Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКА-ИНГИБИТОРА СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ ИЗ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКА-ИНГИБИТОРА СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ ИЗ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ"

сЯ-^збО

АКАДШЯ НАУК СССР • ОРДЕНА ЛЕНИНА ' ИНСТИТУТ БИОХИМИИ Вн1А. Н.БАХА -

На правах рукописи

-"■ Л.

с.-.

, ■ ; 11 АЛОВА Вкатержаа 1>зоваа

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БЫКА-ИНГИБИТОРА • СЕРИВОВЫХ ПРОТБИНАЗ ИЗ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ

\ (Биологичвсвая химия - 03.00.04) V

'/■-'.^л' Автореферат . ■ диссертации на соискание ученой степени. : кандидате биологических науж

Иосква - 1976 , ^ ) ■

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ик. А.Н.БАХА

На правах рукописи

ШЛОВА. Екатерина Львовна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКА-ИНГИБИТОРА СЕРИЮ ВЫХ ПРОТЕИНАЭ ИЗ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ

(Биологическая химия - 03.00.04)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москве - 1976

. Работа выполнена в лаборатории Садка и пуклеиновыг кислот Ордена Ленина Института биохимии имени А.Н.Баха АН СССР.

Научный руководитель - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Мосолов В.В.

Официальные оппоненты;

профессор, доктор биологических наук Черников и.П.

кандидат биологических наук, старший научные

сотрудник Петрова И.С.

На официальный отзыв работа направлена в не«факульте теку в лабораторию биоорганической химии Московского Государственного университета имени II.В.Ломоносова.

Автореферат разослан " 1376 г.

Защита состоится " " -сс+Оїсе.- 1976 г. на заседании ученого Совета Ордена Ленина Института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР (Москва, Ленинский проспект, 33).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического отделения АН СССР (Москва, Ленинский пр.,33).

Ученый секретарь кандидат биологических наук

(Н.Н. Дьячков)

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Белки-ингибитора составляют особую группу белковых веществ, общим свойство» которых является способность образовывать с ферментачи высокоассоциировацные комплексы, устойчивые при физиологических значениях £Н> В составе этих комплексов ферменты полностью лишены каталитической активности. Широкое распространение белков-ингибиторов в природе и,в особенности,обнаружение в последние годы ингибиторов ферментов различных классов С Walsh et аХ.,I97I;Sllano at al., 1973; HesaelUaoh, Hakada ,1975; Wong et al,,19755Brandt et al.,1975) позволяют высказать предположение, что торможение активности ферментов с помощью специальных белков является одбим из общих механизмов регуляции ферментативной активности. Поскольку процессы протеолиза играют важную роль в качестве регуляторов ферментативной активности в клетке ( tunuma «t al.,I975!Holzer , 1975), ингибиторам протеиназ может принадлежать особая роль в регуляции обмена веществ.

Актуальность проблемы. Исследование природных ингибиторов протеиназ важно для понимания путей н механизмов регуляции ферментативной активности в живых организмах. Кроме того, исследование системы фермент-ингибитор открывает широкие возможности для изучения механизма высокоспецифич-ннх белок-белковых взаимодействий, а также структуры активных центров протеиназ и механизма их действия.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось выделение индивидуального белка-ингибитора протео-литических ферментов на доступного источника и детальная его характеристика. Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

- получить ингибитор из клубней картофеля в гомогенном состоянии.

- изучить его химический состав,

- исследовать физико-химическиё свойства ингибитора и его комплексов о некоторыми сериновыми протеинаааыи,

- выявить спактр действия ингибитора,

- вьшснить некоторые детали механизма взаимодействия ингибитора с формантами. ,

Научная новизна, в представленной работе описано выделение из клубней картофеля нового, ранее не описанного, терностабильного белка - высокоэффективного ингибитора Сериковых протеиназ. Особенностью выделенного ингибитора является его способность подавлять активность большого числа оериновых протеиназ различного происхождения. Исследованы аминокислотный состав болка, концевые группы, число дисуль-фидных связой. Изучены некоторые физико-химические свойства ингибитора - молекулярный вес, радиус Стокса, коэффициент диссимметрии, изоэлектрическая точка, способность его молекулы к диссоциации и др. Исследованы некоторые свойства комплексов, образуемых ингибитором с трипсином, хинотрипсином и субтилизином. Получены данные, позволяющие сделать вывод о наличии в молекуле ингибитора двух независимых центров связывания для трипсина и химотрипсина.

Практическая ценность. Ингибиторы протеиназ широко используются в клинической практике при различного рода заболеваниях: панкреатитах, шоке, эмфиземе, а также в хирургии. Б последнее время белки-ингибиторы исследуются, как возможные регуляторы процесса оплодотворения у млекопитающих, и как факторы, избирательно тормозящие роот злокачественных опухолей. Иммобилизованные ингибиторы белковой природы с успехом используются в качестве высокоспецифических сорбентов при очистке протеолитических ферментов из различных источников методом афинвой хроматографии.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на конференции молодых ученых Института биохимии им. А.К.Баха АН СССР (Москва, 1971 г.). Всесоюзном симпозиуме по химии протеолитических ферментов (Бильнюо. 1973 г.), Ш Всесоюзном биохимическом съезде (Рига, 1374 г.), I Конференции ФЕБО (Париж, 1975 г.). В конкурсе на лучшую научцую работу Института бйохимии им. А.Н.Баха АН СССР в 1975 г. работе присуждена вторая премия.

Публикации. По материалам диссертации' опубликовано в работ. *

Объем работы. Диссертация-состоит из введения, обзора литературы, 5 глав экспериквитальной части,*заключения, выводов и списка цитируемой литература (127 наименований). В литературной обзоре рассмотрены имеющиеся данные о распространении и биологических функциях природных ингибиторов протеолитических ферментов, особенностях их химического состава и физико-химических свойств; специальные разделы посвящены механизму действия ингибиторов и строении их реактивных центров, причем основное вникание уделено ингибиторам растительного происхождения. РабСта изложена ка страницах текста, иллюстрирована 28 рисунками, 1 схемой и 17 таблицами.

ПОЛУЧЕШШЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

л

Выделение и очистка ингибитора из клубней картофеля

Клубни картофеля характеризуются высоким" содержанием ингибиторов лротеинеэ. Из литературы известно; чт& до 10% -водорастворимых белков приходится на долю ингибиторов трипсина и хныотрипсина (Ryan , 1ЭТЭ). Так как ингибиторы про-теиназ из растений обычно устойчивы к различным денатурирующим воздействиям и отличаются высокой терио- и кислото-стабильностью, первоначальная стадия очистки включала отделение термолабильных белков. Получение препарата термостабильных белков изображено не схеме 1.

Препарат тормостабильних белков подвергали изоэлектри-чеекому фокусированию на аналитической колонке типа ькв 8100-1 в широкой (рН 3-10) градиенте рН. Результата фокусирования показали, что в препарате присутствуют 8 белков с иэоэлектряческиыи точками 3,6; 3,9; 4,1; 5Д; 5,8; 6,6; 7,2 и 10,0 (рис.1). Определение ингкбиторкой активности во фракциях позволило установить, что все восемь белков угнетают протеолитическую активность ¿-химотрипсина и трипсина. Сильным ингкбируюЕшм действием ка Х-химотрнпсив и трипсин характеризуются белки о изоэлектрическнми точками 7,2 и 10,0. Белки о изоэлактрячвскипи точками 5,1; 5,8 и б,б били

з-а сио

Схема 1

ВЫДЕЛЕНИЕ ТЕР ЫО СТАБИЛЬНОГО БЕЛКА-ИНГИБИТОРА : ПРОТЕИНАЗ о рХ 7,3

Клубни картофеля

I *

наывльчевив, экстракция каС1 в О Дн- НС1

осаждение белков оульфатоы амиония 0,8 насыщения

фильтрование

і V

фильтрат осадок

I

растворение в воде

нагревание при 80°5 минут

I- ■ ■ ■ | фильтрование

ооадок раствор

I

диализ, лиофилизация (препарат теркостаОилвншс белков, удельная активность 0,7 *ти/иг )

иэоэлектричаское фокусирование в зоне рН 6-8

. г,«...,.

рН 6-6 1

отделение акфолинов и оаха-роэы на оефадексе о -50, лвофилиаация (очищенный ингибитор р1 7,3, удельная активность 1,9 1яи/ мг )

Рио.1. Изоэлектричоскоа фокусирование тариостайильаых белков картофеля в градиенте рН 3-10. 1 - рН; 2 - оптическая плотность при 280 ни; 3 - ингибирование протео-литической активности .«¿-хииотрипвина (%); 4 - ингибирование про та оли тич е ской активности трипсина ($).

более активны по отношению к /-хииотрицсину, чей к трипсину. Балки с иэоэлактрическини точнейи 3,6; 3,9 и 4,1, напротив, сильнее ингибировали протеолитическую активность трипсина.

Бели протеолитическую активность ¿-хшіотрипсика и трипсина подавляли различные белки, то на эстеразную активность этих ферментов значительное ингибирующее действье оказывал только компонент о рі 7,2. Другие белковые фракции обнаружили лишь слабое ингибирование эстаразной активности «С -хинотрипсина, а па эстэразную активность трипсина практически не оказывали влияния.

При фокусировании те рііо о та б ильных белков в узком градиенте рН 5-8 в течение достаточно продолжительного времени

їмосто одногр компонента с изоэлекгрическоИ точкой 7,2 выявляются -'2 Солковие фракций с изоэлектричоскиии точками 7,1 и 7,Зі, Белок с.р! 7,1 лишен янгибиторной активности по отноме-ни» к трипсину;:тогда как белок с рХ 7,3 характеризуется высокой,антитрипткческой и антикииотриптической активностью.

. Ввяад.наибольшой антитриптической и акткхимотриптича-ской активности белка о рі 7,3 он явился предметом дальнейшего изучения.^

Первым этапом работы явилось изыскание наиболее эффективного, пути выделения гомогенного препарата ингибитора. Проведенные исследования показали, что наибольшая степень .очистки Салка-ингибитора о рі 7,3 мояет быть достигнута с поморью препаративного иэоэлентричвского фокусирования. Основные этапы очистки представлены на схеме 1.

..1-г'препарата териостабильных белков вносили в колонку для нзоздектрического фокусирования типа IX» 8100-2 объемом Л40 мл; Фокусирование проводили в градиенте плотности сахарозы от о до 40$. Градиент р£{ 6-8 создавали с помощью амфолинов марки ІКВ 8154 {конечная концентрация 1,1%). А но Л ним раствором служил 1$-ныИ раствор серной кислоты в 40^-ной сахарозе, катодный раствор - 1£-ный раствор Наов. Разделение проводили при 2° при напряжении 800 в и силе тока 3,8 .мА", Продолжительность опыта 72 часа. После завершения процесса фокусирования собирали фракции объемом 3,3 мл и в*них измеряли £¿30 и Р"* фРакЦии 0 РЙ около 7,3 (отмечены на рис.2А горизонтальной чертой) объединяли и повторно фокусировали в тех же условиях без предварительного отделения Сахарозы и аифолинов (рис.2Б).

Фракций Ж* 45-50 (рис.2£) освобождали от амфолинов и сахарозына колонке о сефадексом с -50, размером 2,4x50 см, -уравновешенной водой. Фракции, содержащие бедок, объединяли и'лиофильно высушивали. Выход сухого белка около 20 иг ив 1 грамма исходною препарата»

Чистоту виделенного белка проверяли с помощью изоэлект-рического фокусирования в аналитической колонке. Балон при атом фокусировался в виде четкого пика в узкой зоне о рН 7,3 (рис.3). Таким образом, применив двукратное изоэлектри-ческое фокусировавие в градиенте рН 6-8, удалось получить

в

рН

франции

Рис,2. А - Электрофокусировавие тармостабшшшх белков из клубней картофеля в зоне рН 6-8. Б - Рефокусирование фракции, отмеченных на рис.2А горизонтальной чертой.

-- Е280'-----РН

гомогенный препарат ингибитора с р1 7,3, свободный от принеси посторонних белков.

Гомогенность ингибитора следует из результатов гель-хроматографии. диск-электрофореза и ультрацвнтрифугирова-ния и, кроме того, подтверждается анализом концевых групп в белке. В ?,5#-ном полиакриламидном геле (ПАГ) при рН 8.9 и в 1Э5Е-ноы паг при рН 4,3 белок двигается в виде одной полосы, имепасей подвижность 0,07 и 0,26 соответственно. Белок 0Р* 7,8 «ает одну полосу и в случае диск-электрофореза в 10%-нои и 15£-ном Наг в присутствии додецилсульфата натрия и ^-иеркаптозтанола.

3-2010

в

_1_J-ü

to га JO

ft&*rep фракции

Рис.3. Аналитическое электрофокусирование очи ценного балка-ингибитора

1 " Е2ВО' 2 ~ Ря

ХииическиИ состав ингибитора о р! 7.3

Б таблице 1 приведен аминокислотный cocías белна-инги-битора. Минимальный молекулярный вео, вычисленный на основании данных аминокислотного состьва, равен 13 533, Заслуживает внимания, прежде всего, наличие 14 остатков полуци-стина в молекуле ингибитора, что составляет 115& от общего числа аиинокислотних остатков. Кроме того, следует отметить относительно высокое содержание остатков пролила, глицина, аспарагиновой и глутаминовой кислот, лизина, в то же время в белке присутствует только один остаток мвтконина и лишь оледовыв количества триптофана. Отсутствие триптофана и низкое содержание ыетионина типично для многих ингибиторов протепназ растительного происхождения. Наличие относительно большого числа остатков пролина также является характерный для многих белков-ингибиторов и может быть связано с особенностями конфориацкк, делающими их устойчивыми к действие ПрОТеОЛИТИЧвСКИХ ферментов С Laakowakl Jr., Ssaloolr ,1971 ) Белок характеризуется высоким содержанием аминокислотных

Таблица 1

Аминокислотный состав балка с pl 7,3

Аминокислота Число остатков на молекулу Аминокислота Число остатков на молекулу Аминокислота Число остатков на молекулу

Авр 10,80 (И) ТЬг 9,10 (9) ser 8,82 (Û) Glu 11,23 (11) віу 16,01 (16) Pro 7,38 (7) Ain 5,86 (6) Таї <(,07 (4) Met 0,71 (1) Ile 6,23 (6) Туг ?,Э8 <8f Le« 5,58 (6) гы» 2.69 (3) 9,41 (9) Hls 2,00 (2) Arg 4.14 (4) Тгр 0.23 (0) Суа 14.10 (14)

Общее число остатков 126 Молекулярный вес 13 533

остатков, боковые цепи которых способны принимать участие в образовании водородных связей: остатки аргинина, полуцисти-на, гиствдкна. метионина, серина, треонина и тирозина вместе составляет 37,3& от общего числа аминокислотных остатков. Средняя гидрофобность С ЯФ белка, рассчитанная из данных по аминокислотному составу, равна 1017 кал/остаток, что лежит в пределах значений, рассчитзнных для других глобулярных белков, атот результат согласуется с представлзнием о том, что ингибитор с pi 7,3 является компактным глобулярным белком,и что гидрофобные взаимодействия совместно с водородными связями могут вносить определяющий вклад в формирование его третичной отруктуры,

Наличие 14 остатков полуцистина в белке позволяет предположить (по аналогии с другими ингибиторами растительного происхождения) присутствие значительного числа дисульфудных связей. Для оценки количества дисульфндных связей проводили определение содержания сульфгидрильных групп методом Эллма-на ( Eiiraan, 1359) в нэтивном бедке и в белке после восстановления -S-S- связей _)3-иеркаптоэтанолои. Результаты анализа показали, что натмвный белок не содержит свободных тио-ловых групп, а после восстановления обнаруживаются 14- SH-

групп. Эти данные позволяют сделать заключение, что всего молекула белка с иолекулярньш во сои 13 533 содержит 7 дисульфид них мостиков. В нейтральной среде легко происходит спонтанное роокисление восстановленных -з-з- связей. Высокое содержание д«сульфидных связей является, очевидно, одной из причин высокой устойчивости ингибитора к тепловой денатурации и расщеплению протеолитическики ферментами.

Единственной КН^-концевой акикокислогоЯ ингибитора при определении дансилькыы ыетодои является ивтиоиин. Вторая аминокислота, освобождающаяся после проведения реакции деградации по Эдману, была идентифицирована дансилышм методом как тирозин. Таким образом, последовательность Меі--Тут ~ занимает н^-концевое положение в белке.

Для определения ОООН-концевой аминокислоты нативный белок подвергали действии карбоксипоптидазы А. Единственной аминокислотой, освобождающейся в значительных количествах, был серии.

Подавляющее большинство раститедышх ингибиторов про-теиназ представляют собой простые белки и но содержат каких -либо простотичесних групп. Это отличает их от ингибиторов животного происхождения, многие из которых содержат прочно связанную углеводную компоненту. Определение углеводов в белке с рі 7,3 о реактивом фенол-серная кислота показало, что их содержание не превышает в пересчете на глюкозу. Этот факт позволяет считать, что ингибитор из картофеля с рі 7,3,подобно другим ингибиторам из растений, не является гликопротеидом.

Наличие углеводной компоненты в ингибиторах, вероятно, определяет большую компактность их молекул и обусловливает устойчивость к денатурируюдим воздействиям, В большинстве раотителышх ингибиторов структурная жесткость обеспечивается, по-видимому, значительным числом дисульфидных мостиков.

Физико-химические свойства ингибитора с р! 7,3

Выше ужо отмечалась высокая термостабильность ингибитора, нагревание которого до 80° в течение 5 минут не приводит к снижению активности. Не вызывает потери штгибитор-

ной активности и выдерживание белка с р1 7,3 при рН^1,0 в течение нескольких часов.

В таблице 2 приведены некоторые физико-химические свойства выделенного ингибитора. Радиус Стокса (молекулярный радиус) белка, определенный по методу Эккерса (Аокегв, 1970), составляет 24,0 А. Коэффициент диссимметрии (фрикционное отношение), характеризующий степень отклонения молекулы от шарообразной формы, в случае ингибитора с р! 7,3 равен 1,14, что свидетельствует о высокой компактности его молекулы.

При исследовании в ультрацентрифуге при скорости вращения ротора 60 ООО об/мин белок с р1 7,3 ведет себя как гомогенное вещество с коэффициентом седиментации z^Bs . Среднее значение молекулярного веса ингибитора о р! 7,3, найден-

Табдица 2

Физико-химические свойства белка-ингибитора с рХ 7,Э

Молекулярный вес (II)

м II

ч п

Коэффициент седиментации (в20 Радиус Стокса (н ) Фрикционное отношение < ГЛ0 )

Парциальный удельный объем (? ) Йзоэлектрическая точка .(р1)

Ноляргчй коэМицнонт экстинкции (£ )

Гель-хроматография Седиментационное равновесие Электрофорез в ЛАГ в присутствии ВБЗ Скоростное ультрацентрифугирование Гель-хроматография г/£0- н/( 2м_£ х/з

Аминокислотный состав

Изоэлектричасксе фокусирование

31 500

32 500

15 ООО

2,8з 24,0 А

1,14

0,71 мл/г

7.3

24 ООО !

вое из опытов по седиментационному равновесию, составляет (32,5 + 0,9)«103. Эта величина хорошо согласуется со значением молекулярного веса, определенный методом гель-хроматографии (31 500). В то же время значение молекулярного веса, полученное с помощью метода электрофореза в ПЛГ в присутствии додецилсульфзта натрия (sds ) и fi -ыеркэлтоэтзно-ла,равно 15 ООО, Вопрос о том, состоит ли молекула ингибитора с молекулярным весом 32 ООО из двух полипентидных целей о одинаковым молекулярным весом ^ 15 ООО, имеющих одинаковые концевые группы, или она представляет собой диыер, недостаточно ясен. В пользу последнего предположения говорит тот факт, что диссоциация молекулы на две цепи с молекулярным весом 15 ООО происходят также, по всей вероятности, и под влиянием одного зпз и в отсутствии р -ыеркаптоэтано-ла. Кроме того, ассоциация молекул была показана гскже для некоторых других ингибиторов протеиказ растительного происхождения ( Millar et al,,1969} Melville,Нули,1972 ).

Ингибитор с pi 7,3 имеет типичный для белков ультрафиолетовый спектр поглощения с максимумом при 278 ни и минимумом при 255 им. Оптическая плотность 1^-ного раствора белка при 280 им равна 7,52. Исходя из этого значе-

ния, молярный коэффициент экстишсции ингибитора (£ ) с молекулярным весок 32 500 соответствует значению 24 400. Невысокое значение молярного коэффициента экстшгкции согласуется с низким содержанием ароматических аминокислот ъ белке.

Взаимодействие ингибитора с различными ферментами

1. Специфичность ингибитора по отношению к сери-новым протеинаэаы

Выше уже отмечалось, что термостабильный белок с pi 7,3 - эффективный ингибитор трипсина и Х-химотрипсина. В связи с этим изучение специфичности ингибитора с р! 7,3 было начато с более детального исследования его действия на фермента, относящиеся к классу сарыиомых протаинаэ. Исследовалось действие ингибитора на трипсин, химот pit псин, суб-

тилизин, протеинази комплекса проназы, протеолитическив ферменты крови и некоторые другие.

Ингибиторную активность белка с р! 7,3 исследовали, инкубируя постоянные количества фермента с возрастающий« количествами ингибитора при рН 7,6-8,0 и комнатной температурой в течение 5 минут. Затем в инкубационных смесях определяли остаточную ферментативную активность.

Как показали полученные результаты, ингибитор с р1 7,3 подавляет не только протеолитическую и эствразную, но и аиидазную активность трипсина {рис.Угнетение зстераз-ной активности Л- и -форм химотрилсини представлено яа рис.5.

А'А

«о

60 40 20

0,2 <Цк 46 ч» <0нг

Ось абсцисс: мг ингибитора на 1 мг активного

Рис.влияние ингибитора на ферментативную активность (А) трипсина.

трипсина. Субстрат п-нит-роанилид бенэоил- ьь-ар-гинина (БАПНА).

Рис.5. Влияние ингибитора на ферментативную активность (А) <Г"-(1) и Л -хи-мотрипсияа (2). Ось аб-

сциоо; мг ингибитора аа 1 мг активного фермента,

Субстрат - этиловый эфир ацетил-х, -тирозина (АТЭЭ).

Действие ингибитора сильнее проявляется & отновеяии (Г-хицотрипсина. Очевидно, величие дополнительной гидродизо-ванной пептидной связи в иолекуле X-хииотрипсина приводит к обравованип более развернутой конфорцацим, менее благоприятной для связывания природных ингибиторов.

Действие белка с р1 7,3 на протеияазы микробного про-яохождояия представлено ва рис,6.

А, v,

4

Гис.6. Влияние ингибитора на ферментативную активность (А) субталиэина (а) и проказы (б): 1-БАЭЭ-азная и г-ХТЭЭ-азная активности проназы. Ось абсцисс: иг ингибитора на 1 иг активного фермеига (а) и мг ингибитора на 1 мг препарата (б).

Ингибитор подавляет активность как субгидизкна, так и протеиназ комплекса проназы, гидролизующих этиловый эфир беазоил-і,-аргинина (БАЭЗ) и А7ЭЭ, так называемых щелочных протеиназ а,ъ и о. Кроме того, ингибитор с рі 7,3 способен угнетать активность протеиназ ряде других микроорганизмов, таких как Аоі.ї-ітовив, Аог.хг&йіав, А.ар.огував . Способность ингибитора подавлять активность серкновых протеиназ микроорганизмов позволяет высказать предположение, что он может быть часть» защитного механизма, предохраняющего клубни картофеля от поражения фитолатогеаныки бактериями и грибами.

Константы диссоциации комплексов фермент-ингибитор

їв'

(константы ингнбирования, к1 ), характеризующие устойчивость соединений мншбитора о ферментами ^рассчитывали на основании величин остаточной фарыентативной активности в точке эквивалентности по методу Грина (0гвеп,»ог1с,195Э). Подученные значения представлены в таблице 3.

Таблица 3

Константы диссоциации комплексов ингибитора с ферментами

Фермент Субстрат рН х108(М)

Трипсин БАПНА 7,8 0,02

Трипсин БАЭЭ 8,0 81

<Г-хиыотрипсин К$ША* 7,8 0,17

¿'-химогркпсим АТЭЭ 8,0 3,2

Субтили энн АТЭЭ 8,0 3,9

* н-З-кпрбоксипропионид- L-фенилаланин-р-нитро-анилид.

Как видно, значения констант икгибирования сильно зависят от природи использованного субстрата. Этот факт согласуется о конкурентны« характером ккгибированин.

Из числа исследованных сериновых протеинаэ плазмы крови белок о pl 7,3 ингибировал плаэиин, но не действовал на тромбин и калликреин.

Полученные данные позволяет сдала» вывод« что ингибитор из клубней картофеля является весьма аффективным ингибитором большой группы серкшовьгс протейная. По яироте спектра действия описанный ингибитор превосходит все известные ингибиторы кротеинаэ растительного проиохохдения.

На основании весовых отношений ингибитора и фермента при 100%-кои подавлении ферментативной активности были рао-считаны эквивалентные молекулярные веса ингибитора (таблица 4). Близкое совпадение молекулярных весов« рассчитанных из реакция кягиСирсваиия трех различных ферментов, поэво-

Таблица 4 Молекулярные веса белка с pl 7,3

Способ определения м

Гель-хроматография 31 ООО

Электрофорез В ПАТ- 14 500 + 300

аминокислотный состав 13 533

Реакции:

о трипсином 14 400

с ¿'-химотрипсином 13 500

С Л-химотрипсином 14 500

с субтилизиноы 1 13 700

ляат сделать вывод, что ингибиторная активность по отношении к каждому из ферментов принадлежит одной белковой иоле куле. Это является важным критерием, подтверждающим функциональную гомогенность белка с pl 7.3. Совпадение молекулярных весов ингибитора, рассчитанных из реакции с ферментами, с молекулярный весом, определенным с помощью электро фореза в sds , позволяет высказать предположение, что обе полипептидные цепи, входящие в состав его молекулы, обладают одинаковой ингибиторной активностью и каждая из них может инактивировать 1 молекулу трипсина, химотрипсила или субтихизинз.

Все природные ингибиторы протеиназ могут быть разделе ны на "одновалентные", содержащие реактивный центр,отзатст венный за связывание ряда ферментов, и "поливалентные", имеющие различные реактивные центры, ответстяенные за связывание различных ферментов. Для того, чтобы охарактеризовать л этом отношении ингибитор с рХ 7,3,была исследована способность комплекса ингибитора с химотрипсииом подавлять активность трипсина, а также способность комплекса ингибитора с трипсином подавлять активность химотрипсина. Гезуль таты этих экспериментов показали, что ингибитор, связанный в комплексе с химотрипсином, почти так же аффективно подав

ляет активность трипсина, как и свободный ингибитор. Аналогичные результаты были получены в случае комплекса ингибитора с трипсином.

Таким образом, на каждую из полипептидных цепей ингибитора с молекулярным весом "15 ООО приходится по крайней мере 2 независимых реактивных центра. Один из них ответственен за взаимодействие с трипсином, а второй - за связывание хииотрипсина,

2. Физико-химические свойства комплексов ингибитора с трипсином,химотрипсином и субтилиэином

Так как молекула ингибитора с р1 7,3 состоит из двух полипептидных цепей (по всей вероятности соединенных нековал ент ними связями), а каждая полипептидная цепь содержит два независимых реактивных центра, возможны два различных варианта взаимодействия ингибитора с ферментами: (I) -образование комплекса фермент-ингибитор сопровождается распадом молекулы ингибитора на отдельные цепа (это возможно, если полипептилные цепи удерживаются вместе нековалентными связями), каждая иэ них ассоциирует с одной молекулой фермента; (2) - распада на отдельные полипептидные цепи не происходит, и к молекуле ингибитора присоединяются одновременно две молекулы фермента.

С цель» характеристики комплексов ингибитора о трипсином, ¿Г-химотрипсином и оубтилиаином проводилось определение их молекулярных весов к радиусов Стокса с поиоцью метода гель-хроматографии (таблииа 5). Коэффициент диссимметрш расочитывали на основании величин радиусов Стокса, молекулярных весов и удельного парциального объема, найденного как среднее арифметическое удельных парциальных объемов свободных ферментов и ингибитора, и равного в каждом случае 0,72 мл/г.

При исследовании в ультрацентрифуге при скорости вра-цения ротора 60 ООО об/мин. комплексы ингибитора о трипсином, 5"-хииотрипсином и оубтилиаином ведут себя как одно-комлоневтныв системы. Коэффициенты седиментации комплексов приведены в таблице 5.

Таблица 5

Сравнительная физико-химическая характеристика ингибитора с pi 7,3 и его комплексов с протеиназаии

Соединение s20,w U R f/fo

Ингибитор Ингибитор-трипсин Ингибитор-хиыотрипсин Ингибитор-суСтилиЭНН 2,8s 3,9s 4,3s 4.2s 31 500 53 ООО 6 4 500 61 ООО 0 24,0 A, 29,5 A 32,5 î 31,5 A 1.14 1.19 1,23 1,22

Как видно из таблицы 5,комплексы ингибитора с трипои-пои, химотрипсином и субтплизином представляют собоЯ компактные глобулярные структуры,характеризующиеся малой степенью асимметрии.

Результаты определения молекулярных весов комплексов, а также значения коэффициентов седиментации показывают, что взаимодействие ингибитора о ферментом, по всей вероятности, не сопровождается распадом молекулы ингибитора на субъеди-вицы, и каждая молекула ингибитора, состоящая из двух полипептидных-цепей ассоциирует с двумя молекулами фермента. Тем не менее, молекулярный вес комплексов ингибитора о ферментами во всех случаях был меньше суммы молекулярных весов составляющих компонентов, что .возможно, связано с уменьшением молекулярного объема ингибитора и фермента при комп-лексообразовании за счет сильных противоположно направленных электростатических сил или обусловлено сжатием сольват-НЫХ оболочек взаимодействующих компонентов ( Frits et al., 1965).* В пользу такого предположения говорит относительно небольшое увеличение йначевий радиусов Стокса комплексов по сравнение о молекулярными радиусами свободного фермента и ингибитора.

В литературе также неоднократно отмечались заниженные значения молекулярных весов комплексов по сравнению о суммами молекулярных весов образующих компонентов; это оообен—

ао

но часто наблюдается при определении молекулярных secos методой гель-хроматографии, когда разделение веществ идет в соответствии с их молекулярными размерами С Fritz et al., 1965; Sato et al., 1974-J. Вероятно, ассоциация ингибитора о ферментом, как взаимодействие тина белок-белок,приводит к образованию термодинамически устойчивой глобулы комплекса, характеризующейся минимальной поверхностной энергией.

3. Взаимодействие ингибитора с протеиназаии других классов и с неактивными производными химотрипсина

Возможность взаимодействия ингибитора с р! 7,3 о проте иязэам и других классов изучалась на примере пепсина и папа ияа. Пепсин относится к классу кислых лрогеиназ, и ингибитор о pi 7,3 не оказывает угаетащего действия на его активность, Ингибитор не подавляет также активность .тиоловой про те ин а эы папаина.

Таким образом, действие ингибитора с pi 7,3 ограничено сери новым и протеиназаии, обладающий трипсино- или хиыо— хрипсиноподобной специфичностью,

В настоящее время механизм действия ингибиторов являет ся объектом многочисленных дискуссий. Согласно представлениям ЛасковекоГО ( Flnkeaatadt,Laakowekl ,1965 ) комплекс фермента о ингибитором стабилизирован коваленіной связью с участием гидроксила серина активного центра фермента и пред ставдяет собой соединение типа ацил-фермент.

С целью изучения роли остатка серина активного центра химотрипсина в реакции с ингибитором исследовалась способность к компдексообразовании у ангидрохимотрипсина, у которого остаток сзрииа-195 превращен в оотаток дегидроаланина С «einer et al.,1966 >.

- С помощью метода гель-хроматографии било показано, что апгидрохимотрипсин сохраняет способность к образованию комп декcor с ингибитором из клубней картофеля. Ангидрохимотрип-син не содержит какой-либо блокирующей группы в активном центре фермента, кроме того, молекула ангидрохимотрипсияа в конформацноняоы отношении наиболее близка среди всех других неактивных форм химотрипсина к нативному ферменту. Таким

образец, можно сделать вывод, что в реакции хиыотрипсика о белкой-ингибитором не обязательно участие гидроксила остатка серкна-195, расположенного в активном центра фермента. Поэтому соединение ингибитора из картофеля с хиыотрипсином не является соединением типа ацил-фарыент, а вероятнее всего, представляет собой комплекс типа комплекса Ыихаэлиса, стабилизированный нековзлентными связями.

Эти результаты согласуются с литературными данными о том, что ангидротрипсин и энгидрозпшотрипсин сохраняют способность образовывать устойчивые соединения с некоторыми другими белками-ингибиторами С Ако ег ,1974 ).

ВЫВОДЫ

1. С помощью препаративного изозлектрического фокусирования из клубней картофеля выделен термостабильный бедок -ингибитор протеиназ с изоэлектрачаской точкой при рН 7,3. Гомогенность белка подтверждена методами гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле при рН 4,3 и 8,9; а также в ультрацентрифуге С в20

2. Молекулярный вес белка, определенный методом седи-мвнтационЬого равновесия, равен 32 500. Его молекула представляет собой компактную глобулу с молекулярным радиусом 24 А и коэффициентом диссимметрии £/£о»1,1<*-.

3. Результаты определения молекулярного веса методом электрофореза в ПАТ в присутствии додецилсульфата натрия и $ -церкаптоэтааола, а также анализа нн2 - и СООБ-концавых групп позволяют сделать заключение, что молекула белка состоит из двух полипептидных цепей о молекулярным весом

15 ООО, имевших сходную первичную структуру,

4. Аминокислотный состав белка характеризуется высоким содержанием полуцистина, пролива, глицина, асларагиновой и глутаьиновой кислот и лизина. В белке отсутствует триптофан.

5. НативныЙ белов не содержит свободных сульфгидриль-вых групп. После восстановления меркаптоэтанолоы обнаруживаются 23 зН-прупп. Этот результат свидетельствует о наличии в молекуле белка (с мол. весом 32 ООО) 14 дисульфидных мостиков.

6. Выделенный белок подавляет фврыеягагааную активность трипсина, химотрипсина, су Стили эина, плазмина, протеина з комплекса проназы, а также ряда других бактериальных ферментов. В то же время он не оказывает влияния на активвость пепсина и папанна. На этом основании белок можно рассматривать как ингибитор сериновых протаинаэ с необычно широким спектром действия.

7. В белке присутствуют два независимых центра связывания для трипсина и химотрипсина. Константа диссоциации соединения трипсин-ингибитор 2*10"^ М, соединения химо-трипсин-ингибитор I,7'Ю-® И.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации :

1. Б.В.Мосолов, Л.П.Васькова, А.И.Шульмина, Б.Л.Кэды-шева. О механизме взаимодействия сериновых протеинаэ с картофельным ингибитором. - Доклады Академии наук СССР, 204, 1002-1005, 1ЭТ2.

2. В.В.Мосолов, А.И.Шульмина, Е.Л.Налога. Выделения из клубней картофеля ингибитора трипсина и химотрипсина. -Биохимия, 99, 956-363, 1974.

3. Е.Л.Малова, А.И.Шульмина, В.В.Мосолов. Изучение тер-моотабильных белков картофеля методом изозлектрического фокусирования. - Прикладная биохимия и микробиология, 11, 576-579, 1975. •

4. В.В.Мосолов, ЕЛ.Малова, Т.А.Валуева, А. И, ¡Дульцина. Свойотва ингибитора сериновых протеинаэ из картофеля. -Биоорганическая химия, 1445-1457, 1975.

5. ЕЛ.Малова, А.И.Шульмина. Ингибиторы ,6 -химотрипсина и трипсина из картофеля. Выделение и некоторые свойства. - Материалы Всесоюзного симпозиума по химии протеодити-чесхих ферментов, Вильнюс, стр.88-39, 1973 год.

6. ЕЛ.Цалоьа, А.И.Шульмина, В.В,Мосолов. Теркостабильный ингибитор протаииаз из клубней картофеля. Выделение и свойства. - Третий Всесоюзный биохимический съезд (Рига, октябрь 1974 г.). Рефераты научных сообщений, т.2, стр.59, 4.97.

T.V.V.MoeoloVjE.L.MaloTa,!.I.Shulmlna,T.A.Valueva. Isolation and properties of serine proteases Inhibitor from potatoes.-I-th FEBS Meeting,Paris,July 20-27 1973*АЪа.733.

8. А.И.Шульиина, В.Я.Червяк, Н.Н.Магретова, Е.Д.Мало-эа, Л.А.Дровова, В,В.Мосолов, Изучение физико-химических овойотв белка—ингибитора сериновых протаиказ иг картофеля. - Биохимия, 41, * 7, 1976,

Попп. к печати 26/1У-70 г. Бумага 60x91 1/1S Объем 1,5 я.л. Заказ 2040. Тнрож 200

Полиграфкческое объединение 'Псчптник* У проииопатй ,4 о<'' горне пол к ом it г. Москва, ул. Станкевича,21