Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние компонентов экстракта ядер печени на пролиферацию гепатоцитов

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Влияние компонентов экстракта ядер печени на пролиферацию гепатоцитов"

ТБИЛИССКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДРАСТВЕННЫЕ УНИВЕРСИТЕТ им. И.А.ДШАШВИИ

На правах рукописи

КАХИДЗЕ ИРШШ- ГЕОРГНЕВНА

т 576.312

=ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ ЭКСТРАКТА ЯЩЕР ПЕЧЕНИ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ ГЕПАТОЦИТОВ

03.00.11 - Эа«Зриологая,гасюаогая в цахохогия

АВТОРЕФЕРАТ длссвртации на сояскавяо ученой ставя кандидата биологических ваугс

Тбаааса - 1990

Работа выполнена в лаборатории биологии развития Тбилисского ордена Трудового Краевого Знамени государственного университета им.И.А.Дгавахиивили.

Научный руководитель: доктор биологических наук, члев-корр.

АН ГССР, профессор

Г.Д.ТШНИШВИЛИ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Ц.Д.ГЕДЕВАШШВШ кандидат биологических наук П.Р.КОРШ

Водуцео учреждение - Институт экснериаептальной морфологии си.А.Н.Натипвилн АН ГССР

Завита состоится 0 1930 г. в

часоб са заседании специализированного совета К 057.05.17 Тбвэ ласского ордош Трудового Красного Зпаиена государственного университета ш.П.А.Дгавахшвалп (г.Тбилиси, 580043, ул.Унивесагет-ская, 2).

С дассортацаой ыозхо ознакошгься в бпбетогоке университета

Автореферат разосгап

Учспый сокрзгарз сдоцяапаэированнэго соьога иудаз баологзчосйих паук,

доцолг

Н Ци.^ Н.П.Цппцчдзо

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность темн„ Каа известно,' з последнее sposm зсе бояеа четко складывается область биологии, изучающая процессы протекающие з органнэыа. Особенно большие успехи достигнуты в этой отяо-аении з исследовании онтогенеза sibothhx. Благодаря данным, полученный з основном при изучении гавоткых организмов, слогалась новая область биологии - баопогая индивидуального развитая. В пас-гояаеэ зря ия считается общепринятым, что одним из основных звеяа-93 пядивидуальяого раз ил км язгяется росг. к осногаоа форуоП рос-за - 2.3. пролиферативвый росг, прозсходядиВ sa счет разивогеная ЗЛ02О2. Такиа образоа, согеряенно цэ возыогао составэгь acamso об онтогенезе газетных,не пазя четкого предегазгепяя о закономерностях рагиногепия клеток я аонтролируезих проан§ерацаа адханизцов. Не удивительно, что пролиферация шгогов генетически обусловлена и извогда se прошсаот а пэ отстав! os гэавтпческа гадашой гатеп-спвностя, поскольку нарупение рэгузлдшз клеточной проппферацая приводят в развитии сарояого сяокгра сатоаогаО, среда погорше одно пз значительных пост занпмапт злогачееггеппцэ новообразования. Клаточпая пролиферация предетаввяаг собой одзп пз nsneCnns коа-аоаэязоз рзгэнерацпя органов а тзапзй. Czasosasensao, пэучепзо арола§9рацпа гаеет п бозэтоо правгадзов зпачегпо.

В састопцоо вреш сссбоо вшкапав удаяяагеп jpcsangnsi срод-еэгаа рэгуаяции пролиферация кпегоз. ïïuaeïcn бозасая гзэоргура по поводу как росг-сниуяаруЕцах, газ -ппгпблруггдах <£акгороп; Однако, sota существование зох а другях бэсспорао, о механизме их . дэОствия, г^иической прзродо и о sou, s casas агэпьях рзгуяящш принтапг они участие, сведения озяадь пз полоз. Соворзонно очевидно, что паадое новое иссдедогагше в азой сбиастя прзбгягавг гас в поставленной цела. -------

Целыд задача псследовання. На прогягзняа ряда аог, паряду о росг-тораозяцииа вецествама, так назыгаешаа "поAsonara", а такгэ с роотовииа фактораии, ассдодогагась ядорзш росг-ангзбирувщпа фаз то pu (Тукаяишмм.Салаиатнна 1968} Гогсадзо 1973,1977; Саяаиа-запа 1975; Туцаняявиня а др., 1581,1990). Установлено, что ядерный эзетракг а ядерная фракция в опытах in vive тораозят пролифзра-цпэ гouотипичных клегок. Ядерныа ингябирущяы ведестваи праписы-заотся определенная функция з регуляции размноаения клеток, однако пет даза сколько-нибудь аазераэтшх теоретических соображений о рода этих веществ а контроле роса органов а тканой. ЧрвэьычаЗ-

no скудны такаа и сведения о химической природе ядерных факторов.

Целы) настоящей рабогы было: I.разделение ядерного эксгракга (ЯЭ) на компоненты, в предворательной форие; 2.выявление фракций, характеризующихся рост-регулирующей активностью; 3.исследование действия отдельных подфракций и их комбинаций на пролиферации;

выяснение вопроса о том, какие фазы клеточного цикла являются точками приложения для действия росг-регулирующих компонентов ЯЭ.

Научная новизна. Впервые проведено разделение ЯЭ на составные части (белки и РНК). Установлено действие каггдой из подфракций, а такгге их комбинаций на пролиферацию гепатоцитов мыши ¡n vivo . Показано, что ЯЭ содержит как рост-тормозящие, так и рзст-сюиулирующие компоненты. Установлено, что отдельные подфракций в ряде случаев действуют на пролиферацию гепатоцитов совершенно по иному, чей их комбинации. На основании этого делается предположение, что в регуляции пролиферации приникают участие не отдельные (чистые) факторы, с их комплексы.

.... Показано, что факторы ЯЭ влияют на все фазы клеточного цикла.

Предлагается новый способ определения пролиферативной активности в изменения длительности фаз клеточного цикла.

Практическая значимость . Настоящая работа в основной представляет собой фундаментальное исследование. Вместе с той, она включает в себя несомненно прикладную перспективу. 11 ожно одидать, что полученные данные найдут применение,главный образом в медицинской практике, поскольку на их основе могут быть разработаны новые средства управления процессами роста органов и тканей. Таким образом, цокот быть подучена возможность вмешательства в такие процессы как закивлепие ран, регенерация поврежденных органов и др.

В ядерном соке саии обнаруаены факторы обеспечивающие как по,-лосятольпув, так в отрицательную часть регуляторной цепи управление процессами роста.

Особенно вааяоа значение могут приобрести эти данные в связи 4 ворршздзеП нерогулвруваого роста, каковши являются алокачесгвен-ша обрагосашш.

Аяробаиш работа, llaropcacu диссертации были доложены ка конференция t посещенной ЗО-aesas оо дли основания лаборатории биологии раевпгия Тбилисского государственного университета "Пробле-иы баоаогяз раоЕшт" (Тбилиси IS33) н ка обьедапонпои заседании вабораторяв биологам рааытяя и кафедры цзтолопш, гистологии и вибраологнз TUS (IS89).

Публикации. По теме диссертации опубликовано h научных работ.

Структура и объем диссертации.. Диссертация состоит из введения, четырех глав, содержащих 29 подглав с изложением основного материала, заключения и выводов. Работа излояена на 85 стр. машинописного текста, иллюстрирована 20 рисунками и одной таблицей. Список литературы насчитывает 1ЛО наименований, в том числе joo иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Опыты проводились па белых беспородных, половозрелых мызах. Для получения пролифернруияей популяции гепатоцитов проводили частичную гепатэктоыию.

В экспериментах с изучением влияния ЯЭ и его компонентов на ©¿и â фазы, их вводили через 24 часа после операции. Материал брали через 3, б, 10 и 15 часов после введения испытуемых веществ. За час до взятия материала вводили 3Н-ишадин в количестве 60 кБК на грамм веса (1.5 мкК/г).

Изучая G3 фазу после воздействия этих se веществ, их вводили на 48 час после частичной гепатэктоаии, на 49 час вводили колхицин I мкг/г, а материал брали на 52 час.

Во всех опытах^ з те se срока брали материал из контрольных (гепатактомированных,по без введения компонентов ЯЭ) групп яивот-пых. На каждую точку,аз каждой группы брали не иенее 5 гавохных.

ЯЭ получали из ядер, выделенных по методу Хогенбума. (Hogan-Ьоото atol, 1952"), выдерживая их в 0.14 UJ/aCI в течение часа.

Фракционирование белков проводили с помощью сульфата аммония (Cüoync 1985). Предварительно из ЯЭ, I% раствороц проташш-сульфата удаляли РНК (Chambcn ai a Ц1971). В опытах использовав ли фракции белков (ФБ) иеаду 25-35%, 35-45$, 55-75% п 75-90% насыщения сульфата аммония. Наддув фракцию вводила соответственно эо содерналив з 0.5 ыл ЯЭ.

РНК па ЯЭ выделяли горячим фаподышу методом (Наппатис 1985). Высокомолекулярную (B5IPHK) а назкоиодекуляряуо (НУРНК) РНК разделяли добавлением к раствору чистой тотальной РНК J/eCI до конечной концентрации 211. Все операции, вав яра выделении, так и при фраяциоаирмании РНК проводились в Зеэ-РНКазноа посуде в присутствии поливинялсульфата.

Интенсивность включения 3Н-тимадеяа определяли сцпнталяциоа-яыа иатодоа.

- G' -

Dpa авЕорадаограшачеокоЬ определении индекса иочекых ядер применялись еиульсии типов "L"1 и "IIP-2Hn. На автографах для каждого случая считала по 5000 ядер и высчитывали индекс печеных яд-ор в %а в s %,< ох контроля. Колхкцкновий ииготический индекс просчитывали на препаратах изолированных клеток (Бродский в др.1983).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫ! ИССЛЕДОВАНИЙ

Определение относительного изменения длительности CV¿ и Л Фаз. Определение длительности фаз митотического цикла проводят с поповы» построения кривых печеных ыитовов {Qua^f ler, £hcмпеп, 1959; Гуцин 1975) и кривые насыщения (Дондуа, Довдуа 1964; Гущин 1975). Но кривые насыщения па aas? возиохшостн определить длительность %фазы. По кривой печеных иитозов это теоретически возыошо, но практически - удается но всегда, поскольку требует немедленного вступления клеток в следующий ииютический цикл. Кроме того, ати методы пригодны лиаь для определения длительности фаз цикла в асинхронной популяции клеток. В случае га парасинхронных популяций, получаемых после частично!} гепатэктомии, определение дли-тольпостп фаг патетического цикла пвБОзаоаю. Вместе с теы оба исхода требует бопьпого вонвчеетт штериала, что является еще одош пропйтехшеа двп kz прпцопешзя пра изучении действия нескольких еошопоетов НЭ.

Исхода па этих сообрааепий и в иду того, что предполагалось определять anas относительное bsiíohoiiec длительности едз по отно-вешш к контролю, ранено было использовать определение кодхицвво-вого ииготического индекса (КИИ) для иаучепяп изценешш длитель-постс ,&а фазы с дпсашвп пндовса цечопых адор (ШЯ) дна -& фаз. Определение динанакв изиеаепия ИМЯ и Ш усе приценялось ддп исследования пролифератввноВ активности и приблизительной оценки пзиепешш длительности иитогаческого цикла.•( Тушшиивишз, Caлапатипа 1959,Туманиввиви п др. 1981; Строева в др.,1984,Туиа-ni:овала в др.,I9SQ, ©-clfani, 1977.)

Но сак известпо,ШШ такш,^к п Ш указывает па количества клеток» находящихся в конкретной фазе. Известно такш>,что tili не всегда является показателей интенсивности пролиферации,так как iisueneifflc длительности саиого вятоза приводит к ивменешт количества клетоа,находящихся в пей (Дондуа,Ефремов 1974). Сведова тельио а только ИМЯ не позволяет судить пи об üetöbchbeoctz про-гаферац£а,ш5 об вавоаашш времена фаз като&а.

Поэтому, в сочетании с подсчетов ШЯ мы определяй! интенсивность синтеза ДНК. сциатилляцаонныа кетодоа. Но последний величину правильнее назвать суммарной иктенспвносгьа синтеза ДНК (СйСД), поскольку она зависит как от скорости самого процесса, гак и от количества ДНК - синтезирующих клетоз. .

Для облегчения восприятия и интерпретации экспериментальных данных проанализируем несколько теоретических случаев определения изменения длительности С^и В фаз по кривым ИМ и СИСД для асинхронной и парасинхронной популяций.

Для упрощения схемы рассмотрим асинхронную популяцию, где общее количество клеток намного превосходит количества клеток в иито-тическом цикле а не будем учитывать неравномерность распределения по миготическому циклу показанное Дэндуа и Дондуа (ДондуаДондуа. 1964).

Следовательно выбранная нами популяция представляох собой равновесную популяции. Примем такяе, что исходная длительном* фазы равна 10 часам, а 4» фа5ы - б часам. ..

Допустим, что какое-либо воздействие вызывает равномерное, двукратное ускорение всех процессов, прогеяаваих в фазе. Эгэ естественно, вызовет укорачивание этой .фазы, пропорционально ускорению процессов. Поэтому в единицу времени из фазы в $ фагу будет переходить вдвое больше клеток, чем з контрольной популяций. В го ге время, количество клеток, выходящих из 3 фазы до определенного момента остается на коятрпяьиом уровне. Очевидно, что в Л фазе в опытной популяции будет происходить наколленнег к легок е ШЯ определенный в каждый последующий коаенх будет больпе, чей ь предыдущий (рис. I). Параллельно повысится а СИСД. Здеоь зе па-до отметить, что скорость вхоядевия кгогсз в Л фазу осгзагся постоянной. Поэтому накопление «веток в & фазе будет продолжаться до момента, когда всо злеткп пераоначальзо находящиеся з фазе перейдут в й фазу.

С этого момента ИМЯ остается неизменным в течение времена

ЗЛИТ^ЛЬИОСТИ//

равного абсолютному значению разности аервояачааьнМ а узорочеа-ной длительности % фазы, Поело чего количество але:ох в фаза аачинает уцепьаатвая до контрольного уровня за промежуток времени, равный длительности фаэы. Спаг кривой обусловлен тем,что аз М фазы начинается выход тех клеток, которые яаходзлись в О., фазе з 0-ой моаеат. Следовательно, количество внходяцах аз £» Фазы клеток вдвое больве, чем в контрольной популяции, тогда как количество поступающих в фазу клеток одияакого. Ваесте с ИЫЯ

происходи в ссод СИСД. Обо величина будут оставаться на контрольной уровне вплоть до восстановления длительности '¡азы.

Рве. I. Относительное изменение ИМЯ в СИСД при укорачивании Оt фааыСв i раза). Здесь и на всех последующих рисунках обозначения ИМЯ - салопная линия, СИСД - пуна-тир.

Поскольку в рассматриваемом случае количество клеток находятся в Gj, фазе пропорционально ее длительности и вдвое меяь-ие, чей в контрольной популяции, восстановление длительности Gt Фазы вызывает умеиьаение количества клеток переходящих в $ фазу. Соответственно кривые 1ШЯ в СИСД понижаются по отноиение к контроле, достигая 50/4 через проиехутох времени, равный длительности $ {азы. Далее, оба параметра остаются неизменными в течение времени, равного разности длительности Gj и & фаз. После чего кривые этих параметров возвращаются в вонтрольному уровни.

Удлинение Б) фааы соответствует замедление протекающих в ней процессов. Следовательно в единицу времени из G^ fc зы в S фазу будет переходи» вдвое неаые клеток, чем в контрольной популяции. Таким образоа sen ситуация могло представить, как обратную, чем в случае укорвчен:;ой ф«зи в кривые ИКЯ в СИСД являются ¡сак бы зеркальным изобрааенкеа кривых полученных при укорачивании ¿азы. Разшгаа сссгсзэ sse& в *cat ч*о see огрезка кривой увеличат* в соответствии с даительпсстяка фаз мимического цикла.

— э —

Укорачивание & фазы ийчто нвое, как равнозеряоо ускоренно синтеза ДНК в каздой клетке, что соответствует аролорцаопальвозу увеличению СйСД. Прн этом количества клеток, выходных аз 5 ¿азы будет больше, чей количество клеток входящих $ фазу (рис.2), что в свою очередь вызовет уаеньсешае ШЯ. Пропорциональность неаду длительность!) укороченной 0 фазы в количеством находящихся з вей клеток восстановится з тот момент, когда все изначально находаввп-еся в S фазе клетки выйдут аз нее. Следовательно скорость уменьшения ШЯ и его величина в указанный момент вроаорцнояаяыш:. укорачивании & фазы. С этого момента устанавливается равновесие мевау количеством входящих а выходящих клеток, что выраязется выход оа кривой ЛЫЯ да плато и продолжается до того временя, когда воссгававет-вается длительность ¿7 фазы.

Рпо.2. Относительное измененао ИМЯ а СИСД при укорачиаа-вна д фаэы(Э 1,5 раза).

Уигаьавнза количества клетов в й фазе вызовет в уменьяеняв СИСД, который 2 моменту выхода хрзвоэ 1ШЯ на агаго, где аоанчес-тая влетая находящлхся з 2 фазе обратно пропорционально ввтепевв-яоет." сантеза з гандоЗ яз впх, достигает контрольного уровня.

ГЗозент восстаноаяеппя дап-гельаосга $ фззи отазчаеггя рзз-ани поназзеазеа граооа ШЯ п гагь-зейапа, параялелышз повыгепаез до контрольного уроваа.

Прз удлиненна £? фаза крзвыа ИМЯ п СИСД саять-гакз прздетаззя-от собой зеркальное, по растянутое во временя изображала этяя ярз-вых пра укорочешга 3 Фазы.

Прз одновременном нзмевевиа длительности п 0 фаз арзгнэ 1ШЯ в СИСД будут ааеть более слошюЗ вад, па-га калаавнап прзго-деаных графиков друг на друга.

Ясно, что в случае параевнхреняой аодуагша клеток,не аогут быть полечены абсоаптно стандартные крзвые. Фораа кандэго отрезка обуславливаются я&лячаеэ ала отсутстваеа з данноа отрегне аре-

4

/St

too

so

' ' ' 1

3 6 й /о 'Л и

иени, группы клегок переходящих э & фазу. Вследствие этого краткий анализ криьых будет дан длл накдого случая по отдельности. Для более точкой квтерпретац!;.* данлах, гребуется знание распределения клеток входящих £ фазу а тсчзияе всего опыта. Распределение клегок легко определить по контрольной кривой ИМЯ в абсолютных единицах. Обязательно учитывать значение ИМЯ в момент введения изучаемых веществ. На схемах представленных для каждого опыта дано распределение клеток находяздхся в $ фазе в момент введения веществ, клеток находящихся 8 С^фазе,а также нанесено время до их вступления ¿> фазу.

Экспериментальные данные по изменению длительности и £ фаз иитотического цикла под воздействием• ЯЭ и ого компонентов

Результаты различных опытов с введением одного и того же компонента ЯЭ хорошо совпадают друг с другой. Но вследствие парасин-хронносги популяции и необходимости приведения схемы распределения клеток по фазам, з контрольной популяции приводятся линь данные по одному наиболее полному опту для каждого случая.

Введение ЯЭ. Из литературных данных (Туманишвили ,Салаиатииа, 1%9;Колотова и др., 1978) известно,что ЯЭ задерживает пролиферацию клеток.Но для выяснения его влияния на длительность отдельных фаз иитотического цикла было решено провести дополнительные исследовании. На рис.3.1а представлены кривые ШЯ и СИСД относительно контрольных величин. Параллельное снижение обоих параметров указывает на удлинение С* фазы.Понижение кривых показывает,что произошло удлинение фазы в 1,5 -2 раза. В том случае если фаза уди-яйлееь-бы разномерно, кривые ИМЯ и СИСД уже х 10-му и 15-му часу поднялись бя к контрольному урозню,как это происходит для соответствующее теоретической кривой. В рассматриваемом же опте отличие реального графика от теоретического, может быть объяснено лишь неравномерным удлинением ©¿фазы, когда ее первая половина удли-акатся снльаее.чем вторая (рис. 3.16).

Заедание ТВ, Представленные кривые ШШ и СИСД на (рис.3.2,а) характеризую: воздействие ТЕ ЯЗ. Поскольку влияние ТБ изучалось, в тон же ояыгеуко и ЯЭ естественно, контрольная кривая распределен «сеток'в 5 ^азах'то же, что на (рже.3.1.6), Соотношение .вепачвн в С ИОД уздзизает на удлинение £ фазы приблизительно

в к раза. Удлинение 3 фазы кратковремеаво п восстановление ее дла-ie льноста происходит уке к б-uy часу. Для объяснения необычно быстрого подьеиа и спуска кривой ИМЯ, надо опять прабегяуть в схеме распределения клеток (рис.3.2.б). Из этой схемы видно, что в контрольной популяции,большая группа клеток, находящаяся в конце $ фазы к 3-му часу успевает выйти из нее. Удлинение & фазы под воздействием ТБ вызывает задержку в U фазе больней часта клеток этой группы. Сдедсгвиен чего является быстрый подъем кривой ИМЯ. К 6-му часу, из-за восстановления длительности & фазы вся группа клеток выходит из нее, но этии нельзя объяснить падение кривой ¡ШЯ нихе уровня контроля. Следовательно, одновременно с кратковременной удлинением S фазы происходит и удлинение Gj фазы, но более продолкятельное. 11 в то время, когда в контрольной популяции из ¿азы переходит вторая большая группа клеток происходит относительное падение ИМЯ и СИСД в опытной популяции. Дальяейаий хо незначительный подъем этих кривых отражает постепенный переход этих клеток a S ;аэу.

. ' «/ Z

Рис. 3. Относительное изменение ИНЯ и СКСД под воздействие« НЭ (1а), ГБ (¿а) и распределение клеток находящаяся э &t я £ Фазах в контрольной популяция (16,26).

Введение ФБ 35-45. Действие ФБ 35-45 выражается в укорачивавши Од фазы.Клетки контрольной популяции (рис.4.1.6) до 10 часа по своему рарпредедению представляют собой почти идеальную асинхронную популяцию, в если бы не большая группа клеток вступающая в й Фазу к 15-му часу, «огно было бы воспользоваться схемой представленный на (рис.1),хотя первая половина графика все же должна соответствовать упомянутой схеме. Следовательно укорачивание б^фааы происходит в 1,5-1,7 раз. Спуск кривых ИМЯ и СИСД к 10-му часу соответствует спуску кривых ИМЯ и СИСД (рис.1.),но долхен быть вызван несколько другими причинами. Большая группа клеток расположенная на схеме мевду 15 и 10 часами в условиях укороченной (?£ фазы должна была вызвать повышение кривых х Ю-иу часу опита. Отсутствие подобного подъема указывает на то, что ускорение не распрастранилось на данную группу.

6

Рис.4. Относительное изменение ИЪ'Я и СИСд под воздействием ФБ ?5-45 (Ха), ФБ 45-55 (2а) и распределение клеток по п ¿Г фазаа в контрольных популяциях (16,26).

Введение ФБ 45-55. ФБ 45-55 вызывает кратковременное укорачивание % фазы лли укорачивание второй половины фазы (рас.4.2а)

Сравнение действия ФБ 45-55 а ФБ 35-45 казодзт т нысдь, что в данном случав имеет ыесто именно кратковременное укорачивание фазы, которое вызвано действием одного и того ае белка, неравномерно распределенного иежду зтиия фракциями. Резкие подъем кривых к 15-му часу должен бы» объяснен стимуляцией перехода из G«s ^фазу, поскольку распределение клеток представленное на схеме (рпс.4. 26) не дает возможности какой-либо другой интерпретации.

Введение ФБ 55-75. Действие ФБ 55-75 почта диаметрально противоположно действию ФБ 45-55 (рас.5а). Поникание вривых до 6-го

часа еклпчитольно указывает па удлинение Sj, фазы. Нескольдо не обычен подъем кривых ИМЯ к IO-цу часу, т.к. даже при кратковременном увеличении б^фазы аодъеа кривой должен быть несколько позже. Форму кривой ИМЯ полученную з данной опыте моя-но объяснять удлинением самого конца фазы пли неполным блоком перехода. В обоих случаях будет проиоходв» накопление клеток. В первом скучав при восстановлении скорости прохождения клетками конца Gi фазы, а во второй случав - в точке блокирования.

Понижение кривой к 15-му часу можно объяснить только задержкой вступления клеток в иитотическай цикл.

Разница уровней кривых

Рис.:. Относительное изиенение ИЫЯ а СИСД указывает на нез-ИМЯ и СИСД под воздейст- « .

внем ФБ 55-75 (а) и рас- пачигеиное удлинение S фазы.

пределение клеток в кон- , . Введение тотального РНК трольпой популяции.(б). яз> расхоадваИ(>

кривых ¡5УЯ я СИСД на рас. 6а укааызает на 20, что введение тотальной РНК вызывает удлинение S фазы, с постепенным восстановлением ее длительности. Зз соотношений величин ИМЯ а СИСД видно, что длительность И фазы к 3-му часу увеличена в

¡su

/99

Л

//

S.tfaa, * 6-му часу в 4 раза и к 10-му - только я 1.3 раза. К 15-му часу длительность £ фазы практически восстановлена.

Но а случае описанного изменения длительности $ фазы ■ приеденного распределения клеток (рис.66) кривая имела-бы яесколько другой характер. Внес» спуска кривое ИМЯ к 10-му часу, мы должны была иметь плато с последующим спуском яа 15-й час. Полученная хе криаая говорит о параллельном удлинения G4 фазы не менее, чем s 3 раза.

Введение ВМРВК. Действа« ВМРНК мокло рассматривай, как кратковременное удлинение Gt фазы в течение 3-х часов, с одновременным удлинением % фаги, которая увеличивается в 1.3 раза (рис.7.1а)'

Введение НМРНК. Введение НМРНХ вызывает удлинение ©tфа-сц не менее 3-х раз и длится до 10-го часа включительно (рис7.2а).П01Ыпениб ИМЯ и СИСД на 10-й час вызвано именно удлиненней Q¿ фазы a эапаздалым переходом больной группы клеток (рис.76) Заэу, в то время как, в контроле они ухе миновал» се. В данном случае высокий уровень кривых ИМЯ и СИСД isa 15-й час может быть объяснен только стимуляцией перехода лзетоз из G® » Фа&у, при условии, что удлинение

фазы распросзроняется только на клотки находиввшеся в ней в начальный иомэат.

Введение Ь¥?НК вмести с Чей (ШМКУ1Б), После взедепин ШРНК+ ТБ, кривые Ш с C!¿S3 a хеедша С часов воходягся на контрольное уровне я паралгаг-ака ü IO-ггу часу, что указывает ва

удлинение перэоа пс.-.о. Сзд §лэз.(рс.8.1&). Как видно удлинение

Рас.6. Относительное изменение ИМЯ и СИСД под воздействием тотальной РНК и рас-праделение клеток г контрольной популяции (б).

распространяется только ва клетки асходво находящиеся з О-^фазв.

t ^

Рис.?. Относительное изменение ИМЯ а СИСД поз воздействием ВЫРНЕ (1а), ДШРНй (2а) в распределение влетов з контрольной по-пуляции(1б,2о).

Ваедениа НМРНК+ТБ. Сальное, синхронное повнаенив значений ИМЯ и СИСД с 3-го часа явно является следствием сокращения длительности &1. фазы (рис.8.2а). Сложнее понять причину небольшого а недостоверного понижения ИМЯ в 3-му часу. Подобный ход кривых монет иметь место при: кратковременном укорачивании £ фазы; укорачивании в* фазы только с точки соответствующей 3-ыу часу; .кратковременной блоке перехода из в* в £ фагу. Но сравнение о результатами параллельного опыта, не приводящимися по ранее указанным причинам, дает возможность исключить как укорачивание 2 фазы, так а блок Следовательно 5ШРНК+ТБ укорачивает ©^ фазу, но не

влияет ЕЕ ез конец. . . • .

Изманатаз ЕШИ под воздействием ЯЭ а его компонентов. Па диаграмме (рис.9) представлены данные отражающие действие зояпонея-тов ЯЭ на фазу. По характеру действия их можно разделать на

- к -

% ISO

юиг^жг^к-----

SO

t»

iS X.

tS /i « >

Рис.8. Относительное изменение ОДЯ и СИСД под воздействием ВЦРНК+ТБ (1а), Ю4РНК+!"- " " контрольной популяции

ВЦРНК+ТБ (1а), Ю1РНК+ТБ (2а) и распределение клеток в (1о,2б).

три групп": I.Компоненты вызывающие удлинение С^ фазы. К таковым откосятся ЯЭ, ТБ, ФБ 25-35, «Б 35-45, тотальная РНК, ВМРНК+ТБ, HliPffiC+ТБ, НМРНК+ФБ 35-45, НЫРИС+ФБ 55-75. 2.Компоненты вызывающие укорачивание Gj, фазы. К ним откосятся ФБ 45-55, ФБ 55-75, НМРНК и Ш1РШМБ 45-55. З.Конпоненгы но действующие на Ga$a3y. Это - ФБ 75-90 и BUPHK.

Поскольку мы имеем дело с парасинхронной популяцией, примененный метод дает возможность установить лиаь направление изменения длнтздьности С^фазы. Определение ге степени удлинения или укорачивания но представляется возиошш. Применен. ый метод накладывает еще одно ограничение, не позволяя сравнивать антэасиЕноста воздействия разгачша зоазовзйгов в отдельных опытах.

ОГСУГДЗЯНЕ РШлЬШОЗ

В первую очереди ьадз вэдчвриаз» рост-рогулирувщие свойс-

№ ГО

ПШ

kSc W.

iCO

so

□

Он

m

SD

D

а

SO

IE

1 3 2

f Sbl &9fO

U Ii /5 \h

lf!6

Рис.9. Относительное изменение ¡Шй под воздеЯствиеи:ЯЭ - I, ТБ -Z, тотальной РНК - 3, BUPHK - 4, НЙРНК - 5.П. ФБ 25-35 - -б! ФБ 35-45 - 7, ФБ 45-55 - 3, ФБ 55-75 - 9. «Б 75-90 - 10, HSPHK+ФБ 35-45 - 12, НЫРНХ*Ф5 45-55,- 13, ffläPHKtOS 55-75 -14, BUPHKtXB - 15, ЮШйиТБ - 16.

тва чистой РНК, поскольку таковые не была известны по сей день.

Тотальная РНК п ТВ, такае как я ЙЭ проявлявг только росг-тормоэящиа свойства, во дальнейшее разделение выявляет п наличие рост-стниулирующзх веществ.

Фракции белков полученные па Т5 действуют на гее фазы гаготического цикла, но по разному. ©Б 35-45 и ФБ 45-55 вызывают укорачивание {^фазы, а ФБ 55-75 ее удлинение. ФБ 25-35 а ФБ 35-45 удлиняют % фазу, а ФБ 45-55 а ФБ 55-75 укорачивав? ее. Влияние на 0 фаэу у фракций белков гырагено слабо в ФБ 35-45 изивает сэ укорачивание, а ФБ 55-75 - удлиневво. Одинаковое дейсгвае соседствующих фракций обусловлено распределение:! иеязу шиз одетх а тех ве белков (Сяоупс 1385). Свойстп проязляеные фрзкциеа беззоз показывают, что ангабированве в ствцуяяция во всех фазах вызывается разныав белкамп. Следовательно в ТБ имеется по ярзйлеа вара б Факторов непосредственно влаящих па янтенсзвность пролиферация.

Но сравнение действия фракций белкоз а ГБ показывает, что количество белков учавстзуюдах в регулядан длзтельяоегя изготя-чесхого цакга долзао бага бользе, а ах ззаииодеЗстзая достаточно

сдоены.

Действие ТБ па и ^фагы, с их удлвнениен значительно сальнее, чей доявно быю быть при простой суштции свойств фракций.

Бе менее яятсресно взаимодействие конпонентов РНК иекду собой, в с белковыми фракцияыя. Тотальная РНК нягибирует процессы во всех трех фазах, но только в случае &t {азы его ыоаяо объяснить дейсгвиеи HUPHS. Удлинение S фазы вызываемое тотальной РНК ванного сильнее, чей при введении ВМРНК. Удлинение se Ог фазы являет приивр парадоксального действия, так как ИМРНК укорачивает ее, а ШРНК не влияет на длительность Gt фазы. Парадоксально и влияние НМРНК+ТБ на фазу, а также действие НМРНК+ФБ 5S-75 на $аву • В первой случае объединение двух ингибиторов вызывает стинудяцнп, а во второе - два стииуяятора вызывают ингибирование. Таеш образом комбинации конпонентов ЯЗ йогуг усиливать или попять их свойства. Есть в случаи нейтрализации действия. И ТБ и тотальная РНК я БУРНН удлиняю?Я Фазу, ао аи Ш2РНК+ТБ, ни НЫРЯК* ТБ, та цеяьяый ЯЭ во меняют ео даиюльяосгз. -

Теоретическая модель влияния ЯЭ и его компонентов» Для объяснения непростого взаимодействия когяовевтов ЯЗ, яопытаеися аос-троить упроцеппув гоорогичвскуп модель.

Самые слохашо с ивогообразше взноиоквя свойств вводимое коипонентов вабввдавтся а случае G^ фаги а позтоиу czcua с ииня-иаяькыа вовачествон фавторсв, веобходг1Г^х для обьпснопия этих вз-иеиешШ, будет представлена полвостьо.

ПодробвыА атшя данных показывает, что описанные вше изив-яеяия действия требуют существования посих факторов, аеяосредс-твенво so влияющих ш длительность цятотячасвого цикла, но' опосредованно учавствующих в ео рагуияцип.

Допустим, что во фракциях белков присутствуют: фактор стину* дирущпй процессы в Çj фазе (С), фактор яигибируюздв их (И), кофактор рерэводяциа пнгмбятор s оягввяоа состояние (КИ) я еще три ^автора %, % и Б-. КН и G прз фракционировании разделяются, поэтому il переходаг в сеактявяоа состоявио. В ВМРКК каходятся spa фактора , ВР& п Ва в ННРНК - п Я%. Имеется еще фактор Р, распределенный иодцу ВДРНК a НЫРКЕ, по бодьвая ого часть находятся в ШРНН. Дояустш таяео, что рзгуазцзя длительности фазы осуцествшшгся воздействием га;» ш трл процесса п пазозеи ях догешашп фзруоагаш (ЭпЭ, Saîj s ЭаО функционируем ва

протяЕонгя всей ^ Фэси, 32% - с nçpcoj еа яолоино, а Эн©а - во сторон.

Находящиеся з ТБ, С и И действуют на ЭеФ, ао ввиду преобладания И, происходит иягибирование и равноиерное удлинение С^ фазы» При фракционировании ТБ, И переходит в неактивное состояние в проявляется действие С.

Влияние ШИК, НЫРНК и тотальной РНК обусловлено наличием фактора Р, влияющего на ЭнФа и ингибирующего его. Количеством Р определяется сила воздействия тотальной РНК и ее фракций.

При введении комбинаций ТБ с фракциями РНК осуществляется взаимодействие находящихся в них факторов. Б4 в комплексе с НР^, а также Б3 в комплексе с ВР4 переводят И из активного в неактивное состояние. Б,, нейтрализует фактор Р. Вследствие этого НМРНК* ТБ вызывает стимуляцию первой половины фазы. При действия ВЫРНК+ТБ проявляется слабое ингибирование ЭнФ| {актором ВРЛ;

При введении цельного ЯЭ ингибируется все три процесса га счет нейтрализации комплекса фактором В?3 а комплекса

фактором НВ^.

Объяснить влияние компонентов ЯЭ на фазу можно прв помоща аналогичной, но более простой схемы. В действия же на фазу есть один несколько отличающийся момент. Объяснение вливния РНК требует наличия некоторого эндогенного белка, который в комплексе с 01РНК является стимулятором. В таком состоянии открывается активный центр для присоединения ВКРНК, но его присоединение превращает весь комплекс а янгвбитор.

Ц Щ! ^ и в щ

1-*—I-*—^—

I \ х N ч

/ >-N1 V ч

Лс V

\ {сш Уч/

—V-\ -Д^--,

ййй й к й'

Схема влияния компонентов ЯЭ на е^Фазу.

го -

. Обнап характеристика еязяния рост-регулирурддах вевесгв. Схема действия ЯЭ а его компонентов является лишь упрощенной иоделыа в во но&от выявить« es количество реально участвующих факторов, пи клеточные структуры, ва которые влияют введенные вещества. Но виесте с теп, сопоставление это« схемы с нагими и имеющимися в литературе экспериментальными данными дает возмокность сделать некоторые обобщения.

Схека действия компонентов ЯЭ потребовала допущения одновременного существования непосредственных ингибиторов и стииуляторов роста, клеточных факторов мааевей, веществ нейтрализующих действие рост-регуяяруваих факторов,веаеств усиливающих их действие,а так-s3 bChCcís кеяяющих действие рост-регуяирующнх факторов на противо-полсвяре.

Единовременное присутствие s ткава разнонаправленных рост-ре-гуяврувщвх факторов во является чеа-нпбудь новый, признается всеми вссяедоватеяяш а показаю экспериментально (Гогсадзе,1973,1977; Саяаыагкна,1975; Туиавиавали,Гогсадзо,1981; Туваниивилн » др.,1990).

Хорово взвество с валично кяоточвых рецепторов, эбнаруяенкых,

ДЛЯ многих вецеств, В тон ЧИСЛО О ДЛЯ РОСТОВЫХ фаКТОрЭВ (Fabricant

«rf аЦ 1977;Кв\21вгс^аЦ I97á¡^t^u^h\tneci«t,i98g). Надо отмотать,что покязапо esuesesso количества sîue рецепторов (Vfeilonborg ciel., 1989)

Es удпмтольво.что в патера ту ро по удается ваати даввыо о нейтрализации действия факторов, внутриклеточными веществами. Подтвор-едоезо частдчпой иойтраваоацан требует сравнения ваведомо разных состояния теаяа, a полеш ввВтралвзацая скорое ссого будет припсса-ва негодности вводоаого фактора.

Что касавтоя венововпя свойств фактора па прэтивополокное,то к таковы» и они о отпеста в со случал ияпзбзроваямя роста стимуляторами в стимуляции роста, ивтвазторана(Ввглв^Д982; #fa>re <Тегч}С£«£,1988;Ка1г<йвЦ 1988; V/ollanbcr«]ctet,I989). Во наиболее ярким прамероа подобаого взмеаевая свойств является двухфазное действно фактора вевроаа опухолей (©НО). Ингибитор пролиферации ОНО в шншх волцептрацзях стсаугзрует равиновепае твмоцнтов,а при повыаеввв ковдевтрацшз пвгвбпрует ого (EhrKcdcL, 1983).Подобное* явление ведьая обгясплть нваче, чем прасутствпеа небодьвого количества вецестг образувзего с ФНО стаиуяятор пролиферации, что и ярояв-аяотся прз шшх концентрациях ОНО. ПовыаеЕие коваеятрацив ФИО ведет к его накоавепаа в свободам состояяав.что обуславливает аерек-равасао еффекга стзнувяцза п прояаооЕио собсгвовпшс свойств.

В литературе встречается я факты взаимодействия вводящее веществ. Так яри совместном зведеияв ФНО-ав колояге- сямуяяруэде-го фактора -I наблюдается сянергячвсквй эффект стямуяяадя прожя-ферации макрофагов (Brennet«а,1989). Комбинация трасформяруюад-го фактора роста -1 я ФИО тормози прохяфераця» мяелоядяых жейке-мяческмх клеток (Kamijo 1990). В обоях сжучаях совместно«

действие факторов отличается от действяя каждого яакях по отдельности. Первый скучай является также примером,усиления действяж факторов.

Зсе приведенные экспериментальные даякые свкдетехьствувт о том,что два, а может быть я несколько факторов прм совместном воа-действиа могут вяяять как един фактор.

Взаимодействие факторов может бить следствии обравоваяяя ах комплекса, а также суммацвей внутриклеточных процессов, зыэвая-ных воздействием на разные рецепторы. В регуляции пролиферации допустимо наличие обоях иехаяяэмов о вяожяа возможно,что ояя могут действовать параллельно. Но,в некоторых случаях, надо отдан предпочтение существованию и воздействию активных комплексов.

Пря рассмотрении действяя кейяояов, было отмечен7,что ояя сохраняют ткалеспецифичное, рост-яягябярувцее свойство только а виде комплексов. Дальнейпая ях очястка приводят к потере ямя тка-оеспецяфячвостя а НоиЩэвО). Собственно, то хе самое можно

сказа» в о рост-стямуяярувчвх веществах. Осяовяая ях час» в организме представляет собой яядукторы в проявляет высокую тканеспе-цяфичяость.Нй выделенные в частом ляде стимуляторы уже действуют яа с оверлеям о различные ткаяя (&urden«t(d^I989), Надо допустить, что в в данном случае имеет место существование тканеспецяфячаого комплекса, разруваадегося во время его очвсткя.

Несмотря яа то, что в ваяях эксперямен?ах нет возможности судить о тканеспецмфичностя введенных веяеств, для объяснения acero многообразия действяя ЯЭ я его фракций, необходимо было допустить наличие сложных компхексов компонентов ЯЭ, явмевяюцмх своя свойства пря ях разделении.

Ножет показаться, что данному утверхдеяяю противоречат действие, вывиваемое чистой РНК. Но ямеяяо в эхом случае яе приходиться сомневаться,что РЕК может действовать ъ вятактвой ткаяя только в виде комплекса, поскольку в ЯЭ вся РНК ваходитм в комплексе с бея-ком ( Самарина 1%7).

Исходя иа выяесказавяого можяо заключить,что очястка рост-ре-гулирувдих веяеств необходима для установления ях состава а хими-

-ческой природы. При исследовании се самых процессов регуляции роста, как видно надо останавливаться на том этапе очистки,на которое факторы сохраняют все свойства присущие mi в еивой системе. Но и при исследовании вещества сохранившего свои свойства надо учитывать,что его действие зависит от состояния ткани реципиента и мо-sei быть изменено в любув сторону.

В таблице представлены характеристики влияния компонентов ЯЭ на фазы иитотического цикла.

х

ВВЕДЕННЫЕ К0Ш0-" НЕНТЫ ЯЭ ДЕЙСТВИЕ НА ФАЗЫ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА

• в

ЯЭ удлиняет удлиняет

ТБ У • : Д ' П С П я е т

ФБ 25-35 - - удлиняет

ФБ 35-45 укорачивает укорачивает? удлиняет

ФБ 55-75 удлиняет удлиняет? укорачивает

ФБ 75-90 - - -

ТОТАЛЬНАЯ РНК У д л н п я с s

ВИРИЕ ... ? д в и Ератковреимшо В Е 0 Г -

HUPHK удлиняет - . укорачивает

варнк+ТБ удлиняет 2 половину удлиняет

ЕШРНК+ТБ укорачивает ilnoaosnny удлиняет

Ш1РНК+ФБ 35-45 удлиняет

Ш2РЙК+ФБ45-55 укорачивает*

ННРНК+ФБ55-75 удлиняет

8 А ЕЛ В ЧЕй В В Врогодвашо лаш всследсЕаппл cgs рав доказала суцествоваша а ПЭ рэда Еодарзсгворзшх факторов, араипваюзпх учасгво в регуля-щш срогг^зраисл. Несиотрз пп so, чео cau ЯЭ подавляет пролиферации» се к вся прлсу 1'creyci1 веззства» часгъ ксторш: вызывает пйгпОп-

рованио, а часть газваог стимуляцию пролиферацшз.

Рост-регулирувщназ свойствами обладай? как балга, гак и РНК ЯЗ. Компоненты ЯЭ воздействуют па все исследованию на '¿а фаза т-тотического цикла & , ftj, ) иеняя их продолжительность в ту или иную сторону. Для каждой фазы цикла существуй, как стимуляторы, так и ингибиторы. Многообразие действия ЯЭ и его компонентов указывает на наличие довольно сложных комплексов. Помимо стинуля -торов и ингибиторов пролиферации з ядерной экстракте необходимо допустить присутствие двух типов факторов,одна из которых нейтрализуют действие рост-регулируищих веществ, а другие создавая комплексы с ингибиторами ала стимуляторами меняют присущие им свойства. Вследствие подобного взаимодействия монет происходить усиление влияния, а также изменение свойств регулятора роста на противопояоаноэ.

Из анализа литературных данных следуег,чго подобные группы факторов влияют и на известные рост-регулирующяе вещества, вызывая изменение ах свойств.

Пролиферагивная активность в каждой данной момент зависит от соотнояения ингибиторов и стимуляторов, от соотношения их рецепторов и от присутствия веществ нейтрализующих или меняющих свойства ингибиторов и стимуляторов. При исследовании регуляции росга, необходимо учитывать всю сложность протекающих з клетке процессов а взаимодействие упомянутых выае факторов.

Надо отметить,что в данный момент неиззестен механизм действия рост-регулпрувщих веществ ЯЭ, как а ингахгной ткани, так н прз их введении. Трудно сказать, как соотносятся компоненты ЯЭ с другими рост-регулирующими веществами. Но обнаружены клеточные рецепторы связывающие компоненты ЯЭ. Неизвестны причины локализации этих факторов в ядре.

ВЫВОДЫ

1. Экстракт ядер печени взрослой ишза содергпг водорастворлиыэ факторы, как подавляющие,. так в стимулирующие пролнферацзо гепатоцитоа в гепатзктомарованвых шгаах. Но цельный ЯЭ проявляет линь росг-ангнбарувцее свойства.

2. Дэйсгвующвмя компонентами ЯЭ являются в белки а РНК.

3.Тотальный белок ЯЭ и его фраацза s отдельности аогут згиять на интенсивность пролиферация геяатоцяхов, причем некоторые фрака-цви белков тормозят ее а другие стимулируют.

Подобным ае образом разные фракции РНК вызывав? взакмэпрэгсзо-пслозииЯ сффект.

5. КоибаянрованЕое действие различных фракций четко оишчаегия от действия зхих-аг фракций в отдельности. Иногда коиплеко в состаглкзцие его коаповеыты действуют взаииопротивополокныи образов.

0. 3 ЯЭ содержатся факторы, некоторые из которых непосредственно вдлшга на пролиферации, а другие воздействуют на нее линь опосредованно цешш свойства первых.

7. Полученные данные указывают на то, что роот-регулирующие факторы могут быть не какии-дпбо отдельный веществом, а коиплек-сои вецзств действующа как еданное целое.

Работа, опубликованные по теме диссертации:

1. Колэтова И.Д.,Кахадзе И.Г.»Саланатииа Н.В. - Изучение ииготи-чесио'л активности с пршленепиец колхицина и исследование характера вклйчеияя Зц-тшдгна в ДНК печоня куриного аародцша в разные чаек суток в аорас л дод хоздейотвиец ядерного экстракта. Уатериавы конференция молодых иедиков» Тбилиси 1978.

2. и'уаанаявялк Г.Д.,Салаиатина Н.В.,Гогсад8е ¿.¿.»Кахидзе И.Г., ТужшшЕили 'Х.Г.,Длаидиеря К.И. - Рост-ингибпрувдие факторы ядер печени, почю; я пагмевтлого эпителия сетчатки. Тезисы

IX всесоюзного сяилоаиуш "структура и функции клеточног ядра0, Чсраоголовка 1287,251.

3. Кахидзе,2уцанииш1и Т.Г. - Исследование химической природы фактора ядер почпзш шли. Онтогенез,1988,19,5,541.

¡Саихдзе й.Г. - Дейсгваэ белковых компонентов ядерного экстрак-га печен;: тин на. пролиферации гепатоцитов. Материалы конференция, посвященной 30 -детию со дня основания лаборатории биоло-Х'л& раамгйя 717, Т&шссл 1Э30- 23-24.