Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Восстановление памяти, нарушенной ингибитором синтеза белка, у мышей

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Восстановление памяти, нарушенной ингибитором синтеза белка, у мышей"

Ч{Г

На правах рукописи УДК 612.821.2

Амепьченко Евгений Михайлович

ВОССТАНОВЛЕНИЕ ПАМЯТИ, НАРУШЕННОЙ ИНГИБИТОРОМ СИНТЕЗА БЕЛКА, У МЫШЕЙ: ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ И ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКА с-Г<ж В МОЗГЕ ПРИ «НАПОМИНАНИИ»

03.03.01 - Физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

27

2014

005546368

Москва, 2014

005546368

Работа выполнена в Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина» РАМН в лаборатории нейробиологии памяти (заведующий - доктор медицинских наук, профессор Константин Владимирович Анохин)

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Анохин Константин Владимирович

Официальные оппоненты: доктор психологических наук, профессор Александров Юрий Иосифович, Институт психологии РАН, заведующий лабораторией нейрофизиологических основ психики

Ведущая организация: Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии

Защита диссертации состоится «15» мая 2014 г. в 13 часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.008.01 при Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина» РАМН по адресу: 125009, Москва, ул. Моховая, д. 11, стр. 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального Государственного Бюджетного Учреждения «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина» РАМН

Автореферат разослан 1 ЯЗ 7 V

кандидат биологических наук, доцент Плескачева Марина Григорьевна, Московский Государственный Университет им. М.ВЛомоносова, Биологический факультет, кафедра высшей нервной деятельности

РАН

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат биологических наук

О.В. Кубряк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Память является одной из основных функций мозга, которая обеспечивает адаптивное поведение организмов в условиях изменяющейся окружающей среды. Вызванные обучением изменения поведения организма, работы областей мозга, активности клеточных ансамблей и отдельных нейронов, а также лежащие в основе этого молекулярно-биологические процессы в совокупности составляют одну из ключевых проблем современной нейробиологии (Dudai, 2012; Gallistel and Matzel, 2013).

Известно, что в первые минуты и часы после обучения память переходит из кратковременной, лабильной формы в долговременную, стабильную (AgranofTet al., 1965; McGaugh, 1966; Анохин, 1997; Medina et al., 2008), то есть фиксируется, консолидирует, постепенно приобретая устойчивость к действию амнестичных агентов (McGaugh, 2000). Многие клеточные и молекулярные процессы, сопровождающие консолидацию памяти, описаны в литературе (Goelet et al., 1986; McGaugh, 2000; Abel and Lattal, 2001; Kandel, 2001) и послужили основой для создания схемы каскада событий, приводящих к формированию долговременной памяти.

Использование специфических интерферирующих воздействий в экспериментах на животных приводило к развитию амнезии, которую в большинстве случаев считали необратимой (Sara and Hars, 2006, Flexner et al., 1963; Gibbs, Ng, 1977; Davis, Squire, 1984; Bourtchouladze et al., 1994, 1998); это позволило продемонстрировать критическую значимость отдельных этапов каскада молекулярных событий для консолидации памяти.

Однако с конца 60-х годов XX века начали накапливаться данные, свидетельствовавшие о том, что память, нарушенная во время консолидации, тем не менее, может быть восстановлена (Sara and Hars, 2006). В качестве интерферирующих воздействий в этих экспериментах использовали введение антибиотиков-ингибиторов синтеза белка. (Quartermain et al., 1970, Randt et al., 1972; Squire and Barondes, 1972). При этом наблюдали спонтанное восстановление нарушенной памяти (Quartermain et al., 1970; Squire and Barondes, 1972) или восстановление, связанное с использованием процедуры «напоминания», которая заключалась в предъявлении животному перед тестом на долговременную память одного из компонентов ситуации обучения: условного или безусловного сигнала (Miller and Springer, 1972; Quartermain et al., 1972; Radyushkin and Anokhin, 1999). Однако с тех пор молекулярные и клеточные процессы, лежащие в основе восстановления нарушенной памяти оставались неизученными.

В настоящей работе мы сочли необходимым вернуться к исследованию возможности восстановления памяти, нарушенной введением ингибиторов синтеза белка

при обучении, а также исследовать один из ключевых этапов каскада молекулярных событий, сопровождающих обучение и извлечение ранее приобретенного опыта, -активацию генома нейронов, вызванную восстановлением нарушенной памяти. В качестве экспериментальной модели нами было выбрано однократное обучение условнорефлекторному замиранию у мышей (Fanselow, 1980, Payor et al., 1994, Stiedl and Spess, 1997). Функциональное картирование мозга по экспрессии c-Fos было выбрано в качестве подхода для локализации клеточных ансамблей, претерпевающих пластические перестройки под действием напоминания и при тестировании памяти на условный сигнал амнестичных животных и животных с нормальной памятью. Известно, что экспрессия с-Fos в нейронах сопровождает ситуации новизны, обучения и извлечения приобретенного опыта, требующие пластичности синаптических связей (Guzowski, 2002, 2005; Flavell and Greenberg, 2008).

Цель и задачи исследования

Перед работой была поставлена цель: исследовать возможность и особенности процесса восстановления памяти, нарушенной блокадой синтеза белка при обучении мышей в модели условнорефлекторного замирания, а также различия в активности областей мозга амнестичных животных по сравнению с необученными животными и животными с нормальной памятью.

Для достижения поставленной цели мы решали следующие конкретные задачи:

1) исследовать возможность восстановления памяти, нарушенной у мышей введением ингибитора синтеза белка циклогексимидом, в модели условнорефлекторного замирания;

2) изучить временную динамику процесса восстановления памяти, нарушенной введением циклогексимида;

3) провести сравнительный анализ активности мозга по экспрессии c-Fos при напоминании у животных с восстановленной, нарушенной и нормальной памятью;

4) провести сравнительный анализ активности мозга по экспрессии c-Fos при предъявлении условного сигнала животным с нормальной или нарушенной, ио восстановленной памятью.

Научная новизна работы

В работе впервые разработана модель восстановления памяти напоминанием в модели условнорефлекторного замирания у мышей. Впервые выяснено, что память, нарушенная введением ингибитора синтеза белка циклогексимида, может быть восстановлена кратковременной процедурой поведенческого напоминания. Впервые описана временная динамика данного процесса. Впервые показано, что восстановление

напоминанием нарушенной памяти у млекопитающих является медленным градуальным процессом и начинается не ранее, чем через 6 часов после напоминания.

В работе впервые исследована экспрессия транскрипционного фактора c-Fos в мозге животных после напоминания и тестирования. Установлено, что процедура напомипания вызывала различную активацию полей гиппокампа, цингулярной и прелимбической коры, которая зависела от степени целостности памятного следа у животных разных экспериментальных групп. При этом впервые установлено, что экспрессия c-Fos в зубчатой фасции и поле CAI гиппокампа предшествует восстановлению нарушенной памяти, а в поле САЗ и прелимбической коре наблюдается при реактивации нормально сформированной памяти, причем гаких изменений не наблюдали в мозге амнестичных животных.

Научно-практическое значение работы

Полученные в настоящей работе данные указывают на возможность восстановления доступа к памяти, нарушенной во время консолидации, с помощью предъявления напоминающих стимулов через достаточно длительное (до 24 часов) время после нанесения повреждающего память воздействия. Сходства свойств и динамики этого процесса восстановления у млекопитающих с данными, ранее полученными на птицах, позволяет предполагать, что память, считающаяся нарушенной и безвозвратно потерянной, потенциально может быть восстановлена и у человека. При этом ключевым вопросом становится подбор адекватных воздействий, способных реактивировать диссоциированный след памяти или же замедлить его диссоциацию при нейродегенеративных заболеваниях у человека.

Выявленные в настоящей работе различия в активации областей мозга животных с восстановленной памятью по сравнению с амнестичными животными и животными с нормальной памятью указывают на нейроанатомические субстраты и специфические нервные механизмы, лежащие в основе восстановления нарушенной памяти, и могут послужить основой для поиска фармакологических и других воздействий, направленных на компенсацию нарушений памяти у человека.

Положения, выносимые на защиту

1. Память, нарушенная у мышей введением ингибитора синтеза белка при обучении, может быть восстановлена процедурой поведенческого напоминания через 24 ч после обучения. Восстановление памяти не связано с повторным обучением животных, а, вероятно, является следствием реинтеграции диссоциированных элементов индивидуального опыта.

2. Восстановление памяти после напоминания развивается постепенно. Первый эффект наблюдается через 6 ч после напоминания, через 24 ч память восстанавливается до уровпя нормальных животных.

3. Экспрессия c-Fos в мозге после напоминания отражает процессы восстановления нарушенной и извлечения нормальной памяти. Нейроанатомические субстраты этих явлений различны. Повышепие плотности c-Fos-позитивных клеток в зубчатой фасции и поле CAI гиппокампа происходит в мозге амнестичных животных после напоминания и предшествует восстановлению нарушенной памяти. Повышенная экспрессия c-Fos в поле САЗ гиппокампа и прелимбической коре сопровождает реактивацию нормальной памяти.

Апробация диссертации

Материалы диссертационной работы доложены на итоговой конференции НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН (Москва, 2010 г.), 7th FENS Forum of European Neuroscience (Amsterdam, The Netherlands, 2010), Io" Международной междисциплинарной конференции "Современные проблемы системной регуляции физиологических функций" (Сафага, Египет, 2010), 8a1 IBRO World Congress of Neuroscience (Florence, Italy, 2011), 41s' Society For Neuroscience annual meeting (Washington, DC, USA, 2011), XV Школе-конференции молодых ученых Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (Москва, 2011), A joint meeting of European Molecular and Cellular Cognition Society and Haifa forum for Brain and Behavior (Haifa, Israel, 2012), 5°" Международной конференции по когнитивной науке (Калининград, 2012), 10ой Курчатовской молодежной научной школе (Москва, 2012).

Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 10 печатных работ, из них 2 - статьи в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа объемом 114 страниц состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Диссертация иллюстрирована 22 рисунками. Список цитируемой литературы включает 261 источник.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные

Эксперименты выполнены на мышах-самцах линии C57BL/6 в возрасте 2,5- 3 мес. Эксперименты проводили в соответствии с требованиями приказа № 267 МЗ РФ

б

(19.06.2003 г.), а также "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" (НИИ нормальной физиологии им. П.К.Анохина РАМН, протокол № 1 от 3.09.2005 г.).

Экспериментальные камеры и условия

Обучение животных проводили в камере 20 х 30 х 20 см с прозрачными передней и задней и непрозрачными боковыми стенками (контекст А). Электродный пол камеры состоял из прутьев диметром 1.5 мм, расстояние между прутьями 8 мм. Перед помещением каждого животного в камеру, ее протирали 70%-ным раствором этанола. Освещение в компате обеспечивали лампы дневного света. Звук подавали через аудиоколонки (F&D, USA). Процедуру напоминания проводили во второй камере, стенки которой были сделаны из непрозрачных закругленных пластиковых вставок 42.5 х 28.5 см (контекст Б). Электродный пол камеры состоял из прутьев диметром 1.5 мм, расстояние между прутьями 8 мм. Перед помещением каждого животного в камеру, ее протирали 40%-ным раствором этанола с можжевельником. Освещение контекста Б во время напоминания обеспечивала синяя лампа накаливания. Тестирование животных проводили в камере 40.5 х 40.5 х 32 см, стенки которой были сделаны из прозрачного пластика (контекст В). Пол в камере посыпали опилками. Перед помещением каждого животного в камеру, ее протирали 1%-ным раствором уксусной кислота. Освещение контекста В во время процедуры тестирования обеспечивала красная лампа накаливания. Звук подавали через аудиоколонки (F&D, USA).

Поведенческие процедуры

Обучение проводили в контексте А. После 2 mihi свободного обследования камеры на 30 с подавали звуковой условный сигнал (УС, 10 кГц, 70 дБ). Последние 2 с звучания сигнала сопровождались электрокожным раздражением (ЭКР, 0.5 мА) в качестве безусловного сигнала (БС). После этого животпое оставалось в камере еще 30 с, затем его возвращали в домашнюю клетку.

Процедуру напоминания проводили в контексте Б через 24 ч после обучения. Животпое помещали в контекст Б, через который немедленно пропускали ток 0.5 мА. Длительность процедуры напоминания (пребывание в контексте Б, сопровождающееся электрокожным раздражением) составляла 2 с. После процедуры напоминания животных возвращали в домашние клетки.

Тестирование долговременной памяти на звуковой условный сигнал проводили через 2,6 или 24 ч после процедуры напоминания. Тест на УС длился 6 минут в контексте В: первые 3 мин животное свободно обследовало камеру, после чего на 3 мин подавали

звуковой УС. В ходе обучения и тестирования регистрировали длительность эпизодов замирания животных.

Вещества, дозировки и способ введения

Животным экспериментальной группы однократно вводили ингибитор синтеза белка циклогексимид (ЦТ) (Sigma, USA) в дозе 100 мг/кг внутрибрюшинно за 20 мин до обучения. Животные контрольной группы получали инъекцию физиологического раствора (ФР, 0.9%-ный NaCl) внутрибрюшинно (0.1 мл/10 г массы животного).

Экспериментальные группы

Животные получали напоминание через 24 ч после обучения: группы ЦГ+Нап, п=31 и ФР+Нап, п=18 (ЦГ - введение циклогексимида, ФР - введение физиологического раствора, Нап - напоминание). Тестирование проводили через 24 часа после напоминания. Животные, не получавшие напоминания, были протестированы через 48 ч после обучения (группы ЦГ-Нап, п=19 и ФР-Нап, п=15), одновременно с группами, получившими накануне напоминание. Животных группы «активного контроля» после инъекции физиологического раствора помещали во время обучения в контекст А, предъявили звуковой УС, но не сочетали его с БС. Через 24 ч они получили «напоминание» (электрокожное раздражение в контексте Б) и были протестированы через 24 ч (группа АК+Нап, п=10).

В экспериментах по исследованию временной динамики процесса восстановления памяти были введены четыре дополнительные группы: животные, получившие напоминание через 24 ч после обучения и протестированные через 2 и 6 ч после напоминания (ЦГ+Нап/Т2, п=7 и ЦГ+Нап/Тб, п=7 соответственно), а также животные, не получившие напоминания, протестированные одновременно с соответствующими экспериментальными группами (ЦГ-Нап/Т2, п=8 и ЦГ-Нап/Тб, п=8 соответственно).

Для иммуногистохимического выявления белка c-Fos. животных умерщвляли путем транспозиции шейных позвонков через 90 мин после воздействия (напоминания или тестирования) и декапитировали. Мозги извлекали, замораживали в парах жидкого азота и хранили при -70°С.

Иммуногистохимическая детекция белка c-Fos

Выявление белка c-Fos проводили на фронтальных срезах мозга толщиной 20 мкм. Криостатные срезы собирали в соответствие с координатами, приведенными в атласе (Franklin and Paxinos, 2007) относительно точки брегмы (Вг): для цингулярной и прелимбической коры Br +2.34 - +1.98; для миндалины Вг -1.06 - -1.46; для гиппокампа Вг -1.34 - -2.8. Детекцию белка c-Fos проводили с помощью кроличьих первичных

антител Н-125 (Santa Cruz Biotechnology, США) и набора ImmPRESS (Vector Laboratories, США) по протоколу производителя.

Количественный анализ экспрессии c-Fos

Число c-Fos-позитивных ядер и площади структур на срезах определяли автоматически в программе анализа изображений ImagePro Plus 3.0 (Media Cybernetics, США). Границы структур проводили в соответствии с атласом мозга мыши (Franklin and Paxinos, 2007).

Статистический анализ

Статистический анализ поведенческих данных и результаты количественного анализа экспрессии c-Fos проводили с помощью теста Краскела-Уоллиса и теста Манна-Уитни для попарных межгрупповых сравнений. Различия считали достоверными при р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Напоминание индуцирует восстановление памяти, нарушенной введением ингибитора синтеза белка циклогексимида при обучении

Целью первого эксперимента было установить возможность восстановления памяти, нарушенной во время обучения. Животных обучали на фоне введения ЦГ, через 24 часа проводили напоминание кратковременным ЭКР. Через 24 ч тестировали память животных на звуковой УС. Длительность замирания у мышей, получивших и не получивших напоминание, во время тестирования до подачи звукового сигнала не различались достоверно (Краскел-Уоллис: р=0.097, рис.1 А). Таким образом, само по себе попадание животных в новую экспериментальную камеру при тестировании не вызывало реакции замирания.

Достоверные различия были выявлены при тестирования памяти во время предъявления звукового УС (Краскел-Уоллис: р<0.0001, рис.1 Б). Применение напоминания приводило к достоверному увеличению длительности замирания в группе ЦГ+Нап по сравнению с группой ЦГ-Нап (Манн-Уитни: р=0.000004). Достоверных различий между группами ЦГ+Нап и ФР+Нап не было обнаружено (Манн-Уитни: р=0.72, см. рис.1 Б), что свидетельствовало об эффективности использованной процедуры напоминания для восстановления памяти, нарушенной введением ингибитора синтеза белка, до уровня нормальной памяти. Таким образом, введение ингибитора синтеза белка циклогексимида мышам перед обучением условнорефлекторному замиранию приводило к нарушению памяти на УС. Применение напоминания через 24 ч после обучения на фоне действия циклогексимида приводило к восстановлению памяти до уровня ненарушенной.

Рис. 1. Длительность эпизодов замирания при тестировании памяти. А - до подачи условного звукового сигнала, Б - во время подачи условного звукового сигнала. Данные на графике представлены в формате: медиана, 25%-75%-квантили (прямоугольник) ± мин., макс, значения. Группы: АК+Нап - животные группы активного контроля; ФР-Нап - перед обучением животным вводили физиологический раствор, не проводили напоминания; ФР+Нап - перед обучением животным вводили физиологический раствор, через 24 ч после обучения проводили напоминание; ЦГ-Нап - перед обучением животным вводили циклогексимид, не проводили напоминания; ЦГ+Нап - перед обучением животным вводили циклогексимид, через 24 ч после обучения проводили напоминание. * - р<0.05, ** - р<0.0001, н.д. - нет достоверных различий, р>0.05 (критерий Манна-Уитни).

