Влияние регуляторных факторов на морфологические, иммунофенотипические, функциональные особенности и дифференцировку стромальных клеток-предшественников и иммунокомпетентных клеток

Лебединская, Ольга Витальевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние регуляторных факторов на морфологические, иммунофенотипические, функциональные особенности и дифференцировку стромальных клеток-предшественников и иммунокомпетентных клеток
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние регуляторных факторов на морфологические, иммунофенотипические, функциональные особенности и дифференцировку стромальных клеток-предшественников и иммунокомпетентных клеток"

На правах рукописи

ЛЕБЕДИНСКАЯ Ольга Витальевна

ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ ФАКТОРОВ НА МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ, ИММУНОФЕНОТИПИЧЕСКИЕ. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ И ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК

03.00.25 — гистология, цитология, клеточная биология 14.00.36 — аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург 2006

003067730

Работа выполнена на кафедре гистологии, эмбриологии и цитологии ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия имени ак. Е.А. Вагнера» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ (Пермь), в лаборатории регуляции иммунитета ГУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН» (Москва) и в лаборатории клеточного иммунитета ГУ «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина РАМН» (Москва

Научные консультанты:

академик РАН и РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Черешнев Валерий Александрович доктор медицинских наук, профессор Киселевский Михаил Валентинович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Быков Владимир Лазаревич; доктор медицинских наук, профессор Верин Владимир Константинович; доктор медицинских наук, профессор Калюжин Олег Витальевич

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Московская государственная медицинская академия имени И.М. Сеченова» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ

Защита состоится «-^ » ЛгУ^-сь/чЛ 2007 г. в_час. на заседании диссертационного совета Д 208.087.01 п£и ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ (194100 Санкт-Петербург, ул. Литовская, 2, тел.: 542-95-92)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ по адресу: 194100, Санкт-Петербург, Кантемировская ул., 16

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Карелина Наталья Рафаиловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Исследование и использование в клинической практике стволовых клеток (СК) являются одними из самых актуальных вопросов современной биологии и медицины. Интерес к СК обусловлен, с одной стороны, возможностями изучения на этой модели механизмов, лежащих в основе диф-ференцировки клеток, и участия в этих процессах специфических факторов, определяющих тип дифференцировки in vivo и in vitro. С другой стороны, актуальность данной проблемы связана с возможностью применения СК для генной и клеточной терапии [Dinsmore J., Ratliff J., Jacoby D. et al., 1998; Schuldiner V., Yanuka O., Iscovitz-Eldor J. et al., 2000]. Наиболее перспективной областью применения СК следует считать, по-видимому, заместительную биотерапию [Uzan G, 2004]. Причем успехи клинического применения СК, а также возможности появления новых направлений в этой области напрямую зависят от результатов фундаментальных исследований, направленных на изучение стволовых клеток.

Существенный интерес для клинического применения представляют стромальные клетки-предшественники костного мозга [Orlic D., Kajstura J., Chimenti S. et al., 2001; Bailas C.B., Zielske S.P., Gerson S.L., 2002]. Стромальные клетки-предшественники костного мозга были открыты А.Я. Фриденштейном [Friedenstein A., Chailakhjan R., Lalykina К., 1970] около 30 лет назад. Оказалось, что при эксплантации диссоциированных костномозговых клеток в ограниченном количестве in vitro в присутствии эмбриональной телячьей сыворотки в культурах развиваются колонии адгезивных фибробластоподобных клеток. Каждая колония является клоном, то есть образуется путем пролиферации одной клетки. Эти клетки были названы колониеобразующими клетками фибробластов — КОК-ф, или стромальными клетками-предшественниками [Friedenstein А., Chailakhjan R., Lalykina К., 1970; 1976]. Далее было выявлено, что популяция стромальных клеток-предшественников неоднородна по своим дифференцировочным потенциям: некоторые из них являются мультипо-тентными предшественниками, тогда как остальные имеют более ограниченный потенциал, будучи коммитированы к определённой дифференци-ровке [Friedenstein А., 1973]. Это позволило сформулировать концепцию, в соответствии с которой популяция стромальных клеток-предшественников включает в себя наиболее «ранних» представителей — мультипотентные мезенхимальные предшественники, или стромальные стволовые клетки [Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А., 1980]. В настоящее время данные клетки называют также мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), и получены моноклональные антитела SH2, SH3 и SH4, комбинация которых позволяет выделить МСК [Pittner et al., 1999].

Мезенхимальные стволовые клетки могут быть широко использованы в репаративной биотерапии в силу своего значительного пролиферативно-го и дифференцировочного потенциала. Численность их увеличивается in vitro в 100000 раз в течение 6-8 недель, при этом они остаются в недифференцированном состоянии [Pituch-Noworolska A., Majka M., Ja-nowska-Wieczorek A. et al., 2003]. Таким образом, МСК, как часть популяции стромальных клеток-предшественников, обладают всеми признаками CK: они способны к интенсивной пролиферации, могут дифференцироваться во многие клеточные типы, трансплантабельны in vivo [Vassilopou-los G., Wang P., Rüssel D„ 2003].

Стромальные клетки-предшественники содержатся не только в костном мозге, но и в других кроветворных и лимфоидных органах — селезёнке, тимусе, лимфатических узлах. Большинство клоногенных клеток, находящихся в данных органах, серозных жидкостях и крови, и в некотором количестве — в костном мозге, относятся к популяции индуцибель-ных остеогенных клеток-предшественников (ИОКП), которые требуют для реализации своих остеогенных потенций присутствия специфических индукторов остеогенеза — переходного эпителия мочевого пузыря или декальцинированного костного матрикса [Friedenstein А., 1973]. Данная категория клеток способна к миграции, а сформированная ими костная ткань не является самоподдерживающейся. Напротив, другая группа стромальных предшественников — детерминированные остеогенные клетки-предшественники (ДОКП), способные спонтанно реализовывать остеогенные свойства, не мигрируют и содержатся, в основном, в костном мозге, представляя собой местную популяцию клеток.

Несмотря на значительный интерес, который в последние годы исследователи проявляют к стромальным клеткам-предшественникам, многие сведения, касающиеся КОК-ф противоречивы, а часть вопросов остаются не изученными. Например, не исследованы возрастные изменения количества и эффективности клонирования стромальных клеток-предшественников. Недостаточно изучены иммунофенотип, морфогисто-химические особенности КОК-ф и их культуральных потомков, характеристика формируемых ими колоний, влияние условий культивирования и ряда ростовых факторов на их дифференцировку и клоногенность. Между тем поскольку трансплантация размноженных в монослойных структурах стромальных клеток как способ лечения целого ряда заболеваний находит всё большее применение [Чайлахян Р.К. и др., 1998, Herzog E.L. et al., 2003, Lucarelli E. et al., 2003] разработка оптимальных способов их культивирования приобретает особую актуальность.

Ограничены знания о действии введённых in vivo и in vitro бактериальных антигенов и некоторых иммуномодулирующих препаратов на клоногенные и остеогенные свойства КОК-ф. Например, не известно, ка-

кое воздействие на стромальные клетки-предшественники может оказывать человеческий а-фетопротеин, хотя имеются сведения о его стимулирующем влиянии на эмбриональные фибробласты [Черешнев В.А. и др.,

2004]. Практически не исследованы индуцибельные остеогенные клетки-предшественники, выявляющиеся в кровеносном русле и серозных полостях, дискутируются вопросы о возможности циркуляции стромальных клеток предшественников и т.д.

Одной из основных функций стромальных клеток является обеспечение специфического микроокружения для пролиферации и дифференци-ровки гемопоэтических и иммунокомпетентных клеток. Они продуцируют целый ряд необходимых для этого ростовых факторов и цитокинов: интерлейкины — 6, 7, 8, 11, 12, 14, колониестимулирующие факторы, LIF, лиганд Flt-3, SCF и ряд других [Haynesworth S., Baber М., Caplan А., 1996; Bailas С., Zeilske S., Gerson S., 2002, Kim B.D.Y., Yoo K.H., Choi K.S. et al.,

2005]. В свою очередь иммунокомпетентные клетки также вырабатывают ряд стимулирующих и ингибирующих факторов, которые оказывают воздействие на стромальные клетки-предшественники. Таким образом, возможна обоюдная «корректировка» нарушений как микроокружения, так и гемопоэтических и иммунокомпетентных клеток.

В связи с этим другой важнейшей проблемой является исследование возможностей дифференцировки ex vivo иммунокомпетентных клеток (активированных мононуклеарных лейкоцитов, антигенпрезентирующих дендритных клеток, натуральных киллеров и натуральных киллеров-Т-клеток) под влиянием регуляторных факторов, вырабатываемых стро-мальными клетками микроокружения. Именно данные группы генерированных экстракорпорально клеток находят всё большее применение в биотерапии злокачественных новообразований и инфекционных заболеваний, некоторые из них используются для создания противоопухолевых и противоинфекционных вакцин.

Митогенные факторы (лектины) и цитокины (интерлейкины) при инкубации со зрелыми лимфоцитами крови вызывают реакцию бласттранс-формации. В процессе её в популяции лимфоцитов появляются незрелые лимфоидные элементы типа иммунобластов и пролимфоцитов, которые относят к категории активированных лимфоидных клеток. Исследование иммунофенотипа их также свидетельствует об уменьшении количества лимфоцитов, экспрессирующих маркеры зрелых клеточных форм (CD3, CD4, CD8). Подобное явление можно рассматривать как этап дифференцировки зрелых лимфоцитов. Интересен поиск иммуномодулирующих агентов, в том числе и не цитокиновой природы, способных вызвать подобный митогенный эффект. Примером транедифференцировки гемопоэтических клеток может служить генерация дендритных клеток (ДК). При воздействии ростовых факторов ДК могут быть получены как из клеток

миелоидного, так и лимфоидного рядов. Однако группа изученных источников генерации и индукторов созревания ДК весьма ограниченна.

Вышеизложенное свидетельствует о наличии множества нерешённых вопросов, касающихся стромальных клеток-предшественников и иммуно-компетентных клеток. Часть из них может быть решена в комплексном исследовании данных клеток в процессе их культурального роста под действием разнообразных регуляторных факторов.

Цель исследования — изучение морфологических, иммунофеноти-пических и функциональных свойств стромальных клеток-предшественников и иммунокомпетентных клеток, подвергнутых воздействию факторов бактериальной и эукариотической природы, а также видовых, возрастных и культуральных особенностей их дифференцировки ex vivo и возможностей её регуляции.

Основные задачи исследования:

1. Исследовать клоногенные свойства, морфогистохимические и им-мунофенотипические особенности стромальных клеток-предшественников костного мозга и выделенных из крови и серозных жидкостей (плеврального, перикардиального и перитонеального транссудатов) КОК-ф лабораторных животных при различных условиях культивирования in vitro.

2. Определить возрастные изменения количества и клоногенных возможностей стромальных клеток-предшественников костного мозга, тимуса, селезёнки и биологических жидкостей, морфологии формируемых ими колоний у различных лабораторных животных.

3. Изучить возможности модуляции дифференцировки, клоногенных и остеогенных свойств стромальных клеток-предшественников с использованием бактериальных антигенов и препарата профеталь, включающего в качестве основного компонента человеческий а-фетопротеин.

4. Провести сравнительный анализ морфологических и функциональных особенностей детерминированных стромальных клеток-предшественников костного мозга и индуцибельных клоногенных клеток, находящихся в перитонеальном транссудате и экссудате крыс.

5. Исследовать действие препарата профеталь и дать сравнительную характеристику морфогистохимических, электронно-микроскопических, функциональных особенностей и направления дифференцировки моно-нуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, активированных in vitro профеталем, интерлейкином-2 и фитогемагглютинином.

6. Охарактеризовать иммунофенотип, функциональную активность, морфологические и иммуноцитохимические особенности натуральных киллеров, выделенных из поражённой опухолевым процессом печени лабораторных животных, печени, плеврального и перитонеального экссуда-

тов онкологических больных, и дифференцированных из них натуральных киллеров Т-клеток и лимфокин-активированных киллеров.

7. Оценить возможности экстракорпоральной генерации зрелых ан-тигенпрезентирующих дендритных клеток с применением индукторов созревания различной природы (препарата профеталь, бактериальных ли-пополисахаридных комплексов). Показать в сравнительном аспекте им-мунофенотипические и морфофункциональные особенности полученных клеток.

8. Изучить возможности получения опухолеспецифических цитоток-сических лимфоцитов при инкубации со зрелыми дендритными клетками, нагруженными опухолевыми антигенами.

Научная новизна. На значительном экспериментальном материале впервые подробно изучены индуцибельные остеогенные клетки-предшественники, выявленные в крови и серозных жидкостях (плевральном, перикардиальном, перитонеальном транссудатах и перитонеальном экссудате) лабораторных животных.

Впервые показаны в сравнительном плане возрастные изменения численности и эффективности клонирования стромальных клеток-предшественников костного мозга перитонеального транссудата и экссудата различных лабораторных животных.

Дана сравнительная характеристика изменений морфогистохимиче-ских и функциональных показателей КОК-ф костного мозга и клоноген-ных клеток, обнаруженных в перитонеальном транссудате и экссудате у крыс различных линий и возраста, под влиянием условий культивирования.

Впервые исследованы изменения иммунофенотипа, численности и клоногенных свойств стромальных клеток-предшественников костного мозга и селезёнки мышей СВА под действием введённого in vivo и in vitro препарата профеталь, содержащего в качестве основного компонента человеческий а-фетопротеин (ч-АФП).

На модели гетеротропных трансплантатов впервые продемонстрированы изменения эффективности клонирования и способности к остеоге-незу КОК-ф костного мозга мышей при вакцинации их антигенами стрептококка группы А.

Получены новые данные, характеризующие динамику дифференци-ровки лимфокин-активированных киллеров (JIAK) из мононуклеарных лейкоцитов (MJI) периферической крови человека, и на основе морфологических, функциональных и иммунофенотипических характеристик определены оптимальные сроки их культивирования.

Впервые исследовано действие препарата профеталь in vitro и проведена сравнительная оценка активации мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) человека под влиянием интерлейкина-2, фитоге-

магглютинина и профеталя. Выявлена высокая степень бласттрансформа-ции под действием последнего с формированием С034+/С045+ гемопо-этических клеток-предшественников в культурах мононуклеарных лейкоцитов периферической крови здоровых доноров.

Исследованы мононуклеарные лейкоциты (МЛ) крови, МЛ, циркулирующие в плевральном и перитонеальном экссудате и инфильтрирующие различные участки печени онкологических больных и экспериментальных животных с метастатическим процессом, их морфологические, им-муноцитохимические и фенотипические особенности, продемонстрированы возможности их дифференцировки в ЛАК и натуральные киллеры Т-клетки (НКТ), показаны их сравнительные характеристики.

Впервые дана сравнительная оценка морфогистохимических, электронно-микроскопических, иммунофенотипических и функциональных особенностей незрелых и зрелых дендритных клеток, генерированных из различных источников под действием ряда иммуномодуляторов.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты изучения особенностей КОК-ф, обнаруженных в крови, плевральном, перикар-диальном транссудатах, перитонеальном транссудате и экссудате, расширяют представления о стромальных клетках-предшественниках (СКП) и дают направление исследованию биологических жидкостей, как одного из возможных источников выделения СКП для использования в практической медицине.

Сравнительная характеристика детерминированных остеогенных клеток-предшественников костного мозга и индуцибельных клоногенных клеток, выявленных в биологических жидкостях, имеет научно-теоретическое значение и вносит вклад в дискуссию о возможностях циркуляции стромальных клеток-предшественников.

Полученные сведения о возрастных изменениях количества и эффективности клонирования стромальных клеток-предшественников костного мозга и тимуса, селезёнки, перитонеального транссудата у лабораторных животных имеют значение для понимания процессов, происходящих при возрастном остеопорозе. Кроме того, они трактуют необходимость учёта возраста и донора, и реципиента, а также источника получения стромальных клеток-предшественников на определённом возрастном этапе в случае применения их в заместительной терапии.

Продемонстрированный на модели гетеротопных трансплантатов характер влияния антигенов стрептококка группы А на клоногенные и ос-теогенные свойства КОК-ф акцентирует внимание на том, какое значительное воздействие оказывают процессы, происходящие в организме реципиента, на функциональные способности трансплантированных стромальных клеток-предшественников и морфогистохимические особенности формирующейся костной ткани. И это, несомненно, необходимо учи-

тывать при разработке методов по использованию мезенхимальных стволовых клеток для трансплантации.

На основании выявленной динамики дифференцировки лимфокин-активированных киллеров из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, их морфологических, функциональных, иммунофенотипи-ческих характеристик определены оптимальные сроки экстракорпорального культивирования ЛАК, применяемых в адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований и инфекционных заболеваний.

Исследование иммуномодулирующих способностей препарата профе-таль демонстрирует его более широкие по сравнению с классическими митогенами возможности для экстракорпорального получения активированных мононуклеарных лейкоцитов, обладающих высокими пролифера-тивными и цитотоксическими способностями, для индукции созревания дендритных клеток и опосредованного влияния через данные популяции на стромальные клетки-предшественники костного мозга и селезёнки. Данные эффекты и выявленный в исследованиях высокий уровень бласт-трансформации мононуклеарных лейкоцитов под действием профеталя, приводящей к формированию С034/45-положительных гемопоэтических клеток-предшественников, предполагает возможность использования изученных свойств этого препарата в практической медицине.

Продемонстрированная возможность генерации ЛАК-клеток из мононуклеарных лейкоцитов плеврального и перитонеального экссудатов онкологических больных, ЛАК и НКТ-клеток из клеток паратуморальных лейкоцитарных инфильтратов печени больных колоректальным раком с метастатическим процессом и печени поражённых опухолью мышей, изучение морфологических, иммунофенотипических и функциональных характеристик полученных ЛАК и НКТ-клеток имеет значение для теоретической и клинической онкологии.

Сравнительный анализ морфологических, гистохимических, электронно-микроскопических, функциональных и иммунофенотипических особенностей дендритных клеток различного происхождения и находящихся на разных этапах созревания вносит вклад в теоретические аспекты клеточной дифференцировки и предоставляет возможность выбора источников и индукторов созревания при разработке методов создания ДК-вакцин, применяемых в биотерапии опухолей и тяжёлых инфекций.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Численность детерминированных стромальных клеток-предшественников костного мозга, так же как и выявленных в биологических жидкостях индуцибельных остеогенных клеток-предшественников, эффективность их клонирования и морфология формируемых ими колоний зависят от видовых особенностей экспериментальных животных и

условий культивирования, связанных с влиянием гемопоэтических клеток, претерпевают значительные изменения в процессе онтогенеза.

2. Под действием антигенов стрептококка группы А происходят изменения не только количества и клоногенных свойств детерминированных клеток-предшественников костного мозга мышей, но и процессов остеогенеза, осуществляемых КОК-ф в гетеротопных трансплантатах. Причём степень этих изменений зависит от длительности воздействия бактериальных антигенов на остеогенные клетки.

3. Стимулирующее влияние препарата профеталь, введённого in vivo, на КОК-ф костного мозга и селезёнки мышей выражается непосредственно в усилении пролиферативных и клоногенных свойств стромальных клеток-предшественников. Ингибиция колониеобразующих способностей КОК-ф при введении профеталя in vitro осуществляется опосредованно через активированные препаратом мононуклеарные лейкоциты.

4. Сравнительная характеристика морфогистохимических, электронно-микроскопических, фенотипических и функциональных свойств мо-нонуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, инкубированных с IL-2, ФГА и профеталем демонстрирует наиболее выраженную стимуляцию цитотоксической и пролиферативной активности MJI под влиянием последнего. Бласттрансформация мононуклеарных лейкоцитов, вызванная действием препарата профеталь, содержащего человеческий а-фетопротеин, приводит к появлению в культурах CD34+/CD45+ гемопоэтических клеток-предшественников.

5. Генерация JIAK-клеток возможна из MJI плеврального, перитоне-ального экссудатов онкологических больных, ЛАК и НКТ — из клеток перитуморальных лейкоцитарных инфильтратов печени онкологических больных и печени экспериментальных животных с метастатическим процессом.

6. Клетки, генерированные из моноцитов периферической крови человека, прогениторных клеток эмбриональной печени мышей, клеток-предшественников костного мозга взрослых животных, бластов больных острым миелоидным лейкозом имеют комплекс морфологических, электронно-микроскопических, иммунофенотипических и функциональных признаков дендритных клеток. Созревание их может происходить как под действием общепринятого индуктора — фактора некроза опухолей а, так и под влиянием ряда иммуномодулирующих агентов (препарата профеталь, липополисахаридных комплексов бактериального происхождения,). Зрелые ДК, нагруженные опухолевыми антигенами, при коинкубации с МЛ способны активировать их противоопухолевые киллерные способности.

Апробация работы

Материалы диссертационного исследования представлены в виде публикаций на 66 конференциях, съездах, форумах и конгрессах, из них: 3 — на международных конгрессах, 5 — на международных форумах и съездах, 21 — на международных и общероссийских конференциях с международным участием, 25 — на всероссийских конференциях, симпозиумах и съездах, 12 — на межрегионарных, региональных и заочных электронных конференциях РАЕ.

В виде устных и постерных докладов основные положения исследований доложены на: VII Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Казань, 2004), X Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2005» (Санкт-Петербург, 2005), Международном Конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (Москва, 2005), V Общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004), Международной научной конференции «Мор-фофункциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференци-ровки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий» (Курган, 2004), V Всероссийской научной конференции с международным участием (Уфа, 2005), V Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2006),VII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2005), II Российской конференции по иммунотерапии и иммунореабили-тации (Москва, 2005), Всероссийской научной конференции, посвященной памяти академика Н.В. Васильева (Томск, 2005), Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы теоретической и клинической медицины» (Пермь, 2005), II Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальная и клиническая лимфология — практическому здравоохранению» (Пермь, 2003), Межрегионарной научной сессии ПГМА и ИГМА (Пермь, 2005), Научной конференции «Иммунология вчера, сегодня и завтра», (Пермь, 2005), Научных сессиях ПГМА (Пермь 1996, 1997, 1999, 2000, 2002, 2003, 2004, 2006).

Апробация диссертации состоялась 02.06.2006 г. на объединённом межкафедральном научном заседании морфологических кафедр и кафедры микробилогии и иммунологии ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ, иммунологов Института иммунологии и физиологии УрО РАН (Екатеринбург), Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (Пермь) и кафедры микробилогии и иммунологии Пермского государственного университета.

Внедрение в практику. Основные результаты диссертации внедрены в учебный процесс кафедр онкологии, инфекционных болезней, кафедры профессиональных болезней, промышленной экологии и терапии медико-профилактического факультета с курсом профпатологии ФПК и ППС, гистологии, эмбриологии и цитологии, микробиологии и иммунологии, патологической анатомии с секционным курсом ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава» кафедры микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета, в научно-исследовательскую работу лабораторий Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (Пермь), Института иммунологии и физиологии УрО РАН (Екатеринбург).

Экономическая значимость работы обусловлена разработкой малозатратных и недорогостоящих методов экстракорпоральной генерации активированных мононуклеарных лейкоцитов, CD34+/CD45+ гемопоэтиче-ских клеток-предшественников и антигенпрезентирующих дендритных клеток, которые могут быть использованы при создании препаратов, применяемых в биотерапии онкологических и инфекционных заболеваний (акт внедрения в ГУ «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина РАМН»).

Публикации. Материалы диссертации обобщены в 97 печатных работах. В рекомендуемых ВАК изданиях: 30 статей опубликовано в рецензируемых журналах, 2 работы депонированы в ВИНИТИ, 56 статей и тезисов представлены в материалах международных конгрессов, форумов, всесоюзных и всероссийских съездов, международных и общероссийских конференций. В прочих изданиях (межрегиональных и региональных) напечатано 9 работ.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 320 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 6 глав, посвященных собственным исследованиям, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 53 графиками, 27 гистограммами, 270 фотографиями, содержит 31 таблицу. Библиографический список включает 453 источника (85 — отечественных и 368 — зарубежных авторов).

Диссертационная работа обобщает исследования стромальных клеток-предшественников, выполненные автором на базе лаборатории имму-номорфологии Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН под руководством чл.-корр. РАМН, д-р мед. наук, проф. А.Я. Фриденштейна; вопросы влияния культуры стрептококка группы А и препарата профеталь на КОК-ф — в отделе регуляции иммунитета ГУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН» (зав. отделом — д-р мед. наук, проф. В.Г. Нестеренко). Исследование иммунофенотипа и

функциональных свойств иммунокомпетентных клеток (мононуклеарных лейкоцитов, дендритных клеток, натуральных киллеров, натуральных киллеров Т-клеток) — на базе лаборатории клеточного иммунитета ГУ «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина РАМН» (зав. лаб. — д-р мед. наук, проф. М.В. Киселевский). Морфологическая часть работы выполнена на кафедре гистологии, эмбриологии и цитологии ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ (зав. каф. — д-р мед. наук, проф. В.А. Четвертных); электронно-микроскопические исследования — в группе электронной микроскопии Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (зав. гр. — д-р биол. наук, В.И. Попенко).

Автор выражает благодарность коллективам и руководителям названных научных учреждений и лично ведущему научному сотруднику НИИ-ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи — д-ру мед. наук Ю.Ф. Горской, совместно с которой проведено ряд исследований, а также всем участникам работы, чей вклад адекватно отражён в совместных публикациях.

Автор также благодарит своих научных консультантов: ак. РАН и РАМН, д-ра мед. наук, проф. В.А. Черешнева и д-ра мед. наук, проф. М.В. Киселевского за постоянную помощь, внимание и доброжелательное участие на всех этапах работы.

Особая глубокая благодарность и память — своему Учителю, увлёкшему изучением стволовых стромальных клеток, давшему направление исследованиям, — чл.-корр. РАМН, д-ру мед. наук, проф. А.Я. Фриден-штейну.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и материалы исследования. Исследования проведены на самцах лабораторных животных: 700 мышах линии СВА и гибридов F4 массой 10-20 г, 30 эмбрионах мышей СВА, 615 крысах линии Wistar и Augusta массой 45-350 г, 175 морских свинках линии Хьюстон массой 180-250 г, 20 кроликах Новозеландской, Калифорнийской пород и породы «Шиншилла» массой 1,5-2 кг. Животных выводили из опыта с применением эфирного наркоза в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных от 1989 г.».

В исследовании использованы также 20 культур штаммов стромальных фибробластов костного мозга здоровых мужчин добровольцев, 210 проб периферической крови здоровых мужчин добровольцев, 30 проб периферической крови больных колоректальным раком с метастатическим процессом в печени, 30 проб плеврального экссудата больных раком лёгкого и молочной железы и 20 проб перитонеального экссудата больных раком

яичника с метастазами в серозные оболочки, 35 биоптатов селезёнки больных раком желудка с метастатическим процессом в печени, 20 проб костного мозга больных острым миелоидным лейкозом, 20 проб биопсийного материала поражённой метастазами печени больных колоректальным раком, 10 проб биопсийного материала печени, поражённой опухолевым процессом и гепатитом В. Пробы крови здоровых добровольцев получены в отделении переливания крови ГУ РОНЦ РАМН. Все пробы биопсийного материала и крови онкологических больных взяты с соблюдением этических норм и с разрешения больных, находящихся на лечении в Российском онкологическом научном центре им. H.H. Блохина РАМН.

Используемые препараты. Коммерческие рекомбинантные человеческие и мышиные цитокины: интерлейкин-2 (Proleukine, Chiron, Голландия) 1000-2000 ME/мл, интерлейкин-2 («Ронколейкин», Биотех, Россия) в дозе 2000 ME/мл, интерлейкин-4 (Biosource, США) в дозе 10 нг/мл, гра-нулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) в дозе 10 нг/мл, фактор некроза опухолей (TNF-a) (Biosource, США) в дозе 100 нг/мл, — фитогемагглютинин (ФГА) (ПанЭко, Москва) в дозах 5,010,0-15,0 мкг/мл, липополисахарид (ЛПС) К. pneumoniae (0,125 мкг/мл) (Sigma, США), убитая вакцина стрептококка группы А 5-го типа (НИИ-ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи), убитая вакцина Salmonella typhimurium (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи), препарат профеталь (ЗАО «Институт новых медицинских технологий», Пермь), основным действующим компонентом которого является человеческий а-фетопротеин, лиофилизированный и стабилизированный декстраном — в дозах 0,001-0,01—0,1—1,0—1,5-2,010,0 мкг/мл.

Методы исследования

Культуральные

Культивирование стромальных клеток-предшественников. В исследованиях использовали 4 вида культур: культуры адгезивных клеток, оставшихся после удаления неприкрепившихся к поверхности культурального сосуда гемопоэтических элементов (А-культуры); культуры адгезивных клеток с последующим добавлением облученных клеток красного костного мозга — фидера (А+ф-культуры); культуры полной популяции клеток органа (П-культуры); культуры полной популяции клеток органа с последующим добавлением фидера (П+ф-культуры), при различных условиях культивирования [Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А., 1980]. Определяли количество и морфологию сформированных колоний состоящих не менее чем из 50 клеток, морфогистохимические характеристики образующих их клеток. Подсчитывали численность КОК-ф и эффективность их клонирования

/OI/Ч-Л д, 1П-5 „„„ in-6\ „ .________Кол - ВО КОЛОНИЙ , с

(JKO-ф — 10 или 10 ) по формуле--Ю

Кол - во посаженных клеток

или 106.

Клонирование КОК-ф и получение перевиваемых штаммов стромаль-ных фибробластов лабораторных животных и человека [Чайлахян Р.К., Герасимов Ю.В., Фриденштейн А.Я., 1978].

Культивирование мононуклеарных лейкоцитов, выделенных из различных источников по методу Boyum А.(1968), активированных IL-2, ФГА и препаратом профеталь.

Генерация и культивирование дендритных клеток. Дендритные клетки получали из различных источников: моноцитов периферической крови здоровых доноров, бластных форм больных острым миелоидным лейкозом, прогениторных клеток печени эмбрионов и клеток-предшественников костного мозга взрослых мышей СВА, — с применением набора цитокинов, предложенного Г.З. Чкадуа [Чкадуа Г.З. и др., 2002] и индуцировали созревание ДК с помощью TNF-a, ВП-вакцины, бактериальных ЛПС, препарата профеталь.

Культивирование опухолевых клеток NK-чувствительных линий: эритробластного лейкоза человека — К-562, колоректального рака человека — Colo, мышиной лимфомы — YAC-1, рака яичников мышей — СаО-1 и опухоли Эрлиха в полной культуральной среде. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста постоянными пассажами культуры через каждые 2-3 суток.

Методы аллогенной гетеротопной трансплантации

Пересадка клеток костного мозга и селезёнки мышей СВА под капсулу почки мышам той же линии [Чайлахян Р.К. и др., 2001] при сочетаниях донора и реципиента: «молодой — молодой», «старый — молодой», «молодой — старый» [Горская Ю.Ф. и др., 2001].

Пересадка клеток костного мозга мышей СВА под капсулу почки мышам той же линии [Чайлахян Р.К. и др., 2001] при сочетаниях донора и реципиента: «нормальный — нормальный», «иммунизированный культурой стрептококка группы А — нормальный», «нормальный — иммунизированный культурой стрептококка группы А» [Горская Ю.Ф. и др., 2005]. Мышей иммунизировали убитой вакциной стрептококка группы А [База-нова Е.А. и др., 1991]. В сыворотках иммунных мышей определяли ауто-антитела к антигенам ткани сердца [Danilova Т.А., 1994].

Анализ иммунофенотипа методом проточной цитофлюорометрии

Исследование экспрессии поверхностных кластеров детерминации клеток (FACS-анализ) при помощи соответствующих моноклональных антител (Caltag Laboratories, США) на проточном цитометре FacsCalibur (Becton Dickinson, США). Определяли уровень экспрессии дифференци-ровочных антигенов — CD3, CD4, CD8, CD16, CD56, NK 1.1; активаци-

онных антигенов — CD25, CD38; молекул адгезии — CD57, CD58; маркёров гемопоэтических клеток-предшественников — CD34, CD45; кости-мулирующих молекул — CD40, CD80/B7-1, CD86/B7-2; молекул антигенного представления CD 1а, МНС I и II классов (HLA-DR и др.), маркёров моноцитов/макрофагов — CDllc, CD14, CDF4/80; семейства молекул CD1 lc, CD29 и маркёра терминальной дифференцировки ДК — CD83.

Метод иммуномагнитной сепарации

Выделение CD34+ клеток из активированных мононуклеарных лейкоцитов периферической крови здоровых доноров посредством положительной селекции клеток с использованием набора для магнитной сепарации опухолевых клеток (MACS Cytokeratin Microbeads Carcinoma Cell Enrichment Kit, Miltenvi Biotec, Германия) в соответствии с протоколом производителя.

Методы цитологического исследования

Фазовоконтрастная микроскопия культуральной взвеси в светлом и тёмном поле и при окраске моноклональными антителами, меченными FITC (флюоресцинизотиоционатом) и R-PE (фикоэритрином) с соответствующими изотопическими контролями IgGl (Caltag Laboratories, США) с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss Axioplan 2 (Zeiss, Германия).

Гистологические и гистохимические методы — окраска парафиновых срезов органов, мазков культуральной взвеси, колоний и клеток, прилипших к дну культурального сосуда, гематоксилином-эозином, азуром II-эозином по Романовскому-Гимзе, метиленовым синим, фуксином Циля, метиловым зелёным-пиронином по Браше с контрольной обработкой РНК-зой для выявления РНК, кармином Беста и Шифф-йодной кислотой по Шабадашу на гликоген, Шифф-йодной кислотой по Шабадашу с контрольной обработкой амилазой и альциановым синим для определения содержания гликозаминогликанов, Суданом I на липиды, выявление активности щелочной фосфатазы по Гомори [Лилли Р., 1969].

Иммуноцитохимические методы — определение экспрессии антигенов клеток при помощи моноклональных антител (Novocastra, Швейцария) на парафиновых срезах печени онкологических больных, поражённых метастатическим процессом, и мышей с привитой опухолью. Исследованы маркёры: а-фетопротеина, CD3, OLA-LCA-DACO (клоны 2В11 и PD7126) — общего лейкоцитарного антигена, CD 10 — стволово-клеточного антигена, TdT — антигена предшественников Т и В лимфоцитов, WIM (виментин) — клеток мезенхимального происхождения, CD 15 — нормальных гранулоцитов, CD20 — общего B-клеточного антигена, CD68 — антигена макрофагов, гистиоцитов, Ki-67 — пролиферации, BCL-2 — белка-негативного регулятора апоптоза.

Электронно-микроскопические методы. Клетки фиксировали в 2% растворе глютаральдегида на 0,1 М фосфатном буфере и заключали в смо-

лу эпон-аралдит по стандартной методике. Срезы получали на ультрамикротоме LKB-3 (LKB, Швеция) и контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Использовали также метод электронной гистохимии по Бернару для выявления в клетках РНК. Исследование и фотографирование клеток культуральной взвеси проводили на просвечивающем электронном микроскопе JEM-100CX (JEOL, Япония).

Анализ и фотографирование меченых клеток в культуральной взвеси, парафиновых срезов органов, окрашенных колоний и клеток на дне куль-турального сосуда и в мазках с использованием системы Zeiss Axioplan 2 (Carl Zeiss, Jenna, Германия), «ДиаМорф-Cito» (Россия).

Морфометрические методы

Измерение толщины костных капсул (в мкм) во вновь образованном костномозговом органе при пересадке гетеротопного трансплантата взвеси клеток костного мозга с помощью аппаратно-программного морфоденсито-метрического комплекса для клеток и тканей организма «ДиаМорф-Cito».

Определение средней оптической плотности (в усл. ед.) костной ткани костномозгового трансплантата на препаратах, окрашенных гистохимическими методами, с помощью «ДиаМорф-Cito» (Россия) по специальной формуле.

Методы определения функциональной активности стимулированных различными факторами мононуклеарных лейкоцитов

Цитотоксический тест по отношению к клеткам опухолевых линий К-562, Colo, YAC-I [Zund G. et al., 1999]. Опухолевые клетки (lxlO6 в мл) инкубировали в культуральной среде RPMI 1640 с интактными и активированными МНК (в соотношениях клетки мишени/эффекторы 1:5, 1:2, 1:1 и 1:0,5) в плоскодонных 96-луночных микропланшетах (Costar, Франция) в течение 18 часов. Затем в лунки добавляли витальный краситель 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5 дифенилтетразолия бромида (МТТ, Sigma, США) и по оптической плотности, измеряемой на мультискане MS (Labsystem, Финляндия), рассчитывали процент лизиса опухолевых клеток (процент цитотоксичности). Средне-эффективное соотношение клетки мишени/эффекторы (ЭС50), при котором отмечается лизис 50% опухолевых клеток, рассчитывали при помощи программы Biostat.

Тест пролиферативной активности MJI в колориметрическом тесте с использованием витального красителя AlamarBlue (Biosours, США) [Page D. et al., 1993], оценкой результатов на флюориметре Versa Fluor V13 (Vtocal). Процент пролиферирующих клеток или значения пролиферации определяли в единицах флюоресценции по разнице длин между оптическими сигналами (ОП540-ОПб2о), подсчитывали индекс стимуляции (ИС).

Оценка митотической активности MJI с использованием морфологического теста реакции бласттрансформации лимфоцитов традиционным способом [Самойлина Н.Л., 1970] и подсчёт ИС, представляющего отношение

процента бластных клеток в стимулированной культуре мононуклеаров к проценту спонтанных бластных форм в контроле.

Оценка цитокинового профиля

Определение концентрации IL-lß, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-а, INF-y в супернатантах культур спленоцитов мышей, культур незрелых и зрелых ДК методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем (Biosource, Бельгия).

Метод определения фагоцитарной способности дендритных клеток

Оценка фагоцитарной активности ДК по поглотительной способности в отношении латексных частиц диаметром 2,7 мкм (ДИАэМ, Москва) по поглотительной способности в отношении штаммов Staphylococcus aureus 1991 и Salmonella typhimurium 415 (0,4 мл взвеси культуры ДК — 10х10бкл/мл). Определение фагоцитарного индекса (ФИ), фагоцитарного числа (ФЧ), коэффициента фагоцитарного числа [Меньшиков В.В., 1987].

Методы статистической обработки результатов

Обработка результатов в рамках параметрической и непараметрической базовой статистики с использованием регрессивного и многомерного факторного анализа, критерия Стьюдента, метода Хи-квадрат (%2) при помощи стандартных пакетов статистических программ StatSoft 6.0, SPSS 13.0 MS Excel, WinMDI 2.8, ИПСО. Данные представлены как М±т. Различия рассматривались как значимые при р<0,05.

Использование статистических методов, входящих в пакет программ аппаратно-программного морфоденситометрического комплекса для клеток и тканей организма «ДиаМорф-Cito» (Россия).

Применение метода математического моделирования по специальной программе, реализующей метод градиентного спуска, который представляет собой разновидность направленного поиска в сторону уменьшения ошибки, при этом искомая функциональная зависимость определяется уравнением экспоненциальной регрессии с линейным членом [Носач В.В., 1994].

Определение переменных с интервальной и номинальной шкалой — коэффициент корреляции Пирсона (корреляция моментов произведений). Значимыми считались корреляции при /?<0,01.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние условий культивирования и регуляторных факторов на морфофункцнональные свойства стромальных клеток-предшественников

В связи с тем, что трансплантация размноженных в монослойных структурах стромальных клеток как способ лечения целого ряда заболеваний находит всё большее применение [Чайлахян Р.К. и др., 1998, Herzog E.L. et al., 2003, Lucarelli E. et al., 2003] особую актуальность приобретает разработка оптимальных способов их культивирования.

Стромальные клетки-предшественники костного мозга, селезёнки и тимуса мышей, морских свинок, кроликов и крыс во всех видах первичных монослойных культур (А, А+ф, П, П+ф) образуют на поверхности дна культуральных сосудов колонии-клоны фибробластоподобных клеток, каждая из которых является потомком одной КОК-ф.

Несмотря на то, что основную массу колоний составляют фибробла-сты, они отличаются по плотности расположения клеток, их количеству и форме (рис. 1). На примере колоний, сформированных клоногенными клетками стромы костного мозга крыс, выделено три основных типа колоний: компактные, диффузные и образованные, так называемыми, сква-мозными фибробластами.

Компактные колонии состоят из различных по величине типичных фибробластов, расположение которых характеризуется строгой упорядоченностью: более плотно в одном или нескольких центрах и диффузно — на периферии (рис. 1 а-б). Данные колонии могут содержать от нескольких сотен до нескольких тысяч клеток и обладают наибольшим пролифе-ративным потенциалом. Диффузный тип колоний характеризуется наличием в его составе от нескольких десятков до нескольких сотен фибробластов, разобщённых между собой и свободно располагающихся в её пределах (рис. 1 в-г). Клетки имеют выраженные и хорошо различимые отростки. В данном виде колоний наблюдается снижение их пролифератив-ной активности. Колонии, содержащие сквамозные фибробласты, состоят из клеток, которые имеют распластанный вид, плотное пикнотичное ядро, вакуолизированную цитоплазму и представляют собой дистрофически изменённую форму клеточных элементов (рис. 1 д-ё).

Анализ иммунофенотипа клеточных форм в культурах клоногенных клеток костного мозга мышей СВА показал, что среди них имеется большое количество клеток, экспрессирующих на поверхности маркёры NK (NK-1 — 90,9%), моноцитов/макрофагов (F4/80 — 77,39%), активацион-ных молекул (CD 25 — 80,68%), костимулирующих молекул (CD80/B7-1 — 80,63% и CD86/B7-2 — 33,9%). Введение животным убитой вакцины Salmonella typhimurium не сказывается на исследованном иммунофеноти-

пе клеток костного мозга мышей, хотя общее количество их в органе (на бедро мыши) увеличивается в 2-3 раза.

Ш / 'Шу

Л. Л

wmsam т'ъ.. h>

* * *>

U г/ , 4х >' it *

Ф ¿1 г' *

t '¿Л-

■0'

* ' * О* 4.

* * IV - 'i А

с) е

Рис. 1. Первичные мопослойные культуры клеток костного мозга крыс (12-й день культивирования)

Микрофотографии колоний, сформированных стромальными клетками-предшественниками: а -— компакшыйтии (ок. 10, об. 2,5); в—диффузный тип (ок. 10, об. 10); d — колония, содержащая скваданые (дистрофически изменённые) клетки (ок. 10, об. 10); 6. г, е — фибробласты, формирующие соответствующие типы колоний; 6 (ок. 10, об. 20); г, е (ок. 10, об. 40); а, б, а. г — окр. метиленовым синим; д,е—• окр. азуром 11-эозином

В первичных культурах селезёнки мышей наблюдается большое количество клеток, экспрессирующих на своей поверхности N К.-антигены (57,07%), костимулирующие молекулы CD80/B7-1 и CD86/B7-2 (80,63 и 78,50% соответственно), активационные антигеиы (CD25 — 88,35%) и макрофагальные маркёры (F;4/80 — 66,61%). Между тем уровень экспрессии поверхностных молекул сравнительно ниже, чем у клоиогениых клеток костного мозга. Иммунизация животных убитой вакциной Salmonella iy-phimurium практически не оказывает влияния на экспрессию исследован-

ных антигенов на поверхности клоногенных клеток селезёнки мышей при трёхкратном увеличении их численности.

Эффективность клонирования стромальных клеток-предшественников в первичных монослойных культурах клеток костного мозга, тимуса и селезёнки мышей, морских свинок и кроликов [Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А., 1980; Горская Ю.Ф. и др., 2000] зависит от наличия костномозгового фидера (облученных аутологичных гемопоэтических клеток или клеток костного мозга морских свинок). В тимусе, например, в отсутствие фидера даже при высокой плотности эксплантированных клеток (20-30х104 на 1 см2) ЭКО-ф и в адгезивных, и в полных культурах практически равняется нулю, но значительно увеличивается при добавлении облученных гемопоэтических клеток.

Виды культур

А - адгезивные

А+ф-

адгезивные с фидером

П- полные

П+ф - полные с фидером

180,0 600,0 1800,0 6000,0 60000,0

Рис. 2. Эффективность клонирования стромальных клеток-предшественников в первичных монослойных культурах клеток костного мозга крыс

По оси абсцисс — концентрация эксплантируемых клеток на 1 мм2 дна культурального сосуда; по оси ординат — эффективность клонирования (х10~5).

Данные обработаны путём компьютерного моделирования методом градиентного спуска

Введение фидера в культуры клеток костного мозга крыс более чем в 6 раз повышает эффективность клонирования его стромальных клеток-предшественников, однако ЭКО-ф не достигает значений, полученных при культивировании с собственными клетками костного мозга (рис. 2). Выявлено, что присутствие в среде культуры собственных гемопоэтических клеток приводит к повышению эффективности клонирования КОК-ф костного мозга крыс в 10-20 раз.

При этом прослеживается корреляция между уровнем ЭКО-ф и временем адгезии до введения фидера, концентрацией и аллогенным или сингенным источником его (рис. 3).

Виды культур: ША ША+ф ВП ПП+ф

Рис. 3. Уровень зависимости эфеКТйвности клонировании СТромалЬных клсток-предшествешшков костного мозга крыс от возраста животных и условий культивирования во всех вида\ монослой пых культур (А, А+ф, П, П+ф)

По оси абсцисс —условия Культивирования; но оси ординат — степень корреляции. Данные обработаны с применением метода корреляции по 11ирсопу.

Значимая степень корреляции— 0,2 и более

Полученные результаты соответствует данным о том, что колониести-мулирующей активностью в отношении КОК-ф обладают клетки костного мозга и селезенки благодаря содержанию среди них тромбоцитов и мегака-риоцитов [Горская Ю.Ф. и др., 20021, Напротив, кпеггки тимуса, лимфатических узлов и лейкоциты крови не обладают подобной активностью.

Добавление фидера выравнивает эффективность колон необразован и я в адгезивных и полных культурах клеток всех кроветворных и лимфоид-НЫХ органов у крыс, мышей и морских свинок, но ингибирует колонисоб-разование как в исходных культурах клеток костного мозга кроликов, так и в культурах перевиваемых штаммов фибробластов. Однако культураль-ные потомки КОК-ф костного мозга кроликов сохраняют высокую чувствительность к ростстимулирующим факторам тромбоцитов, присущую другим видам животных.

При математическом анализе полученных данных отмечается высокая степень коррелятивной зависимости (более 0,5) ЭКО-ф от количества эксплантируемых клеток и плотности их эксплантации в первичных мо-нослойиых культурах клеток костного мозга крыс (см. рис. 3).

Увеличение количества эксплантированных клеток в культурах усиливает эффективность клонирования КОК-ф по экспоненциальной кривой, но лишь до определённого уровня плотности эксплантата. Повышение плотности эксплантируемых клеток более чем 2-Зх10^/см2 дна культу-рального сосуда, сопровождается падением ЭКО-ф: резким — в полных костномозговых культурах и более плавным — в адгезивных культурах, почти до нулевых значений, независимо от того, достигается ли эта плот-

ность за счёт интактных или облучённых клеток (см. рис. 2). Это свидетельствует не только о ростостимулирующем, но и ингибирующем воздействием на КОК-ф стромы регуляторных факторов, вырабатываемых гемопоэтическими клетками. Таким образом, присутствие определённого количества и вида гемопоэтических клеток и вырабатываемых ими факторов обязательно для нормального функционирования стромы. Причём данные факторы оказывают как стимулирующее, так и ингибирующее действие и имеют видовые отличия.

С возрастом в костном мозге, тимусе и селезенке происходит достоверное снижение численности КОК-ф, изменение морфологии образуемых ими колоний и эффективности клонирования клеток-предшественников у всех изученных экспериментальных животных, особенно значительно и резко в тимусе морских свинок и мышей — в 75 и 12 раз соответственно (см. рис. 4).

0 5 0 75 2 б

Рис. 4. Количество стромальных клеток-предшественииков на орган и эффективность их клонирования в в костном мозге (а, б), в тимусе (в, г) и в селезёнке (д, е): а, в, д—у мышей; б,г,е—у морских свинок

По оси абсцисс — возраст животных; по левой оси ординат — ЭКО-ф, по правой оси -кол-во КОК-ф на исследуемый орган. Диаграммы — кол-во ядерных клеток на орган.

Отмечается высокая степень (более 0,5) отрицательной корреляции между возрастом животных, численностью КОК-ф и эффективностью их клонирования в костном мозге крыс, особенно при выявлении в адгезивных культурах.

Возрастные изменения числа КОК-ф в органах и их ЭКО-ф варьируются по степени выраженности, срокам у разных видов экспериментальных животных и у животных одного вида в различных органах, что, вероятно, зависит от физиологических характеристик, особенностей старения организма, продолжительности жизни животных и функционального назначения органов. Поскольку известно, что в состав популяции КОК-ф селезёнки и тимуса входят индуцибельные остеогенные клетки, то полученные данные указывают на возможность возрастного снижения численности этой категории стромальных предшественников, что можно считать одной из причин возрастного остеопороза.

Таблица 1

Изменение эффективности клонирования и численность стромальных клеток-предшественников в культурах селезёнки и костного мозга мышей СВА под действием препарата профеталь*

Орган Введение профеталя in vivo Число ядерных клеток на орган (селезёнку или бедро х 107) ЭКО-Ф на 10б эксплантиро-ванных клеток Число КОК-Ф на орган (селезёнку или бедро) 37+5 101+24

Селезёнка + 11,6+0,4 14,4±0,6 0,3+0,1 0,7±0,2

Костный мозг + 1,4±0,2 1,3 ±0,2 10,0±0,1 35,0±4,1 135+150 438±530

Примечание' Эксплантировано по 1-2x10' клеток селезенки и по 1-Зх106 клеток костного мозга мышей на матрац площадью 25 см2. В качестве фидера использовались облученные

клетки костного мозга морских свинок в количестве 1х107 клеток на культуру. * Профеталь вводили мышам внутрибрюшинно за сутки до эксплантации клеток в монослойные культуры в количестве 25 мкг на мышь в 0,5 мл физиологического раствора.

Изучение влияния препарата профеталь, на стромальные клетки-предшественники костного мозга и селезёнки мышей показало, что при введении препарата in vivo в 2-3 раза повышается эффективность их клонирования, что может быть обусловлено иммуностимулирующим действием содержащегося в профетале ч-АФП на лимфоидную ткань (см. табл. 1). О такой возможности свидетельствует ряд данных [Dudich Е., Semenkova L., Dudich I. et al., 1999; Hooper D.C., Cohen B.H., Ducas D. et al., 1999].

Напротив, в случае добавлении профеталя непосредственно in vitro ЭКО-ф стромальных клеток-предшественников в культурах клеток костного мозга и селезёнки резко снижается: в селезёнке — в 2 раза и в костном мозге — дозозависимым образом максимально в 5 раз (см. табл. 2).

Таблица 2

Изменение эффективности клонирования в культурах клеток селезёнки и костного мозга мышей под действием препарата профеталь, содержащего а-фетопротеин

Орган Введение препарата профеталь in vitro (мкг/мл) ЭКО-ф на 10" эксплантированных клеток

- 0,4±0,1

Селезёнка 2 0,3±0,1

10 0,2±0,0

50 0,2±0,0

Костный мозг 2 10 50 5,7±1,7 4,0±1,0 1,5±0,3 1,0±0,2

Примечание' см прим. к табл. 1.

По-видимому, это связано с влиянием категории присутствующих в культурах нестромальных клеток, часть из которых (лимфоциты и макрофаги) оказывает ингибирующее действие на клоногенность КОК-ф [Горская Ю.Ф. и др., 1992]. Это даёт возможность определённого опосредованного воздействия препарата профеталь, на пул КОК-ф кроветворных и лимфоидных органов.

Таблица 3

Изменение эффективности клонирования и численность стромальных клеток-предшественников в трансплантатах костного мозга интакгных мышей и иммунизированных культурой стрептококка группы А

Вариант посадки Возраст трансплантата (мес.) Количество ядерных клеток на трансплантат (хЮ6) ЭКО-Ф (х105) Содержание КОК-Ф в трансплантате

Н->Н 1,2±0,2 6,7±0,7 80±8,0

Н-*И 1,5 0,9±0,2 1,9±0,2 17±2,0

И->Н 1,8±0,4 3,8±0,3 68±5,0

Н->Н 3,6±0,2 1,3±0,2 47 ±7,0

Н->И 2,5-3 3,6±0,6 0,3±0,1 11 ±3,0

И->Н 5,2+0,6 0,8±0,2 41+10,0

Н--Н 6,2±1,1 0,5+0,1 33±6,0

Н->И 7-7,5 3,9+0,7 0,1±0,0 5±1,0

И->Н 3,9±0,8 0,4±0,1 15±3,0

Исследование влияния убитой вакцины стрептококка группы А 5-го типа на клоногенные и остеогенные свойства стромальных клеток-предшественников проводили на модели гетеротопных трансплантатов клеток костного мозга мышей СВА под капсулу почки мышам той же линии

при сочетаниях донора и реципиента: «нормальный — нормальный» (Н— Н), «иммунизированный культурой стрептококка группы А — нормальный» (И—-Н), «нормальный — иммунизированный культурой стрептококка группы А» (Н—И). Результаты опытов продемонстрировали, что численность КОК-ф в трансплантатах при пересадке клеток костного мозга от нормальных мышей иммунизированным животным (Н—И) снижаются в зависимости аг возраста трансплантата в 4,5-6,5, а их ЭКО-ф — в 1,6-5 раз по сравнению с такими же трансплантатами, подсаженными интактным реципиентам (И—1-1) (см. табл. 3).

Содержание КОК-Ф в 1,5-3-месячных трансплантатах костного мозга, взятого от животных, иммунизированных убитой вакциной стрептококка, и подсаженного нормальным мышам (И—Н), практически не отличается, а в 7-месячных трансплантатах снижается вдвое но сравнению с содержанием КОК-Ф в трансплантатах костного мозга от нормальных мышей СВЛ, подсаженного нормальным животным (11—Н). Следовательно, развивающийся и существукдциЙ в подвергшемся иммунизации организме костномозговой орган (вариант Н—И) оказывается дефектным как по ЭКО-Ф (т.е. по концентрации), так и но содержанию стромальных клеток-предшественников.

Рис. 5. Микрофотографии гистологических препаратов почки с образованным костномозговым органом при трансплантации:

а — «Нормальный донор — нормальный реципиент»; б —- «Нормальный донор — иммунный реципиент». Окр. Щифф-йодной кислотой но Шабадашу (ок. 10, об. 40)

Антигены стрептококка оказывают влияние не только на клоногенные и п рол ифе ративн ые, по и Fia остеогенныё свойства стромальных к лето к-предшествснников костного мозга мышей. С одной стороны, наблюдается значительное увеличение толщины костных капсул в сформированных ими под капсулой почки костномозговых органах у экспериментальных групп животных, особенно при пересадке трансплантатов от нормальных

— иммунным мышам (рис. 5).

С другой стороны, в экспериментальных группах («иммунный донор

— нормальный реципиент» и «нормальный донор — иммунный реципиент») отмечается заметное снижение содержания гликогена и повышение

количества ШИК-позитивных гликозаминогликанов (выявляемых после обработки срезов амилазой) в межклеточном веществе костной ткани ге-теротопных трансплантатов (рис. 5).

Известно, что мукополисахариды костного матрикса и его структура играют главную роль в фиксации фосфата кальция. Таким образом, снижение уровня гликогена, который используется при фосфорилировании, на фоне повышенного содержания гликозаминогликанов в костной ткани трансплантатов, пересаженных от иммунных нормальным животным и от нормальных в иммунный организм, в сочетании с пониженной активностью щелочной фосфатазы и более значительным разрастанием в эксперименте костной капсулы может свидетельствовать о задержке процесса обызвествления костной ткани гетеротопных трансплантатов под воздействием антигенов стрептококка группы А.

Существуют данные, что иммунизация животных антигенами приводит к резкому увеличению численности КОК-ф в лимфатических узлах и селезенке [Горская Ю.Ф., 1986]. В наших опытах содержание КОК-ф в используемом для трансплантации костном мозге бедра животных, иммунизированных убитой вакциной стрептококка группы А 5-го типа, также существенно (в 3,5 раза) превышает содержание КОК-ф в костном мозге бедра нормальных мышей. Однако, данное превышение не сказывается положительно ни на величине и свойствах трансплантата, сформированного клетками такого костного мозга, ни на величинах ЭКО-ф и содержании КОК-ф в нём.

Полученные результаты говорят о том, что, по-видимому, далеко не все КОК-ф, численность которых увеличивается при введении антигенов, ответственны за трансплантабильность стромальной ткани при ее гетеро-топной пересадке. Таким образом, сам по себе факт, что предназначенный для пересадки костный мозг обогащён КОК-ф, еще не свидетельствует о возможности более успешного формирования трансплантата.

Характеристика клоногенных клеток-предшественников, выявленных в крови и серозных жидкостях лабораторных животных

Исследовалась кровь, транссудат и экссудат серозных полостей различных лабораторных животных с целью выявления в них клоногенных клеток и проведения сравнительного анализа свойств, присущих им и стромальным клеткам-предшественникам костного мозга. В крови морских свинок, перитонеальном, плевральном и перикардиальном транссудатах кроликов, морских свинок и крыс, а также в перитонеальном экссудате крыс обнаружены клоногенные клетки, образующие в первичных монослойных культурах колонии фибробластоподобных клеток (рис. 6). Данные клетки формируют те же 3 вида колоний в культурах, что и КОК-ф костного мозга: компактный, диффузный типы и колонии, состоящие из

сквамозных дистофически измененных фибробластов, В большинстве своём они относятся к популяции индуцибельных остеогенных клеток-предшественников [Фриденштейн А.Я., Лурня В.А., 1980].

\ . «чЬг.* '

•• ■ ; У Г«: ••

1 V! , -г. ;

,1 "I" .

^ *;>» •

•••лу : •

• * ■ ¿г--*.- '

* . - '.Л «й1 V, 5 I

^ 4

/ /V .

у-VI*.

Рис. 6, Первичные м о послойные культуры индуцибельных стромальных клеток-предшественников, выявленных:

а. 6 — В крови морской свинки; е, г — I» плевральном транссудате крысы; д, е — и перитопеалыюм транссудате крысы (12 суток инкубации) Микрофого1рафии колоний (а, в,д). еформированньк индуцибсльными ос1еогенными клегками-прсашсственниками (б,г, е). Окр. азуром П-эозином (а,в, д—ок. 10, об. 2,5; б,г,е—ок. К), об. 40)

Обнаруженные в биологических жидкостях индуцибельные клетки-предшественники по своим характеристикам: степени зависимости от возраста и линии животных, от условий культивирования — плотности экеплантированньгх клеток, наличия фидера (облучённых клеток алло-генного или сингеиного костного мозга), состава газовой среды, по морфологии и диаметру образованных ими колоний, морфогистохимичсски.м особенностям составляющих их элементов идентичны стромальным клеткам-предшественникам костного мозга. Особенно высока степень корреляции (более 0,8) между клопогонными клетками костного мозга и пери-

тонеального транссудата, перитонеального транссудата и экссудата крыс в отношении зависимости численности КОК-ф и значений ЭКО-ф от возраста животных и плотности эксплактированных клеток.

Анализ им му н о фенотипа клеток в монослойных культурах клеточных элементов перитонеального транссудата мышей, демонстрирует преобладание СЭ80+ клеток (63,4%) и высокий уровень экспрессии на поверхности клеток главного комплекса гистосовместимости 1 типа (83,3%), а также наличие некоторого количества СЭ34+ клеток и клеточных форм, имеющих маркёры моноцитов-макрофагов (20,0 и 21,8% соответственно).

В крови морских свинок, взятой из различных отделов сердечнососудистой системы, выявляется различное количество стромальных кле-ток-предшсственников. Самый высокий уровень числа КОК-ф обнаруживается в крови, оттекающей от кроветворных органов. Наибольшей проли-феративной активностью обладают клоногенные предшественники, выявленные в венозных отделах кровеносной системы.

Сравнительная характеристика детерминированных стромальных клеток-предшественников костного мозга и вндуцибсльных остеогенных клеток, выявленных в перитонеальном транссудате и экссудате крыс

Численность клеток-предшественников стромы костного мозга на орган (бедро крысы), выявленных во всех видах первичных монослойных культур, значительно превышает количество КОК-ф, обнаруженных в пе-ритонеальиом транссудате крыс (рис. 7 а).

Щ-— костный мозг |— транссудат —- экссудат

Рис. 7. Сравнительная характеристика количества стромальных клеток-

предшественников и эффективности их клоиированни во всех видах монослойных культур клеток костного мол а, перитониальноро транссудата и экссудата крыс различного возрасти (по весу)

По оси абсцисс — вШ животных (в г); по оси ординат — число КОК-ф и значений ЭКО-ф (10^)

При этом значения эффективности клонирования индуцибельных КОК-ф транссудата крыс вполне сопоставимы с ЭКО-ф детерминированных остеогенных стромальных вдеток-предшественников костного мозга (рис.7 б). В некоторых возрастных группах экспериментальных живот-

пых, а также при определённой плотности эксплантированных клеток (преимущественно, в адгезивных типах культур) уровень ЭКО-ф ют оно-генных клеток транссудата и экссудата оказывается даже выше эффективности клонирования КОК-ф костного мозга (рис. 7, 8).

При сравнении возрастных |ир весу животных) изменений количества КОК-ф и значений ЭКО-ф во всех видах культур в целом выявлено, что если в костном мозге с возрастом количество КОК-ф и эффективность их клонирования значительно снижается, то в перитонеальном транссудате, напротив, показатели числа КОК-ф и ЭКО-ф повышаются, хотя и не достигают максимальных величин, характеризующих клетки-предшественники костного мозга {рис. 7).

Плотность Реплантируемых клеток во всех видах культур в целом оказывает одинаковое влияние на эффект ивность клонирования как клеток стромы костного мозга, так и находящихся в перитонеальном транссудате клеток-предшественников— при превышении оптимальной плотности эксплантации снижаются оба показателя (рис. 8).

0.04- 04- 2 2.0- -1 6.0- го- 40- 0,04- 0,4- г 2,0- 4 в,О- 20- 40

О.г 1,5 4.0 12 40 Э20 О.г 1,6 4,0 1г 40 320

а 6

0— костный мозг Щ— транссудат ,': — экссудат

Рис. 8. Сравнительная характеристика эффективности клонирования стромальных клегок-мредшествеиников в монослойных культурах клеток костного мозга, ПёритониШпьного транссудата и экссудата крыс при различной плотности эксплантации 11о оси абсцисс — плотность реплантированных клеток (хН)"1 на см2); по оси ординат — значения ЭКО-ф (10'6)

При исследовании пер итон еального экссудата крыс, полученного после искусственно вызванного воспалительного процесса, отмечаются довольно высокие и сравнимые с костным мозгом показатели численности КОК-ф и эффективности их клонирования во всех видах культур (особенно у животных старшего возраста), которые в значительной степени коррелируют с возрастом животных, плотностью эксплантирОШаан ы х клеток, наличием и концентрацией фидера, временем адгезии и временем забора жидкости с момента начала развития воспалителения.

Экстракорпорально активированные лимфоциты: морфология, иммунофенотип, функциональные свойства, источники генерации и индукторы дифференцировки

В работе исследованы морфологические, электронно-микроскопические, иммунофенотипические и функциональные особенности лимфо-кин-активированных киллеров (ЛАК), генерированных под действие 1Ь-2 как из общепринятого источника — мононуклеарных клеток периферической крови человека, так и из спленоцитов больных раком желудка, МЛ плеврального и перитонеального экссудатов онкологических больных с метастатическим поражением серозных оболочек, клеток лейкоцитарных инфильтратов паратуморальных областей поражённой метастазами печени при колоректальном раке, и проведена их сравнительная характеристика.

Пиронинофильны е лимфоциты

Макрофаги Властные формы Гранулоциты

Рис. 9. Динамика клеточного состава культуральной взвеси мононуклеарных лейкоцитов крови человека, активированных интерлейкином-2 (%)

По оси абсцисс — сроки культивирования; по оси ординат — количество клеточных форм (%).

Данные обработаны путём компьютерного моделирования методом градиентного спуска Примечание. Мононуклеариые лейкоциты в данном эксперименте выделены на полипиокине

Результаты исследования свидетельствуют о том, что инкубация МЛ периферической крови здоровых доноров с 1Ь-2 в оптимальной концентрации (1000-2000 МЕ/мл) приводит к генерации активированных лимфоцитов, которые по морфологическим и функциональным характеристикам могут быть отнесены к ЛАК-клеткам. Цитологическое изучение мононуклеарных клеток при инкубации с 1Ь-2 выявило, что через 3 суток после активации в культуральной взвеси на фоне резкого уменьшения числа гранулярных лейкоцитов существенно возрастает количество лимфоцитов, которое продолжает прогрессивно увеличиваться до 10 суток (рис. 9).

В культуральной взвеси при фазовоконтрастной микроскопии выявляются колонии крупных клеток лимфоцитарного ряда. На 5-е сутки среди мононуклеаров преобладают бласты, пролимфоциты и пиронинофиль-ные лимфоциты, причём большое количество бластных форм и активиро-

36 часов

3 суток

5 суток

9 суток

10 суток

ванных лимфоцитов сохраняется в течение всего срока исследования. Зрелые лимфоциты подвергаются бласттрансформации и в процессе дифференцировки активируются, о чём свидетельствует накопление РНК в цитоплазме, проявляющееся в её яркой пиронинофилии, исчезающей после обработки РНК-зой, и в появлении многочисленных ШИК-позитивных гранул.

На электронных микрофотографиях большинство клеток культураль-ной взвеси характеризуются как большие гранулярные лимфоциты с хорошо развитыми синтетическими органоидами: митохондриями, гранулярной ЭПС, полисомами и пластинчатым комплексом Гольджи.

Таблица 4

Влияние интерлейкина-2 на иммунофенотип мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека

(Уровень экспрессии поверхностных кластеров детерминации, р±яр,%)

Маркер Время активации (сут.)

0 1 3 4 6 10

CD3 51,5+2,5 31,7±3,9 52,42+2,4 60,55±3,1 70,82+3,3 88,13±4,5

CD4 28,9±0,9 11,9±0,6* 1,65+0,1* 33,52+0,5 6,55±0,3* 52,74±2,0

CD8 37,6±1,2 22,9±0,1 2,52±0,1* 8,95±0,6* 20,24±0,2 35,51±0,9

CD16 16,7±1,1 89,8±3,9** 57,47±2,5** 12,65±0,3 34,68+1,5* 18,76±0,3

CD25 9,7+1,0 60,7±2,8** 38,56+2,2* 6,58±0,1 15,42+0,8 12,43±0,5

CD38 32,6±1,6 32,9±1,3 46,23+1,9 13,35+0,5* 44,85+2,1 12,81+0,3*

CD56 12,1+0,1 25,3±0,6* 82,54±2,4** 34,25+1,0* 24,8310,9* 17,13+0,5

CD57 23,5±1,2 0,9±0,1** 10,81+0,1 * 31,26+1,2 22,88±1,4 12,54+0,5*

CD58 37,4±2,1 79,4±2,7* 84,52±3,1* 84,64+2,9* 99,59±3,2** 26,56+1,1

CD83 2,4+0,1 3,1±0,1 24,82+0,1** 22,24+0,1** 28,53+2,3** 29,20+1,9**

HLA-DR 9,2+0,1 77,2+1,8** 40,00+2,0** 34,01+1,9** 55,11+2,5** 11,39±0Д

Примечание: Различия значимы по сравнению с данными при отсутствии активации'

* — прир <0,05; ** — при /><0,001

Наряду с ЛАК при активации мононуклеаров периферической крови JL-2 на 3-й сутки в культурах появляются в достаточном количестве (24,82+0,06%) и сохраняются в течение всего исследования СБ83+-клетки. Они имеют морфогистохимические (крупные размеры, эксцентрично расположенное ядро и вакуолизированную цитоплазму, содержащую пирони-нофильный и ШИК-положительный компоненты) и электронно-микроскопические (ветвящиеся отростки, многочисленные вакуоли и активированный секреторный аппарат) признаки зрелых дендритных клеток.

Особенности иммунофенотипа ЛАК в виде повышенной экспрессии активационных молекул CD38, CD25, молекул HLA-DR и молекул адгезии CD58 также отражают процесс активации лимфоцитов (см. табл. 4). Он продолжается в течение 6-9 суток, после чего, согласно данным исследования иммунофенотипа (преобладание в популяции ЛАК CD3+-клеток, снижение уровня экспрессии активационных антигенов и молекул

адгезии к 10-м суткам), происходит дифференцировка ЛЛК в зрелые Т-лимфоциты.

Результаты исследований показывают, что генерированные клетки обладают значительно более высокой (В 1,5-2,5 раза) кштлерной активностью, чем интактные МЛ, по отношению к линии опухолевых клеток К-562. Это подтверждает принадлежность полученных клеток к ЛАК, способным активно лизировагь клетки-мишени. Таким образом, исследования подтверждают целесообразность использования ЛАК на 3—5-е сутки инкубации применения в адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований, поскольку в данные сроки выявлено максимальное количество типичных ЛАК с высокой цитотоксической активностью, которые сохраняют пролиферативные способности в течение 10 Суток.

100 -| 80 -6040 -20 -

□ ФГА

□ ПФТ

□ ПАК

Контроль

0,01

0,1

Рис. 10. Влияние препарата профеталь, ллтер.1ешлша-2 и фитогемагглйШ-нина на цнтотоксическую активность монону кл еарн ых лейкоцитов здоровых доноров (н=15) но отношению к линии опухолевых клеток* К-562

По оси абсцисс — концентрация 11ФТ и ФГЛ (мкг/мл). По оси ор,1 шпат — цитотоксичностъ

МЛ по отношений к линии опухолевых клеток К 562 (%) и соотношении клетки-

мише ни/эффекторы 1:5

Исследована также возможность генерации активированных лимфоцитов периферической крови здоровых допоров с использованием препарата профеталь, содержащего в качестве основного компонента ч-АФП. Проведён сравнительный анализ действия данного препарата, 1Ь-2 и ФГА на функциональные свойства мопонуклеарных лейкоцитов в культурах. В результате экспериментов установлено, что по способности активировать МЛ крови человека с образованием клеток, характеризующихся высоким противоопухолевым цитотоксичееким и пролиферативным потенциалом, профеталь превышает такие классические активаторы и митогены, как 1Ь-2 и ФГА (см. рис. 10).

Эффект повышения цитотокс и ческой активности МЛ но отношению к опухолевым клеткам линии К-562 обусловлен индукцией под действием препарата профеталь одновременно и ЦТЛ (С08+), и НК-клеток (С016+, СГ>56+). Активация мононуклеаров ири ко инкубации с ПФТ подтвержда-

ется также усилением экспрессии на их поверхности дифференцировоч-ных, костимулирующих и адгезивных молекул (СБ38, СБ56, С058, НЬА-ОЯ) в 2-6 раз по сравнению с интактными МЛ и ЛАК-клетками (табл. 5).

Таблица 5

Влияние интерлейкина-2 и препарата профеталь на иммунофенотип моно-нуклеарных лейкоцитов периферической крови доноров (4-е с. инкубации) (Уровень экспрессии поверхностных кластеров детерминации, р±$р,%)

Маркёр МЛ доноров (группа 1) МЛ+ИЛ-2* (группа 2) МЛ+профеталь* (группа 3) Достоверность различий между группами

СОЗ 51,5±2,5 60,6±3,1 64,3±4,3 р3 и 1 < 0,05

С04 28,9±0,9 33,5±0,5 37,6±1,9 ръ и ! < 0,05

СЭ8 37,6+1,2 8,9±0,6 47,7±2,4 ръ и ! < 0,05; ръ и 2 < 0,001

СШ6 16,7+1,1 12,6±0,3 32,6±0,9 р3 и 1 < 0,05; ръ и г < 0,01

С025 9,7+1,0 6,6±0,1 10,1 ±0,7 ръ и 2 < 0,05

СОЭ8 32,6±1,6 13,4+0,5 61,3±3,4 Рз и 1 < 0,01; /?3 и 2 < 0,001

С056 12,1+0,1 34,3±1,0 61,0±2,9 Рз и 2 < 0,01; и ! < 0,001

СЭ57 23,5±1,3 31,3±1,2 23,7±1,0 рг и 2 < 0,05

С058 37,4+2,1 84,6±2,9 42,5±1,6 р3 и ! < 0,05; ръ и 2 < 0,01

НЬА-ОЯ 9,2+0,1 34,0+1,9 57,1±2,5 Рз и 2 < 0,01; рз и ] < 0,001

Примечание: Доза интерлейкина-2 — 1 ООО МЕ/мл, доза профеталя — 2,0 мкг/мл.

Выявлено, что и при культивировании в бессывороточных средах профеталь в указанных дозах также повышает уровень митотической активности мононуклеаров периферической крови доноров по сравнению со спонтанной пролиферацией МЛ на 55-58% и пролиферативной способностью ЛАК-клеток — на 37-39% (рис. 11).

Рис. II. Увеличение пролиферативной активности мононукпеарных лейкоцитов, инкубированных с препаратом профеталь, по сравнению с интактными МЛ и ЛАК

По оси абсцисс — концентрация препарата профеталь (в мкг/мл). По оси ординат — увеличение пролиферативной активности МЛ, стимулированных профеталем, по отношению к

интактным МЛ и ЛАК-клеткам в %. Примечание. Процент увеличения пролиферации ПФТ-активированных МЛ вычислены по соответствующей формуле. Данные обработаны компьютерным моделированием методом градиентного спуска

Эти данные могут рассматриваться как проявление бласттрансформа-ции зрелых лимфоцитов периферической крови под влиянием ПФТ, которая сопровождается также появлением в культурах С034+/С045+ клеток (до 28%). Мононуклеарные лейкоциты, активированные профеталем, дают двойное окрашивание моноклональными антителами к данным антигенам (рис. 12), чего не наблюдается в контрольных культурах МЛ.

бт 13ЭБ9 СУ 10 48

[497-1023)446 (27 7%)

"Чвт 514 70 СУ 4 96

[384-102Э]1612 (99 9%)

1С и

ЩП т* 1пЭ 1П* 1П° 1П1 1П2 1П3 1Г

10" 10' 10" 10 Р1.2-Н

СОЭ4

10' Ю2 Ю3 10*

п.1-н С045

Рис. 12. Гистограммы, отражающие экспрессию поверхностных молекул (кластеров детерминации) активированных профеталем (2 мкг/мл) мононуклеарных лейкоцитов периферической крови здоровых доноров (5-е сутки инкубации)

По оси ординат — количество анализированных клеток, по оси абсцисс — интенсивность

флюоресценции. С034/С045 — антигены при двойном окрашивании Р1ТС и РЕ

При микроскопическом исследовании в культурах МЛ периферической крови, коинкубированных с препаратом профеталь в бессывороточной среде, начиная с 3-х суток выявляются кластеры крупных клеток, не прилипающих к стеклу. Обработка активированных профеталем мононуклеарных лейкоцитов магнитными шариками, нагруженными моноклональными антителами к С034, приводит к появлению в культурах розеток, в центре которых выявляются клетки типа лимфоцитов и бластных форм (рис. 13 а).

Морфогистохимические и электронно-микроскопические исследования МЛ культуральной взвеси показывают, что в культурах, активированных ПФТ, преобладают бластные формы, характеризующиеся высоким содержанием РНК и синтетических органоидов (рис. 13 б)., что является показателем повышенной функциональной активности клеток Высокий уровень пролиферативного потенциала МЛ подтверждается наличием большого числа клеток, находящихся в состоянии деления.

При исследовании цитокинового уровня в супернатантах культуры активированных профеталем мононуклеарных лейкоцитов селезёнки мышей через 24 часа инкубации количество 1Ь-1р, 1Ь-6, 1Ь-10, 1Ь-12 значительно превышает контрольный уровень и в 2-6 раз — уровень продукции данных цитокинов ЛАК-клетками.

Таким образом, с помощью морфологических и функциональных методов показано, что под влиянием в препарата профеталь, содержащего в

качестве основного компонента человеческий а-фстопротеин, в выявленных эффективных дозах (от 0,01 до 10,0 мкг/мл) и использованных в опытах условиях культивирования ex vivo может происходить стимуляция ци-тотоксической активности мононуклеарных лейкоцитов, дифференциров-ка НКТ-клеток, повышенная выработка цитокинов, пролиферация и бла-сттрансф ормация МЛ периферической крови с образованием CD34 /CD45 гемопоэтических клеток-предшественников. Это согласуется с данными появившихся в последние пятнадцать лет работ, которые подтвердили, что АФП служит в качестве двойного регулятора роста, способного как к ингибированию, так и усилению его [Mizejewski G.J. et al., 1990].

Рис. 13. Культуры мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, инкубированных с профегалем (5-е сутки)

а — микрофотография клеток, образующих розетки с магнитными шариками, меченными антителами к С 1)34, окр. азуром И-эозином, (ок. 10, об. 100);

5 — электронная микрофотография активированного лимфоцита но взвеси, увел. 3000

Следовательно, препарат профеталь является весьма активным имму-номодулирующим фактором, что свидетельствуют о возможности использования его свойств для экстракорпоральной генерации активированных лимфоцитов, которые могут применяться в иммунотерапии злокачественных новообразований и инфекционных заболеваний наряду с традиционными ЛАК,

Морфологическая, иммунофенотнпическая н функциональная характеристика интактных и активированных мононуклеарных лейкоцитов экссудатов и клеток лейкоцитарных инфильтратов печени онкологических больных и мышей с привитой опухолью

Важное значение для оценки эффективности лечения и прогноза онкологического заболевания с метастатическим процессом в серозные оболочки имеет количественный и качественный состав лейкоцитов экссудата. Обычно в метастатическом плевральном экссудате больных содержится небольшое количество зрелых {неактивированных) форм лимфоцитов, которых недостаточно для лизиса значительного числа опухолевых клеток.

При анализе иммунофенотипа МНК экссудатов выявляется экспрессия маркёров зрелых лимфоцитов CD3, но отсутствует экспрессия акти-вационных молекул CD4, CD 16, CD25, CD56, CD57, HLA-DR, обнаруживается невысокая экспрессия антигенов адгезии CD58.

Мониторинг экстракорпоральной генерации ЛАК из мононуклеарных клеток плеврального экссудата онкологических больных показал, что при активации IL-2 на 3-й сутки происходит пролиферация лимфоцитов, появляются лимфоидные элементы различной степени зрелости, регистрируются единичные митозы, возрастает число крупных активированных лимфоцитов, пролимфоцитов, появляются клетки типа иммунобластов. На 5-е сутки коинкубации мононуклеаров с IL-2 в культурах повышается количество митозов, число бластных форм увеличивается в 20 раз, пролимфоцитов — в 5 и активированных пиронинофильных лимфоцитов — в 3 раза. Цитоплазма и ядрышки данных клеток, принадлежащих, по-видимому, к популяции ЛАК, имеют ярко пиронинофильную окраску, исчезающую при обработке РНК-зой, что свидетельствует о повышенном содержании в клетках РНК, и, следовательно, об их активной синтетической функции.

Таблица 6

Цитотоксическая и НК-активность мононуклеарных лейкоцитов печени и периферической крови онкологических больных с метастазами в печень (p±sp,%)

№ Источник МНК К-562

1 Интактный участок печени 83,0±22,0

2 Паратуморальная область 90,0±24,0

3 Кровь больных 43,0+14,0

4 Донорская кровь 37,0±12,0

различии между группами

р2 > 0,05 />з,4 < 0,05 Pi >0,05 рЗ А < 0,05

ри2 < 0,05; Р4 > 0,05

/>1,2 <0,05 ръ > 0,05

Аутологичные опухолевые клетки

25,0±9,8

62,0±16,0

11,0±3,3

19,0±4,2

Достоверность различий между группами р2,ъ < 0,05 /?4 > 0,05 Pi < 0,05 Рз.4<0,01 Pi < 0,05 р2 < 0,01 р4 > 0,05 Ри > °.05 р2 < 0,01

Примечание: Соотношение клетки мишени/эффекторы 1:5.

Спонтанная цитотоксическая активность лимфоцитов плеврального экссудата по отношению к линии эритробластного лейкоза человека К-562 составляет 45%, а при их инкубации с YL-2 повышается до 90%. Ко-инкубация лимфоцитов с IL-2 приводит к увеличению активированных форм лимфоцитов CD25+, CD56+, HLA-DR+ и повышению уровня экспрессии адгезивных молекул CD57, CD58. Удается установить, что около 70% лимфоцитов составляют Т-клетки, среди которых 35% относятся к CD8+ (могут представлять цитотоксическую субпопуляцию), 25% клеток являются натуральными киллерами (CD16+' CD56+), которые играют важную роль в лизисе опухолевых клеток. Однако уровень экспрессии по-

верхностных антигенов популяции JIAK, полученной из MJT плеврального экссудата онкологических больных, не достигает уровня экспрессии ЛАК, генерированных из периферической крови здоровых доноров.

Мононуклеарные лейкоциты печени онкологических больных, выделенные из параметастатических участков, по иммунологическому фенотипу (повышенный уровень экспрессии молекул CD38, CD57' CD58) существенно отличаются от клеток лейкоцитарных инфильтратов интактных областей и МЛ периферической крови тех же больных и могут быть отнесены к популяции НКТ-клеток, так как являясь преимущественно CD3+ клетками, активно экепрессируюг антигены натуральных киллеровю Данные клетки имеют наиболее высокий уровнь НК-активности и обладают способностью лизировать аутологичные опухолевые клетки (см. табл. 6).

Данные клетки представлены молодыми и активированными (пиро-нинофильными) формами лимфоидного ряда. Под действием IL-2 они могут дифференцироваться в ЛАК-клетки. Генерированные из этого источника ЛАК-клетки обладают более высоким уровнем НК-активности, чем ЛАК, полученные из МЛ интактных участков печени и МНПК онкологических больных и здоровых доноров. В популяции ЛАК, генерированных из НКТ печени, преобладают клетки, экспрессирующие маркёры НК-клеток, молекулы адгезии и антигены активации (табл. 7).

Таблица 7

Иммунофенотип активированных IL-2 мононуклеарных лейкоцитов, выделенных из печени и крови онкологических больных

(Уровень экспрессии антигенов, %)

Маркёр Интактный Паратуморальная Периферическая Достоверность

участок печени область печени кровь различии между гр.

CD3 60,5±14,0 79,9±24,0 76,9±18,0 ри2 > 0,05; pi.3 > 0,05; р2, з > 0,05

CD4 9,1 ±1,7 10,4+4,4 36,6+13,0 ри2 > 0,05; ри < 0,05; />2,з < 0,05

CD8 CD16 CD25 42,2±4,7 10,4±4,2 5,7±1,7 50,9±12,0 12,2±1,1 6,6±1,4 35,0±12,0 19,1 ±6,0 4,5±1,6 р1Л > 0,05; риз > 0,05; Р2,з > 0,05

CD38 42,2±12,0 35,9±4,3 13,8±2,7 Pi 2 > 0,05; pi 3 < 0,05; Р2,з < 0,05

CD57 31,9±5,2 37,1±4,9 24,3±3,4 р, 2 > 0,05; р1 з > 0,05; Ли >0,05

CD58 24,0±9,0 71,5+19,0 15,6±3,8 ри2 < 0,05; pltз > 0,05; р2,ъ > 0,01

Цитоиммунохимические исследования лейкоцитарных инфильтратов на гистологических срезах поражённой метастазами печени онкологических больных с помощью моноклональных антител (МкАТ) показали наличие большого количества клеток, экспрессирующих на своей поверхно-

сти маркёры гранулоцитов (CD 15), клеток мезенхимного происхождения (WIM), Т-лимфоцитов (CD3), макрофагов (CD68), предшественников Т и B-лимфоцитов (TdT), лимфоцитов и макрофагов (OLA), маркёра пролиферации — KÍ67.

При цитоиммунохимическом исследовании печени мышей, заражённых опухолью САО-1, в лейкоцитарных инфильтратах параметастатиче-ских областей выявляется значительно большее количество CD15+, WIM+, CD3+, CD68+, TdT+, OLA+, KÍ67+ клеток, чем в печени онкологических больных, а также выявляются клетки, экспрессирующие стволовоклеточ-ные антигены (CD 10 — CALLA common), рап-В-маркёры — CD20.

MJ1, выделенные из печени мышей после имплантации опухолевых клеток рака яичников СаО-1 в паренхиму органа, проявляют в более высокую степень НК-активности (в 2-2,5 раза) и цитотоксического потенциала по отношению к аутологичным опухолевым клеткам, чем лимфоциты селезёнки. В большинстве своём они экспрессируют CD3 и НК-маркёры.

Следовательно, мононуклеарные лейкоциты, инфильтрирующие пораженную опухолевым процессом печень и циркулирующие в экссудатах онкологических больных могут дифференцироваться в НКТ, а при стимуляции IL-2 — в активные ЛАК-клетки, которые играют важную роль в противоопухолевом иммунитете. Этот может быть использовано для разработки методов локорегионарной адъювантной иммунотерапии метастазов в печень и серозные оболочки.

Источники генерации, индукторы созревания, морфологические, иммунофенотипические и функциональные особенности антигенпрезентирующих дендритных клеток

При стандартных условиях культивирования с добавлением коктейля цитокинов: гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, интерлейкина-4 и фактора некроза опухолей в течение 7 суток из моноцитов/макрофагов крови или стволовых клеток костного мозга генерируются антигенпрезентирующие дендритные клетки с эксцентрично расположенным ядром, характерными ветвящимися отростками, выраженной вакуолизацией цитоплазмы, развитым комплексом Гольджи и ри-босомальным аппаратом (см.рис. 14).

Морфологические и фенотипические признаки свидетельствуют об активности белоксинезирующего и лизомального аппаратов, высокой вероятности межклеточных контактов за счет развитой системы цитоплазматиче-ских отростков и выраженной экспрессии активационных антигенов, что позволяет отнести рассматриваемые клетки к субпопуляции зрелых ДК. Дендритные клетки, генерированные из данных источников демонстрируют также высокий уровень экспрессии молекул главного комплекса гисто-совместимости I и II классов и маркеры костимулирующих антигенов.

а 6

Рис. 14, Зрелые дендритные клетки, генерированные из моноцитов периферической крови здоровых доноров на 9-е сутки инкубации (3-11 сутки после пульсации TNF-a):

а — микрофотография дендритной клетки, прилипшей к дну культу рады юг о сосуда.

Окр. фуксином Циля (ок. 10, об. 90); б — электронная микрофотография дендритной клетки is культуральной взвеси, увел, 3000,

Результаты исследований свидетельствуют о возможности получения зрелых ДК также из стволовых клеток эмбриональной печени мышей с использованием в качестве индукторов созревания TNF-a и препарата профеталь, которые почти в одинаковой степени оказывают влияние па процесс формирования зрелых ДК.

Генерированные дендритные клетки имеют типичные морфологические и электронно-микроскопические характеристики, отражающие повышенные синтетические функции, и иммунофенотип (CD34-, CD38+, CD40+, CD80+, CD86+, MHCI+, MHCII+, F4/80-+). В мазках культуральной взвеси они выявляются в виде крупных клеток овальной формы с эксцентрично расположенным ядром и пиронинофильными ядрышками, вакуолизированной цитоплазмой, имеющей ЩИК-позитивный компонент и ярко пиронинофильную окраску.

Обнаружена способность таких ДК стимулировать пролиферацию син-генных мононуклеарных лейкоцитов. Антигенная стимуляция ДК, полученных из клеток-предшественников эмбриональной печени мышей, лиза-том опухолевых клеток линии YAC-1 приводит к дифференцировке in vitro иммунных лимфоцитов, обладающих высокой питогоксической активностью по отношению к клеткам данной опухолевой линии. Эти факты свидетельствует о возможности использования генерированных из стволовых клеток эмбриональной печени дендритных клеток для разработки ДК-вакцины с целью применения в биотерапии онкологических заболеваний.

Сравнительное изучение использования в качестве индукторов созревания дендритных клеток, полученных из клеток-предшественников костного мозга мышей, профсталя, иммуномодуляторов микробного происхождения (ЛГ1С Klepsiella pneumoniae) и в качестве контроля —TNF-a показывает, что эти факторы в равной степени приводят к созреванию ДК, в процессе которого изменяется их иммунофенотип. В культурах увеличивается

количество клеток, экспрессирующих на своей поверхности активацион-ные, кости мул ирующие молекулы и маркёры гистосовм ести м ости 1 и II типов.

Генерированные данным образом клетки обладают всеми морфологическими, им му н о феноти п и чески м и и функциональными признаками зрелых ДК, лишь незначительными нюансами отличаясь от ДК, полученных из моноцитов/макрофагов периферической крови человека и клеток-предшественников эмбриональной печени мышей (рис. 15).

е г

Рис. 13. Дендритные клетки, генерированные из клеток-предшественников костного мол а мышей на 9-е сутки инкубации (3-и сутки после пульсации ХШ^-а):

а, 6 — миЕсрофотографии дендритных клетоквмазках культуральной взвеси: а—окр. Шифф-кодаой кислотой но Шшадгшу (ок. 10, об. 100); б—окр, Шифф-йояной кислотой '.Й Шабадашу после контрольной обработки амилазой (ок. !0, об. 90); в, г—электронные микрофотографии зрелых ДК в культуральной взвеси; в—ультрасгрушура дендритной клетки, увел. 3000; г— палисады и гранулярная энцошшматическая сеть в цитоплазме зрелой дендритной клетки, увел. 5(XX).

Зрелые дендритные клетки имеют более высокую концентрацию ШИК-положительпого компонента в цитоплазме, уровень которой снижается и почти выравнивается в клетках разной степени зрелости после обработки амилазой, что свидетельствует о повышенном содержании гликогена в зрелых ДК Iю сравнению с незрелыми формами (см. рис. 15 а, б). Электронные микрофотографии демонстрируют высокий уровень синтетических процессов в зрелых ДК, генерированных из клеток-предшественников костног о мозга мышей (рис, 16 г).

При созревании ДК уменьшается их фагоцитарная активность, а в культуральной среде достоверно повышается уровень содержания цито-кинов, регулирующих дифференцировку лимфоцитов (1Ь-1|3, 1Ь-6, 1Ь-!2,

ЮТ-у, Т№-а), и снижается количество цитокинов, действующих на диф-ференцировку самих ДК (1Ь-4), уровень 1Ь-2, 1Ь-10 остаётся без изменений (табл. 8).

Таблица 8

Индукция цитокинов дендритными клетками, генерированными из клеток-предшественников костного мозга мышей (пкг/мл)

ДК lL-lß IL-2 IL-4 IL-6 IL-10 IL-12 TNF-a IFN-Y

1 (езре- 1,03 13,6 44,9 90.9 101.4 5,0 77,2 ¡8,4

лые ±0,1 ±1,5 ±5,3 ±4,8 ±5,9 ±0,03 ±5,6 ±2,1

Зрелые 26,6 13,6 19,1 566,2 109,6 152,1 733,2 159,8

±1,7 ±1,8* ±10.3** ±6,2 ±7,2** ±12,8** ±6,4**

Примечание: Достоверность различий между группами: * —р<0,05; *« —/кО,СЮ1.

Индуктор созревания ДК — ЛИС К. рпеитомае (0,123 мкг/мл).

Зрелые дендритные клетки, стимулированные исследуемыми препаратами, способны повышать цитотоксическую активность лимфоцитов после обработки ли зато м клеток Опухоли Эрлиха и мышиной лимф о мы УАС-1 и усиливать пролиферативные способности сингенных мононук-леарных лейкоцитов.

в г

Рис. 16. Зрелые дендритные клетки, генерированные из моноцитов периферической крови здоровых доноров на 9-е сутки инкубации (3-н сутки после пульсации профеталем)

д, б — микрофотографии лимфоцитов и зрелых дендритных клеток в мазках культуралыюй взвеси: а — окр. мегилоиым зеленым-пиронином но Браще (ок. 10, г>б. 100); б— окр. азуром Ii-эозином (ок. 10, об. 90); в, г—электронные микрофотографии лимфоцитов и зрелых дендрет-ных клеток в культуральной взвеси: в— контакты двух дендритных клеток и лимфоцита, увел. 1000; г—дендритная клетка при обработке препарата по Бсриару: высоко контраст и ронянные участки цитоплазмы —области повышенной концентрации РНК, увел.3000.

Дендритные клетки, полученные в опытах из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови здоровых доноров при активации их препаратом профеталь, имеют иммунофенотипические признаки зрелых ДК: высокий уровень маркёров антигенного представления (CDla), костиму-лирующих молекул (CD80), адгезивных молекул (CD 11с) и, наконец, основной показатель зрелости ДК — высокий уровень экспрессии антигена терминальной дифференцировки CD83. При этом показатели экспрессии данных кластеров детерминации не ниже, чем у клеток, генерированных при использовании общепринятого индуктора созревания ДК —TNF-a и липополисахаридов бактериального происхождения.

Данные морфологических исследований соответствуют функциональным и иммунофенотипическим критериям, характеризующим клетки, полученные в культурах при действии профеталя, как зрелые ДК (рис. 16). Электронномикроскопические исследования полученных дендритных клеток выявляют типичные ДК с многочисленными отростками, теснейшим образом контактирующими с клетками лимфоидного ряда (рис. 16 б, в). Эксцентрично расположенные ядра содержат хроматин, конденсирующийся вблизи ядерной мембраны. В цитоплазме и крупных ядрышках и при окраске по Браше, и при электронно-гистохимической обработке по Берна-ру определяется большое количество РНК (рис. 16 а, г).

Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о возможности получения зрелых ДК из различных источников (моноциты периферической крови, клетки-предшественники эмбриональной печени и костного мозга взрослых животных) при использовании в качестве индуктора созревания как общепринятых цитокинов (фактора некроза опухолей), так и бактериальных липополисахаридных комплексов и иммуномо-дулятора, содержащего человеческий a-фетопротеин (препарат профеталь). Все виды ДК, генерированные из разных источников и с применением в качестве индукторов созревания различных цитокинов и иммуно-модуляторов, имеют морфологические и иммунофенотипические признаки зрелых ДК, обладают способностью усиливать пролиферативную и цитотоксическую способность сингенных мононуклеарных лейкоцитов в культурах. Данные факты свидетельствует о возможности использования генерируемых изученными способами дендритных клеток для разработки ДК-вакцины с целью применения в биотерапии онкологических и инфекционных заболеваний.

Итак, полученные в работе результаты свидетельствуют о том, что под влиянием различных регуляторных факторов: ростовых, колониестиму-лирующих, а также бактериальных антигенов, липополисахаридных комплексов бактериального происхождения, цитокинов, иммуномодулирую-щего препарата профеталь, содержащего в своём составе человеческий а-фетопротеин, — стромальные клетки-предшественники и связанные с

ними иммунокомпетентные клетки способны изменять свои морфологические, иммунофенотипические и функциональные свойства. Таким образом, путём подбора оптимальных доз эффективно действующих имму-номодулирующих препаратов ex vivo можно вызывать направленную дифференцировку клеток с формированием клеточных форм, обладающих различно выраженной биологической активностью. Изученные способы генерации клеток с заданными свойствами могут быть использованы для разработки методов, применяемых в адоптивной иммуноклеточ-ной терапии патологических состояний разнообразного генеза.

Выводы

1. Стромальные клетки-предшественники костного мозга, так же как и колониеобразующие клетки, выявленные в биологических жидкостях, для эффективного проявления своих пролиферативных и клоногенных свойств требуют оптимальных условий культивирования: определённой плотности эксплантации (не более 2х105/см2 дна культурального сосуда), времени адгезии (не менее 2-х часов), наличия фидера (облучённых гемо-поэтических клеток).

2. В ходе постнатального онтогенеза происходит снижение численности и эффективности клонирования стромальных клеток-предшественников в кроветворных и лимфоидных органах у мышей, морских свинок и крыс. Данные изменения имеют видовые и органные особенности.

3. Существенное влияние на пролиферативные и клоногенные свойства стромальных клеток-предшественников в культурах клеток костного мозга и селезёнки (повышение — при введении лабораторным животным и снижение — при добавлении in vitro) оказывает препарат профеталь, содержащий в качестве основного компонента человеческий ct-фетопро-теин. Вакцинация антигенами стрептококка приводит к замедлению ос-сицификации костной ткани гетеротопных трансплантатов, снижению содержания в них колониеобразующих клеток-предшественников и эффективности их клонирования.

4. Клоногенные клетки-предшественники, выявленные в биологических жидкостях (крови, плевральном, перикардиальном и перитонеаль-ном транссудатах и перитонеальном экссудате), по многим показателям (уровню эффективности клонирования, зависимости её от возраста и вида лабораторных животных, плотности эксплантации, по морфологическим характеристикам формируемых колоний, иммунофенотипу и морфоги-стохимии составляющих их элементов) сопоставимы со стромальными клетками-предшественниками костного мозга.

5. Препарат профеталь оказывает стимулирующее влияние на кил-лерную активность и пролиферативный потенциал мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека в культурах, причём более значительное, чем классические митогены — фитогемагглютинин и интер-

лейкин-2. Вызванная профеталем реакция бластгрансформации лимфоцитов сопровождается образованием CD34+/CD45+ гемопоэтических кле-ток-предшественннков. Максимальное количество активированных лимфоцитов с высокой цитотоксической активностью достигается на 3-5-е сутки коинкубации с иммуномодуляторами.

6. Мононуклеарные лейкоциты печени онкологических больных, выделенные из параметастатических участков, обладая высокой НК-активностью, по своему иммунологическому фенотипу (повышенный уровень экспрессии CD38, CD57, CD58) и морфологии (преобладание молодых и активированных форм лимфоцитов) существенно отличаются от мононуклеарных лейкоцитов периферической крови этих же больных и могут быть отнесены к популяции натуральных киллеров Т-клеток (являясь преимущественно CD3+ лимфоцитами, активно экспрессируют антигены натуральных киллеров).

7. Дендритные клетки, генерированные из различных источников: моноцитов крови человека, прогениторных клеток печени эмбрионов и клеток-предшественников костного мозга взрослых мышей линии СБА, — обладают сходными морфологическими, иммунофенотипическими (высокий уровень экспрессии МНС I и II типа, CD40, CD58, CD80, CD86) и функциональными характеристиками (фагоцитарными и антигенпре-зентирующими свойствами). Их созревание может быть индуцировано как с использованием фактора некроза опухолей а, так и бактериальных липополисахаридных комплексов и препарата профеталь. Полученные зрелые дендритные клетки характеризуются высоким уровнем экспрессии антигена терминальной дифференцировки CD83, низкой фагоцитарной активностью и продуцируют спектр цитокинов, регулирующих диффе-ренцировку лимфоцитов (IL-ip, IL-6, IL-12, INF-y, TNF-a).

8. Инкубация лимфоцитов со зрелыми дендритными клетками, генерированными из клеток-предшественников эмбриональной печени и костного мозга взрослых мышей линии СВА и нагруженными опухолевыми антигенами, приводит к дифференцировке цитотоксических лимфоцитов, обладающих высокой избирательной киллерной активностью, в основном, по отношению к тем опухолевым линиям, из которых были получены лизаты для обработки дендритных клеток.

Практические рекомендации

При разработке методов подготовки стромальных стволовых клеток для использования в заместительной биотерапии необходимо иметь в виду, что культивирование стромальных костномозговых клеток-предшественников целесообразно проводить в присутствии тромбоцитов без примеси гемопоэтических клеток (последние могут вырабатывать ростовые факторы, ингибирующие рост как КОК-ф, так и их культураль-ных потомков). Ингибирующий эффект нестромальных костномозговых клеток на рост КОК-ф наблюдается в присутствии эмбриональной телячьей сыворотки, которая обычно является составной частью соответствующей культуральной среды, поэтому при культивировании популяций костномозговых клеток желательно добавлять ауто- или гетерологические сыворотки взрослых животных. В противном случае пролиферативные свойства части КОК-ф и их культуральных потомков могут оказаться нереализованными вследствие проявляющегося эффекта ингибиции роста этих клеток.

Как показали наши исследования на модели гетеротопных трансплантатов, далеко не все КОК-ф, численность которых увеличивается при введении антигенов, ответственны за трансплантабельность стромальной ткани при ее гетеротопной пересадке. Следовательно, тот факт, что предназначенный для пересадки костный мозг обогащен стромальными клетками-предшественниками, ещё не свидетельствует о возможности более успешного формирования трансплантата. Эти особенности необходимо учитывать при разработке методов подготовки стволовых стромальных клеток для трансплантации и каждый способ «разогнать» используемый для этой цели пул стромальных клеток-предшественников должен быть оценен с позиций возможности увеличения популяции КОК-ф, ответственных за трансплантабельность.

Целесообразность использования лимфокин-активированных киллеров на 3-5-е сутки инкубации для адоптивной иммунотерапии подтверждается полученными данными о динамике их дифференцировки, поскольку в данные сроки в культурах выявлено максимальное количество типичных ЛАК с высокой цитотоксической активностью, которые сохраняют свои пролиферативные способности в течение 10 суток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в рекомендованных ВАК рецензируемых журналах:

1. Лебединская О.В., Кочурова И.А. Морфология колоний стромальных фибробластов красного костного мозга крыс // Пермский медицинский журнал. —1997. — T. XIV.

— № 1— С. 46-51.

2. Лебединская О.В. Клетки-предшественники стромальных фибробластов, циркулирующие в крови // Пермский медицинский журнал. —1998. — T. XV. — № 4.-

С. 9-13.

3. Лебединская О.В., Оленев В.А. Исследование эффективности колониеобразования методом компьютерного моделирования // Пермский медицинский журнал. — 1999.

— T.XVL—№1. —С. 11-13.

4. Лебединская О.В. Клоногенные предшественники стромальных фибробластов, циркулирующие в биологических жидкостях // Российские морфологические ведомости. ВРИО АГЭ.— Москва — 1999. — № 1-2. — с. 90-92.

5. Халтурина Е.О., Лебединская О.В., Шубина И.Ж., Доненко Ф.В., Райхлин Н.Т., Киселевский М.В. Морфологические особенности и иммунофенотип дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови человека // Морфология. — 2004.

— №3. —С. 89-92.

6. Ахматова Н.К., Лебединская О.В., Киселевский М.В. Морфологические и фенотипи-ческие особенности дендритных клеток, генерированных из клеток эмбриональной печени мышей // Морфологические ведомости. — 2004. — № 3^4. — С. 41-45.

7. Киселевский М.В., Лебединская О.В. Адоптивная иммунотерапия злокачественных новообразований с использованием лимфокин-акгивированных киллеров и дендритных клеток// Пермский медицинский журнал. — 2004. — № 3. — С. 116-127.

8. Вершинина М.Ю., Халтурина Е.О., Доненко Ф.В., Пагютко Ю.И., Забежинский Д.А., Титов К.С., Кузовлев E.H., Лебединская О.В., Воробьёв A.A., Киселевский М.В. Сравнительная функциональная и иммунофенотипическая характеристики лимфокин активированных киллеров (ЛАК), полученных из натуральных киллеров Т-(НКТ)-клеток у больных с опухолевым поражением печени // Вестник РАМН. — 2004. — №12, —С. 32-36.

9. Лебединская О.В., Горская Ю.Ф., Шуклина Е.Ю., Лациник Н.В., Нестеренко В.Г. Возрастные изменения количества стромальных клеток-предшественников в костном мозге животных // Морфология. — 2004. — № 6 — С. 46-49.

10. Лебединская О.В., Халтурина Е.О., Ахматова Н.К., Шубина И.Ж., Леонова О.Г., По-пенко В.И., Мелехин C.B., Киселевский М.В. Морфологические и функциональные особенности лимфокин-акгивированных киллеров, полученных из мононуклеарных клеток периферической крови человека // Морфология. — 2005. — № 1. — С. 28-32.

11. Черешнев В.А., Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Родионов С.Ю, Лебединская Е.А., Гаврилова Т.В., Карамзин A.M., Киселевский М.В.Получение активированных лимфоцитов из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека под воздействием альфа-фетопротеина // Сибирский онкологический журнал. — 2005. — № 1.

— С. 40-46.

12. Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Шубина И.Ж., Киселевский М.В.Функциональная активность и морфологическая характеристика лимфокин-акгивированных киллеров // Пермский медицинский журнал. — 2005. — № 1. — С. 6-12.

13. Лебединская О.В., Горская Ю.Ф., Данилова Т. А., Нестеренко В.Г. Морфо-гистохимическая характеристика трансплантатов и колоний стромальных клеток-предшественников (КОК-Ф) в культурах гетеротопных трансплантатов костного мозга мышей, иммунизированных антигенами стрептококка группы А // Морфологические ведомости. — 2005. — № 1-2. — С. 99-103.

14. Горская Ю.Ф., Нестеренко В.Г., Лебединская О.В. Потребность культуральных потомков стромальных костномозговых клеток-предшественников (КОК-Ф) кроликов в

тромбоцитарных ростовых факторах // Клеточные технологии в биологии и медицине.

— 2005,—№2, —С. 113-116.

15. Лебединская О.В., Горская Ю.Ф., Шуклина Е.Ю., Лациник Н.В., Нестеренко В.Г. Анализ изменений количества сгромальных клеток-предшественников в тимусе и селезёнке животных различных возрастных групп // Морфология. — 2005. — Т. 127. — №3, — С. 41-М.

16. Горская Ю.Ф., Данилова Т.А., Лебединская О.В., Нестеренко В.Г. Численность сгромальных клеток-предшественников (КОК-Ф) в гетеротопных трансплантатах костного мозга мышей, иммунизированных антигенами стрептококка группы АИ Бюлл. экс-пер. биол. и мед. — 2005. — Т. 140. — № 7. — С. 77-80.

17. Ахматова Н.К., Лебединская О.В., Киселевский М.В., Амоджолов B.C., Доненко Ф.В., Семёнов Б.Ф. Особенности иммунофенотипа и функциональной активности дендритных клеток, генерированных из клеток эмбриональной печени мышей // Молекулярная медицина. — 2005. — № 2. — С. 51-57.

18. Черешнев В.А., Лебединская О.В., Родионов С.Ю., Ахматова Н.К., Шубина И.Ж., Лебединская Е.А., Гаврилова Т.В., Киселевский М.В. Влияние препарата «Профе-таль» на функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов и дендритных клеток человека// Медицинская иммунология. — 2005. — Т. 7. — № 5-6. — С. 525534.

19. Лебединская О.В., Патютко Ю.И., Забежинский Д.А., Ахматова Н.К., Шубина И.Ж., Вершинина М.Ю., Киселевский М.В. Морфофункциональные особенности натуральных киллеров Т-клеток (НКТ) у больных с опухолевыми поражениями печени // Сибирский онкологический журнал. — 2005. — № 3. — С. 24—31.

20. Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Киселевский М.В., Лебединская Е.А. Функциональная активность дендритных клеток, генерированных из клеток эмбриональной печени мышей // Пермский медицинский журнал. — 2005. — Т. 2. — № 2. — С. 1321.

21. Лебединская О.В, Ахматова Н.К., Мелехин C.B., Верескунов A.M., Лебединская Е.А., Киселевский М.В. Влияние лектина клещевины на морфологию лимфоидных органов лабораторных животных и функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов крови человека // Морфологические ведомости. — 2005 — № 3-4. — С. 53-58.

22. Лебединская О.В., Черешнев В.А., Гаврилова Т.В., Лебединская Е.А., Родионов С.Ю., Шубина И.Ж., Ахматова Н.К., Киселевский М.В. Сравнительнаый анализ возможности экстракорпоральной генерации активированных лимфоцитов периферической крови человека с применением препарата «Профеталь» и интерлейкина-2 // Вестник Уральской медицинской академической науки — 2005. — № 4. — С. 52-58.

23. Ахматова Н.К., Лебединская О.В., Киселевский М.В., Макашин А.И., Семенова И.Б., Семенов Б.Ф. Генерация дендритных клеток с использованием в качестве индуктора созревания иммуномодуляторов бактериального происхождения // ЖМЭИ. — 2005.

— №5. —С. 57-62.

24. Ахматова Н.К., Лебединская О.В., Киселевский М.В, Макашин А.И., Семенова И.Б., Курбатова Е.А., Егорова Н.Б., Семенов Б.Ф. Влияние дендритных клеток, генерированных при помощи иммуномодуляторов микробного происхождения, на пролифера-тивную и цитотоксическую активность лимфоцитов // ЖМЭИ. — 2005. — № 6. — С. 58-62.

25. Ахматова Н.К., Кузовлев E.H., Лебединская О.В., Доненко Ф.В., Шубина И.Ж., Макашин А.И., Киселевский М.В. Цитотоксическая активность натуральных киллеров Т-(НКТ)-клеток у мышей с опухолевым поражением печени // Бюлл. эксп. биол. и мед.

— 2006, —Т. 141,—№1,—С. 76-79.

26. Ахматова Н.К., Лебединская О.В., Ахматов А.Т., Лебединская Е.А., Киселевский М.В. Динамика экспрессии поверхностных молекул лимфоцитов под воздействием бактериального иммуномодулятора// Вестник Уральской медицинской академической науки.— 2006.—№ 1.—С. 10-13.

27. Ахматова Н.К., Семёнова И.Б., Курбатова Е.А., Лебединская О.В., Егорова Н.Б., Шубина И.Ж., Киселевский М.В., Семёнов Б.Ф. Фагоцитарная активность дендритных клеток, генерированных из клеток костного мозга мышей // Вестник Уральской медицинской академической науки.— 2006.—№ 1. — С. 14—18.

28. Черешнев В.А., Лебединская О.В., Родионов С.Ю., Ахматова Н.К., Шубина И.Ж., Лебединская Е.А., Гаврилова Т.В., Киселевский М.В. Иммуномодулирующее действие препарата «Профеталь» на мононуклеарные лейкоциты периферической крови человека и генерированные из них дендритные клетки // Иммунология. — 2006. — Т. 27. — №3. —С. 132-141.

29. Лебединская О.В., Велижева Н.П., Доненко Ф.В., Черешнев В.А., Родионов С.Ю., Ахматова Н.К., Шубина И.Ж., Лебединская Е.А., Киселевский М.В. Влияние препарата профеталь надифференцировку и функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов человека // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2006. — №2, —С. 108-117.

30. Родионов С.Ю., Лебединская О.В., Киселевский М.В., Штиль A.A., Черешнева М.В., Черешнев В.А., Тараненко Л.А., Гаврилова Т.В., Орлов O.A., Шур H.H., Е.Г.Орлова К вопросу о механизмах противоопухолевой активности альфа-фетопротеина человека in vitro // Сибирский онкологический журнал. — 2006. — № 3. — Т. 19 — С. 41-47.

Статьи, депонированные в ВИНИТИ

31. Лебединская О.В. КочуроваИ.А. Колониеобразующие клетки плевральной жидкости //Депонировано в ВИНИТИ 17.03.97 № 803-897.

32. Лебединская О.В., Кочурова И.А., Мелехин С.В., Щербаков Р.В. Клоногенные предшественники фибробластов в плевральной и перикардиальной жидкостях морских свинок // Депонировано в ВИНИТИ 28.07.98 № 2443-В98.

Статьи и тезисы в материалах международных конгрессов, симпозиумов, форумов, съездов, международных и всероссийских конференций

33. Фриденштейн А.Я., Лебединская О.В. Потребность стволовых клеток стромы костного мозга в стимуляции гемопоэтическими клетками // Материалы XI Всесоюзного съезда анатомов, гистологов и эмбриологов. — Полтава. —1992. — С. 260.

34. Лебединская О.В., Оленева E.H., Оленев В.А. Компьютерное моделирование медико-биологических процессов // Материалы международной научно-технической конференции «Конверсия, приборостроение, рынок». — Владимир. — 1997. — С. 166-169

35. Лебединская О.В. Эффект воздействия кроветворных клеток на колониеобразование стромальных клеток-предшественников II Материалы Объединенной научной сессии Российской медицинской академии естественных наук (биомедицинская секция). В кн.: «Проблемы лимфологии и клинической патологии». — Москва. — 1997. —

С. 126-128.

36. Лебединская О.В. Сравнительный анализ клоногенных свойств предшественников фибробластов костного мозга, перитонеального транссудата и экссудата// Материалы Международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР профессора В.Г. Елисеева. В кн.: Сборник научных трудов к 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР профессора В.Г. Елисеева. — Москва. —1999. — С. 144-145.

37. Лебединская О.В., Горская Ю.Ф., Шуклина Е.Ю., Лациник Н.В. Сравнительная характеристика возрастных изменений стромальной ткани кроветворных органов различных животных методом математического моделирования // Материалы

VII Международной научной конференции «Здоровье семьи — XXI век». Изд-во. ГОУ ВПО «ПГМА Росздрава» — Пермь (Россия) — Валета (Мальта). — 2003. — С. 107108.

38. Лебединская О.В., Горская Ю.Ф. Влияние возрастных изменений на морфологию колоний, образованных предшественниками фибробластов из гетеротропных трансплантантов лимфоидных и миелоидных органов мышей // Материалы

П Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием.

В кн.: «Фундаментальная и клиническая лимфология — практическому здравоохранению». Изд-во. ГОУ ВПО «ПГМА Росздрава». Пермь. — 2003. — С. 82-86.

39. Лебединская О.В., Горская Ю.Ф., Куралесова А.И. Морфологическая характеристика колоний стромальных клеток-предшественников в культурах гетеротопных трансплантатов костного мозга и селезёнки мышей разного возраста // Успехи современного естествознания. — 2003. — № 10. — С. 76.

40. Лебединская О.В., Горская Ю.Ф., Швецов E.H. Морфология колоний, формируемых индуцибельными остеогенными клетками предшественниками в культурах селезёнки мышей разного возраста//. Успехи современного естествознания. — 2003. —№ 11. — С. 65.

41. Лебединская О.Ф., Мелехин C.B., Щербаков Р.В., Кочурова И.А. Морфологическая характеристика колоний, формируемых сгромальными клетками-предшественниками, циркулирующими в перитонеальной жидкости // Успехи современного естествознания. — 2004. — № 2. — С. 49-50.

42. Лебединская О.В., Горская Ю.Ф., Данилова Т. А., Швецов Е.В., Нестеренко В.Г. Влияние иммунного процесса на морфологию колоний, формируемых стромальными клетками-предшественниками в культурах клеток гетеротопных трансплантатов костного мозга мышей // Материалы УШ Международной научной конференции «Здоровье семьи — XXI век». Изд-во Пермского университета. — Гоа (Индия). — 2004. — С. 166-168.

43. Горская Ю.Ф., Данилова Т.А., Нестеренко В.Г., Лебединская О.В. Численность стромальных клеток-предшественников (КОК-ф) в гетеротопных трансплантатах костного мозга мышей, иммунизированных антигенами стрептококка группы А // Тезисы докладов Объединенного иммунологического форума. — Екатеринбург. — 2004. — С. 3.

44. Лебединская О.В., Халтурина Е.О., Киселевский М.В. Морфологическая и фенотипи-ческая характеристика зрелых дендритных клеток человека // Морфологические ведомости (приложение). — 2004. — № 1-2. — С. 60.

45. Лебединская О.В., Горская Ю.Ф., Данилова Т.А., Нестеренко В.Г. Влияние иммунизации на остеогенные свойства стромальных клеток-предшественников гетеротопных трансплантатов костного мозга мышей // Морфология. — 2004. — Т. 126. — № 4. — С. 71.

46. Лебединская О.В., Мелехин C.B., Халтурина Е.О., Богдановская М.С., Киселевский М.В. Морфологические особенности мононуклеаров в культурах клеток селезёнки, активированных интерлейкином-2 // Фундаментальные исследования. — 2004. — №2, —С. 62-63.

47. Лебединская О.В., Киселевский М.В., Вершинина М.Ю., Мелехин C.B., Богдановская М.С. Морфологическая характеристика мононуклеарных клеток печени онкологических больных // Фундаментальные исследования. — 2004. — № 2. — С. 63-64.

48. Лебединская О.В., Киселевский М.В., Халтурина Е.О., Мелехин C.B., Богдановская М.С., Щербаков Р.В. Характеристика лимфокин-акгивированных киллеров, генерированных из мононуклеарных клеток периферической крови человека// Фундаментальные исследования. — 2004. — № 5. — С. 113-114.

49. Киселевский М.В., Шубина И.Ж., Лебединская О.В., Мелехин C.B., Руди Е.Р. Исследование возможности биотерапии с помощью лимфокин-активированных киллеров (ЛАК) у больных раком молочной железы со злокачественным плевральным выпотом // Фундаментальные исследования. — 2004. — № 6. — С. 49.

50. Лебединская О.В., Горская Ю.Ф., Данилова Т. А., Нестеренко В.Г. Влияние иммунизации антигенами стрептококка группы А на численность стволовых стромальных клеток в гетеротопных трансплантатах костного мозга мышей и на морфогистохимиче-ские особенности формируемой ими костной ткани // Материалы международной научной конференции. В кн.: «Морфофункциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференцировки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий». Изд-во ГУ РНЦ «ВТО им. акад.

Г. А. Илизарова». — Курган. — 2004. — С. 166-169.

51. Shubina I., Titov K., Lebedinskaya O., Kiselevsky M. Immunotherapy of Cancer Patients with Lymphokine-Aktivated Killer Cells Generated from Spleen Lymphocytes // International Congress on Anti-Cancer Treatment, Paris, October 28,2004.

52. Лебединская O.B., Кузовлев E.B., Доненко Ф.В., Мелехин C.B., Киселевский M.B. Морфология и гистохимия натуральных киллеров-Т (НКТ) клеток у мышей с опухолевым поражением печени // Фундаментальные исследования. — 2005. — № 2 — С. 27-28.

53. Лебединская О.В., Горская Ю.Ф., Мелехин C.B., Фадеева Е.В., Путилова М.А. Морфология колоний, образованных стромальными клетками-предшественниками (КОК-ф) в культурах клеток костного мозга мышей, иммунизированных различными типами антигенов стрептококка // Фундаментальные исследования. — 2005. — № 2. — С. 28.

54. Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Киселевский В.М. Сравнительная характеристика морфологических и иммунофенотипических особенностей дендритных клеток, генерированных из клеток-предшественников костного мозга и эмбриональной печени мышей // Материалы Всероссийской научной конференции. В кн.: «Актуальные проблемы теоретической и клинической медицины». Изд-во ГОУ ВПО «ПГМА Росздра-ва. Пермь» — 2005. — С. 21-24.

55. Лебединская О.В., Фрейнд Г.Г., Мелехин C.B., Ахматова Н.К., Киселевский М.В. Сравнительный анализ морфо-гистохимических изменений в лимфоидных и паренхиматозных органах под действием растительных лекгинов и липополисахаридных комплексов бактериального происхождения // Материалы Международной научной конференции «Здоровье семьи — XXI век». — Изд. ПОНИЦАА. — 2005. — С. 193195.

56. Киселевский М.В., Лебединская О.В., Шубина И.Ж., Ахматова Н.К., Фрейнд Г.Г., Мелехин C.B., Фадеева Е.В. Влияние цитокинов на дифференцировку бластных клеток костного мозга больных острым миелоидным лейкозом // Современные наукоёмкие технологии. — 2005. — № 2. — С. 37.

57. Лебединская О.В., Киселевский М.В., Фрейнд Г.Г., Мелехин C.B., Ахматова Н.К., Лебединская Е.А., Путилова М.А. Воздействие растительных лектинов на структуру и клеточный состав лимфоидных органов лабораторных животных // Фундаментальные исследования. — 2005. —№5. — С. 66-67

58. Лебединская О.В., Киселевский М.В., Фрейнд Г.Г., Мелехин C.B., Ахматова Н.К., Доненко Ф.В., Буранова Т.А. Морфогисгохимические изменения паренхиматозных органов лабораторных животных при системном введении растительных лекгинов // Фундаментальные исследования. — 2005. — № 5. — С. 67-68.

59. Шубина И.Ж., Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Киселевский М.В. Возможные источники получения дендритных клеток для создания противоопухолевых вакцин // Медицинская иммунология». — 2005. — Т. 7. — № 2-3. — С. 15.

60. Кузовлев E.H., Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Доненко Ф.В., Шубина И.Ж., Мака-шин А.И., Киселевский М.В., Семёнов Б.Ф. Особенности иммунофенотипа лимфоцитов, выделенных из поражённой опухолью печени мышей // Современные наукоёмкие технологии. — 2005. — № 3. — С. 44.

61. Кузовлев E.H., Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Доненко Ф.В., Шубина И.Ж., Мака-шин А.И., Киселевский М.В., Семёнов Б.Ф. Цитотоксическая активность натуральных киллеров (НК) у мышей с опухолевым поражением печени // Успехи современного естествознания. — 2005. — № 4. — С. 32-33.

62. Макашин А.И., Кузовлев E.H., Ахматова Н.К., Лебединская О.В., Доненко Ф.В., Шубина И.Ж., Киселевский М.В. Генерация дендритных клеток из клеток-предшественников костномозгового происхождения // Успехи современного естествознания. — 2005. — № 4. — С. 58.

63. Макашин А.И., Кузовлев E.H., Ахматова Н.К., Лебединская О.В., Доненко Ф.В., Шубина И.Ж., Киселевский М.В. Роль дендритных клеток в стимуляции противоинфек-

ционного иммунного ответа на модели Klebsiella pneumoniae // Успехи современного естествознания. — 2005. — № 4. — С. 58-59.

64. Лебединская О.В., Мелехин C.B., Шубина И.Ж., Киселевский М.В., Фадеева Е.В. Морфология мононуклеарных лейкоцитов в культурах крови здоровых доноров и костного мозга больных острым миелоидным лейкозом И Современные наукоёмкие технологии. — 2005. — № 7. — С. 49.

65. Лебединская О.В., Мелехин C.B., Руди Е.Р., Киселевский М.В. Морфогистохимиче-ская характеристика мононуклеаров, активированных интерлейкином-2 в культурах плевральных экссудатов онкологических больных // Современные наукоёмкие технологии. — 2005. — № 7. — С. 49-50

66. Кузовлев E.H., Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Доненко Ф.В., Шубина И.Ж., Макашин А.И., Киселевский М.В, Семенов Б.Ф. Цитотоксическая активность лимфоцитов, выделенных из пораженной опухолевым процессом печени мышей // Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение / Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня основания филиала «Иммунопрепарат» МЗ и CP РФ: в 2-х ч., ч. 1, (разд. 1-3). Изд-во РИО филиала «Иммунопрепарат» ФГУП НПО «Микро-ген» МЗ и CP РФ. — 2005. — 300 с.

67. Черешнев В. А., Лебединская О.В., Родионов С.Ю. Альфа-фетопротеин - регулятор гомеостаза при физиологических и патологических процессах // Материалы Международного Конгресса «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» / Аллергология и иммунология в педиатрии. — 2005. — Т. 6. —№5. — Приложение 1. — С. 154.

68. Лебединская О.В., Шубина И.Ж., Мелехин C.B., Ахматова Н.К., Киселевский М.В. Влияние цитокинов на дифференцитровку клеток перитонеального экссудата онкологических больных // Современные наукоёмкие технологии — 2005. — №10. — с.45.

69. Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Киселевский М.В., Лебединская Е.А., Шехмаметь-ев P.M., Мелехин C.B. Влияние лекгина клещевины на митотическую активность мононуклеарных лейкоцитов в культурах крови здоровых доноров // Фундаментальные исследования. — 2006. — № 1. — С. 29.

70. Ахматова Н.К., Лебединская О.В., Киселевский М.В., Шехмаметьев P.M., Лебединская Е.А., Мелехин C.B. Исследование функциональных свойств мононуклеарных лейкоцитов крови здоровых доноров при действии лекгина клещевины // Современные наукоёмкие технологии — 2006. — № 2. — С. 32.

71. Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Фрейнд Г.Г., Киселевский М.В., Лебединская Е.А., Шехмаметьев Р.М.,Буранова Т.Ю., Путилова М. А., Мелехин C.B. Влияние липополи-сахаридных комплексов бактериального происхождения на структуру ряда органов лабораторных животных // Успехи современного естествознания — 2006. — № 2. — С. 43^14.

72. Ахматова Н.К., Лебединская О.В., Киселевский М.В., Шехмаметьев P.M., Лебединская Е.А., Мелехин C.B. Сравнительный анализ влияния растительных лекгинов на митотическую активность мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека // Фундаментальные исследования. — 2006. — № 3. — С. 32-33.

73. Лебединская О.В., Мелехин C.B., Ахматова Н.К., Киселевский М.В., Фрейнд Г.Г., Шехмаметьев P.M., Лебединская Е.А., Буранова Т.Ю. Сравнительный анализ воздействия растительных лекгинов и липополисахаридных комплексов бактериального происхождения на структуру и клеточный состав селезёнки лабораторных животных // Современные наукоёмкие технологии — 2006. — № 3. — С. 40.

74. Ахматова Н.К., Лебединская О.В., Киселевский М.В., Шехмаметьев P.M., Лебединская Е.А., Мелехин C.B. Влияние растительных лекгинов на цитотоксическую активность мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека // Фундаментальные исследования. — 2006. — № 3. — С. 59.

75. Лебединская О.В., Патлусова Е.С., Лебединская Е.А., Мелехин C.B., Киселевский М.В., Шехмаметьев P.M. Морфологические особенности и реакция лимфоидной тка-

ни печени больных с метастатическим опухолевым процессом и гепатитом В // Успехи современного естествознания. —2006. — № 5. — С. 52.

76. Лебединская О.В., Чикилёва И.О., Лебединская Е.А., Шехмаметьев P.M., Мелехин C.B., Киселевский М.В. Клеточный состав и его морфогистохимическая характеристика в культурах мононуклеарных лейкоцитов периферической крови здоровых доноров при воздействии липополисахаридных комплексов Yersinia pestis // Успехи современного естествознания. —2006. — №5. — С. 72-73.

77. Лебединская Е.А., Мелехин C.B., Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Шехмаметьев P.M., Фрейнд Г.Г., Киселевский М.В. Морфогистохимическая характеристика и клеточный состав тимуса лабораторных животных под действием лектина клещевины // Успехи современного естествознания. —2006. —№ 5. — С. 73-74.

78. Лебединская О.В, Ахматова Н.К., Лебединская Е.А., Мелехин C.B., Пепеляева Е.А., Киселевский М.В. Сравнительное исследование функциональной активности мононуклеарных лейкоцитов под действием растительных лекгинов и бактериальных липополисахаридных комплексов // Материалы X Юбилейной международной конференции «Здоровье семьи — XXI век» — Изд-во: ПОНИЦАА. — 2006. — С. 218-219.

79. Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Мелехин C.B., Лебединская Е.А., Пепеляева Е.А., Киселевский М.В. Влияние растительных лекгинов на функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека // Материалы Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование». — Изд-во: ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава. — 2006. — С. 111-113.

80. Лебединская О.В., Киселевский М.В., Лебединская Е.А., Доненко Ф.В., Болотова Е.И., Буранова Т.Ю., Гармашова Е.А., Гусманова П.С., Пепеляева Е.А., Шехмаметьев P.M., Мелехин C.B. Морфологические особенности печени мышей с метастатическим опухолевым процессом // Современные наукоёмкие технологии. — 2006. — № 5. — С. 32.

81. Лебединская О.В., Киселевский М.В., Лебединская Е.А., Доненко Ф.В., Болотова Е.И., Буранова Т.Ю., Гармашова Е.А., Гусманова П.С., Пепеляева Е.А., Шехмаметьев P.M., Мелехин C.B. Цигоиммунохимическая характеристика лейкоцитарных инфильтратов в различных участках печени мышей с метастатическим опухолевым процессом // Современные наукоёмкие технологии. — 2006. — № 5. — С. 32-33.

82. Ахматова Н.К., Лебединская Е.А., Мелехин С.В.Лебединская О.В., Доненко Ф.В., Шехмаметьев P.M., Киселевский М.В. Влияние бактериального иммуномодулятора на функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека // Современные наукоёмкие технологии. — 2006. — № 6. — С. 65.

83. Ахматова Н.К., Лебединская Е.А., Мелехин С.В.Лебединская О.В., Доненко Ф.В., Шехмаметьев P.M., Киселевский М.В. Влияние бактериального иммуномодулятора на течение опухолевого процесса у мышей // Фундаментальные исследования. — 2006. — №6, — С. 28.

84. Киселевский М.В., Лебединская О.В., Паглусова Е.С., Лебединская Е.А., Доненко Ф.В., Болотова Е.И., Буранова Т.Ю., Гармашова Е.А., Гусманова П.С., Пепеляева Е.А., Шехмаметьев P.M., Мелехин C.B. Цигоиммунохимическая характеристика лейкоцитарных инфильтратов различных участков печени больных с метастатическим опухолевым процессом и гепатитом В // Фундаментальные исследования. — 2006. — №6.—С. 34-35.

85. Ахматова Н.К., Лебединская О.В., Киселевский М.В., Гармашова Е.А., Шехмаметьев P.M., Болотова Е.И., Гусманова П.С., Пепеляева Е.А., Мелехин C.B. Динамика фагоцитарной активности дендритных клеток, генерированных из клеток-предшественников костного мозга мышей // Современные наукоёмкие технологии. — 2006.—№6. —С. 65-66.

86. Лебединская О.В., Мелехин C.B., Лебединская Е.А., Киселевский М.В. Морфогистохимическая и электронно-микроскопическая характеристика дендритных клеток, генерированных из клеток-предшественников костного мозга// Успехи современного естествознания. — 2006. — № 8.— С. 45.

87. Лебединская О.В., Мелехин C.B., Лебединская Е.А., Киселевский М.В. Электронно-микроскопические особенности дендритных клеток, генерированных из стволовых клеток печени эмбрионов и клеток-предшественников костного мозга взрослых мышей // Успехи современного естествознания. — 2006. — № 10.— С. 84-85.

88. Лебединская О.В., Киселевский М.В., Мелехин C.B. Морфо-гистохимические и электронно-микроскопические особенности дендритных клеток, генерированных из стволовых клеток печени эмбрионов мышей // Материалы Международного эмбриологического съезда. — Ханты-Мансийск. — 2006. — С. 20-23.

Публикации в межрегионарных и регионарных изданиях:

89. Лебединская О.В. Эффективность колониеобразования стромальных клеток в культурах костного мозга крыс // Тезисы докладов Научной сессии ПГМА 1996 года. — Пермь. —1996,—С. 31.

90. Лебединская О.В. Циркулирующие клетки-предшественники стромальных фибробла-стов // Тезисы докладов. Тезисы докладов Научной сессии ПГМА 1997 года. — Пермь,—1997.—С. 41.

91. Горская Ю.Ф., Лебединская О.В., Шуклина Е.Ю. Математическое моделирование динамики колониеобразования при действии циклофосфамида // Материалы

IV межрегиональной научно-практической конференции врачей патологоанатомов Урала, Сибири и Алтайского края. В кн.: «Актуальные вопросы патологической анатомии». — Омск. — 1998. — С. 38-45.

92. Лебединская О.В. Сравнительная характеристика клоногенных клеток красного костного мозга и перитонеального транссудата // Тезисы докладов Научной сессии ПГМА. — Пермь. — 1999. — С. 26.

93. Лебединская О.В., Черешнев В.А., Родионов С.Ю., Ахматова Н.К., Шубина И.Ж., Киселевский М.В. Сравнительная характеристика иммунофенотипа и функциональных свойств мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, активированных интерлейкином-2 и препаратом «Профеталь» // Материалы научно-практической конференции «Иммунология вчера, сегодня и завтра». — Пермь. —

2005, —С. 3-14.

94. Лебединская О.В., Мелехин C.B., Ахматова Н.К., Фрейнд Г.Г., Киселевский М.В. Влияние лекгина клещевины на цитотоксическую активность мононуклеарных лейкоцитов крови человека и клеточный состав органов лимфоиммунопоэза лабораторных животных // Материалы научно-практической конференции «Иммунология вчера, сегодня и завтра». — Пермь. — 2005. — С. 62-72.

95. Лебединская О.В., Мелехин C.B., Ахматова Н.К., Лебединская Е.А., Киселевский М.В. Сравнительная характеристика влияния растительных лекгинов и липополисахарид-ных комплексов бактериального происхождения на структурные особенности и клеточный состав ряда органов // Материалы юбилейной научной сессии. — Пермь. —

2006, — С. 54-56.

96. Лебединская Е.А., Тришин A.B., Лебединская О.В., Мелехин C.B., Киселевский М.В. изменение противоопухолевой цитотоксической активности мононуклеарных лейкоцитов периферической крови здоровых доноров под действием лекгинов клещевины и гороха // Материалы юбилейной научной сессии. — Пермь. — 2006. — С. 56-58.

97. Лебединская Е.А., Тришин A.B., Лебединская О.В., Мелехин C.B., Киселевский М.В. Оценка пролиферагивной активности мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека при воздействии лекгинов растительного происхождения // Материалы юбилейной научной сессии. — Пермь. — 2006. — С. 58-60.

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Лебединская, Ольга Витальевна

Введение

Глава I. Обзор литературы.,.

1 Сгромальные клетки-предшественники <КЧЖ-ф)— мо рфоф у нк i ш он ад и мы е особенности, кзанмодейстане с гемопо тгнчеекпмн к.четками, факторы. обеспечивающие нх регуляцию,—.,„.„.„.„„„.

1 I Стромадыше клетки-предшественники — методы мцмпш. культивирования. функциональные свойства, морфология.

1.2. Гетерогенность популяции етромальиых клеток-предшее!пенников, мезеихимжльные стволовые клетки .—.—

1.3. Погможиостн мнграннн «ромжьных клеток-предшественников, клоногеи ньк клетки, находящиеся и биологических жидкостях, детерминированные и нндуцибедьные остсогеин ые предшественники

1.4. Регуляция пролнфера ги пн ых й клоногеимьп свойства стромальных клегок-прсдшсственинков in vilro.

1 5, Возрастные изменения. влияние ряда факторов и патологических состояний на оетсогенез н етромальные клстки-прсдшествснники кропствориых и ЛИмфондыш органов,.

1.6. С о манне кроветворного н лнмфондного микроокружения — одна in основных функции етромельных клеток-предшественнике в, факторы, обеепечиваиэпин; взаимодействие клеток.

2, Зксгрдкорноральная генерация н активация эффекторов врожденного иммунитета, характеристика используемы к регуляторных факторов. применение генерированных клеток в медицине.

2. L, НвтурВЛЫШе и ли «фоки к -активирован мыс киллеры (ЛАК). использование ЛАК-клеток в адоптивной иммунотерапии S

2,2, HfljpnnR киллеры Т-клетки (MKT), иммунофенспнпнчеспя и функциональная характеристика, активация, значение л практической

2.3. Антнгсинреэеитнрукшше дендритные клетки: генерация и индукция созревании, иорфофужаноп&пмые характеристики. применение ДК-вокшги а иммунотерапии.

2.4. Бактериальные препараты и лектнны растительного происхождения — регу ляторы клеточных и молекулярных реакций, использование иселедо нянях и медицине-.-.—,

2.5. Человеческий a-фетопротсин — регул пор пшеостиза в физиологических условиях и при резвигаи патологических процессов, возможности его применении в клинике—. .„.

Глава П. Материал н мет оды исследовании.-.—.

1. Экспериментален ые животные ——

I 1 Исподнуемые лабораторные животные,—.—---—.

1.2. Характеристика мышей с имплантированной пораженных опухолью. ,,.,.,

2. Объекты н материалы исслсд(

2.1 Пробы, взятые у здоровых мужчин добровольцев

2.2 Пробы, пятые у онкологических больных.

2.3. Характеристика больных острым мнелоидиым лейкозом и доноров. получиыиих иеПиотен —..

Используемые препараты —---------------------—„—

4. Метода исследования.—.—.9Н

4 [ Кулмввирвиание строиалясых шж-ярешеспоишт (КОК-ф).----------9»

4-2 Методы исследовании возрастных изменений численности КОК-ф и эффехтинности их клонировании---------------.

4.3. Исследование влияния различных фшгторов на КОК-ф кроветворных н лимфонлных op union „„.,.—

4 4 Методы выделения и культивирования мононуклеарных лсйкошгтов

4 5 Методы экстракорпоральной юисраин н зктиниронаииых лейкощгтов —

4 6 Метод нммуночагнитнон сепарлшгн активированных моиоиуклеариых

4.7 Методы исследования функциональных характеристик активированных моиоиуклеариых .-MftKOuiitoa ——.-.-.

4 в Генерация дендритных клеток н индукция та созревания. .L

4.9 Нее,тс ломи не функциональных характеристик гамррешимх дендритных клеток,

4Ю. ИсБКфшяе им-муиофенотниакдегок методом проточной цнтофлюорометрни {F ACS - анип)—

4 [ I Иссяедонмне шгашинп профили .—

4.12. Цитологические, морфо гистохимические. иммуионнтохнмические методы исследования и аиали ■ полученных данных--.———

4.13. Электронно-микроскопические исследования с использованием цитохимической электронной микроскопии —„—.——

4.14. Методы статистической обработки экспериментальных данных

Г. и ни Ш.Собстоеыныг исследования. Стром&льныс клешi-нрслшестнскннки (КОК-ф} костного мозга, селезёнки м тимуса лабораторных животных, изменения

IIN функшгсшимгмх 11 МОрфоЛОГИЧССКНХ характеристик в процессе онтогенеза н иод действием регуля горных факторов.

1 Л. Зависимость свойств етромальных шлет о к - п рели i есгне 11 и НТО в костного мо1 га от условий культивирования в первичных культурок.

1.2 Потребность naccmiUK фиброблистов • трочбонитарных ростовых факторах ,,

1.3. Морфоюгия колоний, формируемых коетночог! оными аромши-ными клетками-предшественниками костного мозга и селезенки.,,.—.-.,.,

1.4. Иямумфпюгп «легок первичных моиослойиых культур костного мозга н селезенка.—.

1.5. Изменения чнелсшюст и тффеююности клонирования сгромлльных клеток-предшественников костного мозга, тимуса и селеэСнки лабораторных ЖП0П1Ш ft rtpottfcetf OrtTOrcwcM—.—

J .6. Действие ц-фстопротеина на пролнферативные и клопогонные свойства КОК-ф костного wolfs, селезенки мышей, пассажные фибробласты костного мозга человека и их днфференпировку..--.,.

1 7, Влияние бшцишшантигенов ни «ршлыше клегюг предшественники костного мозга мьппей

2. Особенности стромальных кдеток-прсдшсствснннков, выявленные в крови н серозных жидкостях лабораторных жииотных.

2 I, Стромальныс клетки предшественники, находящиеся в крови, их клон о генные свойства, морфология формируемых ими колоний

22, Клоиогеииме клетки ажцшмпго транссудата^ их численность, эффективность клонирования и морфология колоний паершккультурах. ,., . , . ,,

2.3. Клоноггниые клетки i и р И к арди алы i ого транссудата крыс. их нролифератнвные свойства в зависимости от условий культивирования н морфология образованных им к колоний

2 J. Стрвмдльиьм клетки- предал1 гвениикп пери юнеалыюго транссудата крыс, их функциональные особенности, зависимые от возраста и условий культивирования, морфологическая характеристика ф<(рмирусмы.ч колоний J

2.5. Колоииеобршукмшк клетки перитоиеалыюго экссудата крыс. их лроллферзтивные it клоногенные особенности

2.6 Сравнительная характеристика детерчиннроваиных стромальиых клеюк предшественников костного монд и индуцнбельных оетеогенных клеток, выявленных в псрпгонеальиом транссудате и экссудате крыс .]

3. Характеристика активированных и то мононуклеари их лейкоцитов периферическая кропи июровмх доноров н экссудатов онкологических больных.

3.1 JIи мфокии -активированные киллеры периферической кропи человека, функциональные, иммунофслотипнчсекне и морфологические характеристики на различных тли ни культи пирммишя--------------------------„.,

3.2 Моионуклеарные лейкоциты периферической крови человека, октивироминые прпцяш профетши». их иммумофенолш. норфолош к функциональная активность„„,„

3.3, Дифференннровга моноиуклеярнщ лейкоцитов периферической крови человека под действием препарата нрофеталь. результаты положительной селекции СВД4" клеток методом иммунома! hhihoU сепарации.

3.4, Функциональная активность моиоиуклеарных клеток периферической крови человека, инкубируемых е лектнначи растительного происхождения

3.5, Влияние ластам» растительного происхождения на клеточный состав, морфогиетохимню и структур) лимфоидных органов лабораторных животных

3.6, Генершшя ЛАК клеток m ЫМШНуктфНЫХ лейкоцитов плеврального экссудата онкологических больных, их морфология. функциональная активность и иммуиофеяэтия-.

4. Клеточный сослав, морфологические и функциональные особенное г"н популяции моиоиуклеарных лейкоцитов печенн онкологических бальных, возможности их экстракорпоральной акшшин--——

4 1. Морфологическая н нммуноцнтохим нчеекая харакл epnci ика лейкоцитарных инфильтратов различных участков печени больных с метастатическим опухолевым процессом.20|

4.2, Мононj клеарные клетки печени онкологических больных, морфодолнкекне и фснотнпические характернетикн, локализация it днфференцнровка ЛКТ»клсток. . .„.„.„„

4.3. Генерация ЛАК из НКТ-клеток печени онкологических бальных, сравнительный анализ их нммунофеиотипнчсских н функциональных свойств

4 4, Морфология п иммунонитохимня лейхоннтарныя инфильтратов печени мышей е привитой опухолью CaO-l.,„,.71 i

4 5. Натуральные киллеры печени мышей, пораженных опухолевым процессом. методы выделения, генерация НКТ-клеток, морфология и иммунофенотин .213 5, Литнгенпрезеитнруюшие дендритные клетки, источники и способы нх jкстракорпорал ьnoil генерации, индукция созревании, морфогисгочичнчсская и хлсктрокно-мнкроскопнческая характеристики, иммунофенотин и функциональные особенности .„.2!

5.1, Дендритные клепсн. гакрвфоюшные ю нокщитп периферической крови VjopoBux доноров с нсполъчовшгнеч GM-CSF. IL-4 н TKF-«, их морфология, нммуиофенотип и ^ишкишлые смЛстм .—

5.2. Дендритные клетки, генерированные н viro нз мононуклеарнмх лейкошггм периферической крон» человека с номошио циюкннон и препарата профеталь, ах чорфопктохнмия. иммунофелотнп и фрпммммме сиоОсти.—-------—„—.

5-3. Морфологические, имчунофяютипические и функциональные характеристики пеипритиых UKWC (тнернроивиник in vtiro

И1 прогеинторимх клеток эмбриональной печени мышей-—

5,4, Деилритаыс клетки, полученные m клеток предшественников костимо мотгд мышей е применением различных индуктора* созревания, их морфология. иммунофенотап и фушнкшт сюЯств*——.

5-5 Дендрит ные клетки. генерированные in йл остов больных острым мислоидным лейконч. нч морфологические, фенопмнческис ифункциональныесвойсття, , .,.,,.,,.,,,.,,.,.—.,

Зякд .-.-.-.-.—.

ВЫВОДЫ .«.,.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние регуляторных факторов на морфологические, иммунофенотипические, функциональные особенности и дифференцировку стромальных клеток-предшественников и иммунокомпетентных клеток"

Актуальность проблемы

Исследование и использование в клинической практике стволовых клеток (СЮ являются одними из самых актуальных вопросов современной биологии и медицины. Интерес к СК обусловлен, с одной стороны, возможностями изучения на этой модели механизмов, лежащих в основе лиффсрснин-ровкн клеток, и участия а этих процессах специфических факторов, определяющих тип лнфференцнровкн in га» и in vitro. С другой стороны, акту альность данной проблемы связана с возможностью применения СК для генной к клеточной терапин [199|, Наиболее перспективной областью применения СК следует считать, по-внлнмому, заместительную биотералню [499]. Причем успехи клинического применения СК. а также возможности появления новых направлений в этой области напрямую зависят or результатов фундаментальных исследований, направленных на изучение стволовых клеток.

Существенный интерес для клинического применения представляют стромальные клетки-предшественники костного мозга |400] Стромальные клетки-предшественники кос t ною мозга были открыты АЛ. Фриденштейном [242) около 30 лет назад Оказалось, что при эксплантации диссоциированных костномозговых клеток в ограниченном количестве ш vitro в присутствии эмбриональной телячьей сыворотки в культурах развиваются колонии адгезивных фнбробластоподобных клеток. Каждая колония является клонам, то есть образуется путем пролиферации одной клетки. Эти клетки были названы колониеобразуюшимн клетками фнбробластов — КОК-ф, или стромальнымн клеткам и-предшественниками |229, 242|- Далее было выявлено, что популяция етромальных клеток-предшественников неоднородна по своим днффереицнровочным потенциям: некоторые из них являются мульти п ответным и предшественниками, тогда как остальные имеют более ограниченный потенциал, будучи коммнтированы к определённой днффе-ренцнронке [89]. Это позволило сформулировать концепцию, в соответствии с которой популяция етромальных клеток-предшественников включает в се

6я наиболее «ранних* представителен — мультипотентные меэенхимальнш предшественники. или стромальные стволовые клетки |89). В настоящее время данные клетки называют также мезекхнмальньгмн стволовыми клетками (МСК), н получены моноклональные антитела SH2, SH3 н SH4. комбинация которых позволяет выделить МСК 1419J.

Мезенхимальиые стволовые клетки могут быть широко использованы а реиаратианой биотерапки а силу своего значительного нролнферативиого н днфференцнровочного потенциала. Численность их увеличивается ш vitro а 100000 раз в течение 6-8 недель, при этом они остаются в недифференцированном состоянии [421]- Таким образом. МСК как часть популяции стро-мальных клеток-предшественников, обладают всеми признаками СК; они способны к интенсивной пролиферации, могут дифференцироваться во многие клеточные типы, трансплантабсльиы in vivo [504].

Стромальиые клетки-предшественники содержатся не только в костном мозге, но н в других кроветворных и лимфоидкых органах — селезёнке, тимусе, лимфатических узлах. Большинство клоногеиных клеток, находящихся в данных органах, серозных жидкостях и крови, и в некотором количестве — в костном мозге, относятся к популяции индуцнбельиых остеоген-ных клеток-предшественников (ИОКГТ), которые требуют для реализации своих остеогенных потенций присутствия специфических индукторов остео-генеза — переходного эпителия мочевого пузыря или декальцнинрованного костного матрнкса [89J. Данная категория клеток способна к миграции, а сформированная ими костная ткань не является самоподдерживающейся. Напротив, другая группа стропильных предшественников — детерминированные остеогенные клетки-предшественники (ДОКП), способные спонтанно реалнзовывать остсогенные свойства, не мигрируют и содержатся, в основном. а костном мозге, представляя собой местную популяцию клеток.

Несмотря на значительный интерес, который в последние годы исследователи проявляют к стромальным клеткам-прслшсственникам, многие сведения. касающиеся КОК-ф противоречивы, а часть вопросов остаются не изученными. Например, не исследованы возрастные изменения количества и эффективности клонирования стромальных клеток-прсдшествсннкков. Недостаточно изучены нммунофенотнп, морфогнстохимнчсскне особенности КОК-ф и нх культуральных потомков, характеристика формируемых ими колоний. влияние условий культивирования и ряда ростовых факторов на их днфференцировку и клоногенность Между тем условия культивирования определяют лролиферагивмыс свойства и направление днфференцнровкн стромальных стволовых клеток человека [460]- Поскольку' трансплантация размноженных в монослойных структурах стромальных клеток как способ лечения целого ряда заболеваний находит веб большее применение (100, 284, 347], разработка оптимальных способов нх культивирования приобретает особую актуальность.

Ограничены также знания о действии введенных in vivo и in vitro бактериальных антигенов н некоторых иммутгомодулируюшнх препаратов на клоногенные и остсогснныс свойства КОК-ф Например, не известно, какое воздействие на стромальныс клсткн-предшественннкн может оказывать человеческий а-фетопротсин. хотя имеются сведения о его стимулирующем влиянии на эмбриональные фнбробласты [103], Практически не исследованы нндунибельные остеогенные кдетки-предшсствснникя, выявляющиеся в кровеносном русле и серозных полостях, дискутируются вопросы о возможности циркуляции стромальных клеток предшественников и т.д.

Одной из основных функций стромальных клеток является обеспечение специфического микроокруження для пролиферации и днфференцнровкн гемопозгическнх н иммуиокомпетентных клеток. Они продуцируют целый ряд необходимых для этого ростовых факторов и цнтокннов: интерлейкины — б, 7. 8, 11, 12, !4, колоннесгнмулнрующие факторы, LIF. лигвнл Flt-3, SCF и ряд других ]277, 131, 320]. В свою очередь иммунокомпетентные клетки также вырабатывают ряд стимулирующих и ннгнбирующнх факторов, которые оказывают воздействие на стромальные клетки ■предшественники. Такнм образом, возможна обоюдная «корректировка» нарушений как мнкроокру-жения, так н гсмопоэтнческнх и нммунокомпетентных клеток.

В связи с этим другой важнейшей проблемой является исследование возможностей дифференцнровки ex viva нммунокомпетентных клеток (активированных мононуклеарных лей копию и, ашнтшреэентнруюшнх дендритных клеток, натуральных киллеров и натуральных кнллеров-Т-клеюк) под влиянием регуляториых факторов, вырабатываемых стромальнымн клетками микроокружения Именно данные группы генерированных экстракорпорально клеток находят вей большее применение в биотераннн злокачественных новообразований н инфекционных заболеваний, некоторые из них используются для создания противоопухолевых и противоинфешнонных вакцин.

Мнтогенные факторы (лектины) и шггокины (ннтерлейкниы) прн инкубации со зрелыми лимфоцитами крови вызыва}от реакцию блаеттрансфор-маиин. В процессе её в популяции лимфоцитов появляются незрелые лнмфо-ндные элементы nttta иммунобластов и пролнмфошлов, которые относят к категории активированных лнмфондных клеток, Исследование иммунофено-типа их также свидетельствует об уменьшении количества лимфоцитов, экс-премирующих маркеры зрелых клеточных форм (CD3, CD4, CD8), Подобное явление можно рассматривать как этап дмфференцировкн зрелых лимфоцитов. Интересен поиск иммуномодулнрующнх агентов, в том числе и не цито-кн новой природы, способных вызвать подобный митогенный эффект Примером гранедифферен инронкн гсмопоэтнческнх клеток может служить генерация дендритных клеток (ДК), При воздействии ростовых факторов ДК могут быть получены как из клеток миелоидного. так и лнмфонлного рядов. Однако группа изученных источников генерации н индукторов созревания ДК весьма ограниченна.

Вышеизложенное свидетельствует о наличии множества нерешённых вопросов, касающихся стромальиых клеток-предшественников и иммупо-компетентных клеток. Часть нз них может быть решена в комплексном неследовании данных клеток а процессе их культурального роста пол действием разнообразных регуляторных факторов

Цель исследовании — изучение морфологических, иммунофенотнпн-чеекнх и функциональных свойств стромальных клеток-предшественников и иммунекомпетентных клеток, подвергнутых воздействию факторов бактериальной и эукариотнческой природы, а также видовых, возрастных и кулыу-рзльных особенностей их днфференцировки ex vivo и возможностей ее регуляции,

Основные задачи исследования:

1. Исследовать клоногенные свойства, морфогнсгохимические и нммунофеношннческне особенности стромальных клеток-нред шестаенникой костного мозга н КОК-ф, выделенных из крови и плевральной, перикарди-альной, пернтонеальной серозных жидкостей лабораторных животных при различных условиях культивирования in vitro.

2. Определить возрастные изменения количества и клоногенных возможностей стромальных клеток-предшественников костнот мозга, тимуса, селезёнки и биологических жидкостей, морфологии формируемых ими колоний у различных лабораторных животных.

3. Изучить возможности модуляции дифферснинровкн. клоногенных н остеогснных свойств стромальных клеток-предшественников с использованием бактериальных антигенов и препарата профетапь (in vivo н in vitro), включающего в качестве основного компонента человеческий а-фетопротекн.

4. Провести сравнительный анализ морфологических и функциональных особенностей детерминированных стромальных клеток-предшественников костного мозга и нндунибсльных клоногенных клеток, находящихся в пернтонеальном транссудате и экссудате крыс

5. Исследовать действие препарата профеталь и дать сравнительную характеристику морфогистохнмическнх. электронно-микроскопических, функциональных особенностей и направления дифференцировкн мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, активированных профе-талсм. ннтерлейкнном-2, бактериальными лнпополисахарилнымн комплексами и растительными лектннами.

6. Охарактеризовать иммунофенотип. функциональную активность, морфологические и иммуноцнтохимические особенности натуральных киллеров (НК). выделенных нз поражённой опухолевым процессом печени лабораторных животных, печени и плеврального экссудата онкологических больных н дифференцированных нз них натуральных киллеров Т-клеток (НКТ) н л имфокип-активированных киллеров (ЛАК).

7. Оценить возможности экстракорпоральной генерации зрелых дендритных клеток нз разных источников с применением индукторов созревания различной природы (фактора некроза опухолей, препарата профсталь. бактериальных лкнополнеахарндных комплексов). Показать в сравнительном аспекте морфологические, нммунэфекотнпическис и функциональные свойства полученных клеток.

Научняя новиша

На значительном экспериментальном материале впервые подробно изучены нндуцнбельные остсогенные клетки-предшественники, выявленные в крови н серозных жидкостях (плевральном, пернкардн&тьном, пернтоне-альном транссудатах и ггеритонеальном экссудате) лабораторных животных.

Впервые показаны в сравнительном плане возрастные изменения численности н эффективности клонирования стромальных клеток-предшественников костного мозга, перитонсального транссудата и экссудата различных лабораторных животных.

Дана сравшгтельная характеристика изменений морфогистохимических и функциональных показателей КОК-ф костного мозга и клоногенных клеток, обнаруженных в перитонсальном транссудате и экссудате у крыс различных линий н возраста, под влиянием условий культивирования.

Впервые исследованы изменения нымунофенотнпа. численности и клоногенных свойств сгромалышх клеток-предшественников костного мозга и селезёнки мышей СВА пол действием введенного in vivo и in vitro препарата профеталь. содержащего в качестве основного компонента человеческий а-фетопротенн (ч-АФГТ).

На модели гетеротропных трансплантатов вперные продемонстрированы изменении эффективности клонирования и способности к остсогенсзу КОК-ф костного мозга мышей при вакцинации их антигенами стрептококка группы А.

Полупены новые данные, характеризующие динамику дифференцнровки лимфокии-актнвированных киллеров {ЛАК) на мононуклеарных лейкоцитов (МЛ) периферической крови человека, и на основе морфологических, функциональных н нммунофенотипнчсских характеристик определены оптимальные сроки их культивировании.

Впервые исследовано действие препарата прафетвдь ш vitro и проведена сравнительная оценка активации мононуклеарных клеток периферической крови человека под нлияннем ннтерлейкина-2, бактериальных липополнеаха-рндных комплексов (J1IIC), лектинов растительного происхождения и профс-татя. Выявлена высокая степень блаеггранеформаиии под действием последнего с формированием CD34+/CD45+ гемопоэтнческих клеток-предшественников в культурах мононуклеарных лейкоцитов периферической крови здоровых доноров.

Исследованы мононуклеарнме лейкоциты (МЛ) крови, МЛ, циркулирующие в плевральном экссудате н инфильтрирующие различные участки печени онкологических больных н экспериментальных животных с имплантированной опухолью, их морфологические, иммуноцитохимнчсские и фено-типнческнс особенности, продемонстрированы возможности их дифферен-цировки в ЛАК и нату ральные киллеры Т-клеткн (НКТ), показаны нх сравнительные характеристики.

Дана сравнительная оценка морфогистохнмнческнх, электронно-мнкрос конических, нммунофенотнпнческнх и функциональных особенностей незрелых и зрелых дендритных клеток, генерированных нз различных источников с применением в качестве индукторов созревания препарата нро-фетвль и бактериальных ЛПС.

Теоретическое и практическое значение работы

Результаты изучения особенностей КОК-ф, обнаруженных в крови, плевральном, иерикардиальном транссудатах, перитонеальиом транссудате и экссудате. расширяют представления о стромальных клетках -предшественниках (СКЛ) и дают направление исследованию биологических жидкостей, как одного из возможных источников выделения СКП для использования в практической медицине.

Сравнительная характеристика детерминированных остеогениых клеток-предшественников костного мозга и нидуцибельных клоногеиных клеток, выявленных в биологических жидкостях, имеет научно-теоретическое значение.

Выявленные закономерности возрастных изменений количества и эффективности клонирования стромальных клеток-предшественников костного мозга и тимуса, селезёнки, гтернтонеального транссудата и экссудата у лабораторных животных позволяют понять процессы, определяющие развитие возрастного остеопороза. Полученные результаты свидетельствуют о необходимость учета возраста и донора, и реципиента, а также источника получения стромальных клеток-предшественников на определённом возрастном зтзпе в случае применения их в заместительной терапии.

Продемонстрированный на модели гетеротопных трансплантатов характер влияния антигенов стрептококка группы А на клоногенные и остео-генные свойства КОК-ф акцентирует внимание на том, какое значительное воздействие оказывают процессы, происходящие в организме реципиента, на функциональные способности трансплантированных стромальных клеток-предшественников и морфогнетохнмическне особенности формирующейся костной ткани. Полученные данные необходимо учитывать при разработке методов по использованию мезенхимальных стволовых клеток для трансплантации.

На основании выявленной лннамнкн дифференцнровки лнмфокнн-активированных киллеров из мононуклеариых лейкоцитов периферической крови человека, их морфологических, функциональных, иммунофенотип иче-ских характеристик определены оптимальные сроки экстракорпорального культивирования ЛАК. применяемых в адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований и инфекционных заболеваний.

Показано, что препарат ирофеталь обладает способностью активировать мононуклеарные лейкоциты периферической крови человека, повышая их цнтотоксическне способности н индуцировать созревание дендритных клеток. Это создаёт более широкие по сравнению с классическими препаратами возможности для экстракорпорального получения зрелых дендритных клеток, активированных мононуклеариых лейкоцитов н опосредованного влияния через данные популяции на стромальные клетки-предшественники костного мозга и селезёнки. Данные эффекты и выявленный в исследованиях высокий уровень бласттрансформацнн мононуклеариых лейкоцитов под действием профеталя, приводящей к формированию С034/45-ноложнтельных гемопоэтнческих клеток, предполагает возможность использования изученных свойств этого препарата в практической медицине.

Обнаруженная возможность генерации ЛАК-клеток из мононуклеариых лейкоцитов плеврального экссудата онкологических больных, ЛАК и НКТ-клеток из клеток лейкоцитарных инфильтратов паратуморальных областей печени больных колоректальным раком с метастатическим процессом и печени мышей с привитой опухолью, открывает новые перспективы для получения клеток-эффекторов противоопухолевого иммунитета,

Выявленные морфологические, тнсгохнмнческне, электронно-микроскопические, функциональные н иммунофенотип ические особенности дендритных клеток рахчичного происхождения при действии разных индукторов днфференцировки предоставляют возможность выбора источников и индукторов созревания при разработке методов создания ДК-вакцин, применяемых в бнотерапнн опухолей и тяжёлых инфекций.

Основные положений, кыноснмые на здшнту:

L Численность, эффективность клонирован ни н морфология колоний етромальных клеток-прелшеетвенникои костного моли, так же как н КОК-ф. выявленных в биологических жидкостях, зависят от видовых особенностей экспериментальных животных, условий культавнронания, присутствия гемопоэтнческих клеток, претерпевают значительные изменения в процессе онтогенеза.

2. Под действием антигенов стрептококка группы А происходят из-менення не только количества и кяоногенных свойств детерминированных клегок-пред шсс i венн нков костного мозга мышей, но и процессов ocieorene-за. осуществляемых КОК-ф в гстеротопных трансплантатах. Причем степень этих изменений зависит от длительности воздействия бактериальных антигенов на остеопенные клетки,

3. Стимулирую шее влияние препарата профсталь. введенного in vivo, на КОК-ф костного мозга и селезёнки мышей выражается непосредственно в усилении пролифератнвных и клоиогенных свойств етромальных клеток-предшественников Ингнбнция кол они собрату ю шмх способностей КОК-ф при введении профеталя in vitro осуществляется опосредованно через активированные препаратом мононуклеарные лейкоциты.

4. Сравнительная характеристика морфофункшюнзльных и имму-нофеноти п и ч ее кнх особенностей моиоиуклеариых лейкоинтов периферической крови человека, инкубированных с IL-2, растительными лекта нам и. бактериальными ЛПС н профеталем демонстрирует наиболее выраженную стимуляцию функциональной активности МЛ под влиянием последнего. Бласт-трансформация моиоиуклеариых лейкоцитов, вызванная действием препарата профсталь, содержащего человеческий я-фстопротенн, приводит к появлению в культурах CD34+/CD45+ гемопозтнчсских клеток-предшественников.

5. Генерация ЛЛК-клеток возможна из МЛ плеврального экссудата онкологических больных, ЛАК и НКТ — из клеток пернтуморальных лейкоцитарных инфильтратов печени онкологических больных с метастатическим процессом и печени экспер и ментальных животных с имплантированной опухолью.

6. Клетки, генерированные hi моноцитов периферической крови человека, прогеннторных клеток эмбриональной печени мышей, клеток-п редш ественк н ко в костного мозга взрослых животных, блаетов больных острым мкелоплным лейкозом имеют комплекс морфологических, электронно-микроскопических, нммунофенотнпнческнх и функциональных признаков дендритных клеток, Созревание их может происходить как под действием общепринятого индуктора — фактора некроза опухолей а. так и под влиянием ряда иммуномодулирующнх агентов (препарата профеталь. лнпополнеа-харидных комплексов бактериального происхождения).

Апробацнн работы, Материалы диссертационного исследования представлены и виде публикаций па 66 конференциях, съездах, форумах и конгрессах, из них: 3 — на международных конгрессах. 5 — на международных форумах и съездах, 21 — на международных и общероссийских конференциях с между народным участием, 25 -— на всероссийских конференциях, симпозиумах и съездах, 12 — на межрегионяриых* региональных и заочных электронных конференциях РАЕ,

В виде устных и лостерных докладов основные положения исследований доложены на: VII Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Казань. 2004), X Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2005- (Санкт-Петербург. 2005). Международном Конгрессе "Иммунитет и болезни; от теории к терапии- (Москва. 2005), V Общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань. 2004). Международной научной конференции * Морфофункционал ьные аспекты регенерации и адаптационной днфференцнровкн структурных компонентов огюрно-двигателыюго аппарата в условиях механических воздействий- (Курган, 2004), V Всероссийской научной конференции с международным участием (Уфа. 2005), V Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва. 2006),VII Всероссийской конференции по патологии клетки {Москва. 2005), II Российской конференции по иммунотерапии н нм-мунореабилитаинн (Москва. 2005), Всероссийской научной конференции, п освящённой памяти академика Н.В Васильева (Томск. 2005), Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы теоретической и клинической медицины» (Пермь, 2005). II Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием -Фундаментальная и клиническая лнмфологня — практическому здравоохранению» (Пермь, 2003). Мсжрсгио-иарнон научной сессии ПГМА и ИГМА (Пермь. 2005). Научной конференции -Иммунология вчера, сегодня и завтра-. (Пермь, 2005). Научных сессиях ПГМА (Пермь 1996. 1997, 1999, 2000, 2002.2003.2001. 2006),

Апробация диссертации состоялась 02.06.2006 г. на объединённом межкафедральном научном заседании морфологических кафедр н кафедры мнкробнлогин и иммунологан ГОУ ВПО -Пермская государственная медицинская академия им, ак, Е,А, Вагнера» Федерального агентства но здравоохранению н социальному развитию РФ. иммунологов Института иммунологам и физиологии УрО РАН (Екатеринбург). Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (Пермь) н кафедры мнкробнлогин и иммунологии Пермского государственного университета.

Внедрение в практику. Основные результаты диссертации внедрены в учебный процесс кафедр онкологии, инфекционных болезнен, кафедры профессиональных болезней, промышленной экологии и терапии меднко-профнлактнчсского факультета с курсом профпатологнн ФПК и ИПС. гистологии. эмбриологии и цитологкн. микробиологии и иммунологии, патологической анатомии с секционным курсом ГОУ ВПО -Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера Ростдрава* кафедры микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета, в научно-исследовательскую работу лабораторий Института экологии н генетики микроорганизмов УрО РАН (Пермь). Института иммунологии и физиологии УрО РАН (Екатеринбург).

Экономическая значимость работы обусловлена разработкой малозатратных и недорогостояших методов экстракорпоральной генерации активированных мононуклеарных лейкоцитов. CD34+/CD45+ гемопоэтнческих клеток-предшественников и антигеипрезентнруюшнх дендритных клеток, которые могут быть использованы при создании препарате, применяемых в бно-терапии онкологических и инфекционных заболеваний {акт внедрения в ГУ «Российский онкологический научный центр им. II.И. Блохнна РАМН»).

Публикации, Материалы диссертации обобщены в 99 печатных работах, В рекомендуемых ВАК изданиях: 32 статьи опубликованы в рецензируемых журналах, 2 работы депонированы в ВИНИТИ. 56 статей и тезисов представлены в материалах международных конгрессов, форумов, всесоюзных н всероссийских съездов, международных и общероссийских конференций. В прочих изданиях (межрегиональных и региональных) напечатано 9 работ.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 329 страницах машинописного текста, состоит нз введения, обзора литературы, главы методов исследования, 5 разделов, посвященных собственным исследованиям, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литерату ры. Работа иллюстрирована 82 графиками, 29 гистограммами. 274 микрофотографиями, содержит 39 таблиц)' Библиографический список включает 525 источника (112 — отечественных н 413 — зарубежных авторов).

Диссертационная работа обобщает исследования стромальных клеток-прсдшественникои, ныполненные автором на базе лаборатории нммуиомор-фологин Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н-Ф. Гамалсн РАМН под руководством чл.-корр. РАМН, д-р мед. наук, проф. А,Я- Фриленштейна. Вопросы влияния антигенов стрептококка группы А и препарата профеталь на КОК-ф разрабатывались в отделе регуляции иммунитета 1~У «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф Гамалеи РАМН» (зав, отделом — л-р мед. наук, проф. В.Г. Нестеренко),

Исследование иммунофенотнпа н функциональных свойств иммуно-компегентных клеток {мононуклеарных лейкоцитов, дендритных клеток, натуральных киллеров, натуральных киллеров Т-клеток) проведено на базе лаборатории клеточного иммунитета ГУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН» (зав. лаб. — д-р мед. наук, проф. MB. Киселевский) в рамках программы «Разработка методов адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований». Морфологическая часть работы выполнена на кафедре гистологии, эмбриологии и цитологии ГОУ ВГЮ «Пермская государственная медицинская академия им. ак, Е.А, Вагнера» Федерального агентства по здравоохранению н социальному развитию РФ (зав. каф, — д-р мел наук, проф В,А, Четвертных); электронно-микроскопические исследования — в группе электронной микроскопии Института молекулярной биологии им. В.А Эигельгардта РАН (зав, гр. — д-рбиол. наук, В.И. Поленко).

Автор выражает благодарность коллективам и руководителям названных научных учреждений и лично ведущему научному сотруднику НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи — д-ру мед. наук Ю.Ф. Горской, совместно с которой проведено ряд исследовании. Автор искренне благодарен всем участникам роботы. чей вклад адекватно отражён в совместных публикациях.

Автор также благодарит своих научных консультантов: ак. РАН и РАМН, д-ра мед наук, проф. В.А. Черешнева и д-ра мед. наук, проф. М.В. Киселевского за постоянную помощь, внимание и доброжелательное участие на всех зтапах работы.

Особая глубокая благодарность и память — своему Учителю, увлекшему изучением стволовых стромальных клеток, давшему направление исследованиям, — чл.-корр. РАМН, д-ру мед. наук. проф. А,Я. Фриден штейну

Данная работа посвящается памяти родителей — Виталия Александровича Олсиева и F-лнзавсты Николаевны Оленевой.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Лебединская, Ольга Витальевна

Выводы Стромапьные клетки-предшественники костного мозга, так же как н колон необразу юшне клетки, выявленные в биологических жидкостях, для эффективного проявления своих пролиферативных и клоногенных свойств требуют оптимальных условий культивирования: определенной плотности эксплантации Сне более 2ж10*/см2 дна культурального сосуда), времени адгезии (не менее 2-х часов), наличия фидера (облучённых гсчопо-этнческнх клеток) или ростового тромбоцитарного фактора в культурах,

2. В ходе постнатального онтогенеза происходит снижение численности и эффективности клонирования стромальных клеток-предшественников в кроветворных и лимфоилных органах у мышей, морских свинок и крыс. Данные изменения имеют видовые и органные особенности.

4. Вакцинация лабораторных животных антигенами стрептококка группы А приводит к замедлению оссицнфикапни костной ткани гетеротопных трансплантатов, снижению содержания в них колониеобразующнх клеток- предшественннков и эффективности их клонирования.

5. Клоногенные клсткн-тгредшествекннкн, выявленные в биологических жидкостях (крови, плевральном, перикардиальном и пернтонеальном транссудатах и пернтонеальном экссудате), по многим показателям (уровню эффективности клонирования, зависимости её от возраста и вида лабораторных животных, плотности эксплантации, по морфологическим характеристикам формируемых колоний, иммунофенотнпу и морфогистохимин составляющих их элементов) сопоставимы со стромальными клетками-предшественниками костного мозга

6. Препарат профеталь оказывает стимулирующее влияние на противоопухолевую цитотокснчсскую активность н пролнферативный потенциал мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека в культурах, более значительное, чем классические митогекы — ннтерлснкнн-2. лнпопо-лнеахаридные бактериальные комплексы и растительные лектины- Активированные профеталем клеткн имеют морфологию больших гранулярных лимфоци тов и более высокий {в 2-5 раз), чем ЛАК уровень экспрессии маркеров CD8, CD 16. CD38, CD56 и HLA DR.

7- Вызванная профеталем реакция бл.тсгтрансформаини лимфоцитов сопровождается образованием CD34+/CD45+ гемопоэтнческих клеток-предшественников.

8. Моионуклеарные лейкоциты печени онкологических больных, выделенные нз параметастатнчсскнх участков, обладая высокой НК-актнвностыо. по своему иммунологическому фенотипу {повышенный уровень экспрессии CD38. CD57. CD58) и морфологии (преобладание молодых и активированных форм лимфоцитов) существенно отличаются от мононуклеарных лейкоцитов периферической крови этих же больных н могут быть отнесены к популяции натуральных киллеров Тклеток,

9- ЛАК могут быть получены из мононуклеарных лейкоцитов экссудата и НКТ печенн онкологических больных н характеризуются морфологией активированных клеток лнмфоидиого ряда, повышенной интотоксиче-ской способностью и высоким уровнем экспрессии активационных антигенов CD25. CD38, молекул адгезии CD58. а также молекулы HLA-DR.

10. Дендритные клетки, генерированные из различных источников; монопнтов крови человека» прогеннторных клеток печенн эмбрионов и клеток-предшественников костного мозга взрослых мышей линии СВА» — обладают сходными морфологическими (крупные размеры, многочисленные ветвящиеся отростки, эксцентрично расположенное ядро, вакуолнзнрованная цитоплазма, содержащая пнронннофильиый и ШИК-лозитнвный компоненты, развитый синтетический аппарат) нммунофенотнпнческнмн (высокий уровень экспрессии МНС I и II типа. СЕМО. CD58, CD80. CD86) и функциональными характеристиками.

1J. Созревание дендритных клеток может быть индуцировано как с использованием фактора некроза опухолей а, так и бактериальных липопо-лнеахаридных комплексов и препарата профеталь. Полученные зрелые дендритные клетки характеризуются высоким уровнем экспрессии антигена терминальной дифференцнровки CD83. антнгснпрсзснтирующсй способностью, низкой фагоцитарной активностью и продуцируют спектр цитокинов, регулирующих днфференцнровку лимфоцитов <JL- lp. IL-6, IL-12. INF-y. TNF-a)

Заключение

Страмальные клетки-предшественники костного мозга, селезёнки и тимуса лабораторных животных, возрастные изменений. влияние условий культивирования и регуляторных факторов на их морфофункционалыше свойства.

В связи с тем. что трансплантация размноженных в монослойных структурах стромальных клеток-предшественников как способ лечения целого ряда заболеваний находит неё большее применение [ 100, 284] особую актуальность приобретает разработка оптимальных способов нх культивирования.

Стромальныс клетки-предшественники костного мозга, селезёнки и тимуса мышей, морских свинок, кроликов и крыс во всех видах первичных монослойных культур (А, А+ф, П. П+ф) образуют на поверхности дна куль-туральных сосудов колонии-клоны фибробластоподобных клеток, каждая из которых является потомком одной КОК-ф. Максимальная активность пролиферации клоногенных клеток костного мозга крыс достигается между' 5-м и 10-м днями культивирования н заканчивается после 15 дня инкубации. Колонии, формирующиеся стромальными клетками-предшеегвенннкамн, имеют различную морфологическую характеристику в зависимости от гтролнфера-тнвной актнвностн

Нссмотря на то, что основную массу колоний составляют фибробла-сты, они отличаются по плотности расположения клеток, их количеству и форме, На примере колоний, сформированных клоногенными клетками стромы костного мозга крыс, выделено три основных типа колоний: компактные, диффузные и образованные, так называемыми, сквамозными фнб-робластами.

Компактные колонии состоят из различных по величине типичных фнбробластов. расположение которых характеризуется строгой упорядоченностью: более плотно в одном или нескольких центрах н днффузно — на периферии. Данные колонии могут содержать от нескольких сотен до нескольких тысяч клеток и обладают наибольшим прелнфератннным потенциалом.

Диффузный тип колоний характеризуется наличием в его составе от нескольких десятков до нескольких сотен фнбробластов, разобщенных между собой и свободно располагающихся н её пределах. Клетки имеют выраженные и хорошо различимые отростки. В данном виде колоний наблюдается снижение их пролиферативиой активности. Колонии, содержащие сквамозные фибробласты, состоят из клеток, которые имеют распластанный вид, плотное пикнотнчное ядро, вакуолизнрованную цитоплазму и представляют собой дистрофически измененную форму клеточных элементов. Наиболее типичными являются колонии с множественными или единичными активными центрами размножения, характеризующиеся высоким пролнфератнвным потенциалом и метаболической активностью. Такие колонии вырастают в присутствии кроветворных клеток костного мозга, При утрате возможности кооперации КОК-ф с гемопоэтнческнмн клетками происходит резкое угнетение пролиферации их внутри колонии, что ведет к появлению колоний с разбросанными и сквамознымн фнброблэстами.

Анализ нммунофенотнпа клеточных форм в первичных полных культурах клоногенных клеток костного мозга мышей СВА показал, что среди ннх имеется большое количество клеток, экспрссснрующнх на поверхности маркёры NK (NK-I — 90,9%), моноцитов/макрофагов (F4/80 — 77.39%), ак-тивационных молекул (CD25 — 80,68%), кости мул ируюши X молекул (CD80/B7-t — 80,63% и CD86/B7^2 — 33.9%) Введение животным убитой вакцины Salmonella typhimurium не сказывается на исследованном нммуно-фенотнпе клеток костного мозга мышей, хотя общее количество их в органе (на бедро мыши» увеличивается в 2-3 раза.

В первичных полных культурах селезёнки мышей наблюдается большое количество клеток, зкепрееенруюших на своей поверхности NK-антнгены (57,0796), костнмулнрующие молекулы CD80/B7-I и CD86/B7-2 (80.63 и 78,50% соответственно), активанионные антигены (CD25 — 88,35%) и макрофагальные маркёры (F4/80 —■ 66,61%). Между тем уровень экспрессии поверхностных молекул сравнительно ниже, чем у клоногенных клеток костного мозга, Иммунизация животных убитой вакциной Saitmmella typhi-murium практически не оказывает влияния на экспрессию исследованных антигенов на поверхности клоногениых клеток селезенки мышей при трехкратном увеличении их численности.

Ранее показано, что эффективность клонирования стромальных клеток-предшественников в первичных монослойных культурах клеток костного мозга и селезёнки мышей, крыс, морских свинок и кроликов {14. 86, 89] зависит от наличия костномозгового фидера (облученных аутологнчных гемопо-зтическнх клеток или клеток костного мозга морских свинок).

В настояшем исследовании выявлено, что. например, в тимусе мышей СВА и морских евннок в отсутствие фидера даже при высокой плотности эксплантированных клеток (20-30x10* на I см1) и в адгезивных, и в полных культурах ЭКО-ф практически равняется нулю, но значительно увеличивается прн добавлении облученных гемопоэтнчсских клеток. А введение фндера в культуры клеток костного моз(а крыс более чем в 6 рзз повышает эффективность клонирования его стромильных клеток-предшественников. Однако прн этом ЭКО-ф не достигает значений, полученных прн ку льтивировании с собственными клетками костного мозга в полных культурах. Присутствие в среде культуры собственных гсмопоэтнческих клеток приводит к повышению эффективности клонирования КОК-ф костного мозга крыс в 10-20 раз, Прн этом прослеживается корреляция между уровнем ЭКО-ф и временем адгезии до введения фидера, концентрацией и аллогенным или сингениым источником его.

Полученные результаты соответствует данным о том, что колоннести-мулнрующей активностью в отношении КОК-ф обладают клетки костного мозга и селезенки благодаря содержанию среди них тромбоцитов И мегака-рноцитов |13]. Напротив, клетки тимуса, лимфатических узлов и лейкоциты крови не обладают подобной активностью.

Добавление фндера выравнивает эффективность колоннеобразовання в адгезивных и полных культурах клеток всех кроветворных и лимфоидных органов у крыс, мышей н морских свинок, но, как показано в наших исследованиях, ингнбнрует колоинеобразованне как в исходных культурах клеток костного мозга кроликов, гак и в культурах перевиваемых штаммов фибробластов. Однако культуральн ыс потомки КОК-ф костного мозга кроликов сохраняют высокую чувствительность к ростстнмулнруюшим факторам тромбоцитов. присущую другим вилам животных.

Оказалось, что большое значение для выявления максимальных клоногенных возможностей етромальных клеток-предшественников имеет плотность эксплантации клеток в культурах |89,50J, При математическом анализе полученных нами данных отмечена высокая степень коррелятивной зависимости (более 0.5) ЭКО-ф етромальных клеток-предшественников от количества эксплантнруемых клеток и плотности их эксплантации в первичных мо-нослойных культурах клеток костного мола крыс.

В наших исследованиях показано, что увеличение количества эксплантированных Клеток в культурах костного мозга крыс усиливает эффективность клонирования КОК-ф по зкепоиеицнальиой кривой, но лишь до достижения определённого уровня плотности эксплантата. Повышение плотности эксплантнруемых клеток более 2-Зх10*/смг дна культуральиого сосуда, сопровождается падением ЭКО-ф: резким — в полных костномозговых культурах и более плавным — в адгезивных культурах, почти до нулевых значений, независимо от того, достигается ли эта плотность за счёт ннтактных или облученных клеток. Это хорошо демонстрирует предложенная нами математическая модель колониеобразования. использующая метод градиентного с пуска.Таким образом, ясно, что ЭКО-ф при культивировании костномозговых клеток в большой степени зависит от их эксплантациоиной плотности. Для достижения максимальной величины ЭКО-ф необходима оптимальная плотность эксплантированных клеток (от 0,2 до 2,0хНУ/смЭ. при меньшей и большей плотности эксплантации рост колоний подавляется. Оптимальная плотность эксплантации костномозговых клеток может быть достигнута путем сочетания в культуре небольшого количества ннтактных костномозговых клеток и достаточного числа облученных костномозговых клеток (фидера)» в этом случае ЭКО-ф остается постоянной и имеется линейная зависимость между числом эксплаитнруемых клеток и количеством вырастающих стромальных колоний. В таких культурах преобладают колонии компактного типа с единичными или множественными центрами размножения среднего размера (2-3 мм). Увеличение числа эксплантированных клеток приводит к отчетливой ннгнбнцнн пролиферативной активности клеток в колониях и появлении колоний с дистрофически изменёнными клетками.

Полученные данные об ингнбнини колониального роста КОК-ф кос г кого мозга крыс при превышении определённого уровня эксплантационной плотности свидетельствует не только о ростостимулирующем, но и иигибн-руюшем воздействием на КОК-ф стромы регуляторных факторов, вырабатываемых гемопоэтическими клетками. Таким образом, присутствие именно определённого количества н вида гсмопозтнческих клеток и вырабатываемых ими факторов обязательно для нормального функционирования стромы. Причём эти факторы оказывают как стимулирующее, так и ннгнбнрующее действие н имеют видовые отличия. Следовательно, наши данные согласуются с тезисом А .Я. Фриденштейна о том, что организация и поддержание микроокружения —это процессы, требующие кооперативного взаимодействия стромальных и кроветворных клеток |89].

Ряд исследователей мезенхимальных стволовых клеток также обратили внимание на то, что функциональные свойства и даже иммунофенотин МСК могут определяться плотностью их эксплантации в культурах, По данным некоторых авторов, пролифератнвиые способности клеток намного выше при небольшой плотности эксплантации [131, 180, 459}. Плотность экспланти-руемых клеток в культуре может влиять даже на экспрессию некоторых генов, а условия культивирования определяют пролиферативные свойства и направление дифферениировкн МСК (459,414].

Сравнительное исследование возрастных изменений КОК-ф кроветворных и лнмфоидных органов мышей линии СВА, морских свинок и крыс линии Wistar выявило следующие особенности. С возрастом и костном мозге, тимусе и селезенке происходит достоверное снижение численности КОК-ф, изменение морфологии образуемых ими колоний и эффективности клонирования клеток'ирсдшествснннкой у всех изученных экспериментальных животных. Это согласуется с данными ряда авторов, рассматривавших возрастные изменения стромальной ткани костного мозга мышей и человека [13, 14. 144,303, 397].

Выявленный процесс наиболее заметен в тимусе морских свинок и мышей: количество КОК-ф в этих органах уменьшается соответственно в 75 н 12 раз н происходит на фоне падения числа ядросодержащих клеток в органе почти до нулевых значений к концу исследования. Такой характер снижения численности стромальных клеток-предшественников можно обьяс-нить. по-видимому, возрастной инволюцией тимуса, темп которой различен у двух видов экспериментальных животных, тем более, что исходный уровень числа КОК-ф (наиболее высокий в раннем возрасте) на порядок выше в тимусе морских свинок по сравнению с мышами

В селезёнке мышей наблюдается 8-кратное паление содержания КОК-ф в связи со старением. Наименьшее возраспюе снижение числа КОК-ф имеет место в селезёнке морских свинок (в 1,5 раза), несмотря на то, что максимальные значения численности КОК-ф в данном орлие у свинок почти в 10 раз выше, чем у мышей,

В костном мозге наибольшее снижение числа КОК-ф по мере старения наблюдается у крыс (в 10 раз), меньшее — у морских свинок (в 4 раза) н мышей (в 2,5 раза)- Отмечается высокая степень (более0.5) отрицательной корреляции между возрастом животных, численностью КОК-ф н эффективностью их клонирования в костном мозге крыс, особенно при выявлении в адгезивных культурах,

Показателем снижения пролнфератнвной активности стромальных клеток-предшественников костного мозга, тимуса н селезёнки при старении является уменьшение числа крупных колоний компактного типа и появление колоний, содержащих дегенерирующие tie сочные элементы в культурах костного мозга, тимуса и селезёнки у всех изученных видов животных.

Графическое отражение изменений числен ностн КОК-ф и эффективности их клонирования с применением математического метода градненггного спуска позволяет выявить большую вариабельность динамики данных показателей. При сравнении параметров числа КОК-ф и эффективности клонирования в культурах клеток различных органов в пределах каждого вида животных можно отмстить следующее. У мышей наибольшее количество КОК-ф и максимальная эффективность клонирования, по нашим данным, наблюдается в костном мозге, причём их величины достигают пиковых значений в конце первого гада жизни животных. В тимусе н селезёнке максимальное содержание КОК-ф на порядок ниже, а ЭКО-ф в культурах клеток костного мозга в 50-100 раз превышает данные показатели в культурах тимуса н селезёнки.

Снижение эффективности клонирования и числа КОК-ф с возрастом у мышей происходит более резко в тимусе, чем в костном мозге и селезёнке.

Максимальные значения эффективности клонирования и количества клоногениых стромальных клеток у морских свинок так же. как и у мышей, являются наибольшими в костном мозге. ЭКО-ф в костном мозге в 3 раза выше, чем а селезёнке, и в 15 раз — чем в тимусе; содержание КОК-ф соответственно в 1,5-2 раза превышает нх число в селезенке и тимусе. И в лимфоидных, и в мнедоидном органах морских свинок число КОК-ф максимально в течение первых 2-5 недель, затем резко падает до нуля к 3 годам в тимусе. а в костном мозге и селезёнке остаётся довольно высоким до конца исследования, что объяснимо, исходя из понятий о взаимоотношениях данных органов гемиммунопоэза в течение онтогенеза. Колебания ЭКО-ф у морских свинок не всегда параллельны изменению числа КОК-ф, хотя также имеют тенденцию к снижению с возрастом животных.

Исходя нз результатов исследования, можно считать, что красный костный мозг у изученных животных является основным источником стромольных клеток-прсдшественни ков. обладающих максимальной эффективностью клонирования, и сохраняет данные свойства при старении в большей степени, чем органы лимфопоэза. Вариабельность изменений числа КОК-ф в органах и их ЭКО-ф у разных видов экспериментальных животных и у животных одного вида в различных органах, вероятно, зависит от физиологических характеристик, особенностей старения организма, продолжительности жизни животных и функционального назначения органов.

Поскольку известно, что в состав популяции KQK-ф костного мозга входят детерминированные остеогенные клеткн-иредшественннкн. а тимуса и селезёнки — нндуиибельные осгеогенные клсткн-прслшсственникн [85J. то полученные данные указывают на возможность возрастного снижения численности обоих популяций предшественников, что может быть одной из причин возрастного остеопороза. Примененная математическая обработка полученных данных с использованием метола градиентного спуска ласт возможность прогнозировать ход возрастных изменении н оценивать динамику численности КОК-ф и эффективности их клонирования в связи со старением.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Лебединская, Ольга Витальевна, Санкт-Петербург

1. Абелев ПИ. Альфа-фетопротеин: биология, биохимия, молекулярная генетика // Иммунология. 1994. Л? 3. С- 4—9.

2. Баранова Е.А„ Бородшок НА, Гнездникая Э-В, // 1991, Si I, С, 32,

3. Барышников А.Ю. Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы алоп-тоза,— М.: Эднторнал. УРСС, 2002. С, 51,

4. Владимирская Е.Б. Пробл. гематол. 1977. №11. С.2Я-31.

5. Полянский ЮЛ,, Колотова Т.Ю., Васильев Н-В. Молекулярные механизмы прсираммированной клеточной гибели // Усп. еовр биол. 1994. Т. 114, вып. 6. С. 679-692.

6. Воробьёва Н.Ф„ Виноградов В,В,, Акулннии Г,Е. и др. Видовые особен ности клеточного состава рыхлой соединительной ткани у полевок / Фитология и патология соединительной ткани.— Новосибирск, 1980. Т. 2, С.178.

7. Гантневская Ю.А. Селянка В В. Дендритные клетки: роль в системе иммунитета И Иммунопатология, аллергология, ннфехтологня, 2001. № 4. С, 5-23.

8. Герасимов Ю,ВГ. Чайлахян Р. К. Действие кюрретажа медуллярной полости на стромалыгыс предшественники костного мозга // Бюлл. эспер, биол. мед. 1978. Т. 186. 1243-1245.9. Горе кая Ю.Ф. и лр„ 2004

9. Горская Ю.Ф. Трошева А.Г. // Иммунология 1986, Si 3. С, 26-29

10. Горская Ю,Ф,. Данилова Т,А. Лсбедннская О.В., Нсстереико В.Г, Н БЭБМ. 2005. Т. 140. № 7. С. 77-80.

11. Горская Ю.Ф. Данилова ТЛ-. Нестереико В.Г. // БЭБМ. 2005 .Т. 140. С. 14—17.

12. Горская Ю.Ф. Куралесова А.И., Шуклина Е.Ю., Нестеренко В.Г. Численность етромальных клеток-предшественников в гетерогенных трансплантатах косгиого мозга и селезёнки мышей СВА разного возраста Н Бгалл. эксп. б нол. мед. 2002. Т. 33. № 2. С. 176-179.

13. Горская Ю.Ф,, Лапин и к Н,В„ Шуклина Е.Ю., Нестеренко В,Г, Возрастные изменения в популяции етромальных остеогенных клеток-предшественников // Russian J, of Immunol. 2000, V. 5. № 2. P. 149-155,

14. Горская Ю.Ф. Фридепштейн А.Я, Зорина А.И. // Гематология и транс-фузнология. 1992. Т. 9-10. С. 3-5.

15. Горская Ю.Ф,, Фрнленштейн А.Я., Кулагина Н.Н, Клетки-предшественники фибробластов, выявляемые методом клонированияin vitro клеток кроветворных органов нормальных и облучённых мышей И Бюлл. зкепер. биол. мед. 1976. № 5. С. 614-617.

16. Горская Ю.Ф., Фрнденштейн А.Я. Лацнник Н.В. и др. // Бюлл. эксп. биол, мед, 1999, т, 127, С, 218-220.

17. Горская ЮФ. Шуклина Е Ю. И Гематология и трансфузиология. 1992. Т. 5-6. С. 10-12,

18. Горская Ю.Ф., Шуклнна Е.10 Нестеренко В.Г. // Бюлл. эксп. биол. мед. 2002. г. 133. С. 317-319

19. Давтян Т.К., Аванесян J1.А. О взанмоотношеннн иммунного и адаптивного ответов, // Успехи соврем, биологии. 2001. Т. 121. № 3. С. 275-286.

20. Давыдов МИ. Нормантовнч В.А. Киселевский М,В,. Волков С.М. и лр. Адоптивная иммунотерапия при опухолевых плевритах: клиннко-лабораторное исследование // Российский онкологический журнал, 2000, Хгб.с. 14-17.

21. Данилова Т. А,. Асоскова Т.К. Бородннж Н.А. н лр. Изучен не специфичности моноклинальных антител, полученных при иммунизации мышей культурой стрептококка группы А, обработанной пепсином // Бюл. эксп. б'нол мед. 1994. № 11. С 493-495

22. Егорова М.Б., Ефремова В.Н., Курбатова Е.А. и др. Итоги экспериментального и клинического изучения полнкомпонентной вакцины нз антигенов условно патогенных микроорганизмов//Жури мнкробнол, 1997. №6. C96-I0L

23. Игнатов В,В, Углсволузнаюише белки-лектниы II Биология.— Соросов, образ, жури. 2004.

24. Катаев В Л Изменения иммунной системы у больных колоректальным раком в условиях лнмфотропиой нммунокоррекцнн миелопндом // Медицинская иммунология. 2002. Т- 4. № 2, С. 298.

25. Кеворков Н.Н. Шилов Ю.И. Ширшёв С.В., Черешнев В.А. Гормоны репродукции в регуляции процессов иммунитета.— Екатеринбург: УИФ «Наукам, 1993 —171 с.

26. Ксйлнс-Борок И В. Клоногеиные предшественники фибробластов среди клеток пернтонеальной жидкости морских свинок// Цитология. 1979. Т. 10. № 5, С. 557-567

27. Ксйлнс-Борок И.В. Клоногснные предшсствскннкн фибробластон среди клеток пернтонеальной жидкости морских свинок II Цитология, 1979, Т. XXI. С 1065-1073.

28. Киселевский MB. Блюмснбсрг А.Г, Адоптивная иммунотерапия рака яичников / Сборник статей, приуроченный к Европейской школе по онкологии,— М-: Мир, 2001. С 164-176.

29. Киселевский M B., Титов К.С., Тер-Ованееов М.Д. Перспективы адоптивной иммунотерапии радикально оперированного рака желудка // Российский бнотерапевтнческнй журнал. 2002, № 4. С. 46-48,

30. Ковальчук Л.В., Гаиковская Л.В., Хорева М.В., Соколова Е.В, Система цитокинов. комплемента и современные методы иммунного анализа.— М.: Рос. гос. мед, уннв-т. 2001. С. 120,

31. Кокорнн И.Н., Сафронова К.Д. Мнскарова Э.Д., Татуашвнлн Н.А. Функциональная и физиологическая характеристика штаммов ретикулярных клеток // Вестник АМН СССР. 1970. № 7. С. 57-64

32. Короткова О.В., Заботнна Т.Н., Артамонова Е,В. н др. Применения по-лнокендоння в лечении больных раком молочной железы // Медицинская иммунология. 2002. Т. 4. № 2. С. 299.

33. Кузнецов С А // Докл. АН СССР 1976. т. 230. с. 1214-1217

34. Кузнецов С.А, Рост и днфференцнровка сгромальной ткани кроветворных органов in vitro // Автор, днсс. канд. биол. наук.— М., 1979. 22 с.

35. Кузнецова А,В., Данилова Т.Н., Гладских О.П. Иванов А. А-. Пальцев М А Дендритные клетки них использование в иммунотерапии И Молекулярная медицина, 2003, № 3. С, 3-17.

36. Кузннк Б.И., Вигковский ЮА., Гаймоленко ИЛ и др. Влияние имму-номодулнруюшей терапии на течение острых н хронических заболеваний легких и взрослых и детей // Мед, иммунол, 2003, Т. 5. Jft 3-4,1. С, 301.42. Кузьменко ПН. и др„ 1972

37. Лацнгапс Н.В. Горская Ю.Ф., Трошева Ф.Г, и др Содержание стромальных колоннсобразующнх клеток (КОК-ф) в костном мозге мышей н клональная природа образуемых ими колоний фнбробластов // Онтогенез. 1986. № I.C. 27-35.

38. Лациник Н,В,, Сидоровнч С Ю,, Горская Ю.Ф. и др. Радиочувствительность и пострадиационные изменения клоногенных стромальных предшественников костного мозга// Радиобиология. 1979. Т. 19. № 6. С- 846848.

39. Лациник Н.В., Сидоровнч С.Ю. Тарханова И.О. Изучение поверхностных рецепторов стромальных механоцитов гемопоэтических органов // Иммунология. 1980. Ns 1С. 26-28.

40. Лациник Н-В., Сидоровнч С.Ю., Фрилснштсйн Ф.Я. Влияние трипсинн-зацнн костного мозга на эффективность образования колоний фнбробластов а монослойных культурах И Бюлд. экспер. биол. мед. 1981. JVs 9.1. С.356-358

41. Лацнник Н.В., Фркденштенн АЛ., Горская Ю,Ф„ Москвина И,В,, Юй Хун Чсн Зависимость образования стромальных КОК-ф колоний от стимулирующего воздействия гемопозтнческих клеток /I Ьюлл экс, биол, мел 1990. № I I.C. 519-520,

42. Лебединская О.В. Эффект воздействия кроветворных клеток на коло-ннеобразованнс стромальных клеток-предшественников И Сборник статей- Проблемы лимфологнн и количественной патологии.— Москва,1. J997. С 126-128.

43. Лебединская О.В., Кочурова И.А. Морфология колоний стромальных фнбробластов красного костного мозга крыс // Пермский медицинский журнал. 1997. Т XIV, As 1,С, 46-51.

44. Лнллн Р. Патогнстологическая техника и практическая гистохимия-— М ; Мнр, 1969. С. 128-131.

45. Лурия Е.А. Кроветворная и лнмфоилная ткань в культурах.— М.: Медицина, 1972

46. Лурия Е.А., Фрндеиштейн АЛ. Грошсва А.Г. Глейберман А.С. Коло-ннеобразутошне предшественники фнбробластов в циркулирующей крови // Бюллетень экспериментальной медицины. 1989. .V? 12. С. 712-714.

47. Луцик М.Д. Панасюк Е.Н., Луцик А.Д, Лектины.— Львов; В ища uik„ 1981. С. 254.

48. Лямпсрт И.М. Дробышевская и др, И «Миммунологня», 1987, № I, с. 64-68.60. Максимов А.А., 1928

49. Медунииьш М.В. Вакцинология, Изд,2-е перераб- и лоп, — М,; Триада-X. 2004, 448 с.

50. Мусина Р.А„ Бекчанова Е.С., Сухих Г.Т. Сравнительная характеристика мезснкнмальных стволовых клеток, полученных из разных тканей человека // Клеточные технологии в биологии и медицине 2005, № 2, С. 8994.

51. Новожилова Т.И., Бугхлала С.А.» Киселевский M B. и др. Действие некоторых uiiTOTDKCHHou в сверхмалых концентрациях на клеточное звено иммунитета // Росс, химнч. журнал. 1999. 5, С- 96-99.

52. Носач В.В. Решение задач аппроксимации с помошью персональных компьютеров.— М.: МИКАЛ. 1994. С. 382,

53. Пальцев М.А. Введение в молекулярную медицину I Под ред, М-А. Пальцева.— М.: Медицина. 2004.496 с.

54. Панасюк А,Ф., Лурия А.Я, Образование колоний фнбробластов в культурах клеток периферической крови // Бюлл. экспер. биол, мед. 1970. Т. 70. №11. С. 96-98

55. Панасюк А.Ф. Лурия Е.А,, Фриденштейн АЛ. Культуры фибробласго-подобных клеток костного мозга человека // Пробл. гематол. перил. крови. 1972. № 8, С. 34-38,

56. Пашенков М.В. Пинегнн Б.В. Основные свойства дендритных клеток // Иммунология. 2001, С. 7—1669 Печенников В.Г. Лектнны информативные молекулярные зонды I/ Биология.— Соросов, образ, жури. 2004.

57. Правоторов Г,В, Ультраструктура гистиоцитов подкожной соединительной ткани у грызунов различной экологической специалюацин при де-гитратацни и голодании I Автореф. дис. каид. биол. наук.— Новосибирск, 1981.

58. Родина А,В. Москалева Е.Ю., Беляев Д.Л, и др, Получение функционально активных дендритных клеток человека с использованием препарата лейкннферон в качестве индуктора созревания I/ Аллергия, астма и клиническая иммунология. 2003. Т. 7. № 9. С. 19-27.

59. Родионов С.Ю„ Кеворков Н-Н-. Черкасов В.А., Малютина Н.Н., Орлов О,А, // Вестник УрМАН. 2004. Si 4 С 58-65.

60. Розенберг С. Адоптивная клеточная терапия: клинические исследования I ДеВита В Т-. Хеллман С. Розенберг С.А, Биологические методы лечения онкологических заболеваний. Пад ред. С. Розенберг.— М,: Медицина, 2002. С. 504-522

61. Ругаль В.И. Пономаренко В.М., Гончар В.А. и др,. 2005,75. Рудакова С.Ф. и др„ 1973.

62. Самойлнна Н,Л. Морфологический метол оценки бластной трансформации лимфоцитов в культуре //Лабораторное дело. 1970. № 8. С, 453-455.

63. Татаринов Ю.С. 11рнсутствне эмбрионального альфа-глобулина в сыворотке больных с первичным раком печени, // Вопр, мед. химии. (964. N* 10. С. 90-91.

64. Топейлнен СЛ. Адоптивная клеточная терапия: преклнннческие исследования / ДсВита В.Т. Хеллман С, Розенберг С,А. Биологические методы лечения онкологических заболеваний. Под ред. С- Розенберг.— М.: Медицина. 2002. С 484-503.

65. Тутельян А.В- Иммуннорегуляторная оценка естественных и синтетических препаратов в системе прайм ннгв лейкоцитов // Эпидемиология и вакиннопрофнлактика 2003, Xs 5(12). С. 55-57,

66. Фриденштейн А.Я., Горская Ю.Ф. Паниннк Н.В. Шуклина Е.Ю. Не-стеренко В-Г. Возрастные изменения содержания стромальных клоногенных клеток (КОК-ф) в кроветворных и лнмфондных органах // Бюлл. эксII. бноя. мед. 1999. т. 127. Л? 5, С. 550-553,

67. Фрндениггсйн А Я-. Иванов-Смоленский А.А., Кулагина Н.Н., Луркя Е.А. Получение чистых линий фнбробластов н признаки, по которым фнбробласты и эпителий различаются тимуса // Бюлл. экспер. бнал. мед. 1981 № 1,

68. Фриденштейн А.Я., Kypanecoaa А-И. Остеогенные клеткн-прсдшсствснннки костного мозга радиохимер. Анализ методом гстсро-топной транспларгтэцин // Онтогенез. — 1971, — Т. 2. —№5. — С. 458465.

69. Фриденштейн А.Я., Лалыкнна К.С. Инду кция костной ткани н остеогенные клетки-предшественннкн.— М,: Медицина, 1973,

70. Фриденштейн А.Я., Лацнник Н.В., Горская Ю.Ф. и др. // БЭБМ, 1999. Т. 127. С, 218-220.

71. Фриденштейн А-Я., Лацнник Н.В„ Горская Ю.Ф., Лурия Е, А. Клональ-ная природа колон иестимулирующего воздействия костномозговых клеток на образование стромальных колоний в культурах костного мозга И Бюлл, экспер. бнол. мед. 1990. № 1 К С. 43,

72. Фриденштей А.Я,, Лебединская О.В. Потребность стволовых клеток стромы костного мозга в стимуляции гемопоэтическими клетками // Материалы XI Всесоюзного съезда анатомов, гистологов и эмбриологов. — Полтава, 1992. С. 260.

73. Фриденштейн А.Я,, Лурня Е.А. Клеточные основы кроветворного микроокружения.'— М.: Медицина, (980. 216 с.

74. Фриденштейн А.Я., Петракова К,В,, Куралесова А,И,. Лацнник Н,В. Клетки-предшественники для остеогенной и кроветворной ткани. Анализ гетеротопных трансплантатов костного мозга // Иммунология. 1968. Т, 10. С. 557-567.

75. Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р.К., Лалыкнна К.С. О фибробласгопо-добных клетках в культурах кроветворной ткани морских свинок ft Цитология. — 1970. — Т. 12. — № 9. — С. 1147

76. Фриденштейн А.Я. Чайлахян Р.К„ Лацнник Н.В. Стромальные клеткн, ответственные за перенос микроокруження в кроветворной н лимфонл-ной тканн // Пробл. гематол. переел, крови. 1973. № 10. С. 14—23.

77. Хаитов P.M. Игнатьева Г А., Сндорович И Г Иммунология.— М-: Медицина» 2002, 536 с.

78. Чайлахян Р.К, Фриденштейн А.Я., Васильев Ю.М. Клонообразование в моиослойных культурах костного мозга//Бюлл экспер. биол, мед. 1970. №2. С. 94-96,

79. Чайлахян Р.К. Динамика формирования фнбробластоподобных клеток в культурах кроветворной ткани // Архив анат., гнет., эмбриол. 1970, 'Г, 68, № 3. С. 73-79,

80. Чайлахян Р.К. Герасимов Ю.В, Изменение содержания етромальных клеток-предшественников у крыс различного возраста // Радиационная иммунология и микробиология; Москва, 1977, С, 84,

81. Чайлахян Р.К. Герасимов Ю.В,, Куралесова А.И. И др. И Известия АН-Серия биологическая. 2001. № 6. С, 682-692.

82. Чай.<1ахян Р.К. Герасимов Ю.В., Фриденштейн А.Я. Перенос костномозгового микроокруження клонамн етромальных механоиитов // Бюлл. экспер, биол, мед. I97S. № 2, С. 765-767.

83. Черешнев В,А., Родионов С.Ю. Черкасов В.А., Малютина Н.Н,» Орлов

84. B.А. Альфа-фстопротенн.— Екатеринбург: УрО РАН, 2004. 376 с.

85. Черешнев В.А., Черкасов В,А,, Васильев Н.В., Родионов С,Ю., Орлов О.А. Применение альфа-фетопротеина в комплексном и комбинированном лечении опухолевых заболеваний, // Вопросы онкологии. 2005. № Г1. C. 57-61.

86. Чертков ИЛ.» Фриденштейн А-Я. Клеточные основы кроветворения.— М,; Медицина, 1977,

87. Чнкклеиа И.О., Халтурина Е.О.» Киселевский М.В. Современные подходы и направления в иммунотерапии и иммунопрофилактике злокачественных новообразований // Молекулярная медицина. 2003. Лг 2. С. 4050,

88. Чкадуа Г.З., Заботила Т.Н., Буркова А.А. Адаптирование методики культивирования дендритных клеток человека нз моноцитов периферической крови для клинического применения // Российский бнотерапевтнческнй журнал. 2002. № 3. С. 56-62.

89. Шмагель К.В., Черешнев В.А, Иммунитет беременной женщины.— М.: Медицинская книга; И. Новгород: над-во НГМА, 2003. 226 с.

90. Ярилин А.А, Апоптоз и его место в иммунных процессах // Иммунология. 1996. №6. С. 10-22.

91. Abclcv G.I. Production of embryonal semur alpha-feloprotein by hepatomas: review of experimental and clinical data // Cancer Res. 1968. Vol. 28.1. P. 1344-1350.

92. Abciev G.I., Pcrova S,D„ Khramkova N.L. Postnikova E.A., Irlin I S. Production of embryonal alpha-globulin by transplantable mouse hepatoma // Transplantation. 1963. № 1. P. 174-178.

93. Able S., Phalcn E,, Ryan M.K, The production of megalocyilc macrocylosis by sistemic factors in SL/SL" mice // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1977.1. V, 155, P. 243-250.

94. Abo Т., Kawamura T. Walanabe И. Physiological responses of extrathimic T cells in the liver И Immunology Review. 2000 V 174(2), P. 135-149.

95. Ackerman A L,, Kyritsis C, Tampe R., Cresswell P., Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens // Рпк Natl. Acad. ScL USA 2003. V. 100, P. 1288912894

96. Akagawa el al. Generation of CDt+RclB+dcndritic cells and tartraie-resislant acid phosphalasc-poeitivc osteoclast-like multinucleated giant cells from human monocyte H Blood, 1996. V. 88. P. 480-483.

97. Akatsu Y., Nakayama Т., Harada M-. Kawano Т., Motohashi S, el at. Expansion oflung V14 NKTcellsby administration of Galactosylccramide-pulscd dcndritic celts// Tpfl. У Cancer Res. 2002. V. 93. P. 397-403.

98. Alexander P Fetal antigens in cancer, Nature 235:137-140, 1972.

99. Allen T.D., Dexter T.M. The essential cells of hemopoeik microcnvironment // Exp. Hemai, 1987. T, 12- P. 517-524.

100. Aramburu J, Garcia-Cozar F., Raghavan A. Okamura H. et al. Selective inhibition of NFAT activation by a peptide spanning the caleineurin targeting site of NFAT // Mo!. Cell. 1998 V I P. 623-637

101. Ardavin C. Martinez del Hoyo G-, Martin P. el al- Origin and differentiation of dcndritic cells Trends in Immunology 2001. V. 22, P. 691-700

102. Ashton B.A., Allen T.D. Hewlett C.R., Eeaglson C.C. ion of bone and cartilage by marrow stromal cells in diffusion chambers in vivo // Clin- Orthop. 1980. V. 152. P. 294-306,

103. Astul P., Viallai J.R., Laurem J.C.r Bradely M., Boutin C- Intrapleural recombinant IL-2 in passive immunotherapy for malignant affusion. Chest. 1993. vol. 103. N 1. p. 209-213.

104. Awaya N. Rupert K, Bryant E. el al. Failure jf adult marrow-dcrivtd stem cells to generate marrow stroma after successful ytmatopoiciic stem cell transplantation// Exp. Hematol. — 2002. V. 30. P. 937-42.

105. Bagby J.C. McCall F,. Layman D.L. Regulation of colomcstimulating activity production: interaction of fibroblast, mononuclear phagocytes and iacto-ferrin //J. Clin. Invest. — 1983. V. 76. P. 340-347.

106. Bulla A., Tuymetova G., Barshishat M. et al. Charac legation of type-H phosphatidyl inositol 4-kinasc isoforms reveals association of the enzymes with endosomal vesicular compartments// J, Biol. Chcm, 2002, V, 15, P. 234-243.

107. В alias C.B. Ziclskc S.P., Gerson S.L, Adult bone marrow stem cells for cell and gene therapies; implication for greater use ft J, Cell. Biochcm. 2002,1. V. 38. P. 20-28.

108. Banchcrcau J,. Stcinman R M. Dendritic cells and the control of immunity H Nature. 1998. Vol. 392, P. 245-252,

109. Banchmann M.F., Lutz M.B., Layton G.T. et al. Dendritic cells process exogenous viral proteins and virus-like particles for class I presentation to CD8+ cytolytic Tcell lymphocytes // Eur. J. Immunol. 1996. N. 26. P. 2595-2600.

110. Barrandon D R., Green M- Cell migration is essentia. for sustained growth of kcratinocytes colonics: the role of TGF-p and EGE-Ccll // — 1987. V. 50.1. P 1131

111. Barratt-Boyes S.M., Walkins S,C„ Finn 0J. In vivo migration of dcndritic cells differentiated in vitro: A chimpanzee model //J. Immunol. 1997.1. V. 158. P 4543-4547.

112. Bartha J.L. Comino-Delgodo R. Arce F., Alba P., Brooullon J.P. Manel Barahona M. Relationship between alpha-fetoprotein and fetal crythrupoiesis //J, Reprod. Med. 1999. V. 44, P. 689-697.

113. Banha J.L, Romcro-Carmona R., Comino-Dclgado R,, Arce F,, Arrabal J, AFP and hematopoietic growth factors in amniotic fluids И Obstet Gynecol. 2000, V % p 588-592.

114. Basse PH. Tissue distribution and tumor localization of effector cells in adoptive immunotherapy of cancer// APMIS Suppl- 1995- V. 55. P. 1-28.

115. Belogortscva N., Molchanova V. Glasunov ct al. Acetyl-glucosamine -specific lectin from the ascidian Drdemnum tematanum // Biochim. Biophys. Acta 1998. V 1380. P. 249-256.

116. Bender A., Bui L.K., Feldman M.A.V. et al. Inactivated influenza virus, when presented on dendritic cells, elicit human Cl>8+ cytolytic T cell responses // J, Exp. Med 1995. N 182 P. 1663-1671

117. Bennett J.A-. Zhu S., Pogano-Mirachi A., Kcllom T A. Jacobsoti H.I, AFP derived from a human hepatoma prevents growth of estrogen-dependent human breast cancer xenograft*. Clin. Cancer Res. 4:2877-2884. 1998.

118. Bendy S.A,, Knutsen Т., Whanpeng J. The origin of the hemopoietic micro-en vironmenl in continuous bone marrow culture // Exp. HemaL 1982. V. 10. P. 367-372.

119. Bendy S,A„ Tralka T.S. Fibronectin-mcdiatcd attachment off hemopoietic cells to stromal in continuous bone marrow culture // Exp. Hematol. 1983. V. II P.129.

120. Bergman R,J, Gazit D. Kahn A , J. et al Age-related Changes in Osteogenic Stem Cells in Mice //J, ot Bone and Mineral Research 1996. v. 11. № 5. P. 568-569.

121. Bergstrand C.G., Czar B, Paper electrophorelic study of human fetal serum proteins with demonstration of a new protein fraction // Stand. J, Clin. Lab Invest. 1957. № 9. P. 277-281.

122. Bcmhard H, Disis ML, Hcimfcld S, Hand S, Gralow J R. Cheever M.A: Generation of immunostimulatory dendnlic cells from human CD34+ hematopoietic progenitor cells of the bone marrow and peripheral blood, // Cancer Res, 1995. V.55.P. 1099.

123. Bcrnsen M R. Van der Velden A,W„ Bvcrsc L,A„ Dulfcns H.F. ct al, // Cancer Immunol, Immunother, 1998, Vol.46. P. 41-47,

124. Bernstein S.E. The cellular basis of the gcncticalte determind defects in anemic mice of genotype SL/SL" // Blood. 1965. V. 26 P. 399,

125. Bcrtolini D.R., Ned win G,E„ Brigman T.S. el al. Stimulation of bone rcsop-iton and ingibition of hone formation in vilro by human tumor necrosis factors//Nature. 1986. V. 319. P.

126. Bindon J., Ruell P et al, // J. Immunol. 1984 Vol. 3. P 475-478,

127. Blankcnstcin T. & SchutcrT. Cross-priming versus cross-tolerance: are two signals enough?//Trends in Immunology. 2002. Vol. 23. P. 171-173.

128. Blardwjy N. ct al Influenza Virus-infected dendritic cells stimulate strong proliferative and cytolytic resonses from human CD8+ T cells HI. Clin. Invest. 1994. N 94 P. 797-809

129. Blumenberg A G., Kisclevski M V., Gorbunova V.A. Volkov S.V., Kada-gidze 7.G. Immunotherapy IL-2/LAK for the treatment of platinum and taxman-resistant advanced U International journal of gynecological cancer. 2002. V. 12. N, 5. P 70.

130. Boyum A. (1968). Isolation of mononuclear cells and granulocytes From human blood. Scand. J. Lab. Invest., 21. SuppI-97.77-89.

131. Bradly T,R,. Mctcalf D, The growth of mouce bone marrow cells in vitro И Austr' J Exp Biol Med Sci 1966. V 44 . P 299

132. Brock D,J,H„ Suicliffc R.G. Alpha-fetoprotein in the antenatal diagnosis of anencephaly and spina bifida. Lancet 2:191-194, 1972

133. Broxmcycr H E . Lu L. Cooper S, Et al Syncrgclie effect of purified recombinant human and murine В ccll growth factor I/ interleukin 4 on colony formation in vino by hematopoietic progenitor cells H J. of Immunol. 1987.1. V, 141, P, 3852-3862

134. Butterfleld L H , Mcng W.S, Koh A et al, T-cell responses to HLA-A*0201-restricted peptides derived from human alpha-fetoprotein // J.Immunol. 2001. Vol 166. № 8 P. 5300-5308.

135. Cardoso E., Valdc* G„ Comint E. //J, Gin, Lab Immunol 1991, V, 34 №4. P. 183-188.

136. Carlcns S., Giltjam M,T Chambers B.J. Aschan J. Guvcn H . Ljunggren H.G. Christensson В. Dilber M.S. A new method for in vitro expansion of cytotoxic human CD3-CD56+ natural killer cells U Hum. Immunol. 2001. V. 62. №4. P. 1092-1098.

137. Castro-Malaspina H, Gay R-, Rcsnic C, et al, Characterisation of human bone marrow fibroblasts colony-forming cells and their progeny // Blood. 1980.1. V. 56. P. 289

138. Caux C. ct al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-liking НУ Exp. Med 1994 V 180 P. 1263-1272.

139. Caux С,, Lcbccquc S., Lie Y-J., Banchereau В Development pathways of human myeloid dendritic cells. In: Lot?.e Т., Tompson A.W. ed. Dendritic cells: Biology and clinical application. Academic Press: San Diego, 1999. P. 63-92,

140. Caux el a., B70/B7-2 is identical ш CD86 an J is ihe major functional ligand for CD28 expensed on human dcndritic cclls //J, Exp. Med, (994, N. 180.1. P. 1841-1847.

141. Cell a M. Sallusto F, Lanzavccchia A: Origin. maturation and antigen presenting function of dendritic cells. //Curr Opin Immuno. 1997, V. 9. P. 10.

142. Cclla M. Bngering A-, Pinet V., Pietras T.r Lanxavccchia A. Inflammatory stimuli induce accumulation of MHC class 11 complexes on dcndritic cells // Nature. 1997 Vol. 388. P. 782-787

143. Chiu C., Dragowska W,, Kim N. ei al.Differential expression of iclomerasc activity in hematopoietic progenitors from adult human bcrnc marrow // Stem Cells. 1996 V 14. P. 239-248.

144. Cho B-K, A proposed mechanism for the induction of cytotoxic T lymphocyte production by heat shock fusion proteins U Immunity, 2000. Vol. 12. P. 263272,

145. Chow C.W., Rincon M., Cavanagh J., Dickens M„ Davis RJ. Nuclear accumulation of NFAT4 by the JNK signal transduction pathway U Science. 1997. V, 278, p, 1638-1641

146. Clarke D., Frisen J. Differentiation potential of adult stem cells //Curr, Opin Genet. Dev. 2001. v. 11. p. 575-580.

147. Colino J,f Snapper C M, Dcndritic cells, new tools for vaccination U Microbes and Infection 2003. V 5. P. 311-319.

148. Colonna M, Trinchicri G, Liu Y J. Plasmacyloid dcndritic cclls in immunity // Nat. Immunol. 2004. V. 5(12}. P. 1219-1226.

149. Colter D.C. Class R„ DiGirolamo C.M., Prockor D.J. Rapid expansion of recycling stem cclls in cultures of plastic-adhcrcnt cclls from human bone marrow П Proc Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 3213-3218.

150. Colter D.S., Sekiya L, Prockop D,J, I Identification of subpopulatiou of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonics of human marrow stromal cclls//2001-Proc. Natl. Acad- Sti.USA-98-7841-7845

151. Coutinho L.H., Testa N.G. Dexter T.M. The myelosupresc cffcct of TNF-y in short and long-term bone marrow cultures I/ Br. J. Hematol. 1986, V. 63.1. P. 517,

152. Cunningham M.W //Clin. Micmbiol. Rev. 2000. V, 13. P. 470,

153. Curry J.L., Trentin J.J. Hemopoietic spleen studies. П. Erytropoiesis //J. Exp. Med, 1967, V, 125, P 703-720.

154. DanilovaT.A. // In Pathogcmc Streptococci, Present and Future. Lancer Publ, St-Pet. 1994. P. 371.

155. Dauer M. Obcrmaier В., Herten J., Haerle C- Mature dendritic cells derived from human monocytes within 48 hours: a novel strategy for dcndritic cell differentiation from blood precursors. // J. Immunol. 2003. V. 170<8).1. P. 4069-4076.

156. De Falco E,, РогсеШ D .Torella A.R, ct al. SDF-involvment in endothelial phenotype fnd ischemia-induced recruitment of bone marrow progenitor cells tt Blood. 2004, V. 104(12). P. 3472-3482.

157. Dc Gowin R., Gibson D., 1978

158. De Ugarte D A. Mori/ono K., Elbarbaiy A. El al. // Cell Tissue Organs 2003, V. 174, N, 3, P. 101-109.

159. Deriglasova J.F., Kulagina N.N. et al. Precursor for fibroblasts in different of hematopoietic cells as detected by the in vitro method /I Ex per. Hernatol. 1974 V, 12, P. 83-92,

160. Dexter T.M. Sromal cell associated haemopoieesis // Devcl. Biol. 1982. № 1. P. 87

161. Dexter T.M,» Allen T.D., Lajlha L.G. Conditions long proliferation of hemopoietic stem cells in culture // J. Cell. Physiol. 1977 V. 91 P. 335-349.

162. Dexter T.M., Testa N.T. Differentiation proliferation of hemopoietic cclls in culture // Methods Gell. Biol. 1976. № 14. P. 387.

163. Dhodapkar M.V., Bhardwaj N. Active immunization оГ humans with dcndritic cells I/ J. Clin. Immunol. 2000, Vol. 20, P. 167-173.

164. Dinarcllo C.A., Obion DJ. et al. Interection stimulates fibroblasts to produce granulocyte macrophage colony-stimulating acti vity and prostaglandin E2 И У Clin, Invest. 1986. V, 78. P, 1316-1323,

165. Dinsmore J,. Rail iff J. Jacoby D. CI al. 1998; Schuldiner V„ Yanuka O. Is-eovitz-Eldor J. ct aL, 2000.

166. Dodd R-. Driekainer K. Lecни-like proteins in model organisms: implications for evolution of carbohydrate-binding activity // Glycobio). 2001- V, 11. P. 12-25.

167. Dominiqucs J.H., Mundy G.R, Osteoblast activating factor // Calcif, Tissue Int. 1980 V. 31. P. 29-34

168. Dorshkind К Regulation of hemopoiesis by bone marrow stromal cells and their products // Ann. Rev Immunol. 1990. V. 8, P. 11-137

169. Ducor P. Miller J.F.A.P., Mouse W. Allman V. Regeneration of Ihemus: histological and cytologicat aspects //Transplantation. 1965. V. 3. P- 639-654,

170. Dudich ILL, Semenkova L.N. Dudich LV. et al. Alpha-fetoprotein-induces apoptosis of canccr cells И Bull Exp Biol. Med 2000. V, 130. № 12,1. P. 1127-1133.

171. El-Badri N.5., Maheshwari A., Sanberg P.R. Mesenchymal stem cells in autoimmune disease // Stem Cells Dev. 2004. V. 13(5). P. 463-472.

172. Emoto M., Kaufmann S.H. Liver NKT cells: an account of heterogeneity // Trends Immunology. 2003- V. 24. № 7. P. 368-369.

173. Enk A H. & jonuleit Ы. Mow do dendritic cells prevent autoimmunity: what is a mature dcndritic ccll in the mouse? // Trends in Immunology. 2001. Vol. 22. P. 547-553,

174. Exley MA & Koxiel MJ. To Be or Not to Be NKT Natural Killer T Cells in the Liver//Hcpatology, 2004 V. 40, №5. P. 1033-1040,

175. Falk C.S., Noessner E., Weiss E.H., Schendel D,J. Retaliation against tumor cells shoing abcrmt IILA expression using lymphokine activated killer-derived T cells // Cancer Res, 2002, V 62. P. 480-187.

176. Feiman R„ Henrikson-De-Stcfano B, ct al, Tumor necrosis factor is an important mediaior of tumor cell killing hymonocytes //J. Immunol. 1987. V. 138. P, 635-640,

177. Ferlazzo G. Wesa A., Wei W.Z., Gull A. Dcndritic cells generated from CD34+ progenitor cells or from monocytes differ m their ability to activate antigen-specific CD8+T cells//J Immunol, 1999, Vot. 163. P, 35-97

178. Fernandez N.C. Flament C., Crepineau F., Angevin E„ Vivier E„ Zitovgel L. Dcndritic cells (DC) promote natural killer (NK) ccll functions; dynamics of the human DC/N К cross talk // Eur. Cytokine Netw. 2002. Vol. 13. P. 17-27.

179. Flores-Romo L. et al. CD40 ligation on human CD34+ hematopoietic progenitors indices their proliferation and differentiation into functional dendritic cells//J. Exp. Med. 1997. V. 185. P. 341-349.

180. Fonlcncau J.F., Larxsoii M. Bhardwaj N. Interactions between dead cells and dendritic cells in the induction of antiviral CTL responses It Curr, Opin. Immunol. 2002. V. 14. P 471-477.

181. Foss F,M. Immunologic mcchanisms of antitumor activity I/ Seimn. Oncol, 2002. Vol. 29 P. 5-11

182. Fowler J.H. Till J.E., Siminovitch L. The cellular for ihe defect in hemopot-csis in flcxcdtatled miccio IL Specificity of the defect for crythropoicsis // Brit. J. Hematol. 1967 V. 13. P. 256.

183. Fowler J.H. Wu A.M., Till E.A . Siminovitch L The cellular composiiion of haemopoietic spleen colonies // J. Cell Physiol, 1967, V. 69. P. 65,

184. Freedman R.S., Platsoncas C.D. Immunotherapy for peritonei ovarian carcinoma metastasis using ex vivo expanded lumorinfiltnHing lymphocytes H 1996. Vol.82, P. 115-116

185. Frcitas 1. Fracchiolla 3., Baranzio G-. Griffmi P. Bertone R., Sitar G.M. Stern cell rccruitmcnt and liver dc-diffcrentiation in MMTV-neu (ErbB-2) transgenic mice // Anticancer Res. 2003. V. 23. № 5A, P. 3783-3794.

186. Frcudcnthal P.S. Steinman R.M. The distinct surface of human blood dendritic cells, as observed alter an improved isolation method H Proc Natl Acad Sci USA. 1990. V. 87 P. 7698.

187. Fridcnstcin A.J. Bone marrow stem cells U In: Cohn D.V., Gloncux F.H-, Martin T.Y. Regulation and Bone Metabolism.— Amsterdam. 1990, V, 10. P. 353-361

188. Fridenstein A.J. Determined and osteogenic precursor cclIs // Hard tissue growdi, repair and remineralization. Ciba Foundation Stmposium (New Scr.) — Amsterdam, 1973. P- 169-185.

189. Fridenstein A.J. Osteogenic stem cells of bone marrow // Bone and mineral rcseach le and Y.A. Kanis, editors. 1990. Elsvier Science (Biochemical Division).

190. Fridenstein A J. Precursor cells tes // Intern. Rev. Cytol. 1976. V. 47. P. 327359.

191. Fridcnstcin A J., Chailakhyan R.K., Gerasimovv U.V. Bone marrow osteogenic stem Cells: uit хпыекш cultivation and transplantation in diffusion chambers//Cell Tissue Kind. 1987 V, 20. P, 263-287,

192. Fridenstein AJ, Chailakhyan R.K., Lalykina K.S. The divelopment of fibroblasts colonics in monolayer cultures of guinea pig bone marrow and spleen cells И Cell Tissue Kind. 1970, V. 3 P. 393-403.

193. Fridenstein A.J. Gcrasimovv U. V, Bone marrow osteogenic slcm cells: шт мшекщ cultivation and transplantation in diffusion chambers //Cell Tissue Kinet. 1987. V. 20. P. 263-287.

194. Fridenstein A J,, twanov-Smolensky A. A., Chailakhyan R.K. Bone marrow stromal mechanocytes in radiochimcras and transplants // Exp. Hemaiol-978, V. 6. P 440-444

195. Fridenstein AJ., Kuralesova A.I. Determined and inductihlc osteogenic precursor in ossis tissue growth, repair and remineralization // Transplantation. 1971. V. 12. P. 99-108,

196. Fridenstein A.J,t Kuralesova A.I, Osteogenic precursors cells of bone marrow in transplantas H Transplantation. 1971 V. 12. № 2. P. 99-108.

197. Fridenstein A.J., Lalikina K.S. Lymphoid cell populations are compartment systems of osteogenesis //Calcif. Tissue Res 1970. T. 41. P. 105-106.

198. Fridenstein A.J. Lalykina K.S. Thymus cells are inducible to osteogenesis // i Immunology. 1972. №2. P. 602-603,

199. Fridenstein AT, Latzinik N-V„ Grosheva A.G., Gorskaya Microenvironment transfer by heterotopic transplantants freshly isolated and culnured cells in porous layer // Exp- Hematol. 1982. V, 10, P, 217-227.

200. Fridenstein A.J , Petrakowa K,W. Kuralesova A.I. et al. Heterotopic trans-plantats of bone ma/row. Analysis of precursors cells for osteogenic and hematopoietic tissues // Transplantation 1968, № 6. P, 230-247,

201. Friedenstein A. Determine! and inducible osteogenic precursor cells // Ciba Found. Symp. 1973- V. II. P. 169-185.

202. Friedenstein A. Precursor cells of mechanocytes И Int. Rev. Cylol, 1976. V 47. P 327-359.

203. Friedenstein A, Stromal-hematopoietic interrelationships: Maximov's ideas and modern models // HamatoL Bluttransfus, 1989- V. 32. P-159-167.

204. Friedenstein A, The development of fibroblast colonics in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells/ A. Friedenstein. R. Chailakhjan, K. Lalykina//Cell Tissue Kinet 1970, V 3, P. 393^103,

205. Friedenstein A,, Chailakhjan R. Lalykina K. The development of fibroblast colonies in nwnolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells // Cell Tissue Kind- 1970. V. 3. P. 393-403.

206. Friedenstein A.J., Latzinik N.V., Gorskaya U-F. et al // Bone and Mineral. 1992. V. 18 P 199-213.

207. Fuji N-, Ucda Y„ Fujiwara H. et al. Antitumor clTect of a-galactosylccramidc (KRN7000) on spontaneous hepatic rneia.sta.ses requires endogenous inter-leukin 12 in the liver// Clinical Cancer Research, 2000, V, 6, № 8, P 33803387.

208. Fujiwara Т., Grimm E. A., Cai D, W, A retroviral wild type p53 expression vector penetrates human lung cancer spheroids and inhibits growth by including apoptosis//Cancer Res. 1993. Vol. 53. P. 4129-4133.

209. Gabius H. Glycobistocbemistry: the why and how of dctcction and localization of endogenous lecti ns tt Anat. Histol. Embryol. 2001. V. 30. P. 3-31.

210. Galvani F.G. Gawky P.M. The effect of a-IFN on long-term hone marrow culture //Lcukcm. Res. 1990. V 14. P.

211. Geigcr J., Hutchinson R-, Hohcnkirk L„ McKdina E. Chang A., Mule J Treatment of solid tumors in children with tumor-lysatc-pulscd dendritic cells // Lancet. 2000. Vol. 356. P. 1163-1165.

212. Gilhoa E., Nair S.K. Lycrly H.K. Immunotherapy of cancer with dendritic-cell-based vaccines //Canccr Immunol Immunothcr. 1998. V, 46. P. 82.

213. Gitlin D, Boesman M. Serum AFP. albumin, and -G-globulin in the human conccptus. J. Clin Invest 45:1826-1830. 1966

214. Globus R.K., Hovel J., Gospodarovwicz D. Cultured bone cells synthesize basic fibroblast growth factor and in their extracellular matrix И Endocrinology, 1989, V P 1534-1547

215. Godfrey D.I., Hammond K .J. Poulton L.D. et al. NKT cells: facts, functions and fallacies // Immunology Today. 2000. № 21. P. 573-583.

216. Godfrey D.L., Kronenberg M, Going both ways; Immune regulation via CD I dp-dependent NKT cells It Clin Invest. 2004. V. 114. P. 1379-1388.

217. Godie D.W., Hoscing W.G., Quan S.G. ct al. Origin of bone marrow fibroblasts It British J Haematol. 1980. V 44 , P

218. Golden-Mason L, O'Farrcly C. Having it all? Stem cells, haematupoiesis and lymphopoiesis in aduh human liver// Immunology Ccll Biol. 2002. V. 80. №1 P 45-51.

219. Gomez del Arco P., Martinez-Martinez S., Maldonado J.L., et al. A role for the MAP kinase pathway in the nuclcar shutting of NFATp. tt J. Biol. Chcm. 2000. V. 275. P. 13872-13878.

220. Goncharova 0-. Dudich E-. Semcnkova L., Gorbatova E., Dudich I. Synergy of a-fcioprotcin and estradiol in suppression of tumor ccll growth, Tumor Biol. 2Q(S2):42, 1999.

221. Gordon M Y., Gordon-Smith E.C- Bone marrow fihroblastoid colony-forming cells (FCF-U) in aplastic anemia: by growth and stimulation of granulocyte macrophage cojony-forming cells (GM-CFC) it British J. Haematol. 1981.1. V. 49 P. 465-482*

222. Gordon M.Y., Gordon-Smith E.C. Bone marrow fibroblasts . .on in relation to granulopoiesis in aplastic anemia /I British J. Haematol. 1983. V, 53.1. P. 483

223. Gordon M.Y,, Riley C-P-, Watt S-M. et al. Compartmeti/ation of a hemoto-poietic growih factor (GM-CSF) by glycosaminoglycans in the bone marrow microenvironmcnt//— 1987. V. 326. P. 403-405.

224. Gowen M., Wood D.D., Ihnc E.J, ct at. Interleukin 1 factor stimulates bt>nc resoption in vitro//Nature. 1983. V. P. 380.

225. Granucci F., Andrews D.M., Degli-Espoli M.A., Ricciardi-Castagnoli P, IL-2 mediates adjuvant effect of dendritic celts U Trends in Immunology. 2002. Vol. 23. P, 169-171.

226. Grecnberg B.R., Wilson F.D. Wood L. Granulopoietic f human bone marrow fibroblastic cells and abnormal ihc granulocytic microcnviromcnt И Blood. 19SI. V 58 P. 153,

227. Grimm A.E. (1986). Human lemphokine-aciivatcd killer (LAK) cells as a po-lemiol immunotherapy! ic modality. Biochim. Biophys.Acta, 865. 267-279.

228. Grimm A.E., Mazumler A.r Zhang H.Z. & Rosenberg A.S. Lymphokine-aetivated killer celt phenomenon. Lysis of natural-ki tier resistant fresh solid tumor by iniericukin-2 activated autologous human peripheral blood lymphocytes. J Exp Med . 155.1823-1843

229. Gronthos S., Graves S., Ohta S. el al. The STRO-1 +■ fraction of adult human bone marrow contains the osteogenic precursors // Blood. 1994. V. 84.p, 4164-4173.

230. Gualde N.D. Altieri D. Goodwin J.S. Effect of lypoximetabohtes of arachi-donic acid on proliferation of в-cclis and T-cells subsets H J. Immunol. 1985. V. 134. P. 1125.

231. Guermonpreit P. Savcanu L. Kleijmeer M. Davoust I., Van Emlert P., Ami-gorena S. ER-phagosomc fusion defines an MHC class I cross presentation compartment in dendritic celts U Nature. 2003. V. 425. P. 397-402,

232. Guo Y-. Xing Z. A study of ytotoxicity of malignant pleural effusion lym-phoctcs and LAK cclls against autologous tumor cells // Chin Med- 1994.1. Vol, 107 N 12. p 903-905.

233. Gupta V„ Rajarman S., Cestanzi JJ. Effect of oxygen oc clonal growth of adherent cells (CFU-f) from different ailment of mouse bone marrow // Exp. Hemat. 1987 V, 15 P 1157

234. Haas N. Falcone F.H , Schranun G,. Haisch K., Gibbs B.F., Klauckc J,, Pop-pclmann M-. Becker W.M., Gabius H.J. Schlaak M. Dietary lectins can induce in vitro release of IL-4 and IL-13 from human basophils It Eur J. Immunol. 1999. №3. P. 918-27

235. Han D.N J. Dendritic cclls: unique leukocytc populations which control the primary immune response / Blood 1997. V. 90 P 3245-3287.

236. Hasebe H„ Nagayama H., Sato K„ Enomoto М.» Takcda Y-. Takahashi T, A., Hasurni K., Eriguchi M. Dysfunctional regulation of the development of monocyte-dcrived dendritic cclls in canccr patients // Bio-med.&Pbannacother. 2000. Vol. 54 P. 291-298.

237. Haynesworth S.E., Dadcr M.A. Caplan A.I. Cytokine ex pre» ion by human marrow-derived mesenchymal progenitor cells in vitro: cffcct of dcxa-mcihasone und L-1 alpha//J Cell. Physiol. 1996- V. 166. P.585-592.

238. Haynesworth S.E., Goshima J., Goldberg V.M., Caplan A.I. Characterization of cells with oncogenic potential from human marrow // Bone. 1992. V, 13. P 81-88.

239. Heard J.M, Fichu I sun S-. Varat D. Role of colony-stimulating activity in murine long-term hone marrow cultures; с for production and consumption by the adherent cells // Blood. 1982. V. 59. p. 761-767.

240. Heidkamp M.C, Bayer A,L. Martin J.L, Samarel A.M. Differeniial activation of mitogcn-aelivated protein kinase С epsiolon and delta in neonatal rat ventricular myocytes // Circ. Res. 2001- V. 89. P. 882-890.

241. Hcldin C .H . Westcrmark B, Growth factors: mcchanisms of action and relation to oncogcns cell // Oncology. 1984. V. 37. P, 9-20.

242. Hensler R., Mantovani L. Ostcr W. Et al. IL4 regulates m-RNA accumulation of macrophage colony-stimulating factor fibroblasts synergism with IL-lp//BriLJ. Hemat. 1990. V. .P. 7-11.

243. Hermon C., Berat V. // Bnt J. Canccr. 1996. Vol. 73. P. 995-960.

244. Hcrzog E.L., Chai L., Krause DS. // Blood 2003 V. 102. P. 3483-93.

245. Ho Um S,. MulhaJl C„ Alisa A„ Ives A.R,. Karani J , Williams R., Hertolelti A. Behboudi S. «-Fetoprotein Impairs APC Fanction and Induces Their Apoplosis //Tlie Journal of Immunology. 2004. St 5 P 1773-1778.

246. Hollings P.E., Fiugerald P H. Heaton D.E. Beard E. Host origin of in vitro bone marrow fibroblasts after bone marrow transplantation in man // Int. J. Cell. Clonnnning. 1984. V, 2. P, 348-35 L

247. Hooper D. С Cohen B. L-. Ducas D. ei al. Selective inhibition of murine T-ccll proliferation and limphokinc-activatcd natural killer cell function hy AFP //Biological activities of alpha-fetoprotein. 1987. Vol. I P 153-167,

248. Hon Т., Mise К., Kan N. Okino Т., Saloh К., Yamasaki S. et al. // Biother-ару. 1992 Vol. 5. P. 21-29.

249. Morton I.E., Raisz L,G., Simmons H.A. ei al. Bone resorption activity in supernatant fluid from cultured human peripheral blood lekocytcs // Scicns, 1972. V 177 P 793-795

250. Howled C.R. Cave J. Williamson M- Et al. Mineralization in vitro of cultures of rabbit marrow stromal cells /1 Gin. Orthop. 1986. V. 213. P. 257263.

251. Hsourigui M. Thabic N. Martin M.E., Benassayag C., Nunc/ E,A, In vivo transient rise in plasma free fatty acids alters the functional properties of al-pha-fctoprotein // Biochim. Biophys. Acta. 1992. 1125. P 157-165,

252. Hsu FJ., Ветке C„ Fagnoni F . Liles T.M., Czerwinski D., Taidi В., Engle-mann E.G., Levy R. Vaccination of patients with B-ccll lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritic cells // Nature. 1996. Vol. 392. P. 245252.

253. Ichmose Y-. Yano Т. Asoh H„ Yokoyama H,, Fukuyama Y. Miyagi J. ct al. // Surg.Gncol. 1997 Vol 66, P. 196-200.

254. Ihaba K. et al. High levels of a major histocompatibility complex ll-self peptide comptexon dendritic cells from lymph node //J. Exp. Med. 1997, N, 186, P. 665-672,

255. Ikeda H., Chamoto K. Tsuji Т., Suzuki Y. Wakita D. Takcshima J.T Nishi-mura T- The critical role of type-1 innate and acquired immunity in tumor immunotherapy // Cancer Sci. 2004. V. 95. Лк 9. P. 697-703.

256. Inaba K,, Inaba M-. Deguchi M. et al. Granulocytes, macrophages, and dem dritic cells arise from a common mujior histocompatibility complex class II-negalive progenitor in mouse bone marrow // Proc, Natl Acad. Sci, USA. 1993, V, 90, P, 3038-3042,

257. Inada K. el al. The tissue distribution of the B7-2 costimulator in mice: abundant expression on dendritic cells in situ and during maturation in vitro // J, Exp. Med. 1994. N. 180, P. 1849-1860

258. Ito T,. Liu YJ,, Kadovvaki N. Functional diversity and plasticity of human dendritic cell subsets // Int. J. Hematol. 2005, V. 81 (31 P 188-196

259. JcfTord M„ Maraskovsky E,. Ccbon J. Davis I.D. The use of dcndritic cells in cancer therapy // Lancet Oncol. 2001. Vol. 2. P. 343-353.

260. Jiang Y,. Jahagirdar В. Remhardt R, et.al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow/ZNature. 2002. V. 418. P. 41-49.

261. Jong E C., Smits H.H., Kapsenbcrg M L Dcndritic ccll mediated T cell polarization // Springer Scmin, Immune. 2005. V. 26. P. 289-307

262. Joyce S., Van Kacr L. CD. -restricted antigen presentation: an oily matter // Curr. Opin. Immunol. 2003. V. 15. P. 95-104

263. Kakimr K, Guidoiti L G, Koezuka Y and Chisari F. V. Natural killer T ccll activation inhibits hepatitis В virus replication in vivo // The Journal of Experimental Medicine. 2000. V. 192. № 7. P. 921-930.

264. Kamcda H.Taketichi Т. // Nippon Rinsho. 2003, Vol, 1 P 228,

265. Kan N., Kodama H,, Ногу T,, Takenaka A.t Yasumunj Т., Kalo 11. et al. // Breast Cancer Res, Treat 1993. Vol, 27 № 3, P. 203-210,

266. Kancko S.4 Motomura S., Ibayashi H. Differentiation of bone marrow-derived fihrohlastoid cloni-forming cells It British J. Haematol. 1982. V, 51. p. 217305,

267. Kasper H.U. Drebber U. Zur Hausen A. et al. Dominance of CD4+ alpha/beta T-cclls and inferior role of innate immune reaction in the liver metastases I/ Anticancer Research. 2003. V. 23. Jfe 4. P. 3175-3181.

268. Kawai K. Terada S. Yokola O- et al. Lectin cytoehemieal demonstraiionof glucosc- and mannosc-contaimng glycoconjugatcs on human reactive astrocytes// Virchows Arch. 2002. V. 44'. P. 584-588.

269. Keel B-A., Eddy K.B., Cho S-. May j.V. Synergistic aciion of purified a-fetoprolem and growth factors on the proliferation of porcine granulosa cells in monolayer culture//Endocrinology. 1991 V. 129. P. 217-225.

270. Keller R. Dcndritic cells: their significance in health and disease // Immunol, Letters 2001 Vol. 78- P. 113-122.

271. Kcnna T,, Mason L,C„ Porcclli S,A, ct al, NKTcclls from normal and tumor-bearing human liver are phenotypically and functionally distinct from murine NKT cells// Journal of Immunology. 2003. V. 166. M- 11 P. 6578-6584.

272. Kiating A„ Singer J,W,, Killcn P D, et al. Donor he in vitro haemopoictic mi-croenvironmem after transplantation in man // Nature. 1982. V. 289. P. 280283.

273. Kirn B.D.H., Yoo КН. Choi K.S. et al. Gene expression profile of cytokine and grow factor during differentiation nf bone marrow-derived mesenchymal stem ccll // Cytokine-2005-31 (2)-119,

274. Knudsen RJ . Dmarcllo C.A. Purification and characterisauon ща a unique human IL-1 from the tumor cell line //J, Ы. 1986 V, 136, P 3311.

275. Krebsbaeh P., Ku/netsov S- Bianco P. et al. /1Сrit. Rev. Oral. BioL Med 1999. V, 10, P. 165-181.

276. Kudo S., Maisuno К., Ogawa M A novel migration pathway for rat dcndritic cells from the blood: Hcpatic sinusoids-lymph translocation // Exp. Med. 1997. N. 185, P, 777-784.

277. Kusia M. Raiajczak M, Raiaje/ak M .Z Bone marrow as a soursc of circulating CXCR4+ nssuc-commitlcd stem cclls// Biol Ccll-2005-97(2M 33-46.

278. Kusia M„ Reca R. et al. Stem cell plasticity revisited: CXCR4-positive cells expressing mRNA for early muscle, liver and ncunil cclls 'hide out' in the bone marrow // Leukemia 2004 V IB P. 29-10.

279. Laborda J., Naval J-. Allouchc M. Et al. Specific uptake of alpha-fetoprotein by malignant human lymphoid cell // Int. J. Cancer. 1987. V, 40, P. 314-318,

280. Lata P.K., Johnson G.R- Monoclonal origin of В-lymphocytes colony-forming cclls in spleen colonics formed by multipotential hemopoietic stem cclls//J. Exp. Med. 1978. V P 1468-1477.

281. Lappin MB, Weiss J.M,. Delating V„ Mai B„ Dittmar П. MaicrC , Mankc K , Grabbe S., Martin S., Simon J, C. Analysis of mouse dendritic cell migration in vivo upon subcutaneous and mini venous injection // Immunology. 1999. Vol. 98 P 181-188

282. Lars son M. HIV-1 and the hijacking of dendritic cells: a tug of war// Springer Scmin. Immune. 2005, V, 26. P, 309-328,

283. Lazaro C.A., Croager E.J. Mitchell С , Campbell J.S., Yu C., Foraker J, et al Establishment, characterization and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes // Hepatology. 2003, V, 38. № 5, P 1095-1106,

284. Lazarus H.M., Haynesworth S.E., Gerson S.L., Caplan A.I. Human bone marrow-derived mesenchymal (stromal) progenitor cells (MCPCs) can not be recovered from peripheral blood progenitor cell collcction // J. Hcmatothcr. 1997 V, 6, P.447-455.

285. Le Douarine N.M., Houssain E,, Jotereau T,Vr, Belo M, of hemopoietic stem cells in embryonic bursa of Fabricius bone marrow studied through interspecific chimeras // Proc. Acad. Sci. 1975. V. 72. P. 2071-2705.

286. Lee J., Sail S. N. and Wetzlcr M. W, Characterization of dcndntic-like cells derived from t(9;22) acute lymphoblastic leukemia blasts // Int. Immunol 2004, V, 16(10). Octobcr I. P. 1377-1389.

287. Lee M., Segal G.M., Bagby G.C. Interleukin I induced bone marrow derived fibroblasts to produce multilinage hemopoietic growth factor// Exp. Hemafol. 1987, V, 15, P. 983-988,

288. Lee R.H., Hsu S.C,, Munoz J. el al. A subset of human rapidly-self renewing marrow stromal cells (MSCs) preferentially engraft in mice // Blood. 2005. ND.

289. Leffcrt H.|„ Sell S. Alplia-fetoprotcin biosynthesis during the growth cycle of differentiated fetal rat hepatocytcs in primaiy monolayer culture. J. Cell. Biol. 61:823-829. 1974.

290. Lcmischka I. The power of stem cclls reconsidered / I. Lemischka // Proc. Natl Acad Sci USA 1999 V 96 P 1493-1499- 39

291. Lima J-E., Sampaio A.L. Henriques M.G., Barja-Ftdalgo C. Lymphocyte activation and cytokine production by Pisum sativum agglutinin (PSA) in vivo and in vitro // Immunopharmacology. 1999. V. 41. № 2. P 147-55.

292. Lin В., Izagnirre C,A„ Aye M.T. et al. Caracterisation of retieulofibmblasioid colonies (CFU-RT) derived from bone marrow and long term marrow cuhurc monolayers//J. Cell. Physiol. 1986 V. 127. P. 45-54

293. LiuX,, Li D. Zhang C., Ba D. cl al. Treatment of 121 patients with malignant effusion due to advanced lung cancer by intrapleural transfer of autologous or allogenic LAK cells combined with rlL-2 Med Set J. 1993. Vol. S. P. 186189.

294. Lodie Т. Btickarz C, Dcvarakonda T. et.al. Systematic analysis of reportedly distinct populations of multipoint bone marrow-derived stem cells reveals a lack of distinction //Tissue Eng. 2002. V, 8. P, 739-751

295. Lord B.J., Wright E-G. Interaction of inhibitors and stimulators in the regulation of hacmopoictic cell proliferation // Lcukcm. Res. 1982. V, 6, P. 541,

296. Lotze M.T., Thomson A.W. / Dcndritic cells. Biology and ctinical applica-lions. Acad. Press. San Diego, London, New York. 1999. P. 214-237.

297. Lucas M,. Gadola S„ Meier U, ct al, Frequency and phenotypc of Circulating Va24/Vpl 1 double-positive natural killer cclls during hepatitis С infection // Journal of Virology 2003. V. 77( 3). P. 2251-2257.

298. Lukarclli E,. Bccchcroni A, Donati D ct al // Biomaterials. 2003. V, 24, P. 3095-100.

299. Luria EA-, Panasuk A.F. Friedenstein A J. Fibroblast colony formation of blood cells//Transfusion. 1971. V. П. P 345,

300. Luria E.A., Panasyuk A.F., Kusmenko G.N., Fridenstein A.J. Freund's adjuvants on the formation of fibroblast colonics by immunocompetent cell population//Celt Immunol. 1972. V, 3. P. 133-136

301. Mackay A.M. Beck S.C. Murphy J.M. ct at. Chondrogenic differentiation of culturcd mesenchymal stem cclts from marrow //Tissue Eng. 1998, V, 4,1. P 415-428

302. Manna S.K, Aggarwal B.B, Differential rcguircmcnt for p56lck in HlV-tat versus TNF-induced cellular responces: effects on NF-kappa B, activator protein-!, c-Jun N-lerminal kinase, and apoptosis // J. Immunol. 2000. V. 164.1. P. 5156-5166.

303. Mantovani L., Hertccsman R., Herrman F. Regulation Of gene expression of M-CSF in human fibroblasts by the acute phase response cytokines TNF- a, IL-6, IL-10II Blut. 1990. P. 75.

304. Maraskovsky E, cl al, Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in F1t3 and ligand-treated mice: Multiple dcndritic cell subpopulation identified//J Exp. Med 1996. V. 184 P. 1953-1962.

305. Marquez С. Trigueros С. Franco J.M., Rami го A.R., Carrasco Y.R. Lopc/-Botct M„ Toribio M L. Identification of a common developmental pathway for thymic natural kilter cells and dcndriiic cclls ft Blood. 1998- V. 911. P. 2760.

306. Marshal. M.J., Nisbct N.W. Evans S Donor origin of in vitro haemopoietic microcnvironmcnt after marrow transplantation in mice /I Expcricnba, 1984. V. 40» P. 385.

307. Maniyama Т., Imai Y, Harada K. ct al. Heterogeneity in leelm-binding characteristics of human lymphokinc-activatcd killer cells//i. Biol, Response Mod. 1990. V 9. P. 378-386.

308. Mattcucci P. Trcsoldi M. Chics G, ct al Intrapleural administration of inter-lcukine-2 and LAK cclls in locally advanced non-small4ell lung cancer // Tumori. 1994 Vol. 80. P. 246-250,

309. Matthew L,A„ Sautcr В., Bhardwaj N. Dcndritic cells acquire antigen from apoptotic cells and induce class I-rcslrieicd CTLs // Nature. 1998. N. 392. P. 86-89.

310. Mauraglia A„ Canccdda R., Quarto R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model // J Cell. Sci, 2000, V 113 P 1161-1166,

311. Mclntry Л.Р,» Bjomson B,H. Human bone marrow stromal cell colonies: response to hydrocortisone and depcndcncc on ;ttclct-dcrivcd growth factor // Exp, Hemat 1986. V, 14 P. 883-889.

312. Menetrier-Caux C., Thomaehot M. C. Albecti L., Montamin G , Blay J.Y- 1L-4 prevents the blockade of dendritic cell differentiation induced by tumor cells // Cancer Res. 2001 Vol. 61, p. 3096-3104.

313. Mctcalf D,» Moore M A, Hacmopoctic cclls // Ed, A, Gubergor and E,A, Tatum.— Amsterdam, London. 1971. 222 p.

314. Mikheyskaya L.„ Molchanova V,» Kunka A. Skobin A-. Glaskova V. Isolation and characterisation of new GatNAc/Gal-speciftc lectin from the sea mussel Crenomytilus Grayanus. Сотр. Biochem. Phy.siol. Vol. 119C, No. I, 45-50, 1998.

315. Milhaud G.» Labat M,L.» Parant M, ct al, linmunobiological defect and it's correction in the osteopetrotic mutant rat // Proc. Nat. Acad. Sci, (977, V, 74 P,339-342

316. MUejewski G J Alpha-fetoprotem as a biologic response modifier relevance to domain and subdomain structure // Proc. Soc. Exp. Biol, Med. 1997,1. V. 215- P. 333-362.

317. Mizcjewski GJ. Alpha-fctoprotein structure and function; rclcvancc to iso-forms, epitopes and conformational variants // Exp. Biol Med (Maywood). 2001. V. 226 P. 377-408.

318. Mizcjewski G.J. Kccnan J.F. ScEiy R.P. Separation of the estrogen-activated growth regulatory forms of alpha-fetoprotein in mouse amniotic fluid // Biol. Rcprod, 1990. V.42, P 887-898.

319. Mizejewski G.J., Warner A,S. Alpha-fctoprolcin can regulate growth in the immature and adult hyophysectomized mouse uterus. J. Rcprod. Fertil. 85:177-185. 1988.

320. Mizuno H. Huakkusoku H. //J. Nippon Med. Sch. 2003, V, 70, N 4, P. 300306.

321. Motser D.E., Coppelson L.W. A thrce-ccll interaction required for induction of the primary immune response in vitro // Proc Nat. Acad. Sci. USA. 1968. V.6I , P. 542-546.

322. Montel A.H., Bochan M.R., Hobbs AJ.t Lynch H.D., Bralmu Z. Fas involvement in cytotoxicity mediated by human NK cells. Cell Immunol 1995: 166:236-46.

323. Moody D.B., Porcelli S-A. Intracellular pathways of CD I antigen presentation // Nat. Rev, Immunol. 2003. V. 3. P, 11-22,

324. Morel P.A. & Feili-Hariri M. How do dendritic cells prevent autoimmunity? //Trends in Immunology, 2001. Vol, 22. P- 546-547.

325. Morse M.A., Clay T.M,, Lyerly H.K. CuiTent status of adoptive immunotherapy of malignancies // Exp. Opin. Biol. Ther. 2002. V. 2. N. 3. P. 237-247.

326. Morse M.A., Coleman R.E., Akabani G„ Nichaus N. Coleman D,. Lyerly H.K. Migration of human dendritic cells after injection in patients with metastatic malignancies // Cancer Res. 1999. Vol. 59. P. 56-58.

327. Morse M,A„ Vrcdcnburgh J J., Lyerly H.K. A comparative study of the generation of dendritic cells from mobilized peripheral blood progenitor cclls of patients undergoing high dose chemotherapy // I. Hemaiother. Stem Cell Res. 1999, Vol. 8, P. 577-584

328. Moskaleva E.Y. Posypanova G.A. Shmyren I.Т., Rodtna A.V., Miuzhnek

329. E.L. Scvcrin E.S., Katukov V.Y. Luzhkov Y.M-. Severin S-E. AFP-medialed targeting: A new strategy to overcome multidrug resistance of tumor ccllsin vitro. Cell. Biol. InL 21:793-799. 1997.

330. Mule JJ. Dcndritic cells: at clinical crossroads// J. Clin Invest 2000. V. 105. N. 6. P. 707-708.

331. Mule JJ. Shu S. Schwarz SX//Scicnce. 1984. Vol. 224. P. 1487-1489.

332. Mule J.J., Shu S., Rosenberg S.A, The anti-tumor efficacy of lymphokine-octivatcd killer cells and recombinant interleukin 2 in vivo // J Immunol. 1985 V. 135. P 646-642

333. Mundi G-R., Rats/. L.G. Cooper R.A. ei al. Evidence of the secretion of an osteoblast stimulating factor// New Engl. J. Med. P 1974. V, 291. p, 10411046

334. Mundy G.R„ Bcrtolini D.R. // In: Endocrinology int. ngr. Scr. 665 (ed. Labris

335. F. Proulk L). Excerpt a Mcdicina. Amsterdam, 1984 P 587-590,

336. Mundy G.R., Lubek R. A. Oppenhemi J.J. Bone resorpting activity in supernatant from lymphoid ccll lines// J Med. 1974. V. 29). V. 290. P. 867-87I

337. Mundy G.R-. Raisz L.G. Big and little forms of the osteoclast activating factor/// Cell Invest. 1977 V 60 P. 122

338. Munker R., Casson J., Ogawa P, Recombinant human TNF produces production of granulocyte-monocyte eolone-stimulating factor// Nature, 1986.1. V. 323. P, 79-83.

339. Murphy G.R., Perussa В., Trichteri G. Effects of TNF and immune INF on proliferation and differentiation of hemopoietic precursors // Exp. Hernat. 1988. V. 16. P. 131.

340. Muul L. M-. Nason-Burchenal K„ Cater C. S. ct al. Development of automated system for generation of human lymphokine-activated killer (LAK) cells foriheadoptive immunotherapy// J, Immunol. Methods. 1987, Vol. 101. P. 171-181

341. Nagao Т., Komatsuda M., Yamanuchi K.„ Arimori S. Fibroblast colonics in monolayer cultures of human bone marrow // J. Clin. Physiol, 1981. V, 108. P. 155.

342. Nair S,K., Morse M-. Boczkowski D., Dimming R-Ц Vasovic L., Gilboa E., Lyerly H.K. Induction of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes in cancer patients by autologous tumor RNA-transfccted dendritic ceils // Ann. Surg. 2002, Vol 235, P 540-549,

343. Nakagawa R. Nagafune l„ Tazunoki Y. ct al. Mechanisms of the antimetastatic cffcct in the liver and of the hcpatocytc injury induced by ct-galjictosylecramide in mice // The Journal of Immunology. 2001. V, 166. Jfcll. P'6578-6584

344. Nechvine E,t Svcdcrsky T.S. ct al. Effect of IL-2, INF-y, and mitogens on the production of TNF-a and p // J. Immunol. 1985. V. 135. P. 2492.

345. Nestle F.O., Alijagic S,. Gillict M . Sun Y., Grabbc S, Dummcr R. Burg G,. Schadendorf D. Vaccination of melanoma patients with peptide- or lurnor lys-alc-pulscd dcndntic cells // Natur. Med. 1996. Vol. 2. P. 328-332.

346. Nijman H.W. ct al. Antigen capture and MHC class II compartments of freshly isolated and cultured human blood dendritic cells // J, Exp. Med, 1995. V. 182, P, 163-174.

347. Nishida S., Endo N„ Yamagiwa H. et al. Number of Osteoprogenitor Cells in Human Bone Marrow Markedly Decreases after Skeletal Maturation // J Bone and Mineral Metab. 1999. v 17, P 171-177.

348. Nouri-Shirazi M., Banchcrcau J., Fay J., Palucka К Dcndritic cell based tumor vaccines // Immunol. Letters. 2000. Vol. 74. P. 5-10.

349. Oriic D,. Kajstura J,. Chimcnti S, ct al. Mobilized bone marrow cclls repair the infracted heart, improving function and survival it Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001. V. 98 P 10344-10349

350. Owen M.E. Linage of osteogenic cells and their relationship to the stromal system // In: Peck W, A. ed- Bone and Mineral Research. Amsterdam Elsvicr 1985. V. 3. P. 1-25.

351. Owen M.E., Cowe J. Joyner С J. Clonal analysis in vitro of osteogenic differentiation of marrow CFU-17/ J. Cell. Biol. 1987. V. 87. P, 731-738

352. Owen M.E., Friedenstein A. J. Stromal stern cells: marrow prived osteogenic precursors // In; Evercd D. Harnett S, cd. Cellular and molecular biology of Vertebrate Hard Tissues Ciba Foundation Symposium 136. Chichester. 1988. P. 42-52.

353. Papadaki H.A„ Kritifcos И.О. Gemctzi C. ei al // Blood, 2002. V 9 P 1610.

354. Park S.H., Kyin Т. Bendelas A. Carnaud C. The contribution of NKT cells, NK cclls. and other gamma-cham-depcndcnt non-T non-B cclls to IL-12-mediaied rejection of tumors // The Journal of Immunology. 2003. V. 170. Jfe3.P 1197-1201.

355. Parmiani G,,Castclli C„ Dalcrba P., Mortarini R,, Rivoltini L. Marincola F.M., Anichini A, Cancer immunotherapy with peptide-based vaccines: what have we achieved? Where are we going? // J- Natl. Cancer Inst. 2002. Vol. 94. P 805-818.

356. Pasare С , Medzhitov R Toll paihway-dependent blockade of CD4+CD25+ T ecll-mediaicd suppression by dendritic cclls // Science. 2003. V. 29991. P. 1033-1036.

357. Patt H.M . Moloney M, A. Bone formation and resorption a reguiremcnt for marrow development // Proc. Soc. exp. Biol. Med. 1970. V. 140. P. 205-301.

358. Patt H.M-. Maloney M, A. Evolution of marrow regeneration is related by transplantation studies// Exp, Cell. Res. 1972. V.71. P. 307

359. Peetre C, Gullberg E„ Nillson E., OUson 1. Effects recombinant tumor necrosis factoron proliferation and differentiation of leukemic and normal hemopoietic cells in vitro// J, Clin Invest 1986 V. 78. P. 1694.

360. It. Pejawar S.S. Parks G.D. Alexander-Miller MA. Abortive versus productive viral infection of dendritic cells with a paramyxovirus results in differential upregulation of select costimulatory molecules // J. Virol. 2005. V. 79(12). P. 7544-7557.

361. Petersen B.E. Grossbard В. Hatch H. Pi L., Deng J., Scott E.W. Mouse A6-positive hepatic Oval cclls also express several hematopoietic stem ccll markers // Hepntology, 2003. V. 37. Л* 3. P. 632-640,

362. Pfeitschifter J. D'Souza S„ MundyG.R. Transforming th factor beta is released from resorbing bone and stimu osteoblast activity //J, Bone Miner Res. 1986. V. 1. P. 294.

363. Phinncy D,G. Building a consensus regarding the nature and origin of mesenchymal stem cells//J. Cell. Biochcm Suppl. 2002. V, 20, РЛ-12.

364. Pierre P- ei al- Developmental regulation of MHC class II transport in moucccse dcndritic cells U Nature 1997. V, 388. P 787-792.

365. Piersma A.H., Brockbank K.C., Pieomacher R.E. Regulation of in vitro mye-lopoicssis by a hemopoietic stromal fibroblastic ccll line // Exp. Hcmaiot-1984. V, 12. P. 617-623.

366. Pielcr J.M. Leenen R-. Egeter M. Langcrhans" ccll histocytosis is caused by dysrcgulation of the E-cadgerin-b-catcnin cascade: A hypothesis // Immunology and Ccll Biology. 1999. N. 77. P. 460-467.

367. Pittengcr M.F., Mackay A.M. Beck S.C ct al. Mulhlincagc potential of adult human mesenchymal stem cells//Sciense. 1999, V. 284. P. 143-147.

368. Pittengcr M.F. Marshak P.R. Mesenchymal stem cells of human adult bone marrow // In: Stem Ccll Biology Eds. Marshak DR., Gardner D.K., Gottlieb D. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001. P. 349374.

369. Pituch-Noworolska A., Majka M. Janowska-Wicczorek A, et al., 2003.

370. Planken E.V. Dijkstia N H, Bakkus M. Willemze R. Kluin-Nelemans J.C. Proliferation of precursor B-lincagc acute lymphoblastic leukaemia by activating the CD40 antigen // Br. J. Haematol. 1996. V. 95. P. 319.

371. Plocmachcr R.E., Vanl Hull E-, Van Sorst P. Studies of the hemopoietic rru-croenvironments: effect of acid mueopolisaccarides and dcxtran sulfate on erythroid and granuloid differentiation in vitro // Exp. He mat. 1978. V. 6.1. P. 311.

372. Prockop D.J., Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoictic tissues //Science. 1997. V. 276. P. 71-74.

373. Raisz L.G, LubcnG.R,. MundyJ.W, ct al. Effect of osteoclast activating factor from human leukocytes of bone metabolism // J, Clin. Invest. 1975. V. 56. P. 408-413426 Rangan S„ 1967

374. Rau J., Juo C. liogan P C Transcription Factors of the NFAT family: regula tion and function//Annu. Rev. Immunol. 1997. V. 15. P. 707-747.

375. Ratajczak M.Z., Kucia M., Reca R, ct al, Stem ccll plasticity revisited: CXCR4-positive cells expressing mRN A for early muscle, liver and neural cells «hide out- in the bone marrow // Leukemia. 2004. V, 18. P, 29-40.

376. Rauie G-, Sistermann J. // Eur. i. Gynaecol. Oncol. 1998. Vol. 19. P. 108112.

377. Rcid C.D.L. Dcndritic cclls and immunotherapy for malignant disease // British J. Haematol. 2001 V. 112. P. 874-887.

378. Reid C.D.L. The dcndritic cell lineage in haemopoiesis // Br. J. Haematol. 1997 V. 96. P. 217-219.

379. Renard N. Lafagc-Pochitaloff M . Durand I. Duvett V. Coignct L. Banchereau J.r Saeland S. Demonstration of functional CD4G in B-lineage acute lymphoblastic leukemia cells in response lo T-ccll CD40 ligand // Blood. 1996. V. 87. P. 5162.

380. Rcnnic D., Jang G. Gcmmel L. Lee F. Control of hemopoiesis by a bone marrow stromal cell clone; lypopolysaharyd and IL-1-inducible production of colony-stimulating factor// Blood. 1987. V. 69. P. 682-691.

381. Rcscigno M ct al. Coordinated events during bactcna-induccd DC maturation // Immunol. Today. 1999. N. 20. P. 200-203.

382. Rcscigno M. Granucci F., Rieciardi-Caslagnoli P. Dcndritic cells at end of Millenium//Immunology and Cell Biology. 1999. N, 77. P. 404-110

383. Reyes M-. Lund T-, Lenvik et al. Purification and cx vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cclls // Blood. 2001. V. 98.1. P. 2615-2625.

384. Reyes R., VerfaillieC Turning Marrow into Brain: In vitro differentiation of post natal human bone marrow stem cclls into neurons, oligodendrocytes, and astrocytes // Blood. 1999. abstract.

385. Romani N., Gruncr S., Brang D. ct al. Proliferating dcndritic cell progenitors in human blood//J, Exp. Med, 1994. V, 180. P, 83-93,

386. Rosenberg S,A, & Lotzc T.M, (1986), Canccr immunotherapy using intcr-leukin-2 activated lymphocytes. Ann. Rev. Immunol., 4.681-709.

387. Rosenberg S-A-, Loize В., Muul L. ct al. Observation in ihc systemic administration of autologous lymphokincactivatc killer cells and recombinant intcr-leukin -2 to patients with metastatic cancer // N. Engl. J. Med. 1985. Vol. 314. P, 1485-1492,

388. Rosenberg S.A., Lotzc В. Yang J,C, ct al. Prospective randomized trial of high dose of IL-2 alone and in conjugation with LAK for treatment of patients with advanced canccr // J. Natl. Canccr Insl. 1993. V. 85, P. 662-632,

389. Rossi M-. Young J.W. Human dendritic cells: potent antigen-presenting cells at ihc crossroads of innate and adaptive immunity// J. Immunol. 2005.1. V 175. P. 1373-1381.

390. Rosso D- Involvement of glycosaminoglycans detachment of early myeloid precursors from bone marrow stromal cells //J, Biochcm, Biophys, Acta, 1981 V, 676. P. 129.

391. Rovcre P., Valitvoto C. Bondanza A. et al. Bystander apoptosis trigger* dcndritic ccll maturation and antigen-presenting function Hi. Immunol. 1998. N. 160, P 2139-2144

392. Ryncarz R.E., Anasetti C. Expression of CD86 on human marrow CD34+cclIs identifies immunocompetent committed precursors of macrophages and dcndritic cells// Blood. 1998, V, 91. N, 10, P 3892-3900.

393. Saclaivalu J., PHsworth L.M el al. Pig catabalin is tbc form of IL-2: cartilage and bone resorption fibroblast make PG collagenase and thymocyte prolifera-lion and augmented in lo one protein // Biochem J. 1984. V. 224. P. 461.

394. Saircnji M., Yanoma S., Moiohashi H,, Kobayashi O,, Okada K. ct al, Indue tion of cytolytic activity of lymphocytes fronicarcinomatous pleural effusion by IL-2 and autologous tumor cclls, Biolhcrapy 1993, vol, 6, N. 4.-p. 281— 290.

395. Sallusto F. Lanzavecchia A. Dendritic cells use macroptnocytosis and Ihe mannosc rcccptor to conccntratc antigen to the MHC class II compartment. Downregulation by cytokines and bacterial products // J. Exp, Med. 1995. V. 182, P. 4229-4236.

396. Sallusto F., Nicolo C, De Maria R.t Corinti S., Testi R. Ceramide inhibits antigen uptake and presentation by dcndritic cells// J. Exp. Med. 1996.

397. Vol. 184. №6. P 2411-2416.

398. Saloncy E,M., Vano T„ Maggiano L, A rapid and highly ve solid phase cn-/.vme immunoassay specific for human tin using a characterized monoclonal antibody//J. Immun. Methods. 1984. V. 72. P. 145-156.

399. Santambrogio L., Sato A,K,, Carven G J. ct al. Extracellular antigen processing and presentation by immature dendritic cells // Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 1999. V 96 Issue. 26

400. Sato T, Locorcgional immunotherapy for liver metastases // Scmin Oncol. 2002. V. 29. N. 2. P. 160-167

401. Schott M- Immunourveillance by dendritic cclls: potential implication for immunotherapy of endocrine cancers // Endocrine-Related Cancer. 2006. V. 13. P. 779-795.

402. Sckiya I,. Larson B.L. Smith J.R, ct al. Expansion of human adult stem cclls from bone marrow stroma: conditions that maximize ihe yields of early progenitors and evaluate their quality // Stem Cclls. 2002. V. 20, P. 530-541.

403. Semenkova L.N., Dudich ЕЛ. Dudich I.V. Induction of apopiosis in human hepatoma cells by alpha-fctoproicin // Tumour Biol. 1997. V. 18» № 5.1. P. 261-273.

404. Scshi В. Kumar S„ King D. Multilineage gene expression in human bone marrow stromal cclls as evidenced by single-cell microarray analysis // Blood Cells Mol. Dis 2003. V 31 P. 268-285.

405. Shadduck R,R., Wahccd A. Grcenberger J., DexterT. Action of clony stimulating factors in a long-term bone marrow cultures // J. Cell. Physiol

406. Shiiba K, Suzuki R., Kawakami K. et al, InterIeukin-2-activated killer cclls: generation in collaboration with interferon and with supressor in cancer patients //Cancer Immunol. Immunoiher. 1986. Vol. 21. P. 119-128.

407. Sibiryak S., Muldasbcv Н.» Sclsky N. Yusupova R Fas (APO-1/CD95.) antigen expression on die pcripherial hlood lymphocytes fPBL) in different disease states // 4tb World cong. Inflammation.— Paris. 1999. P. 245

408. Dev. Biol, 2001 V. 17 P. 435-462;

409. Smith J.R. Pochampally R . Perry A. cl at. Isolation of highly clonogcnic and multipotcntial subfraction of adult stem cclls from bone marrow stroma // Stem cells. 2004. V. 22, P. 823-31.

410. Smyth M.J., Crowe N. Y., Hayakawa Y. ct al- NKT cells conductors of tumor immunity//Current Opinion Immunology. 2002. V. 14 № 2. P. 165-171

411. Soda H„ Koda K„ Yasutoma J. It J. Surg. Oncol. 1999. Vol. 72. P. 211-217.

412. Sombrock MJ-. Siam AJ., Mastcrson A.J. Loughccd S.M, Schakcet M J.

413. MeijerCJ. Pincdo HM, van den Eertwegh AJ., Scheper R.J., de Gruijl T.D. Prostanoids play a major role in the primary tumor induced inhibition of dcndrilic cell differentiation // J. Immunol, 2002, Vol 168, P. 4333^343,

414. Sordi V, Malosio M,L„ Marches! F. et al. Bone marrow mesenchymal stem cells express a restricted set of functionally active chcmocinc receptors capable of promoting migration to pancreatic islcts-2005-106(2)419-27,

415. Suzuki Y., Zeng C.Q.Y., Alpert F. Isolation and characterization of a specific alpha-fetoprotcin receptor on human monocytes // J, Clin, Invest, 1992, V, 90, P. 1530-1536.

416. Svesson M. Stock ingcr B-. Wick M.J Bone marrow-derived dendritic cells can process bacteria for MHC-I and MHC-II presentation to T cell // J. Immunol. 1997. V. 158, P. 4229-4236.

417. Taneja S.S„ Pierce W, Figlin R., Belldegrun A, Immunotherapy of renal cell carcinoma; The era ofinterleukin-2 treatment // Urology. 1995. V. 45. p, 911924.

418. Tatarinov Y.S. Content of embryo-specific alpha-globulin in the blood serum of the human fetus, newborn, and adult man in primary cancer of the liver. Vop Khim SSR 11:20-24. 1965

419. Tavassolli M., Crosby W.H. Transplantation of marrow to amedullary sites It Science. 1968, V 161 P 54-56.

420. Tavassolli M„ Maniatis A., Crosby W.H. Studies of the ovogenesis It Proc. Soc, exp. Biol. Med. 1971. V. 133, P. 878-881.

421. Thompson C.B, Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease // Science. 1995. V. 267 P 1456-1462

422. Tobiumc K,. Saiton M„ Ichijo H. Activation of apoptosis signal-regulating kinase 1 by the stress-induced activating phosphorylation of pre-formed oligomer// J. Cell Physiol. 2002. V. 191. № 1. P. 95-104.

423. Tocsoz D., Dexter T„ Lord B, ct al. The regulation of is in long-term bone varrow cultures. II. Stimulation and ingibition of stem cell proliferation // Blood, 1980, V, 75. P. 562-573.

424. Tolle B.P. Glycosaminoglicans in morphogenesis. Cell histo logy of Extracellular matrix. // N-Y. Plenum. 1981. P. 529

425. Torres J,M., Gcuskens M., Uriel J, Rcceptor-mcdiatcd cndocytosis and recycling of alpha-feioprotein in human ({-lymphoma and T-leukemia cells // Int. J, Cancer 1991. V. 47. P. 110-117.

426. Tosalo G„ Janes K.D., IL-1 induced IL-6 production peripheral blood monocytes // Blood. 1990. V. 75. p. 1 305

427. Trcmain N. Korkko J-, Ibbccson D. MicroSAGE analystsof 2353 expressed genes in a single cell-derived colony of undifferentiated human mcsenchy-malslem cells re veals mRNA of multiple cell lineages // Stem Cells. 2001-V, 19- P, 408-418.

428. Triozzi P.L, Khumun R., Aldrich W.A. Walker M.J. Kim J.A. Jayne.s S Intratumoral injection of dendritic cclls derived in vitro in patients with metastatic cancer// Cancer. 2000. Vol. 89. P. 2646-2653.

429. Liver dendntic cclls (but not bcpalocytes) arc potent activators of IFN-a release by liver NKT cells // The Journal of Immunology. 2001. V. 167. № 3-P. 1413-1422.

430. Ту lor J. A. Articular cartilage cultured with catabo (pig IL-1) synthesis a decreased numder of normal proteoglycan molecules // BiochemJ. 19851. V, 227, P. 869

431. Uriel J., Failly-Crepin C. Villacampa MJ„ Pineiro A., Geuskens M. Incorpu-raliem of AFP by the MCF-7 human breast cancer cell line // Tumour Biol.1984. № 5. P 41-51.

432. Uriel J., Naval J. Labonla J. Alpha-fetoprotein mediated transfer of arachi-donie acid into cultured cloned cells derived from a rat rhabdomyosarcoma// J Biol Cbem, 1987 V. 262. P. 2579-3585.

433. Unci J. Torres J.M,, Anel A- Carrier protein-mediated enhancement of fatty acids transfer into human T lymphocytes // Biochim. Biophys. Acta. 1994. V, 1220 P,231-240,499. Uzan G„ 2004.

434. Valone F.H-. Small E„ MacKezie M et al. Dendritic cell-based treatment of cancer: closing in on a cellular therapy // Canccr J, 2001. V. 7, P, 53-61,

435. Vandenabeele S., Li Wu Dendritic cell origins: Puzzles and paradoxes /I Immunology and Ccll Biology. 1999. N. 77. P. 411-419.

436. Vannuchi S, Fibli C., Cappelleti R. ct al, Glycosaminoglicans changed involved in polymorphonuclear leukocyte activation in vitro //J. Cell Physiol. 1982 V. Ill P 149-151

437. Varma Т.К., Lin C.Y., Toliver-Kinsky Т.Е. et al. Endotoxin-mduced gamma interferon production: contributing ccll types and key regulatory factors // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2002. V. 9. № 3. P. 530-54

438. Vassilopoulos G,. Wang P. Russcl D. 2003

439. Verfaillie С At,, Pera M.F., Landsdoф P.M. II Hematology, 2002. V. I p. 369-396

440. Villacampa M.J. Moro R., Naval i,t Failly-Crepin С . Lamp reave F„ Uriel J Alpha-fetoprotein receptors in a human breast cancer cell line II Biochem. Biophys. Res. Commun 1984. V, 122. P 1322-1327.

441. VollmerC.M., Eilbcr F.C., Butterfield L.H., Ribas A., Economou J.S. Alpha-fetopraiein-speciftc genetic immunotherapy for hcpioecllular carcinoma. Cancer Res. 59:3064-3067,1999,

442. WahJ S.M. Wall! L.M. Modulation of fibroblast growth action by monokines and lymphokincs. // In: Lymphokincs. P, 179.

443. Wakitani S., Caplan A.L. Myogenic cclls derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed toS-azacylidinc // Muscle Nerve. 1995. V. 18, P 1417-1426.

444. Walker. D. Control of borve resoption by hematopoietic cells It J. Exp. Med-1990, V 142, P 651-653

445. Walsh S.R, Bhardwaj N. Gandhil R.T. Dendritic cells and the promise of therapeutic vaccines for human immunodeficiency virus (HIV)-I // Curr HIV Res. 2003. V, 1(2) P 205-216.

446. Wang J., Saffold S„ Cao X., Krauss J. Chen W. Eliciting T celt immunity against poorly immunogenic tumors by immunization with dcndritic cell-tumor fusion vaccines U J. Immunol. 1998. V. 161. P. 5516.

447. Wang W , Alpcri E. // Hematology. 1995. V, 22, № 3. P- 921-928.

448. Wcrtz E,D., Jonson MJ-, Dc Gowin R.J Postiradiation hemopoietic repopula-tion and stromal cell viability tl Rad. Res. 1977. V. 77. P. 214

449. West W.H., Tauer K.W., Yanneli J R. ct al. Constant-infusion IL-2 in adoptive immunotherapy of advanced cancer// N. Engl. J. Mad, 1987. Vol. 316. P. 988-905.

450. Wilscn M-, Bonifcr R., Ostor W ct al. IL4 induced rction of CSF for granulocytes and CSF for macrophages by periferal blood monocytes // Blood. 1987. V. 73. P. 1105-1106.

451. Wilson D.E. A hcmapoictic stroma and microcnvironmcnl // Biblthca hacmat. 1984. V. 48. P. 210-292.

452. Wilson F.D.r O'Grandy L., McNeil C,, Munn S. The formation of bone marrow derived fibroblastic plagues in vitro: mi nary results contrasting these populations to CFU-c // Hematol. 1974. V 2. P. 343-354.

453. Winzlcr C.r Rovere P. Resctgno M, cl al- Maturation stages of mouse dcndritic cells in growth factor-dcpcrvdenl long-term cultures //J, Exp. Med 1997. V. 185. P. 317-328.

454. Wold A.E., Mot as C-. Svanborg C.„ Mestecky J, Lectin rcccptors on IgA iso-types/ZScand. J Immunol. 1994 V 39. P. 195-201.

455. Wolf N.S., Trcntin J J. Hemopoietic colony studies Y. Effect hemopoietic organ stroma on pluripotcnt stem cells /I J. Exp. Med. 1968. V. 127, P. 205.

456. Wright Т., Kinsells M., Keating A., Singer A., Singer V. Proteoglycans in human long-term bone marrow cultures. Biochemical and ultrasructural analysis// Blood. 1986. V 67. P, 1337.

457. Wright-Browne V. McClain K.L. el al, Physiology and pathophysiology of dendritic cells // Human Pathology. 1997. V. 28. N. 563-571

458. Wynn R. Hart C-. Corradi-Penni C, et.nl. A small proportion of mesenchymal stem cells strongly expresses functionally active CXCR4 receptor capable of promoting migration to bone marrow // Blood. 2004. V. 104. P. 26432645.

459. Yachnin S. Demonstration of the inhibitory' effect of human AFP on in vitro transformaiion of human lymphocytes. Proc. Natl. Acad. ScL USA 73:28572860, 1976

460. Yamada K.M., Olden T. Fibronectin-adhesivc glycoprotein ccll surface and blood//Nature, 1979. V, 275, P 175-183.

461. Yamaguchi Y. Ohshita A., Kawabuchi Y. Ohta K. ct al. Adoptive immunotherapy of canccr using aulotogus lymphocytes current status and new strategies//Hum Cell. 2003. V 16. N. 4. P. 183-189.

462. Yoo J.U. Barthel T.S., Nishimura К el al, The chondrogcntc potential of human bone marrow derived mcsenchymalprogemtorT cells // J. BONE Joint. Surg. Am. 1998. V. 80. P. 1745-1757.

463. Young H.E. Steele T,A,. Bray R.A. ct al. Human reserve pluripotcnt mesenchymal stem cells arc present in the connective tissue of skeletal muscle and dermis derived from fetal, adult and geriatric donors // Anat. Rcc. 2001.1. V 264. P. 51-62.

464. Young J.W. Cell fate development in the myeloid system. In: Lot/e T-Tompson A-W. ed. Dcndriiic cells // Biology and clinical application. Academic Press: San Diego. 1999. P 29-49.

465. Zipori P. Sasson T. Adherent cells from mouse bone marrow inhibit and formation of colony stimulating factor (CSF) for myeloid colonies // Exp. Heinat. 1980 V 8 P 816

466. Zucali J R . Broxmcycr H.E. Dinarcllo C.A, ct al. n of early human hematopoietic (BFU-E and CFU-GEMMl precursors cells in vitro by inlerteukin 1-induccd fibroblast ed medium // Blood, 1987, V 69. P, 33-38,

467. Zuk P A . Zhu M , Ashjian P. et al. // Mol. Biol. Cell. 2002. V. 13. X? 12. P. 4279-4295

468. Zuk P.A., Zhu M . Mizuno H, ct al. // Tissue Eng. 2001 V. 7, N 2. P 211 228. Mizuno H. Huakkusoku H. //J. Nippon Med. Sch. 2003- V. 70. N 4. P, 300-306,

Информация о работе

Лебединская, Ольга Витальевна
доктора медицинских наук
Санкт-Петербург, 2007
ВАК 03.00.25

Диссертация

Влияние регуляторных факторов на морфологические, иммунофенотипические, функциональные особенности и дифференцировку стромальных клеток-предшественников и иммунокомпетентных клеток - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы