Введение в культуру in vitro и in vivo видов рода Passiflora L.

Кириллов, Алексей Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Введение в культуру in vitro и in vivo видов рода Passiflora L.
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Введение в культуру in vitro и in vivo видов рода Passiflora L."

На правах рукописи

КИРИЛЛОВ Алексей Александрович

ВВЕДЕНИЕ В КУЛЬТУРУ IN VITRO И IN VIVO ВИДОВ РОДА PASSIFLORA L.

Специальности: 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии), 03.02.01 - ботаника

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

5 ДЕК 2013

Москва - 2013

005541786

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

Коломейцева Галина Леонидовна

Официальные оппоненты:

Калашникова Елена Анатольевна

доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО "Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева", профессор на кафедре генетики и биотехнологии

Широков Александр Игоревич

кандидат биологических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского», доцент кафедры ботаники

Ведущая организация: ФГБУН Институт физиологии растений

им. К.А. Тимирязева Российской академии наук

Защита диссертации состоится 18 декабря 2013 г. в 14-30 часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу 127550, г. Москва, ул. Прянишникова, д. 15; тел./факс. (499) 976-24-92, e-mail: genetics@timacad.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева

Автореферат разослан 18 ноября 2013 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Род Passiflora L. - крупнейший в семействе Passifloraceae и включает 575 видов (J0rgensen et al., 2012), распространенных, главным образом, в тропиках и субтропиках Нового Света, 22 вида происходят из Юго-Восточной Азии, Австралии и Океании. Почти все пассифлоры являются травянистыми или одревесневающими лазающими лианами, 10 видов представлены кустарниками и невысокими деревьями, ещё реже среди них встречаются однолетние травы (Killip, 1938; Feuillet, MacDougal, 2007). Род богат эндемичными редкими видами (Осашро, 2010). Большой ресурсный потенциал рода Passiflora, включающего декоративные, плодовые и лекарственные виды, до настоящего времени полностью не раскрыт.

Крупные коллекционные фонды ботанических садов являются живым генным банком для выявления и отбора ресурсно-значимых видов растений, проведения биотехнологических работ в области микроклонального размножения и оздоровления, а также для длительного хранения генетического материала in vitro (Litz et. al., 2005; Черевченко и др., 2008). Сегодня микроклональное размножение разработано для небольшого числа видов и сортов пассифлор (Faria, Segura, 1997; Alexandre et. al., 2008; Pinto et. al., 2010; Paikrao et. al., 2012), в том числе, для плодовых сортов P. edulis Sims и красивоцветущих сортов P. 'Guglielmo Betto ', Р. 'Manta ', P. x allardii Lynch, (Pipino et. al., 2008, Braglia et. al., 2009; Pipino et. al., 2010). Основные трудности введения в культуру in vitro связаны с сильной эндофитной контаминацией первичных эксплантов. Поиск приемов, позволяющих уменьшить заражение материнских растений и добиться стабильной стерильной культуры, является ключом к успешному культивированию и длительному хранению in vitro полезных и редких видов пассифлор.

В оранжерейных условиях также имеется ряд трудностей, связанных с поддержанием стабильной культуры пассифлор. Это, прежде всего, отсутствие устойчивости большинства видов к галловым нематодам. Разработка экологически приемлемых методов борьбы с этим вредителем без использования пестицидов (прививка на устойчивые к галловой нематоде подвои) является одним из биотехнологических приемов защиты растений, что особенно актуально в условиях защищенного грунта.

В коллекционных фондах Главного ботанического сада РАН в настоящее время представлены 16 из 17 секций пассифлор (Kirillov, 2013), что даёт возможность использовать коллекционные растения для проведения таксономических исследований. Молекулярно-филогенетические работы, опубликованных за последние 10 лет (Muschner et. al., 2003; Yockteng, Nadot, 2003; Hansen et. al., 2006; Paikrao et. al., 2010; Muschneret. al., 2012), с высокой степенью поддержки показали монофилетичность рода и подтвердили его

деление на четыре подрода. Однако отношения на уровне отдельных секций и серий всё ещё остаются неясными.

Цель и задачи. Целью исследования является создание устойчивой культуры видов рода Passiflora L. in vitro и in vivo с использованием живого коллекционного фонда.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Разработка протоколов клонального микроразмножения ресурсных видов.

2. Изучение влияние подвоя на степень эндофитной контаминации интактных растений.

3. Оптимизация биорегуляторов для разработки протоколов микроклонирования.

4. Проведение скрининга видов и сортов пассифлор на устойчивость к галловой нематоде с отбором устойчивых форм и оптимизацией прививочных технологий.

5. Уточнение внутр иродовых отношений с использованием высоко вариабельного межгенного спейсера trnH-psbA на основе изучения коллекционного материала.

6. Создание крупнейшей на территории России коллекции видов и сортов представителей рода Passiflora в условиях защищенного грунта и выявление связи между таксономической принадлежностью и устойчивостью к галловой нематоде.

Научная новизна. Установлено, что в роде Passiflora прививка на устойчивые подвои - эффективный способ понижения эндофитной контаминации в культуре in vitro. Впервые получены данные о степени резистентности 65 видов и двух сортов пассифлор к южной галловой нематоде Meloidogyne incognita Kofoid et White и выявлены резистентные особи 9 видов. Впервые проведён филогенетический анализ таксонов рода Passiflora на основе межгенного спейсера trnH-psbA участка хпДНК, включивший 42 вида. Показано, что подрод Passiflora разделяется на две монофилетические группы. В первую входят секции Stipulata Feuillet & J. M. MacDougal, Tacsonia (Juss.) Feuillet & J. M. MacDougal и Calapathanthus Harms, во вторую Tiliifolia Feuillet & J. M. MacDougal, Coccínea Feuillet & J. M. MacDougal, Passiflora, Laurifolia Killip ex Cervi и Quadrangularis Feuillet & J. M. MacDougal. Найден новый для науки вид пассифлоры P. ejfiisa nom. provis.

Практическая значимость. Создана крупнейшая в России коллекция видов и сортов Passiflora, включающая 149 видов, 6 разновидностей и 31 сорт. Получены два новых декоративных сорта пассифлор. Разработана технология размножения in vitro для трёх видов пассифлор, имеющих ресурсное значение или подпадающих под категорию исчезающих видов IUCN. Банк in vitro (ГБС РАН) пополнен редкими и исчезающими видами. Разработана новая технология оздоровления интактного материала путём

прививки на резистентные виды и показано её влияние на дальнейшее развитие растений-регенерантов в стерильной культуре. Оптимизирована методика прививки пассифлор в связи с биоморфологическими особенностями лиановидного стебля. Определено влияние способа прививки и вида подвоя на прохождение фенологических фаз и на морфометрические показатели in vivo. Впервые в России создан банк ДНК пассифлор, представленный 168 образцами.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены автором в докладах на российских и зарубежных конференциях: «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (Томск, 2010 г.), «Биоморфологические чтения к 150-летию со дня рождения X. Раункиера» (Киров, 2010 г.), ежегодный конкурс научно-исследовательских работ молодых учёных ГБС РАН (2011 г.), «Дендрология, цветоводство и садово-парковое строительство» (Ялта, 2012 г.) и на заседаниях отдела тропических и субтропических растений ГБС РАН (2011-2012 гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК и 1 статья в зарубежном журнале.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов, списка литературы, включающего 241 источника, в том числе 175 на иностранных языках и приложения. Работа изложена на 152 страницах текста, включая 18 таблиц и 9 рисунков.

Благодарности. Автор выражает искренние благодарности своему научному руководителю Г.Л. Коломейцевой за всестороннюю помощь в проведении исследования, а также О.И. Молкановой, И.Г. Мещерскому, И.В. Ширниной, И.А. Шанцеру, В.Н. Чижову, М.Т. Кръстеву и B.JI. Шелейковсшму за ценные советы и помощь в работе. Также мои искренние благодарности Dr. J. MacDougal и Dr. J. Vanderplank за помощь в идентификации пассифлор. Отдельная благодарность моей семье и друзьям за помощь и понимание.

