Влияние редокс-агентов на тирозиновое фосфорилирование белков растений

Петрова, Наталья Валентиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние редокс-агентов на тирозиновое фосфорилирование белков растений
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние редокс-агентов на тирозиновое фосфорилирование белков растений"

На правах рукописи

Петрова Наталья Валентиновна

ВЛИЯНИЕ РЕДОКС-АГЕНТОВ НА ТИРОЗИНОВОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ РАСТЕНИЙ

03.00Л2. - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой стенени кандидата биологических наук

Казань 2008

□03457913

003457913

Работа выполнена в лаборатории сигнальных систем Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Каримова Фатима Габдуллазяновна

доктор биологических наук, Минибаева Фарида Вилевна

доктор биологических наук, Клячко Нелла Леопольдовна

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

(г. Москва)

Защита состоится

16 » 2008 Г. В

на заседании диссертационного совета Д 002.005.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Казанском институте биохимии и биофизики КазНЦ РАН (420111, г. Казань, а/я 30, ул. Лобачевского, 2/31, тел./факс: (843)2927347).

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Казанского научного центра РАН.

Автореферат разослан «.

2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А.Б. Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование роли обратимых посггрансляционных модификаций (ПТМ) белков и их взаимодействия в регуляции клеточной активности -одна из важнейших задач в постгеномную эру. ПТМ могут формировать более 1 млн. молекулярных форм белков, в то время как в геноме человека обнаружено лишь около 30000 генов, кодирующих белки. ПТМ могут контролировать время жизни белков, их активность, клеточную локализацию, фолдинг, секрецию, связывание белков-партнеров и т.д. (Shelton et al., 2005; Walsh et al., 2005).

Наиболее распространенной ПТМ белков является фосфорилирование по специфическим остаткам аминокислот, которое контролируется балансом активности протеинкиназ и протеинфосфатаз. Вычислено, что активность более 30% истинных белков эукариот контролируется фосфорилированием-дефосфорилированием (Cohen, 2004). Внимание привлекает тирозиновое фосфорилирование белков, составляющее небольшую долю от общего фосфорилирования, но являющееся преимущественным механизмом трансмембранного сигналинга в клетках позвоночных, а также играющее ключевую роль в регуляции основных клеточных процессов у различных организмов (Hunter, 2000; Тарчевский, 2001; Manning et al., 2002; Gupta, Luán, 2003).

Активность многих белков регулируется более, чем одним типом ПТМ. Наряду с фосфорилированием редокс-зависимая ПТМ белков влияет на множество аспектов регуляции клеточного гомеостаза во всех типах живых организмов, включая каждую стадию развития растений. ПТМ тиоловых групп остатков цистеина белков пероксидом водорода является преимущественным механизмом редокс-регуляции сигнальной трансдукции (Buchanan, Balmer, 2005). Выявлен редокс-контроль уровня фосфотирозиновых белков позвоночных (Denu, Tanner, 1998). На растениях убедительно показан контроль активности очищенных ферментов, дефосфорилирующих белки по тирозину Л/РТР1, СтяРТР их окислением/восстановлением (Xu et al., 1998; Gupta, Luán, 2003, Dixon et al., 2005). Эти результаты указывают на универсальность каталитического механизма протеинтирозинфосфатаз (ПТФ) эукариот и позволяют исследовать уровень тирозинового фосфорилирования (УТФ) белков растений in vivo. Другие фосфотирозиновые регуляторные белки и белки сигнальных систем растений -мишени редокс-контроля, за небольшим исключением, остаются неидентифицированными. Редокс-регуляпия тирозинового фосфорилирования белков в адаптивных реакциях растений при действии стресс-факторов практически не изучена.

Цель н задачи исследования. В связи с изложенным цель работы заключалась в выявлении влияния редокс-агентов на уровень тирозинового фосфорилирования белков растений и в идентификации конкретных редокс-регулируемых фосфотирозиновых белков корней гороха.

В связи с этим были поставлены следующие задачи: \

1. Выявить фосфотирозиновые белки, уровень фосфорилирования которых регулируется прооксидаитами и антиоксидантами.

2. Идентифицировать фосфотирозиновые белки в корнях гороха методом MALDI-TOF MS (MS/MS).

3. Выявить действие физиологической и токсической концентрации Н2О2 на уровень тирозинового фосфорилирования белков корней гороха и изучить их влияние на пролиферативную активность клеток корней гороха.

Научная новизна работы. Выявлена редокс-регуляция тирозинового фосфорилирования ряда белков растений с помощью экзогенных прооксидантов и антиоксидантов. При поранении и действии in situ прооксидантов выявлен высокий уровень эндогенного содержания П202 в корнях, что коррелировало с повышением уровня тирозинового фосфорилирования белков. Впервые показан значительный вклад активности ПТФ в уровень тирозинового фосфорилирования белков растений, что согласуется с данными, полученными на клетках позвоночных.

Впервые идентифицированы фосфотирозиновые белки растений (21 белок), уровень фосфорилирования которых редокс-зависим; среди них оказались компоненты сигнальных систем, регуляторные, защитные белки, компоненты различных метаболических путей и 3 белка с неизвестной функцией.

Обнаружено, что пероксид водорода в физиологической концентрации вызывает более активное вступление клеток в митоз, в токсической концентрации увеличивает длительность клеточного цикла. Восстанавливающий агент ДТТ элиминирует действие токсической концентрации пероксида водорода, что подтверждает редокс-контроль клеточной пролиферативной активности растений.

Научно-практическая значимость работы. Результаты работы могут быть использованы в фундаментальных исследованиях клеточной активности, в биотехнологических производствах, а также для чтения лекций в университетах, сельскохозяйственных ВУЗах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Часть исследований автора выполнялась в рамках гранта ведущей научной школы № 5492.2008.4. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. Идентификация белков с помощью MALDI-TOF MS (MS/MS) проводилась на базе центра постгеномных технологий института биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН (г. Москва). Данные с использованием конфокальной микроскопии получены при сотрудничестве с н.с. КИББ КазНЦ РАН к.б.н. Мухитовым А.Р.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на 14-ом международном конгрессе FESPB (Краков, Польша, 2004), на 8-ой молодежной школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2004), на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005), на I (IX) международной конференции молодых

ботаннков (Санкт-Петербург, 2006), на втором международном симпозиуме «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006), на итоговых конференциях КИББ КазНЦ РАН (2004, 2007), на конференции молодых ученых КИББ КазНЦ РАН (2005).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 11 научных работ, в том числе 3 статьи, из них 2 статьи в реферируемых журналах и 1 - в сборнике.

Структура и обьем диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 5 таблиц, 7 схем и 23 рисунка. Список литературы включает 265 источников.

1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Объекты исследования. В работе использовали корни 7-ми дневных проростков гороха Pisum sativum L. и культуру одноклеточной водоросли (в логарифмической фазе роста, 10б клеток/мл) Dumliella maritima Theod. Одноклеточная морская водоросль D. maritima Theod. интенсивно используется как удобная модельная система в биохимических и физиологических исследованиях. Обнаружено, что фотосинтез и дыхание этих микроводорослей имеют тесное сходство с высшими растениями (Pick, Israel, 1998; Соа et al., 2001; Katz, Pick, 2001). Кроме того, отсутствие клеточной стенки облегчает проникновение антител в клетки. Растения гороха и культуру водоросли выращивали при 25°С и люминесцентном освещении (10 кЛгокс) с 10-ти часовым фотопериодом. Растения выращивали на !Л среды Хогланда-Арнона 1; для выращивания D. maritima использовали жидкую среду (Абдуллаев, Семененко, 1974).

Корни гороха после отделения от побегов помещали в среду роста, куда добавляли эффекторы. После инкубации кончики корней (0,8 см) фиксировали в жидком азоте и гомогенизировали в среде, содержащей: 50 мМ HEPES, pH 7.5, 1 мМ ДТТ, 1 мМ ПМСФ, 10 мМ ЭГТА, 0,1 мМ ортованадата, 1 мМ теофиллина и 3% поливинилпирролидона, затем центрифугировали при 14000 g в течение 5 мин. Для анализа брали супернатант.

1.2. Определение тирозинового фосфорилирования белков в супернатанте гомогената корней гороха проводили с помощью одномерного или двумерного электрофорезов в 6-20% ПААГ при силе тока 10 мА на гель в течение 120-150 мин с последующим Вестерн-блоттингом при силе тока 150 мА в течение 1 часа. Изофокусировку проб для двумерного электрофореза проводили на стрипах с иммобилизованным градиентом pH 3-10 при силе тока 50 мкА на стрип в течение 40 кВольт-часов. Иммунодетекцию фосфотирозиновых белков на мембране проводили с использованием моноклональных антител PY20 (Amersham). Визуализацию

связывания антител с белками выявляли с помощью ECL-реагента (Amersham). Полученное фиксированное свечение на пленке и гели сканировали на Epson Scaner Perfection 3170 Photo (Япония) для дальнейшей обработки.

1.3. Анализ данных одномерного электрофореза проводили с помощью программы Image Master ID (Англия), а двумерного электрофореза - с помощью программы Flicker (http://open2dprot.sourceforge.net/Flicker) (США). Удельное тирозиновое фосфорилирование выражали как отношение оптической плотности фосфорилированного белка (хемилюминисценция), идентифицированного на радиоавтографической пленке, к оптической плотности того же белка, идентифицированного на мембране, окрашенной Кумасси R-250.

1.4. Определение уровня тирозинового фосфорилирования в клетках Dunaliella maritima Theod. проводили с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа LSM 510 МЕТА (Carl Zeiss, Германия). Клетки водоросли после воздействия эффекторов in vivo фиксировали параформальдегидом (ПФА), обрабатывали 100 мкМ раствором дигитонина, затем первичными антителами к фосфорилированному тирозину (Biosource, USA) и вторичными антителами, конъюгированными с флуорофором ФИТЦ (Calbiochem, USA). Для возбуждения флуоресценции ФИТЦ применяли аргоновый лазер с длиной волны 488 нм. Для исключения автофлуоресценции применяли Х-режим сканирования препаратов с последующей обработкой изображений при использовании алгоритма линейного разложения, позволяющего разделить сигналы, близкие по спектральным характеристикам. Для учета автофлуоресценции исследовали контрольные необработанные клетки D. maritima Theod. Как показали наши исследования, они обладают интенсивной авгофлуоресценцией в области 505-528 нм при длине волны возбуждающего лазера 488 нм, что затрудняет локализацию сигнала от ФИТЦ (эмиссия -519 нм). Для выделения автофлуоресценции от ФИТЦ применяли сканирование препаратов в }.-режимс LSM. Полученные спектры флуоресценции затем были использованы при обработке изображений с помощью алгоритма линейного разложения программой LSM 5 (Release version 4.0).

1.5. Идентификация белков проводилась методом MALDI-TOF MS (MS/MS). Поиск проводился в базе данных NCBl.nr, поддерживаемой NCB1 (http://ncbi.nlm.nih.gov/) с ограниченней по таксону Viridiplantae (зеленые растения). Последовательность аминокислот фрагментов белков, идентифицированных при помощи MALDI-TOF MS (MS/MS), экзаменовали на наличие сайтов фосфорилирования по тирозину, используя базу данных NetPhosK (http://wvAv.cbs.dtu.dk).

1.6. Определение содержания перекиси водорода в корнях гороха проводили с использованием ксиленолового оранжевого (Wolff, 1994).

1.7. Определение митотической активности и хромосомных аберраций проводили, анализируя клетки меристематической зоны главного корня с помощью

светового микроскопа (Carl Zeiss, Германия). Обрабатывали проклюнувшиеся семена 20 мин растворами эффекторов в среде Хогланда-Арнона, затем выращивали на 'А среды Хогланда-Арнона в течение 5 суток при оптимальных условиях. Фиксировали корни каждые сутки в одно и то же время. Митотический индекс вычисляли, учитывая не менее 3000 клеток на точку фиксации.

1.8. Определение количества белка в растворе проводили по методу Бредфорд.

1.9. Статистика. Эксперименты проводили в двух-трех биологических повторпостях. Для электрофореза и конфокальной микроскопии приведены результаты одного характерного опыта. В опытах по определению эндогенного содержания Н202 стандартные ошибки не превышали 11%. Ошибку выборочной доли при вычислении митотического индекса определяли по стандартным методикам (Лакин, 1990).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Механизмы редокс-регуля кии базируются на посггрансляционной окислительной модификации белков, а пероксиду водорода отводится роль вторичного посредника в трансдукции разнообразных сигналов (Rhee et al., 2005, Fedoroff, 2006). Мишенями H202 являются сульфгидрильные, или тиоловые, SH- группы' белковых молекул. Несмотря на наличие многочисленных белков, содержащих тиоловые группы, круг возможных мишеней Н202 ограничен для характерного времени трансдукции из-за различной реакционной способности тиоловых групп в различных белках. Константа ионизации (рКа) SH-групп большинства цистеиновых остатков составляет около 8,5, и при физиологическом значении рН в клетке (-7,4) существенные SH-группы большинства белков остаются неионизированными из-за высокого значения рКа, поэтому они устойчивы к окислению (Kim et al., 2000). Окислению активными формами кислорода (АФК) подвергаются SH-группы с низким значением рКа с образованием сульфеновых (-SOH), сульфиновых (-S02H) и сульфоновых (-S03H) групп или формированием межклеточных и внутриклеточных молекулярных дисульфидных мостиков. Остатки цистеина активного сайта ПТФ - ферментов дефосфорилирующих фосфотирозиновые белки - имеют низкие значения рКа и существуют как тиолат-анионы при нейтральном рН из-за соседства положительно заряженных аминокислотных остатков, которые способны взаимодействовать с отрицательно заряженным тиолатом; таким образом, существенная SH-rpynna ПТФ ионизирована даже при физиологическом значении рН в клетке и может быть окислена, что влечет за собой ингибирование активности ПТФ (Denu, Tanner, 1998). Ингибирование активности ПТФ окислением существенных SH-групп может вызывать значительное повышение содержания фосфотирозиновых белков, так как активность ПТФ выше активности ПТК в 10 раз (Hunter, 1995). Кроме того, окисление существенных SH-групп некоторых ПТК активирует их, также увеличивая содержание фосфотирозиновых белков. Таким образом, окисление ПТФ и ПТК вызывает

повышение содержания фосфотирозиновых белков, а восстановление ферментов тирозинового фосфорилирования - значительное понижение (рис. 1).

Н502

активация

АДФ

f ТИРОЗИНКЙНАЗА

АКТИВНОСТЬ-!

ТИРОЗИНФОСФАТАЗА Акгивность=10

| ингибирование

н3о2

Рис. 1. Схема регуляции тирозинового фосфорилирования белков.

2.1. Выявление фосфотирозиновых белков корней гороха. Наши эксперименты (рис. 2, 3) показати высокую (микромолярную) специфичность использованных моноклональных антител РУ20 к фосфотирозиновым белкам растений. Инкубация антител с 5 мкМ фосфотирозина вызывала драматическое уменьшение связывания антител с фосфотирозиновыми белками корней гороха (рис. 22). Повышение концентрации антигена (фосфотирозина) до 1 мМ (рис. 2-4) привело к полному ингибированию связывания антител с фосфотирозиновыми белками растений.

а б

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Рис. 2. Специфичность связывания антител PY20 с белками экстракта корней Pisum sativum L. (антитела предварительно инкубировали с соответствующим количеством фосфотирозина): а - автограф фосфорилированных по тирозину полипептидов, б - окрашенные Кумасси R-250 полипептиды: 1 - контроль (без добавления фосфотирозина), 2-5 мкМ фосфотирозина, 3-100 мкМ фосфотирозина, 4 - 1 мМ фосфотирозина и 5 - 10 мМ фосфотирозина.

Определение фосфотирозиновых белков методом электрофореза с последующим иммуноблоттингом имеет ограничение из-за низкого содержания фосфотирозиновых

минорных белков (ПТК, ПТФ и ряд других белков сигнальных систем и регуляторных белков, существующих в клетках в единичных копиях (Gygi et al., 2000)), поскольку наблюдается зависимость интенсивности пятен фосфотирозиновых полипептидов (ПП) от содержания белка. В ранних исследованиях на клетках человека фосфотирозиновые белки не обнаруживались у здоровых пациентов или обнаруживались в малом количестве (0,01-0,1% от содержания всех фосфобелков). Причиной тому является более высокая (по крайней мере, в 10 раз) активность ПТФ в клетках позвоночных в сравнении с ПТК (Hunter, 1995). В связи с этим мы использовали корни, отделенные от стеблей - модель стресса, а также другой метод - конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, который позволяет регистрировать общий уровень тирозинового фосфорилирования нативных белков.

Высокую (микромолярную) специфичность использованных для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии первичных (PY20) антител показывают данные рис. 3. После инкубации первичных антител с антигеном (5 мкМ фосфотирозина) интенсивность флуоресцентного свечения ФИТЦ и, соответственно, уровень фосфорилирования белков клеток водорослей по тирозину, уменьшились на 65% (табл. 1) по сравнению с контролем.

ол

'?:' Л'---* " " : 5 J.IM

Vs •:

■> '-• V' '

1 -

5 ЦМ

0Ш

Рис. 3. Специфичность связывания фосфотирозиновых антител PY20 с белками клеток Dunaliella maritima Theod. (красным показана автофлуоресценция, зеленым -флуоресценция ФИТЦ): а - автофлуоресценция, б - контроль, в - контроль специфичности вторичных антител, г-е - контроль специфичности первичных антител (антитела предварительно инкубировали с соответствующим количеством фосфотирозина): г - 5 мкМ фосфотирозина, д - 10 мкМ фосфотирозина, е - 100 мкМ фосфотирозина.

Данные по обработке клеток водорослей лишь вторичными антителами, согласно которым свечение ФИТЦ не детектировалось (рис. 3, в), указывают на отсутствие неспецифического связывания вторичных антител.

Уровень тирозинового фосфорилирования белков зависит от активности ферментов фосфорилирования/дефосфорилирования белков - ПТК и ПТФ. Невысокий (0,3 - 0,5 %) вклад ПТК в уровень тирозинового фосфорилирования белков растений гороха был показан в нашей лаборатории ранее в работах Е.О. Фединой с сотр. (2006). Вклад тирозиновых фосфатаз в содержание фосфотирозиновых белков мы выявляли с помощью специфического ингибитора ПТФ ортованадата натрия. Ванадат ингибирует тирозиновые фосфатазы различных семейств, однако серин/треониновые фосфатазы нечувствительны к ванадату (Huyer et al., 1997; Hulley et al., 2003). По данным 1D-электрофореза ванадат натрия вызывал in situ за 10 минут значительное повышение УТФ 5 полос ПП, а также понижение УТФ Зх полос ПП (рис. 4), что указывает на присутствие в клетках растений различных типов ПТК и ПТФ, регуляция которых осуществляется разными механизмами (Крутецкая, 1998). Повышение УТФ 5 ПП может объясняться ингибированием ПТФ ванадатом (связыванием остатка цистеина ПТФ, что ингибирует образование фосфорильного интермедиата в первой ступени каталитического акта (Huyer et al., 1997)). Понижение УТФ Зх полос ПП могло быть вызвано ингибированием, через ПТФ, ПТК, подобных ПТК src-семейства, обнаруженных в растениях P. Rudrabhatla с сотр. (2006).

19 21 22 26 30 32,6 34 40 45 46 53

Мол.м., кД

Рис. 4. Влияние ванадата натрия in фосфорилирование белков корней Pisum sativum L. Ш - контроль, □ - ванадат (0,1 мМ).

situ

(10 мин) на тирозиновое

Данные по влиянию ингибитора ПТФ - ванадата, полученные с использованием конфокального микроскопа на одноклеточной водоросли D. maritima Theod. (рис. 5, табл. 1) позволяют количественно оценить уровень фосфорилирования белков по тирозину. Анализ данных рис. 5 свидетельствует о 17-ти кратном увеличении уровня фосфорилированных по тирозину белков в клетках водоросли под действием экзогенного ванадата, что указывает на высокий вклад активности ПТФ в определяемый уровень тирозинового фосфорилирования белков.

Рис. 5. Влияние ванадата натрия in vivo (10 мин) на уровень тирозинового фосфорилирования белков клеток Dunaliella maritima Theod. (красным показана автофлуоресценция, зеленым - флуоресценция ФИТЦ): а - контроль, б - ванадат (0,1 мМ).

Табл. 1. Уровень тирозинового фосфорилирования белков D. maritima Theod. при действии in vivo (10 мин) ванадата и после действия антигена на антитела (средняя интенсивность флуоресценции (рис. 2 и 4), полученная с применением программы LSM 5 (Release version 4.0)).

Варианты Средняя интенсивность флуоресценции с учетом площади клеток, отн. ед.

Контроль 1,21

Ванадат (0,1 мМ) 20,53

Обработка антител 5 мкМ фосфотирозина 0,79

Итак, согласно нашим данным (табл. 1, рис. 5), использование ингибитора ПТФ позволило нам выявить 17-ти кратное повышение уровня тирозинового фосфорилирования белков в клетках водоросли в сравнении с выявляемым в контрольных образцах, что согласуется с данными, полученными на клетках позвоночных, свидетельствующими о том, что активность ПТФ выше активности ПТК в 10 раз (Hunter, 1995).

Значительный уровень фосфорилирования белков по тирозину, обнаруженный нами в контрольных вариантах, обусловлен стрессом (отрезанием корней от стеблей и центрифугированием клеток водорослей в ходе эксперимента), который может вызывать повышение внутриклеточного содержания Н202, способного подавлять активность ПТФ окислением их существенных БН-групп. Для того чтобы проверить это, мы измерили внутриклеточное содержание Н202 в корнях гороха после их отрезания от стеблей.

2.2. Изменение содержания перекиси водорода в корнях гороха при механическом стрессе и действии экзогенных эффекторов. Содержание эндогенного Н202, определенное в корнях после их отделения от побегов характеризует динамику стресса (рис. 6). Полученные результаты указывают на высокое содержание эндогенного Н202 в корнях уже через 30 сек после отрезания, что свидетельствует о быстрой продукции пероксида водорода в ответ на стресс. По абсолютным значениям содержание Н202 в наших экспериментах сопоставимо с данными литературы (Атогу е1 а!.. 1992; ВеШпсатр! е1 а!., 2000).

Рис. 6. Влияние механического стресса (отрезание) на эндогенное содержание Н202 в клетках корней Pisum sativum L.

Действие in situ прооксидантов: форболового эфира (ФМА), активирующего через протеинкиназу С НАДФН-оксидазу, (Li et al„ 1994; Cumutte et al„ 2002) и ингибитора каталазы аминотриазола (Gechev, 2002) вызывало повышение содержания Н202 в корнях гороха за все исследуемое время в сравнении с контролем (данные приведены в диссертации). При действии салициловой (СК) и аскорбиновой кислот in situ на отрезанные корни гороха нами также выявлено изменение содержания эндогенной Н202. СК отводят роль ингибитора каталазы (Тарчевский и др., 1999). В наших экспериментах СК повышала эндогенное содержание Н202 в корнях лишь через 30 мин. тогда как за 5-20 минут - понижала в сравнении с контролем. Аскорбат в наших экспериментах вызывал также неоднозначное изменение эндогенного

0.5

г 5 7 10 20 60 120 130

Время, мин

содержапия Н202 за разное время наблюдения. В литературе описана как протекторная функция аскорбата, так и его прооксндантная роль, которая связана с генерацией супероксиданион-радикала (Smirnoff, 2000). По-видимому, с этой функцией аскорбата связано наблюдаемое в наших экспериментах после трех минут действия in situ повышенное содержание эндогенной Н20з. Прооксндантная функция некоторых экзогенных соединений при их действии на растения показана в работе Ф.В. Минибаевой и JI.X. Гордона (2003).

Данные, полученные в этой серии экспериментов, показывают, что механический стресс, а также кратковременное действие экзогенных соединений вызывают значительное изменение внутриклеточного содержания Н202 в корнях гороха, что согласуется с данными литературы (Pastori, Foyer, 2002; Fcdoroff, 2006), и могут объяснить наблюдаемый в наших экспериментах значительный уровень тирозинового фосфорилирования белков в контрольных вариантах (рис. 2, 3, 5) окислением пероксидом водорода существенных SH-групп ПТФ и ПТК.

2.3. Редокс-регуляцня уровня тирозинового фосфорилирования белков растений.

Влияние редокс-агентов на уровень тирозинового фосфорилирования белков позвоночных опосредуется регуляцией активности ферментов ПТК и ПТФ окислением SH-групп в каталитическом центре фермента. По данным литературы, для выявления участия SH-групп в каталитическом механизме ферментов используют алкилирующий агент - йодуксусную кислоту (ЙУК) (Kim et al., 2000; Shelton et al., 2005). Основываясь на этих данных, мы использовали ЙУК, чтобы показать непосредственное участие SH-групп цистеиновых остатков ПТФ в изменении уровня тирозинового фосфорилирования белков. Реакция алкилирования идет по следующей схеме:

R-SH + ICHjCOOH = R-SCH2COOH + HI ЙУК, модифицируя цистеиновые остатки белковых молекул (Michaelis et al., 1934), определяет невозможность функционирования каталитического цистеина ПТФ в качестве акцептора фосфата в первой ступени тирозинфосфатазной активности, что приводит к ингибированию его активности, соответственно, повышению уровня фосфотирозиновых белков. Данные наших экспериментов убедительно демонстрируют повышение йодуксусной кислотой уровня тирозинового фосфорилирования белков за 5 мин действия (рис. 7) в сравнении с контролем: выявлено не менее 20 фосфотирозиновых ПП со значительным уровнем фосфорилирования (рис. 7, б). Известно, что ЙУК связывается только со свободными SH-группами, но не с окисленной формой цистеина и не с дисульфидными комплексами (Lee et al., 1998). Результаты наших экспериментов с йодуксусной кислотой однозначно указывают на непосредственное участие тиоловых групп в регуляции активности ферментов фосфорилирования/дефосфорилирования белков.

<-Л--rj-►

4 Рн 8 4 PH 8

Рис. 7. Влияние йодуксусной кислоты in situ (5 мин) на уровень тирозинового фосфорилирования полипептидов корней Pisum sativum L. а - контроль, б -

йодуксусная кислота (50 мМ). Нагрузка белка в вариантах одинакова.

За 10 мин после отрезания корней (механический стресс) наблюдается значительное число (свыше 50) фосфорилированных по тирозину белков в контрольном варианте (рис. 8, а), что коррелирует с повышенным содержанием эндогенного Н20з по данным рис. 6. По данным 20-электрофореза инкубация отсеченных корней в среде роста с восстанавливающим SH-группы агентом ДТТ in situ за 10 мин вызывала значительное уменьшение числа фосфотирозиновых белков (рис. 8, б), в сравнении с контролем (рис. 8, а). Эти результаты могут объясняться восстановлением активности протеинтирозинфосфатаз, дефосфорилирующих фосфотирозиновые белки. Наши данные по действию ДТТ доказывают, что клетки корней контрольного варианта находятся в состоянии стресса и согласуются с представлениями, принятыми в литературе (Finkel, 2003), что окисление SH-rpynn цистеина белков пероксидом водорода может предотвращаться инкубацией с восстанавливающим агентом ДТТ, способным проникать через мембраны клеток (Мурина и др., 2005), и что результаты, полученные при действии оксидантов, возможно, следует также сравнивать с вариантом с добавлением экзогенного восстанавливающего агента ДТТ.

ущI

Рис. 8. Влияние редокс-агентов in situ на тирозиновое фосфорилирование белков корней Pisum sativum L. а - контроль, б -ДТТ (10 мМ), в-Н202 (1 мкМ), г - Н202 (1 мкМ) + ДТТ (10 мМ), д - Н202 (10 мМ). е - ФМА (2 мкМ).

Удельное тирозиновое фосфорилирование 21 полипептида, идентифицированного методом MALD1-TOF MS (MS/MS), было вычислено с учетом содержания белков в образце (табл. 2).

Табл. 2. Влияние редокс-агентов in situ на удельное тирозиновое

фосфорилирование белков корней гороха (отн. ед.).