Градуальное восстановление нарушенной памяти после напоминания

Целью второго эксперимента было исследовать временную динамику процесса восстановления памяти. Тестирование памяти животных на условный звуковой сигнал проводили через 2 и 6 ч после напоминания. Контрольные группы не получали напоминания и были протестированы одновременно с первыми двумя группами. Введение ЦГ перед обучением приводило к развитию амнезии в тесте на УС через 2-6 ч после напоминания. Процедура напоминания за 2 ч до тестирования не приводила к восстановлению памяти: не было выявлено достоверных различий между группами ЦГ-Нап/Т2 и ЦГ+Нап/Т2 (Манн-Уитни: р=0.42, рис.2). Через 6 ч после напоминания длительность замирания у животных ЦГ+Нап/Тб достоверно превышала этот показатель в группе животных без напоминания (ЦГ-Нап/Тб, Манн-Уитни: р=0.013), что свидетельствовало об индукции восстановления памяти. Однако по сравнению с группой ФР+Н/6 длительность замирания в группе ЦГ+Нап/6 была достоверно ниже (Манн-Уитни: р=0.0041); достоверных различий между группами группой ЦГ+Нап/6 и ЦГ+Нап/2 не обнаружено (Манн-Уитни: р=0.11).

о

интервал между напоминанием и тестом, ч

2

6

24

Рис. 2. Временная динамика восстановления нарушенной памяти после напоминания. Точки на графике соответствуют медианному времени замирания каждой группы в данных временных точках. Группы: ЦГ-Нап -перед обучением животным вводили циклогексимид, не проводили

напоминания; ЦГ+Нап - перед обучением животным вводили циклогексимид, через 24 ч после обучения проводили напоминание; ФР-Нап - перед обучением

животным вводили физиологический раствор, не проводили напоминания; ФР+Нап - перед обучением животным вводили физиологический раствор, через 24 ч после обучения проводили напоминание. * -р<0.05, ** - р<0.001, н.д. - нет достоверных различий, р>0.05 (критерий Манна-Уитни).

Это свидетельствовало о неполном восстановлении памяти через 6 ч после напоминания. Таким образом, кратковременная процедура напоминания инициировала восстановление памяти, которое развивалось во времени градуально: длительность замирания через 2 ч после напоминания не различалась между животными, получившими и не получившими напоминание. Через 6 ч после напоминания длительность замирания возрастала у животных, получивших напоминание, но не достигала уровня этого показателя у животных с нормальной памятью. Через 24 ч после напоминания длительность замирания у животных, получивших инъекцию ЦГ перед обучением, достигает уровня этого показателя у животных с нормальной памятью.

Количественный анализ экспрессии с-Ро5 в мозге после напоминания

Достоверно большая плотность c-Fos-положительных клеток в зубчатой фасции гиппокампа была обнаружена в группе ЦГ+Нап по сравнению с животными, не получившими напоминание (ЦГ-Нап, Манн-Уитни: р=0.009; ФР-Нап, Манн-Уитни: р=0.0062), а также с группой необученных животных, получивших напоминание (АК+Нап, Манн-Уитни: р=0.014, рис. ЗА). Плотность c-Fos-позитивных клеток в поле CAI в группе ЦГ+Нап была достоверно выше, чем в группах ЦГ-Нап (Манн-Уитни: р=0.047), ФР-Нап (Манн-Уитни: р=0.045), и группе активного контроля (АК+Нап, Манн-Уитни: р=0.014, рис. ЗБ).

Гиппокамп

3

s

g- | ISO

O <

A ae 8 ?

120

Г í

/

/ / ¿ ¿ ¿ $

Рис. 3. Плотность c-Fos-экспрессирующих клеток в зубчатой фасции (А) и поле CAI (Б) гиппокампа после напоминания. Данные на графике представлены в формате: медиана, 25%-75%-квантили (прямоугольник) ± мин., макс, значения. Группы: ПК - животные группы пассивного контроля; АК+Нап - животные группы активного контроля; ФР-Нап - перед обучением животным вводили физиологический раствор, не проводили напоминания; ФР+Нап - перед обучением животным вводили физиологический раствор, через 24 ч после обучения проводили напоминание; ЦГ-Нап - перед обучением животным вводили циклогексимид, не проводили напоминания; ЦГ+Нап - перед обучением животным вводили циклогексимид, через 24 ч после обучения проводили напоминание. * - р<0.05 по сравнению с группой ЦГ+Нап, ** - р<0.01 (критерий Манна-Уитни).

В поле САЗ гиппокампа максимальный уровень экспрессии с-Роб был обнаружен в группе ФР+Нап, (рис. 4). Плотность с-РоБ-экспрессирующих клеток в этой группе была

Рис. 4. Плотность с-Роэ-экспрессирующих клеток в поле САЗ гиппокампа после напоминания. Данные на графике представлены в формате: медиана, 25%-75%-квантили (прямоугольник) ± мин., макс, значения. Группы: ПК - животные группы пассивного контроля; АК+Нап - животные группы активного контроля; ФР-Нап - перед обучением животным вводили

физиологический раствор, не проводили напоминания; ФР+Нап - перед обучением животным вводили физиологический раствор, через 24 ч после обучения проводили напоминание; ЦГ-Нап - перед обучением животным вводили циклогексимид, не проводили напоминания; ЦГ+Нап - перед обучением животным вводили циклогексимид, через 24 ч после обучения проводили напоминание. * - р<0.05 (критерий Манна-Уитни).

г*

достоверно выше, чем в группах животных, не получивших напоминание: ФР-Нап (Манн-Уитни: р=0.01) и ЦГ-Нап (Манн-Уитни: р=0.047), а также животных, впервые получивших ЭКР при напоминании (АК+Нап, Манн-Уитни: р=0.014).

Миндалина

В латеральном и центральном ядрах миндалины плотность с-Роб-позитивных клеток не отличалась достоверно между группами (Краскел-Уоллис: р>0.05). В базальном ядре были обнаружены достоверные межгрупповые различия в экспрессии с-Роэ (Краскел-Уоллис: р<0.05, рис. 5). У животных всех экспериментальных групп плотность экспрессии с-Роб-позитивных была достоверно выше, чем в группе ПК (Манн-Уитни: р<0.05). Однако достоверных различий между группами, подвергавшимися

экспериментальным воздействиям, обнаружено не было (Манн-Уитни: р>0.05).

Рис. 5. Плотность с-РоБ-экспрессирующих клеток в базальном ядре миндалины после напоминания. Данные на графике представлены в формате: медиана, 25%-75%-квантили (прямоугольник) ± мин., макс, значения. Группы: ПК - животные группы пассивного контроля; АК+Нап - животные группы активного контроля; ФР-Нап - перед обучением животным вводили физиологический раствор, не проводили напоминания; ФР+Нап - перед обучением животным вводили физиологический раствор, через 24 ч после обучения проводили напоминание; ЦГ-Нап - перед обучением животным вводили циклогексимид, не проводили напоминания; ЦГ+Нап - перед обучением животным вводили циклогексимид, через 24 ч после обучения проводили напоминание. * - р<0.05 (критерий Манна-Уитни).

^ /

Префронтальная кора

Анализ экспрессии с-Роэ в прелимбической коре выявил достоверные межгрупповые различия (Краскел-Уоллис: р<0.05, рис. 5). Наибольший уровень экспрессии в прелимбической коре был обнаружен в группе ФР+Нап и превышал этот показатель в группе необученных животных (АК+Нап) и группе животных с нарушенной памятью (ЦГ-Нап) (рис. 6А). Достоверные различия плотности с-Ров-позитивных клеток были также обнаружены между группами ФР+Нап, ФР-Нап, (Манн-Уитни: р=0.009) и ЦГ+Нап, (Манн-Уитни: р=0.015). Сравнение групп АК+Нап, ФР-Нап, ЦГ-Нап и ЦГ+Нап не выявило достоверных различий (Манн-Уитни: р>0.05). В передней цингулярной коре

достоверно большая плотность с-Роэ-позитивных клеток была обнаружена во всех экспериментальных группах по сравнению с группой ПК (Манн-Уитни: р<0.05, рис. 6Б). В то же время, достоверных различий между экспериментальными группами обнаружено не было (Манн-Уитни: р>0.05).

£ 600 9

Ё 500 х

и

g.~s 400

5 1 S >

2 о зоо о £

•¥ 5

S 200 S 100

X

° О

-

в4

/ / ?

7001 Б 600 500 400 300 200 100 О

*

1

в"

ЧыУ /

Рис. 6. Плотность с-Роэ-экспрессирутощих клеток в прелимбической (А) и передней цингулярной (Б) коре после напоминания. Данные на графиках представлены в формате: медиана, 25%-75%-квантили (прямоугольник) ± мин., макс, значения. Группы: ПК - животные группы пассивного контроля; АК+Нап -животные группы активного контроля; ФР-Нап - перед обучением животным вводили физиологический раствор, не проводили напоминания; ФР+Нап - перед обучением животным вводили физиологический раствор, через 24 ч после обучения проводили напоминание; ЦГ-Нап - перед обучением животным вводили циклогексимид, не проводили напоминания; ЦГ+Нап - перед обучением животным вводили циклогексимид, через 24 ч после обучения проводили напоминание. * - р<0.05, ** - р<0.01, # - р<0.05 группы ПК по сравнению с экспериментальными группами (критерий Манна-Уитни).

