Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние колхамина на сегментацию параксиальной мезодермы куриного эмбриона

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Влияние колхамина на сегментацию параксиальной мезодермы куриного эмбриона"

СаНКГ-ЛЕХЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ЭЛЬ АЛИ Ыохэддин Шабан

ВЛИЯНИЕ КОЛХАМИНА НА СЕШНГАВДЮ ПАРАКСИАЛЬНОЙ

МЕЭОДЗРЩ КУРИНОГО ЭМБРИОНА

Специальность 03.00.11 - Эмбриология,гистологая

и цитология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учзной степени кандидата биологических наук

С^та-Сс-уорбург 1593

Работа выполнена в лаборатории экспериментальной цитологии Биологического научно-исследовательского института Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель - кандидат биологических наук,

доцент В.И.Е1РЕШВ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

в.алучюв,

кандидах биолотчесхих наук

н.сжшш

Ведущее научное учреидение - Институт цитологии

Академия наук Россия

Защита диссертации состоится а Я " ( 1993г.

в часов на ааседании специализированного совета Д 063.57.22 по защите диссертаций на соискание ученое степени доктора биологических наук в Санкт-Петербургской государственном университете по адресу: 199034.С-Летербург. Университетская наб.д,7/Э.Ьиолого-сочвенныа факультет, ауд.133. /

С диссертацией шяю ознакомиться в Научной библиотеке им .А .Ы .Горького С-Пбтербургсаого государственного университета

Автореферат разослан 8 ! 1 . * м ¡аОьлЛ 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Д Л .ОБУХОВ

ОЕШ ХёРШЕРПСГИКЛ РАШТН

Лстуааыюсть ¿вш.В 70-е гг.,в особенности после работ ДЛ523 (i Coo&s» 1373; 1975) .продеиоястряроваетпх прикцотиаль-пуэ воввогноеть Еорфоггиетячзетас двягзкий в ракнеи зибряо-ггаезе егфтбяя прп снасг7вяыгои подазлекяи клеточных деле-ггня.Еоегеггйко утвердилось представление, согласно которое шгетоетая репрсдуяпл либо вообще не принимает участие в кор-фэгзкзао, либо es утастаэ есодатсяг к всясиогателькой роет rrocraspsa клэ?о«зтого кетериала (Ефрзнов,1958; Балоусоа,1990) -

W—W. » W W ——» |<w«vi><v<i(vij»i< Wi *»

стпгзяа кэг-57 15озй^гдаея»ДЕйфзргпцязцгеа я мсрфогснеаск э nacrs£5ï22 грзпт всэ болЕггз ciTatrc:t::D прпсбретаэ? (ппдкзггготкнз) а спеет. Огргггхзтзы стой тсздектап стало êopirç-лгрогглпэ р."з по-то^гпггП о ?сх,к?о з разгарпяаила сяогкоя spoipsi^cï сгрфзгснегоэ п згйряскальноя дайфзрегшгггдет боль-псз ni;? s? &15:годоппгзсз:1я гзтсгогкноеть згето'здцх

спг7ю., сбусяослсягая состоянием некзтезя пролпфгрпцнхг г сргг^о ссгго кс^посгпщггз влетоюиг nenjrajç:« (Дзндуа, ISS3; ûnCTCSz.i»î5ît)) . Пел этом щкцзголагазгея.чго спецпфзса itotsa-погзз бгг?з сгестсгеснпоЛ sa дггКйргпцпаяьнуз чтесгеп-

ТСЛЬПССГЬ C0EC25î30C?en 5 p222GC5paГ2ЕМ KCpÇorS29-

сг-сз £Е5ре;эз ,1975) ; в р.що cçydss нлего-спг!

Ejra когг? rsîîjisrs з ролл сгоссбр^гпого crü'-rrpa, рпта гзгетерг-з zzçzozzvnczz csrzcpzzr^zcz с=гсз œpîaresssa { Sfcara c=d Зе11г±гз ,1925; ítíxssS с5 cl. ,1289) SJ rcsrr гз^язрсзгсссщ, cra-

позгехпг nssn сгросгзя ркзпг^г^ггоея ергс^лзЕЗ» стэсггся СЗГГГГГ^Г-Я œs^ïrsn у сгззяспсЗ ссггп^с-спп

догггегзЗеЕО сссбстгз пнгезепют гргцзсс пптаг ргчзргбэ-îrrsci в 73-Ш-е 22». ectssonsssa 7 поезлготаз: и

£ЗДС?СЗ nrpsrra Çps^rcj з пзсгсянгз птр^в-п езур^пгг: ns тг-гг дсетзгцуго сгз-сгг-гсхжз ^ÏSSSS. Тса пз essîs гтапгз стгреггз с-огэ гггепггл с? iss^ntra стззгзгп-ircsrsrss JETÍ7S3 ccírrr;? «г'Зскжсгз г^ггг^згжгпз п гаегсл*?-rrrn K^ferrî^r егктоз есэ îrp ctrarrriri к

ценными .К числу таких интегрирущах аспектов соштогенсса можно отнести вопросы: как и чаи определяется удивительное видовое постоянство числа сомитов в эародше; что запускает, хронометрирует и терминирует сегмент ад ио; в каком отношении находятся скорость сегментаций и раэнеры сонитов,» наконец, каковы регуляционные потенции параксиальной иазодерш и с чем они связаны.

Заполнено достаточное количество исследования кяетоедоя репродукции и особенностей митотических циклов иезодериа при сомитогенезе (Дондуа и Федорова, 19б4;1967'; Рг1вавс ее а1„ 1989), но все они,как правило,носят описательный характер. До сих пор только на зародышах амфибия были предприняты попытки экспериментально оценить роль клеточного разшовгння в этом процессе ( Соокв ,1975; Е3.зси1е аы! йатгйаоа ,1986). Как выяснилось, продолжительное кнгибирование ыитотичесЕях циклов и делений клеток не влияло на процесс соыитогенеза. Однако автоматическое перенесение сделанного заключения на другие группы позвоночных -вряд ли оправдано,постольку хорошо известна принципиальные различия в характере и длительности протекания некоторых событий раннего зыЗрпогенэза (в т .ч. и о способах гасгрулядна) У амфибий и ашиог. Еолао того,показано , чго осевая,шэодерш зородыаей птиц а мдвяошяеащвх при сзгаентащш отличается от таковой у ам|ибий значительно более высоки« прслифератпвнш статусом,

В представленной работе предпринята попытка восполнить суц&ствущий пробел в экспериментальном анализе участия в рола пролиферации в сошгогеназо,проведя такоа исследование на зародьшах цшленка и уделяв особое внгшнш очень важной количественной характеристике процесса - скорости сагаентациа.

Бал использован традиционный подход, состоящий в вшлэ-чзнии на разнна сроки шюточноа репродукции с поыощьо шшабп-тора штоаа^олхамйна. Выбор этого штостазика в качества ингибитора клеточного цикла был сделан та случайно. Презде всего хотелось по возможности избегать проявления несбалансированного синтеза РНК и белка, вызывающего неконтролируемую) гибель меток. Прилунение шгибиторов митоза в этой случае предпочтительнее ( ШНог-Раагбв се а1. , 1981). В то Ее время известно,что колцешд (колхамин) отличается от колхицина менее вы-

раяеняшг пгтотоксячоапш эффектом .Наконец ,кал обнаружилось уже в ходе вт синения данной работы,длительность митостати-чесхой активности колхамина в тканях аародша зависит от ис-пояьвуемой концентрации; после полного связывания его с тубу-линамя в вародыве блок снимается и клетки окавывавтся в состо-шяк продол вить мктэтический цикл .Эти результаты показали,что с поиовдо колхамина при определенных условиях можно получить временный блок «птозов и, следовательно .вызвать контролируемую синхронизацию клеток »Ориона ia ото . При этом возникла воаиояносгъ расширить круг изучаемых аспектов, включив сода вопрос о влиянии «оппозиционных перестроек популяции сегментирующих клеток.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла во всесторонней анализе участия и роли клеточной пролиферации, ее организации в процессе сомитогенеаа з»*5рионов цыпленка на стадиях детерминации сомитогенных свойств клеток мезодермы и в период ее водимой сегмент алии .В связи с этим были поставлены следугцие задачи:

1.Отработай, технические условия продолжительных (до 2-х суток) экспозиций эмбрионов ia oree инъецированным под бластодерму жтостатиком и,ореаде всего «решить проблему физиологического растворителя активной субстанции (он же контроль-вал среда).

2Лать подообнув и по возможности более полнув характеристику ыорфо-цитояогичесхих я кинйтвческкх изменений в изученных популяциях клеток зародышей в конек* и после снятия блока митозов; оценить уровень и длительность сохранения синхронного состояния. -

3.Провести дифференцированный анализ мерфоэффекта хол-хаыина (через мюер отруб очки шгтоскелета или через блох пролиферации) на сомитогенеа я другие морфз генетические процесса,уделяв особое внимание скорости сегментации.

4 .Оценить регуляционные возможности клеток ыеаодермы после равной степени поражений,вызванных длительным блоком

пролиферации. _

Наушая новизна. Впервые проведен детальный морфоцито- ' логический к авгередширафячеагай анализ кинетики клеточных популяций в «ачаткях хуриияг эмбрионов в ходе продол яг? ель-

ноя обработки митоетатическими агента»® - колхямином и вол-хицином. Обнаружен феномен спонтанного прекращения блока митозов, впаиваемого колхамином.и возобновление клетками митотичес-кого цикла. Описаны последовательные этапы восстановления веретена деления и превращения к-метафаэ в нормальные метафазы, анафазы и т.д. Установлена прямая линейная зависимость длительности блока от концентрации колхамина. Обнаружение факта спонтанного деблокирования и способа произвольно изменять продолжительность блока предоставило возможность вызывать контролируемую синхронизацию клеточного цикла в тканях эароддаа 1а ото .

Установлена критическая продолжительность пребывания клеток в состоянии к-ыетафаэы; клетки»находящиеся в этом состоянии свыше 6-8 часов »претерпевают пикнотическое перерождение и гибнут .Сделана попытка обосновать предположение, со гласно которому наблюдаемая пикнотическая деградация обусловлена непрерывающейся в к-ыетафазе суперконденсацией хроматина.

В работе впервые описаны и проанализированы зависящие от концентрации митостатика нарушения скорости новообразования сомитов,степень которых коррелирует с продолжительностью блока митозов.

Научная и практическая значимость. Теоретический интерес представляет главный вывод диссертанта,состоящий в установлении большой зависимости "распространяющихся" морфогенезов .таких как образование и рост первичной полоски.формирование трубчатого сердца и соштогенеза от количества клеток в местах развертывания этих событий .Важны полученные доказательства того,что источником (поставщиком) клеток для этих норфопроцессоэ у зародышей птиц и ,по-вадимоыу.млекопитающих служит клеточная пролиферация,что,несомненно,является вааной особенность» эмбрионального развития амниот .Дефицит клеток,вызванный временным прекращением митотических делений или гибелью клеток,прежде всего отражается на темпах протекания указанных морфопроцессов и неизбежно приводит к дисгармонии развития.В этом автор видит значение таких количественных характеристик,как скорость сегментации.

Открытие спонтанной обратимости митостатического эффекта колхамина и основанный на ней относительно простой способ

сянхр снявши* югготическях циклов клеток вародытей цыпленка в яяое, делает эту систему перспективной в исследованиях некоторых современных вопросов цитологии.эмбриологии и молекулярной биологии. Вовмошость вызывания с помощь» варьи-рупдих дов колхамина регулируемой гибели клеток несо»иенно воет быть использована при изучении явлений регуляции типа "реставрационного роста" Сноу, а также механизмов возникновения 8мбриопагня в тератологических исследованиях.

Учитывая,что колхамин как противоопухолевый препарат применяется в клинической практике »полученные в работе данные, дсполняндие сведения о фзриаяологичесних свойствах этого агента,кохут быть использованы а медицине.

Апробация работы. Материалы диссертации были дологены и обсугщены на научных семинарах кафедры эмбриологии С-Ле-тербургского университета и лаборатории эксперш-*энтальной ци-тологмп Биологического научно-исследовательского института ШбГУ в 1991-92 гг.

Огруатура и объем диссертант. Работа состоит из введо-еея,4 глав,содерващих обзор литературы,иетодичэскуо часть, результаты я обсуждение; выводов п списка лптеретуры.вклоча-irjsro 136 источников,из которых 91 - пностренных.Объем руко-шся 160 е.,в т.ч. 8 таблиц, 41 - рисунков и фзто!ра$ай.

КРАШЕ ООЩШШ РАБОТЫ

Объект п кетодика исследованид. Объектом нсследовсшя слугщга эибрпонн курс кросса Highosr tíilte на ренних (до • 3,5 суток инкубация) стадиях развития .Для обеспечения сгносп-гельао синхронного развития пародьшей яйца в течение суток сэдеретвали при тешературэ 12-13° С и &У%> спаяю стп .Инкубация производилась прп 38° С 50-60% уропгэ етноезтвльнол платности работа шзтолншгась с яародиаил на стадиях 2,4,5, б и 10 (поИввЬогцвг asd Harriltca ,1951).

В качестве ннгЕбпторов кятоэов использовали два родственные соединения - полхицш и волхамян (лекарственная форка колцемида). Нитостатшот вводили в яйца расгваренкшгя гграа-шгх физиологических средах а концентрации о? 2,5 " 10" до 1,0 х I0"6 r/tra. При плЕккрг>занин дшгаго псслздоваияя учитывались имеющиеся в литературе указания га то^э а уюгя-

- G -

зиях долгосрочна экспериментов с введением под бластодерму физиологических растворов может вызывать различные

структурные уродства. Была проведена проверка на нейтральность 9 различных физиологических растворителей; был сделан выбор в пользу раствора Bavard » забуференного HEPES, £сй - 7,4.

физиологическим контролем служили зародши «которым вводили раствор лшиколхина - вещества инертного в отнявении сборки микротрубочек. Яюмиколхин получали с аомощьо облучения раствора колхамина ультрафиолетом с длиной волны 346 нм в кварцевых кюветах в течение 1,5 час.

"Мит о статики и контрольный раствор вводили в яйца черев окошечно в скорлупе в объеме 0,1 мл с помощью инъекций под ■5да сто дерму зародша .Окошечки заклеивали ¡^дпластырам, затем лота помещали на реинкуС^шяо. Содержание экспериментов состояло е однократном введении митостатика с дальнейшей фнссаци-эй зародышей через последовательные интервалы времени.3 зависимости от конкретной задачи максимальная экспозиция варьировала от 12 до 52 час. Дня исследования кинетики клеточных популяций в условия? блока митозов за полчаса до фиксации производилась дополнительная инъекция 0,1 их смеси (люмикол-хин + ^-тимидин) с активностью 92,5 ИЕк. Снятие с аеятка с помощью буиаяных колец бластодермы промывали в растворе ' Howard .затем фиксировали' в смеси (этанол: уксусная кислота-3:1). Материал тотально окрашивали триоксигематеияом и гематоксилином Ыайера с докраской эозином или эритрозином. Последующее изучение зародышей проводили как на тотальных препаратах .заключенных в бальзам,так и на срезах и автографах. На тотальных препаратах производили морфологическую оценку характера развития; регистрировали наличие или отсутствие аер-~ вичной полоски,хорды,головной складки,зачатка моага,количество сомитов,степень развития сосудистой системы и сердца, а также различные отклонения от нормального развитияЛри высоких увеличениях микроскопа отмечали присутствие к-митозов, нормальных метафаз,анафаз; телофаз,профаз и др. состояний ядерного аппарата,имеющих отношение к митозу. Особо учитывали пикнотические превращения в клетках Да автографах .помимо'указанных характеристик .регистрировали относительную долю меченых и немеченых ядер. На поперечных срезах через презумптив-

иую область параксиальной мезодермы (ранние стадии) или область сегментарной пластинки,где формируется очередной сойот »производили подсчет относительного количества упомянутых форм,выражая его в Í» к общей сумме клеток.Подсчеты выполняли в нейральной эктодерме и осевой мезодерме в зоне, занныашей 3 поля зрения микроскоп» и имеющей центром зачаток горды Л а автографах, помимо указанных характеристик в этой области .регистрировали такте относительную долю меченых я немеченых адер .Результаты количественного анализа обрабатывались с помощью методов вариационной статистики.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ <ек ■ ¿-- I Л'орйотпггологачесгпе и кинетические особенности мктс-тпчаского"эмбриона,вызванного продолжительным воздействием колхачкнаЛотсазано.что нолхакнн в широкои диапазоне концентраций, будучи введенным под бластодерму,вызнэает у куриных эмбрионов остановку китозов по краснея мер? через 10 мин. после акъекцииЛСак н в экспериментах с колхицином,в опытах с аолханяном количество к-метафаз нарастает по кере прохождения клеток по штотическому циклу.Причем до определенного момента наблвдается устойчивое ¿локирование,о чей говорит отсутствие анафаз и телэфаз. Блокированные колхаыиноы нарезы не отличается от еолхициновых к-аэтафав .Плотный комок хроиосом, отсутствие ядерной оболочки, ядршет и никаких прв-внаков шретена деления - таковы внезяпа проявления этой аномальной фориы юктоза у куриного зародила.

Однако в отличие от действия колхицина блоккууощий эффект колхамша не продолжается бесконевдо: по истечении определенного щ>емени ш аоястаткровалж снятие блока и реставрация жахагтоза,тах я другас циклических процессов в клетке. Доказагельстзек эндогенного деблокировеяил может служнть прогресснхяое снижение в ходе екеяегримеята доли зародыае* с тшши Е->жтафаз!Шн вплоть до полного ах исчгшовеншпсь..

рас Л аа с.П^.

Дзутоэ тгодгвсфздэпше снятия блока иовно видеть в аде-го® процента h-kjwosob у зародшей,начиная д онределеннего ерша nocas введения ингибитора,в отытах с 'Е-адкгдаквг Сряс.2) .0дао2ГО£з«с«з постоянно отмечалось массовое пэши-»-аке нормальных (с зеретеяоы) метафаз н анафав в ameном на-

- в -

териале. Это явление напоминает картины,описанные в культурах клеток после отмывки от ингибитора ( Вг1акХ*у « а!, 1967; ЭкгЬи аа* Вг1п)а«г197б).

Рис.'Н.

Рис.1. Изменения доли зародышей,содержащих к-ьситозы

(сплошная линия) и фигуры восстановленияСточеч-ная линия),после инъекции колхамина в концентрации I х 10-° в/ил и 5 х 10-' г/мл зародышам 38 часов инкубации

В отличие от описанной последовательности событий при наблюдаемом эндогенном деблокировании у куриных зародышей преобразования начинаются с одного промежуточного этапа,состоящего в появлении т.н. "рыхлых" метафаз.Это округлые клетки без ядерной мембраны и ядрашка.но конденсированные хромосомы в них располагаются рыхло в центральной зоне клетки,на некотором расстоянии друг от друга,так что можно установить

- 9 -

вг количество; при этом веретено не просматривается .У одних и тех го зародил ей в разных областях мошо видетьпрыглые"ме-тафазы с хромосомами .рассеянными в разной степени .Рыхлые ме-тафазы переходят затем в типичные метафазыЛри изучении на то-талышх препаратах таких типичных .нормальных метафаз, видим, что их хромосомные пластинки имеют веретено и почти всегда располагаются ортогонально к поверхности бластодермы в виде многочисленных палочек .На смену этим фигурам скоро появляются нормальные анафазы,затем переходятае в интерфазы,что выражается в почти полном исчезновении митозов.

В работе показано,что продолжительность метафазного блока митотического цикла клеток эмбрионов находится в прямой зависимости от концентраций вводимого ыитостатика и обратной-от возраста зародыша.Это позволяет предположить,что наступление момента деблокирования в конечном счете определяется количеством молекул свободного (несвязанного) колхамина в суббластодермальном пространстве,откуда ингибитор поступает в клетке зародыша. Пока нет данных,позволяющих дать удовлетворительное толкование спонтанного снятия митостатическогс блока,равно как причин,лежащих в основе отличий дейст-

вия колхицина и колхамина .Высказано предположение,что колха-мин,отличающийся по общему признанию менее токсичным действием,не подавляет в клетке синтез белков, в т.ч. я тубулинов. По мере образования новых тубулиновых димеров, создается насыщение, К01Д8 все молекулы ингибитора уяэ связаны .При этом сборка микротрубочек более не встречает препятствий и течение нормального митоза возобновляется. Колхицин да .помимо связывания с тубулинани,блокирует и синтез белков,пока присутствует в клетке .Основания для такого предположения мошо обнаружить в работах,где показано,что для восстановления нормального митотнческого аппарата после воздействия колхицином совершенно необходим дополнительный синтез белка,тогда как при действии кольцемида восстановление происходит в результате реполимеривации пред существующих тубулинов feouek «sd Штот 1970;Асинз.и 0таросветская»197?). «7

При использовании колхамина в концентрациях 4 х 10" и выше, вызывающего длительную остановку митозов,в большинстве наших экспериментов черев 7-8 час .иаблвдали резкое прогрес-

сивное нарастание числа гибнущих клеток, находящихся на разных стадиях пикнотической дегенерации. Процесс пикнотизаоии был особо выражен при обработке колхамином в концентрации I х Ю-®; очага пикнозов обнаруживались, как правило,в непосредственном соседстве с зонами к-ыитозов. Зто явление не отличается от некротизации, наблюдаемой на поздних сроках обработки колхицином. Чаще причину гибели клеток при воздействии знтитубулинами усматривают в повреждениях миготическоро аппарата и связывает с высокими дозами агента. Значительно меньше внимания уделяется времени пребывания клетки в блокированном состоянии. Подтверждением важной роли, которуп играет в переводе клетки на путь пикнотической гибели длительность ее наховдения в блокированном к-ыитоэе, может служить наблюдаемое нами наличие в одном к том же зародыпе после 3-часового блока как фигур восстановления и нормальных митозов, так и пикнозов, одновременно. Мовно думать,что в подобных случаях пикнозы - это клетки .которые, находясь в начале эксперимента в 0»>, первыми входят в митоз и,следовательно, пребывает в состоянии к-нетафазы максимальное время, тогда как для клеток, вошедших в митоз позднее, это время оказывается короче критического, и они после снятия блока возобновляют течение нормального митоза и клеточного цикла.Т.о., окончательная судьба клетки зависит от временя ее нахождения в блокированной состоянии Лели длительность блока не превышает 6 часов, то клетки оказывается способными в кратчайший срок (около I часа) нормально завершить митоз и перейти в интерфазу. В случае,если блок растягивается до 8 часов и более, наступают необратимые изменения,возмоано вызванные гиперконденсацией хроматина, и клетки так же,как и при обработке колхицином, вступает на путь пикнотической дегенерации.

При обработке колхамином в умеренных концентрациях наблюдается существенное преобразование композиции изученных популяций клеток (распределение клеток по -фазам мистического цикла).выражающееся в значительном повышении их синхронности без заметных изменений характеристик клеточного цикла. Эта наведенная синхронность достигается за счет относительно высокого уровня (до 35ч) митозов после снятия блока и сохраняется на высоком уровне в течение следующего за деблоки-

рованием митотичесяого цикла (с*.рис.2). Обнаруженные кинетические различия меяду мезодермой я эктодермой обусловлены

У? ■ • •'

> (

/ з о

V \

1 а....

90 75 60 ■<5 30 15 Э

$ В 10 !2 и 16 ч.

V /

\' V

г А 6 8 10 12 14 16 '!.

:о

8

20

г « в а го к м к

Пав. и]

Рис.2. Динамика изменения процента к-метафаз Щ.митоз(2),

пикнозов (3), меченых (4) и немеченных (5) ядер параксиальной мезодермы 18-часовых куриных амбрионов,.меченых Щ-тимидином,после различной экспозиции с колха-мином в дозе 4 х 10"' г/мл а и б - опыт; в -контроль. Абсциса - время после инъекции митостатика; ордината - плацент клеток.

предке всего исходно равной вариабельностью некоторых параметров клеточных циклов в втих вачатках. Показано,что меньшая дисперсия характерна для параксиальной мезодермы, чтс связано с изначально более высокой стелены» синхронности ее клеток. В этом отношении наши наблюдения хорошо согласуется с результатами работ других авторов. Так,экспериментами на куриных зародышах (Ефремов,1976; Ефремов и Сер-говская,1Э79; Ефремов и др.,1980; Stern and Bellâtre , 1984; Pximaet et al , 1989) й эмбрионах мышей ( Snou,I977) был установлен парасннхронный характер пролиферации клеток мезодермы в период гвсгруляпии и во время сомитогенеэа.Описанная кинетика клеточных популяций наблюдается при коротком (не более 5-6 часов,?.е.короче одного митотичесхого шала) блоке. В этих случаях,как установлено, подавляющее большинство клеток сохраняет способность к возобновлению нормального цикла.

Вызванные высокими (5 х 10"' г/га и выше) концентрациями колхамина условия длительного блока, значительно превышающего клеточный пикл в зачатках куриного зародыша, несмотря на более высший уровень в-метафаз, тем не менее не приводят к соответственно более значительной синхронизации пос-% ле деблоюфования. Это несоответствие обусловлено гибелью большей части (до 80%) синхронизированной фракции клеток,о чем свидетельствует прогрессивно нарастающее количество пик-нозоЕ, особенно в мезодерме сегментарной пластинки и первичной подоски. .

£ .Мар<Ьогенетичеасий аффект колхамина на развитие куриного эмбриона на стадиях гасгруляции и раннего сомитогенеза.

Обработка кодхаыином зародышей s начале гаструляцни, на стадии ранней полоски вызывает отчетливый морфоэффект, проявлявшийся в двух формах .Это, во-первых, непрерывное во время блока митозов замедление развития у всех эыйрионов.вы-раяеннсе в виде торможения разрастания бластодермы по иелт-ку, снижения темпов роста area p«llacid& »первичной полос- . ки и самого зародыша, с последующим ускорением основных мор-фопропессов у половины зародышей. И,во-вторых, полное прекращение развития осевого комплексе зачатков после снятия блока у другой половины вибрионов с дальнейшей их деграда-

таей. Столь выраяенные различия в судьбе зародыгея, испытавши влияние мктостатика, могут быть объяснены некоторой раз-кипе я в юс во трасте к моменту введения антигубулина.1ароды-аи, достигая« к моменту снятия блоха стадия дефшитианоя полоски,гтродолкшгт развитие в ускоренном темпа.

Гахим образом,полученные данные а определенном смысле под? вербуют результаты известных опытов Куга (Соок»,1975), выполненных на эмбрионах агфгёиЯ.З аналогичных экспериментах Кук показал принпипиальнуг возмоаность морфгенетических процессов,вклвчая гаструлятго.неярулягога и рання» органогенез, с состветствуигея гистодифференпивпиед зачатков, на смотря на длятельнуи блскаду алето^иых деления и существенное недопроизводство клеток эародыиа. При этой он такав констатировал значительное торможение развития. Вместе с тем результаты катего исследования обнаруетвает аагное отличие от полученных Куком. В налей случае продолжать развитие оказывается способными не все эмбрионы,а лишь прошедшие стадио среднея зародышевой подоски.Homo дукать,это такая разная реадция зяродьшей аи{»бий и птиц, находящихся в начале га-струлшии, на деяствив ингибиторов илето^иых деления связана с разным значением фактора количества вяетоа в у спетой прогезании большинства шрфо генетических процессов у представителей этих классов поззоиочинх. Именно в силу большей зависимости процесса гаструляпия от количества клеток у куриного эмбриона (да и у зародила шгшя) просматривается определенная связь этого процесса с клеточной пролиферацией и митотичесетм аиклои.

Что касается влияния холхамина на начало я ход сегментации, то на основании полученных данных могно заялэчкть, что на детерминации соматогенных потенций и начальной разметке презумптивных сомитов, которая происходит как рад на стадии средней полоски (Я riplett and Oejer ,1982; Jacobsoa , I9S8) ,блок клеточного пиала и наведенная парасинхронность пролиферапии не сказываются; сомитогенез начинается своевременно и протекает с нормальной скоростью.

Дня того,чтобы оиенить влияние колхаминового блока клеточных делений на инициал«® сомитогенеза у куриного эмбриона,был поставлен опыт,в котором зародышей на стадиях голов-

ноя отросток - головная складна, параксиальная мезодерма с <-торых уке организована в виде блока сомктоыеров iitejer Д£?9), инъецировали антитубулииом в дозе 2,5 х 1С~' г/мх. Выбранная концентрация обеспечивала короткий, 3-часовой блок митозов,который снимался непосредственно перед или в «оиент начала видимой сегментации к «о вызывая появления пиан озон.

Анализ хода, развития в опытной и контрольной партиях да! показал отчетливую аадерляу развития в первые 4 часа после инъекции колхажша и приблизительно 6-часовое вапаздыва-ние появления сомггов.В последующие 8 часов экспозиции темя морфогенотическиЕ процессов супественно возрастает ,т .ч. по уровне раэвяткя к по появлению сомитов экспериментальный материал в массе своей догоняет контроль .Расчеты средней скорости приросте числа сегментов,начиная со времени их появления,у обработанных зародыоей показывает тек не менее,что тем- пы сегментации в опытном я контрольном материале в последние 56 часов экспозиции абсолютно одинаковы, йохио думать,что на-блвдаемэе 5-часовое вапаздавание начала сомитогенеза является следегшеи обпей аадерпси развития зароднва в целок и его отдельных сисгеи .Длительность отрезка, мввду стадией головного отростка и стадией 7»когда возникает первая видимая граница махду сегментирующейся и несегмент кровато?. парадами мезодерма, столь коротка,« сабямш,сс>вершавдиеся за его времз, столь значительна, чю, nosauyfu иодао говорить о сунхрснносгв возникновения IS сОАШТомеров. Есмехваш» полагать,что такой энергичный морфогенетячаский «кг возмоаеа тсльхо при максимальной ratomoerx всех звеньев система сегментации к, прев- . де гсего.при дэаракдаом «отчестве детерминированных клеток. Система пополняется игетмша постепенно в ходе регрессат первичной полоски .н&чшья со cremt 4 * 5- Поэтому весьма вероятно, что даке кратковременная блокада митозов, задерзявая развитие ,неизьеино нврушает готовность системы сегмеитаааа .Дефицит клеток, вызванный их недопроизводством в результате блока, будет ощущаться в течение 6 часов, хогда большая часть зосстачовившихся от блока югя*ск,р«адшшшись»переф;ет в От l см .рис «2}. Наведенная сшхронносм» НС сказывается па воаюв-нссти возобновления развития я на ашросяа сомитогенеза и формирования сердца.

- 15 -

Дня изучения влияния колхамина на сегмент апис мезодермы а период активно протекающего еомитогенеза были поставлены несколько экспериментов,в которых объектом служили эмбрионы на стадии 9+, содергание а среднем 9 пар сомитов.3 этой части работы нас преяде всего интересовали принципиальная возможность еомитогенеза и теша сегментации при вы-ражённом искажении пролифератквного статуса систем,участвующих в этом процессе со всеми сопутствующими явлениями, в т.ч. и дефицитом клеток. С этой целыо бьии подобраны условия, вызывающие разной длительности блокирование клеточного цикла. Результаты этих экспериментов свидетельствуют,что,начиная с дозы 4 х 10"' г/мл, митостатик вызывает разнообразные клрушения развития. Наиболее чувствительными оказываются производные мезодермы; задерживается развитие сердца,замедляется, а при концентрации I х 10"® практически лреяЬашает-ся новообразование сомитов«возникают аномалии уже сформировавшихся сегментов. Этот эффект имеет выраженный дозоза-зисягмый характер (рис .2) .

В исследованиях влияния митостативов на морфогенез при интерпретация получаемых результатов необходимо учитывать двойственную природу вызываемого эффекта (через ютсротру-бочки ыитэтического веретена или мятротрубочки цитоскеле-та). Достоверно известно,что последние чувствительны к ан-титубулинам в широком диапазоне концентраций,вплоть до очень низких (5 х IQ . г/мл) ( Barrl«*t al ,1978) .'После удаления ингибитора их сборка начинается тотчас и заканчивается очень быстро,так что те морфопрспессы, которые совершаются при прямом участии цитаплавыатических «икротрубочек, например, эпиболия iura разрастание гипобласта ранних куриных эмбрионов, восстанавливаются также в течение очень короткого промежутка времени (до 2 часов) ( Baxsel et al , 1984). После удаления тем или иным способом свободного колцемида из окружающей среды очень быстро возобновляется процесс сборки микротрубочек и веретена,и питоскелета. Поэтому восстановление нормальных митозов может служить показателем сборки скелета клетки. Восстановление нормальной скорости еомитогенеза после снятия блоков в напих экспериментах указывало бы на участие микротрубочек питоскелета в процессе

<0 1 сер« саштов

(б!

0 ¡__—,—,—---—-—

3 6 9 12 15 18 21 24 ч

Рис.5. Прирост числа сонетов в опытах с колхаминоа (исходная стадия 38 часов инкубации). Ордината - число пар сомитов; абсцисса - время экспозиции с мито-статиком 1в часах) Л - биологический контроль ше-

4 --колхаминих г/ил;; э - киллаилп к 10-" г/мл).Гонкими сплошными линиями обозначены соответствующие линии регрессия.

формирования новых сомитов.Однако а данных экспериментах этого не происходит (рис.2), лромэ того,нами не обнаружено нарушение скорости сегментации при использовании митостати-кл в дозе 2,1) х 10"" г/*я, хотя эта доза несотенно вполне достатодаа,чтобы вызывать дезорганизацию цитоплазиатическо-го колтлекса дакригрубочек. Учитывая эти обстоятельства,мы полагаем,что влияние колхашна на сегментацию совершается не через разрушение питосжелета.

3 отличие от экспериментов с применением 5-бром-деэо-ксиуркдина,вызывчпг,его стабильные модификации биохимического фенотипа тканеа и орглноа,не изменяя пролиферативнуо активность я «изнеспэсобность клеток ( Batter , 1975; Х»ое tuad

jaiaae 1978),в напих опытах спектр поражаемых зачатков не меняется от стадии к стадия. Поэтоау стшо душть,что колха-1351 но влияет на де?ершдаапта клстоз а исправлении образования сомитов.

Проведенная анализ показал,«во появление большинства описанных нарушения развития обусловлено нехваткой клеток, участвуггз« в морфопроаессах. Дефолта возникает во время ми-тостатического блока в связи с недопроизводством клеток в результате остановки деления .После превращения действия гсол-яат/на нехватка клетох вызывается гибельо частя блокированной ^ракшги Лр« этой дефицит на всех этапах эксперимента оказывается тем значительнее,чей продолаггелжее блоз и чей выпе пролиферативная активность тяани. Именно поэтому от подобного воздействия больпе всего "страдаит" зачатки, морфогенез которых совершается на фоне аятишоя яролеферации. В . частности, наиболее ощутимые нарушения наблвдаится при сегментации параксиальной иезодерш.

Таким образом, цитоксический эффект высоких доз колха-кина у зародшея птиц изначально обусловлен выключением эвена клеточной пролиферации в общей цепи событий морфогенеза сомитов .Аналогичные результаты, полученные с другими ингибиторами клеточного цикла (например, с яитомицином - С) у ранних эмбрионов мши (Saow ,1983), наводят на ыысль, что здесь да имеем дело с обс^я«свойственной всем амниотам особенностью. У зародышей амниот в отличие от амфибий очень велико значение непрерывного производства клеточного мате-

- IB -

риала,» следовательно в клеточной сролкфератп,обеспечивавшей ето производство .для осуществления морфогенеаов.

Б Ы В С ¿ ь

I .Кслхамкн (фармакологическая фарш колпемида) вызывв-ет остановку митоза в клетках куриного эмбриона»переводя кг в состояние к мг*а;Ьааы. Б отгкчге от коххипвна, действие которого в ааоодыве необратимо,колхаыин создает лиггь временнкя блок характерных событий terrosa, длительность етого блока зависят от количества несвязанного ингибитора,т.е. определяется исходной яснпеитраоией.Исчерпывание sanaca свободного колхамина в тканях зародыва возобновляет проаэесс сборки инк-ротрубочек Св том числе и веретена деления).

¿.Окончательная судьба клетки зависят от времени ее пребывания в б л оккрованн ом состоянии Лете длительность блоке не превшает 6 часов,то клетки способны в кратчайший срок завершить митоз и перейти в ингерфазу. (Описана морфэлолкя последовательных этапов восстановления нормального течения митоза). Если блок растягиваете? до 8 часов и балее,касту-поя кеобратише изменения, и петая, так «е,хак при обработке колхицином,переходят на путь пжкногической дегенерации.

ЗЛри обработке аяродывей ховосаиином в умеренных дозах достигается отчетливое преобразование кожгознпив изученных пепуляцкй клеток,внражающееся в существенном повышении степени их синхронности бев заметных изменений жтгэтического цикла .Наведенная синхронность сохраняется на высоком уродае в течение,ito крайней мере, одного цикла. Обнаруженные кинетические различия меяду эктодермой я мезодермой обусловлены исходно разной вариабельность*) некоторых параметров клеточных шкков в этих зачатках.

4-Уславян длительного бдока.юяваннне высокими концентрациями (5 х 10~7 г/мл в вше) колхамина, несмотря на повышение процента к-штозов, тем не менее не обеспечивают по-вышенну® синхронизацию популяций после снятия блока .Это объясняется гибелью значительной доли синхронизированной фракции клеток., о чем свидетельствуют массовые пиквазы, в особенности в мезодерм» сегкентраной пластинки и в первичной

полоска.

з. Лаххзши вызывает разнообразные нарушения развития, гзлхгаетие ториогвнив эггж1олии, роста полоски и отдельных сйзястеЯ эмбриона, задержку образе паяя я сердца я сошггоэ,за-1»дленке,а яри высота дозах ыитосгатика.и прекращение сег-иоттатга параксиальной каэодерш.

5. 3 большинстве случаев отывченнка нарупения не связаны с язкененкеы свойств клеток, обусловленных состоянием тгюскелета,но сотрясены с недостатком количества клеток,которое необходимо для нормального протекания иорфопрсцессов, в условиях длительного подавления клеточных делений и гибели клеток после снятия блока- Нарупения сзпггитгцкл является ярхли пргагаром подобные отношения.

7.Изменения коитозисип клеточных популяций в результате продолжительного блока ютозов не влиютг на детерминацию соинтообразутядих свойств ¡¿езодерки.незавасяио от того, на какая стадии развития эти изменения вызываются.

8. Сопоставление представленных результатов с дгнншл1 литературы позволяет заключить,что у аьзгаот в отличие от амфибия процесс соютогемеаа (и,по-тздкмоиу, другие корфолро-пессы) существенно зависят от пролиферации - гласного поставщика клеточного нэтериала.ЙЕенно сосэоянием процесса клеточкой репродукции у выеэих позвоночных определяется степень и выражение регуляцисшшх оозшгностея при еэгмзн-

Т2ППП.