Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внутрипопуляционная изменчивость люцерны посевной (Medicago sativa L.) по содержанию антипитательных соединений

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Внутрипопуляционная изменчивость люцерны посевной (Medicago sativa L.) по содержанию антипитательных соединений"

На правах рукописи

1

НИКИТИНА Екатерина Валерьевна

ВНУТРИПОПУЛЯЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ЛЮЦЕРНЫ ПОСЕВНОЙ (MEDICAGO SATIVA L.) ПО СОДЕРЖАНИЮ АНТИПИТАТЕЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Специальности- 03.00 12 - физиология и биохимия растений 06.01 05 - селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ООЗ 1В19Б2

Санкт-Петербург - 2007

003161962

Работа выполнена в отделах биохимии и молекулярной биологии и генетических ресурсов кормовых культур Государственного научного учреждения Государственного научного центра Российской Федерации Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н.И. Вавилова (ГНУ ГНЦ РФ ВИР)

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Конарев Алексей Васильевич, доктор биологических наук, профессор Дзюбенко Николай Иванович

Официальные оппоненты, доктор технических наук,

профессор Красильников Валерий Николаевич, кандидат сельскохозяйственных наук Синицына Светлана Михайловна

Ведущая организация- Ботанический институт им В Л Комарова, РАН

Защита диссертации состоится ноября 2007 г в часов на заседании Диссертационного Совета Д 006.041.01 при ГНЦ ВНИИР им. Н.И. Вавилова по адресу. 190000, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 44

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВНИИР им. Н.И. Вавилова.

Автореферат разослан ^октября 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, а —

профессор ОЛ^^й*^*«--, Э.А.Гончарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Люцерна (.Medicago L.) в качестве кормовой культуры широко распространена по всему миру, в том числе в зонах умеренного климата Она является одной из наиболее ценных кормовых культур, так как весьма богата белком, витаминами и минеральными веществами. Однако кормовая масса люцерны содержит некоторые химические вещества (антипитательные, или антиметаболические), которые могут приводить к заболеваниям и даже гибели сельскохозяйственных животных (Howarth, 1988) Наиболее существенной отрицательной особенностью люцерновых кормов является их способность вызывать повышенное ценообразование в пищеварительном тракте жвачных животных, что приводит к серьёзному заболеванию - тимпании, или вспучиванию жвачных. Miltimore et al. (1970) обнаружили высокую корреляцию между возникновением тимпании и концентрацией так называемой белковой фракции 18S (по коэффициенту седиментации) Однако более поздние исследования (Majak et al, 1995) не подтвердили эти результаты. Было выдвинуто предположение о том, что повышенное ценообразование от люцерновых кормов частично обусловлено присутствием в них таких продуктов вторичного метаболизма растений, как сапонины (Lindahl et al, 1957, Klita et al., 1996) Кроме того, сапонины могут вызывать и другие отрицательные реакции организма животных, например, снижать рост и яйценоскость домашней птицы (Bondi et al, 1973)

Предотвращению тимпании могут способствовать конденсированные фенолы (танины) за счет снижения пенообразования в рубце жвачных животных (Lees, 1992, Tanner et al, 1995) Однако танины при высоком их содержании в кормовой массе могут понижать перевариваемость белка и сухой массы жвачными животными (Ваггу, 1989)

Кормовая масса люцерны характеризуется также наличием такого класса вторичных метаболитов, как фитоэстрогены (изофлавоноиды и кумарины), названные так за способность производить у животных

эстрогенный эффект, часто приводящий к нежелательным последствиям для их репродуктивной системы (Moule et al, 1963) Флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты, вероятно, не представляют прямой угрозы здоровью и жизни сельскохозяйственных животных, потребляющих корма из люцерны, но также могут ухудшать вкусовые качества кормов (Howarth, 1988)

Для многолетних видов люцерны, как для перекрестноопыляющихся культур, характерен высокий уровень внутрипопуляционной изменчивости по биохимическим признакам (Иванов, Гаврилюк, Эгги, 1979, Полякова, Ершова, 2000) В связи с вышеизложенным, актуально изучить эту изменчивость по антипитательным биохимическим признакам, оказывающим наиболее существенное влияние на эффективность использования люцерновых кормов, а также связь этих признаков с одним из основных показателей качества кормовой массы - содержанием белка Мы попытались также высказать свои соображения по наиболее эффективной форме отбора растений в ходе селекции на качество вегетативной массы люцерны.

Дели и задачи исследования. Целью настоящей работы является характеристика закономерностей внутрипопуляционной изменчивости содержания антипитательных веществ на примере двух селекционных популяций люцерны посевной, или синей {Medicago sativa L.) для более эффективной селекции на качество В задачи исследования входило

• определить на уровне индивидуальных растений содержание основных антипитательных веществ (сапонины, фитоэстрогены) и величину показателя пенообразования, а также некоторых других вторичных соединений, присутствие которых может оказать существенное влияние на формирование антипитательных свойств люцерны (танины, флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты) для двух взятых в изучение селекционных популяций люцерны;

• выявить закономерности внутрипопуляционной изменчивости у двух селекционных популяций люцерны по содержанию белка и важнейших антипитательных факторов для обоснованного формирования селекционного материала (селекционной популяции)

Научная новизна. Впервые для люцерны, произрастающей в условиях Северо-Западного региона, выявлены закономерности внутрипопуляционной изменчивости по содержанию белка и важнейшим антипитательным факторам. Показано, что внутрипопуляционное распределение растений люцерны по содержанию антипитательных соединений характеризуется преобладанием растений с относительно невысоким содержанием данных веществ при наличии малочисленных групп растений с их высоким содержанием Установлено, что содержание сапонинов в растениях исследованных популяций люцерны достоверно коррелирует со способностью зелёной массы к пенообразованию, т.е может влиять на заболеваемость жвачных животных тимпанней.

Практическая значимость работы. Полученные данные о закономерностях внутрипопуляционной изменчивости у люцерны посевной по содержанию белка и важнейших антипитательных веществ позволят более эффективно вести селекцию культуры на улучшение питательных (кормовых) свойств В частности: выделять в селекционной популяции группу растений со стабильным содержанием белка или определенных важных для целей селекции антиметаболитов и вести селекционную работу, формируя популяцию на основе выделенных генотипов. Для оценки большого числа растений предложен экспресс-метод определения содержания основных антипитательных соединений люцерны с использованием инфракрасной спектроскопии.

Апробация работы. Результаты работы доложены и обсуждены на научно-практических конференциях аспирантов и молодых ученых ГНУ ГВЦ РФ ВИР им. Н.И. Вавилова в 1996 и 1998 гг., на совещаниях отделов

биохимии и молекулярной биологии и генетических ресурсов кормовых культур ГНУ ГНЦ РФ ВИР им Н.И. Вавилова

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 работы.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав (отражающих результаты исследования и их обсуждение), выводов, списка литературы, включающего 94 наименования, в том числе 75 иностранных, и приложения. Диссертация изложена на 104 страницах, иллюстрирована 8 таблицами и 25 рисунками

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследования служили две взятые в качестве модельных селекционные популяции люцерны посевной, выращенные на Павловской опытной станции ВИР популяция Д-2, несущая мутацию многолисточковости (ген ш^, и популяция Д-6, характеризующаяся повышенной семенной продуктивностью.

Закладку питомников проводили согласно "Методическим указаниям по изучению коллекции многолетних кормовых трав" (ВИР, 1985). Изучались растения первого укоса, равномерно распределённые по всей делянке.

Метеорологические условия вегетационного периода в Ленинградской области в 1996-1997 гг (за апрель-июнь) были близки к средним многолетним показателям 1997 год по сравнению с предыдущим был более тёплым и менее дождливым. Зима 1996-1997 гг отличалась частыми оттепелями и невысоким снежным покровом

Надземную часть растений люцерны брали в фазе начала цветения, в зависимости от метеоусловий в сроки с 13 июня по 15 июля. В 1996 г в каждой из популяций были изучены по 120 растений. В 1997 г. количество изученных растений люцерны было меньшим из-за гибели в зимний период части растений Содержание сухих веществ и белка определено по

методикам отдела биохимии ВИР (Ермаков, 1987) Индекс пенообразования определяли по способности сухой массы люцерны образовывать в модельных условиях пену (Дзюбенко, Марьина, 1986) Для придания этому показателю универсального характера введен стандарт - количество образуемой пены у нетимпанийного растения, лядвенца рогатого (Lotus corniculatus L ) Индекс пенообразования, таким образом, указывает, во сколько раз исследуемое растение образует больше устойчивой пены, чем лядвенец рогатый Для определения содержания сапонинов и фитоэстрогенов использован метод инфракрасной спектроскопии (прибор Inframatic-8620) Калибровочные кривые для работы этим методом построены по данным, полученным методами гемолитического индекса для сапонинов (Илиева, Васильева, 1989) и тонкослойной хроматографии на силикагеле для фитоэстрогенов (Ермаков, 1987). Содержание танинов определено с ванилиновым реактивом, а содержание флавоноидов и фенолкарбоновых кислот - с использованием бумажной хроматографии (Самородова-Бианки, Стрельцина, 1990)

С помощью стандартной программы Microsoft Excel 2000 построены кривые распределения растений в популяциях по величине изученных показателей и проведен корреляционный анализ Анализ главных компонент проведён с помощью хорошо зарекомендовавшей себя в исследованиях, выполненных в последние годы в ВИР им Н.И Вавилова, программы Statistica 5 5

АНАЛИЗ ВНУТРИПОПУЛЯЦИОННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ЛЮЦЕРНЫ ПОСЕВНОЙ ПО БИОХИМИЧЕСКИМ ПРИЗНАКАМ

Люцерна посевная - перекрестноопыляющаяся культура, для которой показана высокая внутрипоп/ляционная изменчивость по многим морфо-биологическим, физиологическим, биохимическим и другим признакам (Иванов, Гаврилюк, Эгги, 1979, Полякова, Ершова, 1985, 2000) Наименее изучена внутрипопуляционная изменчивость биохимических показателей Между тем, знание закономерностей внутрипопуляционной изменчивости

важнейших биохимических признаков, обусловливающих качество кормовой массы люцерны, необходимо для проведения целенаправленных отборов элитных форм и повышения эффективности селекции культуры в целом.

Анализ биохимических признаков индивидуальных растений позволил оценить по ним характер распределения растений в популяции Полученные данные представлены в виде графиков, отражающих состав изученных популяций по анализируемым признакам. Популяции разбиты на группы, соответствующие определённым интервалам значений признаков. Таким образом, графики дают представление о частоте встречаемости растений с определенным содержанием изучаемых веществ в рассматриваемой популяции

15 20 25 30 сухое вещество, %

сухое вещество, %

А Б

Рис 1. Распределение растений люцерны по содержанию сухих веществ А - 1996 г., п (Д-2) = 119, п (Д-6) = 120 Б - 1997 г., п (Д-2) = 98, п (Д-6) = 94 —♦— псгут+яд-2 i пспугщяд-б

Масса сухих веществ. По данным Monsanto (2003), кормовая масса люцерны посевной в фазе отрастания/раннего цветения содержит 17,9 -29,2% сухих веществ Н.И Дзюбенко, О.И. Марьина (1986) приводят данные по содержанию сухих веществ для этой культуры в пределах 20,24-26,58% В наших опытах исследованные популяции люцерны содержали в среднем

сухого вещества в 1996 г популяция Д-2 - 22,30%, Д-6 - 22,55%, в 1997 г Д-2 - 22,55%, Д-6 - 21,67%.

На рис 1 представлены графики распределения растений в популяциях по содержанию сухого вещества. Анализируя внутрипопуляционную изменчивость люцерны по данному показателю, мы не обнаружили существенных различий по накоплению сухого вещества растениями изученных популяций люцерны ни между популяциями, ни по годам изучения.

Белок. А.И. Сметанникова приводит для люцерны посевной в условиях Ленинградской области значения содержания белка в диапазоне 11,8-26,9% (1967) ЯМ Абдушаеваидр (2006) для Новгородской области приводят для люцерны изменчивой данные по содержанию белка- 10,5-17,5% По данным Ensmmger et al (1990), кормовая масса люцерны посевной в фазе отрастания/раннего цветения содержит 17,9% белка на сухой вес. Monsanto (2003) приводит следующий диапазон значений содержания белка на сухой вес в той же фазе развития растений - 15,3-25,8% Согласно полученным нами данным, в 1996 г в популяции Д-2 содержалось в среднем 15,39% белка на сухой вес, а в популяции Д-6 - 17,10% В 1997 г популяция Д-2 содержала в среднем 15,64% белка на сухой вес, а популяция Д-6 - 16,28%. Таким образом, наши результаты в целом соответствовали данным, полученным другими авторами Следовательно, определение антипитательных факторов было проведено в популяциях, характеризующихся средними, типичными для люцерны значениями важнейших признаков качества - накопление сухих веществ и белка

По содержанию белка на уровне индивидуальных растений обе исследованные популяции характеризовались их распределением, близким к нормальному распределению Гаусса (рис. 2). В популяции Д-2 наиболее многочисленная группа растений содержала белок в одном и том же интервале значений за оба года изучения, а для растений популяции Д-6 в 1997 г этот интервал сдвинулся в сторону более низких значений

содержания белка по сравнению с 1996 г.. В зимний период в популяции Д-2 вымерзло 18,3% растений, а в популяции Д-6 - 21,7%. На рис ЗА показано распределение этих растений по содержанию белка согласно данным за 1996 г. Из анализа полученных данных можно сделать вывод о том, что растения как с низким, так и в особенности с высоким содержанием белка (то есть характеризующиеся крайними значениями данного показателя), менее устойчивы к вымерзанию

45 -40 -35 -30 -5 25 -| 20 -5« 15 -10 -5 -

0 -

2

белок, % сырого веса

40

35

30

25

Ф

Я 20

N

& 15

Ю

5

0

2 4

белок, % сырого веса

А Б

Рис. 2 Распределение растений люцерны по содержанию белка. А - 1996 г., п (Д-2) = 118, п (Д-6) =119 Б - 1997 г, п (Д-2) = 90, п (Д-6) = 86 —»—псгт/гац-яд^ в пспугк+яд-б

Содержание белка у большинства растений не было стабильным в течение срока изучения. Практически неизменным оказалось содержание белка только у 35% растений в популяции Д-2, и у 21% растений популяции Д-6 Распределение растений внутри данной группы по содержанию белка отражено на рисунке ЗБ.

белок, % сырого веса

А Б

Рис 3 Распределение растений люцерны по содержанию белка А - растения, вымерзшие зимой 1996-1997 гг., п (Д-2) = 29, п (Д-6) = 34 Б - растения, характеризующиеся стабильным содержанием белка за 19961997 гг. п (Д-2) = 31, п (Д-6) = 19 —|—. пспугщя д-2

- в лсгупрцяд-б

Пенообразование. Ю.В. Харченко (1994) изучил пенообразующую способность нескольких видов и селекционных сортов люцерны в условиях Полтавской области. Данные в его работе представлены в миллилитрах образованной пены, что лишает возможности сравнения этих данных с таковыми, полученными в нашей работе По нашим данным, в 1996 г. среднее значение индекса пенообразования для популяции Д-2 равнялось 1,84, а для популяции Д-6 - 2,51 В 1997 г этот показатель составил 2,75 и 2,82, соответственно

Ю В Харченко наблюдал значительный внутрипопуляционный полиморфизм растений люцерны по пенообразующей способности, что было подтверждено данными наших исследований в условиях Северо-Западного региона РФ. Распределение растений внутри популяций по способности к пенообразованию носило практически симметричный характер в 1996 г. и сохранилось таким в 1997 (рис 4) При анализе внутрипопуляционной изменчивости было выяснено, что у растений популяции Д-2 способность к

пенообразованию в 1997 г. по сравнению с 1996 г. возросла в большей степени, чем у растений популяции Д-6 Популяция Д-6 продемонстрировала бблыную стабильность по данному признаку, при этом в целом она характеризовалась более высокой способностью к пенообразованию

А Б

Рис. 4. Распределение растений люцерны по способности к пенообразованию.

А - 1996 г, п (Д-2) = 108, п (Д-6) =111 Б - 1997 г; л (Д-2) = 89, п (Д-6) = 85 —патугн+яд-2

■ пспугщяд-6

Сапонины. Некоторые авторы считают высокосапониновыми те растения, которые содержат более 1% этих веществ на сухой вес (Fenwick, Oakenfull, 1983) Другие полагают, что к таковым следует относить растения с содержанием сапонинов на сухой вес 0,47% и выше (Livingston et al., 1979). Растения популяции Д-2 в 1996 г/ содержали в среднем 0,25% сапонинов на сухой вес, а растения популяции Д-6 - 0,56%. В 1997 г. среднее содержание сапонинов в растениях обеих изученных популяций значительно возросло для популяции Д-2 этот показатель составил 0,49%' на сухой вес, а для популяции Д-6 - 0,74% Таким образом, в 1996 г. в популяции Д-6, а в 1997 г в обеих популяциях среднее содержание сапонинов превышало 0,47% на

сухой вес, то есть, по мнению некоторых исследователей, эти популяции можно отнести к высокосапониновым

В обеих исследованных популяциях люцерны распределение растений по данному показателю отличалось от нормального распределения Гаусса -большинство растений содержало относительно мало сапонинов при наличии малочисленной группы растений с высоким содержанием данных веществ (рис. 5) Мы предполагаем, что это обусловлено формированием механизмов адаптации к неблагоприятным условиям внешней среды в процессе эволюции на популяционном уровне. Популяция Д-6 в целом характеризовалась более высоким содержанием сапонинов

45

40

35

'1 30

| 25

8 20 о.

И 15 10

5

0

0 200 400

сапонины, мг/100 г сырого веса

0 100 200 300 400 500

сапонины, мг/100 г сырого веса

А Б

Рис. 5. Распределение растений люцерны по содержанию сапонинов.

1996 г: п (Д-2) = 110, п (Д-6) = 114

1997 г. п (Д-2) = 95, п (Д-6) = 82 —пспу1Щяд-2

■ пспугщяд-6

Закономерность распределения растений, вымерзших зимой 1996-1997 гг, по содержанию сапонинов для популяции Д-2 оказалась сходной таковой по содержанию белка. Вымерзшие растения этой популяции в основном относились как к высоко- ( из них погибло 42,9% растений), так и к низкосапониновым (28,6%). В популяции Д-6 из низкосапониновых растений вымерзло только 10,0% В то же время растения с максимальным

содержанием сапонинов, как и в популяции Д-2, оказались менее зимостойкими (в этой группе вымерзло 50,0% растений) В изученных популяциях люцерны выделены растения, у которых содержание сапонинов за два года исследования практически не изменилось. Таких растений оказалось немного 9,8% в популяции Д-2 и 14,8% в популяции Д-6

Танины. По данным ЯоЬЬтБ е1 а1 (1998), оптимальное (одновременное снижение ценообразования и отсутствие негативного воздействия на качество кормовой массы) содержание танинов в кормовой массе составляет 3-4% на сухой вес В 1996 г большинство растений обеих исследованных популяций люцерны содержало танины в значительно меньших количествах Среднее содержание танинов у растений популяции Д-2 составило 0,08%, а максимальное - 0,23%. Для популяции Д-6 эти показатели равнялись 0,13 и 0,31%, соответственно. Кривые распределения растений по содержанию танинов для обеих исследованных популяций характеризовались наличием малочисленных групп растений с более высоким содержанием этих веществ, чем у большинства растений популяции. В связи с тем, что в обнаруженных концентрациях данные вещества не могут оказать существенного влияния на качество кормовой массы люцерны, в 1997 г. их изучение продолжено не было.

Фитоэстрогены. Бюкой1 et а1 (1972) высказали мнение, что содержание фитоэстрогенов в кормовой массе люцерны более 0,5% на сухой вес может привести к заболеваниям крупного рогатого скота и овец. Согласно полученным нами данным, в 1996 г растения популяции Д-2 содержали в среднем 0,18% фитоэстрогенов на сухой вес, а в растениях популяции Д-6 в - 0,19% Более 0,5% фитоэстрогенов на сухой вес содержали только три растения популяции Д-2 и одно растение популяции Д-6. В 1997 г ни одно растение не содержало фитоэстрогены в количестве, превышающем 0,5% на сухой вес Таким образом, изученные в условиях Северо-Западного региона РФ селекционные популяции люцерны характеризовались в целом низким содержанием фитоэстрогенов, однако в

один год изучения в обеих популяциях присутствовали отдельные растения с

относительно высоким содержанием этих веществ (рис 6)

1« а.

И

ВО 70 60 50 40 30 20 10

0

50

-9 V 1—в 100

150

фитозстрогены, мг/100 г сырого веса

А Б

Рис. 6 Распределение растений люцерны по содержанию фитоэстрогенов. А - 1996 г; п (Д-2) = 120, п (Д-6) = 116 Б - 1997 г., п (Д-2) = 95, п (Д-6) = 82 —*—пслугн+яд^ в гщта^д-б

Среди растений, вымерзших зимой 1996-1997 гг, большинство составили те, у которых содержание фитоэстрогенов было минимальным (рис 7А). Растения с наиболее высоким содержанием фитоэстрогенов также были менее жизнеспособны, однако среди них выжило значительно больше особей, чем среди тех, которые накапливали мало данных веществ.

Была выделена группа растений, характеризующихся стабильным в годы изучения содержанием фитоэстрогенов. Их оказалось немного - 11% среди растений популяции Д-2 и 18% среди растений популяции Д-6 (рис 7Б).

О 100 200 300

фит©эстрогены, мг/100 г сухого веса

фитоэстрогены, мгЛОО г сухого веса

А Б

Рис. 7. Распределение растений люцерны по содержанию фитоэстрогенов. А - растения, вымерзшие зимой 1996-1997 гг., п (Д-2) = 29, п (Д-6) = 33 п Б - растения со стабильным содержанием фитоэстрогенов за 1996-1997 гг, п (Д-2) = 9, п (Д-6) =15

—-паугя4<яд-2 в пспугщяд-6

Флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты. По данным за 1996 г, в популяции Д-2 наиболее многочисленная группа растений содержала эти соединения в небольших количествах При этом некоторые растения этой популяции содержали относительно много флавоноидов и фенолкарбоновых кислот. Для популяции Д-6 наблюдали отсутствие максимума на кривой распределения по данному показателю и отсутствие растений с высоким содержанием указанных веществ

Из исследованных нами признаков наименее вариабельными оказались накопление растениями сухих веществ (коэффициенты вариации для изученных популяций за два года исследования колебались в пределах 6,9113,86%) и белка (коэффициенты вариации 7,55-10,72%). Максимальная изменчивость наблюдалась по содержанию флавоноидов и фенолкарбоновых кислот (коэффициент вариации в 1996 г. для популяции Д-2 составил 61,77%, а для Д-6 - 62,3%) В целом, изменчивость по накоплению вторичных

метаболитов была значительно выше, чем по накоплению сухих веществ и белка На наш взгляд, это свидетельствует об участии вторичных метаболитов растений в приспособлении к меняющимся условиям внешней среды.

Корреляционный анализ. Для исследованных сортовых популяций люцерны обнаружена тесная связь между способностью к образованию пены в опытных (лабораторных) условиях и содержанием сапонинов Эта связь проявилась у обеих популяций в оба года изучения (табл 1) Таким образом, мы склоняемся к тому мнению, что сапонины могут оказывать влияние на возникновение тимпании у крупного рогатого скота, способствуя образованию пены в рубце жвачных животных. Среди специалистов до сих пор не существует единого мнения по вопросу влияния сапонинов на заболеваемость жвачных животных тимпанней В литературе отражены противоположные точки зрения (Юйа ег а1, 1996, Ма^ ег а1,1995).

Таблица 1

Корреляция между содержанием сапонинов и способностью к

пенообразованию у растений люцерны

Год Популяция Показатели, характеризующие корреляцию

Коэффициент корреляции ^-критерий

1996 Д-2 0,796 180

Д-6 0,799 182

1997 Д-2 0,782 131

Д-6 0,647 54

В 1996 г. не было обнаружено достоверной корреляции между способностью изученных популяций люцерны к пенообразованию и содержанием танинов в растениях.

Мы не выявили корреляционной зависимости между содержанием белка и сапонинов, что согласуется с данными Н.И.Дзюбенко и О.И Марьиной (1986) и ЮВХарченко (1994), а также между содержанием белка и величиной остальных изученных антипитательных факторов (индекс пенообразования, содержание фитоэстрогенов) Ю В Харченко (1994) также не выявил связи между содержанием общего белка и пенообразующей

способностью люцерны Таким образом, согласно литературным и полученным нами данным, селекция на снижение антипитательных факторов в люцерне не должна привести к снижению количества белка

Анализ главных компонент. Анализируя веса главных компонент для исследованных популяций люцерны (табл 2), можно заметить, что первая компонента тесно связывает такие признаки как индекс пенообразования и содержание сапонинов. Вторая компонента связывает содержание сухих веществ и белка, а также (менее тесно) содержание фитоэстрогенов

Таблица 2

Признак Главная компонента

Р=1 Р=2

Сухое вещество, % -0,19 0,91

Белок, % сырого веса 0,53 0,69

Индекс пенообразования 0,96 -0,06

Сапонины, мг/100 г сырого веса 0,95 0,03

Фитоэстрогены, мг/100 г сырого веса 0,02 0,48

Доля общей изменчивости признаков, % 42,8 30,7

На основании отмеченного выше можно сделать вывод о том, что распределение растений внутри исследованных популяций люцерны по содержанию антипитательных соединений - продуктов вторичного метаболизма растений (сапонины и фитоэстрогены, а также танины, флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты) имело сходный характер. Большинство растений популяций накапливало относительно небольшие количества данных веществ, при этом в популяциях присутствовали малочисленные группы растений, характеризующиеся высоким содержанием данных групп соединений По всей видимости, такое соотношение растений обеспечивает наибольшую жизнеспособность популяции в целом и формируется в процессе эволюции. Это необходимо учитывать при селекции люцерны на качество.

19

ВЫВОДЫ

1 Изученные селекционные популяции люцерны посевной (Medicago sativa L.) характеризуются широким диапазоном внутрипопуляционной изменчивости по содержанию важнейших антипитательных соединений, что необходимо учитывать при селекции люцерны на качество

2 Показано, что в исследованных популяциях люцерны посевной (.Medicago sativa L.) преобладают растения, характеризующиеся нестабильным (за два года изучения) содержанием антипитательных соединений (до 80% популяции) и белка (до 70% популяции) Лишь единичные растения в популяциях одновременно сохраняли стабильным содержание всех исследованных нами антиметаболических соединений и белка.

3. Растения (до 20% в популяции) со стабильным (за два года изучения) содержанием антипитательных соединений и белка (до 30% растений в популяции) характеризовались значениями этих признаков, близкими к средним по популяции.

4. Растения, характеризующиеся самыми низкими и самыми высокими концентрациями антипитательных соединений (сапонины, фитоэстрогены), белка, хуже переносят зимний период.

5. Установлено, что содержание сапонинов в растениях исследованных популяций люцерны коррелирует со способностью зелёной массы к ценообразованию, т е может влиять на возникновение тимпании жвачных

6 Отсутствие прямой зависимости между таким важным показателем качества люцерны, как содержание белка, и содержанием важнейших антипитательных факторов свидетельствует о возможности независимой селекции на эти признаки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чачко ЕВ. (Никитина), Стрельцина С А Антиметаболические вещества люцерны1 методы определения, анализ исходного материала. // Бюл. ВИР -СПб - 1998 - Вып. 236 - С.30-32

2. Стрельцина С А, Чачко Е.В. (Никитина) Антиметаболические вещества люцерны посевной и козлятника восточного: методы определения, анализ исходного материала // Бюл. ВИР.-СПб - 1999 -Вып 237 - С 43-46

3 Стрельцина С А , Жукова М А, Чачко Е В (Никитина), Дзюбенко Н И, Конарев А В Внутрипопуляционная изменчивость люцерны посевной и козлятника восточного по биохимическим показателям качества. // Сельскохозяйственная биология -2001,-№5 - С 37-46.

4. Стрельцина С.А., Юдкевич ЕВ (Никитина), Жукова М.А, Конарев А В, Дзюбенко Н И. Анализ внутрипопуляционной изменчивости люцерны посевной (.Medicago sativa L ) по биохимическим признакам качества // Аграрная Россия. - 2006,-№6- С 41-46.

Подписано в печать 0110 2007 Объем 1,0 п л Тираж 100 экз Заказ №95 Отпечатано в типографии ООО «КОПИ-Р», С-Пб, пер Гривцова 66 Лицензия ПЛД № 69-338 от 12 02 99г

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Никитина, Екатерина Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. АНТИПИТАТЕЛЬНЫЕ ВЕЩЕСТВА КОРМОВОЙ МАССЫ ЛЮЦЕРНЫ: СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ.

1.1. Тимпания жвачных животных.

1.1.1. Пенящие агенты.

1.2. Сапонины.

1.3. Конденсированные танины.

1.4. Фитоэстрогены.

1.5. Флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты.

1.5.1. Флавоноиды.

1.5.2. Фенолкарбоновые кислоты.

1.6. Другие вторичные метаболиты.

1.7. Биохимические аспекты селекции люцерны в связи с проблемой антипитательных веществ.

1.8. Внутрипопуляционная изменчивость биохимических признаков люцерны.

2. ИСХОДНЫЙ МАТЕРИАЛ, ПОГОДНО-КЛИМАТИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Характеристика погодно-климатических условий произрастания люцерны посевной.

2.3. Методы исследования.

3. АНАЛИЗ ВНУТРИПОПУЛЯЦИОННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ЛЮЦЕРНЫ ПОСЕВНОЙ ПО БИОХИМИЧЕСКИМ ПРИЗНАКАМ.

3.1. Содержание сухих веществ.

3.2. Содержание белка.

3.3. Способность к пенообразованию.

3.4. Сапонины.

3.5. Танины.

3.6. Фитоэстрогены.

3.7. Флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты.

3.8. Статистическая обработка результатов.

3.8.1. Корреляционный анализ.

3.8.1.1. Связь содержания сапонинов и танинов с пенообразованием.

3.8.1.2. Связь антипитательных факторов с дифференциацией особей по содержанию белка.

3.8.1.3. Связь между содержанием различных групп антипитательных веществ в растениях люцерны.

3.8.2. Анализ главных компонент.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Внутрипопуляционная изменчивость люцерны посевной (Medicago sativa L.) по содержанию антипитательных соединений"

Актуальность темы

Люцерна (Medicago L.) в качестве кормовой культуры широко распространена по всему миру, в том числе в зонах умеренного климата. Она является одной из наиболее ценных кормовых культур, так как весьма богата белком, витаминами и минеральными веществами.

Однако кормовая масса люцерны содержит некоторые химические вещества (антипитательные, или антиметаболические), которые могут отрицательно влиять на её кормовые качества, приводить к заболеваниям и даже гибели животных. Наиболее существенной отрицательной особенностью вегетативной массы люцерны является её способность вызывать повышенное пенообразование в пищеварительном тракте жвачных животных. Образование стабильной пены в рубце жвачных приводит к серьёзному заболеванию - тимпании, или вздутию жвачных. Есть предположение, что повышенное пенообразование люцерновых кормов частично обусловлено присутствием в надземной массе таких продуктов вторичного метаболизма растений, как сапонины (Klita et al., 1996). Кроме того, сапонины могут производить и другие отрицательные воздействия на организм животных (Cheeke, 1971; Bondi et al., 1973; Oleszek, 1996).

Конденсированные фенолы, или танины, могут способствовать предотвращению тимпании, разрушая пену в рубце жвачных животных (Lees, 1992; Tanner et al., 1995). Однако танины при высоком их содержании в кормовой массе могут понижать перевариваемость белка и сухой массы жвачными животными, (Barry, 1989).

Кормовая масса люцерны характеризуется наличием такого класса вторичных метаболитов, как фитоэстрогены (изофлавоноиды и кумарины), названные так за способность производить эстрогенный эффект в организме животного, приводящий часто к весьма нежелательным последствиям, вплоть до бесплодия самок (Moule et al., 1963). Однако в небольших количествах фитоэстрогены могут оказывать положительное влияние на продукцию животноводства, в частности, стимулируя рост ягнят (Oldfield et al., 1966).

Флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты, вероятно, не представляют прямой угрозы здоровью и жизни сельскохозяйственных животных, потребляющих корма из люцерны, но также могут ухудшать вкусовые качества кормов (в ходе эволюции определилась важная функция таких продуктов вторичного обмена, как фенольные соединения, к которым относятся флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты, - защита растений от поедания животными (Beart et al., 1985).

Для многолетних видов люцерны, как для перекрёстноопыляющихся культур, характерен определенный уровень внутрипопуляционной изменчивости по многим, в том числе биохимическим, признакам (Иванов, Гаврилюк, Эгги, 1979; Полякова, Ершова, 2000). В связи с этим, представляется актуальным изучить эту изменчивость по наиболее важным антипитательным факторам, оказывающим существенное влияние на экономический эффект использования люцерны на корм, а также связь этих признаков с одним из наиболее важных показателей качества кормовой массы - содержанием белка. Целесообразной представляется попытка дать рекомендации по наиболее эффективной форме отбора растений в ходе селекции на качество зеленой массы люцерны.

Основной целью настоящей работы является характеристика закономерностей внутрипопуляционной изменчивости содержания антипитательных веществ на примере двух селекционных популяций люцерны посевной, или синей (Medicago sativa L.) для более эффективной селекции на качество.

В задачи исследований входило:

• определить на уровне индивидуальных растений содержание основных антипитательных веществ (сапонины, фитоэстрогены) и величину показателя пенообразования, а также некоторых других вторичных соединений, присутствие которых может оказать существенное влияние на формирование антипитательных свойств люцерны (танины, флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты) для двух взятых в изучение селекционных популяций люцерны;

• выявить закономерности внутрипопуляционной изменчивости у двух селекционных популяций люцерны по содержанию белка и важнейших антипитательных факторов для обоснованного формирования селекционного материала (селекционной популяции).

Научная новизна. Впервые для люцерны, произрастающей в условиях Северо-Западного региона, выявлены закономерности внутрипопуляционной изменчивости по содержанию белка и важнейшим антипитательным факторам. Показано, что внутрипопуляционное распределение растений люцерны по содержанию антипитательных соединений характеризуется преобладанием растений с относительно невысоким содержанием данных веществ при наличии малочисленных группы растений с высоким содержанием данных групп соединений. Установлено, что содержание сапонинов в растениях исследованных популяций люцерны достоверно коррелирует со способностью зелёной массы к пенообразованию, т.е. может влиять на заболеваемость жвачных животных тимпанней.

Практическая значимость работы. Полученные данные о закономерностях внутрипопуляционной изменчивости у люцерны посевной по содержанию белка и важнейших антипитательных веществ позволят более эффективно вести селекцию культуры на улучшение питательных (кормовых) свойств. В частности: выделять в селекционной популяции группу растений со стабильным содержанием белка или определённых, б важных для целей селекции, антиметаболитов и вести селекционную работу, формируя популяцию на основе этой группы генотипов. Для оценки большого числа растений предложен экспресс-метод определения содержания основных антипитательных соединений люцерны с использованием инфракрасной спектроскопии.

Апробация работы. Результаты работы доложены на научно-практических конференциях аспирантов и молодых ученых ГНУ ГНЦ РФ ВИР им. Н.И. Вавилова в 1996 и 1998 гг., на совещаниях Отдела биохимии и молекулярной биологии ГНУ ГНЦ РФ ВИР им. Н.И. Вавилова.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы, в т.ч. две в журналах, входящих в список ВАК.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Никитина, Екатерина Валерьевна

5. ВЫВОДЫ

1. Изученные селекционные популяции люцерны посевной {Medicago sativa L.) характеризуются широким диапазоном внутрипопуляционной изменчивости по содержанию важнейших антипитательных соединений, что необходимо учитывать при селекции люцерны на качество.

2. Показано, что в исследованных популяциях люцерны посевной (.Medicago sativa L.) преобладают растения, характеризующиеся нестабильным (за два года изучения) содержанием антипитательных соединений (до 80% популяции) и белка (до 70%> популяции). Лишь единичные растения в популяциях одновременно сохраняли стабильным содержание всех исследованных нами антиметаболических соединений и белка.

3. Растения (до 20% в популяции) со стабильным (за два года изучения) содержанием антипитательных соединений и белка (до 30% растений в популяции) характеризовались значениями этих признаков, близкими к средним по популяции.

4. Растения, характеризующиеся самыми низкими и самыми высокими концентрациями антипитательных соединений (сапонины, фитоэстрогены), белка, хуже переносят зимний период.

5. Установлено, что содержание сапонинов в растениях исследованных популяций люцерны коррелирует со способностью зелёной массы к ценообразованию, т.е. может влиять на возникновение тимпании жвачных.

6. Отсутствие прямой зависимости между таким важным показателем качества люцерны, как содержание белка, и содержанием важнейших антипитательных факторов свидетельствует о возможности независимой селекции на эти признаки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Никитина, Екатерина Валерьевна, Санкт-Петербург

1. Абдушаева Я.М., Дегунова Н.Б., Кун C.B. Создание агрофитоценозов люцерны в условиях Новгородской области. Фундаментальные исследования. 2006. №5. С. 21-24.

2. Бриггс Ф., Ноулз П. Научные основы селекции растений. М.: Колос. 1972. 400 с.

3. Дзюбенко Н.И., Марьина О.И. Метод определения сапонинов и возможности снижения их уровня в кормовой массе люцерны. Сб. науч. тр. прикл. бот., генет., селек. ВИР. 1986. Т.107. С. 92-96.

4. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: Распространение, метаболизм и функции в растениях. М.: Наука. 1993. 272 с.

5. Иванов А.И. История, происхождение, эволюция рода Medicago L. подрода Falcago (Reichb) Grossh. Тр. по прикл. ботанике, генетике и селкции. 1977. Т. 59. Вып. 1. с. 3-40.

6. Иванов А.И., Гаврилюк И.П., Егги Э.Э. Иммунохимичский анализ и эволюция многолетних видов люцерны. Бюллетень ВИР. 1979. Вып. 91. С. 53-56.

7. Илиева А., Васильева Б. Оценка сортов и селекционного материала люцерны по содержанию сапонинов гемолитическим методом. Растен. науки. 1989. 4.26. №9. С.45-49.

8. Исследование биологически активных веществ плодовых культур. Под ред. Г.Б.Самородовой-Бианки. Л.: ВНИИР. 1989. 80 с.

9. Конарев A.B. Биохимия в ВИРе: некоторые проблемы и перспективы сельскохозяйственных растений. Научно-технический бюллетень ВНИИР им. Н.И.Вавилова. Вып. 202. С.3-5.

10. Конарев В.Г. Проблемы вида и генома в селекции растений. Генетика. 1994. Т. 30. №10. С.1293-1305.

11. Методические указания. Изучение коллекции многолетних кормовых трав. Сост. А.И.Иванов и др. Л.: ВНИИР. 1985. 39 с.

12. Методы биохимического исследования растений. Под ред. А.И.Ермакова. 3-е изд., перераб. и доп. Л.: Агропромиздат. 1987. 430 с.

13. Пасешниченко В.А. Растения продуценты биологически активных веществ. Соросовский образовательный журнал. Т. 7. №8. 2001. С. 1319.

14. Полякова Л.В., Ершова Э.А. Внутрипопуляционная и межпопуляционная изменчивость люцерны желтой по некоторым биохимическим признакам. Сибирский вестник с.-х. науки. 1985. №4. С. 37-41.

15. Полякова Л.В., Ершова Э.А. Изменчивость фенольных соединений у некоторых травянистых и древесных растений от межпопуляционного до внутрииндивидуального (эндогенного) уровня. Химия растительного сырья. 2000. №1. С.121-129.

16. Сметанникова А.И. Люцерна на Северо-Западе СССР. Л.: Наука. 1967. 224 с.

17. Смиряев A.B., Кильчевский A.B. Генетика популяций и количественных признаков. М.: КолосС. 2007. 272 с.

18. Харченко Ю.В. Создание и изучение исходного материала для селекции сортов люцерны с пониженным содержанием пенообразующих веществ. Автореф. дисс. СПб: 1994. 20 с.

19. Яковлев В.Б. Статистика. Расчеты в Microsoft Excel. М.: КолосС, 2005. 352 с.

20. Achnine Г., Huhman D.V., Farag М.А., Sumner L.W., Blount J.W. and Dixon R.A. Genomics-based selection and functional characterization of triterpene glycosyltransferases from the model legume Medicago truncatula The Plant Journal. 2005. 41: 875-887.

21. Aerts, J.R., Barry, T.N. and McNabb, W.C. Polyphenols and agriculture: benefcial effects of proanthocyanidins in forages. Agric. Ecosyst. Environ. 1999. 75: 1-12.

22. Agrelli J„ Oleszek W,, Stochmal A., 01 sen ML, Anderson P. Herbivore-induced responses in alfalfa (Medicago sativa). J. Chem. Ecol. 2003. 29(2): 303-20.

23. Bangham, A.D., Home, R. W. Action of saponin on biological cell membranes. Nature (Lond.). 1962. 196: 952.

24. Barry, T.N. and McNabb, W.C. The implications of condensed tannins on the nutritive value of temperate forages fed to ruminants. Br. J. Nutr. 1999. 81: 263-272.

25. Beart J.E., Lilley T.H., Haslam E. Plant polyphenols secondary metabolism and chemical defence: come observations. Phytochem. 1985. 24. 1: 33-38.

26. Bialy, Z., Jurzysta, M., Oleszek, W., Piacente, S. and Pizza, C. Saponins in alfalfa (Medicago sativa L.) root and their structural elucidation. J. Agric. Food Chem. 1999. 47: 3185-3192.

27. Bickoff, E.M., Kohler, G.O., Smith D. Chemical composition of herbage. Agronomy. 1972. 15:247-282.

28. Birk, Y. Saponins. In I.E. Liener (ed.). Toxic constituents of plant foodstuffs. Academic Press, New York. 1969. P. 169-210.

29. Bondi, A., Birk, Y. and Gestetner, B. Forage saponins. In G.W.Butler and R.W.Bailey (ed.) Chemistry and biochemistry of herbage. Academic Press, New York. 1973. P. 511-528.

30. Broderick, G.A., Albrecht K.A. Ruminal in vitro degradation of protein in tannin-free and tannin-containin forage legume species. Crop. Sci. 1997. 37: 1884-1891.

31. Brookbanks, E.O., Welch, R.A.S. and Coup, M.R. Oestrogens in pasture and a possible relationship with mastitis. N. Z. Vet. J. 1969. 17: 159-160.

32. Cheeke, P.R. Nutritional and physiological implications of saponins: a review. Can. J. Anim. Sci. 1971. 51: 621-632.

33. Dixon R., Paiva N. Stress-induced phenylpropanoid metabolism. The Plant Cell. 1995. 7: 1085-1097.

34. Duke, J.A. Handbook of phytochemical constituents of GRAS herbs and other economic plants. Boca Raton, FL. CRC Press. 1992.

35. Frank, N.A., Sanger, V.L., Pounden, W.D., Pratt, A.D. and Van Keuren, R. Forage estrogens and their possible influence on bovine mastitis. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1967. 150: 503-507.

36. Fenwick D.E., Oakenfull D.O. Saponin content of food plants and some prepared foods. J. Sci. Food Agric. 1983. 34: 186-191.

37. Free B.L., Satterlee L.D. Biochemical properties of alfalfa protein concentrate. J. Food Sci. 1975. 40: 85-89.

38. Goplen, B.P., Howarth R.E., Sarkar S.K., Lesins K. A search for condensed tannins in annual and perennial species of Medicago, Trigonella, and Onobrychis. Crop. Sci. 1980. 20: 801-804.

39. Hill R.R., Shenlc J.S., Barnes R.F. Breeding for yield and quiality In Hanson (ed). et al. Alfalfa and alfalfa improvement. ASA-CSSA-SSSA. Agronomy Monograph. 1988. 29: 809-825.

40. Heywang, B.W., Thompson, C.R., and Kemmer, A.R. Effect of alfalfa saponin on laying hens. Poult. Sci. 1959. 38: 968-971.

41. Hostettmann, K. and Marston, A. Saponins. Cambridge University Press. Cambrige. 1995.

42. Howarth, R.E. Antiquality factors and nonnutritive chemical components. In Hanson (ed.) et al. Alfalfa and alfalfa improvement. ASA-CSSA. Agronomy Monograph. 1988. 29: 493-514.

43. Howarth, R.E., Chaplin, R.K., Cheng, K.-J., Goplen, B.P., Hall, J.W., Hironaka, R., Majak, W. and Radostits, O.M. Bloat in cattle. Agriculture Canada Publ. 1858/E. Ottawa, Ontario, Canada. 1991.

44. Hudson, B.J.F., Mahgoub, S.E.O. Naturally-occurring antioxidants in leaf lipids. J. Sci. Food Agric. 1980. 31: 646-650.

45. Klita, P.T., Mathison, G.W., Fenton, T.W. and Hardin, R.T. Effects of alfalfa root saponins on digestive function in sheep. J. Anim. Sci. 1996. 74: 1144-1156.

46. Kowalska, I, Stochmal, A., Kapusta, i, Janda, B., Pizza. C„ Piacente, S.„ Oleszek, W. Flavonoids from barrel medic (Medicago truncatula) aerial parts. J. Agric. Food Chem. 2007. 55(7): 2645-52.

47. Kushiro, T., Shibuya, M. and Ebizuka, Y. P-Amyrin synthase. Cloning of oxidosqualene cylase that catalyzes the formation of the most popular triterpene among higher plants. Eur. J. Biochem. Plant Sci. 1998. 5: 380386.

48. Lahiry, N.L., Satterlee, L.D., Hsu, H.W., Wallace, G.W. Characterization of the chlorogenic acid binding fraction in leaf protein concentrates. J. Food Sci. 1977. 42: 83-85.

49. Latunde-Dada, A.O., Lucas, J.A. Involvement of the phytoalexin medicarpin in the differential response of callus linesof lucerne {Medicago sativa) to infection by verticillium albo-atrum. Physiol. Plant Path. 1985. 26: 31-42.

50. Lees, G.L. Condensed tannins in some forage legumes: their role in prevention of ruminant pasture bloat. In Hemingway, R.W. and Laks, P.E. (eds.). Plant Polyphenols. 1992. 1: 915-935.

51. Livingston, A.L. Forage plant estrogens. J. Toxicol. Environ. Health. 1978. 4: 301-324.

52. Livingston, A.L., Knuchlees, B.E., Miller, R.H. and Kohler, G.O. Distribution of saponin in alfalfa protein recovery systems. J. Agric. Food Chem. 1979. 27(2): 362-365.

53. Lungh, T. Metabolism of estrogenic isoflavones in domestic animals. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1995. 208: 33-39.

54. Majak, W., Howarth, R.E., Fesser, A.C., Goplen, B.P. and Pedersen, M.W. Relationships between ruminant bloat and the composition of alfalfa herbage. II. Saponins. Can. J. Anim. Sci. 1980. 60: 699.

55. Majak, W., Hall, J.W., McCaughey, W.P. Pasture management strategies for reducing the risk of legume bloat in cattle. J. Anim. Sci. 1995. 73: 14931498.

56. Majak W., McAllister, T.A., McCartney, D., Stanford, K., Cheng, K-J. Bloat in cattle. Alberta Agriculture, Food and Rural Development Information Packaging Center, Edmonton, Alberta, Canada. 2003.

57. Makkar, H.P.S., Blummel, M. and Becker, K. In vitro effects of and interactions between tannins and saponins and fate of tannins in the rumen. J. Sci. Food Agric. 1995. 69: 481-493.

58. Malinow, M.R. Triterpenoid saponins in mammals: effects on cholesterol metabolism and atherosclerosis, In W.D. Nes (ed.) et al. Isopentenoids in plants. Marcel Dekker, New York. 1984. 229-246.

59. Massiot, G., Lavaud, C., Besson, V., Le Men-Olivier, L. and Van Binst, G. Saponins from te aerial part of alfalfa (Medicago sativa). J. Agric. Food Chem. 1991. 39: 78-82.

60. McSweeney, C.S., Palmer, В., McNeill, D.M. and Krause, D.O. Microbial interactions with tannins: nutritional consequencs for ruminants. Animal Feed Sci. Tech. 2001. 91: 83-93.

61. Milic B. L. Lucerne tannins. I. Content and composition during growth J . Sci. Food Agric. 2001. 23(10 ): 1151-1156.

62. Michaud, R., Lehman, W.F., and Rumbaugh, M.D. World distribution and historical development. In A. Hanson, D.K. Barnes, and R.R. Hill (eds) Alfalfa and alfalfa improvement. American Society of Agronomy. Madison, WI. 1988.259-291.

63. Monsanto. Safety, compositional and nutritional assesment of roundup ready alfalfa events J101 and J103. U.S. FDA/CFSAN. BNF84. 2003.

64. Monties В., Rambourg J.C. Occurrence of flavonoids (flavones and coumestans) in alfalfa (Medicago saliva var. Europe) leaf proteins. Ann. Technol. Agric. 1978. 27: 629-654.

65. Moule, G.R., Braden, A.W.H. and Lamond, D.R. The significance of oestrogens in pasture plants in relation to animal production. Anim. Breed. Abstr. 1963. 31: 139-157.

66. Newby, V.K., Sablon, R.M., Synge, R.L.M. Free and bound phenolic acids of lucerne (Medicago sativa cv. Europe). Phytochemistry. 1980. 19: 651657.

67. Nowacka, J., Oleszek, W. Determination of alfalfa (.Medicago sativa) saponins by high performance liguid chromatography. J. Agric. Food Chem. 1994. 42(3): 727-30.

68. Oldfield, J.E., Fox, C.W., Bahn, A.V., Bickoff, E.M. and Kohler, G.O. Coumestrol in alfalfa as a factor in growth and carcass quality in lambs. J. Anim. Sci. 1966. 25: 167-174.

69. Oleszek, W. Saponin fractions from Medicago sativa: liquid chromatographic separations. J. Chromatogr. Sci. 1991. 29: 128.

70. Oleszek, W. Alfalfa saponins: structure, biological activity, and chemotaxonomy. In Waller and Yamasaki (eds.). Saponins used in food and agriculture. Plenum Press. New York. 1996. 155-170.

71. Oleszek, W. Personal communication to W. D. Price, US Food and Drug Administration, Rockville, MD. 2004.

72. Oleszek, W., Jurzystra, M., Ploszynski, M., Colquhoun, I.J., Price, K.R. and Fenwick, G.R. Zanhic acid tridesmoside and other dominant saponins from alfalfa {Medicago sativa L.) aerial parts. J. Agric. Food Chem. 1992. 40: 191-196.

73. Pedersen, M.W., Zimmer, D.E., McAllister, D.R., Andersen, J.O., Wilding, M.D., Taylor, G.A. and McGuire, C.F. Comparative studies of saponin of several alfalfa varieties using chemical and biochemical assays. Crop Sci. 1967. 7: 349.

74. Popp, J.D., McCaughey, W.P., Cohen, R.D.H., McAllister, T.A. and Majak, W. Enchancing pasture productivity with alfalfa: a review. Can. J. Plant Sci. 2000. 80: 513-519.

75. Robbins, M.P., Bavage, A.D., Strudwicke, C., Morris, P. Genetic manipulation of condensed tannins in higher plant II. Analysis of birdsfoot trefoil plants harboring antisense dihydroflavonol reductase. Plant Physiol. 1998. 116: 1133-1144.

76. Rosenthal, G.A., Nkomo, P. The natural abundance of L-canavanine, an active anticancer agent, in alfalfa (.Medicago sativa L.). Pharmaceutical Biology. 2000. 38: 1-6.

77. Rumbaugh, M.D. Breeding bloat-safe cultivars of bloat-causing legumes. Forage legumes for energy-efficient animal production. Proceeding of a trilateral workshop held in Palmerston North, New Zealand. April 30-May 4, 1984.

78. Saleh, N.A., Boulos, L., El-Negoumy, S.I. and Abdalla, M.F. A comparative study of the flavonoids of Medicago radiala with other Medicago and related Trigonella species. Biochem. Systematics Ecol. 1982. 10 p.33-36.

79. Sarkar S.K, Howarth R.E. Specificity of the vanillin test for flavanols. J. Agric. Food Chem. 1976. 24: 317-320.

80. Sylwia, G., Leszczynski, B„ Oleszek, W. Effect of low and high-saponin lines of alfalfa on pea aphid. J. Insect Physiol. 2006. 52(7): 737-743.

81. Smolenski, S.J., Kinghorn, A.D. and Balandrin, M. Toxic constituents of legume forage plants. Econ. Bot. 1981. 35: 321-355.

82. Stob, M. Naturally occurring food toxicants estrogens. In M. Rechcigl (ed.). CRC handbook of naturally occurring food toxicants. CRC Press. Boca Raton, FL. 1983. 81-100.

83. Stochmal, A., Piacente, S., Pizza, C., DeRiccardis, F., Leitz, R., Oleszek, W. Alfalfa (.Medicago sativa L.) flavonoids. 1. Apigenin and luteolin glycosides from aerial parts. J. Agric. Food Chem. 2001a. 49: 753-758.

84. Stochmal, A., Simonet, A.M., Macias, F.A., Oleszek, W. Alfalfa {Medicago sativa L.) flavonoids. 2. Tricin and chrysoeriol glycosides from aerial parts. J. Agric. Food Chem. 2001b. 49: 5310-5314.

85. Tanner, G.J., Moate, P., Dailey, L., Laby, R. and Larkin, P.J. Proanthocyanidins (condensed tannins) destabilise plant protein foams in a dose dependent manner. Aust. J. Agric. Res. 1995. 46: 1101-1109.

86. Wall, M. Toxins of animal and plant origin. Gordon and Breach Science Pub., London. 1971.

87. Wallase, R.J., and McPherson, C.A. Factors affecting the rate of breakdown of bacterial protein in rumen fluid. Br. J. Nutr. 1987. 58: 313.