор химических соединений для тестирования.

1.4.5. Этапность тестирования.

1.5. Проблемы гармонизации тест-систем и процедур тестирования.

1.6.Прогностическая значимость результатов тестирования.

1.6.1 Проблема ложных позитивных и негативных результатов.

1.6.2. Чувствительность и специфичность тест-систем.

1.6.3. Негативный и позитивный отбор.

1.6.4. Прогностическая значимость тест-системы.

1.6.5. Батареи тестов.

1.7. Исследование связи между структурой и активностью.

1.8. Ранжирование химических соединений по степени генетической опасности для человека.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выявление и прогнозирование мутагенной активности химических соединений окружающей среды"

Среди комплекса проблем, связанных загрязнением окружающей среды, одной из актуальных и вместе с тем наименее разработанной является проблема оценки потенциальной генетической опасности химических соединений. Возникшие мутации могут привести к увеличению наследуемых генетических патологий и лежать в основе злокачественных новообразований и других соматических патологий, в частности, многочисленных заболеваний, связанных с нарушениями обмена веществ.

Сам факт, что химические соединения — загрязнители окружающей среды, также как и ионизирующая радиация, представляют реальную генетическую опасность для человека был осознан немногим более 30 лет тому назад вначале научным, а вслед за этим и всем обществом. В результате возникло повое направление в генетике - генетическая токсикология, основной задачей которой является создание методологии для классификации химических соединений по степени их потенциальной генетической опасности для человека, с целью осуществления различных регулирующих действий, направленных па предотвращение или уменьшение возможных генетических последствий воздействия химических соединений.

Вторая проблема генетической токсикологии связана с необходимостью постоянного тестирования большого числа химических соединений. В настоящее время число зарегистрированных в международном регистре (CAS - Chemical Abstract Service, http://www.cas.org') соединений составляет более 19 миллионов химических веществ. Это число увеличивается каждый день примерно на тысячу соединений. Понятно, что большая часть вновь синтезируемых соединений не попадает в среду в качестве реальных загрязнителей, однако, число «новых» загрязнителей среды также оказывается достаточно велико и составляет величину порядка 3500 в год, то есть примерно 10 соединений в день. Это обусловливает необходимость создания достаточно оперативной и экономичной системы тестирования химических соединений в отношении их потенциальной генетической опасности для человека.

Невозможность экспериментального исследования генетической активности химических соединений у человека обусловила создание и использование для этих целей различных тест систем. Поэтому результаты, получаемые при использовании тест-систем, представляют интерес не сами по себе, а лишь их прогностическая эффективность в отношении генетических последствий воздействия на человека исследуемых соединений.

За время существования генетической токсикологии созданы сотни тест-систем, однако немногие из них в результате длительных валидных исследований включены в национальные системы оценки потенциальной мутагенной или канцерогенной опасности химических соединений. Процесс валидизации теста, включающий в себя развитие протокола его использования, расширение баз данных, содержащих результаты использования теста для изучения мутагенной активности широкого спектра веществ, и оценку прогностической значимости этих результатов для разных классов химических соединений, был и остается одной из основных задач, стоящих перед генетической токсикологией.

На первом этапе развития генетической токсикологии основное внимание уделялось исследованиям краткосрочных и экономичных тест-систем in vitro, главным образом, бактериальных. В процессе развития генетической токсикологии было показано, что мутационный процесс, индуцированный химическими соединениями, в значительно большей степени, чем в случае ионизирующего излучения, зависит от особенностей метаболизма в клетках-мишенях и распределения соединения и их метаболитов по органам и тканям многоклеточного организма. Это определяет относительно низкую прогностическую эффективность тест-систем in vitro и обуславливает необходимость комплексного подхода при оценке потенциальной генетической опасности химических соединений. В результате возникает необходимость использования батарей тестов, а также наряду с биотестированием, применение внеэскпериментальпых методов, основанных на анализе связи между структурой и мутагенной активностью химических веществ. Все это в свою очередь определяет необходимость введения единого количественного критерия для оценки эффективности исследований потенциальной генетической опасности химических соединений и определения степени этой опасности по результатам тестирования для человека.

Цели и задачи работы. Цель работы состояла в разработке формализованной количественной системы оценки эффективности анализа мутагенной активности химических соединений, включая биотестирование и исследование связи между структурой и активностью, и достигаемого в ходе испытаний уровня доказанности генетической опасности.

Для достижения цели работы решались следующие задачи :

1.Проведение валидных исследований бактериальных тест-систем, направленных на увеличение их прогностической эффективности, включая усовершенствование протокола тестирования химических соединений на мутагенную активность и разработку критериев оценки полученных результатов.

2.Расширение базы данных по мутагенной активности лекарственных препаратов путем оценки их активности в тесте Эймса и исследование потенциальной мутагешюй опасности сложных смесей на примере промышленных стоков Байкальского целлюлозно-бумажного комбината.

3.Углубленные исследования особенностей мутагенного действия препаратов, широко используемых в медицине и в практике научно-исследовательских работ.

4. Обоснование и апробация, на примере шести широко используемых в практике биотсстирования методов, селективной информации в качестве количественной меры для оценки прогностической эффективности отдельных тестов и их сочетаний.

5.Разработка системы количественной оценки потенциальной мутагенной опасности химических соединений по результатам их биотест ирования.

6. Исследование связи между структурой и мутагенной активностью нитроароматических соединений с использованием экспериментальных и статистических методов анализа.

Научная пошипи. Открыты новые классы химических мутагенов: хиноксалиновые соединения, к которым относятся антибактериальные препараты диоксидин и хиноксалин, и диазапирены, к которым относятся ДДДТДП и его аналоги. Исследованы механизмы мутагенного и генотоксического действия диоксидина, ДДДТДП и бромида этидия. Установлено, что генетическая активность диоксидина зависит от парциального давления кислорода и проявляет органоснецифичсскую генотоксичность in vivo, вызывая повреждения ДНК в клетках легких мышей, ДДДТДП относится к бифункциональным агентам, а бромид эткдия активируется цитохромом Р-448.

В работе теоретически обоснован, разработан и применён количественный критерий, позволяющий проводить оценку эффективности не только отдельных тестов, но и их батарей, — как в среднем, так и для каждого получаемого в ходе тестирования результата в отдельности. В качестве этого критерия выступает селективная информация наличия (или отсутствия) мутагенных свойств у испытуемых соединений. Для построения шкалы потенциальной мутагенной опасности испытанных химических соединений использована специально введённая функция веса (уровня) доказанности, однозначно связанная со значениями полной информации, достигаемой при проведении биотестирования.

Установлены закономерности связи между мутагенной активностью в тесте Эймса и структурными особенностями нитроароматических соединения от бифенила до полицикличсских соединений - пиренов и его геюроциклических аналогов. Показано, что мутагенная активность этих соединений коррелирует с пара- положением иитрогрупп, и фрагменты структуры, способствующие планарной копформации молекулы, увеличивают ее мутагенность. Впервые показано, что увеличение числа атомов кислорода или внедрение его в молекулу в качестве гетероатома в ииреповые структуры приводит к росту мутагенных свойств соединения. Впервые на примере этих соединений для анализа связи между мутагенной активностью и химической структурой использована нейронная сеть и показано, что нейросстевые модели структура-активность обладают большей прогностической эффективностью, чем модели, основанные на м IЮ/кествсш юй регрессии.

Практическая значимость. Результаты валидных исследований теста Эймса и внесенные изменения в протокол его проведения легли в основу материалов, включенных в Методические указания по использованию бактериальных тест-систем для выявления мутагенной активности химических загрязнителей сред, разработанных по заданию Секции генетических аспектов проблемы «Человек и биосфера» МНТС при ГК СМ ССС по пауке и технике (1977, 1983, 1985 г.г.), а также в Методические рекомендации по проверке мутагенных свойств у новых лекарственных препаратов,утвержденных МЗ СССР (1985 г.)

Результаты первичной оценки расширили базу данных по мутагенной активности лекарственных препаратов. Результаты изучения мутагенной активности диоксидина вошли в материалы о генотоксичности этого препарата, на основании которых Фармакологический комитетет СССР принял решение ограничить применение диоксидина на детях.

Результаты, полученные при 6 летнем мониторинге мутагенной активности сточных вод Байкальского целлюлозно-бумажного комбината, легли в основу обоснования необходимости усиления контроля за технологическими процессами очистки сточных вод Байкальского ЦБК.

Разработанные системы количественной оценки эффективности тестирования и определения потенциальной мутагенной опасности позволяют оптимизировать процедуру тестирования и устранить субъективизм при ее организации и классификации химических соединений по степени потенциальной мутагенной опасности.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации представлялись на IV Всесоюзном съезде фармакологов (Ленинград, 1976), на IV собрании Ассоциации мутагенных обществ (Гернроде, ГДР, 1976), на III-съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. II.И. Вавилова (Ленинград, 1977), на XIV Международном генетическом конгрессе (Берлин, 1978), на заседаниях секции «Генетические аспекты проблемы «Человек и биосфера» госкомитета по науке и технике СССР (Москва, 1975, Киев, 1977, Алма-Ата, 1978, 1989, Караганда, 1990, Ашхабад, 1()82), на III конференции по теоретическим вопросам мутагенеза (Вильнюс, 1980), па Всесоюзной конференции «Актуальные проблемы оценки фармакологической активности химических соединений» (Ногинск, 1981), на Всесоюзном симпозиуме «Объем и методы генотоксической оценки и побочных эффектов биологически активных веществ» (Ленинград, 1989), на Всесоюзном симпозиуме «Микробиологоя охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия» (Челябинск, 1990), на межведомственном рабочем совещании «Мутагены и канцерогены в окружающей среде: Новые подходы к оценке риска для здоровья (Санкт-Петербург, 1997), на IV-съезде ВОГИС (Санкт-Петербург, 2001), на Международной конференции «Новые технологии в защите биоразнообразия в водных экосистемах» (Москва, 2002), на конференции «Химический мутагенез», посвященной 90-летию со дня рождения И.А.Рапопорта (Москва, 2002) и др.

Но теме диссертации опубликованы 38 статей, материалы диссертационной работы были использованы при составлений 7 Методических указаний и рекомендаций.

Глшш 1. Проблемы оценки потенциальной генетической опасности химических соединений для человека.

1.1.История вопроса.

Проблема генетической опасности для человека возникла уже на первых ■этапах развития генетики как экспериментальной науки. Еще в 20-ые годы XX века А.С. Серебровский (Серебровский,1929) высказывал опасения, что возникающие и накапливающиеся в генофонде человека мутации могут быть причиной различ1гых патологий и, в конечном счете, привести к вырождению человека как биологического вида. Проблема генетической опасности приобрела особую актуальность после открытия Г. Меллером (Muller, 1927) способности ионизирующего излучения индуцировать мутации. Развитие идей, сформулированных Г.Меллером (Muller, 1950; Morton et.al., 1956), в дальнейшем привело к определению понятий генетического груза, к представлениям о сегрегационной и мутационной компонентах этого груза и т.д. Однако задача количественной оценки генетического груза у человека, а тем более его мутационной компоненты, оказалась очень сложной, и эта проблема не решена и сегодня (Ниль, Шелл,1958; Фогель, Мотульски, 1990)

Факт установления возможности воздействовать на наследственность •экспериментально, показанный на примере ионизирующей радиации, стимулировал поиск такой способности у химических соединений. Этот поиск осуществлялся в 30-х - начале 40-х годов за рубежом (Oehlkers, 1943) и в СССР (Сахаров, 1933; Лобашев, Смирнов, 1934), и привел к открытию химического мутагенеза И.А.Рапопортом на примере этиленимина, этиленоксида, эпихлоргидрина и других алкилирующих агентов (Рапопорт,

1946) и Ш.Ауэрбах в случае иприта и его аналогов (Auerbach, Robson, 1944;

1947).

Процесс осознания угрозы генетическому здоровью человечества со стороны химических мутагенов - загрязнителей окружающей среды начался лишь в 60-х годах. В этом плане большую роль сыграли работы японских исследователей, обнаруживших мутагенную активность у нитрофурановых соединений, применявшихся в пищевой промышленности в качестве консервантов (Endo et.al., 1963), а также установление факта индукции хромосомных аберраций в клетках крови индивидуумов, подвергшихся воздействию иприта (Conen, Lansky, 1961) . В эти же годы было показано наличие мутагенной активности у ряда широко распространенных в окружающей среде химических соединений (Сагг, 1967; De Serres, Mailing, 1969; Mohamed et.al. 1966; Ramel, 1967; Voogt, VaderVet, 1969). Основную роль в становлении генетической токсикологии сыграли радиобиологи и генетики, в частности, А.Холендер, бывший в то время директором Биологического отдела Окриджской Национальной лаборатории США. В результате, в США в 1969 г., а затем в Европе были созданы общества мутагенов окружающей среды. Это можно считать моментом рождения генетической токсикологии как науки. К середине 70-х годов были получены многочисленные результаты изучения большого числа химических соединений, использующихся в промышленности, сельском хозяйстве, медицине и в быту. В 1977 году была создана Международная комиссия по защите от мутагенов и канцерогенов окружающей среды (ICPEMC-Inteniational Commission for the Protection against Environmental Mutagens and Carcinogens). Одной из главных задач ICPEMC была разработка рекомендаций, которые могли бы быть использованы в качестве основы для национальных законодательных и регулирующих проектов, направленных па минимизацию генетических последствий от мутагенов окружающей среды (Sobels, 1976). При поддержке 1СРЕМС в 80-х годах были опубликованы результаты углубленных исследований генотоксичности, включая эпидемиологические, дихлофоса (Ramel et.al.,1980), эпихлоргцдрина (Sram et.al., 1981), винилхлорида (Clemmesen,1982), лекарств от псориаза ( Bridges et.al., 1982) и изиониазида (Jansen et.al., 1980) и других широко распространенных в окружающей среде химических соединений.

В СССР исследования по генетической токсикологии развивались в рамках Секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера" Государственного Комитета по Науке и Технике, руководимой академиком И.П.Дубининым. В рамках работы Секции ежегодно проводились научные конференции, издавались различные сборники научных трудов по актуальным проблемам генетической токсикологии (Дубинин, 1975, 1977 1980,1982, 1989), разрабатывались Методические рекомендации по изучению генотоксических эффектов химических соединений (Фонштейн и др., 1977; Нашим, 1978). В 1992 г. уже в России было создано Мутагенное общество, объединяющее специалистов в этой области науки.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Абилев, Серикбай Каримович

ВЫВОДЫ

1. Исследование эффективности теста Эймса в зависимости от класса химических соединений позволило оптимизировать протокол его проведения и учета наблюдаемых мутагенных эффектов. Определены оптимальные концентрации S-9 и кофакторов, условия тестирования с и без метаболической активации, предложены мутагены для позитивного контроля и критерии регистрации значимого мутагенного эффекта.

2. Сравнительный анализ SOS-хромотеста, Rec-теета и теста Эймса показал отсутствие однозначной связи между ДНК- повреждающим и мутагенным действием химических соединений. Полученные результаты позволили сделать заключение о необходимости использования для первичной оценки потенциальной генетической активности химических соединений батарею из тестов на мутагенность и на ДНК-повреждающую активность.

3. С использованием теста Эймса впервые впервые была выявлена мутагенная активность антибактериальных средств диоксидина и хиноксидина и препаратов нибитон, ОГ-034 ДДДТДП, синтезированных в качестве перспективных лекарственных веществ. Обнаружена способность противоопухолевых средств фотрина, фопурина, проспидина, тифосфамида, циклофосфана, сарколизина и антибактериальных препаратов фурацилина, фуразолидона, фурадонина и солафура индуцировать генные мутации у микроорганизмов. В случае ДДДТДП показана его способность специфически индуцировать мутации типа сдвига рамки считывания, что в дальнейшем позволило рекомендовать его в качестве позитивного контроля в тесте Эймса.

4. При комплексном использовании микробиологических методов и методов анализа ДНК в клетках млекопитающих in vivo и in vitro показаны особенности мутагенного действия диоксидина, бромида этидия и ДДДТДП. Установлено, что мутагенный эффект диоксидина является RecA-зависимым и органоспецифическим. В случае бромида этидия показано, что его мутагенный эффект является результатом окисления цитохромом Р-448 и интеркаляции образовавшегося при этом метаболита в молекулу ДНК. Анализ кинетики восстановления повреждений ДНК, индуцированных ДДДТДП, свидетельствует в пользу того, что он относится к классу бифункциональных мутагенов.

5. Полученные при проведении 6-летнего мониторинга результаты позволили установить, что мутагенная активность сточных вод Байкальского ЦБК связана с хлорированием при отбелке целлюлозы. Полученные результаты позволили уточнить режимы химической и биологической очистки и разбавления, обеспечивающие снижение мутагенной активности сточных вод до уровня контрольной и обосновать необходимость включения теста на мутагенность в комплексную программу биомониторинга за эколого-токсикологическим состоянием различных производств

Байкальского ЦБК.

6. Проведенный экспериментальный анализ связи структура-активность для нитроароматических соединений позволил установить взаимосвязь между мутагенной активностью и пара-позицией нитрогруппы, планарностью копформации молекулы и электронодонорными или акцепторными свойствами других заместителей. Впервые обнаружено более сильное, чем у нитрогруппы, влияние карбоксильной группы в параположении на мутагенную активность производных флуоренона. Впервые установлено, что увеличение числа атомов кислорода или внедрение его в молекулу в качестве гетероатома в пиреновые структуры приводит к росту мутагенных свойств соединения.

7. При проведении исследования эффективности статистических линейно-регрессионных и нейросетевых моделей QSAR на примере 60 соединений бифенильного ряда показано, что последние обладают лучшей прогнозирующей способностью по сравнению линейно-регрессиоными моделями.

8. Показано, что включение в анализ дескрипторов, отобранных экспертным путем на основе их вероятного механизма участия в мутагенной активности, позволяет улучшить предсказательную способность математической модели, а также количественно определить их вклад в мутагенную активность в рамках рассматриваемой модели. Таким путем обнаружено, что энергия низшей незанятой орбитали Elumo и наличие нитрогруппы в пара-позиции вносят основной вклад в мутагенную активность исследованных соединений.

9. Показана целесообразность использования селективной информации в качестве количественной меры эффективности тестирования как для отдельных тестов, таки их батарей. Использование функции уровня (веса) доказанности, являющейся производной полной информации, позволяет оценивать генетическую опасность химических соединений по результатам их тестирования.

10. Созданная компьютерная база данных и специальные служебные программы позволили провести количественную оценку эффективности батарей для 6 наиболее использующихся в настоящее время тест-систем. Показана низкая эффективность тестов in vitro, как при применении отдельно, так и в составе батарей. Установлено, что эффективность тестирования связана не с увеличением числа тестов, входящих в батарею, а с включением тестов in vivo на видах, филогенетически близких к человеку.

При этом существенно большую эффективность по отношению к другим тестам показал тест по учету доминантных летальных мутаций у мышей.

11. На основе дискриминантного анализаа разработан метод, позволяющий оценивать потенциальную мутагенную опасность химических соединений с учетом числа использованных тестов и результатов их испытаний. Для выборки, включающей в себя 105 химических соединений, у которых известна мутагенная активность в половых клетках грызунов и результаты тестирования хотя бы в одном из 5 тестов (из 6 исследованных в работе) поведена количественная оценка уровня доказанности мутагенной опасности для млекопитающих

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе представлены результаты исследований, проводимых в течение 30 лет, начиная с 1973 года. Этот период времени фактически совпадает с моментом возникновения генетической токсикологии. Характер проблем и их значимость менялись в процессе развития генетической токсикологии и это не могло не отразиться на исследованиях, которые легли в основу данной работы.

На первом этапе эволюции генетической токсикологии наиболее актуальной задачей была апробация высокочувствительных краткосрочных тест-систем, главным образом, бактериальных. В этом плане в работе представлены результаты, связанные с развитием протокола теста Эймса и изучением возможностей его применения для первичной оценки мутагенной активности широкого круга химических соединений (на примере фармакологически активных соединений) и сложных смесей (на примере многолетних исследований мутагенной активности промышленных стоков Байкальского целлюлозно-бумажного комбината). Наряду с тестом Эймса, работа содержит результаты исследования SOS-хромотеста и Rec-теета, позволяющие регистрировать ДНК-повреждающее действие химических соединений, и определены области их применения.

Традиционные исследования механизма мутагенного действия химических соединений ограничивались небольшим числом агентов таких, как алкилирующие вещества, интеркапяторы, аналоги оснований и т.д. Программа оценки потенциальной генетической опасности химических соединений, введенных в биосферу, проводимая в основном с помощью бактериальных тест-систем, в первую очередь с помощью теста Эймса, существенно расширила перечень химических соединений, обладающих мутагенной активностью. Были обнаружены типы химических соединений, механизм мутагенного действия которых отличается от такового для «классических» мутагенов. В этом плане нами были обнаружены новые классы химических мутагенов: производные хиноксалина (диоксидин, хииоксидин) и гетероциклические аналоги пирена (ДДДТДП его производные). Углубленные исследования механизма действия этих мутагенов позволили обнаружить ряд ранее неизвестных особенностей мутационного процесса. На примере диоксидина была обнаружена зависимость генетического эффекта от парциального давления кислорода в тканях. В результате ДНК-повреждающее действие диоксидина наблюдалось в одном из наиболее важных органов - легких. В случае ДДДТДП показана способность ароматических соединений, состоящих из 4-х бензольных колец с гетероатомами в 2-х из них, индуцировать специфически мутации сдвига рамки считывания, так же как и акридины, состоящие из 3-х бензольных колец и являющиеся «классическими» фреймшифт-мутагенами. Обнаружение способности ДДДТДП индуцировать специфически мутации сдвига рамки считывания имело не только теоретическое, но и практическое значение, поскольку результаты исследований позволили рекомендовать и внедрить его в протокол теста Эймса в качестве мутагена для позитивного контроля.

Характеризуя первый этап развития генетической токсикологии в целом, следует отметить, что на этом этапе основная парадигма, сформулированная вначале 70-х годов и заключающаяся в этапности процесса тестирования, не подвергалась сомнению. Основные усилия исследователей были сосредоточены на создании новых тест-систем и процессы их валидизации. Однако к середине 80-х годов были получены результаты, которые поставили под сомнение правильность этой парадигмы (ICPEMC, 1983; Russel et.al., 1984). Впервые этот вопрос возник в отношении способности краткосрочных тестов прогнозировать канцерогенные эффекты химических соединений. Дальнейшие исследования показали низкую эффективность прогноза при использовании краткосрочных систем не только в случае оценки канцерогенности, и но в случае оценки мутагенной опасности химических соединений. При этом оказалось, что проблему низкой эффективности тестов невозможно решить путем простого увеличения числа тестов, входящих в батарею. Стало ясно, что при формировании батарей тестов существенную роль играет их статистическая зависимость между собой. В результате перед генетической токсикологией встал ряд новых проблем значимость которых ранее недооценивалась.

Наряду с созданием более эффективных тест-систем, способных регистрировать особенности метаболизма в клетках млекопитающих, в качестве одной из центральных возникла проблема количественной оценки эффективности тестирования при использовании батареи тестов и всей процедуры тестирования в целом. Это в свою очередь требует введения количественной меры (критерия), позволяющей проводить такого рода оценку как в среднем для всех возможных результатов, получаемых в ходе тестирования, так и для каждого результата в отдельности. Нами на примере шести наиболее часто и широко используемых тест-систем показано, что в качестве такой меры может быть использована селективная информация. При этом значение селективной информации, получаемое в ходе тестирования, позволяет не только оценивать эффективность тестов и их сочетаний (батарей), но и количественно определять уровень генетической опасности химических соединений по результатам их испытаний. Эффективность такого рода оценки зависит от степени развитости баз данных и от полноты представленных в них результатов тестирования.

Таким образом, проблема развития баз данных является еще одной проблемой, значимость которой возрастает, но которая не может быть решена в рамках одной лаборатории, а является задачей, стоящей перед международным сообществом.

Начало работ, связанных с использованием методологии QSAR для анализа потенциальной генетической опасности химических соединений следует отнести к началу 90-х годов. На первом этапе исследований такого рода наиболее актуальной проблемой, которая не решена и сегодня, является апробация различных математических моделей и набора характеристик молекулы (дескрипторов), обеспечивающих максимальную, по крайней мере приемлемую, прогностическую эффективность. В работе на примере нитроароматических соединений проведен анализ эффективности математических моделей зависимости структура-активность, основанных на множественной регрессии и нейронной сети, и показана большая эффективность последней. Сама проблема связи между структурой и потенциальной мутагенной и канцерогенной активностью химических соединений возникла и исследовалась на качественном экспериментальном уровне еще в 70-80-е годы прошлого столетия. Используя этот качественный, экспериментальный подход, в работе были проведены исследования зависимости мутагенной активности в тесте Эймса нитроароматических соединений с различными базовыми структурами (от производных бифенила до пирена и его гетероциклических аналогов) от их структурных особенностей и выявлены общие закономерности этой связи. Работы такого рода не потеряли значения и сегодня и, как показано в данной диссертации, наиболее эффективные результаты могут быть достигнуты при комплексном использовании качественного, экспериментального и статистического, количественного подходов к оценке связи между структурой и активностью.

Характеризуя развитие генетической токсикологии в целом, следует заключить, что проблема оценки потенциальной мутагенной и канцерогенной опасности химических соединений оказалась сложнее, чем представлялась на первом этапе. Эта сложность в основном связана с большей, чем это представлялась в момент зарождения генетической токсикологии, зависимостью процесса возникновения мутации от особенностей метаболизма химических соединений и их распределения по органам и тканям многоклеточного организма. В отличие от проникающей радиации мутагенез, индуцированный химическими соединениями in vivo, оказался зависимым от вида, ткани и пола млекопитающего, а в условиях in vitro - от тест-системы и различных условий проведения эксперимента.

Таким образом, проблема экстраполяции данных, полученных в суррогатных тест-системах, оказалась весьма сложной и зависимой от многих специфичных для каждой тест-системы факторов. В этих условиях представляется, что подход, связанный с развитием отдельных тестов и субьективно-экспертной оценкой их эффективности, на современном этапе развития генетической токсикологии не кажется перспективным. Решение проблемы создания эффективной технологии оценки потенциальной генетической опасности химических соединений связана не только, и скорее всего не столько с созданием новых тест-систем, сколько с формированием системы комплексного анализа, включающего в себя биотестирование и QSAR-анализ.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Абилев, Серикбай Каримович, Москва

1. Абилев С.К. Метаболическая активация мутагенов // М., ВИНИТИ. 1986. Общая генетика, Т.9. С.5-96.

2. Абилев С.К., Абдразаков М.М. Изучение ДНК-повреждающей активности мутагенного производного тетрагидродиазапирена ДДДТДП // Генетика. 1990. Т.26. N9. С. 1686-1684.

3. Абилев С.К., Фонштейн JI.M., Мигачев Г.И., АндриевскийА.М. О мутагенном действии производного тетрагидродиазапирена // Генетика. 1979. Т. 15. N5. С.807-811.

4. Абилев С.К., Любимова И.К. Метод QSAR и его роль в общей процедуре тестирования генотоксичности // В сб.: Мутагены и канцерогены в окружающей среде: Новые подходы к оценке риска для здоровья // Санкт-Петербург: НИИ Химии СПбГУ. 1998. С.117-126.

5. Абилев С.К., Любимова И.К., Мигачев Г.И. Зависимость мутагенной активности гетероциклических аналогов пирена от их химической структуры // Генетика. 1992. Т.28. № 8. С.52-59.

6. Абилев С.К., Порошенко Г.Г. Ускоренные методы прогнозирования мутагенных и бластомогенных свойств химических соединений //М., ВИНИТИ. 1986. Токсикология, Т. 14. С. 170.

7. Абилев С.К., Фонштейн Л.М., Дуган A.M. Статистическая обработка данных тестирования на мутагенность методом Эймса Salmonella/микросомы //Статистическая обработка данных тестирования на мутагенность (Методическое указание). Вильнюс. 1989. С.6-11.

8. Алтухов Ю.П. Генетические процессы а популяциях //М.: ИКЦ «Академкнига». 2003. 431 с.

9. Ажаев С.А. Цитогенетический эффект производных этиленимина в культуре лимфоцитов человека. Сообщение III. Анализ типов хромосомных аберраций // Генетика. 1974. №12. С.156-160.

10. Асланян М.М. Метод оценки рецессивных леталей и его место в системе биотестирования / В сб.: Мутагены и канцерогены в окружающей среде: Новые подходы к оценке риска для здоровья // Санкт-Петербург: НИИ Химии СПбГУ. 1998. С.131-137.

11. Асланян М.М., Ким А.И. Мутанты дрозофилы, чувствительные к ММС. Выделение и генетический анализ // Научные доклады высшей школы. Биол. науки. 1981. № 11. С.83-88.

12. Ауэрбах Ш. Проблемы мутагенеза // М.: Мир. 1978. 463 с.

13. Баскин И.И., Любимова И.К., Абилев С.К., Палюлин В.А., Зефиров Н.С. Исследование количественной связи между мутагенной активностью химических соединений и их структурой. Замещенные бифенилы // Докл. АН. 1993. Т.332. № 5. С.587-589.

14. Баскин И.И., Любимова И.К., Абилев С.К., Палюлин В.А., Зефиров Н.С. Количественная связь между мутагенной активностьюгетероциклических аналогов пирена и фенантрена и их структурой // Докл. АН. 1994. Т.339. № 1. С. 106-108.

15. Белицкий Г., Худолей В. Краткосрочные тесты в системе выявления канцерогенных для человека химических соединений //Вопросы онкологии. 1986. Т.32. N 4. С.3-11.

16. Бобринев Е.В., Облапенко Н.Г., Подольная М.А., Фонштейп Л.М. Анализ и планирование экспериментов с использованием теста Salmonella/микросомы//Генетика. 1983. Т. 19. №1. С. 1835-1840.

17. Боровиков В. STATISTICA: искусство анализа данных на компьютере. Для профессоналов // СПб.: Питер. 2001. 656 с.

18. Бочков Н.П., Чеботарев А.Н. Наследственность человека и мутагены внешней среды // М.: Медицина. 1989. 272 с.

19. Бочков Н.П., Шрам Р.Я., Кулешов Н.П., Журков B.C. Система оценки химических веществ на мутагенность: общие принципы, практические рекомендации и дальнейшие разработки // Генетика. 1975. Т.П. № 10. С.156-169.

20. Воробьева Л.И., Чердынцева Т.А., Абилев С.К. Антимутагенное действие культуральной жидкости бактерий на мутагенез у штаммов

21. Salmonella typhimurium, индуцированный 2-нитрофлуореном // Генетика. 1995. Т.31. №7. С.901-907.

22. Воробьева Л.И., Абилев С.К. Антимутагеппые свойства бактерий (Обзор). //Прикладная биохим. и микробиол. 2002. Т.38. N2. С. 115-127.

23. Глазер В.М., Котелевцев С.В., Степанова Л.И., Абилев С.К., Буевич Г.В., Бейм A.M., Оценка на мутагенность в тесте Эймса сточных вод и прозводственных потоков Байкальского целлюлозно-бумажного комбината//Биол. науки. 1990. N 1. С. 101-109.

24. Давиденко Т.Н., Романовская И.И., Бондаренко Г.И. Ферментативное восстановление нитросоединений //ВИНИТИ. 1990. Биол. химия. Т.34. С. 1-119.

25. Джеджелава Д.А, Егоров И.А., Тарасов В.А. Рекомбинантная плазмида для выявления мутагенов, индуцирующих SOS-функции в клетках Escherichia coli // Докл. АН СССР. 1998. Т. 298. С.473-476.

26. Джеджелава Д.А., Егоров И.А., Тарасов В.А. Индукция SOS-функций в клетках E.coli при действии различных типов химических мутагенов // Генетика. 1989. Т.20. № 9. С.1551-1558.

27. Дубинин Н.П. (Ред.) Генетические последствия загрязнения окружающей среды (материалы Секции), вып .1. М. 1975.

28. Дубинин Н.П. (Ред.) Генетические последствия загрязнения окружающей среды (материалы Секции), вып .2. М. 1977.

29. Дубинин Н.П. (Ред.) Генетические последствия загрязнения окружающей среды (материалы Секции), вып. 3. МЛ980.

30. Дубинин Н.П. (Ред.) Современные проблемы генетических последствий загрязнений окружающей среды и охраны генофонда (материалы Секции). Алма-Ата. «Наука». 1989. 192 с.

31. Дубинин Н.П. Проблемы радиационной генетики // М.: Атомиздат. 1961.39