Содержание работы

Глава 1. Обзор литературы

Рассмотрены проблемы введения пассифлор в культуру in vitro и in vivo. Дана краткая история интродукции и описаны полезные свойства рода. Составлен обзор по протоколам микроклонального размножения пассифлор, типам прививок и прививочных комбинаций, используемых при промышленном производстве различных плодовых видов пассифлор. Приведён обзор по истории систематики и молекулярно-филогенетическим исследованиям рода Passiflora.

Глава 2. Материалы и методы исследования

Методика микроклонального размножения основывалась на общепринятых классических приемах работы с культурами изолированных

тканей и органов растений (Бутенко, 1999; Калашникова и др., 2006; Черевченко, 2008).

Модельными объектами при изучении микроклонального размножения служили три вида пассифлор: P. arbelaezii Uribe (имеет высокий риск исчезновения в природе (IUCN: EN - а, Ь, с)), P. cirrhiflora Juss. (высоко декоративный вид) и P. incaniata L. (лекарственный вид). Для введения в культуру in vitro использовали сегменты стебля с 1 -2 латеральными почками. Изучали способность экспланта к регенерации в зависимости от локализации на побеге и сроков изоляции. Для предварительного обеззараживания эксплантов использовали прививку интактного материала вприклад на близкородственные виды в культуре in vivo. В качестве подвоев были отобраны Р. nitida Kunth, Р. caerulea L., P. edulis Sims, P. tripartita var. molissima (Kunth) Holm-Niels. & P. J0rg., P. laurifolia L. и P. incarnata, обладающие антибактериальной и антимикотической активностью (Nicolls, 1970; Birner, Nicolls, 1973; Nicolls et. al., 1973; Bendini et al„ 2006; Mohanasundari et al., 2007; Doss et. al„ 2008; Mondall et al„ 2009).

На стадии пролиферации применяли минеральную основу питательной среды Мурасиге-Скуга (MC) (Murashige, Skoog, 1962), а также изучали влияние минеральных основ сред Монтейро (MSM) (Monteiro et. al., 2000) и WPM (Lloyd, McCown, 1980). В качестве регуляторов роста в среду MC добавляли: Мб-(2-изопентил)аденин (2ip - 1 мг/л) в сочетании с индолил-3-уксусной кислотой (ИУК 0,1 мг/л); 6-бензиламинопурин (6-БАП - 0,2-2,0 мг/л) и кинетин (К-0,5-2,0 мг/л). На этапе укоренения изучали действие ИУК, yS-индолил-З-масляной кислоты (ИМК) в концентрациях от 0,1 до 1,0 мг/л. При микроклонировании подсчитывали число междоузлий, высоту микропобегов и коэффициент размножения. Продолжительность каждого субкультивирования подбирали индивидуально для каждого вида. Растения культивировали при температуре 24-26 °С, относительной влажности воздуха 60-70 %, 16-ти часовом фотопериоде и освещенности 2-3 тыс. люкс. Адаптацию регенерантов проводили по стандартной методике (Бутенко, 1999).

В процессе исследований измеряли и рассчитывали следующие показатели: длину побегов, число междоузлий, процент укорененных, длину корней, коэффициент размножения. Математическую обработку данных проводили стандартными методами (Доспехов, 1985) с использованием пакета программ Statistica 6.0 и Excel 7.0.

Объектами изучения in vivo послужили 80 видов тропических и субтропических пассифлор, интродуцированных в Фондовой оранжерее ГБС им. Н.В.Цицина РАН из естественны популяций или полученных из европейских питомников. Растения содержали в оранжереях с тропическим температурным режимом (зимняя ночная температура 18-20°С, относительная влажность 70-90%), при естественной освещённости на широте Москвы. Фенологические наблюдения проводили на протяжении 4

лет (2009-2013). При обработке фенологических данных придерживались методики Г.Н. Зайцева (1974).

Анализ анатомических характеристик привитых растений проводили на поперечных срезах. Оценку степени устойчивости видов и сортов пассифлор к южной галловой нематоде (M. incognita) проводили в два этапа. На первом этапе использовали естественный фон заражения оранжереи, оценивая степень поражения 65 коллекционных экземпляров, возраст которых составлял от одного года до четырёх лет. Вторую оценку проводили на искусственно созданном инвазионном фоне, при нагрузке 3-5 личинок нематоды на 1 г прикорневой почвы. Проверку на заражение корневой системы проводили спустя 2,5 месяца, что соответствует примерно трём поколениям М. incognita.

Степень устойчивости образцов определяли по 4-балльной шкале (Методические указания..., 1982). Процент инфицирования, средний балл и индекс устойчивости поражённых растений определяли по формулам:

р (процент поражения) = где п - число поражённых растений, N -

общее число учтённых растений;

И (средний балл поражённых растений) = --, где ПахЬ — Сумма

произведений числа растений (а) на балл поражения (b), п - число пораженных растений;

НУ (индексустойчивости) = (1 - X Ю0, где ПахЬ - сума произведений

числа растений (а) на балл поражения (b), N - общее число учтённых растений, 4 - наивысший балл поражённых растений.

Для изучения родственных связей между видами Passiflora, был использован межгенный спейсер trnH-psbA хлоропластного генома. При выделении ДНК использовали модифицированный СТАВ-метод (Doyle, Doyle, 1987).

Амплификацию межгенного спейсера trnH-psbA проводили с использованием прямого и обратного праймеров (Hamilton, 1999). Секвенирование (Sanger et. al., 1977) производилась на базе ИПЭЭ РАН и ЗАО «СИНТОЛ» Выравнивание последовательностей проводили вручную с помощью программ BioEdit и ClustalW, входящих в пакет программы MEGA 4 (Tamura et al., 2007). Анализ матрицы данных проводили с помощью метода Байеса в пакете программ Mr. Bayes 3.1 (Huelsenbeck, Ronquist, 2001). Проводили от 300000 до 500000 репликаций по методу Монте-Карло до получения стандартного отклонения в пределах 0.01.

Глава 3. Введение пассифлор в культуру in vitro

Для экспериментальных видов (P. cirrhiflora, P. incarnata и P. arbelaezii) были разработаны протоколы микроклонального размножения, включающие следующие этапы: стерилизация и предварительное оздоровление интактного материала с помощью прививки в условиях in vivo, введение в культуру in vitro, индукция развития латеральных почек, укоренение и адаптация.

Показано, что реализация морфогенетического потенциала пассифлор in vitro обусловлена видовыми особенностями, происхождением и сроками изоляции экспланта, составом питательной среды и условиями культивирования.

3.1. Изолирование н стерилизация первичных эксплантов

Основная задача первого этапа введения растений в культуру in vitro -получение растений-регенерантов свободных от грибковой и бактериальной инфекции при сохранении высокой жизнеспособности эксплантов и их активного роста.

Оптимальным стерилизующим агентом для P. incarnata был 7% р-р гипохлорита Na при экспозиции 10 мин., а выход стерильных эксплантов составил 74 % (Табл. 1). Для P. arbelaezii наилучшие показатели были достигнуты при тех же режимах стерилизации, а выход жизнеспособных эксплантов составил 9%, для P. cirrhiflora лучшие результаты были достигнуты при обработке 5% р-ром гипохлорита Na и экспозиции 12 мин., при этом выход жизнеспособных эксплантов составил 13%. Низкий процент стерильных эксплантов P. arbelaezii и Р. cirrhiflora связан с сильной эндофитной контаминацией этих видов. Известно, что тропические растения, в особенности, имеющие лиановидную жизненную форму, характеризуются большим диаметром проводящих сосудов, что приводит к высокому уровню эндогенной инфекции (Putz, Mooney, 1991; Черевченко и др., 2008). Увеличение концентрации стерилизующего агента приводило к некрозу пазушных почек у всех экспериментальных видов.

Таблица 1.

Выход стерильных эксплантов в зависимости от режимов стерилизации

Стерилизующие вещества и режимы стерилизации Выход стерильных эксплантов, %

Р. arbelaezii Р. cirrhiflora Р. incarnata

Сулема 0,1 %, 10 мин. 0 0 53±6

Сулема 0,1%, 15 мин. 0 5±1 61±7

Гипохлорит натрия 3%, 10 мин. 0 11±3 43±7

Гипохлорит натрия 5%, 10 мин. 5±3 12±3 62±9

Гипохлорит натрия 5%, 12 мин. 6±2 13±3 64±8

Гипохлорит натрия 7%, 10 мин. 9±3 9±2 74±7

Гипохлорит натрия 7%, 12 мин. 5 ±2 8±2 55±6

Хлорамин, 5%, 5 мин. 0 5±1 63 ±8

Хлорамин, 5%, 10 мин. 5±2 7 ±2 51 ±7

Для увеличения процента выхода стерильных эксплантов Р. агЬеІаеііі и Р. сіггігі/іога в питательную среду добавляли хемомицин и тетрациклин (Табл. 2).

Таблица 2.

Эффективность получения стерильной культуры и органогенез почек Р. агЬеІаегіі и Р. сіггігі/іога (стерилизация 7% р-р гипохлорита Ыа, 10 мин. и 5%

р-р гипохлорита Na. 12 мин, соответственно)

Антибиотик в питательной среде, мг/л Вид

P. arbelaezii P. cirrhiflora

Выход стерильных эксплантов, % Органогенез. % Выход стерильных эксплантов, % Органогенез. %

Хемомицин 0,25 30±2 5±2 30±2 6±2

Хемомицин 0,5 34+5 6±2 37±3 5±2

Тетрациклин 200 18±3 41±3 23±4 28±6

Тетрациклин 400 23±2 38±7 30±3 26±4

Тетрациклин 900 58±3 24±3 38±2 13±2

Без антибиотика (контроль) 10+2 88±2 13+3 85±4

Установлено, что добавление в среду 400 мг/л тетрациклина позволило повысить процент стерильных эксплантов до 23% у P. arbelaezii и до 30% у Р. cirrhiflora, что дало повышение выхода стерильных эксплантов на 13% и 17% соответственно по сравнению с контролем. При этом органогенез стерильных почек составил 38% и 26% соответственно.

Изучено влияние типа экспланта на регенерационный потенциал в культуре in vitro. На стадии пролиферации использовали метод развития существующих меристем, который позволяет с большей надёжностью ликвидировать самоклональную изменчивость (Высоцкий, 1998; Долгих, 2005).

Изучено влияние сроков изоляции на жизнеспособность эксплантов. Показано, что хорошая приживаемость эксплантов с марта по август характерна для всех трёх экспериментальных видов.

3.2. Клоналыюе мнкроразмножение пассифлор

При отборе эксплантов пассифлор выделяли три зоны растущего побега: верхнюю - от апекса до первой полностью раскрытой листовой пластинки, среднюю - от первой раскрытой листовой пластинки до полностью сформированного листа с функционирующими нектарниками и нижнюю -более старый участок стебля с полностью сформированными листьями и почками. Вычлененные черенки из средней зоны побега всех трёх видов показали высокую эффективность побегообразования (76%, 84% и 87%). У Р. cirrhiflora не было выявлено статистически значимых различий между зонами локализации эксплантов по числу почек, тронувшихся в рост. Высокий процент проснувшихся почек из верхней зоны побега наблюдали у

P. incarnata (79%), а экспланты из нижней зоны побега дали хорошие результаты у P. arbelaezii (86%).

3.3. Влияние регуляторов роста и минерального состава питательной среды на коэффициент размножения

Добавление различных регуляторов роста в среду МС коррелировало с таксономической принадлежностью видов. У близкородственных видов Р. arbelaezii и P. cirrhiflora из подрода Deidamioides (Harms) Killip максимальный коэффициент размножения наблюдали на среде дополненной БАЛ. У P. arbelaezii коэффициент размножения 3,3 был получен при концентрации БАЛ 0,2 мг/л. а у P. cirrhiflora коэффициент размножения 2,5 был получен при концентрации БАЛ 0,5 мг/л. Максимальный коэффициент размножения у P. incarnata составил 3,4 при добавлении в среду МС 2-ip 1,0 мг/л в сочетании с ИУК 0,1 мг/л (Рис. 1). При этом происходило образование хорошо сформированных микропобегов. На остальных вариантах питательных сред показатели коэффициента размножения были в 2 - 5 раз ниже.

шР, arbelaezii иР, cirrhiflora □ P. incarnata

Рис. 1. Влияние гормонального состава питательной среды на коэффициент размножения пассифлор. Условные обозначения: 1 - БАЛ - 0,2 мг/л; 2 - БАП 0,5 мг/л; 3 - БАП -1,0 мг/л; 4 - БАП - 2,0 мг/л; 5 - Кинетин 0,5 мг/л; 6 - Кинетин 1,0 миг/л; 7 - Кинетин 1,5 мг/л; 9 - 2ір - 1,0 мг/л; 10 - 2 ір 1,0 мг/л + ИУК ОД мг/л; 11 - 2 ір 1,5 мг/л + ИУК 0,1 мг/л.

Наряду с гормонами, существенное влияние на развитие эксплантов оказывает состав минеральной среды.

j 4--------p- > ; -----

I; ~_Л]_~- N zrl" П

MC IN/ISM WPM

Питательные среды

I Ш P. arbeiaezii Ш P. cirrhifiora □ P. incarnata |

Рис. 2. Коэффициент размножения микропобегов пассифлор в зависимости от минеральной основы питательной среды

Из трёх испытанных нами сред наиболее эффективной оказалась среда MSM, где коэффициенты размножения составили 4,4 у P. arbeiaezii, 3,7 у Р. cirrhiflora и 4,1 у P. incarnata. При этом происходило образование хорошо сформированных микропобегов (Рис. 2).

3.4. Получение интактного материала пассифлор с помощью прививки

Полученные из литературных источников данные о естественных антимикотических и антибактериальных свойствах пассифлор (Mohanasundari et al., 2007; Doss et. al., 2008; Mondall et al., 2009) позволили отобрать из числа коллекционных растений несколько видов, устойчивых к эндофитной контаминации. Их использовали в качестве подвоев при разработке новой технологии оздоровления интактного материала.

Для получения подвоев с естественной антимикотической и антибактериальной активностью использовали укорененные черенки Р. nitida, Р. caerulea L., P. edulis Sims, P. tripartita var. mollissima (Kunth) Holm-Niels. & P. J0rg., P. laurifolia L. и P. incarnata L. с 4-5 хорошо развитыми листьями. Прививку инфицированного интактного материала на иммунные подвои осуществляли в культуре in vivo способом вприклад.

Таблица 3.

Морфометрические показатели привоя Р. arbelaezii на разные подвои __спустя 90 суток после прививки _

Параметры Подвой Корнесобственные P. arbeiaezii (контроль)

Р. caerulea Р. edulis Р. tripartita var. mollissima P. incarnata

Длина побега, см 25,4±2,3 26,2±2,1 42,2±1,5 46,2±1,4 47,2±0,6

Количество почек, шт 21,1+0,9 25,3+2,1 39,7+0,9 41,4±1,8 38.8±2,1

С целью подбора оптимальной прививочной комбинации изучено влияние подвоев на развитие прививаемых интактных растений и выход оздоровленных эксплантов.

Максимальный выход эксплантов (эксплант - сегмент стебля с 1 латеральной почкой) с привитых интактных растений после выполнения прививочной операции в культуре in vivo наблюдали на подвоях P. incarnata и Р. tripartita var. mollissima (Табл. 3). Подвои P. laurifolia и Р. nitida оказались непригодны для успешного проведения прививочных операций (пробудившихся почек не было отмечено ни у одного из прививаемых видов), вероятно, вследствие филогенетической удаленности привоя и подвоя, относящихся к разным подродам.

Во всех вариантах опыта экспланты, полученные с привитых растений, оказались в 2-3 раза менее инфицированными по сравнению с эксплантами, вычлененными из побегов корнесобственных экземпляров (Рис. 3). Оптимальным режимом стерилизации для P. arbelaezii оказался 5% р-р гипохлорита Na с экспозицией 10 мин. Наиболее низкий процент заражения выявлен у эксплантов. полученных с подвоев P. edulis (91%) и Р. incarnata

(90%).

55 100

ш о 90

X 80

Є X 60

m к 50

л X 40

л ^ 30

s а. 20

41 ь 10

з еа

Режимы стерилизации

1} Корне собственные (контроль)

S Привитые интактные растения {подвой P. incarnats}

□ Привитые интактные растения (подвой P. caeruiea)

□ Привтые интактные растения (подвой P. edulis)

■ Привитые интактные растения (подвой P. tripartita var. molli ssima)

Рис.3. Выход оздоровленных эксплантов Р. агЬе1ае1И в зависимости от типа подвоя и стерилизующего вещества. Условные обозначения: 1 - сулема 0,1%, 10 мин.; 2- сулема 0.1%, 15 мин.; 3 - гипохлорит натрия 3%, 10 мин.; 4 -гипохлорит натрия 5%, 10 мин.; 5 - гипохлорит натрия 5%, 12 мин.; 6 -гипохлорит натрия 7%, 10 мин.; 7 - гипохлорит натрия 7%, 12 мин.; 8 -хлорамин, 5%, 5 мин.; 9 - хлорамин, 5%, 10 мин.

Таким образом, метод прививки на устойчивые к эндогенной инфекции подвои может быть использован при оздоровлении интактного материала пассифлор. А полученная свободная от эндофитной контаминации культура позволила более точно подобрать режим стерилизации.

В культуре in vitro коэффициент размножения эксплантов полученных от привитых и корнесобственных растений различался. На первом этапе культивирования экспланты полученные от корнесобственных растений опережали в своём развитии экспланты полученные от привитых растений. Однако через 2 пассажа коэффициенты выравнивались.

О —..............—i---------------------------------------------

1 г 3 4 5 6

Число пассажей

Рис. 3 Влияние прививки на показатели коэффициента размножения и его изменение в зависимости числа субкультивирований P. arbelaezii

3.5. Укоренение in vitro и адаптация растений-регенерантов к условиям in vivo

Установлено, что концентрация и тип ауксина оказывают разное действие на экспериментальные виды пассифлор. У P. arbelaezii корни количество корней было максимальным при концентрации ИУК Змг/л, у Р. cirrhiflora при ИУК 3,0 мг/л и у P. incamata - ИМК 3,0 мг/л. Добавление к среде ИМК снижало количество корней, у микропобегов Р. cirrhiflora во всех вариантах опыта.

« 4

ИУК 1.0 ИУК2,0 «УКЗ.О ИМК1.0 ИМК2,0 ИМКЗ.О ИУК0.3 +

ИМК0.2

ш Р. arbeíaezü Ш P. cirrhiflora se Р. incamata

Концентрация ауксина, мг/л

Рис. 4 Количество корней на микропобег (шт) у пассифлор на среде Уг МС через 30 дней культивирования.

Для успешной адаптации растений-регенерантов пассифлор к условиям in vivo использовали стерильный субстрат, состоящий из смеси верхового (рыжего) торфа, песка и хвойной земли в соотношении 1:1:1. Приживаемость растений-регенерантов всех экспериментальных видов составила 83-95%.

Глава 4. Введение пассифлор в культуру in vivo

В 4 главе обобщены результаты четырёхлетних фенологических наблюдений, приведены эколого-географические характеристики произрастания видов в природе и выделены группы по климатическим режимам, изучена динамика роста вегетативных и генеративных побегов, произведена оценка хозяйственно-полезных признаков.

4.1. Общая характеристика коллекции

В отделе тропических и субтропических растений ГБС РАН собрана самая большая в России коллекция природных видов пассифлор из различных районов тропиков и субтропиков земного шара. Весной 2008 года она начитывала 7 видов и 1 сорт. За время с 2009 по 2013 год нам удалось увеличить её до 155 видов и 31 сорта. Из них 34,2% (53) вида собраны в местах естественного произрастания во время экспедиций, остальные получены по обмену между ботаническими садами, европейскими питомниками, международным обществом пассифлористов (Passiflora Society International) в виде черенков или семян. Кроме того, культивируются 2 сорта отечественной, 5 украинской, 3 английской, 9 голландской и 4 немецкой селекции. 33 вида в коллекции относятся к группе исчезающих видов 1UCN Red List, среди них 18 видов имеют высокий риск исчезновения в дикой природе (Vulnerable), 6 видов - очень высокий риск исчезновения (Endangered) и 5 видов - экстремально высокий риск исчезновения в дикой природе (Critically Endangered). К категории вероятного риска исчезновения (Near Threatened) относятся 4 вида.

Декоративно цветущие пассифлоры представлены 75 видами, декоративнолиственные 58 видами. Среди лекарственных - три вида включённые в мировую фармокопею - P. alata Curtis, P. edulis и P. incarnata. Плодовые виды также широко представлены (27).

4.2. Особенности адаптации пассифлор к оранжерейной культуре

Из 186 таксонов генеративного возрастного состояния достигают 80 видов. Из них только 14 проходят полный жизненный цикл, завершающийся образованием плодов. На основании фенологических наблюдений в 20092013 гг. по характеру цветения все коллекционные виды пассифлор были подразделены на 10 ритмогрупп: ранневесенне-позднеосенняя. поздевесенне-раннеосенняя, раннелетне-среднелетняя, позднелетне-раннеосенняя, осенняя, зимняя, экзогенно-периодичная, эндогенно периодичная), постоянная и спонтанная. В условиях интродукции экспериментальный вид P. cirrhiflora не цветёт. P. arbelaezii характеризуется позднелетне-раннеосенним типом цветения, а P. incarnata поздевесенне-раннеосенним типом цветения.

На основе наблюдений за динамикой побегообразования были выделены следующие ритмогруппы:

1. прегенеративный - ростовые процессы протекают интенсивно до цветения, ослабевая с наступлением генеративной фазы (63 вида, в том числе P. edulis и P. incarnata и др.);

2. пролонгированный - интенсивность роста вегетативных побегов не замедляется во время цветения (5 видов, в том числе P. arbelaezii, Р. cirrhiflora и др.);

3. эфемероидный - прохождение вегетативных и генеративных и фаз происходит за короткий промежуток времени (1 вид - P. pittierii Mast.);

4. периодический - фазы роста и цветения чётко чередуются (1 вид - Р. racemosa Brot.);

5. спонтанный - этот тип наблюдается только у видов со спонтанным ритмом цветения («Big bang flowering»). Рост побегов сопряжён с окончанием генеративной фазы - (10 видов - P. choconiana S. Watson, P. garckei Mast., P. lehmanii Mast, и др.).

Пролонгированное развитие лиановидного стебля пассифлор является причиной того, что при снятии апикального доминирования латеральные почки трогаются в рост независимо от внутренних ритмов развития растений. Поэтому оптимальным срокам отбора эксплантов является не начало естественного побегообразования, а период с максимальной освещённостью и продолжительностью дня (весна-лето). При необходимости отбор эксплантов в оранжерейных условиях можно проводить и в менее благоприятные сезоны в течение года.

