Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние тяжелых металлов (Hg,Cu,Cd) и карбофоса на иммунофизиологическое состояние молоди осетровых и карповых рыб

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Влияние тяжелых металлов (Hg,Cu,Cd) и карбофоса на иммунофизиологическое состояние молоди осетровых и карповых рыб"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ВНУТРЕННИХ ВОД им И Д Папанина

на правах рукописи УДК 597:612.017.+574.64

ЛАПИРОВА

Татьяна Борисовна

Влияние тяжелых металлов Cd) и карбофоса

на иммунофизиологическое состояние молоди осетровых и карповых рыб

Специальность 03.00.16 - экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Борок 2004

Работа выполнена в Институте биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.Р. Микряков

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В.Г. Галактионов доктор биологических наук, профессор В.Н. Яковлев

Ведущая организация: Ярославский Государственный университет им. П.Г. Демидова

Защита диссертации состоится « 25» февраля 2004 г. в 14°° часов на заседании специализированного совета К.002.036.01 при Институте биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН по адресу: 152742 п. Борок Некоузского р-на Ярославской обл. Тел/факс - (08547)24042

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБВВ.

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

В.н.с, к. б. н.

2004-4 25908

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Ведущее место среди загрязняющих водные экосистемы веществ, вызывающих нарушение структуры рыбных популяций, снижение рыбопродуктивности, адаптивных функций и выживаемости рыб, принадлежит солям тяжелых металлов и пестицидам (Моисеенко 1991; 1997; 2002; Кашулин и др., 1998; Перевозников, 2003; Zeeman, Brindley, 1981; Sorensen, 1982). Происходящие под влиянием химического загрязнения изменения в состоянии' ихтиоценозов свидетельствуют о сужении зон оптимальных экологических условий, глубоких нарушениях функционирования структур, обеспечивающих индивидуальную целостность и устойчивость организма рыб к инфекциям и инвазиям (Микряков и др., 1990; 2001; Моисеенко и др., 1999).

Установлено, что у рыб в поддержании гомеостаза организма в меняющихся условиях среды, как и у высших позвоночных (Вольский, 1991; Маянский, 1991, Галактионов, 1995), ведущая роль принадлежит иммунной системе (Микряков, 1991; Микряков и др., 2000; 2001; Anderson, Zeeman, 1995). При этом у низших позвоночных, в том числе рыб, первостепенное значение имеют неспецифические факторы резистентности, обладающие большим разнообразием и быстротой активации, а на ранних этапах онтогенеза являющиеся определяющими (Кондратьева, Киташова, 2002; Studnicka et al., 1993; Anderson, Zeeman, 1995).

Проблема устойчивости молоди рыб в меняющихся условиях среды особенно остро встает в связи с развитием аквакультуры; для сохранения численности наиболее ценных объектов рыборазведения - осетровых рыб -заводское воспроизводство имеет решающее значение. Поскольку наибольшая чувствительность к загрязняющим веществам и подверженность массовой гибели от инфекций при их воздействии выявлена у рыб на ранних этапах развития (Вирбицкас и др., 2000), из-за ухудшения качества воды возрастают потери, снижается морфофизиологическое качество личинок и молоди как в

естественных водоемах, так и полученной заводским способом (Кокоза, 2002). Между тем данных о реакции показателей естественной резистентности у молоди рыб на токсический стресс крайне мало, практически не изучен неспецифический гуморальный ответ, отсутствуют сведения о взаимосвязи его с другими показателями.

Исходя из этого, изучение характера действия основных загрязняющих веществ и его отдаленных последствий на иммунофизиологический статус рыб представляется весьма важным при разработке научных основ биомониторинга и способов ранней диагностики токсикантиндуцируемых нарушений, определения характера и направления изменений гомеостатических функций, обеспечивающих оптимальный рост, развитие и индивидуальную целостность организма рыб в онтогенезе.

Цель работы. Целью работы явилось установление общих закономерностей изменений иммунофизиологического состояния молоди разных видов рыб при действии некоторых загрязняющих веществ на основе анализа изменений ряда морфофизиологических показателей, а также реакции гуморального и клеточного звеньев врожденного иммунитета в условиях краткосрочных и хронических экспериментов.

Задачи исследований. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние сублетальных концентраций не2\ Си2+ и са2+ на иммунофизиологический статус молоди осетра и на карпа.

2. Исследовать характер изменений протективных свойств тканей личинок плотвы после экспозиции их в растворах соли кадмия.

3. Сравнить влияние различных концентраций карбофоса на карпа при непродолжительных экспозициях и проанализировать процесс восстановления показателей после прекращения воздействия.

4. Оценить влияние карбофоса на развитие иммунного отклика к бактериальному антигену у карпа в хроническом эксперименте.

Научная новизна работы. На основе комплексного анализа реакции клеточного и гуморального звеньев иммунитета получены новые данные об общих закономерностях функционирования иммунной системы разных видов рыб на ранних этапах онтогенеза при действии различных по химической природе токсикантов. Показана зависимость происходящих изменений от вида рыб, природы, концентрации и времени воздействия токсиканта.

Подробно исследована динамика изменения интегрального показателя неспецифической гуморальной защиты - БАСК - в зависимости от силы воздействия и природы токсического агента. Разработан метод определения бактериостатической активности гомогенатов тканей рыб, что дало возможность впервые проанализировать характер изменений данного показателя у личинок плотвы под действием кадмия.

Определен характер сдвигов иммунофизиологических показателей карпа и процессов их восстановления после снятия воздействия в зависимости от концентрации пестицида. Исследованы реакции клеточных и гуморальных факторов врожденного иммунитета на иммунизацию в присутствии карбофоса; показано, что пестицид подавляет защитные свойства сыворотки крови иммунизированных рыб.

Выявлено иммуностимулирующее действие сублетальных концентраций различных по химической природе токсикантов на гуморальные факторы неспецифического иммунитета на начальных этапах воздействия.

Практическое значение. Изучение вопросов функционирования врожденного иммунитета на ранних этапах онтогенеза имеет большое значение как в общетеоретическом плане, так и в практическом - при установлении причин снижения естественной резистентности и выживаемости молоди рыб при изменении условий среды, для оценки состояния здоровья и прогноза численности рыбных популяций в естественных водоемах, оптимизации технологических процессов в условиях искусственного рыборазведения, а также разработки тестов для проведения мониторинговых работ.

Апробация. Основные материалы диссертации были представлены на I Межд. симп. «Зооинд. и экотоксикол. животных в условиях техног. ландшафта» (Днепропетровск, 1993); XII Росс. Научн. конф. «Факторы клет. и гумор. иммунитета при разл. Физиол. состояниях» (Челябинск, 1995); науч.-практ. конф. ихтиопатологов (Москва, 1997); II Межд. конф. "Биол. ресурсы Белого моря и внутр. водоемов Евр. Севера" (Петрозаводск, 1999); науч.-практ. конф. «Пробл. охраны здоровья рыб в аквакультуре» (Москва, 2000); 6-ом Межд. симпозиуме по ветер, иммунологии (Уппсала, 2001); конф. «Пробл. водной токсикол.» (Борок, 2002); Межд. науч.-практ. конф. «Аквакультура начала XXI века» (Рыбное, 2002); Всеросс. науч.-практ. конф. «Пробл. патологии, иммунологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов» (Борок, 2003). Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 работы. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав и выводов. Работа изложена на 192 страницах, содержит 12 таблиц и 24 рисунка. Список литературы включает 293 источника, из них 127 иностранных.

Глава I. Литературный обзор В этой главе представлена краткая характеристика структурно -функциональных особенностей иммунной системы рыб, подробно рассмотрены факторы врожденного иммунитета. Приведены последние литературные данные о влиянии загрязнения вод тяжелыми металлами и пестицидами на иммунофизиологические показатели рыб.

Глава П. Материал и методы исследований -1. Объекты исследования и условия постановки опытов Материалом диссертации послужили результаты экспериментальных работ, проведенных в 1991-2000 гг. Объектами исследования являлись: молодь сибирского осетра (Acipenser baeri Brandt) и личинки плотвы (Rutilus rutilus L.) в возрасте 50 сут, годовики обыкновенного карпа (Cyprinus carpió L.).

В качестве токсических агентов при изучении влияния ионов тяжелых металлов на осетра использовали соли карпа -

Сс1(ЫОз)2 , личинок плотвы - СёСЬ- Для исследования влияния карбофоса на иммунофизиологическое состояние карпа использовали промышленный препарат пестицида.

При проведении экспериментов на молоди осетра постоянство концентраций солей поддерживали с помощью дилютерного устройства оригинальной конструкции (Виноградов, Тагунов, 1989), в остальных случаях -сменой воды через 3 дня; в экспериментах с пестицидом - через день. Температура колебалась в пределах 19-21°С, контролировали также содержание кислорода, жесткость и рН воды. Более подробно условия проведения опытов представлены в табл. 1.

2. Методы исследований Определение морфофизиологических показателей. Коэффициент упитанности и индексы внутренних органов рассчитывали общепринятыми методами (Методика морфофизиологических и биохимических исследований рыб, 1972). Содержание общего белка сыворотки крови определяли рефрактометрически.

Исследование экстрактов тканей иммунокомпетентных органов. Экстракты тканей органов осетра (селезенки, сердца, печени) для определения лизоцима получали по общепринятым методикам (Каграманова, Ермольева, 1966; Вихман, Генералова, 1991), в надосадочной жидкости лизоцим определяли нефелометрическим методом как в сыворотке крови, затем рассчитывали содержание фермента в мкг на мг сырого веса ткани.

Поскольку в литературе не обнаружено описания методов количественного определения защитных свойств тканей и органов, нами была проделана предварительная работа по подбору условий, при которых более полно экстрагировались защитные факторы, и соблюдалось условие линейной зависимости антимикробных свойств тканей от массы навески в данном диапазоне разведений. Подробно этот метод описан в главе III, п. 3.1. диссертации.

Таблица 1

Объекты исследования и условия постановки опытов

Объект исследования Масса, г Число экземпляров Сроки отбора, сутки Применяемое воздействие Доля от LC50 Исследуемые показатели

Сибирский осетр (Acipenser baeri Brandt) 11.4±3.7 120 7,14,30, 60 Нв2* 0.003 Си2+ 0.015 Cd2+ 0.03 мг/л 0.1 0.1 0.1 Коэффициент упитанности; индексы органов; содержание лизоцима в них; общий белок сыворотки крови; БАСК; лейкоцитарная формула; индекс обилия лейкоцитов.

