Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние полиовирусной инфекции на нуклеоцитоплазматический транспорт

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Влияние полиовирусной инфекции на нуклеоцитоплазматический транспорт"

На правах рукописи

Лидский Петр Владимирович

ВЛИЯНИЕ ПОЛИОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА НУКЛЕОЦИТОШАЗМАТИЧЕСКИЙ ТРАНСПОРТ

03.00.06 - вирусология

Автореферат Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2005

Работа выполнена в ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН.

Научный руководитель: Член-корреспондент РАН и РАМН, доктор биологических наук, профессор

Агол Вадим Израилевич

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор

Родионова Нина Павловна

Доктор биологических наук, профессор

Прасолов Владимир Сергеевич

Ведущая организация:

Институт биологии гена РАН

Защита состоится «(О» ноября 2005 г. в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д501.001.76 при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, НИИ Физико-Химической биологии им А. Н. Белозерского, ауд 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан «6 » октября 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук — ^ ^ Калинина

f.3339

/7 ?

з

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Пикорнавирусы и, в частности, полиовирус являются возбудителями важных заболеваний человека и животных. Этим во многом объясняется пристальный интерес, который уделяют исследователи этой группе вирусов. В течение последнего десятилетия достигнуты значительные успехи в понимании молекулярно-биологических основ репродукции пикорнавирусов и вызываемых ими изменений физиологических процессов в зараженной клетке. Вместе с тем, до полного понимания всей картины взаимодействия этих вирусов с клеткой еще далеко. Несколько лет назад в нашей лаборатории был обнаружен еще один интересный аспект воздействия полиовируса на клетку - появление в цитоплазме ядерных белков [Belov et. al., 2000]. В норме ассиметричное распределение белков между ядром и цитоплазмой поддерживается за счет барьерной функции ядерной оболочки, а также при помощи механизмов активного транспорта, задействующих растворимые рецепторы, сигнальные последовательности транспортируемых белков и GTPa3y Ran, сопрягающую транспорт с гидролизом GTP. Настоящая работа посвящена воздействию полиовируса на систему нуклеоцитоплазматического транспорта клетки. Углубленное исследование этого явления представляет значительный интерес, поскольку не только разъясняет проблему взаимодействия цитоплазматического вируса с ядром, но и расширяет наши знания о системах нуклеоцитоплазматического транспорта, их устройстве, регуляции, роли в организации внутриядерного пространства.

Настоящая работ посвящена исследованию нарушений нуклеоцитоплазматического барьера, происходящих при полиовирусной инфекции. Первый вопрос касался самого механизма перехода ядерных белков в цитоплазму. Для решения этой задачи мы

Дели и задачи исследования

экспрессировали в клетках различные флуоресцентные белки и наблюдали их локализацию в зараженных и не зараженных клетках, а также исследовали препараты изолированных ядер.

Вторая задача касалась молекулярной природы исследуемого явления. Нашей целью было разработать подходы для идентификации активности, вызывающей перераспределение белков в инфицированных клетках, и попытаться получить информацию об этой активности или активностях. Для этого мы проверяли различные ингибиторы на их способность подавлять повреждение ядерной оболочки, вызываемое полиовирусом. Была разработана специальная экспериментальная система, позволившая проводить этот анализ in vitro, на препаратах ядер. Кроме того, чтобы идентифицировать белок полиовируса, ответственный за взаимодействие с системами ядерного транспорта, мы индивидуально экспрессировали в клетках некоторые вирусные белки. Было проведено также электронно-микроскопическое исследование ядерных пор в зараженной клетке.

Научная новизна и практическая значимость работы

В настоящей работе впервые показано, что инфекция вирусом (полиовирусом) может приводить к увеличению проницаемости ядерной оболочки для пассивной диффузии в обоих направлениях: ядерные белки большой молекулярной массы выходят в цитоплазму, цитоплазматические входят в ядро. С подавляющей вероятностью это вызвано деградацией ядерных пор, наблюдавшейся под электронным микроскопом. Было установлено, что присутствие полиовирусной протеазы lA^0 необходимо и достаточно для индукции нарушений ядерного транспорта.

Публикации и апробация работы

По материалам диссертации была опубликована одна статья. t. Результаты настоящей работы были доложены на XII и XIII международных конференциях «Молекулярная биология пикорнавирусов»: в 2002 г. на мысе Кейп-Код, США и в 2005 г. в Люнтерене, Голландия соответственно, на международных семинарах по программе INTAS: в 2003 г. в

Москве, и в 2004 г. в Финляндии, а также на семинарах в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им М. П. Чумакова

Структура диссертации

Диссертация изложена на 99 страницах машинописного текста и содержит традиционные разделы. В диссертации содержится 22 рисунка и 5 таблиц. Список литературы включает 148 источников.

Использованные сокращения

БОЕ - бляшкообразующая единица; ГФДГ - глицерофосфатдегидрогеназа; НБС -нормальная бычья сыворотка; ФМСФ - фенилметасульфонил фторид; ЭДТА -этилендиаминтетрауксусная кислота; ЯО - ядерная оболочка; ЯП - ядерная пора; ЕОРР, ОБР - зеленый флуоресцентный белок; ГС» - константа 50% ингибирования; МРСМК - К-(метоксисукциншг)-Ь-аланил-Ь-аланил-Ь-пролил-Ь-валин хлорметилкетон; N1^ - сигнал ядерной локализации; Та ЭУ40 - большой Т антиген обезьяньего вируса 40; ТЬСК -тозиллинхлорметилкетон; гУМХбпк - бензилкарбонил-Ь-валил-Ь-аланил-Ь-аспартил-фторметилкетон; хУАЕ)(ОМе).йпк - бензил карбоншт-Ь-валил-Ь-аланил-Ь-аспартил-(0-метш1)-фторметилкетон;

Собственные исследования

Материалы и методы

Плазмиды и клонирование.

pUHC-2A-wts pUHC-2A-H20N: получены в нашей лаборатории, кодируют 2Арго дикого типа и протеолитически неактивный мутант соответственно.

pUHC-EGFP-NLS: Кодирует зеленый флуоресцентный белок, слитый с NLS Та SV40.

pEGFPx5: кодирует пентамер зеленого флуоресцентного белка, была любезно предоставлена Ю. Лазебником (Лаборатория Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк).

pCyclin-B-EGFP: кодирует циклин В, слитый с зеленым флуоресцентным белком, была предоставлена Д. Булавиным (Национальный Институт Рака, США).

pTimer-NLS: Плазмида была создана путем вставки содержащего NLS фрагмента плазмиды pEGFP-NLS в плазмиду, кодирующую неагрегирующий флуоресцентный белок «таймер» (любезно предоставлена К. Лукьяновым, ИБХ, Москва), по сайтам XhoI-BamHI.

MarxIV 3xEGFP-NLS: получена для настоящей работы. Фрагмент ДНК, содержащий три копи гена зеленого флуоресцентного белка (EGFP) с NLS Та SV40 в рамке, был вырезан из вектора pEGFP-NLS-2xGFP (получена от А. Б. Вартапетяна; НИИ ФХБ, МГУ, Москва) по сайтам Nhel и BamHI и вставлен в вектор для ретровирусной трансфекции MarxIV (получена от Ю. Лазебника).

pUHC-ЗА, pUHC-3C: получены для настоящей работы. PCR фрагменты, кодирующие вирусные белки, после промежуточного клонирования в вектор MarxIV, были переклонированы по двум тупым концам в плазмиду pUHC. Кодирующие области были отсеквенированы.

Культуры клеток и вирус. В работе использовали клетки линий HeLa S3, названные HeLa-B, полученные путем приспособления исходной культуры HeLa S3 к росту на НБС, LinX -amphitropic и MCF-7/C3S-GFP/C9DN (обе культуры любезно предоставлены Ю.

Лазебником), а также 293 и Нер-2. В работе использовали полиовирус типа I, Mahoney. Заражение клеток вирусом проводили с множественностью ~50-100 БОЕ/клетку (если не указано иное).

ТрансЛекиия клеток ппазмидной ДНК. Трансфекцию неполного монослоя клеток проводили при помощи реагента Lipofectamine 2000 (ínvitrogen) в соответствии с рекомендациями производителя.

Получение моноклональной культуры. экспрессируюшей трансгенный белок. Для получения стабильно-трансформированных клеточных линий использовали метод ретровирусной транедукции вектором MarxIV 3xEGFP-NLS. После двух пассажей на селективной среде, содержавшей антибиотик G-418 в концентрации 500 мкг/мл, клетки рассаживали на 96-луночную плашку, из расчета VS клетки на лунку. Яркость ядерной флуоресценции анализировали под микроскопом, самый яркий клон был назван HeLa ЗЕ и использован в дальнейших опытах.

Получение лизатов клеток HeLa. Зараженные и контрольные клетки HeLa собирали в теплом версене, осаждали при -300 g и ресуспендировали в десяти объемах гипотонического буфера. Клетки осаждали в указанном режиме и лизировали тремя циклами заморозки -разморозки. Получившийся лизат осветляли при 100000 g (15000 g в случае 2Арго экспрессирующих клеток), супернатант собирали и хранили при -80°С.

Получение пермеабилизованных клеток. Клетки промывали холодным D-PBS (Sigma), затем холодным гипотоническим буфером, и инкубировали 5 мин в том же буфере, содержащем 40 мкг/мл дигитонина. При такой обработке цитоплазматическая мембрана нарушается, а ядро остается практически интактным. Стекла промывали и исследовали под микроскопом незамедлительно или после инкубации с пробами (1 ч при 37°С).

Выделение ядер. Зараженные и контрольные клетки HeLa ЗЕ собирали в теплом версене, центрифугировали при 300 g, промывали D-PBS и ресуспендировали в гипотоническом

буфере. К клепкам добавляли 1%-ный неиошшй детергент NP-40 (BHD) до конечной концентрации 0.025%, и лизировали 30 движениями пестика в притертом стеклянном гомогенизаторе Доунса (Wheaton). Препараты немедленно наблюдали под микроскопом.

Ингибиторы. В работе использовали следующие ингибиторы: МРСМК, Эластатиналь, Антипэин, Химостатин, zVAD.fmk, Леупептин, пепстатин А, ФМСФ (Sigma), zVAD(OMe).fmk (Enzyme systems), TLCK (Serva). Растворы ингибиторов хранили при температуре -20°С, раствор ФМСФ хранили при -80°С. Раствор TLCK готовили перед использованием.

Иммунофпуооесиеииня. Клетки фиксировали 30 мин реагентом SafeFix (Curtió Maíheson Scientific, Houston, Тех.), дважды промывали водой, блокировали 3% раствором обезжиренного сухого молока и инкубировали с первичными антителами к ГФДГ 6С5 (любезно предоставлены В. Муронцем; ИБХ, Москва) в растворе сухого молока. Клетки отмывали D-PBS, инкубировали с СуЗ-коныогатом (Milan Analytica AG) и рассматривали под микроскопом.

Микроскопия. Флуоресцентные препараты исследовали при помощи микроскопа Leica DMLS, оснащенного камерой Leica DC 100 и флуоресцентными фильтрами А (для препаратов, окрашенных красителем Hoechst), 13 (для наблюдения белка «таймера» и производных EGFP) и N2.1 (для наблюдения флуоресценции «таймера» в красном диапазоне). Электронно-микроскопическое исследование ЯО проводили наши швейцарские коллеги по методике, описанной ранее [Agol et al., 1998].

Результаты и обсуждение Нарушение барьерной функции ядерной оболочки при полиошрусной инфекции

Ilm полиовирусной инсЬекиии ядерные белки выходят в цитоплазму. В предыдущей работе было показано, что полиовирусная инфекция сопровождается накоплением в цитоплазме ядерных белков на ранней стадии заражения [Belov et. al., 2000]. Делалось предположение, что белки из ядра переходят в цитоплазму. Другие исследователи продемонстрировали ингибирование полиовирусом активного импорта белков в ядро [Güstin and Sarnow, 2001], и предположили, что появление ядерных белков в цитоплазме происходит путем накопления новосинтезированных цепей, не способных входить в ядро. Для прояснения этого вопроса мы использовали белок «таймер», изменяющий цвет флуоресценции во времени, соединенный с NLS. Клетки HeLa трансфицировали плазмидой pTimer-NLS и наблюдали под микроскопом. Как видно на рис 1 А, цвет флуоресценции ядер трансфицированных клеток постепенно изменялся во времени от зеленого к желтому через несколько промежуточных оттенков. После заражения таймер-Ж8-экспрессирующих клеток полиовирусом, флуоресценция появлялась и в цитоплазме. Как видно из рис 1 Б, оттенок

А

Б

6ч

18ч

18 ч

26 ч

26 ч

76 ч

76 ч

Рис 1. Выход в цитоплазму ядерного маркера (белка таймер с сиг-налом ядерной локализаиии) Клетки культуры НеЬа трансфицировали плазмидой рТипег-ЖВ и заражали полиовирусом. Фотографии сделаны через 4 ч после заражения. Указан временной интервал между внесением транс-фекционной смеси и съемкой.

контроль полиовирус

цитоплазматической флуоресценции зараженной

клетки соответствовал оттенку ядра, указывая на g,

й

ядерное происхождение попавшего в цитоплазму J}.

на

таймера, в соответствии с Беловым с соавт. [Belov et. g

Ö

al„ 2000]. Если бы, в соответствии с Густином и "

и?

Сарновом [Güstin and Sarnow, 2001], •§

й> О

ГС

перераспределение ядерных белков было бы

следствием отключения систем активного транспорта, а

Рис 2. Выход ядерного белка из накопление их в цитоплазме происходило бы за счет препаратов ядер зараженных

пермеабилизованных клеток. синтеза, цвет цитоплазмы был бы зеленым. Зараженные полиовирусом

клетки НеЬа ЗЕ пермеа-Увеличение пронииаемости ядерной оболочки в бипизировали через 2 часа после

заражения и наблюдали под микроскопом.

зараженной клетке. Для того чтобы проверить, как

контроль

полиовирус

изменяется проницаемость ядерной оболочки (ЯО) при §

•S"

JS

полиовирусной инфекции, был проведен следующий g

4»

эксперимент. Клетки HeLa ЗЕ, стабильно U

ц га

экспрессировавшие ядерный флуоресцентный белок, {Eh

я

заражали полиовирусом. Зараженные и контрольные ^

3 ¡с

клетки обрабатывали дигитонином и наблюдали под Я

микроскопом. Для того чтобы контролировать качество Рж 3 Вшод ядеотго белка ш

выделенных ядер зараженных пермеабилизации, препараты окрашивали трмеа6шизованньюс клеток.

тт „ Ядра выделяли через 2 ч после

интеркалирующим красителем Hoechst-33258 (Sigma), заражения

не способным проникать через плазматическую мембрану, но хорошо окрашивающим ядра

пермеабилизованных клеток. В то время как здоровые клетки сохраняли флуоресценцию,

зараженные полностью теряли ее: флуоресцентный белок, пройдя поврежденную

полиовирусом ЯО, не удерживался разрушенной плазматической мембраной и растворялся в

и

окружающем буфере до недетектируемо малых концентраций (рис 2). Сходный результат был получен при выделении ядер по другому протоколу (рис 3).

При полиовирусной инфекиии иитоппазматические белки входят в ядро. Повышение

контроль полиовирус проницаемости ЯО должно сопровождаться

шитп ¡итммввганввшмва

переходом циггоплазматических белков в ядро. Нами была проверена локализация трех цитоплазматических белков: ГДФГ, циклина В-ЕвРР и пентамера ЕОРР без ЫЬЗ. Эндогенный ГДФГ мы исследовали при помощи иммуннофлуоресценции, а два других белка экспрессировали с помощью соответствующих плазмид в клетках НеЬа и 293 соответственно и исследовали под микроскопом в живых клетках. Оказалось (рис 4), что все три

.цитоплазматических белка при инфекции переходят

Рис 4. Вход иитоги соматических белков в ядро при полиовирусной в ядро. инфекции. Циклин В, слитый с

вРР, а также ГФДФ входят в Таким образом, полиовирусная инфекция

ядро при полиовирусной инфекции.

Аналогично ведет себя и пептамер сопровождается повышением проницаемости ЯО для зеленого белка без N18.

Фотографии сделаны через 2 и 3 пассивно диффундирующих молекул, что вызывает (ГФДГ) часа после заражения

двустороннее перемешивание растворимых компонентов ядра и цитоплазмы: ядерные белки выходят в цитоплазму, а цигоплазматические .- в ядро. Возможно, это нужно вирусу для снабжения своих трансляционных и репликативных систем ядерными факторами, такими как Ьа, РАВР, нуклеолин. Кроме того, нарушение ядерной оболочки может способствовать попаданию в ядро полиовирусных белков (или других цитоплазматических факторов), повреждающих функции ядра (например, ЗСрГ0, которая способна расщеплять транскрипционные факторы, и таким образом, подавлять клеточную транскрипцию). Поскольку регуляция транскрипции во

многих случаях происходит за счет изменений локализации тех или иных транскрипционных факторов, нарушение нуклеоцитоплазматического барьера само по себе может приводить к сбоям в этой системе и, наряду с общим ингибированием транскрипции, обезоруживать клетку перед вирусом.

Разрушение ядерных пор в зараженной полиовирусом тетке

Электронно-микроскопическое исследование ядерных пор (структур, организующих селективный канал, через который осуществляется материальный обмен между ядром и цитоплазмой здоровой клетки, ЯП) проводили наши швейцарские коллеги Курт Бииц и Денис Эггер (Базель). ЯП в незараженной клетке содержат электронно-плотный материал, перегораживающий просвет поры, и вероятно, соответствующий так называемому комплексу ЯП (-125 мДа белковому комплексу, построенному из белков нуклеопоринов) или какой-то его части. Через 6 ч после заражения полиовирусом, в большинстве ядерных пор эта перегородка исчезает, создавая впечатление полностью «открытого» канала, что, по-видимому, указывает на деградацию комплекса ЯП (рис 5). Впрочем, клетки исследовали только через 6 ч после заражения, в то время как выход зеленого белка из ядра регистрируется уже через 2 ч. Поэтому нельзя исключить, что тотальное разрушение

Рис 5. Исследование ядерных пор в зараженных клетках под электронным микроскопом. Ядерная оболочка здоровой (А) и инфицированной полиовирусом (Б) клетки. Я — ядро. Клетки зафиксированы через б ч после заражения. В то время как ядерные поры здоровой клетки обладают темными перегородками (помечены стрелками), при заражении этот электрон-плотный материал теряется, что видимо, отражает разрушение ядерных пор («открытые» поры помечены треугольниками).

ядерных пор, видное на рисунке, может быть поздним явлением, происходящим позже нарушения их функций. Разрезание каких конкретных нуклеопоринов необходимо для повышения проницаемости ЯО и подавления активного транспорта, еще предстоит установить.

Существуют данные об участии ядерных пор в организации внутриядерного пространства, например, метаболизме пристеночного хроматина, сайленсинге генов. Тем самым, индуцированное полиовирусом расщепление нуклеопоринов может приводить к нарушениям функций ядра, не связанных с -фанспортом. Обращает на себя внимание компактизация пристеночного хроматина, наблюдаемая в зараженной клетке (рис 5), хотя пока мы не можем оценить значение нарушений ядерных пор для индукции этого явления.

Механизм повышения проницаемости ядерной оболочки полиоттсом

Повышение проницаемости ядетой оболочки в отсутствие каспаз 3 и 9. Полиовирус

индуцирует апоптоз на ранней стадии заражения. Известно, что в ходе апоптоза повышается

проницаемость ЯО, и за этот эффект отвечает каспаза 9. Для того чтобы проверить,, не

участвует ли каспаза 9 или другая апоптоз-зависимая протеаза в повреждении ЯО при

полиовирусной инфекции, мы провели опыт с

¡слетками МСР-7/С38-0РР/С90Ы, не содержащими

каспаз 3 и 9 и неспособными запускать апоптозную

программу. Клетки трансфицировали плазмидой

риНС-ЕОРР-М1,5 и заражали полиовирусом через

сутки после трансфекции. В то время как в здоровых

клетках флуоресценцию наблюдали строго в ядре, в

инфицированных она появлялась в цитоплазме через

отсутствие активных каспаз 3 и 2 ч после инфекции (рис 6). Таким образом, полиовирус £ Клетки МСГ- ?/СЗЗ-ОГР/С9ПИ

экспрессирующие ЕОРР-ЫЬБ и способен вызывать увеличение проницаемости ЯО инфицированные полиовирусом (2 ч после заражения).

контроль полиовирус

Рис 6. Полиовирус вызывает" выход маркерного белка из ядра в

контроль полиовирус „ _

гажшшгаиташ ншияшнашшиши) независимо от присутствия активных каспаз 3 и 9.

Повреждение ядерной оболочки здоровых клеток.

вызванное лизатом из зараженных клеток. Для того

чтобы исследовать молекулярный механизм

увеличения проницаемости ЯО, нам требовалось

разработать тест-сисггему, в которой мы могли бы

изучать содержащуюся в зараженных клетках

активность

(или активности),

о ьШ^'^^кр^^к, взаимодействующую(ие) с ядром. Здоровые клетки

HeLa ЗЕ, экспрессировавшие флуоресцентный

субстрат и обработанные дигитонином,

Рис 7. Воздействие лизата из инкубировали с S-100 лизатом, полученным из зараженных клеток на ядра

пермеабилированных здоровых клеток HeLa через 3 часа после заражения клеток. Здоровые клетки HeLa

ЗЕ обрабатывали дигитонином и полиовирусом. В качестве контроля использовали инкубировали с лизатом из

зараженных (полиовирус) и лизат из ложно-инфицированных клеток. В то время здоровых (контроль) клеток

HeLa 1 ч при 37"С. Как видно из как в контрольной пробе наблюдали рисунка, лизат из зараженных

клеток вызывал потерю ядрами флуоресцирующие ядра, проба, инкубировавшаяся с зеленого белка.

лизатом из зараженных клеток, полностью теряла флуоресценцию (рис 7). Следовательно, в лизате из зараженных клеток содержится какой-то фактор или факторы, вызывающий выход маркерного белка из ядер здоровых пермеабилизованных клеток. Этот фактор сохранялся в растворе при диализе и инактивировался при прогревании, что указывало на его белковую природу.

Подавление ингибиторами 2Арго способности полиовируса вызывать выход белков из ядра. Мы протестировали несколько ингибиторов протеаз на способность подавлять выход зеленого белка из ядер здоровых пермеабилизованных клеток, вызванный лизатом из зараженных клеток. Лизат из зараженных клеток обрабатывали ингибиторами и

+МРСМК +Эластатиналь +гУАО(ОМе).<тк инкубировали с

пермеабилизованными клетками культуры НеЬа-ЗЕ 1 час при 37°С. Как видно из таб 1, в которой приведены полученные результаты, чувствительность активности из зараженных полиовирусом клеток к различным ингибиторам

полностью совпадала с чувствительностью полиовирусной протеазы 2Арто. Используемая нами

экспериментальная система не позволяла давать количественные оценки действия того или иного ингибитора. Однако фотографии, приведенные на рис 8, позволяют качественно оценить пороговые концентрации ингибиторов, достаточные для полного подавления выхода флуоресцентного белка. Для МРСМК и гУАО(ОМе).Гтк пороговые концентрации находились в относительной близости от известных 1Сзо 2Арго (таб 1). На основании этих данных мы сделали вывод, что для индукции выхода флуоресцентного белка из ядра необходимо действие полиовирусной протеазы 2Арго.

Рис 8. Влияние кониентраиий ингибиторов 2Арго на активность лизатов из зараженных полиовирусом клеток. Минимальные концентрации, при которых ингибиторы продолжают действовать подчеркнуты.

Ингибитор Конп. Эффект1 Известное воздействие на протеазу 2А2 Класс протеаз - мишеней

MPCMK 50 мкМ + Ингибирование с Ю50 = 67 мкМ3 эластазы

Эластатиналь 50 мкМ + Ингибирование при 250 мкМ * «-«

Антигон 300 мкМ + Ингибирование при 300 мкМ3 трипсиноподобные и др.

Химсстатин 20 мкМ + Ингибирование риновирусной 2Арга с 1С50= 25 мкМ4 химотрипсинподобн. и др.

TLCK 100 мкМ + Ингибирование риновирусной 2Арг0 с Ю5о = 80 мкМ 4 каспазы

zVAD(OMe).fmk 5 мкМ + Ингибирование риновирусной 2Арго с Ю50- 5.6 мкМ 5 «-«

zVAD.fmk 100 мкМ - Нет ингибирования риновирусной 2Аргапри 50 мкМ4 трипсиноподобные и др.

Леупептин 1 мМ - Ингибирование на 27% при 1 мМ 6 кислые протеазы

пепстатин А 1 мМ - Нет ингибирования при 1мМ6 трипсин и химотрипсин

ФМСФ 1 мМ - Нет ингибирования при 1 мМ6 трипсиноподобные

ЭДТА 20 мМ + Ингибирование риновирусной 2Арго с 1С50= 16.5 мМ 4 металлозависимые протеазы

Zn~ 5 мМ + Ингибирование на 52% при 10 мМ6 широкий спектр

СсГ 2.5 мМ + Ингибирование на 56% при 10 мМ 6 «-«

Таблица 1. Влияние ингибиторов протеаз на активность лизата из зараженных клеток

1 «+»обозначает подавление способности лизата из зараженных клеток вызывать потерю флуоресценции ядрами здоровых пермеабилизованных клеток HeLa ЗЕ; 2 Если данные по 2АрГ0 полиовируса недоступны, приведены данные для риновирусной 2Арго;3 [Molia et al., 1993а];4 [Sommergruber et al., 1992]; 5 [Deszcz et al., 2004];6 [König and Rosenwirtb, 1987].

Однако результаты, полученные с использованием препаратов ядер, нельзя напрямую экстраполировать на внутриклеточные процессы. Например, нельзя исключить существование других повреждающих ядро активностей, действующих в клетке, но инактивирующихся в лизате. Для того чтобы соотнести описанное увеличение проницаемости ЯО с событиями, происходящими в клетке, несколько ингибиторов были протестированы на способность подавлять выход зеленого белка т ядра зараженных клеток (рис 9). Ингибитор 2Арго, МРСМК (1 мМ) при добавлении к зараженным клеткам культуры НеЬа ЗЕ полностью предотвращал выход зеленого белка из ядер клеток далее к 6 ч после заражения. Поскольку МРСМК подавляет размножение полиокируса, мы решили выяснить, не является ли действие ингибитора на способность вируса повреждать ЯО результатом подавления размножения. Для этого мы поставили эксперимент с другим ингибитором репликации полковируса, гуанидин-хлоридом. Как видно из рис 91, это вещество оказалось не способно подавить индуцированный полиовирусом выход ядерного белка, а следовательно, эффективная репродукция не является обязательным

условием для увеличения проницаемости ЯО, поэтому опосредованное действие

МРСМК маловероятно.

Ингибитор хУАО(ОМе).Стк (100 мкМ) вызывал задержку выхода ядерного белка на один час (рис 9). В соответствии с опубликованными данными, эта

Рис 9. Влияние ингибиторов на выход 3xEGFP- задеРжка ^ответствует времени NLS из ядер зараженных клеток. VA D -

zVAD(OMe) fmk деметилирования ингибитора

контроль полиовирус, 10 БОЕ/кл.

+МРСМК +гуанидин +VAD

эндогенными клеточными эстеразами. Неметилированная форма ингибитора (zVAD.fmk) уже не способна воздействовать на протеазу 2Арго.

Итак, результаты экспериментов с использованием пермеабилизованных клеток и лизатов указывали на необходимость 2АрГ0 для пермеабилизации ЯО. Ингибиторы 2Арг0, zVAD(OMe).fmk и МРСМК подавляли выход ядерных белков в цитоплазму зараженной полиовирусом клетки, указывая на сходство механизмов увеличения проницаемости ЯО в зараженной и пермеабилизованной клетке.

Нарушения ядерного транспорта, вызванные экспрессией попиовитсного белка. Для того

чтобы выяснить, является ли наличие 2Арг0 достаточным для увеличения проницаемости

ядерной оболочки и не способны ли другие вирусные белки вызывать сходные явления,

клетки HeLa ЗЕ трансфицировали плазмидами, кодировавшими различные неструктурные

белки полиовируса. Трансфекция плазмидами, кодировавшими ЗСрг0 и ЗА, не привела к

сколько-нибудь заметному появлению ядерного белка в цитоплазме. Экспрессия 2Арго

л pro „ ^ ого приводила к появлению в цитоплазме

2А мутант 2А дикий тип

~30-50% клеток маркерного белка уже через 6 ч после трансфекции. К 13 ч выход 3xEGFP-NLS достигал значительных масштабов (рис 10).

Рис 10. Индивидуальная экспрессия 2А"Г0 Однако выход ядеРного белка 8

вызывает выход 3xEGFP-NLS из ядра л, nm

транслированной клетки. Снимки сделаны экспедирующей 2АР клетке через 13 часов после трансфекции.

происходил значительно позясе, чем в зараженной (6 ч и 2 ч соответственно), и, в принципе, мог развиваться по другому механизму. Для того чтобы проверить такую возможность, был поставлен следующий эксперимент. Из клеток, экспрессирующих белок 2Арга дикого типа и его мутантную форму, были получены лизаты через 24 часа после трансфекции. Лизат из клеток, содержащих активный белок 2Арго, оказался способен вызывать выход зеленого белка из

ядер пермеабилизованных клеток (рис 11 А). Активность, содержавшаяся в лизате из клеток, экспрессирующих 2Арга ингибировалась МРСМК, химостатином и гУ.АХ)(ОМе).Гтк (рис 11 Б), что указывало на ее сходство с активностью из зараженных клеток. Таким образом, экспрессии протеазы 2Арго достаточно для увеличения проницаемости ЯО по механизму, сходному с наблюдаемым в зараженной клетке.

Рис 11. Исследование свойств

лизатов_из_2Арг0-

экспрессируюших клеток. А. Способность лизатов из 2Арго экспрессирующих клеток

вызывать потерю

флуоресценции ядрами

здоровых пермеабилизованных клеток. Б. Воздействие ингибиторов на лизат из клеток экспрессирующих 2Арю дикого типа. В эксперименте были использованы

концентрации ингибиторов, приведенные в таб 1.

Заключение. В настоящей работе при помощи флуоресцентных зондов было продемонстрировано вызванное полиовирусом повышение проницаемости ядерной оболочки, приводящее к переходу ядерных белков в цитоплазму, а цитоплазматических в ядро, и сопровождающееся разрушением ядерных пор, видимым под электронным микроскопом. Был идентифицирован белок полиовируса (протеаза 2Арг0), ответственный за нарушения ядерного транспорта. Биологическое значение нарушений нуклеоцитоплазматического транспорта еще предстоит установить, однако, мы можем предположить, что оно заключается в снабжении трансляционных и репликационных систем вируса необходимыми ядерными факторами, а также может иметь значение для повреждения функций ядра клетки полиовирусом.

20

Выводы:

1. Показано, что полиовирусная инфекция приводит к увеличению проницаемости ядерной оболочки и переходу ядерных белков в цитоплазму, а цитоплазматических - в ядро.

2. Показано, что полиовирусная инфекция сопровождается деградацией комплексов ядерных пор, что с подавляющей вероятностью, и является причиной пермеабилизации ядерной оболочки.

3. Показано, что полиовирусная протеаза 2Арго является необходимым и достаточным фактором для пермеабилизации ядерной оболочки.

Благодарности

Я выражаю благодарность моему научному руководителю, профессору В. И. Аголу за возможность пройти настоящую научную школу и предложенную тему работы. Я глубоко признателен также Г. А. Белову за огромную помощь в планировании и проведении экспериментов, а также О. В. Микитась, Д. Эггер, К. Бинцу и К. А. Лукьянову, в сотрудничестве с которыми были выполнены эти исследования. Хочется поблагодарить всех сотрудников нашей лаборатории за неоценимую помощь в работе и создание дружелюбной рабочей атмосферы. Также хочется поблагодарить В. Муронца, Ю. Лазебника, Р. Ллойда, Э. Виммера, Д. Булавина за предоставленные материалы.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Belov G. A., Lidsky P. V., Mikitas О. V., Egger D., Lukyanov К. A., Bienz К., and Agol V. I. Bidirectional increase in permeability of nuclear envelope upon poliovirus infection and accompanying alterations of nuclear pores. 2004. J. Virol. 78:10166-10177.

2. Belov G. A., Lidsky P. V., Mikitas О. V., Lazebnik Y., and Agol V. I. Poliovirus increases nuclear envelope permeability. 2002. Xllth Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses. Cape Cod, USA, May 13-19, K4.

3. Lidsky P. V., Hato S., Bardina M. V., Aminev A. G., Palmenberg A. C., van Kuppeveld F. J. M. and Agol V. I. Nuclocytoplasmic traffic disorder induced by cardioviruses. 2005. XIHth Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses. Lunteren, The Netherlands, May 23-29, G09.

Подписано в печать 07.09.2005 Формат 60x88 1/16. Объем 3.5 п.л. Тираж 120 экз. Заказ № 103 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102

И 8 18«

РНБ Русский фонд

2006^4 13339

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лидский, Петр Владимирович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2. 1. нуклеоцитоплазматическии транспорт.

2. 1. 1. Строение и свойства ядерной поры.

2. 1. 2. Транспорт макромолекул через ядерные поры.

2. I. 3. Регуляция нуклеоцитотазматического транспорта отдельных белков.

2. I. 4. Регуляция систем нуклеоцитотазматического транспорта.

2. 1. 5. Модификации белков комтскса ядерной поры.

2. 1. 6. Нарушения нуклеоцитотазматического транспорта при апоптозе.

2.2. Общие сведения о полиовирусе.

2.3. Взаимодействие полиовируса и клетки.

2. 3. 1. Угнетение клеточной транскрипции.

2. 3. 2. Угнетение кэп-зависимой трансляции.

2. 3. 3. Модификация мембран и мембранного транспорта.

2. 3. 4. Перестройка цитоскелета.

2. 3. 5. Гибель зараженной клетки.

2. 3. 6. Воздействие на иуклеоцитотазматический транспорт.

3. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

4. МАТЕРИАЛЫ 11 МЕТОДЫ.

4.1. Методы клонирования ДНК.

4. 1. 1. Получение клеток компетентной культуры штамма Е. coli ТОР-10.

4. 1. 2. Трансформация клеток компетентной культуры тазмидной ДНК.

4. 1. 3. Выделение тазмидной ДНК.

4. 1. 4. Рестрикция.

4. 1. 5. Обработка щелочной фосфатазой.

4. 1. 6. Обработка ДНК фрагментом Кленова.

4. 1. 7. Электрофорез в агарозном геле и выделение фрагментов ДНК из геля.

4. 1. 8. Лигирование.

4. 1. 9. Полимеразная цепная реакция (PCR).

4. 1. 10. Секвенирование тазмидной ДНК.

4.2. Плазмиды.

4. 2. 1. Исходные тазмиды.

4. 2. 2. Получение тазмид.

4.3. Методы работы с эукариотическими клетками.

4. 3. 1. Культуры клеток.

4. 3. 2. Заражение клеток вирусом.

4. 3. 3. Трансфекция клеток тазмидной ДНК.

4. 3. 4. Метод ретровирусной транедукции и получение моноклонов.48 '

4. 3. 5. Получение лизатов эукариотических клеток.

4. 3. 6. Получение пермеабилизованных клеток.

4. 3. 7. Выделение ядер.

4.4. Ингибиторы.

4.5. Микроскопия.

4. 5. 1. Иммунофлуоресценция.

4. 5. 2. Флуоресцентная микроскопия.

4. 5. 3. Электронная микроскопия.

5. РЕЗУЛЬТАТЫ.

5.1. Исследование проницаемости ядерной оболочки в клетке, зараженной полиовирусом.

5. 1. 1. Выход Ттег-ЫЬБ из ядра в цитоплазму зараженной клетки.

5. I. 2. Создание культуры клеток, экспрессирующих ЗхЕСРР-ИЬБ.

5. 1. 3. Выход ядерного белка из препаратов ядер зараженных клеток.

5. 1. 4. Вход цитоплазматических белков в ядро зараженной клетки.

5.2. Исследование ядерных пор в зараженной полиовирусом клетке.

5.3. Исследование механизма повышения проницаемости ядерной оболочки полиовирусом.

5. 3. 1. Повышение проницаемости ядерной оболочки в отсутствие каспаз 3 и 9.

5. 3. 2. Повреждение ядерной оболочки здоровых клеток, вызванное лизатом из зараженных клеток.

5. 3. 3. Подавление ингибиторами 2Арго способности полиовируса вызывать выход белков из ядра.

5. 3. 4. Нарушение ядерного транспорта, вызванные экспрессией полиовирусного белка

6. ОБСУЖДЕНИЕ.

6.1. Нарушение барьерной функции ядерной оболочки при полиовирусной инфекции

6.2. Разрушение ядерных пор в зараженной полиовирусохм клетке.

6. 3. 2АРКО полиовируса вызывает нарушения ядерной оболочки.

6.4. Взаимодействие вирусов и систем нуклеоцитоплазматического транспорта

6.5. Биологическое значение нарушений нуклеоцитоплазматического транспорта при полиовирусной инфекции.

7. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние полиовирусной инфекции на нуклеоцитоплазматический транспорт"

Актуальность проблемы. Пикорнавирусы и, в частности, вирус полиомиелита (полиовирус) являются возбудителями важных заболеваний человека и животных. Этим во многом объясняется пристальный интерес, который уделяют исследователи этой группе вирусов. В течение последнего десятилетия достигнуты значительные успехи в понимании молекулярно-биологических основ репродукции пикорнавирусов и вызываемых ими изменении физиологических процессов в зараженной клетке. Вместе с тем, до полного понимания всей картины взаимодействия этих вирусов с клеткой еще далеко. Несколько лет назад в нашей лаборатории был обнаружен еще один интересный аспект воздействия полиовируса на клетку - нарушение нуклеоцитоплазматнческого транспорта.

Макромолекулярный состав ядра эукариотической клетки существенно отличается от белкового состава ее цитоплазмы. Эта асимметрия достигается благодаря барьерной функции ядерной оболочки, и за счет действия специальных механизмов транспорта белков, РНК и рнбопуклеопротеидов. Многие вирусы эукариот, часть репликативного цикла которых протекает в ядре, используют эти транспортные механизмы для того, чтобы попасть в ядро или выйти из ядра [Izaurralde et. al. 1999]. Некоторые из них модифицируют системы нуклеоцитоплазматического транспорта в соответствии с собственными интересами [Whittaker, 2003]. Аспекты взаимодействия размножающихся в цитоплазме вирусов (к которым относится и полиовирус) с транспортными системами клетки пока остаются менее изученными, хотя также представляют значительный интерес.

Цели и задачи исследования. В предыдущих исследованиях было показано, что при заражении клеток полиовирусом происходит нарушение нуклеоцитоплазматического транспорта белков: ядерные белки оказываются в цитоплазме [Belov et. al., 2000; Gustin and Sarnow, 2001]. Настоящая работа посвящена исследованию данного эффекта. Нашей задачей было установить характер изменений, происходящих с ядерной оболочкой при инфекции, выяснить, какой из продуктов полиовируса ответственен за это изменение, а также исследовать механизм развития эффекта.

Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе данной работы с помощью флуоресцентных зондов было показано, что ядерная оболочка в инфицированной клетке теряет свою барьерную функцию и становится проницаемой для белков большой молекулярной массы. С подавляющей вероятностью этот эффект связан с деградацией ядерных пор, которая была продемонстрирована с помощью электронной микроскопии. Метод ингибиторного анализа показал, что продукт вируса, ответственный за нарушение ядерного транспорта - это нротеаза 2Арго. Индивидуальная экспрессия этого белка в клетках приводила к нарушениям ядерного транспорта, сходным с происходящими при заражении.

Углубленное исследование этого явления представляет значительный интерес, поскольку не только разъясняет проблему взаимодействия цитоплазматического вируса с ядром клетки, но и расширяет наши знания о системах нуклеоцитоплазматического транспорта, их устройстве, регуляции, роли в организации внутриядерного пространства.

Апробация работы. По материалам диссертации были опубликованы две статьи. Результаты настоящей работы были доложены на XII и XIII международных конференциях «Молекулярная биология пикорнавирусов» в 2002 г. на мысе Кейп-Код, США и в 2005 г. в Люнтерене, Голландия соответственно, на международных семинарах по программе ШТАБ в 2003 г. в Москве, и в 2004 г. в Финляндии, на семинарах в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им М. П. Чумакова.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Лидский, Петр Владимирович

7. ВЫВОДЫ

1. Показано, что при полиовирусной инфекции флуоресцентный белок с сигналом ядерной локализации покидает ядро, а цитоплазматические белки сусИп В-ЕОРР, САОРН и пентамер ЕОРР без входят в ядро. ЗхЕОРР-МЬБ эффективно выходил из полученных разными способами препаратов ядер зараженных клеток. Следовательно, полиовирусная инфекция приводит к увеличению проницаемости ядерной оболочки для пассивной диффузии в обоих направлениях.

2. Методом электронной микроскопии показано, что полиовирусная инфекция сопровождается деградацией комплексов ядерных пор, что вероятно, и является причиной увеличения проницаемости ядерной оболочки.

3. Разработана экспериментальная система, позволившая протестировать ряд ингибиторов на способность подавлять индуцированные полиовирусом изменения ядерной оболочки. С помощью данной системы, а также путем экспрессии в клетках отдельных полиовирусных белков, показано, что за нарушение нуклеоцитоплазматического барьера отвечает полиовирусная протеаза 2Арго.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лидский, Петр Владимирович, Москва

1. Агол В.И. Трансляционный контроль фенотипа пикорнавирусов. 2001. Мол биол. 35:691-701

2. Adam S, Marr S, Gerace L. Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors. 1990. J Cell Biol. 111:807-816

3. Agol V. Picornavirus genome: An overview, in Molecular Biology of Picornaviruses. Eds. Semler B, Wimmer E. Washington. 2002. Am Microbiol Soc. P. 127-148

4. Agol V, Belov G, Bienz K, Egger D, Kolesnikova M, Raikhlin N, Romanova L, Smirnova E, Tolskaya E. Two types of death of poliovirus-infected cells: caspase involvement in the apoptosis but not cytopathic effect. 1998. Virology. 252:343-353

5. Agol V, Belov G, Bienz K, Egger D, Kolesnikova M, Romanova L, Sladkova L, Tolskaya E. Competing death programs in poliovirus-infected cells: commitment switch in the middle of the infectious cycle. 2000. J Virol. 74:5534-5541

6. Allen T, Cronshaw J, Bagley S, Kiseleva E, Goldberg M. The nuclear pore complex: mediator of translocation between nucleus and cytoplasm. 2000. J Cell Sci. 113:1651-1659

7. Banerjee R, WeidmanM, Navarro S, Comai L, Dasgupta A. Modifications of both selectivity factor and upstream binding factor contribute to poliovirus-mediated inhibition of RNA polymerase I transcription. 2005. J Gen Virol. 86:2315-2322

8. Barco A, Feduchi E, Carrasco L. Poliovirus protease 3C(pro) kills cells by apoptosis. 2000. Virology. 266:352-360

9. Barton D, Flanegan J. Coupled translation and replication of poliovirus RNA in vitro: synthesis of functional 3D polymerase and infectious virus. 1993. J Virol. 67:822-831

10. Beck M, Forster F, Ecke M, Plitzko J, Melchior F, Gerisch G, Baumeister W, Medalia O. Nuclear pore complex structure and dynamics revealed by cryoelectron tomography. 2004. Science. 306:1387-90

11. Belov G, Evstafieva A, Rubtsov Y, Mikitas O, Vartapetian A, Agol V. Early alteration of nucleoeytoplasmie traffic induced by some RNA viruses. 2000. Virology. 275:244-248

12. Belov G, Fogg M, Ehrenfeld E. Poliovirus proteins induce membrane association of GTPase ADP-ribosylation factor. 2005. J Virol. 79:7207-7216

13. Belov G, Romanova L, Tolskaya E, Kolesnikova M, Lazebnik Y, Agol V. The major apoptotic pathway activated and suppressed by poliovirus. 2003. J Virol. 77:45-56

14. Bhardwaj A, Aggarwal B. Receptor-mediated choreography of life and death. 2003. J Clin Immunol. 23:317-332

15. Egger D, Bienz K. Intracellular location and translocation of silent and active poliovirus replication complexes. 2005. J Gen Virol. 86:707-718

16. Blom N, Hansen J, Blaas D, Brunak S. Cleavage site analysis in picornaviral polyproteins: discovering cellular targets by neural networks. 1996. Protein Sci. 5:2203-2216

17. Bogerd H, Benson R, Truant R, Herold A, Phingbodhipakkiya M, Cullen B. Definition of a consensus transportin-specific nucleocytoplasmic transport signal. 1999. J Biol Chem. 274:9771-9777

18. Bovee M, Marissen W, Zamora M, Lloyd R. The predominant elF4G-specific cleavage activity in poliovirus-infected IleLa cells is distinct from 2A protease. 1998. Virology. 245:229-240

19. Bras M, Queenan B, Susin S. Programmed cell death via mitochondria: Different modes of dying. 2005. Biochemistry (Moscow). 70:231-239

20. Braun I, Rohrbach E, Schmitt C, Izaurralde E. TAP binds to the constitutive transport element (CTE) through a novel RNA-binding motif that is sufficient to promote CTE-dependent RNA export from the nucleus. 1999. EMBO J. 18:1953-1965

21. Buendia B, Santa-Maria A, Courvalin J. Caspase-dependent proteolysis of integral and peripheral proteins of nuclear membranes and nuclear pore complex proteins during apoptosis. 1999. J Cell Sci. 112 :1743-1753

22. Bui M, Whittaker G, Ilelenius A. Effect of Ml protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. 1996. J Virol. 70:8391-8401

23. Bustamante J, Michelette E , Geibel J, Hanover J, McDonnell T, Dean D. Dendrimer-assisted patch-clamp sizing of nuclear pores. 2000. Pflugers Arch Eur J Physiol. 439:829-837

24. Colbere-Garapin F, Pelletier I, Ouzilou L. Persistent infection by picornaviruses. in Molecular Biology of Picornaviruses. Eds. Semler B, and Wimmer E. Washington. 2002. Am Microbiol Soc. 437-448

25. Cronshaw J, Krutchinsky A, Zhang W, Chait B, Matunis M. Proteomic analysis of the mammalian nuclear pore complex. 2002. Cell Biol. 158:915-927

26. Cuconati A., Molla A., Wimmer E. Brefeldin A inhibits cell-free, de novo synthesis of poliovirus. 1998. J Virol. 72:6456-6464

27. Daigle N, Beaudouin J, Hartnell L, Imreh G, Hallberg E, Lippincott-Schwartz J, Ellenberg J. Nuclear pore complexes form immobile networks and have a very low turnover in live mammalian cells. 2001. J Cell Biol. 154:71-84

28. Danker T, Oberleithner H. Nuclear pore function viewed with atomic force microscopy. 2000. Pflugers Arch Eur J Physiol. 439:671-681

29. Deszcz L, Seipelt J, Vassilieva E, Roetzer A, Kuechler E. Antiviral activity of caspase inhibitors: effect on picornaviral 2A proteinase. 2004. FEBS Lett. 560:51-55

30. Dodd D, Giddings T, Kirkegaard K. Poliovirus 3A protein limits interleukin-6 (IL-6), IL-8, and beta interferon secretion during viral infection. 2001. J Virol. 75:8158-8165.

31. Doedens J, Kirkegaard K. Inhibition of cellular protein secretion by poliovirus proteins 2B and 3A. 1995. EMBO J. 14:894-907

32. Doedens J, Maynell L, Klymkowsky M, Kirkegaard K. Secretory pathway function, but not cytoskeletal integrity, is required in poliovirus infection. 1994. Arch Virol Suppl. 9:159-172

33. Donnelly M, Gani D, Flint M, Monaghan S, Ryan M. The cleavage activities of aphthovirus and cardiovirus 2A proteins. 1997. J Gen Virol. 78:13-21

34. Egger D, Gosert R, Bienz K. Role of cellular structures in viral RNA replication, in Molecular Biology of Picornaviruses. Eds. Semler BL, Wimmer E. Washington. 2002. Am Microbiol Soc. P. 247-253

35. Egger D, Teterina N, Ehrenfeld E, Bienz K. Formation of the poliovirus replication complex requires coupled viral translation, vesicle production, and viral RNA synthesis. 2000. J Virol. 74:6570-6580

36. Emig S, Schmalz D, Shakibaei M, Buchner K. The Nuclear Pore Complex Protein p62 Is One of Several Sialic Acid-containing Proteins of the Nuclear Envelope. 1995. J Biol Chem. 270:13787-13793

37. Fagerlund R, Melen K, Kinnunen L, Julkunen I. Arginine/Lysine-rich Nuclear Localization Signals Mediate Interactions between Dimeric STATs and lmportin 5. 2002. J Biol Chem. 277:30072-30078

38. Faleiro L, Lazebnik Y. Caspases disrupt the Nuclear-Cytoplasmic Barrier. 2000. J Cell Biol. 151:951-959

39. Faubion W, Guicciardi M, Miyoshi H, Bronk S, Roberts P, Svingen P, Kaufmann S, Gores G. Toxic bile salts induce rodent hepatocyte apoptosis via direct activation of Fas. 1999. J Clin Invest. 103:137-45.

40. Feldherr C, Akin D. Stimulation of nuclear import by simian virus 40-transformed cell extracts is dependent on protein kinase activity. 1995. Mol Cell Biol. 15:7043-7049

41. Feldherr C, Akin D, Cohen R. Regulation of functional nuclear pore size in fibroblasts. 2001. J Cell Sci. 114: 4621-4627

42. Fischer U, Huber J, Boelens W, Mattaj I, Luhrmann R. The HIV-1 Rev activation domain is a nuclear export signal that accesses an export pathway used by specific cellular RNAs. 1995. Cell. 82:475^83

43. Flint S, Gonzalez R. Regulation of mRNA production by the adenoviral E1B 55-kj.,a and E4 Orf6 proteins. 2003. Curr Top Microbiol Immunol. 272:287-330

44. Follett E, Pringle C, Pennington T. Virus development in enucleate cells: echovirus, poliovirus, pseudorabies virus, reovirus, respiratory syncytial virus and Semliki Forest virus. 1975. J Gen Virol. 26:183-196

45. Fuentes-Prior P, Salvescn G. The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition. 2004. Biochem J. 384:201-232

46. Galy V, Olivo-Marin J, Scherthan H, Doye V, Rascalou N, Nehrbass U. Nuclear pore complexes in the organization of silent telomcric chromatin. 2000. Nature. 403:108-112

47. Gingras A, Svitkin Y, Belsham G, Pause A, Sonenberg N. Activation of the translational suppressor 4E-BP1 following infection with encephalomyocarditis virus and poliovirus. 1996. Proc Natl Acad Sci USA. 93:5578-5583

48. Goldberg M, Wiese C, Allen T, Wilson K. Dimples, pores, star-rings, and thin rings on growing nuclear envelopes: evidence for structural intermediates in nuclear pore complex assembly. 1997. J Cell Sci. 110:409-420

49. Goldstaub D, Gradi A, Bercovitch Z, Grosmann Z, Nophar Y, Luria S, Sonenberg N, Kahana C. Poliovirus 2A protease induces apoptotic cell death. 2000. Mol Cell Biol. 20:1271-1277

50. Gonzalez M, Carrasco L. Viroporins. 2003. FEBS Lett. 552:28-34

51. Gorlich D. Transport into and out of the cell nucleus. 1998. EMBO J. 17:2721-2727

52. Gorlich D, Kutay U. Transport between the cell nucleus and the cytoplasm. 1999. Annu Rev Cell Dev Biol. 15:607-660

53. Greber U, Fassati A. Nuclear import of viral DNA genomes. 2003. Traffic. 4:136-143

54. Grigorieva J, Dainiak M, Katrukha A, Muronetz V. Antibodies to the nonnative forms of d-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: identification, purification, and influence on the renaturation of the enzyme. 1999. Arch Biochem Biophys. 369:252-260

55. Guinea R, Carrasco L. Phospholipid biosynthesis and poliovirus genome replication, two coupled phenomena. 1990. EMBOJ. 9:2011-2016.

56. Gustin K, Sarnow P. Effects of poliovirus infection on nucleo-cytoplasmic trafficking and nuclear pore complex composition 2001. EMBO J. 20:240-249

57. Gustin K, Sarnow P. Inhibition of nuclear import and alteration of nuclear pore complex composition by rhinovirus. 2002. J Virol. 76:8787-8796

58. Fahrenkrog B, Stoffler D, Aebi U. Nuclear pore complex architecture and functional dynamics. 2001. Curr Top Microbiol Immunol. 259:95-117

59. Follett E, Pringle C, Pennington T. Virus development in enucleate cells: echovirus, poliovirus, pseudorabies virus, reovirus, respiratory syncytial virus and Semliki Forest virus. 1975. J Gen Virol. 26:183-196

60. Iwatsuki-Horimoto K, Horimoto T, Fujii Y, Kawaoka Y. Generation of influenza A virus NS2 (NEP) mutants with an altered nuclear export signal sequence. 2004. J Virol. 78:10149-10155

61. Izaurralde E, Kann M, Panto N, Sodeik B, Hohn T. Viruses, microorganisms and scientists meet the nuclear pore. 1999. EMBO J. 18:289-296

62. Izumi R, Valdez Ö, Banerjee R, Srivastava M, Dasgupta A. Nucleolin stimulates viral internal ribosome entry site-mediated translation. 2001. Virus Res. 76:17-29

63. Jänicke R, Sprengart M, Wati M, Porter A. Caspase-3 Is Required for DNA Fragmentation and Morphological Changes Associated with Apoptosis. 1998. J Biol Chem 273:9357-9360.

64. Jans D. The regulation of protein transport to the nucleus by phosphorylation. 1995. Biochem J. 311:705-716

65. Jiang X, Wang X. Cytochrome c-mediated apoptosis. 2004. Annu Rev Biochem. 73:87-106.

66. Johannes G, Carter M, Eisen M, Brown P, Sarnow P. Identification of eukaryotic mRNAs that are translated at reduced cap binding complex eIF4F concentrations using a cDNA microarray. 1999. ProcNall Acad Sei USA. 96:13118-23

67. Kaffman A, O'Shea EK. Regulation of nuclear localization: a key to a door. 1999. Annu Rev Cell Dev Biol. 15:291-339

68. Kann M, Sodeik B, Vlachou A, Gerlich W, Helenius A. Phosphorylation-dependent binding of hepatitis B virus core particles to the nuclear pore complex. 1999. J Cell Biol. 145:45-55

69. Kehlenbach R, Gerace L. Phosphorylation of the Nuclear Transport Machinery Down-regulates Nuclear Protein Import in Vitro. 2000. J Biol Chem. 275:17848-17856

70. Kihlmark M, Rustum C, Eriksson C, Beckman M, Iverfeldt K, Hallberg E. Correlation between nucleocytoplasmic transport and caspase-3-dependent dismantling of nuclear pores during apoptosis. 2004. Exp Cell Res. 293:346-356

71. Kirchhausen T. Three ways to make a vesicle. 2000. Nat Rev Mol Cell Biol. 1:187-198

72. Kleijn M, Vrins C, Voorma H, Thomas A. Phosphorylation state of the cap-binding protein eIF4E during viral infection. 1996. Virology. 217:486-494

73. König H, Rosenwirth B. Purification and partial characterization of poliovirus protease 2A by means of a functional assay. 1987. J Virol. 62:1243-1250

74. Krausslich H, Nicklin M, Toyoda H, Etchison D, Wimmer E. Poliovirus proteinase 2A induces cleavage of eucaryotic initiation factor 4F polypeptide p220. 1987. J Virol. 61:27112718

75. Krull S, Thyberg J, Bjorkroth B, Rackwitz H, Cordes V. Nucleoporins as components of the nuclear pore complex core structure and Tpr as the architectural element of the nuclear basket. 2004. Mol Biol Cell. 15:4261-4277

76. LeHir H, Gatfield D, Izaurralde E, Moore M. The exon-exon junction complex provides a binding platform for factors involved in mRNA export and nonsense-mediated mRNA decay. 2001. EMBO J. 20:4987-4997

77. Lenk R., Penman S. The cytoskeletal framework and poliovirus metabolism. 1979. Cell. 16:289-301.

78. Levine B, Klionsky D. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. 2004. Dev Cell. 6:463-477

79. Lombardo E, Ramirez J, Agbandje-Mckenna M, Almendral J. A 13-stranded motif drives capsid protein oligomers of the parvovirus minute virus of mice into the nucleus for viral assembly. J Virol. 2000. 74:3804-3814

80. Lusk C, Makhnevych T, Wozniak R. New ways to skin a kap: mechanisms for controlling nuclear transport. 2004. Biochem Cell Biol. 82:618-625

81. Madison D, Yaciuk P, Kwok P, Lundblad J. Acetylation of the adenovirus-transforming protein El A determines nuclear localization by disrupting association with importin-a. 2002. J Biol Chem. 277:38755-38763

82. Mattaj I, Englmeier L. Nucleocytoplasmic transport: the soluble phase. 1998. Annu Rev Biochem. 67:265-306

83. McBride A, Schlegel A, Kirkegaard K. Human protein Sam68 relocalization and interaction with poliovirus RNA polymerase in infected cells. 1996. Proc Natl Acad Sci USA. 93:22962301 .

84. Meerovitch K, Svitkin Y, Lee H, Lejbkowicz F, Kenan D, Chan E, Agol V, Keene J, Sonenberg N. La autoantigen enhances and corrects aberrant translation of poliovirus RNA in reticulocyte lysate. 1993. J Virol. 67:3798-3807

85. Michael M, Eder P, Dreyfuss G. The K nuclear shuttling domain: a novel signal for nuclear import and nuclear export in the hnRNP K protein. 1997. EMBO J. 16:3587-3598

86. Miller M, Caracciolo M, Berlin W, Hanover J. Phosphorylation and Glycosylation of Nucleoporins. 1999. Arch Biochem Biophys. 367:51-60

87. Molla A, Paul A, Wimmer E. Cell-free, de novo synthesis of poliovirus. 1991. Science. 254:1647-1651

88. Molla A, Hellen C, Wimmer E. Inhibition of proteolytic activity of poliovirus and rhinovirus 2A proteinases by elastase-specific inhibitors. 1993a. J Virol. 67:4688-4595

89. Molla A, Paul A, Schmid M, Jang S, Wimmer E. Studies on dicistronic polioviruses implicate viral proteinase 2Apro in RNA replication. 1993b. Virology. 196:739-747

90. Molla A, Paul A, Wimmer E. Effects of temperature and lipophilic agents on poliovirus formation and RNA synthesis in a cell-free system. 1993c. J Virol. 67:5932-5938

91. Neznanov N, Chumakov P, Ullrich A, Agol V, Gudkov A. Unstable receptors disappear from cell surface during poliovirus infection. 2002. Med Sci Monit. 8:BR391-396

92. Neznanov N, Kondratova A, Chumakov KM, Angres B, Zhumabayeva B, Agol VI, Gudkov AV. Poliovirus protein 3A inhibits tumor necrosis factor (TNF)-induced apoptosis by eliminating the TNF receptor from the cell surface. 2001. J Virol. 75:10409-10420

93. Paragas J, Talon J, O'Neill R, Anderson K, Garcia-Sastre A, Palcse P. Influenza B and C Virus NEP (NS2) Proteins Possess Nuclear Export Activities. 2001. J Virol. 75:7375-7383

94. Pemberton L, Paschal B. Mechanisms of receptor-mediated nuclear import and nuclear export. 2005. Traffic. 6:187-198

95. Pestova T, Hellen C, Shatsky I. Canonical eukaryotic initiation factors determine initiation of translation by internal ribosomal entry. 1996. Mol Cell Biol. 16:6859-6869.

96. Pestova T, Kolupaeva V, Lomakin I, Pilipcnko E, Shatsky I, Agol V, Hellen C. Molecular mechanisms of translation initiation in eukaryotes. 2001. Proc Natl Acad Sci USA. 98:70297036

97. Petersen J, lier L, Varvel V, Lund E, Dahlberg J. The matrix protein of vesicular stomatitis virus inhibits nucleocytoplasmic transport when it is in the nucleus and associated with nuclear pore complexes. 2000. Mol Cel Biol. 20:8590-8601

98. Petersen J, Her L, Dahlberg J. Multiple vesiculoviral matrix proteins inhibit both nuclear export and import. 2001. Proc Natl Acad Sci USA. 98:8590-8595

99. Pollack R, Goldman R. Synthesis of infective poliovirus in BSC-1 monkey cells enucleated with cytochalasin B. 1973. Science. 179:915-916

100. Porter A, Dhakshinamoorthy S. Apoptosis initiated by dependence receptors: a new paradigm for cell death? 2004. Bioessays. 26:656-664.

101. Rabut G, Doye V, Ellenberg J. Mapping the dynamic organization of the nuclear pore complex inside single living cells. 2004. Nat Cell Biol. 6:1114-1121

102. Rakowska A, Danker T, Schneider SW, Oberleithner II. ATP-induced shape changes of nuclear pores visualized with the atomic force microscope. 1998. J Membrane Biol. 163:129136

103. Romanova L, Belov G, Lidsky P, Tolskaya E, Kolesnikova M, Evstafieva A, Vartapetian A, Egger D, Bienz K, Agol V. Variability in apoptotic response to poliovirus infection. 2005. Virology. 331:292-306

104. Roulston A, Marcellus R, Branton P. Viruses and apoptosis. 1999. Annu Rev Microbiol. 53: 577-628

105. Rust R, Landmann L, Gosert R, Tang B, Hong W, Hauri H, Egger D, Bienz K. Cellular COPII proteins are involved in production of the vesicles that form the poliovirus replication complex. 2001. J Virol. 75:9808-9818

106. Sandoval I, Carrasco L. Poliovirus infection and expression of the poliovirus protein 2B provoke the disassembly of the Golgi complex, the organelle target for the antipoliovirus drug Ro-090179. 1997. J Virol. 71:4679-4693

107. Schmitz H. Reversible nuclear translocation of glyceroaldehyde-3-phosphate dehydrogenase upon serum depletion. 2001. Eur J Cell Biol. 80:419-427

108. Schwartz T. Modularity within the architecture of the nuclear pore complex. 2005. Curr Opin Struct Biol. 15:221-226

109. Schlegel A, Giddings T, Ladinsky M, Kirkegaard K. Cellular origin and ultrastructure of membranes induced during poliovirus infection. 1996. J Virol. 70:6576-6588

110. Sandri-Goldin R.Viral Regulation of mRNA Export. 2004. J Virol. 78: 4389-4396

111. Semler B, Wimmer E. editors. Molecular Boilogy of Picornaviruses. 2002. ASM Press Washington DC

112. Shen Y, Igo M, Yalamanchili P, Berk A, Dasgupta A. DNA binding domain and subunit interactions of transcription factor IIIC revealed by dissection with poliovirus 3C protease. 1996. Mol Cell Biol. 16:4163-4171

113. Smith W, Schurter B, Wong-Staal F, David M. Arginine methylation of RNA helicase a determines its subcellular localization. 2004. J Biol Chem. 279:22795 22798

114. Sommergruber W, Ahorn H, Zophel A, Maurer-Fogy, Fessl F, Schnorrenberg G, Liebig H, Blaas D, Kuechler E, and Skern T. Cleavage specificity on synthetic peptide substrates of human rhinovirus 2 proteinase 2A. 1992. J Biol Chem. 267: 22639-22644

115. Stanway G, Joki-Korpela P, Hyypia T. Human parechoviruses—biology and clinical significance. 2000, Rev Med Virol. 10:57-69

116. Stofiler D, Goldie K, Aebi U. Calcium-mediated structural changes of native nuclear pore complexes monitored by time-lapse atomic force microscopy. 1999. J Mol Biol. 287:741-752

117. Stommel J, Marchenko N, Jimenez G, Moll U, Hope T, Wahl G. A leucine-rich nuclear export signal in the p53 tetramerization domain: regulation of subcellular localization and p53 activity by NES masking. 1999. EMBO J. 18:1660-1667

118. Suhy D, Giddings T, Kirkegaard K. Remodeling the endoplasmic reticulum by poliovirus infection and by individual viral proteins: an autophagy-like origin for virus-induced vesicles. 2000. J Virol. 74:8953-8965

119. Svitkin Y, Imataka H, Khaleghpour K, Kahvejian A, Liebig H, Sonenberg N. Poly(A)-binding protein interaction with elF4G stimulates picornavirus IRES-dependent translation. 2001. RNA. 7:1743-1752

120. Svitkin Y, Meerovitch K, Lee H, Dholakia J, Kenan D, Agol V, Sonenberg N. Internal translation initiation on poliovirus RNA: further characterization of La function in poliovirus translation in vitro. 1994. J Virol. 68:1544-1550

121. Takizawa C, Morgan D. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-Bl-Cdkl and Cdc25C. 2000. Curr Opin Cell Biol. 12:658-665

122. Tcrskikh A, Fradkov A, Ermakova G, Zaraisky A, Tan P, Kajava A, Zhao X, Lukyanov S, Matz M, Kim S, Wcissman I, Siebert P. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. 2000. Science. 290:1585-1588

123. Tolskaya E, Romanova L, Kolesnikova M, Ivannikova T, Smirnova E, Raikhlin N, Agol V. Apoptosis-inducing and apoptosis-preventing functions of poliovirus. 1995. J Virol. 69:11811189

124. Tolskaya E, Romanova L, Kolesnikova M, Ivannikova T, Agol V. Final checkpoint in the drug-promoted and poliovirus-promoted apoptosis is under post-translational control by growth factors. 1996. J Cell Biochem. 63:422-431

125. Weed H, Krochmalnic G, Penman S. Poliovirus metabolism and the cytoskeletal framework: detergent extraction and resinless section electron microscopy. 1985. J Virol. 56:549-557

126. Weidman M, Yalamanchili P, Ng B, Tsai W, Dasgupta A. Poliovirus 3C Protease-Mediated Degradation of Transcriptional Activator p53 Requires a Cellular Activity. 2001. Virology. 291:260-271

127. Weidman M, Sharma R, Raychaudhuri S, Kundu P, Tsai W, Dasgupta A. The interaction of cytoplasmic RNA viruses with the nucleus. 2003. Virus Res. 95:75-85

128. Welsh J, Swimmer C, Cocke T, Shenk T. A second domain of simian virus 40 T antigen in which mutations can alter the cellular localization of the antigen. 1986. Mol Cell Biol. 6:2207-2212.

129. Whittaker G. Virus nuclear import. 2003. Adv Drug Deliv Rev. 55:733-747

130. Willis S, Day C, Hinds M, Huang D. The Bcl-2-regulated apoptotic pathway. 2003. J Cell Sci. 116:4053-4056

131. Whittaker G, Bui M, Helenius A. The role of nuclear import and export in influenza virus infection. 1996. Trends Cell Biol. 6:67-71

132. Yalamanchili P, Harris K, Wimmer E, Dasgupta A. DNA binding domain and subunit interactions of transcription factor IIIC revealed by dissection with poliovirus 3C protease. 1996. Mol Cell Biol. 16:4163-4171

133. Yalamanchili P, Banerjee R, Dasgupta A. Poliovirus-encoded protease 2APro cleaves the TATA-binding protein but does not inhibit host cell RNA polymerase II transcription in vitro. 1997a. J Virol. 71:6881-6886

134. Yalamanchili P, Datta U, Dasgupta A. Inhibition of host cell transcription by poliovirus: cleavage of transcription factor CREB by poliovirus-encoded protease 3Cpro. 1997b. J Virol. 71:1220-1226

135. Yalamanchili P, Weidman K, Dasgupta A. Cleavage of transcriptional activator Oct-1 by poliovirus encoded protease 3Cpro. 1997c. Virology 239:176-185

136. Yanagiya A, Jia Q, Ohka S, Horie H, Nomoto A. Blockade of the poliovirus-induced cytopathic effect in neural cells by monoclonal antibody against poliovirus or the human poliovirus receptor. 2005. J Virol. 79:1523-1532

137. Yu S, Lloyd R. Identification of essential amino acid residues in the functional activity of poliovirus 2A protease. 1991. Virology. 182:615-625

138. Zamora M, Marissen W, Lloyd R. Multiple eIF4GI-specific protease activities present in uninfected and poliovirus-infected cells. 2002. J Virol. 76:165-177

139. Zoll J, Galama J, van Kuppeveld F, Melchers W. Mengovirus leader is involved in the inhibition of host cell protein synthesis. 1996. J Virol. 70:4948-4952