Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение, физико-химические свойства и некоторые структурные характеристики бета-1,3-глюканазы из гриба Verticillium dahlie Kleb.

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Выделение, физико-химические свойства и некоторые структурные характеристики бета-1,3-глюканазы из гриба Verticillium dahlie Kleb."

РГ6 од

2акН$Мй$ наук республики Узбекистан институт микробиологии

На правах рукописи

САТТАРОВА Регина Сераджидиновна

УДК 577.154

ВЫДЕЛЕНИЕ, ФИЗИКО-

ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И НЕКОТОРЫЕ СТРУКТУРНЫЕ

ХАРАКТЕРИСТИКИ ß— 1,3-ГЛЮКАНАЗЫ ИЗ ГРИБА

VERTICILLIUM DAHLIAE KLEB.

03.00.23 — Биотехнология 03.00.04 — Биохимия

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент — 1993

Работа выполнена в лаборатории биохимии и биотехнологии физиологически активных соединений Института микробиологии АН РУз

Научный руководитель

академик АН РУз, доктор биологических наук, профессор А. Г. Халмурадов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Ш. И. Салихов

доктор биологических наук С. М. Ходжибаева

Ведущая организация

кафедра биохимии биологического факультета Ташкентского Государственного Университета

Защита состоится «18» июня 1993 г. в «9» часов на заседании специализированного совета Д 015. 02. 21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте микробиологии АН РУз по адресу: 700128, Ташкент—128, ул. А. Кадыри, 7Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН РУз.

Автореферат разослан «_» 1993 г.

Ученый секретарь

специализированного совета, доктор биологических наук

Ж. Сафиязов

.- J -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Проблема ликвидации ущерба, наносимого , хлопководству вертициллезным вилтам,: считается актуальной, несмотря на ухе существующие методы (химические, селекционные,агротехнические и др.1 снижения вредоносности фитопатогена. Отсутствие надежных научнообоснованных рекомендаций на основе -, фундаментальных исследований механизма взаимоотношений патоге-' на и растения тормозит внедрение в хлопководство биологических . способов зашита растений от патогена.

3 механизме зашиты растительных клеток хлопчатника от ,повтеждашего действия микроскопического гриба Verticilliuir. ,dahliae Kleb, существенная роль обводится фитсалексинам. Синтез последних в растительных клетках может индуцироваться, молекулами. названными элиситораш. Ими могут быть олигосахарид-ные фрагменты полисахаридов-клеточных стенок как гриба-патоге-t на, гак и шстения-ховяйна.

Известен ряд ферментов, раз рушащих клеточные стенки, которые высвобождают из них определенные олигосахариды, Образование > олигосахаридов а ряде случаев катализируют фермента 3-1,3-глюкаиазы, механизмы молекулярного действия которых составляют самостоятельную научную проблему. В связи с этим, а последнее время з Институте учкробиодсгии АН РУз ведутся исс- ' . ледавания," направленные на выяснение молекулярных механизмов образования и действия нового класса фитогормонов - одигосаха-ринов (фрагментов клеточных стенок), индуцирующих защитные реакции хлопчатника против его заболевания вютом, фрагментом "¡тих исследований и является настоящая работа,

Дель работы, основной целью райогы ввилось исследование основного ферментативного звена в образовании олигосахаринов :слетсчных стенок - а-1,3-глюканазы. Для достижения этой цели ■■геобходимо было решить следующие задачи:

- зылелить и-1,3-глюкапаау из гриба V.dahliae в гсмогеи-

:;ом' состоянии; ' ! 4 :

- и-jV''.i'.Tb фиайко-химические и кинетические характеристики

,• выведенного йермента;

- леем давать гидролитическое действие фермента на поли- ' сахарили {щеточных стенок г&ийз. '

Научная новизна и практическое значение работы. Б резуда-тате осужеегвлеадэГФ скрининга отобран щтамм гриба У.с1аЬ11ае с наиболее 1К ,3-гл»адаавой активностью. Определены ос~

. тиыальнуе.свок^ культивирования продуцента, при которых обеспечиваете? нашдааде

Бг.евдщ доказана оущ^вование двух внеклеточных модеку-

Методами гель-. , ионообменной, ад-ашгштсградкй и препаративного электрофэреза в.по-дгшрад®йшк>* та» вдаеогёны а высокоочиценном состоянии . обе форт 4-1 Л-гздканазы. Изучены вх основные фиаико- химические и кагадцтш§сюй& свойства, Показано, что выделенный фермент по отюшйвдю к даыинарину «вдается зкэо-в-Д.З-гдюкаааэой. Уста-ноадена. рш» мютацоюаш остатков в, проявлении каталитической активности а-1,Э-тлюканааы. Определено, что активность а-ЬЗ-глкиаваэы. регулируется: посредством некоторых аминокислот. Впервые показано, что полисахариды иэ клеточных стенок гриба, гадрозваовааше а-1.3-глвканагой, значительно увеличивает индукцию эадитнкх реакций хлопчатника.

' Совокупность полученных данных может служить основой для выделениа препаратов в^глшназ с цель» использования юс для получен»* отв-осахарадныг фрагментов, индукторов защитных реакций хлопчатника, против его заболевания вкдтоы.

Изучение механизма действия к активных центров з-1,3-глю-канаа Факхе служит необходимой предпосылкой для правильного и эффективного использования их в структурной химии углеводсо-держаша биополимеров.

Апробация работы. Материалы диссертации долоиеш на V Международном симпозиуме по вертиццллизму ( Ленинград... 1990), XV Международном биохимическом Конгрессе' (Израиль, 1991), \ Конференции биохимиков Республик Средней Азии и Каааастанг (Таянент, Ш1).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 5 печ; та работ, из коториг . 4 журнальные статьи и 3 тезиса докладов.

Структура и сСъьу диссертации. Диссертация состоит я; введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов я,их обсуждения, заключения, выводов, списка испсльаова ной литературы, включавшего /60 наименований.

Работа надеже на на страницах машинописного текста иллюстрирована <37 рисунками и € таблицами.

»

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Скрининг штаммов грйба V.dahliae по способности к биосинтезу молекулярных форм а-1.3-глюканазь проводили у 14 штаммов микроскопического гриба V.dahliae. Штаммы получены из лаборатории коллекции микроорганизмов Института микробиологии АН РУз.

' Гриб выращивали в 1,0-литровых колбах Эрленмейера, содержащих 200 мл среды Чалека-Докса при 28°С в сгашонарннх условиях, с последующим определением а-'1,3- глюканазнсг) активности в' фильтрате культуральной жидкости по методу Шомодьи-Нельсона (Somogyi, Nelson, 1952), используя в качестве стандарта глюко-ày. Субстратом служил ламинарии - 8-1,3-гдхжан из водоросли Laminaria cycharioides (Elyakova, Zwyagiritseva, 1974). ' За единицу ферментативной активности принимали количество Фермента, которое образует 1 мкмоль восстанавливающих Сахаров 'в пересчете на глюкозу ва 1 мин в оптимальных условиях действия Фермента, Удельную актшшкги» определяли, числом единиц активности на 1 мг белка.

Содержание белка определяли модифицированным (Larson et al., 1986) методом Лоури.

Гомогенные молекулярные формы а-1,3-глюквназы выделяли, , применяя методы: осаждения культуральной жидкости этиловым спиртом (или изопропанолом), . гель-хроматографии на сефадексе . G-50 ("Pharmacia Fine chemicals", Швеция), TSK-геле HW 50 То-yopearl, ионообменной хроматографии на DEAE-TSK 650М Toy opear! (Toyo Soda MFG Co, Ltd, Япония). Высокоочииенные формы 3-1.3-глхжанаэи получали также и методами адсорбционной хроматографии на HA-Ultrogel (LKB, Швеция), препаративного электрофореза на масткнкахс 72-ным полиакриламвдиьгм гелем (Davis, 1964; Gabriel, 1963)..

Молекулярные массы Форм I и II о-1,3-глюканазы определяли методами электрофореза в подиакриламидном геле в присутствии додешлсульфата натрия (Weber, Osbom, 1969) и гель-фильтрации на сс-фад«ксе G-1G0 (Детерман, 1970).

Аминокислотные анализы обеих <£орм 0-1,3-глюканазы бали проьедскы с идентификацией фенилтиокарбомильных производных, аминокислот с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (Cohen. Strydoro, 1988).

- Ь -

Температурные оптимумы молекулярных форм в-1,3-глюканазы определяли в интервале 28 - SO°C.

рИ-оптимумы определяли в интервале рН среды 3,7 - 8.С.

Фотоокисдение гисшша в молекулах а-1,3-глюканазы проводили в присутствии рибофлавина (Murachi, 1975).

Анализ KHg-концевызс аминокислот определяли по методу Грея (Gray, 1872). - в

. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Отбор грнба - продуцента 8-1,3-глюканазы

С целью отбора наиболее продуктивного , в отношении В-1,3-глюканазы продуцента было исследовано 14 штаммов микроскопического гриба V.dahliae, полученных из лаборатории коллекции микроорганизмов Института микробиологии АН РУз.

На основании результатов изучения динамики биосинтеза 8-1,3-гликанааы, исследованные штаммы удалось разделить на четыре группы, примем было установлено, что с повышением вирулентности гриба возрастает и 8-1,3-глюканазная активность.

Наиболее высокой глвканазной и-1,3-активностью из исследованных культур обладал втамм 2 гриба V.dahliae. Максимальное образование В-1,3-глюканазы у указанного штамма наблюдалось на 15-ые сутки роста.

Z. Выделение и очистка 0-1.3-глюканазы

Необходимость использования во многих случаях высокоочи-аекных в-1»3-глюканаз ставит задачу разработки способов очистки ферментов. К настоящему времени в гомогенном состоянии получены 6-1,3-глюканазы из дрожжей, грибов, бактерии, высших растений и беспозвоночных животных.

С иельо получения комплексного препарата в-1.3-глюканазы кулътурадъную жидкость гриба V.dahliae предварительно отделяли от мшелия путем фильтрации под вакуумом и далее концентрировали на роторном испарителе. В ходе эксперимента было установлено, что при четырехкратном концентрировании фильтрата кул— турадьной жидкости сохраняется lOOJ-яая активность фермента.

- 7 - . %

Белковые компоненты концентрата культуральной жидкости осаждали этиловым спиртом в соотношении 1 : 5. Для избавления от примесей солей, соосаждаешх вместе с белками,полученный препарат белков подвергали гель-хроматографии на сефадексе G-50 (coarse).

Как этапы, предшествующе очистке в-1,3-глюканазы до гомогенного состояния, изучали некоторые физико-химические характеристики активной фракции после гель-хроматографии на сефадексе $-50; рН-оптипмум, рН-стабильность, температурный оптимум и температурную стабильность.

В результате было установлено наличие 3-х точек рН-оптимума: при рН 5,2; 5,9; 7,7 , ферментный препарат сохранял активность в области рН 4,5 - 6,7 в течение 5 час. При исследовании температурного оптимума оказалось, что препарат, инкубированный в течеьИе 30 мин с субстратом в точках рН-оптимума, жтивен в интервале 54 - 60°С. Изучение температурной стабильности показало, что о-1,3-глюканазная активность при предварительной инкубации препарата в течение 30 мин сохраняется при -температурах до 45°С и присходит быстрая инактивация ,при более высоких температурах.

Выделение о-1,3-глсканааы проводили с пшовыо ионообмен-О'л хроматографии ферментного препарата на анионите DEAE-TSK >50М в линейном градиенте конг?ятрацвй ашояий-бикарбонатного уферз при рН 7,8 (рис. 1). ' •

В результате было получено семь фрачдай. в-1,3-Глюканзз-,ой активностью обладала фракция^ Злшруемая при 0,24 U ЦНСОз. -'/'.' ' .. ' •

Подученную активную фракцию затем подвергали дальнейшей метке гель-хроматографией на TSK-геле HW SO (рис. 2). При том происходит разделение белков с в-1,З-глюканавной актив-гстыо на две фракции, которые оказались молекулярными формами ;«рмгнта, что характерно для многих ферментов, синтезируемых Микроорганизмами.

На первых стадиях очистки удельная активность глюка-■агы увеличивается в 3 рава. На стадии ионообменной хромзто-'радии удельная активность возрастает в 12 раз. В ре-)ультате гель-хроматографии на Т5К- геле Ш 50 достигается 32-х сраткзя очистка сборьо.' I и 19-ти кратная очистка формы 11 !1-1.3-глшаназы.

lOO.O £00.» WOO C<5»«il, МП

4 ООО

Рис. J. Ноыоови«ныая хроыатогр*фи< с

Д-КЭ-глюкляизпой активностью tu. DEAE-TSK 650И Калош» 1.5x20 ем

Грвшент 200 ил 0.0&U NH.HC0, pH 7.8

200 ми IM NH.KCO, pH 7,в Сшеросп элювия 38 ил/ч

в.о> ЖЛЛ

41"»" "'!" -««в «fc» »0.0 100.0 ООМН. МП

120.2

Ржс.2. Гвш—хром*тол»фт активно* фрьима с Д-(,3-глюк*паано» дктшмвсги! m TSK 1ПГ-50 Horwmc« löröo см 8у»ер 0.0Ö U NH«HC0j рв 7.8 Скор©«»» лпюют 32 ыл/п

При попытке выделения а-1,3-глюканазы с помощью адсорбционной хроматографии на НА-1Мгоге1 также подучены данные, сви-детедьствующие о существовании двух форм фермента. Но данный метод неэффективен в связи с низким выходом фермента.

Результаты очистки а-1,3-гдшанавы представлены в табл.1.

Таблица 1

Очистка 3-1,3-глюкаиазы из гриба У.йаШае методами гель- и ионообменной хроматографии

Стадии очистки Белок, мг Суммарная активность, . Е Удельная активность, Е /мг Выход по активности, t Степень очистки

Сырой препарат 2217,6 3326,4 i;5 100,0

Гель-хроматография на сефа-дексе G-50 554,4 2328,5 4,2 70,0 3,0

Хроматография на DEAE-TSK 650« 110,8 1933,8- 17,4 58,1 12,0

Гель-хроматография на TSK-геле HW 50 форма I форма 11 22,1 24,5 ,1054,8 703,2 - 47,7 28,7 31,8 21,1 32,0 19,0

Для получения обеих молекулярных форм а-1,3-гдюканазы в гомогенном состоянии в дальнейших исследованиях применяли препаративный электрофорез в полиакриламидном геле на пластинках, основанный на определении глвканазной активности в сегментах геля - получения аимбграмм.

Результаты очистки (¡-1,3-глюканазы представлены в табл.2.

Анализируя данные таблицы, можно вакшочить, что степень очистки и выход по активности обеих форм фермента приближаются к аналогичным показателям, полученным при выделении их методами осаждения,' гель- и ионообменной хроматографий, представленными в табл. 1. Ъля исследований физико-химических и rame-

- ю -

тических характеристик 0-1,3-глюканазы, фермент накапливали методом, 'препаративного электрофореза, т.к. этот метод менее трудоемкий и не требует больших затрат времени.

Таблица С

Очистка в-1,3~гдюкадазы из гриба У.йаШае методом препаративного электрофореза

Стадии . очистки Еедок, ■ иг • Суммарная активность, ■ Е . Удельная "активность, Е/мг Выход по активности, X Степень очистки

Сырой препарат 480,0 1 666,6 1,4 100,0 .1,0

Гель-хроматография на сефа-дексе (3-50 120,0 481,4 4,01 72,2 3.0

Препаративный электрофорез форма I форма I! 5,2 "8,7 222,0 215,6 42.7 24.8 . 33,3 ' 32,3 31,0 18,0

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что гриб У.с1аШае в подобранных условиях синтезирует и секратируёт две формы (I и II) 3-1,3-глвоканазы. Разработаны схемы выделения и одновременной очистки обеих форм 3-1,3-глшанааы.

3. Физико-химические свойства и кинетические характеристики молекулярных форм 8-1.3-гдоканазы

Для понимания образования сшгосахаридов - злиситоров, в возникновении которых основную роль играют .3-глюканазы. необходимо знать физико-химические и кинетические свойства этих ферментов.

Изучение характера действия а-1,2-глюканаз на ламинаоин показало, что обе формы фермента обладают экзо-типом действия, т.к. основным продуктом гидролиза ламинарина является глюкоза.

Фермент проявляет высокую специфичность по отношению к лаыинаркну я значительно менее эффективно протекает гидролити-

•- 11 - •

ческая реакция по отношению к лихенину, состоящему иа ангид-роглюкозных остатков, соединенных с-1,3- (на 20-302) и й-1.4-глмкозидшми свявями (на 70-801) и пустулаяу,. в молекулах которого глюкозные остатки соединены 8-1,6-связыо. Установлено, что лихенин является конкурирующим аналогом по отношению к даминарину, а пустулан, наоборот, неконкурирующим.

Одним из факторов, существенно влияющих на активность ферментов, является температура и рН среды, в которой происходит их действие. В результате проведенных зксперкменгов установлено, что молекулярные формы 0-1,3-глюкаиаэы стабильны к нагреванию до 40°С и в диапазоне рН 4,0 - 7,5. Максимальная активность формы I наблюдается при 45°С и рН 6,8, формы II -при 55°С и рН 5,2 (рис.3).

1.0

1.0

о «

о «

N

0.5

0.0 ; I I v"r m )■ I I 1'г1' т ' 'I

2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 W рН

0.5

I

0.0 1 ад

I I Г "I I l-rpl I I 1 ГЧ I |

4.0 в.О 8.0 10.0

с

л

I

1.0

0.5

о

л

0.5

0.0 i i l ' t г I I 11) I, м 111 г ri

Î 4 0.0 I I M I | ' I I I I Г 14 I | Ч ГГ1 \

0.0 25.0 50.0 75.0100.0 0.0 25.0 50.0 75.0100.0

Температура, °С Температура, "С

Рис. 3. Ояпшумы рН и температуры для форм [ (в) к il (b) в- 1,3-глюквнвзы из гоиба V.dahliae

- 12 -

Молекулярные массы обеих форм и-1.й-глюканазы определяли методом гель-хроматографии на сефадексе 6-150 (рис. 4,а) и методом электрофореза в 10%-ном полиашиламидиом геле в присутствии додедалсульфата натрия (рис. 4,6).

2.4 -а

•> 2 з

1

¿2.0 |

а а * 1.8 |

3

1.6 |

■3

1.4 I

»ча

V

V

ч?

1.2 тт-0.0

'II I '" Г | 1111

4.0

МгхЮ

(Ь) 4.9 -а

4.6 3 -. «Ч Г

4.7 \ ! * 1!

4.6 |' V

4.5 \ >

М! -4.4 "3

4.3 •3

4.2 3 —1

4.1 л

1 4.0 ■1гг: иг;! : [ п ■ •; 1 ■ я 1

\» л

8.0 0.00

0.40 О.ВО

х

1.20

Рис. 4. Определение молекулярных масс форы 1 и II Т1юканаэы методами

гель-отлт. ^ .дай н& сетадексе С-15й (а) и олектпогос.^^эй в ПАЛГ (Ь) а-иитохром (М12300;. б-трипсин (М24000), Е-яичнын альбумин (М43000), г-бычий сы-вороточиый вльбушгн Ш67000), д-ангид-раза ШЗОООО), е-ингиОигор трипсина 1М20000), ж-лахтоатпбуынн Ш14400}

Ллк формы I молекулярная масса оказалась равной 52 ООО дадьтон, а для формы II - 49 ООО. соответственно.

Нзоэлектрические точки молекулярных форм, определенные методом изозлектрического фокусирования, оказались одинаковы к были равны 5,8.

- 13 -

ЮЬ-концевой анализ а-1,3-глюканаэы показал, что для формы I Шг-концевой аминокислотой является гдишн, а для формы П - мании. Наличие по одной Шг-конпевой аминокислоте для каждой из форм фермента является дополнительным подтверждением гомогенности полученных препаратов.

Так как молекулярные массы обеих форм 3-1,3-глюканази близки, важно было провести сравнение их аминокислотных составов. Аминокислотные составы представлены в табл. 3.

Таблица 3.

Аминокислотные составы форм I и II з-1,9-гдюканазы иа гриба У.&зЛИзе

Аминокислоты | Количество остат-| {ков на молекулу { Аминокислоты Количество остатков на молекулу

| . формы { формы

■ 1 I 1 п ! I 1 II

агр 42 41 Ьуг 8 '9

• в1и 55 56 уа1 20 20

•зег 10 10 те! 15 13.

®1у 45 46 СУ 5 2 2

20 19 1еи 43 40

а!а 36 37 Не 33 35

рго ■ 9. 8 рпе 45 45

18 18 1уэ 5 5

агэ 35 34

Анализируя данные таблицы, можно отметить высокое содержание кислых аминокислот глииина и алаяина в каждой форме. Преобладание этих аминокислот характерно и для других 3-1,2-глюканаз (Зайкина и др., 1985!.

3 аэлсм, аминокислотные составы обеих форм очень , схожи, и уозможнс, их аминокислотные последовательности имеют высокую степень гомологии.'

Определение кинетических характеристик молекулярных .форм фермента пасазало. что кривые зависимости скорости фермента-

тивной реакции от концентрации ламинарина близки к гиперболическим, т.е. гидролиз субстрата е-1,3-глюканааой (обе формы) соответствуют уравнению Михаэлиса-Ыентен.

Величины Км и V (рис. 5) по отношению к даминарину, вычисленные по методу двойных обратных величин Лайнуивера-Бзрка, для формы I равны 2,4х10_5Ы и 33,5 мкМУмин, для формы II -

Рис. 5. Зависимость активности /2-1,3 -глюканпэы ст коицевтрации паминаринь

— в координате* Михазлиса-Мектек Ь) - в координате* Лайнуипера-Бэрка - I форма /3-1,3—глюканааы ■ й - И ферма /9-1.3-глю1:анвэм

При изучении регуляции активности молекулярных форм з-1,3-глюкаиазы аминокислотами установлено, что активирующими гффекторзми для обеих форм являются аминокислоты лизин и треонин. Отрицательным или ингибирухетм эффектором является валян. Исследование характера активирования иди ингибировавия скорости ферментативных реакций в присутствии вышеперечисленных аминокислот (рис. 6) показало, что они являются неконкурентными эффекторами. Иньмн словами, эффекторы присоединяются к ферменту не в активном центре, где связывается субстрат, а в ином

- у;, -

2. Khalmuradov A.G.. Adylbekoy M.T., Sattarova R.Z. 2-1,3-Glucan and 8-1,3-glucanase of Verticllllum dahlias Fungi // Abstracts of . "15th interrational Congress of Biochemistry. Jerusalem, Israel, august 4 - a. 1991. p. 43.

3. Сагтарова P.C., Адылбеков Ы.Т., акад." АН УзССР Ха-чму-радов А.Г. а-1,3-Глюкаааза гриба Vertlcilllura dahliae // Лскл. АН Уз CCF. 1991, N 9, с. 51 - 53.

4. Адылбеков М.Т., Саттарова P.C., Халмурадов А.Г. Индуктор защитных функций хлопчатника из гриба VerticlIlium dahliae // Тезисы докладов V Конференции биохимиков Республик Средней Азии и Казахстана. Ташкент. 12 - 15 ноября, 1991, с.' 350.

5. Адылбеков И.Т., Саттарова-Р.С. Изучение карбогидраз-ных активностей гриба Yerticillium dahliae /У Биология я биотехнология микроорганизмов. Под ред. акад. АН РУз А.Г.Халмура-дова. Ташкент:"Фан", 1992, с. 119 -121.

УгозкЕСТоЕ Респуоликаси Фенлар Академиясининг Микробиология Института P.C. Саттарова

"'-'erticllliisn dahilae Kiep, замоуругидан 0-1,3-глпкавазаш зЕвагеа олиниши ва ушшг физдк-гашевий хамда тузилиш хоссаларг" Биология Фанлада яоизодлигага тавсия огилгая лиссертацияоинннг кискача мазмуни '. ■ .

Хммоя IS93 вил ишда Узбекистон Фанлар Академияси жкробиология йнститпишшг иадсус кенгашида сулади. 700128, Гсш^8вт-12а, ¿.Кодирай кучвса 7й, кшкрооиология институте.

Лисгэргашя ш киши, адабибтлар анализа. амашй ип, зляпган мзълшоглар ва улариинг кзо*и, хулоса, фойдалвнилган .■здабге'тлар руазати ¡¿О ибораг. Иа мзгаи бетдая ибораг судас, s жадвал, 3' асдцдэн олидган расмларни уз ичига олган.

Пахта сш$апши яхшклзш вг госилдорликни оширишнинг ЯУллз-рвдзн ощ! - пагтэнинг вилт касалига чалишшшш оартараф вд-лаишр. йикроскопЕК замбуруг V.dahilae тактага таъсир втавт-гзнда усяшк хужаарасида хкмоя механизма вшга тушада. су гзраеялэ фигоалексинлар маг су с урин ту тали. Уларнинг хосил зудяаи пун элиситорлар индухторлик вазифасгши оажарадвлар. Зласитор сифатида эса заморут-патоген еки усимлик хужвйра яобигидаги полисахарид парчалари - олигасагаридлэр оудшзи штат, илигасйиришир хосил оулиада, озъзи холларда, кум-ладак, 7.dalЦlas замбуругада 0-1,3-глкканаза форментиникг ^амвята кагталхги кз£л зтилган.

•йрридаги кэйд юшшган асосларга к?ра, мазкур ившнг асо-агй M-'ii-ccsjT.;:

1.V.daallae замбуругкдап' гомоген холатда р-1,3-глшаиаза зжратке олие;

2. Оликган ферментнил:' кикетик ва амзика-кимбвкй хоссала-ргпа Ургашк;

С. зермецтнвнг зсмбуруг хукаяра кооигидаги полисахариялар-никг гээтапаниа коощшятини урганишдан воорат. "ИрКНИНГ ВССОЙИЭ. |3-1.3-глшаяазь вктивлигм юкори СУЛГШ1 штамм такрковлар натакасвдэ ажратиб. олинди. Продуцент 5стирил1:дигаи стгашал вант ашпушди. оуцда. хужайрадаги фермент мшугори кжо-цоящатя б?лади. Бирнлчи марта (з-1,3-глюкзлазаяккг иски м-;

лэкуляр холатда о?лнш курсатидлк.

Гель, исналмаптишп, адссроцион хроматография ва препарвтив электрофорез (полиакриламид гелида) усулларида ферментнинг икк;; модекуляр шакли тоза холда ажратио олшда. Олинган ферментнинг ламинаринга нисоатан экзо-р-1,3-глжаназа эканлиги кУрсатилд:;. Гастидин тутган оирикмаларнинг ферменгатив фаолликка тзъсярв Зрганилди. Фермент фаоллига оир-нвча аминокислоталар воситаси-да амалга оширилиши тахлил вдлинда. Замоуруг хухайра цооигида-ги полисахаридларнинг (Ы.З-глшанвза оилан парчаланган оулек-лари пахта устлигининг химояланиш механизма учун индуктор оулио хизмат шш оаринчи' Оор курсзтилди.

Олинган маьлумотларга асосланно, |3-1.3-глхканаза фермента яарчалаган полисахарид оулаклари, льни химоя функция индуктор-лари 05лган олетосахаридлзрни агратао олиш мумкин о?лади. • 6-1,3-глюканаза гаъсир этап механизми ва актив марказининг Тргашшши, углевод тутган ' оиогголкмерлар кимёсини Ургакишда эффектив ва г?гри й?л курсатувчи омил сулади.

- 22 -

Academy of Sciences of Republic Uzbekistan Institute of-Microbiology

• Segina S. Sattarova

Isolation, physical and chemical properties and some structural characteristics of 3-1,3-gluca-nase from fungus Verticilliusi dahliae.

Thesis of dissertation presented for receiving a degree of Candidate of Biological Sciences Suranary

The thesis will be defended juriy 1993 at o'clock at the special council of the Institute microbiology of AS of RUz, at address: 700128, Tashkent, Kadiry str.\ 7B, Institute of Microbiology. ' * .

The thesis vas typewritten and it consists of introduction, 3 chapters, conclusions, practical proposals and a list of literature. It Is Illustrated with <9 tables, 3\ pictures.

One of the main reserve for increasing of cotton yield and improving of cotton quality is elimination" of damages, caused to cotton plant by Verticlllium dahliae.

The phytoalexins play, essential role in .mechanism of cotton plant cells protection from da-rag-ingv action of microscopic fungus Verticillium dahllac. The synthesis of the latter in plant cells can be induced by molecules called eiicitors. îhsv may be oligosaccharide, fragments of cell walls* polysaccharides as well as fungus-pathogène and nost-plant. Oligosaccharides formation in some cases cataiizes ¿y enzyna -- »-1.3-slucanase, found in fungus Verticil!ium •Janiiao, .

In connection with montiorwd above, the main ainr. of the? ¡¡re-cnt won: cosists of:- isolation of B-l,3-£lucanase frow fungus Verticil liu-n ¿a'lllae In homogenous; state;

- stuav of pnvslcal arii criewicai -characteristics of isolate sisMnes:

- researching o: rr» clytic action 'of a en^wt-polysaccharides of fuTiir»^ .-»all walls.

As a result of screc-hing the strain of fungus V. dahlia-with highest 6-1,3-glucanases activity has been selected.

The optimum terms of producent cultivation had Deen determined under which the greatest enzvme accumulation is croviaea. Firstly the existence of extracellular molecular forms of a-i,3-glucanase is shown. By mettioos of gel-, ionexchanging, adsorption chromatographies and preparative electrophoresis in polyacrilamid gel both forms of the highly rectified enzymes has been Isolated. Their main physical and cnemlcal as well as catalitical properties were studied. It was shown that isolated enzyme regarding to laminarin Is 9xo-B-l,3-glucanase. The role of histldlne resudies in enzymatic activity of B-l,3-glucanase was established. It was defined that enzymatic activity is regulated by some aminoacids. It was shown firstly that polysaccharides from fungus cell walls hydrollzed by 0-1,3-glucanase, considerably increase the induction of cotton protective reactions.

Totality of recleved data can serve as a basis for 3-1.3-glucanase preparations isolation to use tnew for obtaining of oligosaccharides fragments, inductors of ccttor. protective reactions against Its vilt disease.

Studing of action mechanism and active centres of S-i.S-glucanase also serves as necessarv precise for tneir effective utilizing in structural cnemlstrv of caroohvcr^tes containing bioDolvners.

OP-