Глава 5. Оценка устойчивости пассифлор к галловым нематодам Сложность культивирования пассифлор ex situ связана с биотическими факторами. В частности, нами были выделены две причины. Первой причиной, как было показано выше, является сильная эндогенная инфицированность интактных побегов, что затрудняет введение пассифлор, в особенности редких и исчезающих видов, в культуру ш vitro, вторая причина связана с восприимчивостью корневых систем пассифлор к галловым нематодам, поражение которыми резко ослабляет взрослые растения в оранжерейной культуре.

5.1. Восприимчивость пассифлор к галловым нематодам У подавляющего большинства видов коллекционных пассифлор в Фондовой оранжерее было обнаружено сильное поражение корневых систем галловой нематодой, которая по морфометрическим параметрам и характерному рисунку анально-вульварной пластинки самки была идентифицирована как южная галловая нематода Meloidogyne incognita.

С целью выявления устойчивых к галловой нематоде видов нами были проведены испытания 65 образцов пассифлор. Из них 54 образца (51 вид и 3 сорта) оказались в высокой степени восприимчивы к нематоде. Виды Passiflora guatemalensis Wats., P. triloba Ruiz & Pav. ex DC. и P. edulis var.

flavicarpa'IAC-273' были относительно устойчивы, т. е. наблюдались единичные мелкие галлы первого поколения, что соответствовало поражению в 1 балл. Развитие нематоды на таких видах проходило медленно (с меньшим количеством поколений), самки имели удлиненную форму и меньшие размеры, а их яйцевые мешки содержали значительно меньше яиц. Восемь видов пассифлор (P. arbelaezii, P. ferruginea Mast., Р. truncata Regel, P. holosericea L., P. choconiana, P. eichleriana Mast., P. laurifolia и P. lobata (Killip) Hutchinson ex Mac-Dougal) показали абсолютную устойчивость к этому виду нематоды (галлы не были обнаружены). Но у отдельных видов пассифлор (P. eichleriana, P. laurifolia и P. lobata) на небольшом участке корня формировались нетипичные для поражения этим видом нематоды одиночные галлы. Они были изолированы друг от друга здоровьми участками корня, на их поверхности не наблюдалось яйцевых мешков. Самки нематод в таких галлах развивались медленнее. Возможно, это было связано с локальной потерей иммунитета, поскольку такой характер поражения часто наблюдается на устойчивых к нематоде растениях (например, на томатах) под действием внешних неблагоприятных факторов. Было показано, что все устойчивые виды пассифлор могут быть использованы в качестве подвоев для восприимчивых видов. В поиске надёжных методов поддержания устойчивой культуры пассифлор в условиях ex situ, нами был подобран оптимальный способ прививки на устойчивые к галловым нематодам виды пассифлор.

5.2. Влияние способа прививки и типа подвоя на рост и развитие некоторых видов и сортов пассифлор

Высокая регенерационная активность тканей лиан объясняется особенностями их экологии (Putz, Mooney, 1991). Нами было исследовано влияние способа прививки на приживаемость, рост и развитие плодового сорта P. edulis 'Frederick' (маракуйи). Рассмотрены особенности анатомического строения стебля и дана сравнительная характеристика анатомии двух типов прививок. Были опробованы следующие варианты прививки: копулировка вприклад и улучшенная копулировка с двумя язычками.

Установлено, что приживаемость прививок способом копулировки вприклад была на 13% выше, чем способом улучшенной копулировки с двумя язычками. Способы прививки оказали существенное влияние на морфом етрические показатели привоев. Растения, привитые способом вприклад. превосходили растения, привитые способом улучшенной копулировки по длине стебля, количеству листьев и их площади на 110%, 62% и 196% соответственно. Способ прививки оказал существенное влияние на прохождение генеративной фазы. Так, растения, привитые копулировкой вприклад, зацветали на 1,5 недели раньше, чем при прививке улучшенной копулировкой.

Таким образом, была разработана методика (подобран подвой и выявлен способ прививки), обеспечивающая получение растений пассифлор, устойчивых к галловой нематоде в оранжерейных условиях.

Глава 6. Филогенетический анализ

Проанализирована структура коллекции пассифлор ГБС РАН, дана таксономическая характеристика коллекции, показано, что коллекционный генофонд тропических субтропических пассифлор является уникальным поставщиком биологического материала для фундаментальных научных исследований в области систематики рода.

Рис. 5. Таксономическая структура коллекции пассифлор

6.1. Таксономическая характеристика коллекции

В настоящее время коллекция пассифлор Главного ботанического сада РАН отображает практически все основные систематические группы (рис. 5), выделенные в последней внутриродовой классификации рода (Feuillet, MacDougal, 2003; Krosnick et al., 2009). Среди пяти подродов наиболее полно представлены Passiflora (42%) и Decaloba (DC.) Rchb. (45%). Подроды Deidamioides (Harms) Killip, Astrophea (DC.) Mast, и Tetrapathea (DC.) P. S. Green представлены 4, 3 и 1 видами соответственно. Секции Decaloba (DC.) J. M. MacDougal & Feuillet, Granadillastrum Triana & Planch, и Laurifolia Killip ex Cervi - самые многочисленные в коллекции и представлены 34, 26 и 16 видами соответственно. Секции Leptopoda Killip ex Feuillet & Cremers, Polyanthea DC., Tetrastylis (Barb. Rodr.) Harms, Calopathanthus Harms, Tacsonia (Juss.) Feuillet & J. M. MacDougal и Manicata (Harms) Feuillet & J. M. MacDougal представлены каждая 1 видом.

В коллекции также представлены виды из Старого Света - все 4 австралийских вида из секции Disemina (Labill.) J. M. MacDougal & Feuillet и 2 из 22 видов южно-азиатской секции Octandranthus. Секция Tacsonioides DC.

и монотипные секции Calopathanthus и Polyanthea представлены в коллекции полностью. Исчерпывающе представлены секции Quadrangulares, Laurifoliae, Passiflora, Hahniopathanthus (Harms) J. M. MacDougal & Feuillet, Leplopoda и Tetrastylis (71,4%; 60%; 53.8%; 60%; 50% и 50% соответственно). Не смотря на то, что секция Decaloba является самой многочисленной по количеству видов в коллекции, она составляет всего 29.8% от общего числа известных видов в этой секции.

Благодаря тому, что в коллекции представлены практически все секции, имеются виды ранее не включённые в исследование нуклеотидных последовательностей ДНК (22 вида), возможности регулярного получения свежего генетического материала от живых коллекционных растений пассифлор появилась возможность уточнить внутриродовые отношения с использованием дополнительных участков генома и протестировать монофилею сомнительных таксономических групп пассифлор.

6.2. Характеристика исследуемых участков генома

Выравнивание включало 60 образцов, общая длина его составила 342

пар нуклеотидов, 67 позиций были потенциально филогенетически информативными. Анализ проводили в программе NONA с использованием оболочки Winclada методом максимальной экономии (с использованием метода island hop) с параметрами по-умолчанию. Получено 48 наиболее коротких деревьев длиной L=153 с индексом состоятельности Ci=66 и индексом удерживаемости Ri=85. На рисунке 6 приведено консенсусное дерево, полученное методом majority rule, с указанными над ветвями индексами бутстрепа.

6.3. Филогенетические связи видов рода Passiflora

В ходе проведённого анализа были внесены уточнения и дополнения в разработанную внутриродовую классификацию пассифлор. На дереве все исследуемые виды образуют несколько крупных клад, отношения между которыми оказались не полностью разрешенными. Р. cirrh.ifl.ora, во всех предыдущих исследованиях оказывавшаяся сестринской по отношению к остальным видам рода, была использована в качестве внешней группы. Два вида традиционно относимые к подроду Decaloba (Р. megacoriacea и Р. guatemalensis) образовали кладу, сестринскую по отношению к остальным включенным в анализ видам. Все остальные виды образовали общую политомию, в которой выделяются следующие клады, отношения между которыми остались не разрешенными.

Два образца Р. arbelaezii сгруппировались вместе и образовали самостоятельную кладу. Виды секции Dysosmia также образовали отдельную кладу с числом хромосом 2п=12, в то время как в предыдущих исследованиях последовательностей хпДНК виды этой группы оказывались в общей кладе с видами подрода Passiflora. Секция Dysosmia разделяется на две сестринские клады. Все образцы двух сборов Р. quadrangularis из Коста-Рики на дереве образуют одну кладу.

Еще одну кладу со 100% поддержкой образуют виды подрода Decaloba. Оставшиеся виды, все относящиеся к подроду Passiflora, образуют общую кладу, разделенную на две сестринские клады. Первая включает виды секций Stipulata и Calopathanthus, вторая - Passiflora, Tiliifolia, Laurifolia и Quadrangularis. Монотипная секция Calopathantus, состоящая из единственного вида Р. racemosa, оказывается сестринской для Р. subrotimda. Р. cincinnata оказывается сестринской для серии Laurifoliae, тогда как по морфологическим признакам является частью секции Passiflora. Секции Coccínea и Passiflora формируют две сестринские клады.

Межвидовая изменчивость межгенного спейсера оказалась высокой, поэтому соответствующие узлы на филогенетическом дереве имеют высокие бутстреп-индексы.

Подроды Deidamioides образует две отдельные клады, включающие Р. cirrhiflora и Р. arbelaezii, что согласуется с деревом построенным по объединённым данным на основе nrITS, ncpG.S1, tmL-F и ndhF (Krosnick et. al., 2013). Для Р. cirrhiflora показана вариабельность по trnH-psbA.

Полученные молекулярно-филогенетическиие данные могут быть использованы в практических целях при интродукции видов рода Passiflora в условиях защшцённого грунта. В частности, уточнённый статус надсекций и секций позволил выявить связь между секционным делением рода и устойчивостью представителей разных секций к южной галловой нематоде.

Показано, что все представители австралийской секции Disemina (Labill.) J. М. MacDougal & Feuillet (Р. aurantia, Р. cinnabarina, Р. herbertiana и Р. samoensis) сильно восприимчивы к Meloidogyne incógnita. Столь же высокая степень восприимчивости оказалась у всех изученных нами видов, относящихся к секциям Decaloba DC. (Р boenderi, Р tulae, Р. cuprea, Р cuspidifolia, Р. vespertillio, Р. lyra, Р perfoliata, Р. mexicana, Р. smilacifolia, Р. murucuja и Р. ornithoura) и Xerogona (Raf.) Killip (Р. capsularis, Р. rubra и Р. sanguinolenta), надсекциям Coccínea Feuillet & J. M. MacDougal (Р. miniatá) и Tacsonia (Juss.) Feuillet & J. M. MacDougal (P. tripartita var. mollissima и Р. manicata). Три вида надсекции Bryonioides (Harms) J. M. MacDougal & Feuillet (P. bryonioides, P. karwinskii и Р. morifolia), приуроченные к ксерофильным лесам, также показали высокую восприимчивость, в то время, как Р. lobata, произрастающая во влажных тропических лесах, проявила высокую устойчивость. Высокие показатели устойчивости были у всех видов надсекции Multiflora (Small) J. М. MacDougal & Feuillet (Р. truncata и Р. holosericeá) и секции Tryphostemmatoides Harms (Р. arbelaezii), а надсекции Auriculata J. М. MacDougal & Feuillet, Passiflora, Granadillastrum Triana & Planch. Feuillet & J. M. MacDougal., Laurifolia (Cervi) Feuillet & J. M. MacDougal (серии Laurifoliae Killip ex Cervi и Tiliifoliae Feuillet & J. M. MacDougal) включали по одному виду, характеризующемуся высокой степенью устойчивости (Р. ferrujinea, Р. edulis var. flavicarpa'IAC-273', Р.

eichleriana, P. laurifolia и P. triloba соответственно), в то время как остальные

виды этих групп были, напротив, высоко восприимчивы.

ВЫВОДЫ

1. Тропикогенный род Passiflora, включая декоративные, лекарственные и плодовые виды, характеризуется существенным ресурсным потенциалом для введения в культуру защищенного грунта.

2. Впервые в культуру in vitro введены три вида пассифлор - P. arbelaezii, Р. cirrhiflora. и P. incarnata. Выявлено, что оптимальной для размножения Р. arbelaezii является питательная среда MC + БАП (0,2 мг/л); для Р. cirrhiflora - MC + БАП (0,5 мг/л), для Р. incarnata - MC + 2 ip 1,0 мг/л + ИУК0,1 мг/л.

3. Разработан метод снижения эндофитной контаминации интактных растений путём прививки на резистентные к эндогенной микрофлоре виды Р. incarnata и P. tripartita var. mollissima. Использование метода предварительной прививки является видоспецифичным, а его широкое применение ограничено небольшим числом близкородственных иммунных подвоев.

4. Установлено, что для экспериментальных видов оптимальным стерилизующим агентом является раствор гипохлорита натрия. Для Р. incarnata - концентрация 1% при экспозиции 10 мин., для P. arbelaezii -концентрация 5% при экспозиции 10 мин., для P. cirrhiflora -концентрация 7% при экспозиции 12 мин.

5. Абсолютно устойчивые к южной галловой нематоде Passiflora arbelaezii, P. edulis var. flavicarpa'IAC-273', P. ferruginea, P. truncata, P. holosericea, P. choconiana, P. eichleriana, P. laurifolia и P. lobata могут быть использованы в качестве подвоя для восприимчивых к этому вредителю видов пассифлор.

6. Оптимальным способом прививки для пассифлор с пустотелым лиановидным стеблем является копулировка вприклад.

7. Секвенированы последовательности trnH-psbA у 60 представителей рода Passiflora. Подрод Passiflora образует две хорошо поддержанные сестринские клады. Первая включает виды секций Stipulate! и Calopathanthus, вторая - Passiflora, Tüiifolia, Laurifolia и Quadrangularis. Положение секции Dysosmia остаётся неопредёлённым.

Список опубликованных работ

1. Кириллов, A.A. Предпосылки создания в России национальной коллекции страстоцветов и её сохранение в культуре ex situ / A.A. Кириллов, Г.Л. Коломейцева //Материалы конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии», Томск,- 2010.- С. 37-39.

2. Кириллов, A.A. Коллекция рода Passiflora L. Фондовой оранжереи Главного ботанического сада РАН / A.A. Кириллов // Материалы Всероссийской научной конференции «Биоморфологические чтения к 150-летию со дня рождения X. Раункиера», Киров,- 2010 - С. 330-342.

3. Кириллов, A.A. Образование ариллусов у Passiflora L. в связи со способом опыления / A.A. Кириллов, Г.Л. Коломейцева // Науч. ведомости Белгор. гос. ун-та. Естественные науки,- 2011.- № 3.- Вып. 14/1,- С. 280-283.

4. Кириллов, A.A. Скрининг образцов коллекции пассифлоры на устойчивость к галловым нематодам/ A.A. Кириллов, В.Н, Чижов // Гавриш-2012. №3,- С. 34-36.

5. Кръстев, М.Т. Анатомия прививки представителей рода Passiflora L. / М.Т. Кръстев, A.A. Кириллов, С.А. Протас // Бюл. Гл. ботан. сада - 2013. - Т. 199,- № 2,- С. 38-42.

6. Кириллов, A.A. Особенности плодообразования у некоторых видов Passiflora L. в оранжерейных условиях / A.A. Кириллов // Материалы Международной научной конференции "Дендрология, цветоводство и садово-парковое строительство", посвященное 200-летию НБС, Ялта.- 2012 - С. 59.

7. Kirillov, A.A. Passiflora collection of the Main Botanical Garden, Russia / A.A. Kirillov // Passiflora.- 2013,- V.23.- №1,- P. 3-13.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Формат 60x84 1/16 Усл. печ. л.1,4. Тираж 100 экз. Зак. 547. Издательство РГАУ-МСХА 127550, Москва, Тимирязевская ул., 44 Тел.: (499) 977-00-12, 977-26-90, 977-40-64

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кириллов, Алексей Александрович, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ГЛАВНЫЙ БОТАНИЧЕСКИЙ САД ИМ. Н.В.ЦИЦИНА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи УДК 602.7: 635.9:577.21

04201450614

КИРИЛЛОВ Алексей Александрович

ВВЕДЕНИЕ В КУЛЬТУРУ IN VITRO И IN VIVO ВИДОВ РОДА PASSIFLORA L.

Специальности 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнология)

03.00.05 - ботаника

Москва-2013

СОДЕРЖАНИЕ

Введение.......................................................................................3

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................8

1.1 История интродукции пассифлор................................................8

1.2 Особенности распространения и экологии представителей рода Passiflora.....................................................................................11

1.3 Ресурсный потенциал пассифлор в культуре................................16

1.4 Восприимчивость к галловой нематоде как проблема практической интродукции пассифлор в условия защищенного грунта.......................20

1.5 Использовании прививки в производстве маракуйи.......................22

1.6 Микроклональное размножение пассифлор.................................25

1.7 Систематика и молекулярная филогения пассифлор.......................35

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................35

ГЛАВА 3. ВВЕДЕНИЕ ПАССИФЛОР В КУЛЬТУРУ IN VITRO................46

3.1 Изолирование и стерилизация первичных эксплантов........................46

3.2 Клональное микроразмножение пассифлор.....................................49

3.3 Влияние регуляторов роста и минерального состава питательной среды на коэффициент размножения............................................................52

3.4 Получение интактного материала пассифлор с помощью прививки.....57

3.6 Укоренение in vitro и адаптация растений-регенерантов к условиям in vivo ................................................................................................62

ГЛАВА 4. ВВЕДЕНИЕ ПАССИФЛОР В КУЛЬТУРУ IN VIVO................64

4.1 Общая характеристика коллекции................................................64

4.2 Особенности адаптации пассифлор к оранжерейной культуре.............66

ГЛАВА 5. ОЦЕНКА УСТОЙЧИВОСТИ ПАССИФЛОР К ГАЛЛОВЫМ НЕМАТОДАМ........................................................................

5.1 Восприимчивость пассифлор к галловым нематодам........................69

5.2 Влияние способа прививки и типа подвоя на рост и развитие некоторых видов и сортов пассифлор.............................................................74

ГЛАВА 6. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ.....................................82

6.1 Таксономическая характеристика коллекции...................................82

6.2 Характеристика исследуемых участков генома...............................86

6.3 Филогенетические связи видов рода Passiflora................................87

ВЫВОДЫ...................................................................................91

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................94

ПРИЛОЖЕНИЕ.......................................................................... 120

ВВЕДЕНИЕ

Род Passiflora L. - крупнейший в семействе Passifloraceae и включает 575 видов (Jorgensen et al., 2012), распространенных, главным образом, в тропиках и субтропиках Нового Света, 22 вида происходят из Юго-Восточной Азии, Австралии и Океании. Почти все пассифлоры являются травянистыми или одревесневающими лазающими лианами, 10 видов представлены кустарниками и невысокими деревьями, ещё реже среди них встречаются однолетние травы (Killip, 1938; Feuillet, MacDougal, 2007). Род богат эндемичными редкими видами (Ocampo et al., 2010). Большой ресурсный потенциал рода Passiflora, включающего декоративные, плодовые и лекарственные виды, до настоящего времени полностью не раскрыт.

Крупные коллекционные фонды ботанических садов являются живым генным банком для выявления и отбора ресурсно-значимых видов растений, проведения биотехнологических работ в области микроклонального размножения и оздоровления, а также для длительного хранения генетического материала in vitro (Litz et al., 2005; Черевченко и др., 2008). Сегодня микроклональное размножение разработано для небольшого числа видов и сортов пассифлор (Faria, Segura, 1997; Alexandre et al, 2008; Pinto et al., 2010; Paikrao et al., 2012), в том числе, для плодовых сортов P. edulis Sims и красивоцветущих сортов P. 'Guglielmo Betto', Р. 'Manta P. x allardii Lynch, (Pipino et al., 2008, 2010; Braglia et al., 2009). Основные трудности введения в культуру in vitro связаны с сильной эндофитной контаминацией первичных эксплантов. Поиск приемов, позволяющих уменьшить заражение материнских растений и добиться стабильной стерильной культуры, является ключом к успешному культивированию и длительному хранению in vitro полезных и редких видов пассифлор.

В коллекционных фондах Главного ботанического сада РАН в настоящее время представлены 16 из 17 секций пассифлор (Kirillov, 2013), что даёт возможность использовать коллекционные растения для проведения таксономических исследований. Молекулярно-филогенетические работы, опубликованных за последние 10 лет (Muschner et al., 2003, 2012; Yockteng, Nadot, 2003; Hansen et al., 2006; Paikrao et al., 2010), с высокой степенью поддержки показали монофилетичность рода и подтвердили его деление на четыре подрода. Однако отношения на уровне отдельных секций и серий всё ещё остаются неясными.

Цель работы; Целью исследования является создание устойчивой культуры видов рода Passiflora in vitro и in vivo с использованием живого коллекционного фонда.

Были поставлены следующие задачи;

1. разработка протоколов клонального микроразмножения ресурсных видов;

2. изучение влияния подвоя на степень эндофитной контаминации интактных растений;

3. оптимизация биорегуляторов для разработки протоколов микроклонирования;

4. проведение скрининга видов и сортов пассифлор на устойчивость к галловой нематоде с отбором устойчивых форм и оптимизацией прививочных технологий;

5. уточнение внутриродовых отношений с использованием высоко вариабельного межгенного спейсера trnH-psbA на основе изучения коллекционного материала;

6. создание крупнейшей на территории России коллекции видов и сортов представителей рода Passiflora в условиях защищенного грунта и выявление связи между таксономической принадлежностью и устойчивостью к галловой нематоде.

развитие растений-регенерантов в стерильной культуре. Оптимизирована методика прививки пассифлор в связи с биоморфологическими особенностями лиановидного стебля. Определено влияние способа прививки и вида подвоя на прохождение фенологических фаз и на морфометрические показатели in vivo. Впервые в России создан банк ДНК пассифлор, представленный 168 образцами.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов, списка литературы, включающего 241 источника, в том числе 175 на иностранных языках и приложения. Работа изложена на 135 страницах текста, включая 15 таблиц и 25 рисунков.

Благодарности. Автор выражает искренние благодарности своему научному руководителю Г.Л. Коломейцевой за всестороннюю помощь в проведении исследования, а также О.И. Молкановой, И.Г. Мещерскому, И.В. Ширниной, И. А. Шанцеру, В.Н. Чижову, М.Т. Кръстеву и B.JI. Шелейковскому за ценные советы и помощь в работе. Также мои искренние благодарности Dr. J. MacDougal и Dr. J. Vanderplank за помощь в идентификации пассифлор. Отдельная благодарность моей семье и друзьям за помощь и понимание.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 История интродукции пассифлор

Первые сведения о культуре пассифлор (страстоцветов) теряются глубоко в доколумбовой эпохе развития Америки, о чём свидетельствуют археологические находки на территории США. Алгонкинские индейцы возделывали страстоцвет мясо-красный (Passiflora incarnata L.) ради съедобных плодов, а побеги употребляли в лечебных целях (Gremillion, 1989). Первое литературное упоминание о пассифлорах встречается в историко-географической рукописи Педро Сьезы Де Леона «Хроники Перу» (1553), где он даёт детальное описание плодов Р. ligularis Juss. и мест произрастания этого вида (Ulmer, MacDougal, 2004).

Е. Kugler, L. King (2004) отмечают, что уже с момента появления первых зарисовок цветков пассифлор в Европе «их описание стало переплетаться с религиозными и мистическими трактовками, так как различные части цветка фактически символизировали распятие Христа на кресте». Церковным учёным и секретарём мальтийского ордена Giacomo Bosio было составлено подробное описание цветка, где он отмечает элементы страданий в каждой части растения. Согласно его представлениям, тычинки были бичами, андрогинофор олицетворял колонну для бичевания, столбики пестиков символизировали гвозди, 5 кроваво-красных пятен у основания цветка были пятью ранами, 72 нити кроны были шипами на терновом венке, листья олицетворяли острые копья, а 30 нектарников на нижней поверхности листа означали тридцать серебряников, ради которых Иуда предал Христа. Считается, что такое толкование цветка послужило косвенным знаком испанским конкистадорам для обращения американских индейцев в католическую веру. Среди последующих работ встречаются и другие трактовки символики цветка. Предполагается, что в 1753 году Карл Линней, в своём знаменитом труде Species Plantarum, куда он включил 24 известных

тогда вида пассифлор, использовал слово 'Passiflora' («flos» - "цветок", «passio» - "страсть"), как неоспоримое название рода.

В культуре пассифлоры известны с 1612 года. Р. incarnata L. был первым видом пассифлоры, введённым в культуру в Париже (Ulmer, MacDougal, 2004). Чуть позже, в 1625 году, был интродуцирован Р. caerulea L., а за ним последовали Р.foetida L., Р. laurifolia L., Р. lutea L., Р. suberosa L. и другие виды.

Пассифлоры были чрезвычайно популярны в Викторианской Англии, после чего интерес к ним в значительной мере угас и возобновился только 90-х годах XX века, что подтверждается появлением обширной специализированной литературы и многочисленных дискуссионных онлайн групп. В 1992 году группой американских и европейских ботаников было организовано «Международное общество пассифлористов» (Passiflora Society International), работа которого направлена на популяризацию пассифлор в культуре, сохранение и распространение редких и исчезающих видов. На общей волне возрастающего интереса увеличилось и число энтузиастов, которые вводят в культивирование виды, привезённые из своих экспедиций (Ulmer, MacDougal, 2004). Нередко среди них оказываются и новые виды.

Прошло около 140 лет (1612) после того, как пассифлоры появились в Европе и о них узнали в России (Kirillov, 2013). Первое упоминание о пассифлорах, выращиваемых на территории Российской Империи, можно встретить в перечне растений Аптекарского огорода в Санкт-Петербурге, составленного в 1749 году огородником Девидом Бером в его отчёте для Медицинской канцелярии. С того момента и до 1793 года в каталогах оранжерейных растений и списках растений, отведённых для продаж частным лицам, упоминается только два вида Passiflora pentaphylla flore roseo clavato (Р. caerulea) и Passiflora hederae hirsute folio flore albo {P. foetida). В более поздних списках 1816 и 1817 гг. можно найти, по крайней

мере, 6 видов страстоцветов: Р. caerulea, P. serratifolia L., P. murucuja L., Р. holosericea L., Р. subpeltata Ortega, Р. suberosa.

Будучи популярным растением парадных комнат в домах российской интеллигенции, пассифлора получило название «Кавалерская звезда», которое сохранилось до наших дней, за его сходство с одной из главных наград царской России - звездой ордена Святого апостола Андрея Первозванного.

Наиболее крупная коллекция пассифлор того времени принадлежала министру народного просвещения графу Алексею Разумовскому. В перечне растений 1812 года, составленном его главным садовником Фишером указывается 22 вида пассифлор: P. alata Curtis, P. angustifolia, P. laurifolia, P. serratifolia, P. glauca, P. caerulea, P. caerulea tenuifolia hort., P. peltata, P. lutea, P. ciliaris, P.foetida, P. rubra Lam., P. tuberosa, P. biflora, P. holosericea L, P. adiantifolia, P. perfoliata, P. suberosa, P. minima, P. hirsute, P. ciliaris, P. incarnata. Именно оттуда страстоцветы уже попадали в остальные ботанические сады России.

В 1812 году Р. caerulea была введена в культуру в Никитском ботаническом саду (Улейская, 1996) и до сих пор остаётся единственным зимующим страстоцветом открытого грунта. В дальнейшем там же были введены в культуру Р. biflora Lam., P. serratifolia, P. alata, P. aurantia G. Forster, P. ciliata Ait., P. caerulea tenuifolia hort. и P. holosericea L., а чуть позднее в 1818 году P. rubra и P. edulis Sims. Некоторые из этих видов были рекомендованы к выращиванию в открытом грунте в летнее время.

В 19 веке страстоцветы появились в декоративной культуре субтропиков Кавказа. Поначалу они выращивались в парках, ботанических садах и оранжереях, но ко второй половине 20 века P. incarnata и Р. caerulea стали дичать и распространились по городским улицам и пригородам.

Нарастающая роль Р. incarnata в мировой фармацевтической промышленности привели к испытанию Р. incarnata на

сельскохозяйственных полигонах Советского Союза. В 1963 гг. И.М Рабиновичем была защищена кандидатская диссертация «Пассифлора инкарнатная в условиях влажных субтропиков Грузинской ССР (биологические основы культуры)». Кроме того, географические испытания Р. incarnata проводились в Батумском ботаническом саду Академии Наук Грузинской ССР, в Тбилиси, в ряде мест влажных субтропиков Абхазии и Краснодарского края, а также в Сухуми (Гульрипши) на опытной станции ВИРа, близ г. Гагра, на опорном пункте Главного ботанического сада АН СССР, на мысе Пицунда и в Сочи (Дендрарий) (Муравьева и др., 1964). В интродукционном питомнике и на полях Кобулетского совхоза Лекрастреста Минздрава СССР до сих пор существуют действующие плантации Р. incarnata.

Широко пассифлора применяется в озеленении городов юга России. В Сочи растения Р. caerulea успешно плодоносят и дают самосев.

Представительная коллекция страстоцветов была также собрана в БИН им. В.Л.Комарова РАН, где сегодня культивируется более 40 видов и гибридов этих растений (Арнаутов и др., 2003).

Особую популярность страстоцвет получил в Украине. Сегодня местными селекционерами получены ряд декоративных и плодовых сортов внутривидовой и межвидовой гибридизации на основе Р. incarnata, Р. edulis, Р. cincinnata и Р. tucumanensis. Такие сорта народной селекции, как 'Intucu', 'Faraon', 'Blue Skies', 'Bytention' и 'Byte' широко представлены в садах местных любителей.

1.2. Особенности распространения и экологии представителей рода

Passiflora

Лиановидная жизненная форма, являясь интегральным элементом сукцессионной динамики лесов, определила стратегию выживания пассифлор в лесном сообществе. Первичные тропические леса

характеризуются относительно низкой плотностью лиан, где они взрослее, но малочисленнее по сравнению с вторичными лесами. Выживание лиановидных пассифлор зависит от появления прогалин в лесном пологе, чему предшествуют оползни, ураганы, старение деревьев первых ярусов и пр. Так, в первичных лесах семена P. vitifolia Kunth прорастают только тогда, когда поверхность почвы на лесных прогалинах прогревается солнечными лучами не менее трёх часов в день (Gentry, 1981; Plowes, 2006). Анализ мест обитаний пассифлор показывает, что одревесневающие или полуодревесневающие виды растут по линии древостоя и уходят со временем в лесной полог, в то время как более мелкие травянистые виды приурочены к открыты

Информация о работе

Кириллов, Алексей Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.06

Диссертация

Введение в культуру in vitro и in vivo видов рода Passiflora L. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы