Влияние паразитической инвазии на формирование клеточного иммунного ответа насекомых на примере личинок стрекоз рода Aeschna (отряд odonata)

Крюкова, Наталья Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние паразитической инвазии на формирование клеточного иммунного ответа насекомых на примере личинок стрекоз рода Aeschna (отряд odonata)
ВАК РФ 03.00.09, Энтомология

Автореферат диссертации по теме "Влияние паразитической инвазии на формирование клеточного иммунного ответа насекомых на примере личинок стрекоз рода Aeschna (отряд odonata)"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ СИСТЕМАТИКИ И ЭКОЛОГИИ ЖИВОТНЫХ

На правах рукописи

Крюкова Наталья Анатольевна

ВЛИЯНИЕ ПАРАЗИТИЧЕСКОЙ ИНВАЗИИ НА ФОРМИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА НАСЕКОМЫХ НА ПРИМЕРЕ ЛИЧИНОК СТРЕКОЗ РОДА АЕБСНт (ОТРЯД ОИОМАТА)

03.00.09. - энтомология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2005

Работа выполнена в лаборатории патологии насекомых Института Систематики и Экологии Животных СО РАН

Марченко В. А. кандидат биологических наук А.В. Симакова

Ведущее учреждение: Санкт - Петербургский Государственный Аграрный Университет

Защита состоится «</6» декабря 2005 года в часов на заседании диссертационного совета Д 003.033.01 в Институте Систематики и Экологии Животных СО РАН по адресу 630091, г. Новосибирск, ул. Фрунзе, д. 11.

Отзывы на автореферат диссертации в двух экземплярах, заверенные печатью учреждения, просим направлять по адресу: 630091 , г. Новосибирск, ул. Фрунзе, д. 11, Диссертационный совет ИСиЭЖ СО РАН. Факс: (383) 2170973, e-mail: mi@eco.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института Систематики и Экологии Животных СО РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук

В.В. Глупов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Автореферат разослан « .» ноября 2005г.

Ученый секретарь

доктор биологических наук,

профессор

А.Ю. Харитонов

<?/?/? 6 ¿2 £Г/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. К настоящему времени существует большое количество работ по морфологии, систематике и экологии стрекоз, но по изучению иммунного ответа, в частности, клеточного, имеются единичные работы. Известно, что личинки стрекоз могут выступать в роли дополнительных хозяев для трематод (Судариков и др., 2002; Genov and Samnaliev., 1984). Вполне закономерно, что гибель личинок может привести к элиминации паразита из ценоза. Для сохранения в промежуточном хозяине, паразиту необходимо с одной стороны избежать воздействия иммунной системы, с другой -предотвратить возникновение вторичных инфекций. Проникновение чужеродного объекта в гемоцель насекомого приводит к активации всех защитных систем организма хозяина. IIa первых этапах формирования иммунного ответа насекомых важную роль играет клеточный иммунитет, ключевыми клетками которого являются свободноциркулирующие клетки лимфы - гемоциты. Последние взаимодействуют с проникшими в гемоцель инородными объектами и участвуют в различных иммунных реакциях. Существенную роль в распознавании инородных объектов гемоцитами играют лектины, которые могут присутствовать как на поверхности гемоцитов, так и в лимфе. Лектины являются так называемыми паттерн-распознающими молекулами и могут инициировать активацию профено-локсидазного каскада (ПФК) и гранулообразование (Chen et al., 1995; Lee et al., 1999; Yu et al., 2002). При капсулообразовании вокруг паразита синтезируется меланин. Во время ме-ланизации могут образовываться хиноны и семихиноны, обладающие цитотоксическими свойствами. В ходе сопряженной эволюции паразиты выработали множество защитных механизмов, способствующих избеганию или подавлению иммунных реакций хозяина (Сапрунов, 1987; Vinson, 1990; Brehelin, 1990; Strand, Pech, 1995; Hochuli et al., 1999; Ki-nuthia et al., 1999). Одним из таковых является «молекулярная мимикрия», при которой поверхностные компоненты паразита не распознаются иммунной системой хозяина (Сапрунов, 1987; Vinson, 1990). В ряде случаев паразиты могут активно воздействовать на иммунитет хозяина, подавляя или частично блокируя его. В первую очередь подавляется активность клеточного иммунного ответа, а также профенолоксидазный каскад (Vinson,1990; Brehelin,1990; Lavine, Beckage, 1995; Kinuthia et al., 1999; Shelby et al., 2000; Bell et al., 2003). К настоящему времени существует незначительное количество работ по влиянию паразитов на иммунную систему насекомых. Основные исследования, как правило, проводятся на паразитоидах, которые, как установлено, в основном подавляют активность гемоцитов и запуск тригерных механизмов, активирующих ПФК (Rizki et al., 1990.1991; Carton et al., 2000; Rivers et al., 2002, 2003). Отсутствуют работы по изучению

влияния паразитов, в частности трематод,

J-

на формирование иммунного ответа стрекоз, об участии в данном процессе гемоцитов; изучению возникновения бактериозов на фоне паразитической инвазии. Кроме того, отсутствуют работы по морфо-функционапьному описанию гемоцитов стрекоз; не изучались лектины и леюгиноподобные соединения гемолимфы стрекоз.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение влияния паразитической инвазии на формирование клеточного иммунного ответа насекомых на примере личинок стрекоз рода Aeschna (отрад Odonata).

Соответственно, были поставлены следующие задачи:

1. Идентификация гемоцитов исследуемых насекомых с использованием морфологических и цитохимических критериев.

2. Изучение агглютининов гемолимфы личинок стрекоз рода Aeschna и выявление гемоцитов, участвующих в синтезе агглютининов.

3. Изучение паразитофауны личинок стрекоз рода Aeschna Новосибирской области.

4. Изучение влияния паразитической инвазии на формирование клеточного иммунного ответа личинок стрекоз при моделировании вторичной инфекции.

Научная новизна: Впервые был изучен и описан типовой состав гемоцитов личинок стрекоз рода Aeschna. Помимо морфологических критериев в работе по идентификации клеток гемолимфы, были использованы цитохимические и иммунохимические маркеры, а также зонд на внутриклеточный кальций (хлортетрациклин). Впервые было изучено, влияние трематод семейств Plagiorhidae и Prosthogonimidae на клеточные иммунные реакции личинок стрекоз A. grandis, являющихся их промежуточными хозяевами. Были выделены агглютинины гемолимфы личинок стрекоз, а также зарегистрирована экспрессия лектиноподобных белков в гемоцитах. Впервые были выделены бактерии персистирую-щие в гемолимфе и гемоцитах стрекоз. Данные бактерии при повышении температуры окружающей среды, способны вызывать гибель личинок стрекоз. Впервые было зарегистрировано паразитирование микроспоридий в жировом теле личинок стрекоз рода Aeschna, обитающих в водоемах России. Микроспоридии были отнесены к виду Systenosterma alba.

работе результаты по эндоцитобионтам и паразитическим простейшим, вносят вклад в накопление данных о паразитофауне стрекоз рода Aeschna.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийской конференции «Беспозвоночные животные Южного Зауралья и сопредельных территорий» (Курган, март 1998),на конференции «Паразит в природных комплексах и рисковые ситуации» (Новосибирск, июнь 1998), на VI Европейском энтомологическом конгрессе (Чехия, август 1998), на конференции «Взаимоотношения паразита и хозяина» (Москва, декабрь1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста; состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 19 рисунками и 1 таблицей. Список литературы включает 187 работ, из которых 156 на английском языке.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность д.б.н. В.В. Глупову за руководство научной работой, к.б.н. Л.И. Бурцевой за предоставленные штаммы Bacillus thuringiensis, к.б.н. В.П. Ходыреву за помощь при определении микробиологического материала, к.б.н. Н.И. Юрловой за помощь при определении паразитологического материала, к-б.н. Ю.Я. Соколовой за помощь при идентификации паразитологического материала и проведение электронной микроскопии, к.б.н. И.М. Дубовскому и к.б.н. В.В. Мартемья-нову за помощь при проведении исследований, к.б.н. С.А. Бахвалову и к.б.н. М.Ф. Хво-щевской за обсуждение рукописи и ценные критичкские замечания.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Глава 1. Литературный обзор

В главе рассматриваются основные звенья клеточного и гуморального иммунного ответа насекомых, таких как: фагоцитоз, капсулообразование, коагуляция лимфы, профе-нолоксидазный каскад и система генерации активированных кислородных метаболитов. Рассматриваются ключевые аспекты воздействия паразитарной инвазии на иммунные реакции хозяина-насекомого.

Глава 2. Материалы и методы исследования Насекомые.

В работе использовали личинок стрекоз 7-8 возраста рода Aeschna (A. grandis, A.viridis). Личинки были собраны в водоемах Колыванской и Новосибирской области в период с конца мая до середины июня.

Паразитологический анализ. Паразитологический анализ проводили по общепринятой методике, с последующим подсчетом количества цист в одной особи, учитывая их месторасположение и наличие меланизации на поверхности цист. В дальнейшем проводили определение метацеркарий до семейства. Личинки стрекоз, несущие дополнительную паразитическую нагрузку, помимо трематод, из опыта исключались.

Сбор гемолимфы и получение суспензии гемоцитов. Гемолимфу собирали в пластиковые пробирки (1,5мл), прокалывая стернитную пластинку восьмого сегмента брюшка личинки. Для предотвращения меланизации на дно пробирки помещали кристаллик фенил-тиомочевины (ФТМ). Затем образцы центрифугировали при 500 g в течение 5 минут и на-досадочную жидкость при 4000 g на протяжении 5 минут. Супернатант использовали для дальнейших исследований. Для получения суспензии гемоцитов гемолимфу собирали в пластиковые пробирки с охлажденным (+4°С) антикоагулянтом (АК) (Leonard et al., 1985). Затем гемолимфу центрифугировали 5 мин при 500 g, полученный осадок ресуспензпровали и гемоциты трижды отмывали в холодном АК и один раз в 0,01М фосфатном буфере рН 7.2 с 150мМ NaCl (ФБ).

Идентификация типов гемоцитов при помощи световой микроскопии. Идентификация гемоцитов проводилась в фиксированных этанолом и окрашенных азур-эозином мазках гемолимфы. При идентификации типов гемоцитов пользовались классификацией, адаптированной из работ Gupta (1979), Ratcliffe (1982), Brechelin, Zachary (1986). Кроме того, для идентификации гемоцитов был использован зонд на внутриклеточный кальций -хлортетрациклин (ХТЦ). В работе использовали среду Грейса. Измерение интенсивности флуоресценции комплекса Са2+-ХТЦ регистрировали с помощью микроскопа «Люмам -И2». Интенсивность флуоресценции измеряли в относительных единицах по показанию вольтметра как разность флуоресценции клетки и фона, уровень которого постоянно регистрировали при измерениях.

Флуорохромирование растительных лектинов и использование их в идентификации гемоцитов. Растительные лектины - конканавали A (Con А) и фитогемагглютинин (ФГА), метили флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ). Конъюгированные ФИТЦ лектины инку-

бировали с отмытой суспензией гемоцитов или монослоем гемоцитов в течение 40 мин., затем клетки промывали ФБ и микроскопировали, используя микроскоп «Люмам - И2».

Определение агглютинирующей активности гемолимфы. Реакцию агглютинации проводили согласно методике Зигль (1980). В опытах по определению агглютинирующей активности использовали эритроциты человека различных групп крови. В качестве ингибиторов использовали растворы 10мМ, 20мМ ЭДТА и 200 мМ различных углеводов.

Получение фракций гемолимфы с агглютинирующей активностью Лимфу личинок стрекоз разделяли с помощью гель-фильтрации на колонке (1 х 30 см) с Toyopearl HW-55 (Toyo Soda MFG. CO. Ltd.) в 50 мМ трис-HCl буфере, рН 7,5 с 150 мМ NaCl. Полученные активные фракции использовали в дальнейшей работе.

Получение поликлональиой антисыворотки к агглютининам гемолимфы. При получении поликлональной антисыворотки придерживались рекомендаций Amírante, Mazzalai (1978) с незначительными изменениями. Активные фракции гемолимфы, полученные с помощью гель-фильтрации, инкубировали с эритроцитами человека (108 клеток/мкл) 2 часа при температуре 22 ± 2 С. Затем эритроциты трехкратно отмывали в ФСБ и использовали 10 %-ю суспензию для иммунизации кроликов.

Выявление агглютининов в гемоцитах. Для выявления агглютининов в гемоцитах использовали иммуноферментный метод (Полак, Ван Норден, 1987). В качестве первых антител использовали иммуноглобулины кролика, полученные в результате разделения сыворотки на сефарозе, конъюгированной с белком А. В качестве вторых антител использовали козьи антитела, конъюгированные с пероксидазой. Далее, монослои инкубировали в ФБ с 0,5 мг/мл 3,3-диаминобензидина тетрагидрохлорида (ДАБ), содержащем 0,03 % ПгОг.

Электронная микроскопия гемоцитов. Для электронной микроскопии гемоциты были фиксированы в 2,5 % глутаровом альдегиде. Затем гемоциты дегидрировали в серии градиента ацетона и помещали в смесь смол эпон-аралдит. Ультратонкие срезы были проанализированы в электронном микроскопе Hitachi -300 ЕМ.

Выделение бактерий из гемоцитов. Дня выделения бактерий, предварительно отмытые гемоциты, гомогенизировали в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,4 и центрифугировали при 15000 g в течение 15 мин. Полученный осадок помещали непосредственно на триптозный агар (Ferak, Berlin) в чашках Петри. Чашки инкубировали при температуре 28 °С 48 часов, затем бактерии были идентифицированы по определителю Берлин (1997).

Аффинная хроматография. Для приготовления аффинного сорбента бром-циан активированную Сефарозу 4В (Sigma) конъюгировали с IgG кролика согласно Харрисону, Итину (Harrison, Itin, 1980). Сывороточные IgG кролика были очищены согласно Трукко, де Пет-рис (1983). При проведении аффинной хроматографии использовали фракции гемолимфы с агглютинирующей активностью, полученные после гель-фильтрации.

Электрофоретическое разделение белков. Электрофоретическое разделение белков проводили как в денатурирующих условиях, так и без детергентов по модифицированной методике Laemmli (1970). При разделении белков в денатурирующих условиях (в присутствии додецилсульфата натрия - SDS) использовали 15% разделяющий и 4,5% концентрирующий гели (PAGE-SDS). При проведении электрофореза без детергентов, использовали 7% разделяющий и 4,5% концентрирующий гели. Во всех вариантах в качестве маркеров молекулярной массы использовали белковые стандарты (Sigma). Количество белка в образцах определяли по методу Лоури с сотр. (Lowry et al„ 1951), в качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин (БСА).

Электрофоретический перенос в сочетании с иммунноферментным анализом. Белки, разделенные с помощью PAGE-SDS, электрофоретически переносили с геля на нитроцел-люлозный фильтр (Hybon-C, размер пор 0,45 мкм, Amersham, England) по методу Towbin et al (1979) с некоторыми изменениями. Для выявления агглютининов лимфы использовали иммуноферментный метод (Полак, Ван Норден, 1987).

Инъецирование стрекоз бактериальными клетками и суспензией сефадекса. Личинкам инъецировали 12 мкл суспензии сефадекса ДЕАЕ - 25 (1мг/мл) и по 4 мкл суспензии вегетативных клеток Bacillus thuringiensis s.s.p.galleria 69-6 (106 клеток/мл) и Escherichia coli K-12 (107 клеток/мл). Бактерии были предварительно убиты формалинглутаровым фиксатором (1.6% формалина, 0.25% глутарового альдегида в ФБ). Сефадекс трижды отмывали в ФБ. Инъецирования проводили с помощью микродозатора под 8 стернит брюшка.

Инъецирование стрекоз цистами трематод. Личинкам стрекоз рода Aeshna инъецировали в гемоцель цисты трематод семейства Plagiorchidae и Prosthogonimidae. Цисты были предварительно извлечены из тканей личинок стрекоз различных таксонов, в том числе, относящихся к другим семействам. Цисты промывали в ФБ и инъецировали в прокол под седьмым стернитом. Наблюдения за процессом инкапсуляции проводили через 4, 24, 48 и 72 часа. Для инъецирования использовали стеклянный капилляр.

Регистрация фенолоксидаз в клетках. Выявление фенолоксидаз в гемоцитах личинок стрекоз проводили на фиксированных ацетоном монослоях клеток. Субстратом для фер-

мента служил dl-днгидрооксифенилаланин (ДОФА). Монослои клеток инкубировали 1 час с 4 мг/мл ДОФА в ФБ.

Регистрация активированных кислородных метаболитов в клетках крови. Образование активных форм кислорода в клетках крови стрекоз регистрировали по восстановлению нитросинего тетразолия (HCT), используя методику Дуглас и Куи (1983) с незначительными изменениями. Стекла с монослоями инкубировали 1 час при температуре 37 "С в ФБ с 1.7 мг/мл HCT. Затем клетки фиксировали формалин-глутаровым фиксатором.

Статистическую значимость различий определяли по t - критерию Стьюдента. Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Морфофункциональная дифференциация гемоцитов

У личинок стрекоз последнего возраста A. grandis и А. viridis при помощи световой микроскопии на основе морфологических критериев было выделено три основных типа гемоцитов: прогемоциты (Рг), гранулоциты (Gr) и плазматоциты (PI). У личинок стрекоз выделяется три подтипа плазматоцитов: PL, - веретеновидные клетки (5-10 мкм х 20 -40 мкм), РЬг - клетки по форме напоминающие инфузорию-туфельку (10-15 мкм х 35-40 мкм) и PL3 - округлые крупные клетки (15-20 мкм х 20-25 мкм). При более детальном изучении гемоцитов с помощью электронной микроскопии, было выявлено, что гранулоциты можно разделить на два подтипа: округлые Gri(8-10 мкм х 8-15 мкм) и вытянутые Grj(8-10 мкм х 15-20 мкм). При использовании цитохимических методов были получены следующие результаты. Активность фенолоксидазы была зарегистрирована в Gr, PI, и Р1з, общее количество фенолоксидазоположительных гемоцитов было в пределах 7 - 15 %. За исключением Р1г, эстеразную активность отмечали практически во всех типах гемоцитов (6-13 %) в виде диффузно-распределённых в цитоплазме гранул. Наиболее интенсивно окрашивались Gr и Рг. Восстановление нитросинего тетразолия (HCT), как показателя окислительного метаболизма клетки, было зарегистрировано в гранулоцитах и во всех подтипах плазматоцитов, причем наиболее интенсивное образование формазана фиксировали в Pli и Р13. Общее количество НСТ-положительных гемоцитов составило 2-7 %.

Кроме того, в работе использовали зонд на внутриклеточный кальций - хлортетра-циклин (ХТЦ), который связывается с кальцием и с каким-либо компонентом клетки (мембраны, АТФ и т.д.) (Добрецов, 1989). Наиболее яркое свечение регистрировалось у гранулоцитов и прогемоцитов, для которых характерно сильное свечение цитоплазмы. Вероятно, это связано с большим количеством митохондрий, эндоплазматическим рети-кулумом и других структур, в значительной мере развитых в клетках с высокой метаболи-„ ческой активностью. Промежуточное положение по интенсивности свечения заняли

плазматоциты. Ионы кальция играют немаловажную роль в физиологии клетки, участвуя в механизмах, контролирующих рост и дифференциацию клеток. Таким образом, использование данного метода, позволяет судить о степени зрелости клеток и предположительно, об их иммунной активности. Использование иммуноферментных маркеров позволяет судить о возможной роли того или иного типа гемоцитов при протекании иммунного ответа.

Основываясь на результатах морфологического и цитохимического анализа мы можем говорить об уникальности популяции гемоцитов стрекоз рода Aeschna (A.grandis, A. viridis). В первую очередь, размеры гемоцитов стрекоз в несколько раз превышают размеры клеток крови многих видов насекомых. Во-вторых, такие типы клеток как сферу-лоциты и эноцитоиды, характерные для Lepidoptera и Coleóptera у стрекоз не были отмечены. Результаты цитохимического анализа позволяют предположить, что Pli и Р1з наряду с Gr принимают наиболее активное участие в клеточном иммунном ответе.

3.2. Агглютинины

У личинок стрекоз рода Aeschna была зарегистрирована агглютинирующая активность в гемолимфе, а также экспрессия лектиноподобных белков в гемоцитах. Определение агглютинирующей активности проводили в лимфе, методом двойного разведения. Титр агглютинации эритроцитов человека различных групп крови нативной лимфой личинок стрекоз составил 10 (к^титр"1). Следует отметить, что агглютинация эритроцитов в гемолимфе личинок стрекоз не ингибировалась при добавлении ЭДТА (20мМ). Из чего следует, что для проявления активности агглютининов не обязательно наличие ионов кальция и магния (Ca/Mg -независимые).

При разделении гемолимфы с помощью гельфильтрации, была получена фракция с агглютинирующей активностью (Рис. 1). Молекулярный вес агглютиниа при электрофо-ретическом разделении в полиакриламидном геле с использованием детергентов (SDS), составил около 90 Ша. Электрофоретическое разделение без использования детергента, показало, что молекулярная масса нативного агглютинина составляет примерно 380 - 390 ГОа. Возможно, молекула агглютинина состоит из 4-х субьединиц. При иммунизации кроликов эритроцитами человека, которые ранее инкубировали с очищенной фракцией гемолимфы A.viridis, была получена поликлонапьная сыворотка к белкам, которые связались с поверхностью эритроцита. После выделения из поликлональной сыворотки иммуноглобулинов, был проведен иммуноблотинг, а также иммуногистохимический анализ. При иммуноблотинге с использованием полученных иммуноглобулинов, были выявлены субъединицы с молекулярным весом 90 kDa как у A. granáis так и у A.viridis, которые

соответствовали пику гель фильтрации (Рис. 1). При дальнейшей очистке агглютининов с помощью ионообменной и аффинной хроматографии, полученные фракции теряли активность. Возможно, что для нормального функционирования молекулы агглютинина, необходимо наличие каких-либо белков, способных стабилизировать их конфигурацию, необходимую для взаимодействия с тест-объектами. При иммуногистохимическом анализе агглютинины были выявлены в клетках лимфы личинок стрекоз. В основном окрашивались От и Р13. Общее количество окрашенных клеток составило от 17 до 28 %.

Рис- 1 А — Гель-фильтрация гемолимфы личинок стрекоз А -grandi а на TOYO-SODA WH- 75 .

Агглютинирующая активность — ~т mm и _ , Оптическая плотность при 24 0 пгп ^—*

Б — ИммуиоОлоттинг с использованием поликлональиых кроличьих антител против сывороточных агглютининов гемолимфы А. grandie (1) и A. vix-idia (2) .

Наряду с паттерн-распознающими белками лектины способны обуславливать активацию таких процессов как фагоцитоз, капсуло- и гранулообразование (Pendland, Boucias, 1996; Wilson et al., 1999; Tojo et al., 2000; Beattyet et al„ 2002; Yu, Kanost, 2003; Wang et al„ 2004). В организме насекомых агглютинины могут участвовать в процессах элиминации чужеродного материала и коагуляции гемолимфы (Lavine, Strand, 2002; Theopold, Schmidt, 1997; Yu, Kanost, 2003; Li et al., 2002). У личинок стрекоз рода Aeschna, регистрировали высокую коагулирующую активность гемолимфы, наряду с высокой адгезивной активностью гемоцитов. Добавление в лимфу бактериальных клеток или эритроцитов человека, приводит к практически моментальному клампированию клеток. Коагуляцию лимфы регистрировали и при отсутствии инородных тел. Высокая коагулирующая активность лимфы и высокая способность гемоцитов к клампообразованию, вероятно, позволяют личинкам стрекоз избежать большой кровопотери и дальнейшего заражения.

3.3. Паразиты личинок стрекоз рода Aeschna 3.3.1. Бактериальные инфекции

В гемоцитах личинок стрекоз рода Aeschna последнего и предпоследнего возрастов регистрировали бактерии (эндоцитобионты). Понятие эндоцитобионты, включает в себя широкий спектр как паразитических, так и симбиотических внутриклеточных микроорганизмов, оказывающих определенное влияние на физиологический статус хозяина. Эндоцитобионты гемоцитов стрекоз относятся к роду Pseudomonas. Данные бактерии определить до вида не удалось, в связи с трудностью культивирования на классических питательных средах. Электронная микроскопия показала, что эндоцитобионты плеоморфны, их форма и размер варьирует от сферического до бесформенного, 1-2 мкм в диаметре. Эндоцитобионты в инфицированных клетках представлены как единичными клетками микроорганизмов, так и формируют кластеры, погруженные в аморфный матрикс неопределенной природы и могут быть покрыты многослойным матриксом. Группы или единичные клетки бактерий, окруженные волокнисто-подобной оболочкой, регистрировали только в цитоплазме клеток иммунокомпетентного звена - плазматоцитах и в меньшей мере в грануло-цитах.

Нами было установлено, что повышение температуры окружающей среды выше 32 °С, приводит к гибели личинок стрекоз от Pseudomonas. Смертность может составлять от 70 до 90%. Возможно, что резкое повышение температуры окружающей среды индуцирует развитие бактерий. Какова роль выявленных микроорганизмов в жизнедеятельности стрекоз - не ясно. Возможно, стрессовые ситуации стимулируют рост количества бактерий рода Pseudomonas, что в итоге приводит к гибели хозяина. Наличие данных бактерий, вероятно, можно рассматривать как один из факторов регуляции численности стрекоз.

3JJ Микроспоридии

В клетках жирового тела личинок стрекоз Aeschna viridis были обнаружены микроспоридии. Основываясь как на морфологии спор, так и на видовой принадлежности хозяина, микроспоридии были отнесены к виду Systenostrema alba. Экстенсивность заражения составляла около 3,5%. Ранее, Larsson (1988) описывал этот вид паразита у личинок стрекоз Aeschna grandis , обитающих в водоемах Швеции. На территории России не регистрировали микроспоридиозной инфекции в личинках стрекоз. Влияние паразитирования микроспоридий на иммунный ответ личинок стрекоз, проследить не удалось, в связи с низким процентом зараженности природной популяции и невозможностью вторичного заражения.

(О

3.3.3. Трематоды

В личинках стрекоз рода Aeschna регистрировали высокий процент заражения трематодами семейства Plagiorhidae и Prosthogonimidae. В зависимости от места и времени сбора, процент зараженности мог составлять от 50 до 89 % (р<0,05) от общего числа исследуемых личинок. Около 30% (р<0,05) цист были покрьггы меланизированной оболочкой, тем не менее, личинка трематоды оставалась жизнеспособной.

Для выяснения возможного влияния шщистированных метацеркарий на протекание клеточного иммунного ответа стрекоз A. grandis и A.viridis, в гемоцель личинок инъецировали суспензию убитых бактериальных клеток В. thuringiensis s.s.p.galleria или Е. coli. Также в гемоцель инъецировали суспензию сефадекса. Через сутки после инъецирования сефадекса у исследуемых личинок регистрировалось образование крупных мела-низированных гранул (капсул), локализованных преимущественно в пределах поврежденной кутикулы и прикрепленных к мышцам брюшка, трахеям и жировому телу. При инъецировании в гемоцель личинок стрекоз суспензии бактериальных клеток, уже через 4 часа отмечали единичные гранулы в теле насекомого, которые локализовались в основном в жировом теле около кишечника. Таким образом, цисты трематод не блокируют грануло-и капсулообразование. Кроме того, как зараженным метацеркариями, так и не зараженным личинкам стрекоз, инъецировали в гемоцель цисты трематод семейств Plagiorchidae и Prosthogonimidae. Цисты были предварительно извлечены из тканей личинок стрекоз А. grandis, A. viridis, а также из личинок стрекоз относящихся к другим родам (Cordulia aenea, Epiteca ЫтасиШа). Инкапсуляцию цист не регистрировали в гемоцеле A. grandis и А. viridis в течение 3-х суток независимо от вида предыдущего хозяина и зараженности реципиента метацеркариями трематод. Однако, определенные участки на поверхности инъецируемых цист были меланизированны. Меланизации подвергались в основном остатки тканей предыдущего хозяина. Возможно, что поверхностный слой метацеркарий содержит соединения различной природы, позволяющие избежать паразиту распознавания иммунной системой хозяина. Не исключено, что в поверхностный слой цист входят протеогликаны - белки с большим содержанием углеводных остатков, которые и образуют своеобразный «камуфляжный слой».

Одновременно, после инъецирования убитых бактериальных клеток В. thuringiensis s.s.p.galleria или Е. coli, в гемоцель не инвазированных личинок стрекоз A. grandis, регистрировали резкое повышение НСТ-положительных клеток до 17% (pä0,05) с последующим спадом до контрольных значений в течение трех суток (Рис.2). У личинок, зараженных трематодами, количество НСТ-положительных клеток незначительно увеличивалось

до 8% (р£0,05) с последующим спадом до контрольных значений на протяжении суток, и в дальнейшем оставалось стабильным (6%) (Рис. 3).

Рис.2 ДинамикаНСТ-положительных клеток Л. grandis, не инвазированных трематодами при инъецировании B.thunngiensis; * -р <0,05 по сравнению с контролем 1-контроль, 2-иньецированные

%10т

Рис. 3 Динамика НСТ-положительных

гемоцигов личинок А grandis .инвазированных трематодами при инъецировании В thurigiensis; р * 0,05 по равнению с

контролем 1- контроль, 2- инъецированные

При инъецировании личинкам, как содержащим метацеркарии, так и без метацер-карий, суспензии клеток В, через 4 часа регистрировали подъем ФО-

положительных клеток до 25% (р«0,05), с последующим снижением до 5-6% на первые сутки у не инвазированных личинок (Рис.4) и до 11% у личинок зараженных трематодами (Рис. 5). В дальнейшем количество ФО-положительных клеток отличалось у личинок зараженных и не зараженных трематодами. Так, у инвазированных личинок стрекоз количество ФО-положительных клеток не изменялось в течение трех суток после инъецирования бактериальной суспензии (Рис. 5).

- ♦ - 1 % 30 * - В - 1

20- -♦ 2

—т—2 10 ■ \ _ • чаш

, часы 0 -1-h -1-1

Рис. 4 Динамика ФО -положительных гемоцигов личинок

Л grandis не инвазированных трематодами, при инъецировании В thuringiensts, * - р S 0,05 по

сравнению с контролем 1-контроль, 2-инъецированные

Рис.5 Динамика ФО- положительных гемоцигов личинок А^галйи, инвазированных трематодами, при инъецировании B.lhurmgien¡ls; * - р < 0,05 по сравнению с контролем 1- контроль 2- инъецированные

В то же время, инъекция бактерий в гемоцель не инвазированным личинкам приводило к резкому увеличению ФО-положительных гемоцитов на вторые сутки до 17% (ps

0,05) (Рис.4). Следует отметить, что у личинок зараженных трематодами, изначально были более высокие контрольные значения как НСТ-положительных, так и ФО-положительных клеток лимфы (Рис. 3, 5), но отличия между инвазированными и неинвазированными личинками в контроле были не достоверны.

У личинок стрекоз A grandis и А. viridis, зараженных цистами трематод семейства Plagiorchidae и Prosthogonimidae, отмечали изначально более высокую ферментативную активность в гемоцитах. Однако, это не приводило к уничтожению или элиминации паразитов. В то же время, при инфекционной нагрузке, иммунная система хозяина не способна реагировать на проникновение чужеродного тела в полной мере, в отличие от интактных личинок. Можно предположить, что паразит подавляет иммунные реакции организма до уровня безопасного для его существования, но не снижает иммунного статуса насекомого-хозяина до критического уровня.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ключевую роль в формировании иммунного ответа насекомых играют клетки лимфы (гемощпы) и, в первую очередь, клетки иммуннокомпетентного звена - грануло-циты и плазматоциты. Популяция гемоцитов неоднородна, что может быть связано как с различной степенью зрелости клеток, так и с многообразием функций, выполняемых ими. Соотношение тех или иных типов гемоцитов может изменяться в зависимости от стадии развития и физиологического состояния, а также от вида насекомого (Gupta, 1979; Ratcliffe, White, 1982; Lackie, 1988). У личинок стрекоз последнего возраста A. grandis и А. viridis было выявлено уникальное среди насекомых соотношение гемоцитов. Следует особо отметить необычно крупные размеры гемоцитов личинок стрекоз рода Aeschna, а также отсутствие таких типов клеток как эноцитоиды и сферулоциты, широко представленные у различных видов насекомых.

О степени зрелости клеток и их функциональной активности позволяет судить наличие связанного внутриклеточного кальция. Последний регистрируется с использованием зонда - хлортетрациклина (ХТЦ), который связывается с кальцием и с каким-либо компонентом клетки (мембраны, АТФ и т.д.). Интенсивность свечения в клетках крови ХТЦ-зонда, зависит от характера распределения внутриклеточного кальция. У личинок стрекоз наиболее яркое свечение регистрировалось в гранулоцитах и прогемоцитах, т.е. в

клетках для которых характерна высокая иммунная активность. О функциональной роли гемоцитов может говорить наличие в клетках таких ферментов как фенолоксидазы, эсте-разы и фиксируемое с помощью нитросинего тетразолия образование активных кислородных метаболитов (АКМ). У личинок стрекоз в гранулоцитах и плазматоцитах, регистрировали наличие фенолоксидаз (ФО), эстераз и активированных кислородных метаболитов (АКМ). В прогемоцитах регистрировали весь спектр вышеперечисленных ферментов. То что в гранулоцитах и плазматоцитах были зафиксированы данные ферменты, а также генерация АКМ, вполне закономерно, поскольку эти клетки активно участвуют в иммунном ответе насекомых, а фенолоксидазы, эстеразы и АКМ могут непосредственно участвовать в уничтожении паразита. Наличие фенолоксидаз в прогемоцитах Aeschna - уникальное явление, так как у насекомых других отрядов данный фермент никогда ранее не регистрировали.

Немаловажную роль в процессах иммунного ответа играют лектины и лектинопо-добные белки (агглютинины) лимфы и клеток крови. Агглютинины насекомых, участвуя в иммунном ответе, выполняют множество функций, действуя как рецепторные молекулы, активируя процессы клеточного иммунного ответа, а также процессы метаморфоза и регенерации (Wilson et al., 1999; Gelbic, Olejnicek, 2004; Lavine, Strand, 2002; Yu, Kanost, 2003; Li et all., 2002). В гемолимфе личинок стрекоз рода Aeschna была выявлена агглютинирующая активность. Выделить чистый агглютинин из лимфы личинок стрекоз с помощью аффинной и ионообменной хроматографии не удалось, возможно, что молекулы агглютинина не устойчивы и для их нормального функционирования необходимо наличие каких-либо белков, способных стабилизировать их конфигурацию. При использовании иммуногистохимических методов была показана экспрессия лектиноподобных белков в гемоцитах, в основном в Gr и Р1з. Известно, что агглютинины являются паттерн распознающими белками, т.е. участвуют в иммунном распознавании. Возможно, этим можно объяснить наличие лектинов на поверхности гранулоцитов и плазматоцитов, так как данный тип клеток наиболее активно участвует в иммунных реакциях, направленных на изолирование и уничтожение паразита. Кроме того, у личинок стрекоз рода Aeschna, регистрировали высокую коагулирующую активность гемолимфы, наряду с высокой адгезивной активностью гемоцитов. В условиях водной среды, где насекомое контактирует с большим количеством бактерий, паразитов и т.д., высокая скорость коагуляции и клампообра-зования вполне оправдана, так как предотвращает значительные потери гемолимфы и закрывает «ворота инфекции» при ранениях.

В данном исследовании было обнаружено редкое явление, а именно - наличие эн-доцитобионтов в иммунокомпетентных клетках крови. Роль микроорганизмов в организме

стрекоз, остается не выясненной. Однако, учитывая высокий процент зараженности, а также то, что персистенция бактерий не оказывает значительного влияния на иммунные реакции насекомого, можно предположить симбионтный характер их взаимоотношений. Основываясь на результатах наблюдений, можно предположить, что температура может служить регулирующим фактором численности стрекоз, опосредованно через активацию эндосимбионтов. Кроме того, в процессе исследований у личинок стрекоз обнаружили паразитирование микроспоридий в жировом теле. Паразитирование микроспоридий в личинках стрекоз рода Aeschna, было впервые зарегистрировано на территории России. Микроспоридии бьии отнесены к виду Systenostrema alba Larsson 1988.

Личинки стрекоз также являются дополнительными хозяевами для трематод семейств Plagiorchidae и Prosthogonimidae. В процессе эволюции у трематод вокруг цист метацеркарий сформировалась уникальная оболочка, которая не распознается иммуно-компетентным звеном насекомого. Возможно, в состав оболочки цист входит большое количество протеогликанов, для которых характерна высокая степень гликозилирования. Вероятно, концевые углеводные остатки протеогликанов, входящих в состав оболочки цист, образуют однородный слой, состоящий из моносахаров. Наличие данных соединений может обуславливать отсутствие распознавания и иммунного ответа у личинок стрекоз рода Aeschna при пересадке им цист, полученых из личинок других родов и семейств. При инъецировании бактериальной суспензии в гемоцель насекомых, было обнаружено, что у зараженных трематодами личинок стрекоз, количество иммунокомпетентных клеток (ФО- и НСТ-положительных), вдвое меньше по сравнению с не зараженными личинками характеризующихся высоким уровнем генерации АКМ и фенолоксидазной активностью. Данное иммуносупрессивное действие трематод на клеточный иммунитет насекомых, вероятно, может быть обусловлено или частичным истощением ресурсов организма хозяина, или тем, что метаболиты паразита обладают ингибирующей активностью узкого действия, которая проявляется только при вторичной инфекции. Следует также отметить, что основные функции клеток иммунной системы стрекоз полностью не ингибируются при инвазии трематодами. Такие ключевые реакции как фагоцитоз, капсуло- и гранулообра-зование у инвазированных личинок наблюдаются в полной мере. Таким образом, с одной стороны паразиты не угнетают ключевые реакции иммунного ответа и приводят к повышению активности клеток иммуннокомпетентного звена, с другой стороны, ответ на вторичную инфекцию не развивается в той степени, которая характерна для неинвазирован-ной личинки Подобное взаимодействие позволяет личинкам стрекоз инвазированных паразитами противостоять вторичному заражению, а паразиту - не быть уничтоженным иммунной системой насекомого.

выводы

1. На основании морфологического и цитохимического анализов у личинок стрекоз рода Aeshna были выделены три основных типа гемоцитов: прогемоциты(Рг), гранулоци-ты (Gr) и плазматоциты (PI).

2. В гемолимфе личинок стрекоз рода Aeshna была выявлена агглютинирующая активность. Молекулярный вес нативного агглютинина составил 380 - 390 kDa. Молекула агглютинина состоит из 4-х субьединиц весом 90 kDa. Агглютинины экспрессирова-лись в плазматоцитах и гранулоцитах.

3. В гемоцитах стрекоз были обнаружены бактерии рода Pseudomonas. Наличие эндоци-тобионтов в клетках крови не влияло на протекание иммунных реакций в личинках стрекоз рода Aeshna.

4. Впервые на территории России у личинок стрекоз, в частности - А. viridis обнаружили микроспоридии (Systenostrema alba).

5. Зарегистрировали заражение личинок стрекоз рода Aeshna личинками трематод семейств Plagiorhidae и Prosthogonimidae. Цисты трематод не инкапсулируются гемоци-тами и не блокируют инкапсуляцию чужеродных веществ в гемоцеле личинок стрекоз. При пересадке цист трематод семейств Plagiorhidae и Prosthogonimidae, полученных из различных видов стрекоз в личинок рода Aeschna, было выяснено, что поверхностный спой паразитов не распознается иммунной системой хозяина.

6. При инъецировании бактериальной суспензии в гемоцель личинкам, зараженных трематодами, обнаружено отсутствие влияния цист трематод на клеточные иммунные реакции, в частности механизмы грануло- и капсулообразования.

7. Использование цитохимических маркеров позволило выявить, что у зараженных трематодами личинок стрекоз количество иммунокомпетентных клеток (ФО- и НСТ-положительных), вдвое меньше по сравнению с не зараженными личинками характеризующихся высоким уровнем 1енерации АКМ и фенолоксидазной активностью.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Крюкова H.A., Глупов В.В. Изучение гемоцитов с помощью хлортетрацикпина // Регуляция численности беспозвоночных и фитопатогенов (под ред. Штерншис М.В., Глупова В.В.), Новосибирск, 1997,- С. 38-41.

Глупов В.В, Хвощевская М.Ф , Крюкова H.A., Лозинская Я.Л., Дубовских И.М., Мертемь-янов В.В., Формирование клеточного иммунитета насекомых (Insecta): образование активированных кислородных метаболитов в гемоцитах // Беспозвоночные животные

Южного Зауралья и сопредельных территорий. Матер. Всерос. Конф. 14-16 апр. 1998. Курган -1998г.- С. 93-95.

Сухачева Г.А., Крюкова Н.А.,Сербина Е.И. Влияние трематод на биохимическиепараметры популяции личинок стрекоз p. Aeschna И Всероссийская научная конференция "Взаимоотношения паразита и хозяина" Тезисы докладов. Москва 1998.

. Глупов В.В, Крюкова H.A., Ходырев В.П., Соколова Ю.Я. Эндоцитобионты гемоцитов личинок стрекоз Aescna juncia L. (Odonata) / Endocytobionts of haemocytes of Aeschna juncia L dragonfly (Odonata) // Евроазиатский Энтомологический журнал, 2002,- С. 131132.

Сухачева Г.А., Крюкова H.A., Глупов В.В. О роли морфометрических и биохимических критериев при идентификации видов (на примере личинок стрекоз рода Aeshna) II Известия АН, сер. биол. 2003.- № 1,- С.74-80.

Крюкова H.A., Соколова Ю.Я., Глупов В.В. Микроспоридиоз личинок стрекоз Aeshna viridis (Odonata, Aeshnidae), вызываемый Systenosterma alba Larsson 1988 (Microsporidia, Telohaniidae) II Паразитология (в печати).

Крюкова H.A., Глупов В.В., Юрлова Н.И., Влияние трематод на клеточный иммунитет стрекоз Aeshna grandis и Aeshna viridis (Odonata) II Паразитология 2005. - T. 34.- вып. 4.- С. 306-317.

Sokolova Y., Kryukova N., Glupov V., Fuxa J. Systenostrema alba Larsson 1988 (Microsporidia, Thelohaniidae) in Dragonflies, Aeschna viridis (Odonata, Aeschnidae), from South Siberia: Morphology and Molecular Characterization // J. Eukariot. Microbiol. 2006 Vol. 53. (в печати).

05 - 2 2 щ

РНБ Русский фонд

2006-4 22651

M j

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Крюкова, Наталья Анатольевна

Введение

Глава 1 Литературный обзор

1.1 Классификация гемоцитов

1.2 Роль гемоцитов в иммунном ответе насекомых

1.2.1 Фагоцитоз

1.2.2 Гранулообразование и капсулообразование

1.3 Гуморальный иммунитет

1.3.1 Агглютинирующая система 1.3.2 Коагуляция

1.3.3 Фенолоксидазная система

1.4 Генерация активированных кислородных метаболитов у насекомых

1.5 Влияние паразитической инвазии на иммунный 'о'т-вет насекомых

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние паразитической инвазии на формирование клеточного иммунного ответа насекомых на примере личинок стрекоз рода Aeschna (отряд odonata)"

Стрекозы являются древнейшими представителями в классе насекомых, широко распространенные во всем мире. К настоящему времени существует большое количество работ по морфологии, систематике и экологии стрекоз, но по изучению иммунного ответа, в частности клеточного, имеются единичные работы. Как известно, личиночная стадия - наиболее длительный период развития стрекоз. Именно в этот период происходит проникание различных паразитов в организм стрекоз. Многие паразиты используют личинок стрекоз как промежуточных хозяев. В связи с этим гибель стрекоз может привести к элиминации паразитов из ценозов. Для сохранения в промежуточном хозяине, паразиту необходимо с одной стороны избежать воздействия иммунной системы, с другой - предотвратить вторичные инфекции.

Проникновение чужеродного объекта приводит к активации и взаимодействию всех систем врожденного иммунитета. В большинстве случаев активация одного из звеньев иммунного ответа, инициирует ряд защитных реакций, направленных на уничтожение или изоляцию инородного тела. Клетки гемолимфы первыми взаимодействуют с проникшим в гемоцель инородным объектом. Образование капсул или гранул вокруг паразита сопровождается синтезом меланина (Nappi et al., 1995; Lavine, Strand, 2002; Wilson et al., 2003). Процесс меланогенеза происходит при непосредственном участии ферментов фенолоксидаз и сопровождается образованием хинонов, семихинонов, а также активированных кислородных метаболитов (АКМ), в частности, супероксиданиона и гидроксильного радикала (Nappi et al. , 1995; Nappi, Ottaviani, 2000; Carton, Nappi, 2001; Kobayashi, 1998; Slepneva et al. , 1999; Wilson et al. , 2001; Sugumaran, 2002) .

В ходе сопряженной эволюции паразиты выработали множество защитных механизмов, способствующих избеганию или подавлению иммунных реакций хозяина (Сапрунов, 1987; Vinson, 1990; Brehelin, 1990; Strand, Pech, 1995; Hochuli et al. , 1999; Kinuthia et al. , 1999). Пассивная защита паразита от иммунных реакций хозяина (так называемая молекулярная мимикрия), возможна в том случае, если его поверхностная структура не воспринимается как чужеродный объект. Такого рода взаимодействие становится возможным в случае секреции на поверхность паразита защитных компонентов (гликопротеины, гликолипи-ды, протеогликаны и т. д.), маркирующих поверхностный слой паразита как близкородственный иммунным составляющим организма хозяина. В некоторых случаях, возможно избирательное поглощение и встраивание паразитом молекул хозяина в собственный поверхностный слой, и в дальнейшем воспринимаемых иммунной системой насекомого как компоненты собственного организма (Сапрунов, 1987; Vinson, 1990; Brehelin, 1990; Beckage, 1993; Kinuthia et al. , 1998; Hu et al. , 2003) . Избегание воздействия иммунной системы хозяина возможно также при развитии в органах или тканях, в которых паразиты защищены от иммунного распознавания (жировое тело, слюнные железы, эпителиальные клетки кишечника) (Strand, Pech, 1995; Исси, 1986). Часто паразиты активно воздействуют на иммунитет насекомого, подавляя или частично блокируя его. В частности, может ингибироваться активность клеточного иммунного ответа, а также профенолоксидазный каскад (Vinson,1990; Brehelin,1990; Lavine, Beckage, 1995; Kinuthia et al. , 1999; Shelby et al. , 2000; Bell et al., 2003) .

Все вышеизложенное определило цель настоящей работы: изучение влияния паразитической инвазии на формирование клеточного иммунного ответа насекомых на примере личинок стрекоз рода Aeshna (отряд Odonata).

Соответственно, были поставлены следующие задачи:

2. Изучение агглютининов гемолимфы личинок стрекоз рода Aeshna и выявление гемоцитов, участвующих в синтезе агглютининов.

3. Изучение паразитофауны личинок стрекоз рода Aeshna Новосибирской области.

Научная новизна: Впервые был изучен и описан типовой состав гемоцитов личинок стрекоз рода Aeshna. Помимо морфологических критериев в работе по идентификации клеток гемолимфы, были использованы цитохимические и иммунохимические маркеры, а также зонд на внутриклеточный кальций (хлортетрациклин). Впервые было изучено, влияние трематод семейств Plagiorhidae и

Prosthogonimidae на клеточные иммунные реакции личинок стрекоз A. grandis, являющихся их промежуточными хозяевами. Были выделены агглютинины гемолимфы личинок стрекоз, а также зарегистрирована экспрессия лектиноподоб-ных белков в гемоцитах. Ранее подобного рода исследований на примере представителей отряда Odonata не проводилось .

Впервые были выделены бактерии персистирующие в гемолимфе и гемоцитах стрекоз. Данные бактерии при повышении температуры окружающей среды, способны вызывать гибель личинок стрекоз. Впервые было зарегистрировано паразитирование микроспоридий в жировом теле личинок стрекоз рода Aeshna, обитающих в водоемах России. Микроспоридии были отнесены к виду Systenosterma alba.

Научно-практическая значимость. Представленные результаты вносят вклад в дальнейшее понимание механизмов формирования иммунных реакций беспозвоночных при наличии паразитической инвазии. Были разработаны подходы для оценки состояния клеточного иммунитета личинок стрекоз при паразитической нагрузке. Представленные в работе результаты по эндоцитобионтам и паразитическим простейшим, вносят вклад в накопление данных о парази-тофауне стрекоз рода Aeshna. Основываясь на данных о возможном влиянии эндоцитобионтов на численность популяции стрекоз при изменении температуры окружающей среды, мы можем предположить, что данные микроорганизмы, могут выступать в роли одного из механизмов регуляции численности популяции.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Заключение Диссертация по теме "Энтомология", Крюкова, Наталья Анатольевна

3.5. Выводы

1. На основании морфологического и цитохимического ана-• лизов у личинок стрекоз рода Aeshna были выделены три основных типа гемоцитов: прогемоциты(Рг) , гранулоци-ты (Gr) и плазматоциты (PI).

2. В гемолимфе личинок стрекоз рода Aeshna была выявлена агглютинирующая активность. Молекулярный вес нативно-го агглютинина составил 380 - 390 kDa. Молекула агглютинина состоит из 4-х субъединиц весом 90 kDa. Агглютинины экспрессировались в плазматоцитах и грануло-цитах. ф 3. В гемоцитах стрекоз были обнаружены бактерии рода

Pseudomonas. Наличие эндоцитобионтов в клетках крови не влияло на протекание иммунных реакций в личинках стрекоз рода Aeshna.

4. Впервые на территории России у личинок стрекоз, в частности - А. viridis обнаружили микроспоридии (5уstenostrema alba).

5. Зарегистрировали заражение личинок стрекоз рода Aeshna личинками трематод семейств Plagiorhidae и

Prosthogonimidae. Цисты трематод не инкапсулируются гемоцитами и не блокируют инкапсуляцию чужеродных веществ в гемоцеле личинок стрекоз. При пересадке цист трематод семейств Plagiorhidae и Prosthogonimidae/ полученных из различных видов стрекоз в личинок рода Aeschna, было выяснено, что поверхностный слой паразитов не распознается иммунной системой хозяина.

6. При инъецировании бактериальной суспензии в гемоцель личинкам, зараженных трематодами, обнаружено отсутст вие влияния цист трематод на клеточные иммунные реакции, в частности механизмы грануло- и капсулообразо-вания.

Использование цитохимических маркеров позволило выявить, что у зараженных трематодами личинок стрекоз количество иммунокомпетентных клеток (Ф0- и НСТ-положительных), вдвое меньше по сравнению с не зараженными личинками характеризующихся высоким уровнем генерации АКМ и фенолоксидазной активностью.

Заключение

Ключевую роль в формировании иммунного ответа насекомых играют клетки лимфы (гемоциты) и в первую очередь клетки иммуннокомпетентного звена - гранулоциты и плаз-матоциты. Популяция гемоцитов неоднородна, что может быть связано как с различной степенью зрелости клеток, так и с многообразием функций, выполняемых ими. Соотношение тех или иных типов гемоцитов может изменяться в зависимости от стадии развития и физиологического состояния, а также в зависимости от вида насекомого (Gupta, 1979; Ratcliffe, White, 1982; Lackie, 1988) . При проникновении в гемоцель паразит взаимодействует с клетками крови, через систему паттерн-распознающих рецепторов, запускающих триггерный механизм дегрануляции, нередко сопровождающийся разрушением клеток (своеобразная апокринная секреция)(Klein, 1999; Johansson, 1999; Lavine, Strand, 2002,2003; Jiang et all, 2004). В результате дегрануляции в гемолимфу выбрасываются различные вещества, активирующие комплекс ферментов протеаз и эстераз, которые в свою очередь активируют фенолокси-дазную, коагулирующую и агглютинирующую системы (Kanost, 1999, 2004; Gorman, 2001; Li, 2002; Ashida, Brey, 1997). В процессе эволюции паразиты выработали ряд механизмов, позволяющих им избежать существенного воздействия со стороны иммунной системы хозяина. В частности, поверхностный слой паразита может содержать соединения, которые не распознаются иммунокомпетентными клетками хозяина (молекулярная мимикрия) (Сапрунов, 1987; Strand, Pech. 1995; Kinuthia et al., 1998; Hu et al., 2003). В других случаях паразит использует соединения, обладающие иммуносупрессивным действием (Vinson,1990; Brehèlin, 1990; Lavine, Beckage, 1995; Kinuthia et ail., 1999; Shelby at all., 2000; Bell et all., 2003). Таким образом, воздействие паразита, в первую очередь направлено на избегание, либо подавление клеточных иммунных реакций (Brechelin 1990; Vinson 1990; Silva et all., 2000). Нередко, воздействие паразита может сопровождаться тотальным уменьшением количества гемоцитов, их морфологическими изменениями, приводящими к неспособности клеток к адгезии и в дальнейшем к гибели гемоцитов (Stolnz et al., 1986; Sambeec et al., 1999; Richards et al., 2002; Rivers et al., 2002).

У личинок стрекоз последнего возраста A. grandis и А. viridis было выявлено уникальное среди насекомых соотношение гемоцитов. Так, на основе морфологических критериев было выделено три основных типа гемоцитов: прогемоциты (Рг), гранулоциты (Gr) и плазма-тоциты (PI). При этом можно выделить три подтипа плаз-матоцитов: Pli, PI 2 и PI3- Гранулоциты также можно разделить на два подтипа: округлые Gri и веретеновидные Gr2. Такие типы клеток как эноцитоиды и сферулоциты, широко представленные у различных видов насекомых, у стрекоз отсутствуют. Следует особо отметить необычно крупные размеры гемоцитов личинок стрекоз рода Aeschna. У большинства видов насекомых размеры клеток лимфы не превышают 35 мкм, в то время как гемоциты стрекоз могут превышать 60 мкм.

Для всех типов гемоцитов личинок стрекоз рода АеэсЬпа характерна различная метаболическая активность, которая, возможно, связана с функциональным значением этих клеток. О степени зрелости клеток и их функциональной активности позволяет судить наличие связанного внутриклеточного кальция. Последнмй регистрируется с использованием зонда - хлортетрациклина (ХТЦ), который связывается с кальцием и с каким-либо компонентом клетки (мембраны, АТФ и т.д.) . О функциональной роли гемоцитов может говорить наличие в клетках таких ферментов как фенолоксидазы, эстеразы и фиксируемое с помощью нитросинего тетразолия образование активных кислородных метаболитов (АКМ).

Интенсивность свечения в клетках крови ХТЦ-зонда, зависит от характера распределения внутриклеточного кальция. У личинок стрекоз наиболее яркое свечение регистрировалось в гранулоцитах и прогемоцитах,. т.е. в клетках для которых характерна высокая иммунная активность . Кроме того, в гранулоцитах и плазматоцитах личинок стрекоз, регистрировали наличие фенолоксидаз (ФО) , эстераз и активированных кислородных метаболитов (АКМ) .То что в гранулоцитах и плазматоцитах были зафиксированы данные ферменты, а также генерация АКМ, вполне закономерно, поскольку эти клетки активно участвуют в иммунном ответе насекомых, а фенолоксидазы, эстеразы и АКМ могут непосредственно участвовать в уничтожении паразита. В прогемоцитах, котрые являются предшественниками всех последующих типов гемоцитов, регистрировали весь спектр вышеперчисленных ферментов. Наличие фенолоксидаз в прогемоцитах Aeschna - уникальное явление, так как у насекомых других отрядов данный фермент никогда ранее не регистрировали. Вероятно, это связано с тем, что мы регистрировали клетки, которые уже начали дифференцироваться в гранулоциты и плазмато-циты, хотя существенных морфологических изменений мы не наблюдали.

Для насекомых, подобно позвоночным, характерно наличие двух основных систем иммунного ответа: клеточного и гуморального. Гуморальные иммунные реакции насекомых включают в себя коагуляцию гемолимфы, фенолоксидазный каскад, активацию ряда ферментативных систем, сопровождающихся образованием высокореактивных кислородных метаболитов, а также, выработку антибактериальных белков. Немаловажную роль в процессах иммунного ответа играют лектины и лектиноподобные белки (агглютинины) лимфы и клеток крови. Агглютинины насекомых, участвуя в иммунном ответе, выполняют множество функций, действуя как рецепторные молекулы, активируя процессы клеточного иммунного ответа, а также процессы метаморфоза и регенерации (Yealton, 1983; Chen et al., 1995; Theopold, Schmidt, 1997; Wilson et al., 1999; Gelbic, Olejnicek, 2004; Lavine, Strand, 2002; Yu, Kanost, 2003; Li et all., 2002). Агглютинины насекомых способны увеличивать коагулирующую активность гемолимфы за счет способности образовывать агрегаты (полимеры) при контакте с инородным телом (Hugo, Natjri, 1987; Theopold, et al., 2002) . В гемолимфе личинок стрекоз рода Aeschna была выявлена агглютинирующая активность. Агглютинин был частично очищен и его молекулярный вес в БОЭ-РАСЕ составил около 90 кБа. Дальнейшая очистка фракций гемолимфы с применение методов ионообменной и аффинной хроматографии, приводила к потере агглютинирующих свойств. Возможно, что молекулы агглютинина гемолимфы стрекоз рода АеБсЬпа не устойчивы и для их нормального функционирования необходимо наличие каких-либо белков, способных стабилизировать их конфигурацию. При использовании иммуноги-стохимических методов была показана экспрессия лектино-подобных белков в гемоцитах, в основном в Сг и Р1з. Известно, что агглютинины являются паттерн распознающими белками, т.е. участвуют в иммунном распознавании. Возможно, этим можно объяснить наличие лектинов на поверхности гранулоцитов и плазматоцитов, так как данный тип клеток наиболее активно участвует в иммунных реакциях, направленных на изолирование и уничтожение паразита. Кроме того, у личинок стрекоз рода АегсЛла, регистрировали высокую коагулирующую активность гемолимфы, наряду с высокой адгезивной активностью гемоцитов. В процесс коагуляции активно вовлекаются как гемоциты, так и различные компоненты лимфы, формируя своеобразные аггрега-ты (клампы) клеток лимфы с инородными телами. В условиях водной среды, где насекомое контактирует с большим количеством бактерий, паразитов и т.д., высокая скорость коагуляции и клампообразования вполне оправдана, так как предотвращает значительные потери гемолимфы и закрывает «ворота инфекции» при ранениях.

При работе с природной популяцией стрекоз мы столкнулись с заражением личинок метацеркариями трематод семейств Plagiorchidae и Prosthogonimidae. Параллельно, в гемоцеле и гемоцитах личинок была отмечена бактериальная инвазия. Бактерии были отнесены к двум родам Bacillus и Pseudomonas. Кроме того, в жировом теле личинок стрекоз были обнаружены микроспоридии Systenostrema alba Larsson 1988.

Бактерии рода Pseudomonas персистировали в клетках крови личинок стрекоз - своеобразные эндоцитобионты. В данном исследовании было обнаружено редкое явление, а именно - наличие эндоцитобионтов в иммунокомпетентных клетках крови. В гемоцитах бактерии формировали различные структуры, препятствующие их уничтожению. Роль микроорганизмов в организме стрекоз, остается не выясненной. Однако, учитывая высокий процент зараженности, а также то, что персистенция бактерий не оказывает значительного влияния на иммунные реакции насекомого, можно предположить симбионтный характер их взаимоотношений. В то же время, при повышение температуры окружающей среды выше 30°С, наблюдается гибель личинок стрекоз. Возможно, что температура может служить регулирующим фактором численности стрекоз, опосредованно через активацию эндосимбионтов. Кроме того, в процессе исследований у личинок стрекоз обнаружили паразитирование микроспоридий в жировом теле. Основываясь как на морфологии спор, так и на видовой принадлежности хозяина, микроспоридии были отнесены к виду Systenostrema alba Larsson 1988, и впервые выявлены на территории России. Ранее этот вид был описан только для Швеции. Известно, что микроспоридии являясь внутриклеточными паразитами, вызывают патологические изменения в тканях и органах хозяина, приводящих в дальнейшем к его гибели. В связи с низким процентом зараженности природной популяции, проследить возможное влияние микроспоридий на иммунный ответ личинок стрекоз не было возможности.

Поскольку личиночная стадия у стрекоз наиболее продолжительна по времени, к концу старших возрастов личинки содержат различных паразитов: микроспоридии, грегарины, нематоды и т.д. Личинки стрекоз могут так же быть дополнительными хозяевами для трематод семейств Р1ад1огсЫс1ае и РгозЬЬодоп1т1йае. Развитие взрослой формы паразита происходит в птицах (Илюшина,197 5).' Поэтому для паразита вполне «целесообразно» свести свое влияние на дополнительного хозяина к минимуму, так как его гибель может привести к элиминации паразита. В процессе эволюции у трематод вокруг цист метацеркарий сформировалась уникальная оболочка, которая не распознается иммунокомпетентным звеном насекомого. Возможно, в состав оболочки цист входит большое количество проте-огликанов, для которых характерна высокая степень гли-козилирования. Вероятно, концевые углеводные остатки протеогликанов, входящих в состав оболочки цист, образуют однородный слой, состоящий из моносахаров. Наличие данных соединений может обуславливать отсутствие распознавания и иммунного ответа у личинок стрекоз рода АеэсЬпа при инъецировании цист, полученых из личинок других родов и семейств. Можно предположить, что это характерно для всех трематод, которые используют насекомых в качестве промежуточных или дополнительных хозяев. Однако, паразит, даже находясь на стадии цисты, не способен полностью предотвратить выделение собственных метаболитов в окружающюю среду (гемолиму личинок стрекоз) . Вероятно, даже незначительные количества этих метаболитов могут выполнять своеобразные сигнальные функции и приводить к активации иммунокомпетентных клеток. Вероятно, этим объясняется повышенное количество клеток с фенолоксидазной активностью и клеток, в которых регистрируется образование АКМ. Возможно, за счет этого развитие иммунного клеточного ответа будет происходить в более короткие сроки. Однако, при инъецировании бактериальной суспензии в гемоцель насекомых, было обнаружено, что у зараженных трематодами личинок стрекоз, количество иммунокомпетентных клеток (ФО- и НСТ-положительных), вдвое меньше по сравнению с не зараженными личинками характеризующихся высоким уровнем генерации АКМ и фенолоксидазной активностью.

Данное иммуносупрессивное действие трематод на клеточный иммунитет насекомых, вероятно, может быть обусловлено или частичным истощением ресурсов организма хозяина, или тем, что метаболиты паразита обладают ин-гибирующей активностью узкого действия, которая проявляется только при вторичной инфекции. Следует также отметить, что основные функции клеток иммунной системы стрекоз полностью не ингибируются при инвазии трематодами. Такие ключевые реакции как фагоцитоз, капсуло- и гранулообразование у инвазированных личинок наблюдаются в полной мере.

Основываясь на результатах, проведенной нами работы по изучению возможного влияния трематод семейства Р1ад1огсЬ1с1ае и РгогЬ1юдоп1т1с1ае на клеточные иммунные реакции личинок стрекоз рода АезсЬпа, можно предположить, что в ходе сопряженной эволюции стрекоз и их паразитов, у последних сформировались ряд адаптаций, которые обеспечивают их нормальное развитие в организме хозяина, не оказывая существенного влияния на его иммунную систему. С одной стороны паразиты не угнетают ключевые реакции иммунного ответа и приводят к повышению активности клеток иммуннокомпетентного звена, с другой стороны, ответ на вторичную инфекцию не развивается в той степени, которая характерна для неинвазиро-ванной личинки. Подобное взаимодействие позволяет личинкам стрекоз инвазированных паразитами противостоять вторичному заражению, а паразиту - не быть уничтоженным иммунной системой насекомого.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Крюкова, Наталья Анатольевна, Новосибирск

1. Адо А. Д. Патофизиология гемоцитов // М.: Медгиз, 1961. 295 с.

2. Азизова O.A., Борин M.JI. Быков С.С. и др. Внутриклеточная сигнализация // М.: Наука. 1988. С.144-150.

3. Арцруни Г. Г. Влияние внешних электростатических полей на распределение Са2+ в клетках печени // http://www.medlib.am/ 2001 2 5FR.htm

4. Белъшев Б.Ф. Стрекозы Сибири // Новосибирск: Наука СО. 1973. Т. 1. 620 с.

5. Владимиров Ю.А. Физико-химические основы патологии клетки. Нарушение функций митохогдрий при тканевой гипоксии // Москва. 1998. МГУ. РГМУ.

6. Глупов В.В. Механизмы резистентности насекомых // Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты (под ред. Глупова В.В.), Москва: Круглый год. 2001. С.471-557.

7. Глупов В.В., Бахвалов С.А. Механизмы резистентности насекомых при патогенезе // Успехи совр. Биол. 1995.Т.118. Вып.4,С. 466-482,

8. Глупов В.В., Хвощевская М.Ф., Щепеткин И. А., Крюкова H.A. Морфофункциональная структура популяции гемоцитов Galleria mellonella при инфекционном процессе // Известия АН, сер. биол. 1997. № 6. С. 645-653

9. Голованова О.В., Глупов В.В., Хвощевская М.Ф. Агглютинины гемолимфы капустной совки Mamestга

10. ЬгазБ1сае (Ь) 1758 (Lepidoptera: Noctuidae)// Известия РАН, сер. биол. 1998. № 6. С.705-711.

11. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов// М.: Наука. 1989 278с.

12. Дуглас С.Д. Куи П.Г. Исследование фагоцитоза в клинической практике// М.:Медицина, 1983. С. 110

13. Зенков Н.К., Панкин В.З., Меныцикова Е.Б. Окислительный стресс. Биохимические и патофизиологические аспекты// МАИК «Наука / Интерпериодика» 2001. 345 с.

14. Игнатов В. В. Углеводузнающие белки лектины // Соро-совский образовательный журн. 1997. №2. С.14-20.

15. Илюшина Т.П. Роль водных насекомых в жизненном цикле трематод// Паразиты в природных комплексах Северной Кулунды. Новосибирск: Наука СО 1975. С. 5394 .

16. Исси И. В. Микроспоридии как тип паразитических простейших// Микроспоридии. Ленинград. Наука. 1986. С. 6-136.

17. Королев Р. П. Функции лектинов в клетках/ Итоги науки техники / Сер. «Общие проблемы физико-химической биологии», 1984. Т. 1. 352 с.

18. Краснолобова Т. А. Трематоды фауны СССР. Род Р1ад1огсЫ-dae (отв. Ред. В.Е.Судариков)// Москва. Наука. 1987. С.163

19. Краснолобова Т.А., Илюшина Т.Л. Стрекозы как промежуточные хозяева гельминтов.// Гельминты животных. М. Наука. 1991 С. 59-71. (Труды ГЕЛАН СССР. Т. 38) .

20. Купер Э. Сравнительная иммунология// М. : Мир, 1981. 422 с.

21. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия// Москва. «Мир». 1969. 970с.

22. Маянский А.Н., Невлятуллин А.Л. , Чеботарь И.В. Реактивная хемилюминисценция в системе фагоцитоза// ЖМЭИ.1987.Т.7.С.109.

23. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К. Окислительный стресс при воспалении// Успехи совр. биол. 1997. Т. 117 Вып. 2. С. 155-171.

24. Сапрунов Ф.Ф. Молекулярные основы паразитизма//М.: Наука 1987.

25. Селезнев К.В., Антонова O.A., Исси И.В. Микроспоридиоз сверчков Grillus bímaculatus (Gryllidae) , вызванный микроспоридией Nosema grylli (Nosematidae)// Паразитология. 1996, Т.30(3) С.250-262.

26. Скулачев В. П. Кислород в живой клетке: добро и зло// Природа 1997.Вып.11. С.26-35.

27. Судариков В.Е., Шигин A.A., Курочкин Ю.В., Ломакин В.В., Стенько Р.П., Юрлова Н.И. Метацеркарии трематод паразиты пресноводных гидробионтов Центральной России// М., Наука. 2002. С.296 .

28. Сухачева Г.А., Крюкова Н.А., Глупов В.В. О роли морфо-метрических и биохимических критериев при идентификации видов (на примере личинок стрекоз рода Aeshna)// Известия АН. Сер. биол. 2003. №1. С. 7480.

29. Харитонов А.Ю. Стрекозы// Определитель пресноводных беспозвоночных России и сопредельных территорий. Т. 3. Паукообразные и низшие насекомые. СПб. : Наука. 1997. С. 222.

30. Шарон Н. Гликопротеины. Перспективы биохимических исследований (под редакцией Дж.Туза и С.Прентиса)// Москва «Мир». 1987, 194с.

31. Andersen S.O., Peter M.G., Roepstorff P. Cuticular Sclerotization in Insects//Comp. Biochem. Physiol. 1996. Vol. 113B. №4. P. 689-705.

32. Anderson R.S., Holmes В., Good R.A. Comparative biochemistry of phagocytizing insect hemocytes// Сотр. Biochem. Physiol. 1973. V.46B. P.595.

33. Armstrong P.В., Melchior R., Qoigley J.P. Humoral Immunity in Long-lived Arthropods// J.Insect Physiol. 1996. Vol.42 № 1. P.53-64.

34. Arnold J.W., Hinks C.F. Haemopoiesis in Lepidoptera I. The multiplication of circulating haemocytes// Can. J. Zool. 1976. Vol. 54(6). P.1003-1012.

35. Arrese E.L., Canavoso L.E., Jouni Z.E., Pennington J.E. r Tsuchida K. , Wells M.A. Lipide storage and mobilization in insects: current status and future directions// Insect Biochem. Mol. Biol. 2001. Vol.31. P.7-17.

36. Aruoma O.I. Free radicals, antioxidants and international nutrition// Asia Pacific J. Clin. Nutr. 1999. Vol. 8(1). P. 53-63.

37. Asgari S. , Zhang G. , Zareie R. , Schmidt 0. A serine proteinase homolog venom protein from an endoparasitoid wasp inhibits melanization of the host hemolymph// Ins. Biochem. Mol. Biol. 2003. Vol.33. P. 1017-1024.

38. Ashida M. Prophenoloxidase cascade in insect immunity// Res. Immun. 1990. Vol. 141. P. 908-910.

39. Ashida M. , Brey P. T. Resent advancers in research on the insect prophenoloxidase cascade// Molecular Mechanisms of Immune Responses in Insects / ed. Paul T. Brey and Dan Hultmark. 1997. Chapman & Hall, London. P. 135-172.

40. Ashida M. , Yamazaki H.I. Biochemistry of the phenoloxi-dase system in insects: with special reference to its activation// Molting and Metamorphosis. Ed. Ohnishi E., Ishizaki H. Japan Sci. Soc. Press, Tokyo; Springer Verlag. Berlin. 1990. 239-265.

41. Babior M.A., Kipnes R.M., Curnutte J.T. Biological defense mechanisms. The production by leucocytes of superoxide, a potential bactericidal agent// J. Clin. Invest. 1973. V. 52. P. 741-744.

42. Beatty W.L., Rhoades E.R., Hsu D.K., Liu F.-T. and Russell D.G. Assotiation of a macrophage galactoside-binding protein with Mycobacterium-containing phagosomes// Cell. Microbiol. 2002. Vol. 4№3. P.167-176.

43. Beckage N.E. Games parasites play: the dynamik roles of proteins and peptides in the relationship between parasite and host// Parasit. Patogenes Insects. 1993. Vol.1. P. 25-57.

44. Bedick J.C., Pardy R. L. , Howard R. W. , Stanley D.W.1.sect cellular reactions to the lipopolysaccha-ride component of the bacterium Serratia marces-cens are mediated by eicosanoids// J. Insect Physiol. 2000. Vol. 46. P. 1481-1487.

45. Bell H.A., Kirkbride-Smith A.E., Marris G.C., Edwards J. P. Teratocytes of the solitary endoparasitoid Meteorus gyrator (Hymenoptera: Braconidae): morphology, numbers and possible functions// Physiol. Entomol. 2004. Vol. 29. P.335-343.

46. Bohn H. Hemolymph clotting in insects// In: Immunity in Invertebrates / Ed. Brechelin M., Berlin; Heidelberg: Springer-Verlag, 1986. P.188-207.

47. Borgsteede F.H.M. , Davids C.f Duffels J. P. The life history of Schistogonimus rarus (Braun, 1901) Lühe, 1909 (Trematoda: Prosthogonimidae)// Koninkl. Nederl. Akad. Wetenchappen, Amsterdam. Ser. Zoology. 1969. C 72. № 1.- P. 28-32.

48. Boucias D.G., Pendland J.C. The galactose binding lectin from the beet armyworm, Spodoptera exigua:distribution and site of syntesis// Insect Bio-chem. Mol. Biol. 1993. Vol. 23. P.233-242.

49. Brehèlin M. Comparative study of structure and function of blood cells from too Drosophila species// Cell tissue Res. 1982. V. 221. P. 607-615.

50. Brehèlin M. Depression of immune reactions in insects// Res. Immunol. 1990. Vol. 141. P. 935-938.

51. Brehèlin M., Zachary D. Insect haemocytes: new classification to rule out the controversy// Immunity Springer Verlag. 1986. P.36-48.

52. Butt T. M. , Shields K. S. The Structure and Behavior of Gypsy Moth (Lymantria dispar) Hemocytes// J. Invert. Pathol. 1996. Vol.68. P. 1-14.

53. CartonYNappi A.J. Immunogenetic aspects of the cellular immune response of drosophila against para-sitoids// Immunogenetics 2001. Vol. 52. P. 157164 .

54. Chain B.M., Anderson R.S. Selective depletion of the plasmatocytes in Galleria mellonella following injection of bacteria// J. Insect. Physiol. 1982. Vol. 28 (4) P. 377-384.

55. Charalambidis N.D., Foukas L.C., Zervas C.G., Marmaras V.J. Hemocyte Surface Phenoloxidase (PO) and Immune Response to Lipopolysacchride (LPS) in Cer-attis capitata// Insect Biochem. Molec. Biol. 1996. Vol. 26. P. 867-874.

56. Chen C. , Durrant H.J., Newton R. P., Ratcliffe N.A. A study of novel lectins and their involvement in the activation of the prophenoloxidase system in

57. Blaberus discoidalis// Biochem. J. 1995. Vol. 310. P. 23-31.

58. Dahlman D. Teratocytes and Host-Parasitoid Interactions// Biol. Cont. 1991. Vol. 1. P. 118-126.

59. Dales R.P., Kalag Y. Phagocytic defence by the earthworm eisenia foetidae against certain pathogenic bacteria// Biochem. Physiol. 1992. Vol. 101A. № 3 P. 487-490.

60. Dodd R.B.f Drickamer K. Lectine-like proteins in model organisms: implicanions for evolution of carbohydrate-binding activity// Glycobiol. 2001. Vol.11. № 5. P. 71-79.

61. Dunphy G.B., Webster J.M. Lipopolisaccharides of Xenorhabdus nematophilus (Enterobacteriacea) and their haemocyte toxicity in non-immune Galleria mellonella (Insecta: Lepidoptera) larvae// J. Gen. Microbiol. 1988.Vol.134 . P. 1017-1028.

62. Dziarski R. Peptidoglycan recognition proteins (PGRPs)// Mol. Immunol. 2004. Vol. 40. № 12. P. 877-886.

63. Erickson E. , Cohen A. , Brummett D. , Lusby W. , Cameron B. . Tyrosine Nodules in the Gasters of Adult Honeybees// J. of Invert. Pathol. 1997. Vol.70. P.27-32.

64. Fellowes M.D.E. & Godfray H.C.J. The evolutionary ecology of resistance to parasitoids by Drosophila Heredity 2000. Vol. 84. P. 1-8.

65. Gadelhak G.G., Pedibhotla V.K., Stanley-Samuelson D.W.

66. Eicosanoid Biosynthesis by Hemocytes from the Tobacco Hornworm, Manduca sexta// Insect Biochem. Molec. Biol. 1995. Vol. 25. № 6. P.743-749.

67. Gardiner E.M.M., Strand M.R. Monoclonal antibodies bind distinct classes of hemocytes in the moth Pseu-doplusia includens// J. Insect Physiol. 1999. Vol. 45. P. 113-126.

68. Genov, T., and P. Samnaliev. Biology, morphology and taxonomy of Plagiorchis elegans (Rudolphi, 1802) (Plagiorchidae) in Bulgaria. In: Fauna, taxonomy and ecology of helmints of birds I. Vasilev (ed.)// Izdatel'stvo na BAN, Sofia, 1984. P. 75114 .

69. Goldstein I.J., Hughes R.C., Monsigny M. , Osawa T., Sharon N. What should be called a lectin?// Nature. 1980. Vol. 285. P. 66.

70. Gorman M.J., Andreeva O.V., Paskewitz S. M. Sp22D: a multidomain serine protease with a putative role in insect immunity// GENE 2000. Vol. 251. P. 917 .

71. Gorman M.J., Paskewitz S.M. Serine proteases as mediators of mosquito immune responses// Ins. Biocem. & Mol. Biol. 31 (2001) 257-262.

72. Gotz P. Encapsulation in Arthropods// Imm. in Invert.

73. Ed. Brehelin M., Berlin; Heidelberg: Springer Verlag. 1986. P. 153-172.

74. Greenberg S. Signal transduction of phagocitosis// Trends in cell biology Vol. 5 March 1995.

75. Gupta A.P. Hemocyte type: their structure, synonymies, interrelationships and taxonomies significance// Insect hemocytes: development, form, functions and techniques / Cambridge University Press, Cambridge. London. 1979. P. 85-127.

76. Guzo D. , Stoltz B. Observations on cellular immunity and parasitism in the tussock moth// J.Insect. Physiol. 1987. Vol. 33. P. 19-31.

77. Hahn U.K., Bender R.C., Bayne C.J. Production of reactive oxygen species by hemocytes of Biomphalaria glabrata: carbohydrate-specific stimulation// Dev. and Comp.Immunol. 2000. Vol. 24. P. 531-541.

78. Hillyer Julian F. r Christensen Bruce M. Characterization of hemocytes from the yellow fever mosquito Aedes aegypti// Histochem. Cell Biol. 2002. Vol. 117. P. 431-440.

79. Hinks C.F., Arnold J.W. Haemopoiesis in Lepidoptera II. The role of the haemopoetic organs// Can. J. Zool. 1977. Vol. 55(10). P. 1740-1755.

80. Hoffmann J.A., Zachary D., Hoffmann D., Brechelin M. , Prte A. Postembryonic development and differentiation: Hemopoetic tissues and their functions in some insects// Ed. Gupta 1979

81. Holmblad T., Soderhall K. Cell adhesion molecules and antioxidative enzymes in a crustacean, possible role in immunity// Aquaculture 1999. Vol.172. P. 111-123.

82. Howard A. B. , Kirkbride-Smith A. E.r Marris G. C., Edwards J. P. Teratocytes of the solitary endopara-sitoid Meteorus gyrator(Hymenoptera: Braconidae): morphology, numbers and possible functions// Physiolog. Entomol. 2004. Vol. 29. P. 335-343.

83. Hu J. , Zhu X-X. , Fu W-J. Passive evasion of encapsulation in Macrocentrus cingulum Brischke (Hymenoptera: Braconidae), a polyembryonic parasitoid of Ostrinia furnacalis Guenee (Lepidoptera: Pyrali-dae)// J. Insect. Physiol. 2003. Vol. 49. P. 367375.

84. Jiang H. , Wang Y. f Yu X.-Q., Zhu Y. , Kanost M.

85. Prophenoloxidase-activating proteinase-3 (PAP-3) from Manduca sexta hemolymph: a clip-domain serine proteinase regulated by serpin-lJ and serine proteinase homologs// J. Biochem. And Mol. Biol. 2003. Vol. 33. P. 1049-1060.

86. Johansson M.W. and Soderhall K. . The Prophenoloxidase Activating System and Associated Proteins in Invertebrates// Invert. Immunol./ Eds.: Rinke-vich B., Muller W.E.G./ Springer Verlag, Berlin. 1995. P. 46-66.

87. Johansson M.W. Cell adhesion molecules in invertebrate immunity// Develop. and Comp. Immunol. 1999. Vol.23. P. 303-315.

88. Johnson J.K., Rocheleau T.A., Hillyer J.F., Chen C.C., Li J. , Christensen B.M. . A potential role for phenylalanine hydroxylase in mosquito immune responses //J. Biochem. And Mol. Biol. 2003. Vol. 33. P. 345-354.

89. Kanost M.R., Jiang H. , Yu X.-Q. . Innate immune' responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta//Immunol. Reviews 2004. Vol.198. P.97-105.

90. Kanost M.R. Serine proteinase inhibitors in arthropod immunity// Dev. and Comp. Immunol. 1999. Vol. 23. P. 291-301.

91. Kinuthia W. , Li D. , Schmidt 0. , Theopold U. Is the surface of endoparasitic wasp eggs and larvae covered by a limited coagulation reaction?// Journal of Insects Physiol. 1999. Vol. 45. P. 501-506.

92. Klein J. Self- nonself discrimination, histoincompati-bility, and the concept of immunology// Immunoge-netics 1999. № 50. P. 116-123.

93. Kobayashi A. Insect defence molecules ' and reactive oxygen// Dev. and Comp. Immunol. 1998. Vol. 22. № 1. P. 12 9.

94. Kopacek P., Weise C., Gôtz P. The Prophenoloxidase from' the Wax Moth Galleria mellonella: purification and characterization of the proenzyme// Insect Biochem. Molec. Biol. 1995. Vol. 25. № 10. P. 1081-1091.

95. Kuhn K.H., Uhlir J., Grubhoffer L. Ultrastructural localization of a sialic acid-specific hemolymph lectin in the hemocytes and other tissues of the hard tick Ixodes ricinus (Acari; Chelicerata)// Parasitol. Res. 1996. Vol. 82. P. 215-221.

96. Kurata S., Recognition of infectious non-self and activation of immune responses by peptidoglycan recognition protein (PGRP)-family members in Droso-phila// Dev. and Comp.Immunol. 2004. Vol. 28. P. 89-95.

97. D.r Scherfer C., Korayem A.M., Zhao Z., Schmidt 0

98. Mandato C.A., Delhi-Jones W.L., Moore S.J., Downer R.G.H. The Effects of Eicosanoid Biosynthesis Inhibitors on Prophenoloxidase Activation, Phagocytosis and Cell Spreading in Galleria Mellonella// J. Insect Physiol. 1997. Vol. 43. № 1. P. 1-8.

99. Miller J. S., Howard R. W. , Rana R. L. , Tunaz H., Stanley D. W. Eicosanoids mediate nodulations to bacterial infections in adults of the cricket,

100. Gryllus assimilis// J. Insect Physiol. 1999. Vol. 45. P. 75-83.

101. Mohrig W. , Schittek D. Phagocytosis-stimulating mediators in insects// Acta boil. med. garm. 1979. Vol. 38. P.953-958.

102. Mullen L. , Goldsworthy G. . Changes in lipophorins are related to the activation of phenoloxidase in haemolymph of Locusta migratoria in response to injection of immunogens// J. Biochem. And Mol. Biol. 2003. Vol. 33. P. 661-670.

103. Nacahara Yuichi, Kanamori Y. , Makoto K. , Manabu K. In vitro studies of hematopoiesis in the silkworm: cell proliferation in and hemocyte discharge from the hematopoietic organ// J. Ins. Physiol. 2003. Vol. 49. P. 907-916.

104. Nappi A.J., Ottaviani E. Cytotoxity and cytotoxic molecules in invertebrates// BioEssays 2000. Vol. 22. P. 469-480.

105. Nappi A.J.f Vass E. Comparative studies of iron-mediated production of hydroxyl radical by glutathione, cysteine, ascorbic acid, and selected catechols// Biochim. et Biophys. Acta. 1997. Vol. 1336. P. 295-301.

106. Nappi A.J.f Vass E., Fray F., Carton Y. Superoxide anion generation in Drosophila during melanotic encapsulation of parasites// Eur. J. of Cell Biol. 1995. Vol. 68. P. 450-456.

107. Nappi A.J., Vass E.f Frey F. r Carton Y. Nitric Oxide Involvement in DrosophilaImmunity// NITRIC OXIDE: Biology and Chemistry 2000. Vol. 4. № 4. P. 423430 .

108. Nardi J. B. r Pilas B., Ujhelyi E. , Garsha M. , Kanost M.

109. R. Hematopoetic organs of Manduca sexta and hemo-cyte lineages// Dev. Genes. Evol. 2003. Vol. 213. P. 477-491.

110. Ochiai M. , Ashida M. A pattern-recognition Protein for /3-1,3- Glucan// J. Biol. Chem. 2000. Vol. 272. № 7. P. 4995-5002.

111. Ochiai M. , Ashida M. Purification of a (3-1,3- Glucan Recognition Protein in the Prophenoloxidase Activating System from Hemolymph of the Silkworm, Bombyx mori// J. Biol. Chem. 1988. Vol. 263. № 24. P. 12056-12062.

112. Olafsen J.A. Invertebrate Lectins: Biochemical Heterogeneity as a Possible Key to Their Biological Function// Immun. . Invert. Ed. by M. Brehelin. Springer-Verlag. Berlin Heidelberg 1986. P. 94111.

113. Pendland J.C., Boucias D.G. Phagocytosis of lectin-opsonized fungal cells and endocytosis of the ligand by insect Spodoptera exigua granular hemo-cytes: an ultrastructural and immunocytochemical study// Cell Tissue Res. 1996. Vol. 285. P. 5767 .

114. Peters A., Ehlers R.-U. Encapsulation of the Entomopa-thogenic Nematode Steinernema feltiae in Tipula oleracea// J. Invert. Pathol. 1997. Vol.69. P. 218-222.

115. Ratcliffe N.A. Invertebrate immunity primer for a nonspecialist// Immunol. Lett. 1985. Vol. 10. P. 252-270.

116. Ratcliffe N.A. r Rowley A.F. Role of hemocytes in defense against biological agents// Insect hemocytes / Ed. Gupta A. P. London; Cambridge Univ. Press. 1979. P. 332-414.

117. Ratcliffe N.A., White K.N., Rowley A.F., Walters J.B.

118. Cellular defense systems of the Arthropoda// The reticuloendothelial system comprehensive treaties / Eds. Cohen N. and Sigel M.M., New York: Plenum Press. 1982. Vol. 3. P. 167-255.

119. Reed A.D., Brown J.J. Host/parasitoid interactions: critical timing of parasitoid-derived products// J. Insect. Physiol. 1998. Vol. 44. P. 721-732.

120. Richards Elaine H. , Edwards John P. Parasitization of Lacanobia oleracea (Lepidoptera) by the ectopara-sitic wasp, Eulophus pennicornis, suppresseshaemocyte-mecliated recognition of non-self and phagocytosis// J. Insect Physiol. 2000. Vol. 46. P. 1-11.

121. Rizki M., Rizki T. The Cellular Defense System of Dro-sophila melanogaster// Insect Ultrastructure. Vol.2 / Edited by R.C.King and H. Akai (Plenum Publishing Corporation). 1984.

122. Rizki R.M. , Rizki T.M Effects of Lamellolysine From a Parasitoid Wasp on Dro.sophila Blood Cells In Vitro// J. Exp. Zool. 1991. Vol. 257. P. 236-244.

123. Rizki R.M. , Rizki T.M. Parasitoid virus-like particles destroy Drosophila cellular immunity// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990. Vol. 87. P. 8388-8392.

124. Saito T. , Hatada M. , Jwanaga S., Kawabat S. A newly Identified Horseshoe crab Lectin with Binding Specificity to O-antigen of Bacterial Lipopoly-saccharides// J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. № 49. Issue of Desember 5. P. 30703 30708.

125. Sambeek J., Weisner A. Successful Parasitaition of Locusts by Entomopathogenic Nematodes Is Correlatedwith Inhibition of Insect Phagocytes// J. Invert. Pathol. 1999. Vol. 73. P. 154-161.

126. Shackelford R. E., Kaufmann W. K. , Paules R. S. Oxidative stress and cell cycle checkpoint function// Free Rad. Biol. & Medicine. 2000. Vol. 28 № 9. P. 1387-1404.

127. Shelby K.S., Adeyeye O.A., Ocot-Kotber B.M., Webb B.A.

128. Parasitism-Linced block of Host Plasma Melanisa-tion// J, Invert. Pathol. 2000. Vol. 75. P. 218225.

129. Shin S.W., Park D.-S., Kim S.Ch., Park H.-Y. Two carbohydrate recognition domains of Hyphantria cunea lectin bind to bacterial lipopolysaccharide through O-specific chain// FEBS Letters. Vol. 467. P. 70-74.

130. Silva J.B.D., Albuquerque C.M.R.D., Araujo E.C.D., Peixoto C.A., Hurd H. Immune defense mechanisms of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culcidae) against Candida albicans infection// J.Invert. Pathol. 2000. Vol. 76. P. 257-262.

131. Soderchall K. Biochemical and molecular aspects of cellular communication in arthropods// Boll. Zool. 1992. Vol. 59. P. 141-151.i

132. Soderhall K. Phenoloxidase activating system and melanisation a recognitions mechanism of arthropods?// Dev. Comp. Immunol. 1982. Vol. 6. P. 601-611.

133. Sohal R.S., Sohal B.H., Orr W.C. Mitochondrial superoxide. and hydrogen peroxide generation, protein oxidative damage, and longevity in different species of flies// Free Radical and Medic. 1995. Vol. 19. № 4. P. 499-504.

134. Stoltz B.r Guzo D. Apparant haemocytic transformations associated with parasitoid-induced inhibition of immunity in Malacosoma disstria larwae// J. Insect. Physiol. 1986. Vol. 32. P. 377-383.

135. Strand M.R., Pech L.L. Immunological basis for compatibility in parasitoid-host relationship// Ann. Rev. Entomol. 1995. Vol. 40. P. 31-56.

136. Styczynska-Jurewicz E. Remarks on the life cycle of Plagiorchis elegans (Rud. , 1802) (Trematoda, Pla-giorchidae) and the problem of revision of thegenus Plagiorchis Lühe, 1889// Acta

137. Parasitológica Polonica 10. 1962. 21/27. P. 419445.

138. Sugiyama H. and Natori S. A novel mechanism of Sar-cophaga lectin gene expression. Possible involvement of oxidation of the sulfgydryl group of a fat-body protein// Eur.J.Biochem. 1991. Vol. 200. P. 495-500.

139. Sugumaran M. Comparative Biochemistry of Eumelanogene-sis and the Protective Roles of Phenoloxidase and Melanin in Insects// Pigment Cell Res. 2002. Vol. 15. P. 2-9.

140. Sugumaran M. , Bolton J.L. Laccase and Not Tyrosinase - Is the Enzyme Responsible for Quinone Methide Prodaction from 2, 6-Dimetoxy-4-allyl Phenol// Arch. Biochem. Biophys. 1998. Vol. 353. № 2. P. 207-212.

141. Sugumaran M. , Nellaiappan K. , and Valivittan K. . A new Mechanism for the Control of Phenoloxidase Activity: Inhibition and Complex Formation with Quinone Isomerase// Archives of Biochem. And Biophys. 2000. Vol. 379. № 2. P. 252-260.

142. Swanson J. A. and Baer S.C. Phagocytosis by zippers and triggers// TRENDS in Cell Biol. Vol. 5 March 1995 .

143. Takahashi S., Enomoto G. Scaning Electron Microscopic Study of the Initial phase of Encapsulation in

144. Samia Cynthia ricini// Develop. Growth and Differ. 1987. Vol. 29. № 3. P. 249-256.

145. Theopold U. / Li D., Fabri M. , Scherfer C., Schmidt O.

146. The coagulation of insect hemolymph. Rewie// CMLS. CellMol. Life Sci. 2002. Vol. 59. P. 363372 .

147. Theopold U. , Schmidt 0. Helix pomata Lectin and Annexin ■ V, Two Molecular Probes for Insect Micropaticles : Possible Involvement in Hemolymph Coagulation// J.Insect Physiol. 1997. Vol. 43. № 7. P. 667-674.

148. Tojo S., Naganuma F., Arakawa Yokoo K.S. Involvement of both granular cells and plasmatocytes in phagocytic reactions in the greater wax moth, Galleria mellonella// J. Insect Physiol. 2000. Vol. 46. P. 1129-1135.

149. Van der Horst D.J., van Hoof D., van Marrewijk W. J.A., Rodenburg K.W. Alternative lipid mobilization: The insect shuttle system// Mol. Cell.Biochem. 2002. Vol. 239. P. 113-119.

150. Vasta G.R.r Marchalonis J.J. Humoral recognition factors in the Arthropoda: specificity of Chelicer-ata serum lectins// Am.Zool. 1983. Vol. 23. P. 157-171.

151. Vasta G.R., Quesenberry M. , Ahmed H. , O^Leary N. C-type lectins and galectins mediate innate and adaptive immune functions: their roles in the complement activation pathway// Dev. Comp. Immunol. 1999.1. Vol. 23. P. 401-420.

152. Vinson S.B. How parasitoids deal with the immune system of their host: an overeview// Arch. Insect. Biochem . Physiol . 1990. Vol. 13. P. 3-27.

153. Wago H. , Tanaka T. Synergistic Effects of Calyx Fluid and Venom of Apanteles kariyai Watanabe (Hymenop-tera: Braconidae) on the Granular Cells of Pseu-daletia separate Walker (Lepidoptera: Noctui-dae)// Zool. Science 1989. Vol. 6. P. 691-696.

154. Wang X. , Rocheleau T.A., Fuchs J.F. et al. A novel lectin with a fibrinogen-like domain and its potential involvement in the innate immune response of Armigeres subalbatus against bacteria// Insect Molecular Biology 2004. Vol. 13. № 3. P. 273-282.

155. Wang Y.r Oberley L.W. and Murhammer D.W. Evidence of oxidative stress following the viral infection oftwo Lepidopteran insect cell lines// Free Radical and Medic. 2001. Vol. 31. № 11. P. 1448-1445.

156. Weiske J. and Weisner A. Stimulation of NO Synthase Activity in the Immune-Competente Lepidopteran Es-tigmene acraea Hemocyte Line// NITRIC OXIDE: Biology and Chemistry 1999. Vol. 3. № 2. P. 123131.

157. Whitten M.M.A. , Mello C.B. et al. Role of Superoxide and Reactive Nitrogen Intermediates in Rhodnius prolixus (Reduviidae)/ Trypanosoma rangeli Interaction// Exp. Paras. 2001. Vol. 98. P. 44-57.

158. Whitten M.M.A., Ratcllife N.A. In vitro superoxide activity in haemolymph of the West Indian leaf cockroach, Blaberus discoidalis// J.of Ins. Physiol. 1999. Vol. 45. P. 667-675.

159. Wilson K. , Cotter S.C., Reeson A.F., Pell J.K. Melanism and disease resistance in insect// Ecol. Letters. 2001. Vol. 4. P. 637-649.

160. Wilson R. , Chen C., Ratcliffe N.A. Innate Immunity in Insects: The Role of Multiple, Endogenous Serum Lectins in the Recognition of Foreign Invaders in the Cockroach, Blaberus discoidalis// Journal of Immunology. 1999. Vol. 162. P. 1590-1596.

161. Wilson R. , Ratcliffe N.A. Effect of lysozyme on the lectine-mediated phagocytosis of Bacllus cereus by haemocytes of the cockroach Blaberus discoidalis// Journal of Insect Physiology 2000. Vol. 46. P. 663-670.

162. Wiwsner A., Wittwer D. , Gótz P. A smoll phagocytosis stimulating factor is released by and acts on phagocytosing Gallería Mellonella haemocytes in vitro// J.Insect. Physiol. 1996. Vol. 42. № 9, P. 829 -835.

163. Yelton R.W. Wound Responses in Insects// Amer. Zool. 1983. Vol. 23. P. 195-203.

164. Yu X. -Q. , Jiang H. , Wang Y., Kanost M.R. Nonprote-olytic serine proteinase homologs are involved in prophenoloxidase activation in the tobacco horn-worm, Manduca sexta// Insect Biochem. Mol. Biol. 2003. Vol. 33. P. 197-208.

165. Yu X.-Q., Kanost M.R. Manduca sexta lipopolysaccha-ride-specific immulectin-2 protects larvae from bacterial infection// Dev. and Comp. Immunol. 2003. Vol. 27. P. 189-196.

166. Yu X.-Q., Zhu Y.-F., Ma C., Fabrick J. A., Kanost M.R.

167. Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma// Ins. Biochem. And Mol. Biol. 2002. Vol. 32. P. 1287-1293.

168. Zhao X. , Ferdig M.T., Li J.r Christensen B.M. Biochemical pathway of melanotic encapsulation of Brygia malayi in the mosquito Armigeres subalbatus// Dev. Comp. Immunol. 1995. Vol. 19. P. 205-215.

Информация о работе

Крюкова, Наталья Анатольевна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2005
ВАК 03.00.09

Диссертация

Влияние паразитической инвазии на формирование клеточного иммунного ответа насекомых на примере личинок стрекоз рода Aeschna (отряд odonata) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы