Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние соединений свинца на альго-цианобактериальное сообщество серой лесной почвы

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние соединений свинца на альго-цианобактериальное сообщество серой лесной почвы"

На правах рукописи

Темралеева Анна Дисенгалиевна

ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИЙ СВИНЦА НА АЛЬГО-ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНОЕ СООБЩЕСТВО СЕРОЙ ЛЕСНОЙ ПОЧВЫ

03.02.03. - микробиология 03.02.08. - экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г 4 ОКТ 2013

005535757

Москва-2013

005535757

Работа выполнена в лаборатории физико-химии почв Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Пинский Давид Лазаревич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, ведущий научный

сотрудник лаборатории изучения экологических функций почв Института проблем экологии и эволюции имени А.Н. Северцова РАН Терехова Вера Александровна

кандидат биологических наук, начальник лаборатории клеточной биоэнергетики НТК «Биоэнергетика» НБИКС-Центра

Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» Намсараев Зоригто Баирович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт микробиологии имени С.Н. Виноградского Российской академии наук, г. Москва

Защита диссертации состоится «19» ноября 2013 года в 15:30 в аудитории М-2 на заседании Диссертационного совета Д501.002.13 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, д.1, строение 12, факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « ^» 2013 года.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании диссертационного совета или прислать отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные печатью, по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, факультет почвоведения, Ученый совет.

Ученый секретарь

диссертационного совета Зенова Галина Михайловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. В настоящее время возрастает интерес к методам биодиагностики состояния сред, среди которых особое место занимает почва - главный биогеохимический барьер на пути миграции загрязнителей в сопредельные среды. Перспективность использования микроорганизмов для биодиагностики загрязненных почв показана в ряде исследовательских работ (Звягинцев и др., 1989; Гузев, Левин, 1991; Кабиров и др., 1997; Штина и др., 1998; Полянская, Звягинцев, 2005; Терехова, 2007; Домрачева и др., 2008). Почвенные водоросли sensu lato составляют неотъемлемую часть эдафона, имеют многочисленные трофические и топические связи, участвуют в почвообразовательном процессе, обладают специфической чувствительностью к различным видам антропогенного воздействия и быстрой ответной реакцией на изменение экологической ситуации (Кабиров, 2007). В связи с этим, почвенные водоросли как объекты биодиагностики представляют значительный научный и практический интерес, но реакция почвенного альго-цианобактериального сообщества (АЦС) на загрязнение соединениями тяжелых металлов (ТМ) изучена недостаточно. Кроме того, в приоритетном списке загрязнителей почвы одно из первых мест занимает свинец, вследствие широкого использования, высокой токсичности и способности к аккумуляции в цепях питания живых организмов. В отличие от органических загрязнителей, ТМ, в том числе и свинец, не разрушаются и способны только перераспределяться между компонентами природной среды (Черных и др., 2001). Таким образом, разработка научных основ биодиагностики загрязненной ТМ почвы на основе реакции АЦС является актуальной научной задачей.

Цель исследования: оценка влияния различных соединений свинца на состояние альго-цианобактериапьного сообщества серой лесной почвы в модельных экспериментах.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить воздействие различных соединений свинца на почвенные водоросли по изменению структурно-функциональных показателей на различных уровнях организации АЦС: молекулярно-клеточном, организменном и ценотическом.

2. Выявить устойчивые к загрязнению виды почвенных водорослей.

3. Определить наиболее диагностически значимые показатели состояния

АЦС.

4. Оценить прямое и косвенное влияние химической формы свища на реакцию АЦС.

5. Разработать систему оценки влияния соединений свинца на АЦС на основе метода водно-почвенного культивирования водорослей, обосновать преимущества использования данного метода в экотоксикологических экспериментах, сравнив его с методом чашечных культур со «стеклами обрастания».

Научная новизна. Для изучения влияния соединений свинца на состояние почвенного АЦС в экотоксикологических экспериментах был впервые использован метод водно-почвенных культур. Разработана, обоснована

и апробирована методика, позволяющая в близких к естественным почвенным условиям получить достаточную биомассу водорослей для определения реакции АЦС на молекулярно-клеточном, организменном и ценотическом уровнях. Впервые изучено влияние разных химических форм свинца и физико-химических свойств культуральной среды на таксономическую структуру и функциональное состояние АЦС серой лесной почвы.

Практическая значимость. Полученные результаты о влиянии соединений свинца на структурно-функциональные показатели АЦС серой лесной почвы могут быть использованы как научная основа для разработки методик альгодиагностики по оценке состояния почв. По итогам работы даны практические рекомендации по использованию АЦС в экотоксикологических экспериментах: по срокам пробоотбора почвы, по учету влияния химической формы металла, о необходимом уровне точности при таксономическом определении почвенных водорослей, по пробоподготовке почвенно-альгологических проб, а также по модификации метода чашечных культур со «стеклами обрастания». Полученные данные могут быть использованы в учебных курсах по экологии микроорганизмов, почвенной альгологии и экотоксикологии.

Защищаемые положения.

1. Зеленые водоросли более устойчивы к воздействию соединений свинца по сравнению с цианобактериями и желто-зелеными водорослями.

2. Различные соединения свинца неодинаково влияют как на структурно-функциональные показатели АЦС, так и на физико-химические свойства жидкой фазы водно-почвенной культуры.

3. Для характеристики состояния АЦС при загрязнении почвы тяжелыми металлами следует использовать систему альгологических показателей на разных уровнях организации сообщества.

Апробация работы. Диссертационная работа выполнялась в 2009-2012 гг. в рамках проекта РФФИ 09-04-00652-а и гранта УМНИК Х»8084 р /12612 Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере, а также гранта №24/11 КЦ компании ОПТЭК. Результаты исследований докладывались на 12 российских (Пущино, Москва, Тула, Сыктывкар) и 4 международных (Ческе-Будеёвице, Чехия; Стамбул, Турция; Женева, Швейцария; Киев, Украина) конференциях.

Личный вклад автора. Соискатель принимал участие в постановке и решении задач исследования, в отборе и пробоподготовке почвеино-альгологических проб, разработке схемы экотоксикологических экспериментов и в их проведении. Выполнял химико-аналитические работы по определению физико-химических свойств почвы и культуральной среды, проводил микробиологические исследования по идентификации почвенных цианобактерий и водорослей, а также культуральную работу с сохранением альгологических штаммов серой лесной почвы в рабочей коллекции.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 24 работы, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК, 2 статьи в

коллективных монографиях и 20 публикаций в сборниках тезисов и материалах российских и международных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав и выводов, изложена на 141 странице текста и 30 страницах приложений, сопровождается 33 иллюстрациями и 23 таблицами. Список литературы включает 306 наименований, из них 230 - на иностранном языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Почвенные водоросли (обзор литературы)

В главе дана характеристика почвенных водорослей как экологической группы микроорганизмов, подчеркнуты их морфологические и физиологические особенности, связанные со средой обитания. Рассмотрены возможности использования водорослей для биологического контроля загрязненных сред, вопросы влияния тяжелых металлов на водоросли, а также описаны внеклеточные и внутриклеточные механизмы устойчивости водорослей к их действию.

Глава 2. Материалы и методы исследований

Объектом исследований было АЦС серой лесной почвы. Пробоотбор почвенно-альгологических проб был проведен в июле 2009 года на стационарной пробной площадке N4, находящейся в районе опытно-полевой станции ИФХиБПП РАН (Пущино, Московская область), во вторичном мелколиственно-широколиственном разнотравном лесу. Образцы для исследований отбирали из верхнего 5 см слоя почвенного горизонта А1, далее высушивали до воздушно-сухого состояния, измельчали, просеивали и тщательно перемешивали. Во всех экспериментах использовали только одну смешанную пробу серой лесной почвы, подготовленную вышеуказанным образом. Для приготовления чашечных культур (ЧК) использовали протокол Кузяхметова, Дубовик (2001). Для приготовления водно-почвенных культур (ВПК) использовали соотношение «почва-вода» 1:3 (Коспков и др., 2001). Соединения свинца добавляли однократно в форме нитрата, ацетата, сульфата и оксида (II) в концентрациях: 100, 500, 1000 мг/кг почвы в пересчете на катион. Контроль (без внесения) ставили с каждым соединением отдельно. Повторность опытов пятикратная. Все культуры инкубировали при температуре 23-25 °С и освещенности 2000 Лк при 12 часовом световом дне. В случае ЧК после 2,4 и 8 недель культивирования проводили микроскопирование «стекол обрастания» для определения таксономической принадлежности водорослей и их обилия. В случае ВПК спустя 1 и 2 месяца отбирали микропробы водорослевой пленки цветения с поверхности жидкой фазы, а также соскобы со стенок бюкса и поверхности почвы для определения систематического положения водорослей и их обилия. Затем водорослевую пленку осаждали на мембранном фильтре при фильтровании жидкой фазы системы под вакуумом. В жидкой фазе ВПК определяли валовую концентрацию свинца, рН и содержание растворенного органического вещества (РОВ). Из биомассы водорослей на фильтре и твердой фазе ВПК экстрагировали пигменты с помощью 90% водного раствора ацетона (ГОСТ 17.1.4.02 - 90). Концентрации пигментов рассчитывали по уравнениям

Джеффри и Хамфри (Jeffrey, Humphrey, 1975) для смешанного фитопланктона. Пигментные индексы (Е480/Е664, Е430/Е664) рассчитывали исходя из оптических плотностей ацетонового экстракта пигментов в областях длинно- и коротковолнового максимумов поглощения света хлорофиллом а (664 нм и 430 нм) и коротковолновых максимумов для каротиноидов (430 нм, 480 нм).

Для определения видового состава сообщества использовали только живой нефиксированный материал из смешанной культуры. Трудно идентифицируемые виды изолировали и выращивали на твердых и жидких средах Bristol и BG-11 (рН=7.0). Альгологически чистые культуры водорослей культивировали в одинаковых условиях. Все микроскопические работы были выполнены с помощью микроскопов Leica DM750 и Carl Zeiss Axio Scope AI (Германия) методами световой микроскопии (светлое поле и интерференционный контраст).

Определение видов водорослей проводили с использованием отечественных и зарубежных определителей (Голлербах и др., 1953; Дедусенко-Щеголева, Голлербах, 1962; Ettl, 1978; Ettl et al., 1983; Komärek, Fott, 1983; Ettl, Gärtner, 1988; Царенко, 1990; Ettl, Gärtner, 1995, Андреева, 1998; Komärek, Anagnostidis, 1998, 2005). В работе за основу выбрана система водорослей, принятая в международной электронной базе данных AlgaeBase (Guiry, Guiry, 2013), также использовались следующие монографии: «Водоросп rpyirrie ...» (Костков и др., 2001), «Freshwater Algae of North America: ecology and classification» (2003), «Unraveling the algae: the past, present, and future of algal systematics» (2007). Состав жизненных форм (ЖФ) определялся по классификации Э.А. Штиной (Штина, Голлербах, 1976; Алексахина, Штина, 1984). Для оценки обилия вида использовали балльную систему (шестибалльная шкала Гецен с соавт. (1994): 1 - единично (менее 10 индивидов в препарате), 2 - редко (10 индивидов в препарате), 3 - нередко (1-10 индивидов в ряду препарата), 4 - часто (11-25 индивидов в ряду препарата), 5 -очень часто (25-50 индивидов в ряду препарата), 6 - в массе (более 50 индивидов в ряду препарата). Морфологические отклонения в форме клеггок, размерах, окраске отмечали визуально при микроскопическом просмотре проб.

В жидкой фазе ВПК измеряли pH (рН-метр Hanna pH 211, Германия), концентрацию свинца методом атомно-абсорбционной спектроскопии с электротермической атомизацией (Analyst 400 HGA 900 Graphite Furnance, PerkinElmer, США) и содержание РОВ методом мокрого озоления органического вещества по Тюрину и сжигания по Никитину (Шеуджен и др., 2007).

Статистический анализ полученного материала проводили с применением программных пакетов Statistica 6.1 и PC-ORD. Для обработки данных использовались следующие статистические методы и критерии: критерий нормальности распределения Шапиро-Уилка (Shapiro-Wilk normality test), критерий однородности дисперсии Левена (Levene's Test for Equality of Variances), одномерный дисперсионный анализ (ANOVA), включая метод множественных парных сравнений средних (PostHoc) по критерию Tukey HSD; многомерный дисперсионный анализ (MANOVA); корелляционный анализ. Для

1-месячных и 2-месячных экспериментов были рассчитаны средние значения и стандартное отклонение следующих параметров: концентрация свинца, pH и содержание РОВ в жидкой фазе культуры, концентрация пигментов и пигментные индексы. При составлении общего флористического списка из 5 повторностей эксперимента учитывали постоянство вида. При этом постоянными видами для данного сообщества считали, если они встречались более чем в 50 % выборок, добавочные - в 25-50 % выборок, случайные — менее чем в 25 % выборок. Случайные виды в список не включали. Балл видового обилия рассчитывали как среднее индивидуальных проб. Так как в ходе дисперсионного анализа для показателей контрольных АЦС в ВПК была показана значимость фактора «сезон», то эксперименты с различными соединениями свинца были разделены на 2 группы: заложенные в «зимний» сезон (серия опытов с внесением нитрата и ацетата свинца) и «летний» сезон (серия опытов с внесением сульфата и оксида свинца), эти группы анализировали независимо друг от друга.

Глава 3. Оценка влияния свинца на почвенные водоросли: метод чашечных культур со «стеклами обрастания» Таксономическая структура и обилие водорослей. Всего в исследованных ЧК было обнаружено 17 видов водорослей и цианобактерий из 14 родов, 7 порядков, 2 отделов. Водоросли отдела Heterokontophyta встречались единично в нескольких пробах и были отнесены к случайным видам и в дальнейшем анализе не учитывались. При культивировании АЦС загрязненной серой лесной почвы методом ЧК было обнаружено, что независимо от присутствия свинца, его дозы и химической формы при 2-х недельном культивировании во всех ЧК был обнаружен только 1 вид цианобактерии Cyanodictyon reticulatum (Lemmermann) Geitler. При этом в одном из контролен была обнаружена зеленая водоросль Spongiochloris minor Chantanachat & Bold. Данный факт, очевидно, связан не столько с высокой концентрацией свободного металла в опытах с загрязнением и устойчивостью колониальной цианобактерии с хорошо развитой слизью к его влиянию, сколько с недостаточным исходным количеством почвенных водорослей и в связи с этим отложенным пуском механизма «цветения почвы». При 1 месяце культивирования АЦС не наблюдалось массового развития водорослей в опыте с нитратом свинца при дозе 1000 мг РЬ/ кг почвы, в опыте с ацетатом свинца при средней и максимальной дозах, что связано с высокой токсичностью данных доз растворимых солей свинца. В случае с нитратом и ацетатом свинца доля зеленых водорослей в составе 1-месячного АЦС и видовое разнообразие в целом уменьшались прямо пропорционально токсической нагрузке (рис. 1, а). При максимальной дозе металла на «стеклах обрастания» были обнаружены единичные представители цианобактерий. При добавлении малорастворимых соединений свинца подобной тенденции не было выявлено: независимо от дозы всегда доминировали зеленые водоросли. После продолжительного культивирования (2 месяца) видовое разнообразие АЦС увеличивалось (рис. 1, б), во всех опытах без исключения доминировали зеленые водоросли родов Elliptochloris, Bracteacoccus, Tetracystis, Chlamydomonas, Chlorella,

БрощюсЫот, Мускопа№$ и Соссотуха. Цианобактерии, если они и обнаруживались на «стеклах обрастания», имели низкие баллы обилия и степень доминирования не более 12%.

■ ♦ - РЬ(СН!СОО)2*ЗН20 - -Ж - РЬО

(а) (б)

Рнс. 1. Влияние соединений свинца на индекс видового разнообразия Шеннона при 1 (а) и 2-х (б) месяцах культивирования АЦС: 0 - контроль, 1-100 мг РЬ/ кг почвы, 2 - 500 мг РЬ/ кг почвы, 3 -1000 мг РЬ/ кг почвы

Спектр жизненных форм водорослей. Увеличение вклада С- и СЬ-форм в спектр экобиоморф одномесячного АЦС наблюдалось по мере увеличения градиента концентрации свинца в ацетатной и нитратной формах, соответственно. Согласно Штиной и Голлербаху (1976), СЬ-форму составляют виды, способные вызывать «цветение почвы», отличающиеся исключительной выносливостью к различным экстремальным условиям, а также чрезвычайной конкурентоспособностью. С-форма включает виды водорослей с обильной слизью, способные легко переходить в пальмеллевидное состояние, за счет которого переживают неблагоприятные условия. Почвенные водоросли X-формы исчезали из состава 1-месячного сообщества при максимальной дозе нитрата свинца и средней и максимальной ацетата свинца, что соответствует представлениям об их низкой устойчивости к экстремальным факторам среды. Таким образом, увеличение срока культивирования водорослей, как правило, приводило к повышению видового богатства АЦС, расширению спектра ЖФ водорослей, что, вероятно, связано со снижением токсической нагрузки и адаптацией к ней сообщества, а также с достижением определенного количества клеток водорослей в почве и отсутствием ингибирующих биотических взаимодействий. Исходя из полученных данных, высокие дозы ацетата свинца оказывали самый сильный отрицательный эффект на формирование и таксономическую структуру 1-месячного АЦС, культивируемого методом ЧК, по сравнению с другими соединениями металла. Возможно, имело место антагонистическое взаимодействие между грибами, потреблявшими доступное органическое вещество, и почвенными водорослями, которое было сведено к минимуму при 2-месячном сроке культивирования. Следует также отметить, что все опыты были заложены в период с апреля по июнь, и зависимости результатов эксперимента от сезона закладки опытов

обнаружено не было. Однако, хотелось бы подчеркнуть высокую вариабельность данных о видовом богатстве, разнообразии и обилии видов, что несомненно связано со сложностью устранения почвенной неоднородности при пробоподготовке. Кроме того, на «стеклах обрастания» способно развиваться ограниченное количество видов водорослей, вследствие чего влияние соединений свинца на видовой состав, обилие и спектр ЖФ не всегда четко прослеживается.

Глава 4. Оценка влияния свинца на почвенные водоросли: метод водно-почвенных культур 4.1. Влияние свинца на состояние АЦС

Таксономическая структура и обилие водорослей. Всего в исследованных ВПК было обнаружено 22 вида водорослей и цианобактерий из 19 родов, 8 порядков, 3 отделов. В целом, при внесении высоких концентраций растворимых солей свинца и экспозиции 1 месяц наблюдалось увеличение доминирования зеленых водорослей: Bracteacoccus minor (Chodat) Petrovä, Chlorosarcinopsis cf. eremi Chantanachat & Bold, Chlorella vulgaris Beijerinck и Chlamydomonas sp. Поступление доступного азота при внесении минимальной и средней доз нитрата свинца оказывало благоприятное воздействие на АЦС и нивелировало токсическое действие металла: видовое разнообразие и богатство оставалось на уровне контроля (рис. 2, а). При внесении максимальной дозы — в составе сообщества присутствовали исключительно зеленые водоросли.

—4—Pb(N03)2 - - РЬГСтСОО)2-ЗШО

—it— PbS04 - - PbO

¿Г*"

• , •Ш

8-.......Ш -

(а) (б)

Рис. 2. Влияние соединений свинца на индекс видового разнообразия Шеннона при 1 (а) и 2-х (б) месяцах культивирования АЦС: 0 - контроль, 1 - 100 мг РЬ/ кг почвы, 2 - 500 мг РЬ/ кг почвы, 3-1000 мг РЬ/ кг почвы

При добавлении ацетата свинца развивались способные к факультативной гетеротрофии цианобактерии, однако при максимальном воздействии также преобладали зеленые водоросли. Малорастворимые соединения свинца не оказывали существенного воздействия на почвенные водоросли: состав АЦС был полночленным, разнообразие и обилие на уровне контрольных опытов без внесения свинца. После 2-х месяцев экспозиции показатели видового богатства и разнообразия находились на уровне контрольных, или даже превышали их (рис. 2, б). Особенно высоки эти показатели при добавлении ацетатной формы свинца. В составе всех сообществ при разной степени токсической нагрузки

присутствуют представители 3-х отделов. Вероятно, что при более длительном культивировании после периода замедленного роста водорослей вследствие токсичности среды доступный углерод необходим больше, чем азот. Азот был потреблен водорослями сразу и дал потенциал для быстрого роста устойчивым к свинцу видов при 1 месячной экспозиции. Углерод, по-видимому, обладает «замедленным» косвенным действием на АЦС. Возможно, его влияние было опосредованно через гетеротрофный компонент системы (бактерии и грибы), стимуляцию их размножения с последующим выделением углекислого газа и метаболитов, активизирующих фотосинтез и рост водорослей. Косвенный механизм воздействия ацетата свинца, по-видимому, является одной из причин задержки развития 1-месячного АЦС.

Спектр жизненных форм водорослей. При увеличении токсической нагрузки наблюдается сужение спектра экобиоморф и увеличение доминирования Ch-формы, представителями которой являются устойчивые виды-убиквисты. Это тенденция сохраняется в динамике. Долговременное культивирование водорослей при внесении нитрата и ацетата свинца приводит к увеличению разнообразия ЖФ, а действие малорастворимого оксида свинца вызывает резкое уменьшение количества ЖФ и преобладание олиготрофов, способных развиваться на бедных субстратах.

Морфологические изменения водорослей. В 1-месячных экспериментах во всех опытах с различными соединениями свинца морфологических изменений цианобактерий и водорослей обнаружено не было (рис.3, 1-5а). При более продолжительном культивировании во всех экспериментах отмечались возрастные изменения водорослей в сообществе, которые выражались в накоплении масла внутри клеток — у В. minor (рис.3, 46), Ch. cf. eremi (рис.3, 36) и Characiopsis borziana Lemmermann (рис.3, 56). Наряду с этим были замечены морфологические изменения, свидетельствующие о неблагоприятной среде для водорослей, такие как вакуолизация клеточного содержимого у зеленых водорослей Chlamydomonas sp. (рис.3, 26) и образование гипноспор и синтез вторичных каротиноидов у Protosiphon botryoides (Kützing) Klebs (рис.3, 16, в). Также был отмечен лизис клеток.

Так как данные явления были установлены и для контрольных опытов без влияния свинца, то можно заключить, что морфологические изменения водорослей в составе АЦС связаны с истощением питательных веществ в ВПК после 2 месяцев культивирования. Однако, процессы старения и отмирания клеток особо отчетливо были заметны при 2-х месячном сроке культивирования водорослей и внесении максимальных концентраций нитратной формы свинца (рис.3, 2-5в), что связано не только с изменениями возрастной структуры АЦС, но и с прямым токсическим действием металла. Только CA. vulgaris и Соссотуха subglobosa Pascher не обнаруживали каких-либо морфологических отклонений во всех вариантах экспериментов.

Рис. 3. Морфологические особенности почвенных водорослей фоновой и загрязненной свинцом ВПК: 1 - Р. botryoides, 2 - Chlamydomonas sp., 3 - CA. cf. eremi, 4 -B. minor, 5 - Ch. borziana; а - 1 месяц (контроль+опыт), 6-2 месяца (контроль+опыт), в - 2 месяца (1 ООО мг РЬ / кг почвы в форме нитрата)

Пигментный анализ. В качестве показателя обилия цианобактерий и водорослей была использована концентрация хлорофилла а, для оценки «физиологического» состояния АЦС были рассчитаны значения пигментных индексов Е430/Е664 и Е480/Е664. Концентрация хлорофилла а из смешанной культуры водорослей и цианобактерий при разных воздействиях отражена на рис. 4. После 1 месяца с начала эксперимента по всем пигментным показателям в опытах без внесения свинца четко выделяются 2 группы: эксперименты, заложенные в феврале и июне. Несмотря на то, что культивирование водорослей происходило в стандартных условиях, при постоянной освещенности и температуре, скорость размножения и роста водорослей различается в холодный и теплый периоды. Этот факт, связанный с естественной эндогенной ритмикой развития АЦС, был также отмечен рядом авторов при работе в стандартных условиях как со смешанными культурами, так и отдельными штаммами цианобактерий (Golden et al., 1997; Lee, Rhee, 1999; Kondo, Ishiura, 2000; Golden, Canales, 2003; Nakajima et al., 2005) и водорослей (Андреева, 2001; Suzuki, Johnson, 2001; Mittag et al., 2005; Божков и др., 2008; Lüning et al., 2008). Однако, после более продолжительного срока культивирования (2 месяца) этой сезонной зависимости не наблюдается. Концентрация хлорофилла а в опытах с 1-месячным культивированием

максимальна при внесении малорастворимых соединений сульфата и оксида свинца и минимальна в случае хорошо растворимых нитрата и ацетата свинца. В 2-х месячных экспериментах при внесении ацетата и оксида свинца содержание хлорофилла а водорослей снижалось, а добавление нитрата свинца, напротив, стимулировало рост АЦС. В целом, на концентрацию пигмента значимо оказывали воздействие факторы «соединение» и «время», но не «доза».

■ РЬ(ШЗ)2 □ РЬ(СНЗСО0)2«ЗН2О ОРЬ804 ОРЬО ИРЬ(ШЗ)2 □ РЬ(СНЗШ0)2-ЗН20 0РЬ804 ПРЬО

Хл. а, мг/л

Хл. а, мг/л

-: ---3-----

(а)

(б)

Рис. 4. Концентрация хлорофилла а в 1 (а) и 2-х (б) месячных АЦС при воздействии различных соединений свинца: 0 - контроль, 1 - 100 мг РЬ/ кг почвы, 2 - 500 мг РЬ/ га-почвы, 3 - 1000 мг РЬ/ кг почвы

Индексы Е430/Е664 и Е480/Е664 характеризуют соотношение общих каротиноидов и хлорофилла а. Считается, что повышение этих индексов свидетельствует об ухудшении «физиологического» состояния альгоценоза и увеличении его пигментного разнообразия (Бульон, 1983; Ермолаев, 1989; Минеева, 2004). Увеличение значений индексов относительно контроля отмечено для опытов с внесением минимальной дозы ацетатной (1 месяц), сульфатной (1 месяц) и оксидной (2 месяца) форм металла. При увеличении срока культивирования в 2 раза в опытах с растворимыми соединениями свинца значения пигментных индексов снижались, а в случае с малорастворимым оксидом свинца — наоборот, повышались по сравнению с более ранним сроком. При средней токсической нагрузке увеличение длительности культивирования вызывало увеличение индексов только в опытах с сульфатом и оксидом свинца, в случае с ацетатом свинца происходило снижение, а при внесении нитрата свинца значения индексов не зависели от времени.

В целом, содержание хлорофилла а и значения пигментных индексов в смешанной пробе почвенных водорослей могут рассматриваться в качестве экологических показателей, отражающих общее обилие водорослей и их экофизиологическое состояние, соответственно. Однако, без учета таксономической структуры они могут быть неправильно интерпретированы, так как ухудшение экофизиологического состояния чувствительных водорослей и аналогичное ухудшение устойчивых - это две разные экологические

ситуации, которые могут быть выражены в одинаковых количественных значениях пигментных характеристик.

4.2. Влияние соединений свинца на свойства жидкой фазы водно-почвенной культуры

Свинец в жидкой фазе. Жидкая фаза ВПК является источником как биологически необходимых элементов питания для водорослей, так и источником токсических соединений. Концентрации свинца в растворе при внесении различных доз 4-х соединений металла составляют от 0.003 до 0.082 % от внесенной дозы. С увеличением длительности культивирования АЦС концентрация свинца в жидкой фазе ВПК снижается минимально в 1.1 раз, максимально - в 7.7 раза (рис. 5).

1РЬ(ШЗ)2 ВРЬ(СНЗС00)2-ЗН20 □ РЬв04 ПРЬО ВРЬ(МОЗ)2 В РЬ(СНЗС00)2-ЗН20 ОРЬ504 ОРЬО

С

(а) (б)

Рис. 5. Концентрации свинца в жидкой фазе ВПК после 1 (а) и 2 (б) месяцев культивирования АЦС: 0 - контроль, 1 - 100 мг РЬ/ кг почвы, 2 - 500 мг РЬ/ кг почвы, 3 -1000 мг РЬ/ кг почвы

Согласно факторному анализу в опытах без дополнительного внесения металла (контроли) естественная концентрация свинца в растворе значимо снижается с увеличением времени культивирования АЦС, в то время как влияние сезона закладки эксперимента на данный параметр выявлено не было. В опытах с внесением свинца во всех химических формах по мере увеличения длительности культивирования АЦС концентрация свинца в растворе снижалась за счет связывание металла сорбционными участками почвы и микроорганизмов. Концентрация свинца в жидкой фазе ВПК зависит от дозы, вносимой в ВПК, формы соединения и времени культивирования АЦС. В опытах с растворимыми солями концентрация свинца в растворе растет прямо пропорционально увеличению токсической нагрузки при всех изучаемых дозах. Фактор «доза» объясняет 78.2% вариации концентрации свинца при добавлении нитратной и ацетатной формы металла и 66.9% при добавлении сульфатной и оксидной. Концентрация ионов свинца в жидкой фазе ВПК при добавлении его растворимых солей определяется адсорбционными взаимодействиями с поверхностью твердой фазы почвы, а токсическое действие свинца и его поступление в водоросли, еще и взаимодействием с

компонентами раствора. При внесении в почву малорастворимых солей свинца его концентрация определяется не только адсорбцией на поверхности почвенных частиц, но и растворимостью этих солей. Максимальные концентрации свинца в растворе наблюдались при внесении растворимых солей металла, а среди них - нитрат свинца имел максимальные концентрации в растворе независимо от доз внесения металла и сроков культивирования АЦС. Этот факт связан с тем, что при добавлении нитрата свинца в растворе образуются различные комплексные катионы свинца, в том числе ионная пара Pb(N03)+. Она очень нестабильна, и содержание ее в растворе крайне незначительно. Значительная часть металла находится в формах РЬ2+ (до 40%) и РЬ(ОН)+ (до 20%) (Минкина и др., 2009). При добавлении ацетата свинца в жидкой фазе ВПК в значительный количествах образуется прочный комплексный катион РЬ(Ас)+ (Пинский и др., 2010). Данный однозарядный катион нейтрализует только 1 заряд на поверхности почвенных частиц. Как следствие, при одинаковой сорбционной емкости серой лесной почвы уксуснокислый свинец в большем количестве сорбируется почвой по сравнению с азотнокислым. Кроме того, ацетат-ион может усиливать депротонизацию поверхности почвенных частиц за счет связывания протона анионом уксусной кислоты. При этом увеличивается катионообменная емкость почвенных частиц и, следовательно, адсорбция положительно заряженных форм свинца. Спустя 2 месяца с начала эксперимента концентрации свинца в жидкой фазе ВПК стали заметно ниже независимо от формы и дозы внесения, что, очевидно, связано как с трансформацией адсорбированного свинца в менее растворимые поверхностные осадки (Borda, Sparks, 2008), так и со связыванием металла бурно развивающейся почвенной биотой.

рН культуральной среды. Водоросли весьма чувствительны к изменению рН среды. Значения рН жидкой фазы ВПК при внесении различных доз 4-х соединений металла показаны на рис. 6. Данный показатель зависит от химической формы металла и срока культивирования водорослей, но не от дозы. Отсутствие значимого влияния фактора «доза» свидетельствует о высокой буферной емкости серой лесной почвы. В зависимости от формы свинца изменялось кислотно-щелочное равновесие в растворе: так, после 1 месяца культивирования АЦС жидкая фаза ВПК с ацетатом свинца имела нейтральную реакцию среды независимо от дозы. Для нитрата и оксида свинца отмечалась обратная тенденция: подщелачивание раствора пропорционально токсической нагрузке (см. рис. 6, а). В случае с сульфатом свинца максимальная доза вызывала значимый сдвиг рН в нейтральную сторону. После 2 месяцев эксперимента, в жидкой фазе ВПК наблюдается снижение рН во всех опытах кроме ацетата свинца, где значение рН оставалось нейтральным. В данном случае ацетат сработал как буфер, и реакция среды не зависела от срока культивирования (фактор «время» незначим). Самая щелочная реакция отмечается в опыте с оксидом свинца (рис.6, б).

—•—РЬ(НОЗ)2 —&—РЬЭ04 рН 8,5

- РЬ(СЮСО0)2-ЗН2О -РЬО

- РЬ(СНЗСОО)2'ЭН20 •РЮ

7,5 7,0 6,5

1

ГГ '•ш . . т .

- - -

(а)

(б)

Рис. б. рН жидкой фазы ВПК при внесении различных соединений металла после 1 (а) и 2-х (6) месяцев культивирования АЦС: 0 - контроль, 1 - 100 мг РЬ/ кг почвы, 2 - 500 мг РЬ/ кг почвы, 3 - 1000 мг РЬ/ кг почвы

С увеличением срока культивирования возрастание дозы металла не вызывает резких изменений рН, а только плавные незначительные сдвиги в менее щелочную или нейтральную стороны, что связано с большим вкладом в показатель рН биотических факторов. В целом, щелочная и слабощелочная реакция среды способствует увеличению суммарного отрицательного заряда почвы, что ведет к усилению процесса неспецифической адсорбции катионов ТМ в почвенном поглощающем комплексе, а также снижению конкуренции за адсорбционные места со стороны ионов водорода (Дабахов и др., 2005).

Растворенное органическое вещество. Содержания РОВ в жидкой фазе ВПК при внесении различных доз 4-х соединений металла представлены на рис. 7. Общей тенденцией практически для всех экспериментов является снижение количества РОВ по мере увеличения срока культивирования. Данная зависимость, вероятно, связана с развитием почвенной биоты в ВПК и потреблением углерода в качестве питательного субстрата. Кроме того, можно предположить, что существенный вклад в пул РОВ могут также вносить аллелопатические соединения, и снижение содержания растворенной органики связано со стабилизацией структуры АЦС и ослаблением конкурентного давления водорослей друг на друга после более продолжительного периода культивирования. При токсическом воздействии вероятно прямое влияние свинца на продуктивность почвенных водорослей. Так, минимальная концентрация РОВ была отмечена в 1 месячных культурах водорослей при воздействии ацетата свинца (рис. 7, а), что свидетельствует о преобладании процесса потребления органики над его продукцией. Данный факт согласуется с недостаточным развитием почвенных водорослей и активным ростом гетеротрофов, связанным с поступлением высоких концентраций углерода.

(а) (б)

Рис. 7. Содержание РОВ в жидкой фазе ВПК при воздействии различных форм свинца после 1 (а) и 2-х (б) месяцев культивирования АЦС: 0 - контроль, 1 - 100 мг РЬ/ кг почвы, 2 - 500 мг РЬ/ кг почвы, 3 - 1000 мг РЬ/ кг почвы

Во всех остальных опытах, где наблюдался бурный рост водорослей, содержание РОВ было на уровне контроля или незначительно ниже. Влияние дозы свинца на концентрацию РОВ заметно в случае с высокой концентрацией металла, однако зависимости между содержанием РОВ и формой соединения свинца не выявлено. Одномесячные культуры водорослей имели значимо более высокие уровни РОВ, что может быть связано не только с их аллелопатической функцией в бурно развивающемся АЦС, по и с выполнением органическими экзометаболитами роли хелаторов, связывающих доступный свинец и, таким образом, нейтрализующих его токсическое воздействие. Таким образом, основной вклад в содержание РОВ вносят факторы «время» и «соединение». Фактор «доза» является значимым только при добавлении малорастворимых соединений свинца и обуславливает различие в концентрации РОВ между 2-й и 3-й дозами. Однако, эти факторы и взаимодействия между ними объясняют менее 20% вариации данного показателя.

4.3. Комплексное влияние физико-химических характеристик водно-почвенной культуры на состояние АЦС

Актуальная токсичность свинца для почвенных водорослей и цианобактерий зависит не только от его валовой концентрации, но и от физико-химических условий реализации этой токсичности. Такие факторы, как тип почвы, рН, содержание органического вещества и др. влияют на распределение валового свинца между твердой фазой и почвенным раствором (Воробьева и др., 1983). Так, например, при одной и той же максимальной дозе ацетата и нитрата свинца при 1 месяце культивирования наблюдается выпадение из состава сообщества цианобактерий и желто-зеленых водорослей, доминирование зеленых водорослей, сужение спектра экобиоморф с преобладанием СЬ-формы, уменьшение содержания хлорофилла а, что связано с максимальными концентрациями свинца в жидкой фазе ВПК. Спустя 2 месяца валовая концентрация металла в ВПК не меняется, однако его

значительное уменьшение в жидкой фазе ВПК приводит к восстановительным процессам структурно-функционального состояния ЛЦС. Благоприятным фактором снижения токсичности свинца для АЦС являлись нейтральные и слабощелочные значения pH жидкой фазы. Известно, что в почвах с нейтральными значениями pH, подвижность, биодоступность и токсичность ТМ может быть сильно ограничена (Ram, Verloo, 1985; Pawlik-Skowroriska, 2002; Mbila, Thompson, 2004). В слегка щелочных почвах (pH 7—8) фракция потенциально доступного свинца составляет менее 1% от валовой концентрации металла (Ullrich et al., 1999). В свою очередь, кислотно-щелочное равновесие раствора будет зависеть как от формы соединения ТМ и его концентрации, которая максимальна при внесении растворимых солей металла, так и от природы и содержания РОВ, которое снижается с увеличением времени культивирования водорослей. Например, в 1 месячном опыте с ацетатом свинца была обнаружена значимая отрицательная связь между концентрацией металла в жидкой фазе и pH среды (г=-0.73, р<0.05). Это, вероятно, связано с разными скоростями процессов ионного обмена, ассоциации в растворе и взаимодействия с АЦС особенно проявляющимися в первый месяц взаимодействия, когда система еще далека от равновесия. Одновременно с процессом подкисления происходит снижение содержания РОВ по градиенту токсической нагрузки. Известно, что свинец активно взаимодействует с органическим веществом (Карпухин, 1998; Дабахов и др., 2005). Поэтому, уменьшение содержания РОВ в растворе приводит к уменьшению количества металлорганических комплексов в жидкой фазе ВПК, а, следовательно, увеличению его токсичности для почвенных цианобактерий и водорослей, что отражается в описанных выше изменениях структуры АЦС и концентрации хлорофилла а. В свою очередь, высокая токсичность металла снижает метаболическую активность и продуктивность почвенных водорослей. После 2-х месяцев культивирования наибольшая концентрация металла в растворе наблюдается в опыте с внесением максимальной дозы нитрата свинца. И только в этом опыте были особо заметны морфологические изменения клеток водорослей, такие как накоплении масла внутри клеток В. minor, Ch. cf. eremi и Ch. borziana, вакуолизация клеточного содержимого Chlamydomonas sp., а также лизис клеток, что связано не только с возрастными изменениями АЦС, но и с прямым токсическим действием металла.

Глава 5. Особенности изучения почвенных водорослей в экотокспкологическнх экспериментах

В главе обсуждается общая специфика изучения почвенных водорослей при воздействии ТМ с акцентом на полученные результаты.

Выбор метода культивирования АЦС. Выбор метода культивирования АЦС зависит от поставленной задачи и определяет качество и достоверность получаемых с его помощью данных. Общим и несомненным достоинством обоих испытанных нами методов культивирования водорослей является близость к естественным условиям среды за счет присутствия почвенного компонента, который одновременно является источником почвенных водорослей и других представителей почвенной биоты, обеспечивает их

питание и обуславливает естественные физико-химические свойства среды. Кроме того, сравнительно-флористический анализ видового списка АЦС серой лесной почвы, культивируемого с помощью метода ВПК, со списками других авторов (Алексахина, 1984; Кабиров, 2009) имел общие черты: преобладающей группой по числу видов являлись зеленые водоросли; цианобактерии и желто-зеленые водоросли присутствовали незначительно, диатомовые водоросли — единично. В целом, до 82% видов водорослей, культивируемых методом ВПК и определенных в данной работе, были встречены в других почвенно-альгологических сводках. Следовательно, ВПК позволяет инициировать развитие естественного АЦС, присущего конкретной почве. Наряду с этим отмечены концептуальные сложности изучения почвенных водорослей в экотоксикологических экспериментах, связанные с гетерогенностью почвенных условий и микрозоналыюстью распределения водорослей в почве, а также со сложностью разделения естественной динамики АЦС от антропогенно-инициированной .

Выбор тест-критерия оценки состояния АЦС. Одной из актуальных проблем в экотоксикологических исследованиях любого биообъекта является проблема выбора информативного и надежного критерия, адекватно отражающего состояние этого биообъекта и его окружения в целом. Так, при использовании ЧК со «стеклами обрастания», многовариационный дисперсионный анализ MANOVA не выявил взаимосвязи между таксономической структурой АЦС и присутствием свинца в разных дозах и формах, т.к. внутригрупповая вариабельность показателя была выше, чем межгрупповая. Возможно, снизить вариабельность данного показателя удастся, учитывая альгологические обрастания не только покровных стекол, но и всей поверхности почвы на чашке Петри. При культивировании АЦС методом ВПК показано, что такие показатели АЦС, как концентрация хлорофилла а и пигментные индексы, не зависели от присутствия свинца, в то время как таксономическая структура чувствительно реагирует на наличие свинца в системе, но не его содержание в жидкой фазе ВПК в диапазонах концентраций от 0.71 мкг/л до 185.19 мкг/л. Эти результаты хорошо согласуются с данными других авторов. Так, Терехова (2007) рекомендовала использовать видовое разнообразие микромицетов для оценки состояния почв, т.к. этот показатель отличался наименьшей вариабельностью по сравнению с общей численностью и видовым богатством. В работе Lazzaro с коллегами (2006) не было отмечено четкой зависимости между базальным дыханием и биодоступностью свинца: при увеличении подвижной фракции металла, а, следовательно, повышении токсичности, не во всех случаях наблюдалось уменьшение дыхания почвенного микробоценоза. Однако, на структуру бактериального сообщества внесение свинца имело четкое воздействие. Кроме того, ряд исследований (Guasch et al., 2002; García-Meza et al., 2005), подтверждает, что структурные изменения альгоценозов при воздействии ТМ являются более заметными, чем снижение фотосинтетической активности водорослей. Таким образом, при выпадении из состава сообщества некоторых чувствительных к ТМ видов водорослей, их экологические ниши занимают устойчивые виды, в то время как концентрация

хлорофилла может не изменяться при таких структурных перестройках АЦС. Однако, наиболее оптимально использовать ряд параметров, дающих надежную информацию о состоянии почвенных водорослей, и, следовательно, о степени загрязнения почвы.

Влияние формы ceumfa на почвенные водоросли. Важным вопросом при модельных исследованиях влияния ТМ на почвенные микроорганизмы является выбор его химической формы. В проведенном исследовании оценили влияние формы свинца на показатели АЦС при разных способах его культивирования. Как и следовало ожидать, токсичное влияние соединений свинца было в первую очередь связано с их растворимостью и, следовательно, биодоступностыо для водорослей. В ЧК ацетат свинца вызывал задержку массового размножения почвенных водорослей, связанную с развитием гетеротрофного компонента почвенной биоты вследствие внесения легкодоступного источника углерода. При водно-почвенном культивировании водорослей от формы металла зависело большинство исследованных физико-химических параметров, а также структурно-функциональные показатели АЦС. Положительный эффект растворимых солей свинца, по-видимому, связан с влиянием ацетат- и нитрат-анионов. Нитрат проявлял стимулирующий эффект на самых ранних стадиях развития АЦС, вероятно, использовавшего его в качестве питательного субстрата. В то же время, ацетат имел отложенный стимулирующий эффект, возможно, связанный с косвенным положительным воздействием на АЦС через бактериальный компонент почвенной системы.

Оценка устойчивости водорослей к стрессу: Chîorophyta vs. Cyanobacteria. Интересной биологической задачей является сравнение устойчивости различных таксонов водорослей к абиотическому и биотическому стрессу, связанная с их эволюционным происхождением и развитием адаптивных механизмов. В нашей работе при использовании обоих культуральных методов наиболее устойчивыми к воздействию свинца видами АЦС являлись зеленые водоросли Ch. vulgaris, В. minor, S. minor. Ch. cf. eremi, С. subglobosa и Chlamydomonas sp. Эти данные хорошо согласуются с другими альгологическими работами по ТМ отечественных (Кабиров, Шилова, 1994; Евдокимова и др., 1997; Кузяхметов, 1998) и зарубежных коллег (Takamura et al., 1989; Maxwell, 1991; Kalinowska, Pawlik-Skowroñska, 2008). В целом, устойчивость водорослей к свинцу может быть связана с наличием подвижных стадий в жизненном цикле (В. minor, S.minor, Ch. cf. eremi), значительной слизи (С subglobosa, Chlamydomonas sp.). Устойчивость Ch. vulgaris к ТМ объясняется высоким содержанием ФХ (Kaplan et al., 1995), металлотионеин-подобных белков (Huanga et al., 2009) и антиоксидантов, таких как а-токоферол, аскорбиновая кислота, каротиноиды, хлорофилл (Miranda et al., 2001; Lemoine, Schoefs, 2010; Kumar et al., 2011) и глутатион (Fahey et al., 1987). Высокие концентрации этих биомолекул эффективно защищают органеллы и клеточный метаболизм от ионов ТМ. Кроме того, клеточная стенка этой водоросли содержит спорополлеин - биополимер, чрезвычайно устойчивый к химическому и биологическому воздействию (Gunnison, Alexander, 1975; Geisert et al., 1987; Gross, 2000; Agrawal, Singh, 2001; Agrawal, Manisha, 2007;

Ueno, 2009). Необходимо отметить, что зеленые водоросли успешно растут в кислых условиях среды, которые всегда содержат высокие концентрации металлов вследствие увеличения их растворимости (Campbell, Stokes, 1985) и/или снижения взаимодействия с органическим веществом (Guy, Chakrabarti, 1976). Как показали детальные исследования ацидофильные и ацидотолерантные водоросли устойчивы к воздействию TM (Albertano et al. 1980а,b,с; Albertano, Taddei, 1980), что связано развитием общих механизмов изменения активности АТФ-азы, мембранного потенциала и проницаемости мембран. В целом, эукариотная организация водорослей за счет строения клеточной мембраны и пространственного разделения клетки на компартменты, позволяющего более эффективно регулировать биохимические процессы (Seckbach, Oren, 2007), является более устойчивой к избытку как протонов водорода, так и ионов ТМ, чем прокариотная организация цианобактерий с диффузным расположением внутриклеточных органелл.

В заключение главы сформулирован ряд практических рекомендаций:

1. Для более раннего запуска механизмов «цветения» почвы при лабораторном культивировании водорослей следует отбирать почвенные образцы в периоды массового размножения водорослей (как правило, май и сентябрь).

2. Независимо от выбора способа культивирования почвенных водорослей необходимо дальнейшее усовершенствование методики устранения гетерогенности почвы, приводящей к качественному и количественному неравенству пула водорослей в пробах.

3. При чашечном методе культивирования водорослей необходим сбор и учет альгологических образцов со всей поверхности почвы на чашке Петри, а не только «стекол обрастания».

4. Требуются изменения методики экстракции пигментов водорослей из почвы: разработка и введение отсутствующих поправочных коэффициентов на экстрагируемую неспецифическую почвенную органику и, возможно, применение других органических экстрагентов для пигментов, что могло бы существенно повысить качество и надежность анализа.

5. Необходимо закладывать экотоксикологические эксперименты в один сезон, так как почвенное АЦС даже в хорошо контролируемых лабораторных условиях сохраняет собственную естественную эндогенную ритмику развития.

6. При исследовании влияния ТМ на почвенные водоросли следует учитывать химическую форму соединения, потому что тип сопутствующего аниона может прямо или косвенно влиять на биологические характеристики исследуемого объекта

Выводы

1. Установлена количественная зависимость влияния химической формы свинца на АЦС серой лесной почвы. Растворимые соли свинца (ацетат и нитрат) оказывают больший токсический эффект на 1-месячное АЦС по сравнению с малорастворимыми сульфатом и оксидом свинца: из состава сообщества исчезают желто-зеленые водоросли, доля цианобактерий

снижается, а доля зеленых водорослей увеличивается, преобладает Ch-ЖФ почвенных водорослей.

2. Под влиянием нитрата свинца развивается АЦС с низким индексом видового разнообразия, но высоким уровнем хлорофилла а, что свидетельствует о токсичности соли для остальных видов водорослей сообщества и стимуляции роста устойчивых видов доступным азотом. Выявлен «замедленный» стимулирующий эффект ацетата свинца на АЦС, вероятно, опосредованный через гетеротрофный компонент почвенного микробоценоза.

3. При использовании обоих культуральных методов наиболее устойчивыми к воздействию соединений свинца видами АЦС серой лесной почвы являются зеленые водоросли Chlorella vulgaris, Bracteacoccus minor, Spongiochloris minor, Chlorosarcinopsis cf. eremi, Coccomyxa subglobosa и Chlamydomonas sp.

4. Таксономическая структура АЦС, выращенного методом ВПК, реагирует на наличие свинца в системе, но не на степень токсической нагрузки в диапазонах концентраций металла от 0.71 мкг/л до 185.19 мкг/л жидкой фазы. Не обнаружено статистически значимой зависимости между содержанием свинца в растворе и пигментными характеристиками, т.к. при выпадении из состава сообщества некоторых чувствительных к свинцу видов водорослей, их экологические ниши занимают устойчивые виды, как правило, без изменений концентрации хлорофилла.

5. Сезон постановки эксперимента влияет на пигментные характеристики и таксономическую структуру АЦС, но не физико-химические свойства жидкой фазы ВПК (валовая концентрация свинца, pH, содержание РОВ). В «зимний сезон» наблюдается заторможенное развитие АЦС вследствие более продолжительного лаг-периода роста водорослей, что приводит к различиям в характеристиках АЦС при 1 месяце культивирования. С увеличением срока культивирования до 2-х месяцев сезонная зависимость, обусловленная собственной естественной эндогенной ритмикой развития АЦС, исчезает.

6. Впервые примененный в экотоксикологических экспериментах метод водно-почвенного культивирования АЦС обладает следующими преимуществами по сравнению с методом чашечных культур со «стеклами обрастания»: дает более полную информацию о таксономическом составе АЦС почвы, равномерно распределяет токсикант в системе, обеспечивает биомассу почвенных водорослей, достаточную для проведения качественных и количественных анализов.

7. Ни один из альгологических показателей в отдельности не позволяет оценить степень загрязнения почвы свинцом, что свидетельствует о высокой лабильности почвенных водорослей, большой буферной емкости серой лесной почвы и требует комплексного изучения состояния АЦС на различных уровнях его организации: молекулярно-клеточном, организменном и ценотическом.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Темралеева А.Д., Пинский Д.Л. Адаптация почвенных цианобактерий и водорослей к воздействию свинца в лабораторных условиях // Теоретическая и прикладная экология. 2010. №3. С. 42-46.

2. Темралеева А.Д., Пинский ДЛ., Патова Е.Н., Спирина Е.В. Использование альго-цианобактериальных сообществ для оценки уровней загрязнения свипцом серой лесной почвы // Почвоведение. 2011. № 3, С.358-364.

В коллективных монографиях:

1. Темралеева А.Д., Пинский Д.Л. Содержание суммарного хлорофилла в альго-цианобактериальных сообществах при модельном загрязнении свинцом / «Водоросли: проблемы таксономии, экологии и использование в мониторинге». -Наука, Екатеринбург, 2011.

2. Anna Temraleeva, David Pinsky, Elena Patova Response of soil algae to lead effect: model experiments with "soil-water" cultures 2012. Progress on Heavy Metals in the Environment. Maralte. P. 359-368.

В прочих изданиях:

1. Anna D. Temraleeva and David L. Pinsky Use of Algae/Cyanobacterial Communities in Assessment of Lead Contamination of Grey Forest Soil // 18th Symposium of the International Association for Cyanophyte Research. Book of abstracts. Ceske Budejovice, Czech Republic, 2010. - P. 37.

2. Anna D. Temraleeva, David L. Pinsky, Elena N. Patova, Tatiana V. Pampura Lead effect on nitrogen fixing species of soil cyanobacteria // 9th European Nitrogen Fixation Conference. Abstract book. Geneva, Switzerland, 2010. - P.77.

3. Темралеева А.Д. Влияние соединений свинца на альгофлору серой лесной почвы: эффект аниона // Актуальные аспекты современной микробиологии: VII Молодежная школа-конференция с международным участием. Москва, 24 - 26 октября 2011 г.: Тезисы. - М.: МАКС Пресс, 2011. -С. 89-91.

4. Темралеева А.Д., Пинский Д.Л. Оценка воздействия соединений свинца на сообщества водорослей серой лесной почвы: многоуровневый подход // Актуальные проблемы современной альгологии: IV Международная конференция. Тезисы докладов. 2012. С. 294-296.

5. Темралеева А. Д., Пинский Д. Л. Оценка состояния альго-цианобактериального сообщества при загрязнении почвы свинцом: выбор критерия // Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред: Международная конференцияю Тезисы докладов. 2013. М.: Бином. Лаборатория знаний, С. 209.

Всего 20 публикаций в сборниках тезисов и материалах российских и международных конференций.

Подписано в печать:

16.10.2013

Заказ № 8850 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Темралеева, Анна Дисенгалиевна, Пущино

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ ПОЧВОВЕДЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201364059

Темралеева Анна Дисенгалиевна

ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИЙ СВИНЦА НА АЛЬГО-ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНОЕ СООБЩЕСТВО СЕРОЙ ЛЕСНОЙ ПОЧВЫ

03.02.03. — микробиология 03.02.08.-экология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., профессор Пинский Д.Л.

Пущино-2013

Введение

5

Глава 1. Почвенные водоросли (обзор литературы) 10

1.1. Использование водорослей для биологического контроля 13 загрязненных сред

1.2. Влияние тяжелых металлов на водоросли 16

1.3. Внеклеточные и внутриклеточные механизмы устойчивости 17 водорослей к действию тяжелых металлов

Глава 2. Материалы и методы исследований 29

2.1. Пробоотбор и подготовка почвы для анализа 29

2.2. Метод чашечных культур со «стеклами обрастания» 29

2.3. Метод водно-почвенных культур 30

2.4. Методики изучения почвенных водорослей 32

2.5. Методики проведения физико-химического анализа 34

2.6. Статистический анализ данных 35

Глава 3. Оценка влияния свинца на почвенные водоросли: метод 36 чашечных культур со «стеклами обрастания»

3.1. Таксономическая структура и обилие водорослей 36

3.2. Спектр жизненных форм водорослей 47

Глава 4. Оценка влияния свинца на почвенные водоросли: метод 56 водно-почвенных культур

4.1. Влияние свинца на состояние АЦС 56

4.1.1. Таксономическая структура и обилие водорослей 56

4.1.2. Спектр жизненных форм водорослей 69

4.1.3. Морфологические изменения водорослей 73

4.1.4. Пигментный анализ 76

4.2. Влияние соединений свинца на свойства жидкой фазы 85

водно-почвенной культуры

4.2.1. Свинец 85

4.2.2. рН 88

4.2.3. Растворенное органическое вещество 90 4.3. Комплексное влияние физико-химических характеристик 93

водно-почвенной культуры на состояние АЦС

Глава 5. Особенности изучения почвенных водорослей в 96 экотоксикологических экспериментах

5.1. Выбор метода культивирования АЦС 96

5.2. Выбор тест-критерия оценки состояния АЦС 99

5.3. Влияние формы свинца на почвенные водоросли 101

5.4. Оценка устойчивости водорослей к стрессу: Chlorophyta vs. 104 Cyanobacteria

5.5. Рекомендации по использованию почвенных водорослей в 109 экотоксикологических экспериментах

Выводы 111

Список литературы 113

Приложения 142

Список сокращений

АЦС - альго-цианобактериальное сообщество

ВПК - водно-почвенная культура

ЖФ - жизненная форма

МТ - металлотионеины

ОС - окружающая среда

ТМ - тяжелые металлы

ФХ - фитохелатины

ЧК - чашечная культура

Введение

Актуальность исследования. Осуществление профилактических и защитных мероприятий по охране окружающей среды (ОС) и здоровья населения приобрело в наше время характер актуальнейших задач государственного масштаба (ФЦП РФ: «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009 - 2013 годы)», «Снижение рисков и смягчение последствий чрезвычайных ситуаций природного и техногенного характера в Российской Федерации до 2015 года»; Указ Президента РФ «Основы экологической политики Российской Федерации на период до 2030 года»). Однако, современная система контроля за состоянием ОС, основанная на нормативах предельно допустимых концентраций загрязняющих веществ, не позволяет охватить всего их многообразия, учесть сочетанный эффект действия загрязнителей и, как следствие, не может дать актуальную оценку состояния живых организмов и экосистем в целом, а также прогнозировать их структурно-функциональные изменения. В связи с этим в настоящее время возрастает интерес к методам биодиагностики состояния сред, среди которых особое место занимает почва - главный биогеохимический барьер на пути миграции загрязнителей в сопредельные среды. Тем не менее, разработка экологических нормативов применительно к почвам значительно отстает от создания таковых для других сред (атмосфера, водные системы), что связано со сложностью и неоднородностью почвы как объекта. Для диагностики загрязненных почв используется широкий ряд организмов: зеленые водоросли, дафнии, инфузории, высшие растения и др. Однако, подавляющее большинство этих тест-организмов представляют собой типичных гидробионтов, не характерных для почв. Перспективность использования микроорганизмов для биодиагностики загрязненных почв показана в ряде исследовательских работ (Звягинцев и др., 1989; Гузев, Левин, 1991; Кабиров и др., 1997; Список ..., 1998; Полянская, Звягинцев, 2005; Терехова, 2007; Домрачева и др., 2008). Почвенные водоросли sensu lato

составляют неотъемлемую часть эдафона, имеют многочисленные трофические и топические связи, участвуют в почвообразовательном процессе, обладают специфической чувствительностью к различным видам антропогенного воздействия и быстрой ответной реакцией на изменение экологической ситуации, хорошо растут в лабораторных условиях и удобны в работе (Мейт§, 1981; .ГоЬашеп, 8ЬиЬег1 2001; Ьике§оуа 2001; Кабиров, 2007). В связи с этим, почвенные водоросли как объекты биодиагностики представляют значительный научный и практический интерес. Однако важно изучать не выборочные реакции отдельных представителей почвенной альгофлоры на загрязнение, а комплекс показателей на разных уровнях организации альго-цианобактериального сообщества (АЦС).

Кроме того, в приоритетном списке загрязнителей почвы одно из первых мест занимает свинец, вследствие широкого использования, высокой токсичности и способности к аккумуляции в цепях питания живых организмов. В отличие от органических загрязнителей, тяжелые металлы (ТМ), в том числе и свинец, не разрушаются и способны только перераспределяться между компонентами природной среды (Черных и др., 2001), таким образом, разработка научных основ биодиагностики загрязненной ТМ почвы на основе реакции АЦС является актуальной научной задачей.

Цель исследования - оценка влияния различных соединений свинца на состояние альго-цианобактериального сообщества серой лесной почвы в модельных экспериментах.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить воздействие различных соединений свинца на почвенные водоросли по изменению структурно-функциональных показателей на различных уровнях организации АЦС: молекулярно-клеточном, организменном и ценотическом.

2. Выявить устойчивые к загрязнению виды почвенных водорослей.

3. Определить наиболее диагностически значимые показатели состояния

АЦС.

4. Оценить прямое и косвенное влияние химической формы свинца на реакцию АЦС.

5. Разработать систему оценки влияния соединений свинца на АЦС на основе метода водно-почвенного культивирования водорослей, обосновать преимущества использования данного метода в экотоксикологических экспериментах, сравнив его с методом чашечных культур со «стеклами обрастания».

Научная новизна. Впервые использовали метод водно-почвенных культур в экотоксикологических экспериментах для изучения влияния соединений свинца на состояние почвенного АЦС. Разработана, обоснована и апробирована методика, позволяющая в близких к естественным почвенным условиям получить достаточную биомассу водорослей для определения реакции АЦС на молекулярно-клеточном, организменном и ценотическом уровнях. Впервые изучено влияние разных химических форм свинца и физико-химических свойств культуральной среды на таксономическую структуру и функциональное состояние АЦС серой лесной почвы.

Практическая значимость работы. Полученные результаты о влиянии соединений свинца на структурно-функциональные показатели АЦС серой лесной почвы могут быть использованы как научная основа для разработки методик альгодиагностики по оценке состояния почв. По итогам работы даны практические рекомендации по использованию АЦС в экотоксикологических экспериментах: по срокам пробоотбора почвы, по учету влияния химической формы металла, о необходимом уровне точности при таксономическом определении почвенных водорослей, по пробоподготовке почвенно-альгологических проб, а также по модификации метода чашечных культур со «стеклами обрастания». Полученные данные могут быть использованы в учебных курсах по экотоксикологии, экологии микроорганизмов и почвенной альгологии.

Публикации по теме диссертации. По теме диссертации опубликовано 24 работы, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, входящих в

перечень ВАК, 2 статьи в коллективных монографиях и 20 публикаций в сборниках тезисов и материалах российских и международных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав и выводов, изложена на 141 странице текста и 28 страницах приложений, сопровождается 33 иллюстрациями и 23 таблицами. Список литературы включает 306 наименований, из них 230 - на иностранном языке.

Благодарности. Автор выражает сердечную благодарность своему научному руководителю, заведующему лабораторией физико-химии почв ИФХиБПП РАН, проф., д.б.н. Давиду Лазаревичу Пинскому за помощь в планировании эксперимента, обсуждении материала и всестороннюю поддержку при написании работы. Огромную признательность хотелось бы высказать заведующей Отделом флоры и растительности Севера к.б.н., доценту Е.Н. Патовой (Институт биологии Коми НЦ УрО РАН) за помощь при проведении исследований и консультации при определении видов почвенных водорослей. Данная работа была бы невозможна без неоценимой помощи в микробиологической практике с.н.с. лаборатории криологии почв Е.В. Спириной (Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН), без детальных советов по статистической обработке данных к.б.н. В.Э. Смирнова (Институт математических проблем биологии РАН), а также без практических рекомендаций сотрудников лаборатории реликтовых микробных сообществ д.б.н. Л.М. Герасименко и к.б.н. В.К. Орлеанского (Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН). Огромное спасибо к.б.н. И.В. Новаковской (Институт биологии Коми НЦ УрО РАН) за помощь в определении сложных в таксономическом отношении видов зеленых водорослей. Особое влияние на научные взгляды и квалификацию автора оказал углубленный курс подготовки по определению почвенных и аэрофитных желто-зеленых, эустигмафитовых и зеленых микроводорослей под руководством проф., д.б.н. Игоря Юрьевича Костикова (Киевский национальный университет им. Тараса Шевченко) и Determination Course of Freshwater and Terrestrial Cyanobacteria под руководством профессора Jin

Кошагек (Южночешский университет, ЛИосеэка итуегека). Автор благодарит также сотрудников Центра коллективного пользования научным оборудованием Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН и Института фундаментальных проблем биологии за проведение аналитических работ, сотрудников лаборатории физико-химии почв - за обсуждение эксперимента и поддержку. Особые теплые слова благодарности хочу сказать своей семье за терпение и понимание.

Глава 1. Почвенные водоросли (обзор литературы)

Водоросли sensu lato представлены эукариотическими водорослями и цианобактериями и являются гетерогенной экологической группой фототрофных одноклеточных, колониальных или многоклеточных организмов. В систематическом отношении прокариотические водоросли (цианобактерии) рассматриваются как организмы «двойной принадлежности» и могут описываться по правилам Международного кодекса номенклатуры бактерий или Ботанического кодекса (цит. по: Ефимова, Ефимов, 2007). Под термином «почвенные водоросли» обычно понимают совокупность нескольких экологических группировок водорослей, включающую наземные водоросли, которые лишь при благоприятных условиях разрастаются в массовых количествах на поверхности почвы, водно-наземные, разрастающиеся на поверхности постоянно влажной почвы, и собственно почвенные водоросли, населяющие толщу почвенного слоя (Зенова, Штина, 1990).

Показано, что почвенные водоросли нельзя рассматривать как некий остаток водных группировок или случайно попавшие в почву гидрофильные водоросли. В почве сформировалась специфическая альгофлора, систематический состав которой более ограничен по сравнению с альгофлорой водоемов. Многие таксоны, включая отделы водорослей, не встречаются в почвах. Но и большое число видов зеленых и желто-зеленых водорослей обнаружены только в почвах, например, Chlorococcum humicola (Nag.) Rab., Bumilleria sicula Borzi, Protosiphon botryoides (Kützing) Klebs, ряд видов родов Botrydium Wallroth, Botridiopsis Borzi, Microcoleus Desmaz и др. Одной из ярких флористических особенностей почвенных сообществ водорослей является высокое видовое разнообразие желто-зеленых, на долю которых приходится в среднем 12 %, а в лесных почвах — до 24 % общего числа видов, в то время как в водоемах желто-зеленые водоросли составляют обычно 1-3 % общего числа видов (цит. по: Водоросли, 1989).

Почва как биотоп имеет некоторые особенности местообитания, к которым у водорослей сформировались морфологические и физиологические приспособления.

Непрозрачность почвы оказывает решающее воздействие на развитие водорослей. Интенсивное развитие водорослей как фототрофных организмов возможно только в пределах проникновения света. В целинных почвах это поверхностный слой почвы толщиной до 1 см, в обрабатываемых почвах он немного толще (Штина, Голлербах, 1976). С глубиной резко падает как численность, так и видовое разнообразие водорослей. По-видимому, в более глубокие горизонты водоросли заносятся с поверхности путем вмывания, а также почвенными животными и корнями растений. Однако в толще почвы, куда не проникает свет, жизнеспособные водоросли обнаруживаются на глубине до 2 м в целинных почвах и до 2,7 м в пахотных. Это объясняется способностью некоторых водорослей переходить в темноте к гетеротрофному питанию. Правда, их гетеротрофный рост в темноте идет значительно медленнее, чем автотрофный рост на свету. Многие водоросли, несмотря на способность к усвоению органических веществ, нуждаются в свете и в почве сохраняются лишь в покоящемся состоянии. Поэтому в глубоких слоях почвы обнаруживается сравнительно небольшое число видов, преимущественно одноклеточные зеленые и желто-зеленые водоросли.

Низкая влажность почвы приводит к формированию комплекса морфологических и физиологических приспособлений для поглощения, удержания воды и сохранения жизнеспособности почвенных водорослей при засухе:

1. Важную роль в засухоустойчивости почвенных водорослей играет способность к обильному образованию слизи - слизистых колоний, чехлов и обверток, состоящих из гидрофильных коллоидных полисахаридов, а также к ослизнению клеточных оболочек. Благодаря наличию слизи, водоросли способны быстро поглощать и удерживать большие количества воды, которые во много раз превышают их сухую массу (Штина, Голлербах, 1976).

2. Малые размеры почвенных водорослей обеспечивают более легкое перемещение в почве и распространение с пылью, большую водоудерживающую способность и засухоустойчивость. Например, в дерново-подзолистой почве (Зенова, Штина, 1990) клетки с диаметром менее 10 мкм составляют около 60% от общего количества клеток.

3. У многих почвенных водорослей отсутствуют зооспоры, жгутиковые формы обладают слабой подвижностью. Период увлажнения после засухи приводит к быстрому образованию гамет и зооспор, например у зеленых, которые обладают фототаксисом и распространяются на поверхности почвы (Зенова, Штина, 1990).

4. «Эфемерность» вегетации - способность почвенных водорослей быстро переходить из состояния покоя к активной вегетации и, наоборот, без образования особых стойких спор и специфических стадий. Так, например, корочки водорослей на почве, высыхающие в сухие периоды, начинают расти уже через несколько часов после увлажнения (Штина, Голлербах, 1976).

5. Протопласт некоторых почвенных водорослей обладает физиолого-биохимическими особенностями: вязкость протоплазмы и устойчивость против плазмолиза; высокая концентрация клеточного сока и относительно высокое содержание связанной воды в клетке; отсутствие крупных вакуолей и большая сосущая сила, позволяющая использовать даже гигроскопическую влагу воздуха; накопление масла. В целом, эти особенности обеспечивают высокую засухоустойчивость даже видам, не имеющим чехлов (Зенова, Штина, 1990).

5. Снижение интенсивности дыхания в клетке по мере ее обезвоживания. При этом дыхание сохраняет свою энергетическую полноценность, что видно по количеству органического кислоторастворимого фосфора, который не разрушается при высыхании у пойкилоксерофитов (Зенова, Штина, 1990).

Чтобы защититься от сильной инсоляции, во многих случаях у водорослей, обитающих на поверхности почвы, имеются темные слизистые чехлы вокруг клеток.

Кроме того, особое значение в жизнедеятельности водорослей в почве как в среде с микрозональным строением, где питательные вещества распределены гетерог