Плотва (Rutil us rutilus) 0.038± 0.006 960 7 Cd2+ 2.5; 5.0 и 7.5 мг/л 0.15; 0.30; 0.45 Противомикробная активность тканей; состав лейкоцитов крови.

Обыкновенный карп (Cyprinus carpio) 91.2±6.8 100 7, 14,21, 28 Cd2+ 5.0 мг/л 0.2 Индексы органов; общий белок сыворотки крови; БАСК; лейкоцитарная формула.

65.6±6.1 120 7 и 49 Карбофос 1,5,10 мг/л 7 сут; Речная вода 49 сут 0.05; 0.25; 0.5 Индексы органов; общий белок сыворотки крови; БАСК; лейкоцитарная формула; индекс обилия лейкоцитов.

53.3±4.6 150 0.25,1,4, 7,30 Карбофос 2 мг/л, иммунизация 0.1 Индексы органов; общий белок сыворотки крови; БАСК; лейкоцитарная формула.

Показатели гуморального звена иммунитета.

Определение лизоцима. Содержание фермента определяли, высокочувствительным фотонефелометрическим методом (Блумберга, Дундуре, 1987; Практикум по иммунологии, 2002). Использовали промышленный препарат лиофилизированных бактерий Mycrococcus lysodeicticus, в качестве стандарта для построения калибровочной кривой - лизоцим яичного белка.

Определение бактериостатической активности сыворотки крови (БАСК). Анализ этого показателя осуществляли нефелометрическим методом (Смирнова, Кузьмина, 1966) в модификации В.Р. Микрякова (Методические указания, 1987) с использованием в качестве тест-организмов живой суточной культуры Aeromonas hydrophila.

Изучение состава лейкоцитов периферической крови

Определение лейкоцитарной формулы. Приготовленные мазки фиксировали и окрашивали по Романовскому-Гимза стандартным методом, на одном мазке просчитывали не менее 200 лейкоцитов. При определении лейкоцитов пользовались классификацией Н.Т. Ивановой (Иванова, 1983; 1995).

Индекс обилия лейкоцитов. Для его определения, подсчитывали суммарное количество лейкоцитов в 100 полях зрения на различных участках мазка, и рассчитывали среднее количество клеток в одном поле зрения.

Определение средних полулегальных концентраций токсикантов проводили экспресс-методом (Фрумин и др., 1991; Frumin et al., 1992).

Все результаты подвергли статистической обработке в программах Excel и Quattro Pro при Р=0.05.

Глава III. Влияние солей тяжелых металлов на молодь разных видов рыб 1. Реакция иммунофизиологических показателей молоди осетра на экспозицию в сублетальных концентрациях солей Щ, Си и Cd Коэффициент упитанности был весьма стабилен как у контрольных рыб, так и во всех группах опытных, и колебался в среднем в пределах 0.30-0.33%. По индексам сердца во все сроки наблюдений значимых отклонений от контроля также не было выявлено. Наиболее сильные изменения по индексам селезенки и печени были отмечены под действием ртути: относительная масса селезенки возросла в среднем на 30% в течение первых 14 сут, гепатосоматический индекс - на 60% в первый срок отбора. Сдвиги уровня общего белка сыворотки крови зависели от вида токсиканта, в целом наибольшие колебания данного показателя, как и индексов органов, вызвали

Максимальное

содержание лизоцима было

выявлено в богатой

клетками лимфо-миело-

идного ряда селезенке, в

ней также отмечена и

наиболее яркая реакция на

токсическое воздействие

(Рис. 1), хотя достоверный

подъем данного показателя

выявлен также в тканях • ♦ Контроль ■-«-•Не Си л са

сердца и печени.

Рис. 1. Содержание лизоцима в селезенке осетра при действии солей тяжелых металлов

ионы ртути.

К концу эксперимента уровень БАСК у осетров, экспонированных в соли меди, не отличался от контрольного, в то время как под действием ртути и кадмия был значительно ниже.

Под действием всех трех солей были отмечены значительные изменения картины крови осетра. В табл. 2 представлены данные по рыбам, экспонированным в соли ртути, изменения под действием ионов меди и кадмия носили в целом сходный характер. Помимо лимфопении, было отмечено значительное возрастание доли нейтрофилов и эозинофилов, что свидетельствует об инициации иммунопатологических процессов, в том числе -аллергизации организма.

Таблица 2

Относительное содержание лейкоцитов периферической крови осетра под

влиянием ионов ртути

Сроки отбора, сут Типы лейкоцитов, %

Лимфоциты Нейтрофилы палочко-ядерные Нейтрофилы сегменто-ядерные Эозинофилы

7 67.0±1.9* 83.7±5.6 3.4±1.2 3.5±0.5 8.4±1.6* 3.3±0.5 20.2±4* 9.5±1.9

14 87.3±1.8 87.2±7.6 2.7±0 3.2±0.7 3.3±3.3 3.6±1.9 6.7±1.8 6.0±0.9

30 70.0±4.7 77.8 ±6.9 9.6±1.7 6.6±1.5 14.0±2.8* 5.4±1.5 6.0±2.1* 10.2±1.8

60 81.0±1.3 80.6±5.4 4.5±2.6 9.3±3.4 1.0±0.6 3.3±1.9 12.5±3.9* 6.8±0.3

Примечание: в числителе - показатели опытных рыб, в знаменателе -контрольных; здесь и далее в таблицах * помечены данные, достоверно отличающиеся от контроля; m - стандартная ошибка.

Индекс обилия лейкоцитов в течение периода наблюдений у всех подопытных рыб был ниже, чем у контрольных, к концу опыта это снижение достигло в среднем 75%, что указывает на глубокие патологические изменения в гемопоэтической ткани осетра, разрушение центров лейкопоэза.

2. Влияние ионов кадмия на иммунофизиологическое состояние карпа

Достоверное снижение индексов почек (на 45%) было выявлено на 21 сут, селезенки (на 55%) - к концу срока наблюдений. Наиболее продолжительное отклонение после экспозиции в токсиканте было выявлено по гепатосоматическим индексам, а именно - значимое превышение над контролем (около 10%) в течение 3-х нед с начала опыта.

Уровень общего белка сыворотки крови у подопытных рыб к концу периода наблюдений был достоверно (на 25%) ниже, чем у контрольных. При анализе защитных свойств сыворотки крови карпа был выявлен значительный подъем БАСК под действием ионов кадмия по сравнению с контрольными рыбами в течение первых двух нед эксперимента (Рис. 2).

100 -г

! 80 -х ф

Ф 60 -х

ь.

>.

г? 40 -20 -

7 14 21 28

Сроки отбора, сут Контроль —Опыт

Рис. 2. Динамика БАСК карпа при действии соли кадмия

В отличие от осетра, столь резких сдвигов в соотношении лейкоцитов крови под действием кадмия у карпа не выявлено. Лишь по зрелым формам нейтрофилов с 14 сут отмечено достоверное превышение над контролем.

3. Исследование действия ионов кадмия на протектнвные свойства тканей личинок плотвы

3.1. Методические подходы к анализу антимикробных свойств экстрактов тканей. Для предварительного анализа использовали внутренние органы карпа 1+: селезенки, сердца и печени. Ткани гомогенизировали с

забуференным фосфатным буфером изотоническим физраствором (ЗФР) с рН 7.2-7.3, который позволяет максимально сохранить активность естественных антибактериальных факторов и дважды замораживали для более полного выхода ферментов. Время и скорость центрифугирования подбирались опытным путем, пока не были отработаны условия, позволяющие получить прозрачную надосадочную жидкость. Из супернатанта с помощью ЗФР готовили серию последовательных разведений и определяли бактериостатическую активность аналогично определению таковой в сыворотке крови. На основе проведенных исследований было показано, что в пределах выбранного диапазона разведений (1:2 — 1:8) соблюдалось условие линейной зависимости бактериостатических свойств экстрактов от массы навески.

3.2. Влияние различных концентраций ионов кадмия на бактериостатические свойства личинок плотвы Антибактериальные свойства экстрактов тканей рыб контрольной группы не были выявлены. Это свидетельствует о том, что защитные гуморальные факторы, которые могли быть получены по материнской линии (van Loon et.al.,

1981; Ellis, 1988), к этому возрасту уже не действуют. Помещение рыб в растворы соли Cd вызвало резкую активизацию данного показателя, причем, более низкие концентрации токсиканта оказали более сильное стимулирующее действие (Рис. 3). Зрелые формы лейкоцитов на мазках периферической крови на момент проведения эксперимента не были обнаружены, но установленный нами в присутствии токсиканта высокий уровень защит-Рис. 3. Бактериостатическая активность экстрактов тканей личинок плотвы при действии соли кадмия

0,0 2,5 5,0 7,5

Концентрация ионов Cd, мг/л

ных свойств тканей личинок позволяет предположить наличие иммуноцитов, способных к выработке антимикробных факторов, в развивающихся тимусе и пронефросе рыб. Таким образом, если, выработка собственных иммуноглобулинов у многих видов рыб нарастает медленно и достигает уровня взрослых рыб лишь к 5-8-мес возрасту (van Loon et al., 1981), то механизмы гуморальной неспецифической защиты, стимулированные слабым токсическим воздействием, способны активно функционировать уже в 2-х мес возрасте.

Глава V. Реакция иммунофизиологических показателей карпа на карбофос 1. Влияние различных концентраций карбофоса на иммунофизио-логическое состояние карпа при непродолжительных экспозициях Достоверное снижение индексов; селезенки было выявлено лишь под действием максимальной концентрации пестицида. Значимые изменения индексов печени произошли во всех опытных группах: показатель снизился на 42,27 и 48% при 1, 5 и 10 мг/л карбофоса соответственно.

После восстановительного периода (выдерживания в течение 7 нед в чистой речной воде) у рыб, экспонированных при концентрации карбофоса 1 мг/л индексы селезенки и при 5 мг/л индексы почек, оказались достоверно выше (на 50%), чем контрольные, что может свидетельствовать о наличии воспалительного процесса в этих органах. В случае гепатосоматических индексов, то и после снятия воздействия этот показатель был значительно ниже контроля (на 50,57 и 60% соответственно). Как показано М.А. Перевозниковым (2002), механизм детоксикации карбофоса у рыб сходен с таковым у млекопитающих, его разрушение осуществляется карбоксилэстеразой печени. Вполне вероятно, что работа органа в течение длительного срока в форсированном режиме может вызывать развитие в нем атрофических процессов. Нарушение функционирования печени сказалось на уровне общего белка сыворотки крови: во всех опытных сериях была отмечена тенденция к снижению показателя, при максимальной концентрации токсиканта оно было

статистически достоверным, сохранилось и после восстановительного периода.

реакция бактериостатических свойств сыворотки крови на действие карбофоса: минимальная концентрация пестицида вызвала полное их подавление, причем нулевой уровень БАСК сохранился и после восстановительного периода. При действии более высоких концентраций было отмечено пропорциональное возрастание показателя, и возврат к контрольному уровню после восстановительного периода (Рис. 4). Рис. 4. Отношение БАСК карпа после экспозиции в растворах карбофоса и восстановительного периода к таковой контрольных рыб

Изменения в лейкоцитарной формуле рыб, находившихся в растворе карбофоса концентрацией 10 мг/л, представляли четкую картину неспецифической реакции на стресс: статистически достоверные лимфопения и нейтрофилия; при концентрации пестицида 1 мг/л отмечено лишь снижение доли палочкоядерных нейтрофилов. При 5 мг/л в опыте не произошло значимых изменений в соотношении лейкоцитов, в то же время, после восстановительного периода у рыб этой группы отмечалось резкое снижение доли лимфоцитов и нейтрофилия. Полученные результаты показывают, что отсутствие быстрых изменений гематологических показателей может свидетельствовать лишь о более медленном развитии ответной реакции лейкоцитов крови при действии относительно низких концентраций токсиканта по сравнению с более высокими, а не о соответствии токсической нагрузки адаптационным возможностям организма.

Выявлена парадоксальная

Изменения показателя индекса обилия лейкоцитов демонстрируют стимулирующее влияние низких концентраций карбофоса на лейкопоэз на начальном этапе воздействия, в то время как высокие подавляли эту функцию. Независимо от направления сдвига показателя в опыте, после восстановительного периода лейкопоэз был достоверно снижен у всех подопытных рыб.

Таблица 3

Соотношение и индекс обилия лейкоцитов периферической крови карпа

после экспозиции в карбофосе и восстановительного периода

Тип клеток, % Концентрация карбофоса, мг/л

Лимфоциты Контроль 1 5 10

94.3±3.1 93.6± 12.0 96.3±1.0 92.9±7.0 92.2±1.4 71.3±9.0* 79.9±5.2* 74.5±10.4*

Метамиелоциты 1.9±0.2 2.1±0.4 2.0±0.5 3.2±0.7 3.2±0.5 6.3±1.8* 4.8±2.5 3.9±1.6

Палочкоядерные нейтрофилы 2.6±0.7 2.5±2.7 0.5±0.2* 2.4±0.5 3.0±0.6 12.6±3.2* 10.0±0.8* 10.4±0.5

Сегментоядерные нейтрофилы 0.7±0.3 1.5±1.3 0.5±0.2 1.3±1.0 1.0±0.5 9.6±1.8* 4.5±0.8* 10.8±1.2

Моноциты 0.5±0.2 0.3±0.1 0.7±0.3 0.2±0.1 0.6±0.3 0.2±0.1 0.8±0.5 0.4±0.2

Индекс обилия лейкоцитов 13.2±1.7 11.3±0.6 22.5±2.0* 6.4±0.7* 13.7±1.2 2.5±0.3* 8.4±1.2* 5.7±0.6*

Примечание: в числителе значения в опыте, в знаменателе — после восстановительного периода

Полученные результаты демонстрируют, что низкие концентрации карбофоса на клеточное и гуморальное звенья иммунитета могут оказывать различное действие: стимулировать лейкопоэз, но в то же время подавлять защитные свойства сыворотки крови.

После выдерживания в карбофосе на мазках крови рыб всех опытных групп было отмечено образование "монетных столбиков": слипание эритроцитов и вытягивание их параллельными цепочками, что свидетельствует и о серьезных изменениях биохимии крови (Хэм, Кормак, 1983).

2. Анализ влияния пестицида на иммунитет к бактериальному антигену в хроническом эксперименте Наибольшие колебания индексов почек и селезенки вызвал карбофос, наименьшие - бактериальный антиген. Показатели рыб 3-ей группы на протяжении эксперимента были ближе к таковым иммунизированных рыб, но к концу срока наблюдений оказывались достоверно ниже контроля. В этот же период гепатосоматические индексы также были достоверно снижены (около 40% во всех опытных сериях). Содержание общего белка снизилось также у всех подопытных рыб, но больше - у экспонированных в карбофосе (на 30%).

И пестицид, и иммунизация вызвали резкие колебания защитных свойств сыворотки крови (Рис. 5), однако динамика изменений показателя сильно различалась. При действии карбофоса на начальных этапах эксперимента

Рис. 5. Динамика БАСК карпа при действии карбофоса и иммунизации

значения БАСК возросли более чем в 6 раз. Ход кривой изменений показателя у рыб при сочетанном действии карбофоса и иммунизации сходен с таковым у иммунизированных рыб, однако, пик активности на заключительном этапе,

выявленный у последних, отсутствует, что однозначно свидетельствует о подавлении защитных свойств сыворотки у иммунизированных рыб после экспозиции их в карбофосе.

Анализ лейкоцитарной формулы показал, что карбофос не вызвал существенных изменений доли лимфоцитов, в то время как бактериальный антиген отдельно и в сочетании с пестицидом в первые сутки наблюдений достоверно снизил показатель. Гранулоцитоз был отмечен в 1 - 4-е сут под действием всех факторов. Наиболее ярко выраженная реакция из всех изучаемых типов клеток была выявлена в первые сут у тромбоцитов: под влиянием пестицида отмечена двукратная тромбопения, иммунизация по отдельности и в сочетании с пестицидом привела, напротив, к резкому росту процентного содержания этих клеток (в среднем в 1.7 раза). Полученные результаты свидетельствуют об активном участии тромбоцитов в реакции периферической крови на различные воздействия, причем изменения в относительном содержании этих клеток наступают быстро и зависят от вида стрессора. К 7-м сут картина крови в основном нормализовалась.

Глава V. Обсуждение результатов Как показали результаты работы, в реакцию рыб на токсическое воздействие вовлекаются все уровни организации иммунной системы: клеточный, тканевой, органный. При этом происходящие изменения зависели от вида рыб, а также природы загрязняющего вещества и сроков воздействия.

Исследования по изучению влияния солей тяжелых металлов на молодь осетра позволили заключить, что в целом наиболее сильным токсическим действием обладали ионы ртути, вызвавшие максимальные колебания почти всех изучаемых параметров, изменения показателей после экспозиции в солях меди были наименее выраженными. Наши данные свидетельствуют также, что к 50-суточному возрасту качественный состав лейкоцитов периферической крови и их реакция на токсический стресс у молоди сибирского осетра соответствуют описанным в литературе для взрослых особей.

Установлены некоторые различия в действии одного класса токсикантов (ионов тяжелых металлов) на исследуемые показатели рыб одного вида, с одной стороны, и с другой - отмечена видовая специфичность в реакции на однотипное воздействие. Так, при действии ионов кадмия в эквитоксических концентрациях реакция лейкоцитов периферической крови карпа не была столь ярко выраженной, как у осетра, при этом изменения белкового обмена под действием токсиканта были более сильными у карпа. Причиной этого явления могут быть различия в связывании катионов кадмия аминокислотами, пептидами и белками, особенно металлотионеинами (Коновалов, 1993), у разных видов рыб.

Поскольку основная масса сывороточных белков синтезируется в печени, весьма интересным и важным представляется вопрос о влиянии изменений в работе печени под влиянием токсикантов на уровень общего белка. Для анализа сопряженности значений гепатосоматического индекса и концентрации общего белка был определен коэффициент корреляции этих показателей г (Табл. 5).

Выявлено, что для разных ионов тяжелых металлов уровень сопряженности показателей резко различался: для ионов меди взаимозависимость не была установлена, в то время как для ртути и кадмия у осетра приближалась к линейной. Наиболее высокое абсолютное значение коэффициента корреляции было получено у карпа при действии кадмия. Таким образом, учитывая влияние данного класса токсикантов на другие показатели, можно заключить, что при действии солей тяжелых металлов, обладающих более выраженным общим токсическим действием, наблюдается высокий уровень взаимозависимости между состоянием печени и содержанием общего белка, причем корреляция может быть как положительной, так и отрицательной, в зависимости от вида рыб. Для ионов с менее выраженной токсичностью, в данном случае меди, связи между данными показателями не установлено.

В случае экспозиции в карбофосе и после иммунизации коэффициенты

сопряженности показателей оказались очень близки и достаточно высоки,

Таблица 5

Взаимосвязь изменений гепатосоматического индекса и уровня общего белка

Вид рыбы Воздействие Коэффициент корреляции г

осетр нй -0,89

осетр Си 0,36

осетр а -0,9

карп а 0.99

карп Карбофос 0,76

карп Бактерии 0,74

карп Карбофос+бакгерии 0,84

чтобы говорить об однонаправленности изменений. При усилении силы стрессора (совместном действии данных факторов) коэффициент корреляции оказался более высоким, как и в случае действия более токсичных ионов тяжелых металлов. Это позволяет предположить, что с повышением силы стрессора взаимозависимость между гепатосоматическим индексом и уровнем сывороточного белка повышается. Расчет данного показателя может оказаться весьма полезным при оценке токсичности различных соединений.

Помимо активизации выработки тканевого лизоцима у осетра, установлено стимулирующее действие ионов кадмия и карбофоса на защитные свойства сыворотки крови карпа. Из наших данных также следует, что в условиях слабого токсического стресса, вызванного экспозицией в растворе соли кадмия, у личинок плотвы происходит выработка защитных антимикробных соединений, отсутствующих у интактных рыб. Основываясь на полученных результатах, можно заключить, что на начальных этапах воздействия разные по химической природе токсиканты вызывают у рыб разных видов стимуляцию механизмов неспецифического гуморального иммунитета. В то же время, анализ наших и литературных данных (Резниченко, 1982), позволяет заключить, что активизация защитных функций на первых

этапах воздействия может являться проявлением форсированного (нагрузочного) режима жизнедеятельности, что способно в дальнейшем привести к развитию патологии, особенно важно учитывать это при увеличении силы стрессора или продолжительности воздействия.

Поскольку противомикробная активность обеспечивается веществами белковой природы, в основном ферментами, интерес представляет также наличие связи между уровнем общего белка сыворотки крови и ее защитными свойствами. Нами были просчитаны коэффициенты корреляции г между указанными показателями для карпа при различных воздействиях.

Таблица 6

Взаимозависимость изменений показателей БАСК и общего белка у карпа

Однозначной взаимозависимости у исследованных рыб не выявлено (Табл. 6). Однако можно отметить довольно высокий уровень положительной корреляции (от 0.52 до 0.96) этих показателей в случае действия токсических агентов, и отрицательной (либо отсутствие связи) - при действии бактериального антигена, даже в сочетании с пестицидом. Это может свидетельствовать о различных путях осуществления неспецифической гуморальной защиты при действии биотических и химических факторов.

Обнаруженные изменения в соотношении типов лейкоцитов периферической крови при действии разных по природе токсикантов на разные виды рыб носят в целом сходный характер, свидетельствующий о развитии общей неспецифической реакции, сопровождающейся лимфопенией и гранулоцитозом, а также снижением лейкопоэза.

Особого внимания заслуживает явление более сильного повреждающего действия низких концентраций карбофоса (1-5 мг/л) по сравнению с более высокими, что проявляется не только в полном подавлении БАСК после

экспозиции, сохранении изменений содержания общего белка сыворотки крови и уровня ее защитных свойств, но и в нарушении соотношения между отдельными типами лейкоцитов и снижении лейкопоэза в течение длительного периода после снятия токсического воздействия.

Данные экспериментов свидетельствуют, что сублетальные концентрации карбофоса не оказали существенного влияния на большинство иммунофизиологических показателей карпа при действии бактериального антигена, за исключением достоверного угнетения защитных факторов сыворотки крови у иммунизированных рыб. Также было установлено, что реакция тромбоцитов на токсическое и биотическое воздействия была противоположно направленной, а при совместном действии токсиканта и иммунизации влияние карбофоса сглаживалось.

Подытоживая полученные данные, можно заключить, что при действии загрязняющих веществ различной природы у молоди рыб разных видов развиваются сходные в целом изменения, заключающиеся в нарушении белкового обмена и защитных свойств сыворотки крови, угнетении антителопродуцирующей и активизации фагоцитарной составляющих периферической крови, подавлении функции иммунопоэтической ткани, что, в конечном счете, делает рыбу более восприимчивой к различным инфекционным и инвазионным заболеваниям.

На основе полученных результатов были сделаны следующие выводы: 1. Токсические факторы различной природы вызывают у рыб разных видов развитие универсальной неспецифической реакции. При этом интенсивность и направленность происходящих в иммунной системе изменений имеют видовую специфику и зависят от природы, концентрации токсиканта и времени воздействия. Реакции клеточного и гуморального звеньев неспецифического иммунитета на действие загрязняющих веществ могут иметь противоположную направленность.

2. Ионы тяжелых металлов, даже в эквитоксических концентрациях, действуют на показатели иммунофизиологического статуса молоди осетра неодинаково; наиболее выраженное влияние оказали соли ртути, наименее -меди. Ионы кадмия вызывают у осетра более явные сдвиги в соотношении лейкоцитов периферической крови, у карпа - изменения морфофизиологических показателей.

3. Ткани личинок плотвы в норме не обладают противомикробными свойствами. Сублетальные концентрации кадмия инициируют выработку защитных агентов развивающимися иммунокомпетентными органами; с повышением концентрации токсиканта данный эффект снижается.

4. Низкие концентрации карбофоса могут вызывать более глубокие структурно-функциональные нарушения в иммунной системе, чем более высокие; независимо от концентрации токсикант приводит к угнетению лейкопоэза в течение длительного периода после переноса рыб в чистую воду.

5. Карбофос в концентрации 0.1 от ЬС50 подавляет реакцию неспецифических гуморальных факторов рыб на бактериальный антиген. На остальные показатели иммунизированных рыб пестицид существенного влияния не оказал.

6. Все виды стрессоров- вызвали резкие сдвиги относительного содержания тромбоцитов периферической крови в первые сутки с начала воздействия, причем направленность изменений на токсический и биотический факторы была противоположной.

7. Сопряженность между изменениями гепатосоматического индекса, содержанием общего белка сыворотки крови и ее антимикробными свойствами зависит от характера воздействия, его силы и вида рыбы.

8. Загрязняющие вещества проявляют иммуномодулирующие свойства; помимо иммуносупрессии, на начальных этапах воздействия сублетальные концентрации токсикантов способны вызвать значительное повышение показателей неспецифической гуморальной защиты рыб.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Микряков В.Р., Понякина И.Д., Лебедев К.А., Балабанова Л.В., Лапирова Т.Б., Силкина Н.И. Анализ лейкоцитов крови для скрининга рыб в популяционно-экологических исследованиях //Вопр. ихт., 1992. Т. 32, вып. 5, с. 155—160.

2. Лапирова Т.Б., Маврин А.С., Разумова O.K., Микряков В.Р. Динамика концентрации тканевого лизоцима молоди сибирского осетра под воздействием сублетальных концентраций Си, Hg и Cd //Межд. симп. "Зооиндикация и экотоксикология животных в условиях техногенного ландшафта". Тез. докл. Днепропетровск, 1993. с. 196—197.

3. Лапирова Т.Б., Разумова O.K., Микряков В.Р., Виноградов Г.А Влияние солей тяжелых металлов на картину белой крови молоди осетра //Межд. симп. "Зооиндикация и экотоксикология животных в условиях техногенного ландшафта". Тез. докл., Днепропетровск, 1993. с. 197—198.

4. Лапирова Т.Б. Изменения состава иммуноцитов периферической крови карпа под воздействием карбофоса //'Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях". XII Российская научная конф. Тез. докл., Челябинск. 1995. С. 75.

5. Микряков В.Р., Лапирова Т.Б. Влияние солей некоторых тяжелых металлов на картину белой крови молоди ленского осетра Acipenser baeri Brandt/ZBonp. ихт. 1997. Т. 37, № 4, с. 538—542.

6. Микряков В.Р., Лапирова Т.Б. Влияние карбофоса на картину белой крови карпа//Итоги науч.-практ. работ в ихтиопатологии, инф. бюлл., М., 1997. с. 72—73.

7. Лапирова Т.Б. Изменения показателей белой крови карпа под воздействием карбофоса// Матер. II Межд. конф. "Биол. ресурсы Белого моря и внутр. вод. Европ. Севера", изд. Петроз. ун-та, Петрозаводск, 1999. С.237-239.

8. Лапирова Т.Б., Микряков В.Р. Маврин АС., Виноградов ГА Влияние сублетальных концентраций солей ртути, кадмия и меди на содержание

лизоцима в тканях молоди ленского осетра (Acipenser baeri BrandtZ/Журн. эволюц. биох. и физиол. Т.36. № 1. 2000. С. 37-41.

9. Лапирова Т.Б. Изменения показателей белой крови карпа под влиянием карбофоса и иммунизации//Биол. внутр. вод. №3,2000. С. 102-106.

10. Лапирова Т.Б. Влияние различных концентраций карбофоса на гематологические показатели молоди карпа// Биол. внутр. вод. 2000. №4. С. 141-146.

11. Микряков В.Р., Балабанова Л.В., Заботкина Е.А., Лапирова Т.Б., Попов А.В., Силкина Н.И. Реакция иммунной системы рыб на воздействие некоторых биотических и абиотических факторов среды. Деп. ВИНИТИ. №388-ВОО. 2000. 121с.

12. Лапирова Т.Б. Влияние различных токсикантов на некоторые показатели периферической крови молоди рыб//Акт. проблемы естеств. и гуманитарных наук на пороге XXI века. Тез. докл. Ярославль: ЯрГУ. 2000. С. 54-56.

13. Лапирова Т.Б. Влияние некоторых токсикантов на бактериостатическую активность сыворотки крови карпа (Cyprinus carpió L.)// "Проблемы охраны здоровья рыб в аквакультуре". Матер, науч.-практ. конф. М. Россельхозакадемия. 2000. С. 79-80.

14. Лапирова Т.Б., Изюмов Ю.Г., Микряков В.Р. 2000. Влияние ионов кадмия на антибактериальные свойства тканей личинок плотвы (Rutilus rutilus, L.)// "Проблемы охраны здоровья рыб в аквакультуре". Материалы науч.-практ. конф. М. Россельхозакадемия. 2000. С. 80-81.

15. Лапирова Т.Б. Влияние сублетальных концентраций ртути, меди и кадмия на иммунофизиологическое состояние молоди ленского осетра// Биол. внутр. вод. №3,2001. С. 80-84.

16. Микряков В.Р., Балабанова Л.В., Заботкина Е.А.,Лапирова Т.Б., Попов А.В., Силкина Н.И. Реакция иммунной системы рыб на загрязнение воды токсикантами и закисление среды. М., Наука, 2001. 126 с.

17. Mikryakov V.R, Lapirova T.B., Soltani, M., Mavrin A.S. and Vinogradov G.A. Influence of sublethal concentrations of some heavy metal salts (Hg, Cd and

Cu) on the contents of lysozyme in tissues of sturgeon fmgerlings (Acipenser baeriy/Bull. ofthe Eur. Ass. of Fish Pathol. V. 22 (1), 2002. P.15-21.

18. T.B. Lapirova, A.S. Mavrin, V.R. Mikryakov, G.A. Vinogradov, M. Soltani. The effect of sublethal concentrations of Hg2+, Cu2+ and Cd2+ on the content of tissue lysozyme in juvenile Lena sturgeon (Acipenser baeri Brandt ) //6th International Veterinary Immunology Symposium. Uppsala, 2001. P.87.

19. Лапирова Т.Б., Микряков В.Р. Влияние карбофоса на протективные свойства сыворотки крови карпа//Всерос. конф. «Проблемы водной токсикологии». Тез.докл. Борок, 2002. С 47-48.

20. Лапирова Т.Б., Микряков В.Р. Реакция иммунной системы карпа Cyprinus carpio, L. на иммунизацию бактериальным антигеном и загрязнение воды карбофосом//Матер. Межд. науч.-практ. конф. «Аквакультура начала XXI века: истоки, состояние, стратегия развития». Рыбное, 2002. С. 71-77.

21. Балабанова Л.В., Заботкина Е.А., Лапирова Т.Б., Микряков В.Р. Влияние карбофоса и иммунизации бактериальным антигеном на некоторые показатели иммунной системы карпа Cyprinus carpio L. (Cyprinidae)//Bonp. ихт., 2003. Т. 43, №2. С. 262-271.

22. Лапирова Т.Б. Сравнительный анализ влияния различных классов токсикантов на иммунофизиологический статус молоди рыб// Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. «Пробл. патол., иммун. и охраны здоровья рыб и других гидробионтов». М., 2003. С. 65-67.

23. Заботкина Е.А., Лапирова Т.Б. Влияние тяжелых металлов на иммунофизиологический статус рыб (обзор)// Успехи совр. биол. 2003. Т. 123, №4. С. 411-418.

РНБ Русский фонд

2004-4 25908