Таким образом, нами было установлено, что напоминание, индуцирующее восстановление долговременной памяти, нарушенной введением ингибитора синтеза белка при обучении, сопровождается повышением экспрессии c-Fos в зубчатой фасции и поле CAI гиппокампа. В связи с этим, представляло интерес выяснить, отличается ли транскрипционная активность мозга мышей с восстановленной памятью от таковой у животных с нормальной памятью и амнестичных животных, не получивших напоминание, после извлечения долговременной памяти во время тестирования на звуковой УС?

Количественный анализ экспрессии c-Fos в мозге после тестирования памяти на звуковой УС

Гиппокамп

В зубчатой фасции и поле САЗ достоверных различий в экспрессии c-Fos между группами с нормально сформированной, нарушенной и восстановленной памятью после тестирования обнаружено не было (Краскел-Уоллис: р>0.05). В поле CAI были

обнаружены достоверные межгрупповые различия в плотности с-Роэ-позитивных клеток (Краскел-Уоллис: р<0.05). У животных с нормальной, нарушенной и восстановленной памятью экспрессия с-Ров была выше, чем в группе ПК (Манн-Уитни: р<0.05).

Миндалина

В латеральном и базальном ядрах миндалины после тестирования памяти экспрессия с-Роэ достоверно различалась между группами (Краскел-Уоллис: р>0.05). В обоих ядрах плотность с-Ров-экспрессирующих клеток у животных с нормальной, нарушенной и восстановленной памятью была выше, чем в группе ПК (Манн-Уитни: р<0.05). Различия между группами ФР+Нап, ЦГ-Нап, ЦГ+Нап были не достоверны (Манн-Уитни: р>0,1). В центральном ядре миндалины количество с-Роэ-положительных клеток достоверно различалось между группами (Краскел-Уоллис: р<0.05, рис. 7). Экспрессия с-Ров в группе с восстановленной памятью (ЦГ+Нап) была достоверно выше, чем в группе с нормальной памятью (ФР+Нап, Манн-Уитни: р=0.0074) и группе ПК (Манн-Уитни: р=0.014). В то же время, в группе амнестичных животных (ЦГ-Нап) уровень экспрессии с-Роэ оказался достоверно выше, чем в группах ФР+Нап (Манн-Уитни: р=0.006) и ПК (Манн-Уитни: р=0.0082). Между группами ЦГ+Нап и ЦГ-Нап не было обнаружено достоверных различий (Манн-Уитни: р=0.68).

Рис. 7. Плотность с-Роз-экспрессирующих клеток в центральном ядре миндалины после тестирования памяти на звуковой УС. Данные на графике представлены в формате: медиана, 25%-75%-квантили (прямоугольник) ± мин., макс, значения. Группы: ПК - животные группы пассивного контроля; ФР+Нап - перед обучением животным вводили физиологический раствор, через 24 ч после обучения проводили напоминание; ЦГ-Нап - перед обучением животным вводили циклогексимид, не проводили напоминание; ЦГ+Нап - перед

ФР+Нап ЦГ-Нап ЦГ+Нап

обучением животным вводили циклогексимид. через 24 ч после обучения проводили напоминание. * -р<0.05 (по сравнению с группой ПК), ** - р<0.01, # - р<0.05 (но сравнению с группой ФР+Нап) (критерий Манна-Уитни).

Слуховая кора

Количественный анализ экспрессии с-Ров в слуховой коре после тестирования памяти выявил достоверные межгрупповые различия после предъявления звукового УС (Краскел-Уоллис: р<0.05, рис. 8). Достоверно большая плотность с-Ров-позитивных клеток была обнаружена во всех экспериментальных группах по сравнению с группой ПК

15

(Манн-Уитни: р<0.05). Однако достоверных различий между группами, прошедшими тестирование памяти, обнаружено не было (Манн-Уитни: р>0.2).

Рис. 8. Плотность с-Роз-экспрессирующих клеток в слуховой коре после тестирования памяти на звуковой УС. Данные на графике представлены в формате: медиана, 25%-75%-квантили (прямоугольник) ± мин., макс, значения. Группы: ПК - животные группы пассивного контроля; ФР+Нап - перед обучением животным вводили физиологический раствор, через 24 ч после обучения проводили напоминание; ЦГ-Нап -перед обучением животным вводили циклогексимид, не проводили напоминание; ЦГ+Нап - перед обучением животным вводили

h

ПК ФР+Нап цг-Нэп ЦГ+Нап

циклогексимид, через 24 ч после обучения проводили напоминание. * - р<0.05. ** - р<0.01 (критерий Манна-Уитни).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Поведение животных во время обучения и тестирования памяти на звуковой УС

Результаты тестирования памяти животных на звуковой УС через 48 ч после обучения свидетельствуют об эффективной выработке условнорефлекторного замирания у мышей. При этом системное введение мышам ингибитора синтеза белка ЦГ за 20 мин до обучения вызывало нарушение долговременной памяти в тесте с предъявлением звукового УС. Эти данные согласуются с результатами, полученными ранее в данной модели обучения (Radulovic et al., 1998, Stiedl et al., 1999). Классическое объяснение этих результатов основано на гипотезе, согласно которой синтез белка de novo необходим для консолидации памяти (Alberini, 2008, Davis and Squire, 1984). При этом предполагают, что введение ингибиторов синтеза белка до или сразу после обучения приводит к необратимому нарушению процесса консолидации, что делает невозможным хранение и последующее извлечение долговременной памяти (Davis and Squire, 1984).

Однако наши данные, полученные в первом эксперименте, не подтверждают эту гипотезу. Нами показана возможность восстановления нарушенной при обучении памяти после применения процедуры напоминания в модели условнорефлекторного замирания у мышей. Сходные результаты были получены ранее в экспериментах по обучению пассивному избеганию цыплят, крыс и мышей (Радюшкин, Анохин, 1997, Miller and Springer, 1972, Quartermain et al., 1970). В настоящей работе показано, что

кратковременная процедура напоминания безусловным стимулом в новой обстановке приводит к восстановлению нарушенной реакции на звуковой УС. Этот факт позволяет по-новому рассмотреть проблему о факторах, определяющих процесс восстановления памяти в подобных исследованиях (Miller and Springer, 1972, Quartermain et al., 1970, Quartermain et al., 1972). Сильным контраргументом при обсуждении возможности восстановления памяти, нарушенной во время консолидации, было предположение о возможности повторного обучения при напоминающих воздействиях (Gold and King, 1974, Sara and Hars, 2006). В разработанном нами протоколе процедура напоминания включала в себя предъявление одного лишь безусловного стимула - электрокожного раздражения. Таким образом, наблюдаемое в тесте на условный сигнал восстановление памяти не могло быть связано с повторным обучением на сочетание условного сигнала (звука) с безусловным (электрокожным раздражением) или с повторным попаданием в известную обстановку - контекст обучения и контекст напоминания существенно различались (Miller and Matzel, 2006). Процедура напоминания не приводила к генерализации реакции замирания в новом контексте, так как в тесте на условный сигнал в течение первых трех минут (до подачи звука) животные всех групп демонстрировали одинаково низкое время замирания.

В экспериментах на цыплятах ингибиторы синтеза белка вводили локально в структуру мозга, для которой показано вовлечение в обучение пассивному избеганию (Радюшкин, 1998). Наблюдаемое восстановление памяти в этой работе могло быть связано с участием других областей мозга в консолидации. Мы вводили ЦГ системно, поэтому компенсаторное вовлечение одних структур мозга в процесс консолидации при нарушенной функции других в наших экспериментах представляется маловероятным.

Во втором эксперименте нами была показана градуальность восстановления нарушенной памяти. Она выражалась в постепенном увеличении времени замирания у амнестичных животных при тестировании через 2, 6 и 24 ч после напоминания. Эти данные согласуются с результатами, полученными в модели обучения пассивному избеганию у цыплят (Радюшкин, 1998). В указанной работе животных обучали избегать клевать бусину определенного цвета. Перед обучением цыплята получали инъекцию ЦГ. Через 24 ч после обучения проводили напоминание. Тестирование животных через разные временные интервалы после напоминания показало, что восстановление памяти происходило через 5-7 ч после напоминания.

Как у цыплят, так и у мышей 6-часовой интервал считают ключевым для окончания молекулярных процессов консолидации памяти, связанных со второй волной синтеза белков (Dudai, 2004, Freeman et al., 1995, McGaugh, 2000). Вероятно, завершение данного

процесса после второй волны синтеза белка через 4-7 ч, делает возможным извлечение долговременной памяти на более поздних сроках.

Одно из возможных объяснений полученных данных может заключаться в неполном ингибировании синтеза белка в мозге в момент обучения. Это рассматривается некоторыми авторами как возможная причина «восстановления» памяти, которая в данном случае не может считаться нарушенной полностью (Alberini, 2008). Однако известно, что системное введение ЦГ мышам в дозах 75-150 мг/кг приводит к существенному (на 95-98%) ингибированию синтеза белка в мозге уже через 30 мин (Quinton and Rramarcy, 1977). Основываясь на этих данных, мы предполагаем существенное ингибирование синтеза белка в наших экспериментах у животных, которые получали циклогексимид системно в дозе 100 мг/кг за 20 мин до обучения. Вместе с тем, вероятность формирования в таких условиях некоторого подпорогового следа долговременной памяти, потенциируемого процедурой напоминания, не может быть полностью исключена. Вторая возможность объяснения полученных нами данных может состоять в том, что помимо синтеза новых белков существует и другой молекулярный механизм формирования следов долговременной памяти, не нарушаемый введением циклогексимида (например, синтез новых молекул РНК или ДНК, Анохин, и др., 1988; Комиссарова и др., 2008; Reinis et al., 1972). Дополнительные эксперименты позволят разделить эти альтернативные возможности.

Топография экспрессии c-Fos в мозге при восстановлении памяти

Анализ экспрессии c-Fos у амнестичных животных, получивших напоминание (группа ЦГ+Нап), по сравнению с другими группами выявил несколько областей мозга, в которых восстановлению памяти предшествовало повышение количества c-Fos-положительных клеток. К этим структурам относились DG и поле CAI гиппокампа. Плотность c-Fos-экспрессирующих клеток в группе ЦГ+Нап в этих областях было достоверно больше, чем в группе животных с нарушенной памятью (ЦГ-Нап) и животных, которые получили ЭКР впервые во время напоминания (АК+Нап). Индукция c-Fos, связанная с получением животными ЭКР, представляется нам мало вероятной, поскольку в DG и CAI не было обнаружено достоверных различий между группами обученных животных, получивших напоминание (ФР+Нап), не получивших напоминание (ФР-Нап) и получивших ЭКР впервые в индивидуальном опыте (АК+Нап).

Извлечение нормальной памяти напоминанием активировало иную распределенную популяцию нейронов в мозге: повышение экспрессии c-Fos наблюдали в поле САЗ гиппокампа и PL. В отсутствии прошлого опыта (группа АК+Нап) или при нарушении консолидации (группа ЦГ+Нап) процедура напоминания не индуцировала

экспрессию c-Fos в этой популяции клеток. Повышение экспрессии c-Fos в мозге во время реактивации аверсивной памяти было обнаружено и в других исследованиях (Tronel and Sara, 2002; Strekalova et al., 2003; Salinska et al., 2004). Таким образом, экспрессия c-Fos носила опыт-зависимый характер и могла отражать процесс реорганизации нейронных ансамблей, лежащий в основе модификации индивидуального onbrra(Svarnik et al., 2013). Подобные изменения в мозге происходят при реконсолидации. Согласно современным представлениям, этот процесс заключается во временном возвращении консолидированной памяти в лабильное состояние для модификации индивидуального опыта (включения в него новых, актуальных элементов и исключения устаревших, утративших адаптивную значимость) (Przybyslawski and Sara, 1997; Sara, 2000; Alberini et al., 2006; Tronson and Taylor, 2007; Dudai, 2012).

Процедура напоминания приводила к реактивации аверсивной памяти, что выражалось в повышении экспрессии c-Fos в САЗ и PL группы ФР+Нап по сравнению с ФР-Нап. На уровне поведения у этих животных наблюдали увеличение времени замирания при тестировании через 24 ч после напоминания по сравнению с животными память которых не была реактивирована (ФР-Нап). Улучшение воспроизведения навыка у животных с нормальной памятью наблюдали в ряде исследований с применением ЭКР в качестве напоминания (Lewis et al., 1968; Miller and Springer, 1972; Gold et al., 1973; Gold and King, 1974).Анализируя эти данные, Голд и Кинг приходят к заключению, что напоминание ЭКР «предоставляет животному дополнительную информацию, действуя, таким образом, как дополнительное обучение» (Gold and King, 1974). Кроме того, авторы обращают внимание на то, что необученные (как и полностью амнестичные) животные не приобретают навык после несочетанного предъявления ЭКР (Gold and King, 1974). Воспроизведение навыка после напоминания улучшалось лишь у животных, обученных на предъявление слабого ЭКР, или у особей с неполной амнезией (Cherkin, 1972; Gold et al., 1973; Haycock et al., 1973). Таким образом, напоминание ЭКР является дополнительным эпизодом обучения, которое, суммируясь с ослабленной памятью, приводит к улучшению воспроизведения навыка (Gold and King, 1974). Можно предположить, что повышение длительности замирания в группе ФР+Нап по сравнению с группой ФР-Нап было вызвано таким эпизодом дополнительного опыта. Тогда повышение экспрессии c-Fos в группе ФР+Нап в поле САЗ гиппокампа и прелимбической коре свидетельствовало бы о пластических перестройках, индуцированных процедурой напоминания. Однако, если напоминание являлось дополнительным эпизодом обучения, следовало ожидать повышения экспрессии и в группе АК+Нап, по крайней мере, в некоторых из проанализированных областей мозга. Тем не менее, плотность экспрессии с-

Fos в этой группе после напоминания не отличалась достоверно от групп, не получивших напоминание. Таким образом, можно заключить, что высокая экспрессия c-Fosb группе ФР+Нап была связана с извлечением и модификацией индивидуального опыта процедурой напоминания; в отсутствии напоминания (как в группе ФР-Нап) или аверсивного опыта (как в группе АК+Нап) длительность замирания и экспрессия c-Fos в мозге была существенно ниже.

Наши данные согласуются с рядом электрофизиологических исследований, в которых была продемонстрирована скоординированная электрическая активность в гиппокампе и префронтальной коре (Battaglia et al., 2011). В контексте настоящего исследования особый интерес представляют данные Лестинга и соавт. (2011), которые продемонстрировали (на уровне электрической активности клеток) сопряжение LA, СА1 и инфралимбической коры на частоте тета-ритма при реактивации памяти и после ее угашения (Lesting et al., 2011). При этом угашение реакции замирания (в результате неподкрепляемого предъявления обученным животным УС без БС) сопровождалось снижением скоррелированноститета-ритмов между миндалиной, гиппокампом и префронтальной корой (Lesting et al., 2011). Таким образом, синхронная активация клеточных ансамблей, принадлежащих морфологически разным областям мозга, при извлечении памяти проявляется на уровне электрической и транскрипционной активности нейронов.

Таким образом, мы можем заключить, что процедура напоминания стала триггером, индуцировавшим в разных областях мозга процессы, вероятно, связанные с актуализацией и модификацией прошлого опыга животных. При этом в наших исследованиях удалось продемонстрировать, по крайней мере, на уровне корреляции, не только связь экспрессии c-Fos с реактивацией сохранной памяти, но и впервые активацию генетического аппарата в распределенной популяции нейронов, сопровождавшую восстановление нарушенной памяти.

Топография экспрессии белка c-Fos в мозге после тестирования памяти на звуковой

УС

Гиппокамп

В проанализированных областях гиппокампа плотность c-Fos-позитивных клеток в группах ФР+Нап, ЦГ-Нап и ЦГ+Нап после тестирования памяти не различалась достоверно. Извлечение из памяти прошлого опыта связывают с активацией генетического аппарата нейронов, в частности, с экспрессией «ранних» генов c-fos, zif268 в гиппокампе (Milanovic et al., 1998; Strekalova et al., 2001; Lee et al., 2004; Wislowska-Stanek, 2005; Wheeler et al., 2013) и ряде других областей (см. ниже, Hall et al., 2001а).

Отличительной особенностью гиппокампа при реактивации памяти на звуковой УС является невысокий уровень экспрессии «раннего» гена z¡J268 (Hall et al., 2001a). Кроме того, в работе Халла и соавт (2001b), как и в наших исследованиях, не было выявлено достоверных различий в экспрессии c-Fos в DG и поле CAI гиппокампа между группами обученных и псевдообученных животных после извлечения памяти на звуковой УС (Hall et al., 2001Ь).Данные по разрушению этой области мозга перед обучением позволили предположить, что приобретение и манифестация памяти на УС могут протекать и в отсутствии гиппокампа (Selden et al., 1991; Philips and LeDoux, 1992; McEchron et al., 2000; Hunsaker and Kesner, 2008).Таким образом, можно заключить, что извлечение памяти на условный звуковой сигнал, по-видимому, не требует усиления экспрессии c-fos в гиппокампе.

Миндалина

Тестирование долговременной памяти животных на звуковой УС сопровождалось повышением количества c-Fos-позитивных клеток в ядрах миндалины в группах ФР+Нап, ЦГ-Нап и ЦГ+Нап по сравнению с животными, взятыми из домашней клетки. В то же время, не было выявлено различий между протестированными группами, что может говорить о неспецифической индукции c-Fos при извлечении памяти звуковым УС. В СеА. Плотность c-Fos-экспрессирующих клеток в группе ЦГ+Нап было достоверно выше, чем в группах ФР+Нап и ПК. Неожиданно высокий уровень экспрессии был обнаружен и в группе ЦГ-Нап; он достоверно превышал этот показатель в группах ФР+Нап и ПК. После тестирования памяти на звуковой УС экспрессия c-Fos в ВА и СеА была повышена у обученных животных по сравнению с животными, взятыми для декапитации из домашней клетки (аналогичны группе ПК в настоящей работе) (Hall et al., 2001Ь).Извлечение памяти па обстановку при повторном попадании животных в контекст обучения (где ранее получали ЭКР) также сопровождалось повышением экспрессии c-Fos в ВА, LA и СеА по сравнению с контрольными животными (Beck and Fibiger, 1995; Milanovic et al., 1998; Scicli et al., 2004; Holahan and White, 2004), а также накоплением [6-14С]глюкозы, что свидетельствовало о повышении метаболизма в миндалине (Boujabit et al., 2003). Таким образом, обнаруженный в нашем исследовании паттерн экспрессии c-Fos в миндалине животных с нормальной памятью согласуется с результатами, описанными в литературе.

Анализ транскрипционной активности мозга амнестичных животных и животных с восстановленной памятью при извлечении прошлого опыта проведен в настоящей работе впервые. Продемонстрировано повышение количества c-Fos-позитивных клеток в СеА животных, получивших перед обучением ЦГ.Известно, что предъявление обученному

животному УС сопровождается изменением спайковой активности нейронов СеА -специализация нейронных популяций относительно конкретного УС в зависимости от его значимости (предсказывает он БС или нет) (Ciocchi et al., 2010). Специализация нейронов относительно эпизодов индивидуального опыта требует активации генетического аппарата и синтеза белка (Agnihotri et al., 2004; Анохин, 1997; Dudai, 2004; Svarnik et al., 2005). В связи с этим, повышение экспрессии c-Fos, которое мы наблюдали в СеА животных групп ЦГ-Нап и ЦГ+Нап, могло быть связано с реконструкцией нейронной сети, целостность которой была нарушена введением ЦГ при обучении. У животных группы ЦГ-Нап в отсутствии напоминания нейронная сеть, обеспечивающая манифестацию поведения замирания на звуковой УС, не была реактивирована. В связи с этим, предъявление звукового УС не приводило к замиранию во время тестирования. Можно также предположить, что процедурой тестирования у этих животных был запущен иной процесс: звуковой сигнал, утратив ассоциативную значимость для амнестичных животных, был квалифицирован как индифферентный стимул. Как и любая другая процедура обучения, этот процесс также требовал пластических перестроек (в том числе в той части сети, которая связана с проявлением поведения замирания) и сопровождался индукцией c-Fos. Проверка этих альтернативных гипотез требует проведения дополнительных экспериментов.

Слуховая кора

Извлечение памяти во время тестирования сопровождалось индукцией экспрессии c-Fos в слуховой коре животных экспериментальных групп по сравнению с труппой ПК. Между группами ФР+Нап, ЦГ-Нап и ЦГ+Нап достоверных различий обнаружено не было. Слуховая кора была выбрана для анализа транскрипционной активности c-Fos после тестирования памяти на звуковой УС как область, нейроны которой модулируют свою спайковую активность в связи с обучением УРЗ (Galvan and Weinberger 2002; Weinberger, 2004). Реактивация прошлого опыта вызывала не только градуальное увеличение амплитуды ответов в слуховой коре в течение нескольких дней после обучения (Galvan and Weinberger, 2002), но также приводила к повышению экспрессии zif268 при предъявлении УС (Kwon et al., 2012). Как упоминалось выше, ответы нейронов слуховой коры претерпевают «настройку» на звуковой УС в течение трех дней после обучения (Galvan and Weinberger, 2002), что, вероятно, требует включения механизмов пластичности. В наших экспериментах животные группы ЦГ-Нап замирали мало при предъявлении звукового УС; тем не менее, нельзя исключить вероятность узнавания этого УС животными данной группы. В связи с этим, повышение экспрессии c-Fos в мозге животных с восстановленной и реактивированной нормальной памятью (ЦГ+Нап п

ФР+Нап соответственно) нельзя однозначно связать с реактивацией ассоциативной памяти. Дальнейшие исследования позволят уточнить причины, вызвавшие сопоставимую индукцию c-Fos в слуховой коре животных с различным индивидуальным опытом и разной степенью сохранности памяти, необходимы дополнительные исследования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе продемонстрирована возможность восстановления памяти, нарушенной введением ингибитора синтеза белка при обучении. Процедура напоминания через 24 ч после обучения приводила к восстановлению памяти на условный звуковой сигнал у амнестичных животных. Наблюдаемое восстановление памяти не было связано с повторным ассоциативным обучением животных, так как сама процедура напоминания не включала в себя повторное предъявление условного звукового сигнала. Восстановление памяти происходило не моментально (в отличие от извлечения прошлого опыта): процесс развивался постепенно после предъявления напоминания, первый эффект которого был заметен не ранее, чем через 6 ч. Через 24 ч нарушенная память восстанавливалась до уровня нормальной.

Анализ экспрессии c-Fos в группе ЦГ+Нап позволил выявить несколько областей мозга, в которых восстановлению памяти предшествовало повышение количества c-Fos-положительных клеток по сравнению с другими группами. К этим структурам относились DG и поле CAI гиппокампа. Реактивация нормальной памяти после напоминания сопровождалась индукцией экспрессии c-Fos в сети, включавшей в себя нейроны поля САЗ гиппокампа и прелимбической коры. Вероятно, эта индукция была связана с извлечением приобретенной ранее аверсивной памяти. В ряде структур (LA, ВА, СеА, АСС) существенных изменений количества c-Fos-позитивных клеток после напоминания обнаружено не было; предъявление напоминания животным вызывало повышение экспрессии c-Fosb ВА и АСС по сравнению с животными, не получившими этого воздействия.

Извлечение памяти при предъявлении звукового УС во время тестирования приводило к индукции экспрессии c-Fos в DG, поле САЗ и CAI гиппокампа, латеральном и базалыюм ядрах миндалины во всех экспериментальных группах. В центральном ядре миндалины повышение экспрессии в группах, получивших ЦГ при обучении, мы связываем с процессами реорганизации индивидуального опыта: в группе ЦГ-Нап увеличение числа c-Fos-позитивных клеток могло быть вызвано изменением прогностической значимости звукового УС, как не предсказывающего появление аверсивного БС. В группе ЦГ+Нап, напротив, мог завершаться процесс реконструкции

нейронной cení, сопровождающий восстановление аверсивной памяти. Для выяснения точной природы наблюдаемого феномена необходимы дополнительные исследования. Индукция экспрессии в слуховой коре, вероятно, носила неспецифкческий характер и была связана с предъявлением всем животным звукового УС. Тем не менее, на основании разного индивидуального опыта животных, этот звуковой сигнал мог быть отнесен ими в различные категории, что сопровождалось активацией разных популяций нейронов, распределенных в мозге.

ВЫВОДЫ

1. Память на звуковой условный сигнал, нарушенная у мышей при обучении в модели условнорефлекторного замирания ингибитором синтеза белка циклогексимидом, может быть восстановлена с помощью кратковременной процедуры поведенческого напоминания через 24 ч после обучения.

2. Восстановление памяти при напоминании происходит у мышей в отношении специфического звукового условного сигпала, использованного при обучении, и не является генерализованной реакцией замирания на помещение в новую экспериментальную камеру.

3. Восстановление памяти на звуковой условный сигнал развивается градуально. Эффект восстановления начинает проявляться у животных с нарушенной памятью через 6 часов после напоминания; длительность эпизодов замирания, достигает уровня животных с нормальной памятью через 24 ч.

4. Напоминание вызывает у животных с нарушенной памятью избирательное повышение экспрессии транскрипционного фактора c-Fos в нейронах зубчатой фасции и поля CAI гиппокампа, являющееся специфическим молекулярной характеристикой процесса восстановления памяти.

5. У мышей с нормально сформированной памятью напоминание индуцирует активацию c-Fos в популяциях клеток поля САЗ гиппокампа и прелимбической коры.

6. Несмотря на идентичность стимула, предъявление напоминания вовлекает у животных с нормальной и нарушенной памятью различные нейроанатомические субстраты, в одном случае вызывая извлечение нормально сформированной памяти, а в другом приводя к восстановлению поврежденной памяти.

7. Предъявление условного звукового сигнала мышам с нарушенной и восстановленной памятью приводит к повышению экспрессии c-Fos в центральном ядре миндалины по сравнению с получающими такой же сигнал животными с нормальной памятью. Это различие может отражать разницу в процессах реконсолидации

индивидуального опыта, обусловленную различной степенью значимости условного сигнала и/или консолидированности памяти у этих групп животных.

8. Предъявление условного звукового сигнала вызывает одинаковое повышение экспрессии c-Fos в нейронах гиппокампа, латерального и базалыюго ядер миндалины и слуховой коры у мышей с нарушенной, восстановленной и нормальной, не нарушавшейся памятью, по сравнению с интактными животными. В совокупности с различающейся активностью c-Fos в центральном ядре миндалины у этих групп животных данный факт свидетельствует о том, что восстановление нарушенной памяти напоминанием ведет к возникновению паттерна реакции структур головного мозга на условный сигнал, отличающегося от картины активности как у нормальных, так и у амнестичных животных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Amelchenko Е.М., Bezryadnov D.V., Zvorykina S.V., Chekhov S.A., Tiunova A. A., Anokhin К. V. Reminder-induced recovery of impaired fear memory in mice may be based on residual memory traces in amygdala. // Abstracts of 7lh FENS Forum of European Neuroscience. Amsterdam, the Netherlands, 2010. P. 057.3.

2. Амельченко E.M., Зворыкина C.B., Безряднов Д.В., Чехов С.А., Анохин К.В. В поисках следа памяти: экспрессия c-Fos в мозге мышей при восстановлении памяти, нарушенной ингибитором синтеза белка при обучении. // Iм Международная междисциплинарная конференция "Современные проблемы системной регуляции физиологических функций". Сафага, Египет, 2010. Тезисы докладов. С. 16-17.

3. Anokhin К.V., Zworykina S.V., Amelchenko Е.М., Bezryadnov D.V., Chekhov S.A. Reminder-induced recovery of fear memory impaired by inhibition of protein synthesis in mice. // Abstracts of 8,h IBRO World Congress of Neuroscience. Florence, Italy, 2011. B294.

4. Anokhin K.V., Zworykina S.V., Amelchenko E.M., Bezryadnov D.V., Chekhov S.A. Recovery of fear memory impaired by inhibition of protein synthesis in mice. // Abstracts of 41s' Society for Neuroscience annual meeting. Washington, DC, USA, 2011.

5. Амельченко E.M., Зворыкина C.B., Безряднов Д.В., Чехов С.А., Анохин К.В. Повышение экспрессии транскрипционного фактора c-Fos в гиппокампе мышей, вызванное напоминанием, как возможный механизм восстановления нарушенной памяти. // XV Школа-конференция молодых ученых Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН. Москва, Россия, 2011. Тезисы докладов. С. 27.

6. Amelchenko Е.М., Zworykina S.V., Bezryadnov D.V., Chekhov S.A., Anokhin K.V. In pursuit of the forgotten: reminder-induced recovery of fear memory impaired by

inhibition of protein synthesis in mice. // Abstracts of A joint meeting of European Molecular and Cellular Cognition Society and Haifa forum for Brain and Behavior. Haifa, Israel, 2012. P. 6-7.

7. Зворыкина C.B., Амельченко E.M., Анохин K.B. Поиск механизмов регенерации памяти: экспрессия c-Fos при восстановлении памяти, нарушенной блокадой синтеза белка. // 5™ Международная конференция по когнитивной науке. Калининград, Россия, 2012. Тезисы докладов. С. 368-369.

8. Амельченко Е.М., Зворыкина C.B., Безряднов Д:В., Чехов С.А., Анохин К.В. Процедура напоминания вызывает градуальное восстановление нарушенной памяти и экспрессию c-Fos в гиппокампе у мышей. // 10" Курчатовская молодежная научная школа. Москва, Россия, 2012. Тезисы докладов. С.57.

9. Амельченко Е.М., Зворыкина C.B., Безряднов Д.В., Чехов С.А., Анохин К.В. Восстановление нарушенной памяти и экспрессия гена c-Fos в мозге амнестичных животных в ответ на напоминающие воздействия. // Б юл л. экспер. биол. мед. - 2012. — Т. 153 - № 5. - С. 698-702.

10. Амельченко Е.М., Зворыкина C.B., Безряднов Д.В., Чехов С.А., Анохин К.В. Возможность репарации памяти: напоминание восстанавливает условнорефлекторное замирание, нарушенное ингибитором синтеза белка у мышей. // Жури. высш. нерв. деят. - 2013. - Т. 63. - №2. - С. 227-234.

Подписано в печать 12.03.2014 г.

Заказ № 45 Типография ООО "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, Тел. (499)152-00-16 Тираж 100 шт.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Амельченко, Евгений Михайлович, Москва

российская академия медицинских наук

федеральное государственное бюджетное учреждение научно-исследовательский институт нормальной физиологии

им. П.К.АНОХИНА

04201457131

На правах рукописи УДК 612.821.2

Амельченко Евгений Михайлович

ВОССТАНОВЛЕНИЕ ПАМЯТИ, НАРУШЕННОЙ ИНГИБИТОРОМ СИНТЕЗА БЕЛКА, У МЫШЕЙ: ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ И ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКА с-Ров В МОЗГЕ ПРИ «НАПОМИНАНИИ»

03.03.01 - Физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.м.н., член-корр. РАН и РАМН, профессор Анохин Константин Владимирович

Москва 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений..................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................6

Актуальность исследования.....................................................................................6

Цель и задачи исследования.....................................................................................8

Научная новизна работы..........................................................................................8

Научно-практическое значение работы..................................................................9

Положения, выносимые на защиту.........................................................................9

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................11

Введение...................................................................................................................11

Консолидация - экспериментальный феномен. Данные, послужившие основой для формирования представления о консолидации............................................13

Консолидация памяти с точки зрения разных уровней протекания данного процесса в мозге.............................................................................15

Феномен восстановления нарушенной памяти....................................................22

"Чаи'

Экспериментальные свидетельства возможности восстановления памяти. Разнообразие ситуаций, в которых наблюдается этот феномен. Возможные мишени амнестических агентов, применяемых во время

обучения.........................................................................................................22

Условнорефлекторное замирание как модель формирования аверсивной эмоциональной памяти: описание модели, нейроанатомические и нейрохимические основы приобретенного условнорефлекторного страха.....27

Описание модели..........................................................................................27

Нейроанатомический субстрат условнорефлекторного замирания........28

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.........................................................................................43

Животные.......................................................................................................43

Экспериментальные камеры и условия......................................................43

Поведенческие процедуры...........................................................................43

Вещества, дозировки и способ введения....................................................44

Экспериментальные группы........................................................................44

Иммуногистохимическая детекция белка с-Ров........................................45

Количественный анализ экспрессии с-Ров.................................................46

Статистический анализ.................................................................................47

РЕЗУЛЬТАТЫ...............................................................................................................48

Поведение животных во время обучения условнорефлекторному замиранию 48

Поведение животных во время процедуры напоминания..................................51

Поведение животных во время тестирования памяти на звуковой УС.............51

Градуальное восстановление нарушенной памяти после напоминания...........54

Количественный анализ экспрессии транскрипционного фактора с-Рое в мозге после напоминания.................................................................................................55

Количественный анализ экспрессии с-Роб в гиппокампе после напоминания..................................................................................................56

Количественный анализ экспрессии с-Роб в миндалине после напоминания..................................................................................................59

Количественный анализ экспрессии с-Ров в префронтальной коре после напоминания..................................................................................................62

Поведение животных во время тестирования памяти на звуковой УС.............65

Количественный анализ экспрессии транскрипционного фактора с-Роб в мозге после тестирования памяти на звуковой УС........................................................67

Количественный анализ экспрессии с-Рое в гиппокампе после тестирования памяти на звуковой УС........................................................67

Количественный анализ экспрессии с-Роб в миндалине после тестирования памяти на звуковой УС........................................................69

Количественный анализ экспрессии с-Роб в слуховой коре после тестирования памяти на звуковой УС........................................................73

ОБСУЖДЕНИЕ.............................................................................................................74

Поведение животных во время обучения и тестирования памяти на звуковой УС........................................................................................................"....................74

Топография экспрессии транскрипционного фактора с-Роб в мозге после напоминания............................................................................................................77

Топография экспрессии с-Ров в гиппокампе после напоминания...........78

Топография экспрессии с-Роб в миндалине после напоминания.............80

Топография экспрессии с-Ров в префронтальной коре после напоминания..................................................................................................80

Топография экспрессии с-Роб в передней цингулярной коре после напоминания..................................................................................................82

Топография экспрессии с-Роб в мозге при восстановлении памяти..................82

Топография экспрессии с-Роб в мозге после тестирования памяти на звуковой УС...................................................................................................84

Топография экспрессии с-Роб в гиппокампе после тестирования памяти на звуковой УС..............................................................................................84

Топография экспрессии с-Бов в миндалине после тестирования памяти

на звуковой УС..............................................................................................85

Топография экспрессии с-Ров в слуховой коре после тестирования памяти на звуковой УС.................................................................................87

Возможные побочные эффекты действия ингибитора синтеза белка...............88

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.............................................................................................................91

ВЫВОДЫ.......................................................................................................................93

ЛИТЕРАТУРА...............................................................................................................95

Список сокращений

АСС - передняя цингулярная кора (anterior cingulate cortex)

АР-1 - активаторный белок 1 (activator protein 1)

ВА - базальное ядро миндалины (basal amygdaloid nucleus)

BLA - базолатеральный комплекс ядер миндалины (basolateral amygdaloid nucleus) СА1 - поле CA1 гиппокампа САЗ - поле САЗ гиппокампа

СеА - центральное ядро миндалины (central amygdaloid nucleus)

CeAl - латеральная часть центрального ядра миндалины (central amygdaloid nucleus, lateral part) CeAm - медиальная часть центрального ядра миндалины (central amygdaloid nucleus, medial part)

DG - зубчатая фасция гиппокампа (dentate gyrus)

LA - латеральное ядро миндалины (lateral amygdaloid nucleus)

PL - прелимбическая кора (prelimbic cortex)

AK - активный контроль

БС - безусловный стимул

ГАМК - гаммааминомасляная кислота

ДВП - долговременная потенциация

ИСБ - ингибитор(-ы) синтеза белка

Нап - напоминание

ПК - пассивный контроль

РГ - «ранние» гены

УРЗ - условнорефлекторное замирание

УС - условный стимул

ФР - физиологический раствор

ЦГ - циклогексимид

ЭКР - электрокожное раздражение

ЭСШ - электросудорожный шок

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Память является одной из основных функций мозга, которая обеспечивает адаптивное поведение организмов в условиях изменяющейся окружающей среды. Вызванные обучением изменения поведения организма, работы областей мозга, активности клеточных ансамблей и отдельных нейронов, а также лежащие в основе этого молекулярно-биологические процессы в совокупности составляют одну из ключевых проблем современной нейробиологии (Dudai, 2012; Gallistel and Matzel, 2013).

Эпизоды приобретения нового опыта могут быть как достаточно длительными, так и сравнительно кратковременными, занимая секунды. Тогда как память об этих событиях, вне зависимости от длительности обучения, зачастую храниться месяцами и даже годами. Известно, что в первые минуты и часы после обучения память переходит из кратковременной, лабильной формы в долговременную стабильную (Agranoff et al., 1965; McGaugh, 1966; Анохин, 1997; Medina et al., 2008), другими словами фиксируется, консолидируется, постепенно приобретая устойчивость к действию различных амнестичных агентов (McGaugh, 2000). Многие клеточные и молекулярные процессы, обеспечивающие консолидацию памяти, описаны в литературе (Goelet et al., 1986; McGaugh, 2000; Abel and Lattal, 2001; Kandel, 2001) и послужили основой для создания схемы каскада событий, приводящих к формированию долговременной памяти.

Критическая значимость отдельных этапов каскада молекулярных событий для консолидации была продемонстрирована в работах с использованием специфических интерферирующих воздействий. Животных подвергали действию амнестических агентов незадолго до или сразу после ситуации обучения, что приводило к нарушению долговременной памяти и развитию амнезии, которую в большинстве случаев считали необратимой (Sara and Hars, 2006, Flexner et al.,1963; Gibbs, Ng, 1977; Davis, Squire, 1984; Bourtchouladze et al., 1994, 1998).

Однако с конца 60-х годов XX века начали накапливаться данные, свидетельствовавшие о том, что память, нарушенная во время консолидации, тем не менее, может быть восстановлена (Sara and Hars, 2006). В качестве интерферирующих воздействий в этих экспериментах использовали электроконвульсивный шок (Quartermain et al., 1970; Cooper and Koppenaal, 1964; Kohlenberg and Trabasso, 1968) или введение антибиотиков-ингибиторов синтеза белка (Quartermain et al., 1970, Randt et al., 1972; Squire and Barondes, 1972). При этом, наблюдали спонтанное восстановление нарушенной памяти (Cooper and Koppenaal, 1964;

Kohlenberg and Trabasso, 1968; Quartermain et al., 1970; Squire and Barondes, 1972) или восстановление, связанное с использованием процедуры «напоминания», которая заключалась в предъявлении животному перед тестом на долговременную память одного из компонентов ситуации обучения: условного или безусловного сигнала (Lewis et al., 1968; Koppenaal et al., 1967; Miller and Springer, 1972; Quartermain et al., 1972; Radyushkin and Anokhin, 1999).

Результаты этих экспериментов послужили основой для развернувшейся дискуссии о необходимости синтеза белка для процесса консолидации памяти, а также о возможной природе экспериментальной амнезии (Davis and Squire, 1984; Miller and Matzel, 2006; Sara and Hars, 2006). Согласно классической точке зрения, нарушение консолидации считали необратимым, приводящим к нарушению приобретения, хранения и извлечения из памяти индивидуального опыта (Davis and Squire, 1984). Наблюдаемое же в ряде случаев "восстановление" памяти связывали с новым обучением или с недостаточной эффективностью интерферирующих воздействий (Gold and King, 1974; McGaugh and Petrinovich, 1966). Противники этой точки зрения предполагали, что амнезия связана лишь с невозможностью извлечения из памяти ранее приобретенного опыта, которая вызвана действием амнестического агента. В качестве аргументов использовали работы, в которых была показана возможность восстановления памяти спонтанно, в результате действия напоминания или введения экспериментальным животным психоактивных веществ (Miller and Springer, 1973; Lewis and Mäher, 1966; Quartermain, 1988; Radyushkin and Anokhin, 1999). Таким образом, обсуждение возможных сценариев формирования долговременной памяти и причин амнезии привело к пересмотру считавшейся долгое время незыблемой концепции консолидации (Sara and Hars, 2006). Однако в последующие годы данная тема не получила продолжения, и были выполнены лишь отдельные исследования возможности восстановления памяти, нарушенной во время консолидации, а также молекулярных процессов, лежащих в основе данного феномена (Radyushkin and Anokhin, 1999).

В настоящей работе мы сочли необходимым вернуться к исследованию возможности восстановления памяти, нарушенной введением ингибиторов синтеза белка при обучении, а также исследовать один из ключевых этапов каскада молекулярных событий, сопровождающих обучение и извлечение ранее приобретенного опыта, - активацию генома нейронов, вызванную восстановлением нарушенной памяти. В качестве экспериментальной модели нами было выбрано однократное обучение условнорефлекторному замиранию у мышей. Преимущества данной модели заключаются в том, что ассоциативный навык приобретается животными в течение одного сеанса, а формирующаяся при этом память является долговременной (Fanselow, 1980., Payor et al., 1994, Stiedl and Spess, 1997). Являясь весьма популярной, данная

поведенческая методика позволила подробно описать нейрональный субстрат и каскады молекулярных событий, необходимых для обучения и формирования долговременной памяти у млекопитающих (Kim et al., 1993; Milanovic et al., 1998; Radulovic et al., 1998; Schafe and LeDoux, 2000; Fanselow and LeDoux, 1999; Pape and Pare, 2010). Первым этапом изменений на молекулярном уровне является экспрессия «ранних» генов, в частности, c-fos, в нейронах головного мозга в ситуациях, связанных с новизной, обучением и извлечением приобретенного опыта, требующих при этом пластических перестроек (Анохин, 1997; Guzowski, 2002, 2005; Flavell and Greenberg, 2008). В настоящей работе экспрессия c-Fos была использована с целью выявления локусов пластических событий, происходящих в мозге амнестичных животных под действием напоминания, а также для обнаружения сходств и различий активации мозга на условный сигнал у животных с нормальной и восстановленной памятью.

Цель и задачи исследования

Перед работой была поставлена цель:

исследовать возможность и особенности процесса восстановления памяти, нарушенной блокадой синтеза белка при обучении мышей в модели условнорефлекторного замирания, а также различия в активности областей мозга амнестичных животных по сравнению с необученными животными и животными с нормальной памятью.

Для достижения поставленной цели мы решали следующие конкретные задачи:

1) исследовать возможность восстановления памяти, нарушенной у мышей введением ингибитора синтеза белка циклогексимида, при обучении в модели условнорефлекторного замирания;

2) изучить временную динамику процесса восстановления памяти, нарушенной введением циклогексимида;

3) провести сравнительный анализ активности мозга по экспрессии c-Fos после напоминания у животных с нарушенной и нормальной памятью;

4) провести сравнительный анализ активности мозга по экспрессии c-Fos при предъявлении условного сигнала животным с нормальной и восстановленной памятью.

Научная новизна работы

В работе впервые разработана методика восстановления памяти напоминанием в модели условнорефлекторного замирания у мышей. Впервые выяснено, что память, нарушенная введением ингибитора синтеза белка циклогексимида при обучении, может быть восстановлена кратковременной процедурой поведенческого напоминания. Впервые описана временная

динамика данного процесса. Впервые показано, что восстановление напоминанием нарушенной памяти у млекопитающих является медленным градуальным процессом и начинается не ранее, чем через 6 часов после напоминания.

В работе исследована экспрессия транскрипционного фактора c-Fos в мозге животных после напоминания и тестирования. Установлено, что процедура напоминания вызывала различную активацию полей гиппокампа, цингулярной и прелимбической коры, которая зависела от степени сохранности памяти у животных разных экспериментальных групп. При этом впервые установлено, что экспрессия c-Fos в зубчатой фасции и поле CAI гиппокампа предшествует восстановлению нарушенной памяти, а в поле САЗ и прелимбической коре наблюдается при реактивации нормально сформированной памяти, причем таких изменений не наблюдали в мозге амнестичных животных.

Научно-практическое значение работы

Полученные в настоящей работе данные указывают на возможность восстановления памяти, нарушенной во время консолидации, с помощью предъявления напоминающих стимулов через достаточно длительное (до 24 часов) время после нанесения повреждающего память воздействия. Сходства свойств и динамики этого процесса восстановления у млекопитающих с данными, ранее полученными на птицах, позволяет предполагать, что память, считающаяся нарушенной и безвозвратно потерянной, потенциально может быть восстановлена и у человека. При этом ключевым вопросом становится подбор адекватных воздействий, способных реактивировать след памяти или же замедлить его диссоциацию при нейродегенеративных заболеваниях у человека.

Выявленные в настоящей работе различия в активации областей мозга животных с восстановленной памятью по сравнению с амнестичными животными и животными с нормальной памятью указывают на нейроанатомические субстраты и специфические нервные механизмы, лежащие в основе восстановления нарушенной памяти, и могут послужить основой для поиска фармакологических и других воздействий, направленных на компенсацию нарушений памяти у человека.

Положения, выносимые на защиту

1. Память, нарушенная у мышей введением ингибитора синтеза белка при обучении, может быть восстановлена процедурой поведенческого напоминания через 24 ч после обучения. Восстановление памяти не связано с повторным обучением животных, а, вероятно, является