№ белка на 2D-геле контроль 10 мМ ДТТ 1 мкМ н202 1 мкМ Н202 +10 мМ ДТТ 2 мкМ ФМА 10 мМ Н202

1 1,30 0,60 lj57 0.79 L53 2,67

2 1,18 0,79 1.02 1.03 1.12 1,42

3 1,37 0,33 1,23 0.41 1,28 1,49

4 0,91 1,22 0,78 0,87 0,66 2,43.

5 0,92 0,58 0,76 0.75 0.86 1,26

6 1,77 0,64 1,90 0,43 1.27 2,07

7 1,45 0,55 1,85 0,48 1.52 1,83

8 1,36 0,74 1.07 1,65 1.50 1.41

9 0,87 1,03 0,81 1,02 1,75 1,35

10 1,11 0,86 1,46 0,97 0,96 1,33

11 1,40 1,44 1,69 1,07 3,43 1.97

12 1,21 1,01 1,08 2,29 2,87 2,05

13 1,27 0,43 0,91 0,72 1,15 1,60

14 1,03 0,83 2,96 0,42 1,15 1,36

15 1,73 0,98 2,04 1.51 2,64 1.74

16 1,64 1,90 1,70 2,54 2,60 1.83

17 1,15 0,75 1,22 0,88 1.36 0.66

18 1,43 0,56 1.15 0,60 1.01 1,26

19 1,27 0,49 1,11 0,48 0,88 1,04

20 1,05 0,38 1.15 0,42 0,84 0,89

21 1,12 0,86 1.05 0,50 0,97 0,61

Полужирным шрифтом выделены значения выше контроля, подчеркнуты

значения выше варианта ДТТ.

Однако действие ДТТ за 10 мин было неоднозначно: наряду со снижением УТФ большинства ПП, ДТТ также вызывал появление дополнительных фосфотирозиновых ПП мол. массы 17 - 22 кД с р/ равным 7.0-7.3 (рис. 8, б). Эти данные могут быть объяснены различием в величинах рКа каталитического цистеина у разных ПТФ и в возможности образовывать тиолатные ионы, а также структурным расстоянием между двумя цистеинами, образующими дисульфиды, что может сильно влиять на возможность быстрой регуляции активности различных ПТФ и других белков изменением внутриклеточного редокс-статуса (СЫап^1, 01гп, 2003). Наши результаты о появлении новых фосфотирозиновых белков в присутствии ДТТ указывают на то, что не все ПТФ корней гороха имеют одинаковые рКа и, соответственно, по-разному

подвергаются редокс-регуляции, что также согласуется с данными, свидетельствующими о том, что ПТФ фасоли относительно нечувствительна к инактивации пероксидом водорода (Dixon et al., 2005).

В качестве экзогенного прооксиданта использовали пероксид водорода (рис. 8, в) в концентрации 1 мкМ, в которой он является сигнальной молекулой (Foyer, 1997; Neill et al., 2002), и действие которой направлено на оптимизацию клеточного метаболизма (Orozco-Cardenas et al., 2001; Vranová et al., 2002). H202, генерируемый в клетках при любом стрессе или физиологическом стимуле, приводит к окислению активного цистеина белков в стабильную, один раз окисленную сульфеновую кислоту (-SOH); однако эта модификация обратима и может служить основой для механизма временного ингибирования активности ПТФ. Эффекты Н202, образуемой при стрессе различными прооксидантными системами, в том числе и за пределами цитоплазмы (в клеточной стенке и плазмалемме) (Pastori, Foyer, 2002), могут также объясняться способностью Н202 проникать в клетки через мембраны и непосредственно окислять SH-группы каталитических центров ПТК и ПТФ в цитозоле. Обнаружено, что Н202 может диффундировать через мембрану по водным каналам (Henzler, Steudle, 2000). Данные 20-электрофореза и иммуноблоттинга показывают, что 1 мкМ экзогенного Н202 за 10 мин in situ (рис. 8, в, табл. 2) вызывал в корнях в сравнении с контрольным вариантом (рис. 8, а, табл. 2) уменьшение УТФ большинства ПП и повышение у 7 ПП, что указывает на сигнальную функцию 1 мкМ Н202. Однако, в сравнении с вариантом, где корни были инкубированы с ДТТ, 1 мкМ Н202 вызывал повышение общего числа и уровня фосфотирозиновых ПП (рис. 8, б, табл. 2), за исключением 3 ПП (№ 4, 9 и 16) для которых наблюдалось понижение УТФ.

При совместном действии 1 мкМ Н202 и ДТТ (рис. 8, г и табл. 2) наблюдается значительное снижение УТФ большинства ПП в сравнении с действием 1 мкМ Н202 отдельно, что убедительно демонстрирует редокс-регуляцию тирозинового фосфорилирования белков корней гороха.

Токсическая концентрация Н202 (10 мМ) вызывала значительное повышение тирозинового фосфорилирования большинства ПП корней гороха за 10 мин in situ (рис. 8, д, табл. 2), что коррелировало с появлением хромосомных аберраций и удлинением клеточного цикла (фаз митоза) (данные приведены в диссертации).

Чтобы продемонстрировать участие внутриклеточных ферментов, катализирующих образование АФК и их гидролиз в изменении уровня тирозинового фосфорилирования белков, были проведены эксперименты с воздействием форболового эфира (рис. 8, е) и аминотриазола (рис. 9) на уровень тирозинового фосфорилирования белков. Действие ФМА (табл. 2, рис. 8) сравнимо с действием 1 мкМ Н202 относительно контроля для 11 ПП (понижение для 8 ПП и повышение для 3 ПП). Неоднозначные изменения УТФ ПП, вызванные ФМА в сравнении с контролем (рис. 8, е, табл. 2) указывают, что кроме действия через супероксидсинтазную сигнальную систему в механизмы действия ФМА, возможно, вносят вклад и другие

сигнальные системы клеток. Известно, что эффект форболового эфира, связанный с увеличением содержания АФК, реализуется через протеинкиназу С, которая помимо активации НАДФН-оксидазы, изменяет содержание ионов Са2+ в клетках(1д et al., 1994; Curnutte et al., 2002). Возможно, изменения уровня тирозинового фосфорилирования белков, наблюдаемые нами при действии ФМА, могут быть связаны с регуляцией активности тирозиновых киназ и фосфатаз компонентами сигнальной сети, чувствительными к изменению содержания Са2+ в клетке, поскольку сами ПТК и ПТФ являются Са2+-зависимыми ферментами (Крутецкая, 1998). Ингибитор каталазы аминотриазол (рис. 9) вызывал при действии in situ, как и ожидалось, повышение уровня тирозинового фосфорилирования белков у большинства полос Г1П, увеличивающееся со временем.

Мол. м., кД

Рис. 9. Влияние аминотриазола in situ за 5 (а) и 10 (б) минут на тирозиновое фосфорилирование полипептидов корней Pisum sativum L.

□ - контроль, I - аминотриазол (10 мМ).

Нами было показано действие аминокислоты пролина на уровень тирозинового фосфорилирования белков корней гороха. Это соединение мы выбрали в связи с тем, что в литературе кроме протекторной роли в качестве осмолита, описана его прямая роль в качестве ловушки синглетного кислорода (Alia et al., 1991), чем определяется его защитная функция в высокой концентрации при повреждениях, вызванных свободными радикалами. В наших экспериментах (данные приведены в диссертации)

инкубация отсеченных корней с 20 мМ пролина вызывала снижение уровня тирозинового фосфорилирования большинства полос ПП корней гороха. Очевидно пролин, вызывая снижение внутриклеточных АФК, предупреждает окисление ПТК и ПТФ, от активности которых зависит уровень тирозинового фосфорилирования белков.

Способность ДТТ восстанавливать in vivo существенные SH-группы ПТФ, соответственно их активность, была продемонстрирована на клетках D. maritima Theod. с использованием конфокального лазерного микроскопа: по данным экспериментов наблюдается значительное уменьшение уровня фосфотирозиновых белков (рис. 10, б) в сравнении с контролем (рис. 10, а). Данные рис. 10 свидетельствуют об антиоксидантной функции аскорбата, т.к. инкубация клеток D. maritima Theod. с 10 мМ аскорбата в среде роста вызывала in vivo за 10 мин уменьшение уровня фосфотирозиновых белков (рис. 10, в), по сравнению с контролем (рис. 10, а).

а б в

Рис. 10. Влияние восстанавливающего агента ДТТ и аскорбиновой кислоты in vivo на тирозиновое фосфорилирование белков клеток D. maritima Theod. за 10 минут воздействия. Показано распределение интенсивности флуоресценции, отражающее уровень тирозинового фосфорилирования. а - контроль, б -ДТТ (10 мМ), в -аскорбиновая кислота (10 мМ). Скопления пиков на графиках отражают отдельные клетки. Координаты X-Y соответствуют плоскости клетки. Изменения цвета от синего к красному отражает увеличение интенсивности флуоресценции (уровень фосфорилирования белков).

Итак, результаты проведенных нами экспериментов указывают на редокс-зависимость тирозинового фосфорилирования значительного числа белков растений. Приведенные данные подтверждают, что экзогенный Н202 в концентрации 1 мкМ (рис. 8, табл. 1) может служить в клетках растений сигнальной молекулой, вызывающей регуляцию внутриклеточного уровня тирозинового фосфорилирования белков. Принимая во внимание доказанную высокую специфичность использованных нами антител к фосфотирозиновым белкам растений, мы можем сделать вывод, что редокс-агенты влияют именно на уровень тирозинового фосфорилирования белков через

гоменение активности в значительной степени ПТФ (следует отметить, что серин/треониновые фосфатазы нечувствительны к окислению пероксидом водорода (Denu, Tanner, 1998; Chiarugi , Buricchi 2007)). Неоднозначный характер этих изменений указывает на множественность ПТФ в клетках растений (Luán, 2002), у которых может различаться рКа, а также на регуляцию ПТК и ПТФ через редокс-чувствительные белки других сигнальных каскадов в клетке, например, Са2+-зависимой сигнальной системы.

2.4. Идентификация белков корней гороха, тирозиновое фосфорилнрование которых контролируется редокс-статусом клетки. Особый интерес для нас представляет идентификация фосфотирозиновых белков сигнальных систем, поэтому 21 белок, уровень тирозинового фосфорилирования которых изменялся под действием редокс-агентов были нами идентифицированы методом MALDI-TOF MS (MS/MS) (табл. 3). Некоторые белки с высоким уровнем фосфорилирования не удалось вырезать для идентификации из-за их низкого содержания в геле. Среди идентифицированных белков можно выделить белки сигнальных систем, регуляторные, защитные и метаболические белки (табл. 3). Характеристика этих белков приведена в диссертации. Последовательность аминокислот фрагментов белков, идентифицированных при помощи MALDI-TOF MS (MS/MS), экзаменовали на наличие сайтов фосфорилирования по тирозину, используя базу данных NetPhosK (http://www.cbs.dtu.dk). Их количество составляет от 1 до 9 (табл. 3, графа N1).

Табл. 3. Белки, идентифицированные из корней Pisum sativum L.,

фосфорилированные по тирозину (достоверны значения выше 65 единиц mowse score, для белков №11,13,14 - достоверны значения выше 42 единиц mowse score)._

№ пятна мМ/pI в геле мМ/р1 теор. N1 Достовер ность mowse score 2 № белка по базе данных NCBI Название белка

1» 15/5.75 114/7.75 8 68 gi|6681366 белок родственный ретинобластоме*

2* 17/5.7 16.6/5.07 4 78 gi|20631 АБК-респонсивнын белок ABR17*

3 25/6.35 47.8/5.56 5 85 g¡| 1169534 енолаза (2-фосфоглнцерат дегидрогеназа)

4 28 28.7/7.07 3 79 gi|27375647 фактор регуляции транскрипции

5* 27/5,7 27/5.52 3 99 gi|20648 L-аскорбатпероксидаза *

6* 30/4.95 29.4/4.71 6 UO gi|4775555 14-3-3 подобный белок*

7* 30/5.2 29.4/4.71 6 102 _gi|4775555 14-3-3 подобный белок*

8 31.2/7.5 35.6/7.07 3 93 gi|3023847 белок, подобный Р-субъединице G-белка*

9* 33.5/7.4 37.4/5.98 3 67 g¡|261212 Р-1,3-глюканаза*

12« 38/7.4 38.5/6.77 5 112 gi|U68410 Цитоплазматическая фруктозо-бисфосфат альдолаза*

13 39/6.45 33.96/5.5 3 65 gi|3114905 редуктаза бензилового эфира фенилкумаровой кислоты

14 39.3/6.5 5 33.95/6.4 6 7 221 gi|652502l НАД(Ф)Н-зависимая оксидоредуктаза, подобная изофлавонредуктазе

15* 39/6.8 38.5/6.77 5 113 gi]l 168410 Цитоплазматическая фруктозо-бисфосфат альдолаза*

16* 38.5/7.2 38.5/6.67 5 174 pi 927505 фруктозо-бисфосфат альдолаза *

17 40/4.5 118/7.85 4 49 gi|39636757 Белок устойчивости к гнили RGA4 [Solanum bulbocastanum|

18 56/5.6 47.7/5.31 5 135 gi42521309 енолаза

19 56/5.7 53/5.69 5 48 gi!29691 168 аденозилгомоцнстеиназа

21 57.5/6.0 1 42.2/7.1 5 92 gi(2055273 гндроксипнруваредуктаза

Неизвестные белки

10 34/6.45 75.3/9.3 6 65 gi 14716946 Предполагаемый полипротеин fCicerarieiinum|

11 34.5/7.2 37.6/7.7 1 60 gi|77745483 Неизвестный белок [Solanum tuberosum!

20 65/6.1 74.5/6.67 9 53 gb|AL022580 Неизвестный белок (Arabidopsis thaliana)

'Число сайтов тирозинового фосфорилирования по базе данных NetPhosK. * - идентифицированы, как белки Pisum sativum L.

Характеризующая величина достоверности mowse score определяется, исходя из

уникальности регистрируемого набора масс для белка из базы данных, количества предполагаемых пептидов и полноты перекрывания последовательности белка

2.5. Влияние Н2Ог и ДТТ на пролиферацию клеток растении. Изменение уровня тирозинового фосфорилирования белков корней гороха в ответ на действие экзогенных соединений является динамическим показателем. Для характеристики влияния редокс-агентов на клеточную активность на интегральном уровне мы определили митотический индекс (МИ) и использовали анафазно-телофазный метод определения частоты хромосомных аберраций. Результаты наших экспериментов показали, что увеличение МИ после кратковременного воздействия 1 мкМ Н202 и 10 мМ ДТТ происходит за счет возрастания относительной длительности профазы, что указывает на активное вступление клеток в митоз; при действии 10 мМ Н202 - за счет увеличения длительности клеточного цикла, главным образом, за счет метафазы, причем, присутствие ДТТ практически полностью снимает эффект 10 мМ Н202. Токсическая концентрация Н202 вызывала увеличение частоты хромосомных аберраций типа мостов хромосом (данные приведены в диссертации). Наши данные о редокс-регуляции тирозинового фосфорилирования белков (рис. 8-10, табл. 2) и влиянии редокс-агентов на клеточную пролиферацию подтверждаются данными (Zhang et al., 1996) о критической роли тирозинового дефосфорилирования гистон-подобной киназы с помощью фосфатазы cdc25 для разрешения митоза в паренхимных клетках табака.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В литературе, несмотря на выявление редокс-чувствительных белков растений, практически отсутствуют данные о фосфотирозиновых белках и уровне их тирозинового фосфорилирования, критичных для передачи сигнала и регуляции клеточного метаболизма растений в норме и при адаптивных реакциях. Использование

адекватных объектов для выявления фоефотирозиновых белков (отсеченных от стеблей корней, испытывающих мощнейший механический стресс, и одноклеточной культуры водоросли Dunaliella maritima Theod., центрифугирование которой вызывало в клетках также стрессовое состояние), позволило нам выявить значительное (более 50) число фоефотирозиновых белков корней гороха. Экспериментальное обнаружение фоефотирозиновых белков в клетках позвоночных представляет проблему в оптимальных условиях, обусловленную более высокой (в 10 раз) активностью - ПТФ, в сравнении с активностью ПТК (Hunter, 1995). Использование специфического для ПТФ ингибитора (Huyer et al., 1997) позволило нам выявить до 10-17 раз больший уровень тирозинового фосфорилирования белков корней гороха и водоросли в сравнении с уровнем контрольных образцов.

Мы выявили более 50 растворимых белков корней гороха, уровень тирозинового фосфорилирования которых находится под редокс-контролем; из них 21 - были идентифицированы методом MALDI-TOF MS (MS/MS). Среди них оказались регуляторные, защитные белки, компоненты сигнальных систем и метаболических путей.

Нам удалось выявить высокую (микромолярную) специфичность связывания использованных антител (PY20) с фосфотирозиновыми белками растений двумя независимыми методами: электрофореза и конфокальной лазерной микроскопии.

Использование хорошо проникающих через клеточные мембраны прооксидантов (экзогенный Н202, ФМА, аминотриазол), восстанавливающего агента ДТТ, аскорбата, аминокислоты пролина позволило нам изменять баланс клеточного редокс-статуса in situ в сторону окисления белковых SH-групп с низким рК3 и их восстановления. Измерение динамики изменения УТФ белков в этих условиях позволило выбрать время действия экзогенных соединений. Доказательством того, что мишенями действия экзогенных редокс-агентов являются SH-группы детектируемых нами с помощью антител PY20 фоефотирозиновых внутриклеточных белков, служат эксперименты с алкилирующим SH-группы белков агентом - йодуксусной кислотой.

Показана сигнальная функция 1 мкМ Н202, выражающаяся в неоднозначном изменении УТФ ПП корней гороха и в повышении митотического индекса за счет более активного вступления клеток в митоз (в профазе); тогда как токсическая концентрация 10 мМ Н202 вызывала значительное повышение УТФ ПП, увеличение митотического индекса за счет увеличения длительности клеточного цикла и появление хромосомных аберраций.

специфичность использованных нами антител к фосфотирозиновым белкам растений, мы можем сделать вывод, что редокс-агенты влияют именно на уровень тирозппового фосфорилирования белков растений через изменение активности в значительной степени ПТФ. Неоднозначный характер этих изменений указывает на множественность ПТФ в клетках растений (Luán, 2002), у которых может рахтичаться рКа, а также на регуляцию ферментов, осуществляющих тирозиновое

фосфорилирование/дефосфорилирование белков, через редокс-чувствительные белки других сигнальных каскадов в клетке, например, Са2+-зависимой сигнальной системы.

Мы не исключаем влияния редокс-регуляции белков-субстратов ПТК и ПТФ на их уровень тирозинового фосфорилирования.

Прооксиданты Антиоксиданты

i i

Ингибирование Восстановление

активности ПТФ активности ПТФ

I 1

Изменение уровня тирозинового фосфорилирования регуляторных белков, компонентов сигнальных и метаболических путей

Регуляция клеточных процессов i

Адаптация растений

Рис. 11. Схема влияния редокс-агентов на тирозиновое фосфорилирование белков растений через регуляцию сигнальных систем клеток.

ВЫВОДЫ

]. Впервые показано редокс-зависимое тирозиновое фосфорилирование белков растений в экспериментах in vivo и in situ.

2. Идентифицирован методом MALDI-TOF MS (MS/MS) 21 редокс-регулируемый фосфотирозиновый белок. В их число входили белки сигнальных систем, регуляторные, защитные белки и компоненты метаболических путей. Определено количество потенциальных сайтов (1-9) тирозинового фосфорилирования в идентифицированных редокс-регулируемых фосфотирозиновых белках.

3. Подтверждена сигнальная функция Н202 в физиологической концентрации 1 мкМ в редокс-регулируемом изменении уровня тирозинового фосфорилирования белков корней гороха, а также в пролиферативной активности клеток корней гороха, вызывая более активное вступление клеток в митоз. Установлено, что высокая

концентрация Н202 (10 мМ) вызывала хромосомные аберрации и увеличение длительности клеточного цикла.

4. Впервые показано значительное (в 17 раз) увеличение уровня тирозинового фосфорилирования белков в клетках D. maritima Theod. при добавлении специфического ингибитора протеинтирозннфосфатаз ванадата. Это доказывает значительный вклад протеинтирозинфосфатаз в уровень тирозинового фосфорилирования белков растений.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Петрова, Н.В. Н202 и салициловая кислота индуцируют тирозиновое фосфорилирование белков в растениях. / Н.В. Петрова, О.Ю. Захарова, Ф.Г. Каримова // Тез. докл. / Объед. научно-тех. изд-во ПНЦ РАН. - Пущино, 2004. - С. 25.

2. Petrova, N. Plant protein tyrosine phosphorylation induced by H202 and salicylic acid / N. Petrova, 0. Zakharova, F. Karimova // The 14111 Federation of European Societies of Plant Biology: Abstracts. - Cracow. 2004. - P. 135.

3. Петрова, Н.В. Влияние H202 на тирозиновое фосфорилирование белков растений / Н.В. Петрова, Ф.Г. Каримова // Сб. мат-в / Объед. научно-тех. изд-во ПНЦ РАН. - Пущино, 2005. - С. 375-377.

4. Петрова, Н.В. Н202-индуцированное тирозиновое фосфорилирование изоформ полипептидов корней гороха / Н.В. Петрова, Ф.Г. Каримова, И.А. Тарчевский // Тез. докл. / Объед. научно-тех. изд-во ПНЦ РАН. - Пущино, 2005. - С. 89.

5. Petrova, N. Plant protein tyrosine phosphorylation is regulated by cell redox-state / N. Petrova, F. Karimova, // XV Congress of Federation of European Societies of Plant Biology: Abstracts. - Lyon. 2006. - P. 172.

6. Каримова, Ф.Г. Влияние H202 на фосфорилирование по тирозину белков гороха / Ф.Г. Каримова, Н.В. Петрова // Физиология растений. - 2007. - Т. 54, № 3. -С. 365-372.

7. Метод конфокальной лазерной сканирующей микроскопии в выявлении тирозинового фосфорилирования белков растений / А.Р. Мухитов, Н.В. Петрова, О.В. Власова, Ф.Г. Каримова II Ученые записки Казанского государственного университета, сер. Естественные науки. - 2008. - Т. 150, кн.2. - С. 141-153.

Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю д.б.н., проф. Ф. Г. Каримовой за всестороннюю помощь в ходе выполнения и написания работы, акад. И.А. Тарчевскому за советы при обсуждении работы, к.б.н., н. с. лаборатории микроскопии КИББ КазНЦ РАН А.Р. Мухитову за помощь в проведении микроскопических исследований и обсуждении полученных результатов, И.Ю. Торопыгину за проведение идентификации белков с помощью метода MALDI-TOF MS, а также сотрудникам лаборатории сигнальных систем КИББ КазНЦ РАН за постоянную поддержку.

Отпечатано в «Оперативной типографии» ИП ЛогазаЛ.С. ИНН 166109345069 г. Казань, ул. Московская, 43/6; тел: 251-25-97,292-00-91 Тираж 100 экз. Формат 147*210мм бумага офсетная

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Петрова, Наталья Валентиновна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Понятие редокс-сигналинга

1.2. Активные формы кислорода

1.2.1. Пути образования АФК в клетках.

1.2.2. Защита qt АФК.

1.3. Редокс-сигналинг

1.3.1. Роль АФК в передаче сигнала.

1.3.2. Редокс-регуляция белков.

1.4. Тирозиновое фосфорилирование белков.—.

1.4.1. Тирозиновые прогеинкиназы.

1.4.2. Тирозиновые протеинфосфатазы.

1.5. Редокс-регуляция ферментов тирозин-киназного каскада

1.5.1. Киназы и фосфатазы в передаче редокс-сигнала.

1.5.2. Редокс-регуляция тирозинфосфатаз.

1.5.3. Редокс-регуляция тирозинкиназ.

1.6. Изучение тирозинового фосфорилирования в растениях

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследования---------------------------------------------------—.

2.2. Условия культивирования.

2.3. Определение тирозинового фосфорилирования белков —.—

2.3.1. Приготовление образцов.

2.3.2. Одномерный электрофорез по методу Laemmli.

2.3.3. Двумерный электрофорез.

2.3.4. Метод полусухого блотирования (Вестерн-блотинг).

2.3.5. Иммунодетекция тирозинового фосфорилирования белков.

2.3.6. Детектирование хемилюминесценции.

2.3.7. Анализ данных, полученных с помощью методов одномерного и двумерного электрофореза.

2.3.8. Метод конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

2.4. Идентификация белков методом MALDI-TOF MS

2.4.1. Трипсинолиз белкового образца.

2.4.2. Регистрация масс-спектров.

2.4.3. Идентификация белков.

2.5. Определение специфичности использованных антител

2.6. Определение содержания Н2О2 в клетках корней гороха

2.7. Определение митотической активности и хромосомных аберраций

2.7.1. Приготовление цитогенетических препаратов.

2.7.2. Вычисление митотического индекса и частоты аберраций.

2.8. Определение количества белка в растворе по методу Бредфорд

2.9. Химические реактивы и материалы----------------------------.—

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выявление фосфотирозиновых белков корней гороха

3.2. Изменение содержания Н202 в корнях гороха при различных видах стресса и действии экзогенных эффекторов

3.3. Редокс-регуляция уровня тирозинового фосфорилирования белков растений

3.4. Идентификация белков корней гороха, тирозиновое фосфорилировапие которых контролируется редокс-статусом клетки.-.—

3.5. Влияние Н202 и ДТТ на пролиферацию клеток растений

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние редокс-агентов на тирозиновое фосфорилирование белков растений"

Актуальность проблемы.

Исследование роли обратимых посттрансляционных модификаций (ПТМ) белков и их взаимодействия в регуляции клеточной активности — одна из важнейших задач в постгеномную эру. ПТМ могут формировать более 1 млн. молекулярных форм белков, в то время как в геноме человека обнаружено лишь около 30000 генов, кодирующих белки протеома. ПТМ могут контролировать время жизни белков, их активность, клеточную локализацию, фолдинг, секрецию, связывание белков-партнеров и т.д. (Shelton et al., 2005; Walsh et al., 2005).

Наиболее распространенной ПТМ белков является фосфорилирование по специфическим остаткам аминокислот, которое контролируется балансом активности протеинкиназ и протеинфосфатаз. Вычислено, что активность более 30% истинных белков эукариот контролируется фосфор илированием-дефосфорилированием (Cohen, 2004). Внимание привлекает тирозиновое фосфорилирование белков, составляющее небольшую долю от общего фосфорилирования, но являющееся преимущественным механизмом трансмембранного сигналинга в клетках позвоночных, а также играющее ключевую роль в регуляции основных клеточных процессов у различных организмов (Hunter, 2000; Тарчевский, 2001; Manning et al., 2002; Gupta, Luan, 2003).

Активность многих белков регулируется более, чем одним типом ПТМ. Наряду с фосфорилироваиием редокс-зависимая ПТМ белков влияет на множество аспектов регуляции клеточного гомеостаза во всех типах живых организмов, включая каждую стадию развития растений. ПТМ тиоловых групп остатков цистеина белков пероксидом водорода является преимущественным механизмом редокс-регуляции сигнальной трансдукции (Buchanan, Balmer, 2005). Выявлен редокс-контроль уровня фосфотирозиновых белков позвоночных (Denu, Tanner, 1997). На растениях убедительно показан контроль активности выделенных и очищенных ферментов, дефосфорилирующих белки по тирозину ^?РТР1 и GvwPTP, их окислением/восстановлением (Xu et al., 1998; Gupta, Luan, 2003, Dixon et al., 2005). Эти результаты указывают на универсальность каталитического механизма протеинтирозинфосфатаз (ПТФ) эукариот и позволяют исследовать уровень тирозинового фосфорилирования (УТФ) белков растений in vivo и in situ. Другие фосфотирозиновые регуляторные белки и белки сигнальных систем растений -мишени редокс-контрол я, за небольшим исключением, остаются неидентифицированными. Редокс-регуляция тирозинового фосфорилирования белков в адаптивных реакциях растений при действии стресс-факторов практически не изучена.

Цель и задачи исследования.

Цель работы заключалась в выявлении влияния редокс-агентов па уровень тирозинового фосфорилирования белков растений и в идентификации конкретных редокс-регулируемых фосфотирозиновых белков корней гороха.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) Выявить фосфотирозиновые белки, уровень фосфорилирования которых регулируется in vivo и in situ прооксидантами и антиоксидантами.

2) Идентифицировать фосфотирозиновые белки корней гороха методом MALDI-TOF MS (MS/MS).

3) Выявить действие физиологической и токсической концентрации НгСЬ на уровень тирозинового фосфорилирования белков корней гороха и изучить их влияние на пролиферативную активность клеток корней гороха.

Научная новизна работы.

Выявлена редокс-регуляция тирозинового фосфорилирования ряда белков растений с помощью экзогенных прооксидантов и антиоксидантов. При поранении и действии in situ прооксидантов выявлен высокий уровень эндогенного содержания Н202 в корнях, что коррелировало с повышением уровня тирозинового фосфорилирования белков. Впервые показан значительный вклад активности ПТФ в уровень тирозинового фосфорилирования белков растений, что согласуется с данными, полученными на клетках позвоночных.

Впервые идентифицированы фосфотирозиновые белки растений (21 белок), уровень фосфорилирования которых редокс-зависим; среди них оказались компоненты сигнальных систем, регуляторные, защитные белки, компоненты различных метаболических путей и три белка с неизвестной функцией.

Научно-практическая значимость работы.

Результаты работы могут быть использованы в фундаментальных исследованиях клеточной активности, в биотехнологических производствах, а также для чтения лекций в университетах, сельскохозяйственных ВУЗах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования.

Часть исследований автора выполнялись в рамках гранта ведущей научной школы № 5492.2008.4. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. Идентификация белков с помощью MALDI-TOF MS проводилось на базе центра постгеномных технологий института биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН (г. Москва). Данные на конфокальном микроскопе получены в сотрудничестве с п.с. КИББ КазНЦ РАН к.б.н. Мухитовым А.Р.

Апробация работы.

Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на 14ом международном конгрессе FESPB (Краков, Польша, 2004), на 8ой молодежной школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2004), на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005), на I (IX) международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006), на втором международном симпозиуме «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006), на итоговых конференциях КИББ КазНЦ РАН (2004, 2007), на конференции молодых ученых КИББ КазНЦ РАН (2005).

Публикации.

По материалам диссертационной работы опубликовано 11 научных работ, в том числе 3 статьи, из них 2 статьи в реферируемых журналах и 1 — в сборнике.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Петрова, Наталья Валентиновна

выводы

1. Впервые показано редоке-зависимое тирозиновое фосфорилирование белков растений in vivo и in situ.

2. Идентифицирован методом MALDI-TOF MS (MS/MS) 21 редокс-ретулируемый фосфотирозиновый белок. В их числе оказались белки сигнальных систем, регуляторные, защитные белки и компоненты метаболических путей. Определено количество потенциальных сайтов (1-9) тирозинового фосфорилирования в идентифицированных редокс-регулируемых фосфотирозиновых белках.

3. Подтверждена сигнальная функция Н202 в физиологической концентрации 1 мкМ в редокс-регулируемом изменении уровня тирозинового фосфорилирования белков корней гороха, а также в пролиферативной активности клеток корней гороха, вызывающая более активное вступление клеток в митоз. Установлено, что высокая концентрация Н202 (10 мМ) вызывает хромосомные аберрации и увеличение длительности фаз митоза.

4. Впервые показано значительное (в 17 раз) увеличение уровня тирозинового фосфорилирования белков в клетках D. maritima Theod. при добавлении специфического ингибитора протеинтирозинфосфатаз ванадата. Это доказывает значительный вклад протеинтирозинфосфатаз в уровень тирозинового фосфорилирования белков растений.

- 110-ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В литературе, наряду с выявлением редокс-чувствительных белков растений, практически отсутствуют данные о редокс-чувствительных фосфотирозиновых белках и уровне их тирозинового фосфорилирования, критичных для передачи сигнала и регуляции клеточного метаболизма растений в норме и при адаптивных реакциях. Использование адекватных объектов для выявления фосфотирозиновых белков (отсеченные от стеблей корни, испытывающие мощнейший механический стресс, и культура одноклеточной водоросли Dunaliella maritima Theod., центрифугирование которой вызывает в клетках также стрессовое состояние), позволило нам выявить значительное число фосфотирозиновых белков растений. Экспериментальное обнаружение фосфотирозиновых белков в клетках позвоночных представляет проблему в оптимальных условиях, обусловленную более высокой (в 10 раз) активностью — ПТФ, в сравнении с активностью ПТК (Hunter, 1995). Использование специфического для ПТФ ингибитора (Huyer et al., 1997) позволило нам выявить до 17 раз больший уровень тирозинового фосфорилирования белков корней гороха и водоросли в сравнении с уровнем контрольных образцов.

Мы выявили более 50 растворимых белков корней гороха, уровень тирозинового фосфорилирования которых находится под редокс-коптролем; из них 21 - были идентифицированы методом MALDI-TOF MS (MS/MS). Среди них оказались регулягорные, защитные белки, компоненты сигнальных систем и метаболических путей.

Использование хорошо проникающих через клеточные мембраны прооксидантов (экзогенный Н202, ФМА, аминотриазол), восстанавливающего агента ДТТ, аскорбата, аминокислоты пролина позволило нам изменять баланс клеточного редокс-статуса in situ в сторону окисления белковых SH-групп с низким рКа и последующего восстановления этих групп. Измерение динамики изменения УТФ белков в этих условиях позволило выбрать время действия экзогенных соединений. Доказательством того, что мишенями действия экзогенных редоксагентов являются SH-группы ПТФ, от активности которых зависит УТФ детектируемых нами с помощью антител PY20 фосфотирозиповых внутриклеточных белков, служат эксперименты с алкилирующим SH-группы белков агентом — йодуксусной кислотой.

Показана сигнальная функция 1 мкМ Н202, выражающаяся в неоднозначном изменении УТФ ПП корней гороха и в повышении митотического индекса за счет более активного вступления клеток в митоз; тогда как токсическая концентрация ЮмМ Н202 вызывала значительное повышение УТФ Г1П, увеличение митотического индекса за счет увеличения длительности фаз митоза, а также хромосомные аберрации.

Итак, результаты проведенных нами экспериментов указывают на редокс-зависимость тирозинового фосфорилирования значительного числа белков корней гороха. Выявленное методом 20-электрофореза и иммуноблоттинга число фосфотирозиновых белков корней гороха составляет более половины числа (94), обнаруженного в клетках Arabidopsis thaliana N. Sugiyama с сотр. (2008) с использованием новых техник протеомики. Принимая во внимание доказанную высокую специфичность использованных нами антител к фосфотирозиновым белкам растений, мы можем сделать вывод, что редокс-агенты влияют именно на уровень тирозинового фосфорилирования белков растений через изменение активности в значительной степени ПТФ. Неоднозначный характер этих изменений указывает на множественность ПТФ в клетках растений (Luan, 2002), у которых может различаться рКа, а также на регуляцию ферментов, осуществляющих тирозиновое фосфорилирование/дефосфорилирование белков, через редокс-чувствительные белки других сигнальных каскадов в клетке, например, Са2+-зависимой сигнальной системы.

Мы не исключаем влияния редокс-регуляции бслков-субстратов ПТК и ПТФ на уровень их тирозинового фосфорилирования.

Прооксиданты Антиоксиданты

I D I

Ингибирование Восстановление активности ПТФ активности ПТФ

I 1

Изменение уровня тирозинового фосфорилирования регуляторных белков, компонентов сигнальных и метаболических путей 1

Регуляция клеточных процессов I

Адаптация растений

Схема 7. Влияние редокс-агентов на тирозиновое фосфорилирование белков растений через регуляцию сигнальных систем клеток.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Петрова, Наталья Валентиновна, Казань

1. Абдуллаев, А.А. Интенсивная культура Dunaliella salina Teod. и некоторые ее физиологические характеристики / А.А. Абдуллаев, В.Е. Семененко // Физиология растений. — 1974. — Т. 21. — № 6. — С. 1145-1153.

2. Быстрова, М.Ф. Перекись водорода и пероксиредоксины в редокс-регуляциивнутриклеточной сигнализации / М. Ф. Быстрова, Е.Н. Буданова // Биологические мембраны. — 2007. — № 2. — С. 115-125.

3. Дас, Д.К. Превращение сигнала гибели в сигнал выживания при редокс-сигнализации /Д.К. Дас, Н. Молик// Биохимия. — 2004. — Т. 69. — С. 16-24.

4. Дубинин Н.П. Радиационный и химический мутагенез / Н.П. Дубинин. -М: Наука, 2000. 465 с.

5. Каримова, Ф.Г. "Кальциевый парадокс" в растительных тканях / Ф.Г. Каримова, Е.К. Бунтукова, О.И. Тарчевская // Физиология растений. — 1989. -№> 36. С. 1178-1183.

6. Каримова, Ф.Г. Влияние Н2О2 на фосфорилирование по тирозину белков гороха / Ф.Г. Каримова, Н.В. Петрова // Физиология растений. 2007. - Т. 54. -№ 3. - С. 365-372.

7. Крутецкая З.И. Роль тирозинового фосфорилирования в регуляции активности ионных каналов клеточных мембран. / Крутецкая З.И., Лебедев О.Е.С.-Пб.: Айю, 1998. 245с.

8. Крутецкая, З.И. Механизмы внутриклеточной сигнализации / З.И. Крутецкая, О.Е. Лебедев, Л.С. Курилова. СПб.: СПб ун-т, 2003. - 245 с.

9. Минибаева, Ф.Б. Продукция супероксида и активность внеклеточной пероксидазы в растительных тканях при стрессе / Ф.Б. Минибаева, Л.Х. Гордон // Физиология растений. — 2003. — вып. 50. №3. -с. 459-464.

10. Паушева, З.П. Практикум по цитологии растений / З.П. Паушева. М: Агропромиздат, 1988. -271 с.

11. Смирнова, Г.В. Глутатион у бактерий /Г.В. Смирнова, О.Н. Октябрьский //Биохимия. 2005.-№ 70. - С. 1459-1473.

12. Тарчевский, И.А. Метаболизм растений при стрессе / И.А. Тарчевский. -К: Фэн, 2001. 448 с.

13. Федина, Е.О. Влияние брассинолида на тирозиновое фосфорилирование белков листьев гороха / Е.О. Федина, Ф.Г. Каримова, И.А. Тарчевский // Биохимия. 2006. - Т. 71. - №4. - С. 525-532.

14. Влияние эпибрассинолида на фосфорилирование по тирозину некоторых ферментов цикла Кальвина /Е.О. Федина, Ф.Г. Каримова, И.А. Тарчевский и др. // Физиология растений. 2008. - Т. 55. -№ 2. - С. 210-218.

15. Супероксид устраняющая активность некоторых аминокислот в водных растворах / В.А. Чистяков, И.В. Корниенко, М.Е. Клецкий и др. // Биофизика. 2005. -№50.- С. 601-605.

16. Aitken, А. 14-3-3 and its possible role in co-ordinating multiple signaling pathways / A. Aitken // Trends Cell Biol. 1996. -V.6.- P. 341 -347.

17. Alia, S.P.P. Proline enhances primary photochemical activities in isolated thylakoid membranes of Brassica juncea by arresting photoinhibitory damage / S.P.P. Alia, P. Mohanty // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. V. 181. - P. 1238-1244.

18. Allan, A.C. Two distinct sources of elicited reactive oxygen species in tobacco epidermal cells /A.C. Allan, R. Fluhr //Plant Cell. 1997. - V. 9. - P. 15591572.

19. Allen, R.D. Dissection of oxidative stress tolerance using transgenic plants / R.D. Allen//Plant Physiol. -2005. V. 107. P. 1049-1054.

20. Amory, A. M. The use of 3-amino-l,2,4-triazole to investigate the short-term effects of oxygen toxicity on carbon assimiiation by Pisum sativum seedlings / A.

21. M. Amory, L. Ford, N. W.Pammenter, C.Cresswell // Plant, Cell and Environment. 1992. - V. 15. -P. 655-663.

22. Apostol, I. Rapid stimulation of an oxidative burst during elicidation of cidtured plant cells. Role of defense and signal transduction /1. Apostol, P.F. Heinstein, P.S. Low//Plant Physiol. 1989. - V. 90.-P. 106-116.

23. Arrigo, A.-P. Gene expression and the thiol redox state / A.-P. Arrigo // Free Rad. Biol. Med. 1999. - V. 27. - P. 936-944.

24. Apel, K. Reactive oxygen species: Metabolism, Oxidative Stress, and Signal Transduction / K. Apel, H. Hirt // Annu. Rev. Plant Biol. 2004. - V. 55. - P. 373-399.

25. Asada, K. The water—water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygen and dissipation of excess photons / K. Asada // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999. - V. 50. -P. 601-639.

26. Aziz, A. Stress-induced changes in poly amine and tyr amine levels can regulate proline accumidation in tomato leaf discs treated with sodium chloride / A. Aziz, J. Martin-Tanguy, F. Larher//Physiol. Plant. 1998. - V. 104. -P. 195-202.

27. Babior, B.M. NADPH oxidase: an update. / B.M. Babior If Blood. 1999. V. -93. -P. 1464-1476.

28. Backer M.A. Active oxygen in plant pathogenesis / M.A. Backer, E. W. Orlandi // Annu. Rev. Phytopathol. 1995. - V. 33. -P. 299-321.

29. Barizza, E. Evidence suggesting protein tyrosine phosphorylation in plants depends on the developmental conditions / Barizza, E., Schiavo F.L., Terzi M., Filippini F. //FEBSLett. 1999. - V. 447. -P. 191-194.

30. Baskin, T.I. Inhibitors of protein kinases and phosphatases alter root morphology and disorganize cortical microtubules / T.I. Baskin, J.E. Wilson // Plant Physiol. 1997. -V. 113.-P. 493 -502.

31. Bl-type cyclin-dependent kinases are essential for the formation of stomatal complexes in Arabidopsis thaliana / V. Boudolf, R. Barroco, A. Engler Jde et al. //Plant Cell. 2004a. -V. 16.-P. 945 -955.

32. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford//Anal. Biochem. 1976. - V. 72. -P. 248-254.

33. Buchanan, B.B. Redox Regulation: A Broadening Horizon / B.B. Buchanan, I. Balmer//Annu. Rev. Plant Biol. -2005. V. 56. -P. 187-220.

34. Cadena D.L. Receptor tyrosine kinases / D.L. Cadena, G.N. Gill // FASEB J. — 1992. -V.-6.-P. 2332-2337.

35. Comparative proteome bioinformatics: identification of a whole complement of putative protein tyrosine kinases in the model flowering plant Arabidopsis thaliana / A. Carpi, G. Di Maira, M. Vedovato et al. //Proteomics. 2002. - V.2. -P. 1494-1503.

36. The inactivation mechanism of low molecular weight phosphotyrosine-protein phosphatase by H2O2 / A. Caselli, R. Marzocchiiti, G. Camici et al. // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 32554-32560.

37. Arabidopsis ethylene-response gene ETR1: similarity of product to two-component regulators / C. Chang, S.F. Kwok, A.B. Bleecker, E. Meyerowitz // Science. -1993. V. 262. -P. 539-544.

38. Chen, S.X. Hydroxylradical production in physiological reactions. A novel function of peroxidase / S.X. Chen, P. Schopfer // Eur. J. Biochem. 1999. - V. 260.-P. 726-735.

39. Cheng, H.F. Purification and characterization of a phosphotyrosyl protein phosphatase from wheat seedlings / H.F. Cheng, M. Thao // Biochem. Biophys. Acta. 1989. - V. 988. - P. 271 -276.

40. Cohen, P.T. W. Signalling through protein phosphatases /P.T. W. Cohen // Topics Curr. Gen. 2004. -V. 5.- P. 1-20.

41. Elevated glutathione biosynthetic capacity in the chloroplasts of transgenic tobacco plants paradoxically causes increased oxidative stress / G. Creissen, J Firmin, J. Fryer et al. //Plant Cell. 1999. - V. 11. -P. 1277-1292.

42. Dangl, J.L. Plant pathogens and integrated defense responses to infection / J.L. Dangl, J.D.G. Jones//Nature.-2001. V. 411. -P. 826-833.

43. Dat, J. Dual action of the active oxygen species during plant stress responses. / J. Dat, //Cell. Mol. Life Sci.-2000. -V.57.-P. 779-795.

44. Davison P. A. Over expression offi-carotene hydroxylase enhances stress tolerance in Arabidopsis / P.A. Davison, C.N. Hunter, P. Horton // Nature. 2002. - V. 418. -P. 203-206.

45. Desikan, R. Regulation of the Arabidopsis transcriptosome by oxidative stress. / R. Desikan, A.-H.S. Mackemess, J.T .Hancock, S.J. Neill //Plant Physiol. -2001. V. 127. -P. 159-172.

46. Doke, N. NADPH-dependent О2 generation in membrane fractions isolated from wounded potato tubers inoculated with Phytophtora infentans / N. Doke // Physiol. Plant Pathol. 1985. - V. 27. -P. 311-322.

47. Function of glutathione and glutathione disulfide in immunology and immunopathology / W. Droge, K. Schulze-Osthoff, S. Mihm et al. // FASEB J. 1994. V. 8. P. 1131-1138.

48. Dunphy, W.G. The decision to enter mitosis / W.G. Dunphy // Trends Cell Biol. -1994. -V. 4.- P. 202-207.

49. Erpel, T. Src family protein tyrosine kinases and cellular signal transduction pathways / T. Erpel, S.A. Courtneidge // Curr. Opin. Cell Biol. 1995. - V. 7, No 2. -P. 176-182.

50. Etienne, P. Induction of tcl 7, a gene encoding a fi-subunit of proteasome, in tobacco plants treated with elicitins, salicylic acid or hydrogen peroxide / P. Etienne, A.-S. Petitot, V. Houot//FEBSLetters. -2000. V. 466.-P. 213-218.

51. Eulgem, T. The WRKY superfamily of plant transcription factors / T. Eulgem, P.J. Rushton, S. Robatzek, I.E. Somssich // Trends Plant Sci. 2000. -V. 5, No 5. -P. 199-206.

52. Fedoroff, N. Redox regulatory mechanisms in cellular stress responses / N. Fedoroff//Ann. of Botany. -2006. V. 98. -P. 289-300.

53. Feng, G.S. Containing phosphotyrosine phosphatase as a target of protein-tyrosine kinases / G.S. Feng, C.C. Hui, T. Pawson //Science. 1993. - V. 253. -P. 1607-1611.

54. Finkel, T. Oxidant signals and oxidative stress / T. Finkel / Curr. Opin. Cell Biol.- 2003. V. 15, No 2. - P. 247-254.

55. Finnie, C. 14-3-3 proteins: eukaryotic regulatory proteins with many functions // C. Finnie, J. Borch, D.B. Collinge//Plant Mol. Biol. 1999. - V. 40, No. 4. -P. 545-554.

56. Fischer, E.H. Protein tyrosine phosphatases: a diverse family of intracellular and transmembrane enzymes / E.H. Fischer, H. Charbonneau, N.K. Tonks // Science.- 1991. V. 253. -P. 401 -406.

57. Forsberg, J. Protein tyrosine phosphorylation in the transition to light state 2 of chloroplast thylakoids / J. Forsberg, J.F. Allen // Photosynth Res. 2001. - V. 68, No. 1. -P. 71-79.

58. The plant cell cycle in context / M.R. Fowler, S. Eyre, N. W. Scott et al. // Mol. Biotechnol. -1998. -V. 10.-P. 123 -153.

59. Hydrogen peroxide- and glutathione-associated mechanisms of acclimatory stress tolerance and signaling / C.H. Foyer, H. Lopez-Delgado, J.F. Dat, I.M. Scott // Physiol. Plant. 1997. V. 100. P. 241-254.

60. Frilling, A. Unusual features of multiple endocrine neoplasia / A. Frilling, H. Becker, H. D. Roeher // Henry Ford Hosp. Med. J. 1992. - V. 40, No. 3-4. - P. 253-255.

61. Hydrogen peroxide protect tobacco from oxidative stress by inducing a set of antioxidant enzymes / T.S. Gechev, F. Gadjev, F. Van Breusegem et al. // Cell. Mol. Life Sci. -2002. -V. 59. -P. 708-714.

62. Tyrosine phosphorylation inhibits the interaction of 14-3-3 proteins with the plasma membrane if -ATP as e / S. Giacometti, L. Camoni, C. Albumi et al. // Plant Biol. 2004. -V.6.- P. 422 -431.

63. Golisz, A. Microarray expression profiling of Arabidopsis thaliana L. in response to allelochemicals identified in buckwheat / A. Golisz, M. Sugano, Y. Fujii // J. Exp. Bot. 2008. - V. 59. - P. 3099-3109.

64. Gonzalez-Meier, M.A. Direct inhibition of mitochondrial respiratory enzymes by elevated CO(2): does it matter at the tissue or whole-plant level? / M.A. Gonzalez-Meier, J.N. Siedow//Tree Physiol. 1999. - V. 19.-P. 253-259.

65. A maize cDNA encoding a member of the retinoblastoma protein family: involvement in endoreduplication / G. Graft, R.J. Burnett, T. Helentjaris et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93. -P. 8962-8967.

66. Salt and oxidative stress: similar and specific responses and their relation to salt tolerance in citrus / Y. Gueta-Dahan, Z. Yaniv, B.A. Zilinskas, G. Ben-Hayyim // Planta. 1997. - V. 203, No. 4. - P. 460-469.

67. A tumor suppressor homolog, AtPTENl, is essential for pollen development in Arabidopsis / R. Gupta, J.T Ting, L.N. Sokolov et al. //Plant Cell. 2002. -V.14, No. 10. -P. 2495-2507.

68. Identification of a dual-specificity protein phosphatase that inactivates MAP kinase from Arabidopsis / R. Gupta, Y. Huang, J.J. Kieber, S. Luan // Plant J. -1998. -V. 16.-P. 581 -590.

69. Gupta, R. Redox control of protein tyrosine phosphatases and mitogen-activated protein kinases in plants /R. Gupta, S. Luan //Plant Physiol. 2003. - V. 132, No. 3. -P.l 149-1152.

70. Salt-induced oxidative stress in chloroplast of pea plants / J.A. Hernandez, M. Rubio, E. Olmos et al. //Plant Sci. 1995. - V. 105. -P. 151-167.

71. The distribution and possible origin of blue-green fluorescence in control and stress barley leaves / E. Hideg, M. Juhasz, J.F. Bornman, K. Asada // Photochem. Photobiol. Sci. -2002. -V. 1.-P. 934-941.

72. Hincha, D.K. /3-/,3-glucanase is cryoprotective in vitro and is accumulated in leaves during cold acclimation / D.K. Hincha, F. Meins Jr., J.M. Schmitt // Plant Physiol. 1997. - V. 114. -P. 1077-1083.

73. Hirayama, T. Novel protein kinase of Arabidopsis thaliana (APK1) that phosphorylates tyrosine, serine and threonine / T. Hirayama, A. Oka //Plant Mol. Biol. 1992. - V. 20. - P. 653 -662.

74. NADPH oxidase activation increases the sensitivity of intracellular Ca~ stores ti inositol 1,4,5-trisphosphate in human endothelial cells / Q. Ни, G. Zheng, J.L. Zweier et al. //J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - P. 15749-15757.

75. ATMPK4, an Arabidopsis homolog of mitogen-activated protein kinases, is activated in vitro by AtMEKl through threonine phosphorylation / Y. Huang, H. Li, R. Gupta et al. //Plant Physiol. 2000. - V. 122. -P. 1301 -1310.

76. Protein tyrosine phosphorylation during phytohormone-stimulated cell proliferation in Arabidopsis hypocotyls /H.-J. Huang, Y.-M. Lin, D.-D. Huang et al. //Plant Cell Physiol. 2003. - V. 44. -P. 770-775.

77. Huber, S. Protein phosphorylation as a possible trigger for degradation of enzymes // S. Huber, G. Tang, S. Hardin // Curr. Top. Plant Biochem. — 2002. — V. 21.-P. 1415.

78. Hulley P. Regulation of tyrosine phosphorylation cascades by phosphatases- what the actions of vanadium teach us / P. Hulley, A. Davison // Journal of Trace Elements in Exp. Med. 2003. -V. 16.- P. 281-290.

79. Hunter, Т. Protein kinases and phosphatases: the yin and yang of protein phosphorylation and signaling / T. Hunter// Cell. 1995. - V. 80. -P. 225 -236.

80. Protein-tyrosine kinases and phosphatases in cell signaling / T. Hunter, A. Bihves, M. Broome et al. //FASEB J. 1996. - V. 10. - P. 1300.

81. Hunter, T. Signaling—2000 and beyond / T. Hunter // Cell. 2000. - V. 100, No. 1. -P. 113-127.

82. Hunter, T. The role of tyrosine phosphorylation in cell growth and disease / T. . Hunter//Harvey Lect. 1998-1999. - V. 94. -P. 81-119.

83. Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: past, present and future / T. Hunter // Biochem. Soc. Trans. 1996. - V. 24, No 2. -P. 307-327.

84. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate / G. Huyer, S. Liu, J. Kelly et al. //J. Biol. Chem. -1997. V. 272, No. 2. - P. 843-851.

85. Mitogen-activated protein kinase cascades in plants: a new nomenclature / K. Ichimura et al. (МАРКgroup) // TRENDS in Plant Science. 2002. V. 7, No. 7. -P. 301-308.

86. Islas-Flores, I. Protein phosphorylation during coconut zygotic. embryo development / I. Islas-Flores, C. Oropeza, T. Hernandez-Sotomayor // Plant Physiol. 1998. -V. 118.-P. 257 -263.

87. Comparative proteomic analysis of NaCl stress-responsive proteins in Arabidopsis roots / Jiang, B. Yang, N.S. Harris, M.K. Deyholos // J. Exp. Bot. -2007. V. 58, No. 13. -P. 3591-3607.

88. Jones, D.H. Isoforms of 14-3-3 protein can form homo- and heterodimers in vivo and in vitro: implications for function as adapter proteins / D.H. Jones, S. Ley, A. Aitken //FEBSLett. 1995. - V. 368. -P. 55-58.

89. Tyrosine phosphorylation in plant bending / K. Kameyama, Y. Kishi, M. Yoshimura et al. //Nature. 2000. - V. 407. -P. 37.

90. The small GTP-binding protein Rac is a regulator of cell death in plants / T. Kawasaki, К Henmi, E. Ono et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. -P. 10922-10926.

91. A plant homolog of the neutrophil NADPH oxidase gp91phox subunit gene encodes a plasma membrane protein with Ca2+ binding motifs / T. Keller, H.G. Damude, D. Werner et al. //Plant Cell. 1998. -V. 10.- P. 255-266.

92. Keyse, S.M. Protein phosphatases and the regulation of MAP kinase activity / S.M. Keyse//Semin. Cell. Dev. Biol. 1998. -V. 9.-P. 143-152.

93. Identification of proteins containing cysteine residues that are sensitive to oxidation by hydrogen peroxide at neutral pH / J.R. Kim, H.W. Yoon, KS. Kwon et al. //Anal. Biochem. -2000. V. 283. -P. 214-221.

94. The isolation and purification of specific "protector" protein which inhibits enzyme inactivation by a thiol / Fe (III) / O2 mixed-function oxidation system / K. Kim, I.H. Kim, KY. Lee et al. //J. Biol. Chem. 1988. - V. 263. -P. 4704-4711.

95. Klotz L.O. Oxidant-induced signaling: effects of peroxynitrite and singlet oxygen / L.O. Klotz//Biol. Chem.-2002. V. 383.-P. 443-456.

96. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli//Nature. 1970. - V. 227. -P. 680 -685.

97. Characterization of a maize cDNA that complements an enolase-deficient mutant of Escherichia coli / S.K. Lai, S. Johnson, T. Conway, P.M. Kelley // Plant Mol. Biol. -1991. V. 16, No. 5. -P. 787-795.

98. Lai, S.K. Differential Regulation of Enolase during Anaerobiosis in Maize / S.K. Lai, C. Lee, M. M. Sachs //Plant Physiol. 1998. - V. 118, No. 4. - P. 12851293.

99. Identification and characterization of a mitochondrial thioredoxin system in plants / C. Laloi, N. Rayapuram, Y. Cliartier et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2001. V. 98, No. 24. -P. 14144-14149.

100. A small CDC25 dual-specificity tyrosine-phosphatase isoform in Arabidopsis thaliana /1. Landrieu, M. da Costa, L. de Veylder et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2004. -V. 101.-P. 13380-13385.

101. Reversible inactivation of protein-tyrosine phosphatase IB in A431 cells stimulated with epidermal growth factor / S.R. Lee, K.S. Kwon, S.R. Kim, S. G. Rliee//J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. -P. 15366-15372.

102. Lee, T.M. An increase of ornithine S-aminotransferase-mediated proline synthesis in relation to high-temperature injury in Gracilaria tenuistipitata (Gigartinales, rhodophyta) / T.M. Lee, Y.C. Chang //J. Phycol. 1999. - V. 35, No.l. - P. 8488.r

103. Dicot and monocot plants differ in retinoblasloma-relatedprotein subfamilies / A. Leiulvai, A. Pettko-Szandtner, Ё. Csordas-Toth et al. //J. Exp. Bot. 2007. - V. 58, No. 7. -P. 1663-1675.

104. H202 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response / A. Levine, R. Tenhaken, R. Dixon, C. Lamb // Cell. 1994. - V. 79. -P. 583-593.

105. Essential role of the NADPH oxidase subunit p47phox in endothelial cell superoxide production in response to phorbol ester and tumor necrosis factor-a / J.-M. Li, A. M. Mullen, S. Yun et al. //Circ. Res. 2002. - V. 90. - P. 143-150.

106. Antioxidative defense system, pigment composition, and photosynthetic efficiency in two wheat cultivars subjected to drought / B. Loginni, A. Scartazza, E. Brugnoli, F. Navari-Izzo//Plant Physiol. 1999. - V. 119. -P. 1091-1099.

107. Low, P.S. The oxidative burst in plant defense: function and signal transduction / P.S. Low, J.R. Merida//Physiol. Plant. 1996. - V. 96. -P. 533-542.

108. Luan, S. Tyrosine phosphatases in higher plants / S. Luan, J. Ting, R. Gupta // New Phytol. 2001. - V. 151. -P. 155 -164.

109. MacRobbie, E.A.C. Evidence for a role for protein tyrosine phosphatase in the control of ion release from the guard cell vacuole in stomatal closure / E.A.C. MacRobbie//Proc. Natl. Acad. Set USA.-2002. V. 99. -P. 11963 -11968.

110. The regulation of tyrosine kinase signalling pathways by growth factor and G-protein-coupled receptors / K. Malarkey, С. M. Belham, A. Paul et al. // Biochem. J. 1995. - V. 309.-P. 361-375.

111. The protein kinase complement of the human genome / G. Manning, D.B. Whyte, R. Martinez et al. //Science. 2002. - V. 298. -P. 1912-1934.

112. Marshall, C.J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation / Marshall C.J. // Cell. 1995. - V. 80. -P. 179-185.

113. Hydrogen peroxide inhibits cell cycle progression by inhibition of the spreading of mitotic CHO cells / Martinez-Munoz C., van Meeteren L.A., Post J.A. et al. // Free Radic. Biol. Med.-2002. V. 33.-P. 1061-1072.

114. Matysik, J. Molecular mechanisms of quenching of reactive oxygen species by praline under stress in plants / J.Matysik, B.B. Alia, P. Mohanty // Current Science. -2002. V. 82. -P. 525-531.

115. Mauro, L.J. Zip codes' direct intracellular protein tyrosine phosphatases to the correct cellular 'address'/L.J. Mauro, J.E. Dixon // Trends in Biochemistry and Science. 1994. - V. 19. -P. 151-155.

116. Maxwell, D.P. The alternative oxidase lowers mitochondrial reactive oxygen production in plant cells / D.P. Maxwell, Y. Wang, L. Mcintosh II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. -P. 8271-8276.

117. May, T. 14-3-3 proteins from a guidance complex with chloroplast precursor proteins in plants / T. May, J. Soil//Plant Cell. 2000. - V. 12. - P. 53 -63.

118. Meskiene, I. MAP kinase pathways: molecular plug-and-play chips for the cells / I. Meskiene, H. Hirt // Plant Molecular Biol. 2000. - V. 42. -P. 791-806.

119. Crystal structures of pinoresinol-lariciresinol and phenylcoumaran benzylic ether reductases and their relationship to isoflavone reducteses / T. Min, H. Kasahara, D.L. Bedgaretal. //J. Biol. Chem.-2003. V. 278. -P. 50714-50723.

120. Miranda-Saavedra, D. Classification and functional annotation of eukaryotic protein kinases / D. Miranda-Saavedra, G.J. Barton //Proteins. — 2007. — V. 68. -P. 893-914.

121. Mittler, M. Regidation of pea cytosolic ascorbate peroxidase and other antioxidant enzymes during the progression of drought stress and following recovery from drought / M. Mittler, B.A. Zilinskas // The Plant Journal. — 1994. — V. 5.-P. 397-405.

122. Mittler, R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance / R. Mittler // Trends Plant Sci. 2002. - V. 7, No. 9. ~ P. 405-410.

123. Mizoguchi, T. Environmental stress response in plants: The role of mitogen-activated protein kinases / T. Mizoguchi, K. Ichimura, K. Shinozaki // Trends Biotech. 1997. - V. 15. -P. 15 -19.

124. Monteiro, H.P. Redox Modulation of Tyrosine Phosphorylation-dependent Signal Transduction Pathways /H.P. Monteiro, A. Stern //Free Rad. Biol. Med. 1996. - V. 21. -P. 323-333.

125. Phosphorylation-dependent interactions between enzymes of plant metabolism and 14-3-3 proteins / G. Moorhead, P. Douglas, V. Cotelle et al. // Plant J. 1999. -V. 18.-P. 1-12.

126. Morris, P.C. MAP kinase signal transduction pathways in plants / P.C. Morris // NewPhytologist. -2001. V. 151. -P. 67-89.

127. Мои, Z. Inducers of plant systemic acquired resistance regulate NPR1 function through redox changes / Z. Мои, W. Fan, X. Dong // Cell. 2003. - V. 113. - P. 935-944.

128. Musaccho, A. Structure and function of the SH3 domain / A. Musaccho, M. Wilmanns, M. Saraste//Prog. Biophys. Mol. Biol. 1994. - V. 61. -P. 283 -297.

129. Interaction of 14-3-3 with signaling proteins is mediated by the recognition of phosphoserine /A.J. Muslin, J. W. Tanner, P.M. Allen, A.S. Shaw // Cell. 1996. - V. 84. -P. 889-897.

130. Mustelin, T. Meeting at mitosis: cell cycle-specific regulation of c-Src by RPTPa/ T. Mustelin, T. Hunter//Sci. STKE. 2002. - V. 115. - P. pe 3.

131. Hydrogen peroxide and nitric oxide as signalling molecules in plants / S. Neill, R. Desikan, A. Clarke et al. //J.Exp.Bot. 2002. - V. 53. - P. 1237-1247.

132. Noctor, G. Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control. / G. Noctor, C.Foyer//Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. - V. 49. -P. 249-279.

133. Localisation of 28-kDa peroxiredoxin in rat epithelial tissues and its antioxidant properties // S. V. Novoselov, I. V. Peshenko, V.I. Popov et al. // Cell Tissue Res.1999. V. 298, No. 3. -P. 471-480.

134. O^Reilly, A. Structural determinants of SHP-2 function specificity in Xenopus mesoderm induction/А. O Reilly, B.G. Neel//Molecular and Cellular Biology. -1998. V. 18.-P. 161-177.

135. О'Kane, D. Chilling, oxidative stress and antioxidant responses in Arabidopsis thaliana callus / D. О'Kane, V. Gill, P. Boyd, R. Bur don // Planta. 1996. - V. 198. -P. 371-377.

136. Peroxiredoxin IV is a secretable protein with heparin-binding properties under reduced conditions /A. Okada-Matsumoto, A. Matsumoto, J. Fujii, N. Taniguchi

137. J. Biochem. (Tokyo). -2000. -V. 27, No. 3. -P. 493-501.

138. Abrupt increase in the level of hydrogen peroxide in leaves of winter wheat is caused by cold treatment // T. Okuda, Y. Matsuda, A. Yamanaka, S. Sagisaka // Plant Physiology. 1991. - V. 97. -P. 1265-1267.

139. Signal transduction in lemon seedlings in the hypersensitive response against Alternaria alternata: participation of calmodulin, G-protein and protein kinases / X. Ortega, R. Polanco, P. Castaneda, L.M. Perez // Biol. Res. 2002. - V. 35. -P. 373-383.

140. Specific interactions with TBP and TFIIB in vitro suggest that 14-3-3 proteins may participate in the regulation of transcription when part of a DNA binding complex /S. Pan, P.C. Sehnke, R.J. Ferl, W.B. Gurley//Plant Cell. 1999. - V. 11.-P. 1591-1602.

141. Pastori, G. M. Common components, networks, and pathways of cross-tolerance to stress. The central role of "redox" and abscisic acid-mediated controls / G.M. Pastori, С. H. Foyer//Plant Physiol. 2002. - V. 129, No. 2. -P. 460-468.

142. Pawson, T. Protein modides and signaling networks / T. Pawson // Nature. -1995. V. 373. -P. 573 -580.

143. Pawson, T. SH2 domains interaction modules and cellular wiring / T. Pawson, G.D. Gish, P. Nash // Trends Cell Biol. 2001. -V. 11.-P. 504 -511.

144. Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate abscisic acid signalling in guard cells / Z.-M. Pei, Y. Murata, G. Benning et al. // Nature. 2000. - V. 406. -P. 731-734.

145. Pick, U. Dunaliella — a model extremophilic algae / U. Pick, I. Israel // Plant Science. 1998. - V. 46. -P. 131-140.

146. Polle, A. Dissecting the superoxide dismutase-ascorbate peroxidase-glutathione pathway in chloroplasts by metabolic modeling. Computer simulations as a step towards flux analysis. / A. Polle // Plant Physiol. 2001. - V.126.-P. 445-462.

147. Polya, G.M. Purification and characterization of two wheat-embryo protein phosphatases / G.M. Polya, M. Haritou //Biochem. J. 1988. - V. 251. - P. 357 -363.

148. Peroxovanadium compounds. A new class of potent phosphotyrosine phosphatase inhibitors which are insulin mimetics / B.I. Posner, R. Faure, J.W. Burgess et al. //J. Biol. Chem. 1994. - V. 269, No. 6. -P. 4596-4604.

149. Hormonal control of the cell cycle / J. C. del Pozo, M.A. Lopez-Matas, E. Ramirez-Parra, C. Gutierrez//Physiol. Plant. -2005. V. 123.-P. 173-183.

150. Purvis, A.C. Role of the alternative oxidase in limiting superoxide production by plant mitochondria / A.C. Purvis//Physiol. Plant. 1997.-V. 100.-P. 165-170.

151. Regulation of leaf mitochondrial pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation / D.D. Randall, J.A. Miernyk, N.R. David et al. // Protein phosphorylation in plants. — Oxford Press, 1996. P. 87-103.

152. Rao, M. V. Ozone: a tool for probing programmed cell death in plants / M. V. Rao, J.R. Koch, K.R. Davis//Plant Mol. Biol. 2000. - V. 44. - P. 345-358.

153. Direct interaction between p47phox and protein kinase C: evidence for targeting of protein kinase С by p47phox in neutrophils / E. P. Reeves, L.V. Dekker, L.V. Forbes et al. //Biochem. J. 1999. - V. 344. - P. 859-866.

154. Resit, M.D. Myristylation and palmitylation of Src family members: the fats of the matter/M.D. Resh //Cell. 1994. - V. 76. -P. 411-413.

155. Association of the protein kinases c-Bcr and Bcr-Abl with proteins of the 14-3-3 family / G.W. Reuther, H. Fu, L.D. Cripe et al. //Science. 1994. - V. 266. - P. 129-133.

156. Transcriptional down-regulation by abscisic acid of pathogenesis-related J3-1,3-glucanase genes in tobacco cell cultures / E. Rezzonico, N. Flury, F. Meins Jr., R. Beffa //Plant Physiol. 1998. -V. 117.-P. 585-592.

157. Intracellular messenger function of hydrogen peroxide and its regulation by peroxiredoxins / S. G. Rhee, S. W. Kang, W. Jeong et al. // Curr. Opin. In Cell Biol.-2005. -V. 17.-P. 183-189.

158. Cellular regulation by hydrogen peroxide /S.G. Rhee, T.-S. Chang, Y.S. Bae et al., //J. Am. Soc. Nephrol. 2003. - V. 14. -P. S211-S215.

159. Hydrogen peroxide: a key messenger that modulates protein phosphorylation through cysteine oxidation /S.G. Rhee, Y.S. Bae, S.-R. Lee, J. Kwon //Sci. STKE. -2000. V. 53. -P. 1-6.

160. Rhee, G. S. Redox signaling: hydrogen peroxide as intracellular messenger / G. S. Rhee//Exp. Mol. Med. 1999. - V. 31. -P. 53-59.

161. Data mining the Arabidopsis genome reveals fifteen 14-3-3 genes. Expression is demonstrated for two out offive novel genes. / M. Rosenquist, M. Alsterfjord, C. Larsson, M. Sommarin // Plant Physiol. -2001. V. 127. -P. 142-149.

162. Rudrabhatla, P. Developmentally regulated dual-specificity kinase that is induced by abiotic stresses / P. Rudrabhatla, R. Rajasekharan // Plant Physiol. 2002. -V. 130. -P. 380-390.

163. Rudrabhatla, P. Genome-wide analysis and experimentation of plant serine / threonine / tyrosine-specific protein kinases / P. Rudrabhatla, M.M. Reddy, R. Rajasekharan //Plant Mol. Biol. 2006. -V. 60.- P. 293 -319.

164. E.S.R. of spin-trapped radicals in aqueous solutions of amino acids reactions of the hydroxyl radical/S. Rustgi, A. Joshi, H. Moss, P. Riesz //Int. J. Radiat. Biol.- 1977. V. 31. - P. 415- 440.

165. The Arabidopsis NIM1 protein shows homology to the mammalian transcription factor inhibitor IkB / J. Ryals, K. Weymann, K. Lawton et al. // The Plant Cell. — 1997. V. 9. - P. 425-439.

166. Sagi, M. Superoxide production by plant homologues of the gp91phox NADPH oxidase. Modulation of activity by calcium and by tobacco mosaic virus infection / M. Sagi, R. Fluhr // Plant Physiol. -2001. V. 126. -P. 1281-1290.

167. Redox regulation of protein tyrosine phosphatase IB involves a sidphenyl-amide intermediate /A. Salmeen, J.N. Andersen, M.P. Myers et al. //Nature. 2003. -V. 423. - P. 769-773.

168. Savitsky P.A. Redox regidation of Cdc25C / P.A. Savitsky, T. Finkel // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. -P. 20535-20540.

169. NaCl and CuS04 treatments trigger distinct oxidative defense mechanisms in Nicotianaplumbaginifolia L. /A. Savoure,D. Thorin, M. Davey et al. //Plant Cell Environ. 1999. - V. 22. -P. 387-396.

170. Schlessinger, J. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases / J. Schlessinger, A. Ullrich//Neuron. 1992. - V. 9, No. 3.-P. 383-391.

171. Schlessinger, J. SH2/SH3 signaling proteins / J. Schlessinger // Curr. Opin. Genet. Dev. 1994. -V. 4, No 1. -P. 25-30.

172. Phosphoiylation of insulin receptor kinase by phosphocreatine in combination with hydrogen peroxide: the structural basis of redox priming / E. Schmidt, A. Holz- Wagenblatt, V. Hacj, W. Droge // FASEB J. 1999. - V. 13. - P. 14911500.

173. Responses of antioxidative systems to drought stress in pendunculate oak and maritime pine as modulated by elevated CO2 / P. Schwanz, C. Picon, P. Vivin et al. //Plant Physiol. 1996. -V. 110.-P. 393-402.

174. Sen, S.K. Redox signaling and the emerging therapeutic potential of thiol antioxidants / S.K. Sen // Bio chem. Pharm. 1998. - V. 55. -P. 1747-1758.

175. Sgherri, C. L. M. Sunflower seedlings subjected to increasing water deficit stress: oxidative stress and defence mechanisms / C. L. M. Sgherri, F. Navari-Izzo // Physiol. Plant. -1995. V. 93. - P. 25-30.

176. Shelton, M. Glutaredoxin: role in reversible protein S-glutathionilation and regidation of redox signal transduction and protein translocation / M. Shelton, P. Chock, J. Mieyal//Antiox. & Redox Signal. -2005. -V. 7. -P. 348-366.

177. Sheng, L. Protein phosphatase in plants / L. Sheng // Annu. Rev. Plant Biol. -2003. -V. 54. -P.63-92.

178. Shimizu, S. Changes in protein interactions of cell cycle-related genes during the dormancy-to-growth transition in pea axillary buds / S. Shimizu, H. Mori // Plant Cell Physiol. 1998. - V. 39. -P. 1073-1079.

179. Changes in protein tyrosine phosphorylation during mannose and senescence induced cell death in rice / Y.-W. Shin, W.-C. Chou, Y.-M. Lin et al. // Plant Growth Regul. 2004. - V. 42. -P. 271 -282.

180. Simon, M.I. Diversity of G proteins in signal transduction / M.J. Simon, M.P. Strathmann, N. Gautam//Science. 1991. - V. 252. -P. 802-808.

181. Smirnoff N. Ascorbic Acid: Metabolism and Functions of a Multi-Facetted Molecule // Curr. Opin. Plant Biol. 2000. - V. 3.-P. 229-235.

182. Smirnoff, N. Hydroxyl radicals scavenging activity of compatible solutes / N. Smirnoff, Q.J. Cumbes//Phytochemistry. 1989. - V. 28. -P. 1057-1059.

183. Smirnoff, N. Plant resistance to environmental stress / N. Smirnoff // Current Opinion in Plant Biology. -1998. V. 9. -P. 214-219.

184. Protein phosphatase inhibitors block root hair development and alter cell shape in Arabidopsis roots/R.D. Smith, J.E. Wilson, J.C. Walker, T.I. Baskin //Planta. -1994. V. 194.-P. 516-524.

185. Somrner, D. A possible tyrosine phosphorylation of phytochrome / D. Sommer, T.A. Wells; P.S. Song//FEBSLett. 1996. - V. 393. -P. 161-166.

186. A family of cylin D homologs from plants differentially controlled by growth regulators and containing the conserved retinoblastoma protein interaction motif/ R. Soni, J.P. Carmichael, Z.H. Sliah, J.A. Murray//Plant Cell. 1995. -V.7.-P. 85-103.

187. Pea PR 10.1 is a ribonuclease and its transgenic expression elevates cytokinin levels / S. Srivastava, R.J.N. Emery, L. V. Kurepin et al. // Plant Growth Reg. -2006. V. 49. -P. 17-25.

188. Streuli, M. Protein tyrosine phosphatases in signaling / M. Streuli // Curr. Opin. Cell. Biol. 1996. - V. 8, No. 2. -P. 182-188.

189. Large-scale phosphorylation mapping reveals the extent of tyrosine phosphorylation in Arabidopsis / N. Sugiyama, H. Nakagami, K. Mochida et al. If Mol. Sys. Biology. 2008. - V. 4, No. 193. -P. 1-7.

190. PTEN modulates cell cycle progression and cell swvival by regulating phosphatidylinositol 3,4,5,-trisphosphate and Akt / protein kinase В signaling pathway / H. Sun, R. Lesche, D. Li et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. -V. 96. -P. 6199 -6204.

191. Sun, H. The coordinated action of protein tyrosine phosphatases and kinases in cell signaling/H. Sun, N.K. Tonks // Trends Biochem. Sci. 1994. - V. 19. - P. 480 -485.

192. Superti-Furga G. Regulation of the Src protein tyrosine kinase / G. Superti-Furga//FEBS Lett. 1995. - V. 369, No l.-P. 62-66.

193. Suzuki, K. Transient activation and tyrosine phosphorylation of a protein kinase in tobacco cells treated with a fungal elicitor / K. Suzuki, H. Shins hi// Plant Cell. -1995. V. 7. -P. 639 -647.'

194. Ozone and ultraviolet В effects on the defense-related proteins f}-l,3-glucanase and chitinase in tobacco / M. Tlialmair, G. Bauw, S. Thiel et al. // J. Plant Physiol. 1996. - V. 148. -P. 222-228.

195. Function of the oxidative burst in hypersensitive disease resistance / R. Tenhaken, A. Levine, L.F. Brisson et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - V. 92. - P. 4158-4163.

196. Thannickal V.J. Reactive oxygen species in cell signaling / V.J. Thannickal, B.L. Fanburg // Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 2000. - V. 279. - P. L10005-L1028.

197. Identification of major binding proteins and substrates for the SH2-containing protein tyrosine phosphatase SHP-1 in macrophages / J.F. Timms, K. Carlberg, H. Gu et al. //Mol. Cell. Biol. 1998. - V. 18, No. 7. -P. 3838-3850.

198. Tonics, N.K. From form to function: signaling by protein tyrosine phosphatases / N.K. Tonks, B.G. Neel//Cell. 1996. - V. 87, No. 3. -P. 365-368.

199. Tonks, N.K. PTP1B: From the sidelines to the front linesI / N.K. Tonks // FEBS Lett.-2003. V. 546. -P. 140-148.

200. Torruella, M. Evidence of the activity of tyrosine kinase(s) and of the presence of phosphotyrosine proteins in pea plantlets / M. Torruella, L.M. Casano, R.H. Vallejos//J. Biol. Chem. 1986. - V. 261. -P. 6651-6653.

201. Characterization of dual specificity protein kinase from maize seedlings / J.B. Trojanek, M.M. Klimecka, A. Fraser et al. // Acta Biochim. Polonica. 2004. -V. 51. -P. 635-647.

202. Phosphorylation of plant proteins and the identification of protein-tyrosine kinase activity in maize seedlings / J. Trojanek, P. Ek, J. Scoble et al. //Eur. J. Biochem. 1996. - V. 235. -P. 338-344.

203. Ullrich, A. Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity / A. Ullrich, J. Schlessinger//Cell. -1990. V. 61, No. 2. -P. 203-212.

204. Umbach, A.L. Covalent and noncovalent dimers of the cyanide-resistant alternative oxidase protein in higher plant mitochondria and their relationship to enzyme activity / A.L. Umbach, J.N. Siedow //Plant Physiol. 1993. - V. 103, No. 3. - P. 845-854.

205. Ushio-Fukai, M. Localizing NADPH oxidase-derived ROS /М. Ushio-Fukai // Sci. STKE. 2006. - V. 349. - re8.

206. Plant enolase: gene structure, expression, and evolution / D. Van Der Straeten, R.A. Rodrigaes-Pousada, H.M. Goodman, M. Van Montagu // Plant Cell. -1991. V. 3.- P. 719-735.

207. Van Vactor, D. Genetic analysis of protein tyrosine phosphatases / D. Van Vactor, A.M. O'Reilly, B.G. Neel//Curr. Opin. Genet. Dev. 1998. - V. 8. - P. 112-126.

208. Venekamp, J.H. Regulation of cytosol acidity in plants under conditions of drought/ J.H. Venekamp//Physiol. Plant. 1989. - V. 76. -P. 112-117.

209. Vera-Estrella, R. Effect of specific elicitors of Cladosporium fulvum on tomato suspension cells. Evidence for the involvement of active oxygen species / R. Vera-Estrella, E. Blumwald, V.J. Higgins // Plant Physiol. 1992. - V. 99. - P. 12081215.

210. In vivo characterization of a thioredoxin h target protein defines a new peroxiredoxin family / L. Verdoucq, F. Vignols, J.P. Jasquot et al. // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274, No. 28. -P. 19714-19722.

211. Vernonx, T. Glutathione biosynthesis in plants / T. Vernottx, R. Sanchez-Fernandez, M. May // Oxidative Stress in Plant, eds. D. Inze, M. V. Montagu, pp. 297-311. London: Naylor and Francis.,

212. Vranova E. Signal transduction during oxidative stress / Vranovd E., Inze D., Van Breusegem F. //J.Exp.Bot. 2002. V. 53. P. 1227-1236.

213. Wagner, A.M. A role for active oxygen species as second messengers in the induction of alternative oxidase gene expression in Petunia hybrida cells / A.M. Wagner//FEBSLett. 1995. - V. 368. -P. 339-342.

214. Walsh, C.T. Protein posttranslational modifications: the chemistry of proteome diversifications / C.T. Walsh, S. Garneau-Tsodikova, G.J. Gatto Jr. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl.-2005. V. 44, No. 45. -P. 7342-7372.

215. Walton, K.M. Protein tyrosine phosphatases / K.M. Walton, J.E. Dixon // Annu. Rev. Biochem. 1993. - V. 62. -P. 101-120

216. Drought and air pollution affect nitrofen cycling and free radical scavenging in Pinus halepensis (Mill.) / F.A.M. Wellburn, K.-K. Lau, P.M.K. Milling, A.R. Wellburn //J. Exp. Bot. 1996. - V. 47. -P. 1361-1367.

217. Catalase is a sink for H202 and is indispensable for stress defense in C3 plants / H. Willekens, S. Chamnongpol, M. Davey et al. //EMBO J. 1997. - V. 16. - P. 4806-4816.

218. Regulated phosphorylation of 40S ribosomal protein S6 in root tips of maize / A.J. Williams, J. Werner-Fraczek, I.-F. Chang, J. Bailey-Serres //Plant Physiol. -2003. V. 132. - P. 2086-2097.

219. Wolff, S.P Ferrous ion oxidation in presence of ferric ion indicator xylenol orange for measurement of hydroperoxides / S.P. Wolff // Methods Enzymol. -1994. V. 223. -P. 182-189.

220. Wu, K. The Arabidopsis 14-3-3 multigene family / K. Wu, M.F. Rooney, R.J. Ferl //Plant Physiol. 1997. - V. 114. -P. 1421 -1431.

221. Isolation and characterization of GmSTYl, a novel gene encoding a dual-specificity protein kinase in soybean (Glycine max L.) / Z.-S. Xu, Y.-Z. Ma, X.-G. Cheng et al. //J. Integr. Plant Biol. 2006. - V. 48. - P. 857-866.

222. Molecular characterization of a tyros ine-specific protein phosphatase encoded by a stress-responsive gene in Arabidopsis /Q. Xu, H.H. Fu, R. Gupta, S. Luan // Plant Cell. 1998. -V. 10.-P. 849-857.

223. The structural basis for 14-3-3: Phosphopeptide binding specificity / M.B. Yaffe, K. Rittinger, S. Volinia et al. // Cell. 1997. -V. 91.- P. 961-971.

224. Yang, T. Hydrogen peroxide homeostasis: activation of plant catalase by calcium/calmodulin / T. Yang, B.W. Poovaiah // PNAS. 2002. V. 99. P. 40974102.

225. An Arabidopsis cell cycle-dependent kinase-related gene, CDC2b, plays a role in regulating seedling growth in darkness / T. Yoshizumi, N. Nagata, H. Shimada, M. Matsui//Plant Cell. 1999. -V. 11.-P. 1883 -1896.

226. Zhang, К. Cytokinin controls the cell cycle at mitosis by stimulating the tyrosine dephosphorylation and activation of p34cdc2-like HI histone kinase / K. Zhang, D.S. Letham, P.C. John//Planta. 1996. - V. 200. -P. 2-12.

Информация о работе

Петрова, Наталья Валентиновна
кандидата биологических наук
Казань, 2008
ВАК 03.00.12

Диссертация

Влияние редокс-агентов на тирозиновое фосфорилирование белков растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы