Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние ионизирующих излучений и противоопухолевых препаратов на клетки SP линии B16 меланомы и линии MCF-7 аденокарциномы молочной железы

ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние ионизирующих излучений и противоопухолевых препаратов на клетки SP линии B16 меланомы и линии MCF-7 аденокарциномы молочной железы"

На правах рукописи

МАТЧУК Ольга Николаевна

ВЛИЯНИЕ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИИ и ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА КЛЕТКИ ЯР ЛИНИИ В16 МЕЛАНОМЫ И ЛИНИИ МСР-7 АДЕНОКАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

03.01.01 - Радиобиология

1 АПР 2015

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Обнинск - 2015

005566745

005566745

Работа выполнена в Медицинском радиологическом научном центре им. А.Ф. Цыба — филиале Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный медицинский исследовательский центр им. П.А. Герцена» Министерства здравоохранения Российской Федерации (МРНЦ им.А.Ф. Цыба-филиал ФГБУ «ФМИЦ им. П.А. Герцена» Минздрава России)

Научный руководитель:

- Жаворонков Леонид Петрович, доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

- Пелевнна Ирина Ивановна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт химической физики им. Н.Н.Семенова» РАН, главный научный сотрудник лаборатории радиационной биофизики и экологии;

- Нугис Владимир Юрьевич, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение Государственный научный центр «Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна» Федерального медико-биологического агентства Российской Федерации, заведующий лабораторией радиационной гематологии и цитогенетики.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится 15 мая 2015 года в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.132.01 при Медицинском радиологическом научном центре им. А.Ф. Цыба - филиале Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный медицинский исследовательский центр им. П.А. Герцена» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 249036, г. Обнинск Калужской обл., ул. Королёва, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МРНЦ им. А.Ф.Цыба -филиале ФГБУ «ФМИЦ им. П.А. Герцена» Минздрава России.

Автореферат разослан « /У» марта 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Палы га Геннадий Фёдорович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования.

Гетерогенность опухолевых клеток по функциональным признакам, в том числе по чувствительности к противоопухолевым воздействиям, является фундаментальным свойством злокачественных новообразований. В частности, в клеточных культурах in vitro и опухолях in vivo установлено наличие небольшой группы клеток, активно исключающих ряд соединений, в том числе флуоресцентный краситель Хёхст 33342, вследствие высокой экспрессии на плазматической мембране транспортёров, прежде всего, различных белков ABC-семейства (Hirschmann-Jax С. et al., 2004; Choi C.H. et al., 2005; Chen K.D. et al., 2009). Указанные клетки формируют при проточноцитометрическом исследовании так называемую боковую популяцию (side population - SP) и, как показано, в большинстве изученных модельных систем обладают свойствами опухолевых стволовых (стволоподобных) клеток (Patrawala L. et al., 2005; Dou J. et al., 2009; Lôpez J. et al., 2012; Wouters J. et al., 2013). Учитывая широкое распространение этого термина в мировой литературе, в данной диссертационной работе использована его английская аббревиатура, а для обозначения остальных опухолевых клеток - словосочетание «NSP».

В последние годы показана высокая радио- и химиорезистентность клеток SP (Woodward W.A. et al., 2007; Wan G. et al., 2010; Xia P. et al., 2013; Richard V. et al., 2013). Этот факт позволяет предположить, что именно клетки SP, составляющие по разным оценкам 0,01 - 5% всех опухолевых клеток, могут оказывать значительное влияние на течение заболевания и эффективность различных методов его лечения, в том числе радиотерапии. Однако радиобиологические свойства клеток SP, закономерности и механизмы их реакции на различные радиационные и химические воздействия изучены недостаточно, что определяет актуальность данной работы.

Цель работы: выяснение закономерностей и молекулярно-клеточных механизмов действия ионизирующего излучения и химиопрепаратов на клетки SP линии В16 меланомы и линии MCF-7 аденокарциномы молочной железы.

Задачи исследования:

1. Выяснение чувствительности клеток SP и NSP меланомы линии В16 и аденокарциномы молочной железы линии MCF-7 к действию редкоионизирующего излучения б0Со с применением различных методических подходов.

2. Сравнительный анализ чувствительности клеток SP изучаемых линий к действию гамма- и нейтронного излучений,

3. Оценка чувствительности клеток SP и NSP к ряду химиопрепаратов (метотрексат, цисплатин, салиномицин).

4. Анализ клеточного цикла БР и N8? для выяснения механизмов повышенной резистентности клеток ЭР изучаемых линий к действию редкоионизирующего излучения и некоторых химиопрепаратов.

5. Исследование одного из показателей состояния окислительно-восстановительной системы в изучаемых популяциях - внутриклеточного содержания оксида азота (II) - как возможного фактора повышенной радиорезистентности клеток БР.

6. Количественный анализ спонтанных и радиационно-индуцированнных двунитевых повреждений ДНК в клетках БР и N5? как одного из механизмов повышения радиорезистентности БР.

7. Выяснение особенностей конститутивной и радиационно-индуцированной экспрессии белков теплового шока (БТШ27 и БТШ70) в изучаемых популяциях как одного из механизмов повышения радиорезистентности БР.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В диссертационной работе получены новые данные о чувствительности к редкоионизирующему излучению клеток БР и N8? меланомы и рака молочной железы в широком диапазоне доз (1,0-20,0 Гр) с использованием различных методических подходов (анализ относительного и абсолютного числа клеток указанных популяций в близкие сроки после облучения и определение их клоногенной способности в отдаленные сроки после воздействия). Впервые в мире изучена чувствительность клеток БР и КБР к действию плотноионизирующего (нейтронного) излучения и установлена одинаковая чувствительность указанных популяций к данному типу воздействия. Также не вызывает сомнений новизна данных о механизмах повышенной резистентности БР к различным (но, что очень важно, не ко всем) воздействиям. В частности, в работе впервые проведен сравнительный анализ количества двунитевых повреждений ДНК, экспрессии БТШ27 и БТШ70 в изучаемых популяциях клеток и показана их роль в формировании повышенной резистентности БР к действию редкоионизирующего излучения.

Новые знания о механизмах радио- и химиорезистентности изучаемой популяции (БР) представляют интерес не только с теоретической, но и практической точки зрения как основа для разработки новых противоопухолевых воздействий. В частности, результаты работы свидетельствуют об эффективности нейтронного излучения с точки зрения элиминации клеток БР, резистентных к редкоионизирующему излучению и, как показывают данные литературы, обладающих рядом свойств стволоподобных опухолевых клеток. Кроме того, полученные результаты обосновывают применение ингибиторов БТШ27 и БТШ70 как средств радиосенсибилизации фракции клеток, резистентных к редкоионизирующему излучению, и показывают перспективность дальнейшей работы в этом направлении.

В целом, подход, представленный в данной работе и учитывающий реакцию не только общей массы опухолевых клеток, но и отдельно БР,

является перспективным для разработки новых средств/способов воздействия на опухоль, а также совершенствования существующих методов лечения онкологических заболеваний.

Положения, выносимые на защиту.

1. Резистентность клеток SP линии В16 меланомы мыши и линии MCF-7 рака молочной железы человека к действию редкоионизирующего излучения значимо выше, чем таковая клеток NSP, в диапазоне доз до 20,0 Гр.

2. Радиочувствительность клеток SP и NSP изучаемых линий к действию нейтронного излучения статистически значимо не отличается.

3. Клетки SP изучаемых линий более резистентны к метотрексату, чем клетки NSP. Клетки SP линии MCF-7 обладают меньшей чувствительностью к цисплатину и одинаковой чувствительностью к салиномицину по сравнению с клетками NSP.

4. Распределение клеток SP и NSP по фазам цикла значительно различается. Состояние относительного пролиферативного покоя клеток SP является одной из причин их более высокой резистентности к действию редкоионизирующего излучения и некоторых химиопрепаратов.

5. Относительно высокая радиорезистентность клеток SP к редкоионизирующему излучению по сравнению с NSP связана с низким количеством двунитевых повреждений ДНК, возникающих в клетках этой популяции под влиянием облучения, и высокой экспрессией радиационно-индуцированных БТШ27 и БТШ70.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на: 4th International Congress of Molecular Medicine (Istanbul, Turkey, 2011); XV Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2011); I Международной научно-технической конференции «Компьютерная биология - от фундаментальной науки к биотехнологии и биомедицине» (Пущино, 2011); 39th Annual Meeting of the European Radiation Research Society (Vietri sul Mare, Italy, 2012); итоговом заседании регионального конкурса молодежных инновационных научно-технических проектов по Программе «У.М.Н.И.К.» (Обнинск, 2012); VII съезде онкологов и радиологов стран СНГ (Астана, Республика Казахстан, 2012); Всероссийской научной школе для молодежи «Современные методы флуоресцентной визуализации в биомедицинских и биотехнологических исследованиях» (Москва, 2012); VIII Всероссийском съезде онкологов «Онкология XXI века - от научных исследований в клиническую практику» (Санкт-Петербург, 2013); 4th International Conference on Stem Cells and Cancer (ICSCC-2013): Proliferation, Differentiation and Apoptosis (Mumbai, India, 2013); Международной научной конференции «Радиобиологические основы лучевой терапии опухолей» памяти А. С. Саенко (Москва, 2013); 39th ESMO Congress (Madrid, Spain, 2014); VII съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2014).

Апробация диссертационной работы проведена на научной конференции экспериментального радиологического сектора «МРНЦ им. А.Ф. Цыба» - филиале ФГБУ «ФМИЦ им. П.А.Герцена» Минздрава России 10 декабря 2014 г. (протокол № 280).

Личный вклад автора.

Автор принимала непосредственное участие в планировании данной работы, осуществляла ее организацию, проводила все входящие в её состав экспериментальные исследования, выполняла обработку полученных результатов, в том числе, статистическую, а также анализ и сопоставление с данными, имеющимися в литературе, готовила результаты работы к публикации в научных изданиях.

Публикации.

По результатам исследований опубликовано 7 статей в ведущих российских и зарубежных журналах, рекомендованных Перечнем ВАК МОиН РФ и 12 тезисов докладов, представленных на всероссийских и международных конференциях.

Объём и структура диссертационной работы.

Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты экспериментов, их обсуждение, заключение, выводы, а также список сокращений и список литературы, содержащий 252 источника, 244 из которых являются зарубежными. Диссертационная работа иллюстрирована 24 рисунками и 4 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования являлись клеточные культуры мышиной меланомы линии В16 и рака молочной железы человека линии MCF-7, культивированные в стандартных условиях при температуре 37°С и 5% содержании COi.

Выявление и сортировка клеток SP. К суспензии клеток, снятых с подложки, добавляли флуоресцентный краситель Хехст 33342 (Hoechst33342, далее Но342) (Sigma-Aldrich, США) до конечной концентрации 5 мкг/мл и инкубировали 60 мин для клеток меланомы В16 или 90 мин для клеток рака молочной железы MCF-7 при 37°С, в конце инкубации добавляли иодистый пропидий (ИП) (Sigma-Aldrich, США) в конечной концентрации 2 мкг/мл. В качестве контроля часть образцов инкубировали с Но342 и верапамилом (ABBOTT GmbH &Со. KG, Германия), который препятствует обратному транспорту ряда веществ, в том числе, Но342 из клетки. Образцы анализировали с помощью проточного цитофлуориметра-сортировщика FACS Vantage (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, BDIS, США).

На рисунке 1 показан типичный пример выявления 8Р меланомы линии В16. Определение и количественный анализ клеток БР аденокарциномы молочной железы линии МСГ-7 осуществлялись аналогичным образом. Клетки 8Р и ЫБР были отсортированы и подвергнуты дальнейшим исследованиям.

о

•ч

200 400

Интенмшность флуоресценции Но342 (675±20 нм)

Рисунок 1 - График распределения ИП" клеток линии В16 по интенсивности флуоресценции Но342 без обработки верапамилом (слева) и после таковой (справа). Выделены регионы клеток 8Р с указанием процента от общего числа клеток

Анализ клеточного цикла. Предварительно отсортированные и зафиксированные в этаноле клетки 8Р и №Р окрашивали с помощью ИП (50 мкг/мл) в присутствии РНКазы (1 мг/мл, О^Ьсо, США) в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего анализировали с помощью проточного цитофлуориметра БАСБ СаНЬиг (ВГЛ5, США) и определяли распределение клеток по фазам клеточного цикла с помощью стандартного программного обеспечения.

Определение внутриклеточного содержания оксида азота (II). Клетки инкубировали одновременно с Но342 в описанных выше условиях и 4,5-диаминофлуоресцеин-2-диацетатом (Sigma-Aldrich, США), который проникает через плазматическую мембрану, подвергается воздействию эстераз и взаимодействует с оксидом азота (II) (N0). В результате этой реакции образуется флуоресцирующий продукт, который регистрируется с помощью проточной цитометрии. По интенсивности флуоресценции судили о внутриклеточном содержании N0 в выделенных популяциях клеток (8Р и N8?). Для контроля флуоресценции к части клеток добавляли нитропруссид натрия, являющийся донором N0.

Количественную оценку двунитевых повреждений ДНК проводили с помощью иммуноцитохимического метода выявления фокусов фосфорилированных гистонов уН2АХ в предварительно отсортированных клетках SP и NSP линии В16 до и через 60 мин после облучения в дозе 3,0 Гр. Для анализа окрашенных образцов использовали конфокальный лазерный сканирующий микроскоп Leica 4000 TCS SPE (Leica Microsystems, Германия).

Анализ содержания БТШ27 и БТШ70 выполняли с помощью непрямого иммуноцитохимического окрашивания предварительно отсортированных клеток SP и NSP линии MCF-7 до и через 20 ч после облучения в дозе 5,0 Гр. С помощью конфокальной лазерной микроскопии анализировали интенсивность флуоресценции клеток, инкубированных с соответствующими антителами.

Облучение клеток, источники. Клетки обеих культур подвергали воздействию у-излучения (60Со) на установке «Луч» (Россия) в дозах 1,0-20,0 Гр (мощность дозы 0,9 Гр/мин, средняя энергия ~ 1,3 МэВ). В другом случае на клетки воздействовали в дозах 0,1-5,0 Гр импульсным (для В16) или непрерывным (для MCF-7) нейтронным излучением, источником которого являлся генератор ИНГ-031 (ВНИИА им. Н.Л. Духова, Россия) или генератор на газозаполненной нейтронной трубке НГ-14 (ВНИИА им. Н.Л. Духова, Россия), соответственно. Энергия нейтронов составляла ~ 14,0 МэВ. Через 4872 ч после облучения несортированных образцов регистрировали долю клеток SP, NSP и рассчитывали их абсолютное количество. В случае предварительной сортировки клетки SP и NSP облучали отдельно и анализировали их клоногенную способность по стандартной методике подсчета колоний.

Обработка клеток противоопухолевыми препаратами. Клетки в логарифмической стадии роста инкубировали с метотрексатом (1,0 и 5,0 мкг/мл, ОАО «ВЕРОФАРМ», РФ), или цисплатином (2,5 и 12,5 мкг/мл, ОАО «ВЕРОФАРМ», РФ), или салиномицином (7,5 мкг/мл и 37,5 мкг/мл, Sigma, США) в течение 48 ч, после чего определяли относительное и абсолютное количество клеток SP и NSP в опытных и контрольных флаконах.

Статистическая обработка результатов экспериментов. Статистическую обработку полученных результатов выполняли с помощью программ Origin 6.0 (MicroCal Software, США) и Statistica 6.0 (StatSoft, Inc., США). Для межгруппового сравнения данных использовали критерий Стьюдента, предварительно проверив распределение на соответствие нормальному, или критерий Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия при р<0,05; при 0,1>р>0,05 упоминали о тенденции к наличию различий.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Чувствительность клеток БР и N8? к действию редко- и плотнононнзнрующего излучения.

Относительное количество клеток БР в интактных культурах линий В16 и МСБ-7 в логарифмической стадии роста составляло в среднем (±БЕ) 0,90±0,04 и 1,81±0,04 %, соответственно.

В обеих клеточных культурах определено абсолютное и относительное количество клеток БР в контроле и после воздействия редкоионизирующего излучения в дозах 1,0-20,0 Гр. Исследование носило сравнительный характер, в тех же экспериментальных условиях определено количество клеток МБР. Данные представлены на рисунках 2, 3. Абсолютное количество клеток ЫБР, составляющих подавляющее большинство в изученных клеточных культурах, уменьшалось в зависимости от дозы радиационного воздействия в обеих линиях, хотя и в несколько разной степени. Клетки В16 являлись более чувствительными к радиационному воздействию по сравнению с МСР-7 по критерию уменьшения абсолютного числа клеток во флаконе.

Зарегистрировано статистически значимое увеличение абсолютного количества клеток БР в культурах В16 и МСБ-7 при дозах 1,0 Гр и выше по сравнению с контролем (р<0,05 по критерию Манна-Уитни, рисунок 3). Этот показатель достигал максимальной величины при дозах 5,0-10,0 Гр, затем несколько снижался (статистически незначимо).

о о

ш о

о. X

со

2 ш

X (Л

о 1- -н

о О)

§ X

о ф 3-

ш га

1-о о X со

т о

0)

Ц о X ■3

¥ ф

о о о. и

X § о X о

Ц ы

о л

о ц

3 ■&

В16 МСР-7

ю

Доза, Гр

Рисунок 2 - Уменьшение абсолютного количества клеток КБР изучаемых культур линий В16 и МСР-7 в зависимости от дозы радиационного воздействия

о. со

01 5 X <0 У

га х

Г) ф

ф X

9

Q. О

§

!£ Ф

0

Е g

1 °

5 * о га

ю ¿

< о

ш

10 15 20

Доза, Гр

Рисунок 3 - Абсолютное количество клеток БР, выявленное после радиационного воздействия в разных дозах на культуры линий В16 и МСБ-7

Таким образом, по критерию изменения числа клеток во флаконе в близкие сроки после воздействия показана более высокая резистентность SP обеих клеточных культур к действию у-излучения б0Со. При оценке клоногенной способности также установлено, что клетки SP обеих клеточных культур более резистентны к действию у-излучения по сравнению с NSP, в то время как их чувствительность к нейтронному излучению в представленном диапазоне доз статистически значимо не различается. Так, при действии у-излучения на отсортированные клетки В16 D0 составляет в среднем (±SE) 2,3±0,3 Гр для SP и 1,4±0,2 Гр для NSP (р=0,047 по U-критерию Манна-Уитни). Относительная биологическая эффективность нейтронного излучения по сравнению с у-излучением составляет 2,6 для клеток SP и 2,1 для NSP на уровне D10. Рисунок 4 иллюстрирует результаты исследования клеток линии В16, сходные данные получены в отношении линии MCF-7.

Изменение количества клеток SP и NSP меланомы В16 и рака молочной железы MCF-7 под действием метотрексата.

Для сопоставления эффекта действия метотрексата в разных культурах абсолютное число клеток в контроле было принято за 100%, остальные числа отнормированы по этому значению. Результаты, представляющие изменение количества клеток NSP и SP обеих клеточных культур во флаконах при различной концентрации метотрексата, приведены на рисунках 5 и 6.

к

с;

о

о. н ш

X со

о ■н

ф

ь о X X ф

т

(б

л 1- X п

о ф

о ф

2 X

0> Ч

(б ш

ш о.

о

*

Л

Ш

Доза, Гр

Рисунок 4 — Зависимость выживаемости клеток изучаемых популяций линии В16 от дозы ионизирующих излучений: 1 - клетки БР, у-излучение; 2 - клетки N8?, у-излучение; 3 - клетки БР, нейтронное излучение; 4 - клетки КБР, нейтронное излучение

о. от г

ж о н

о §

о

ш

й ш

с

о ф

о

X I-2 с; о о

3

2 ш х от ш -н

I5

О X X Р)

£ <»

5 ®

о х

о- Ч

Ф

£ о.

9 о

Г—1—! т

*

т

Метотрексат Метотрексат Контроль 1 МКГ/МЛ 5 Мкг/мл

Рисунок 5 - Уменьшение абсолютного количества клеток ИБР через 48 ч

инкубации с метотрексатом в различных концентрациях р<0,05 по критерию Манна-Уитни по сравнению с интактным контролем

В обеих культурах происходило значительное уменьшение количества клеток N5? под влиянием метотрексата по сравнению с контролем. При этом в культуре линии МСБ-7 отмечалось увеличение количества клеток БР, в то время как в культуре линии В16 обнаружено уменьшение абсолютного количества клеток БР (статистически значимое при использовании метотрексата в 5-кратной дозе) по сравнению с интактным контролем.

о

с :

о

о X 2 ш 180

X га X В] (Л 4-1 160

ш о О)

о а. 140

о. >. X

5 2 >> 2 о X а> т 120

О. га

О X X <•> 100'

5 аГ X с о а. 1-х о а> X Ч 80' 60

о ш

П о о. о 40'

С

-9- 20-

о

ш 0'

Контроль

Метотрексат 1 м кг/мл

Метотрексат 5 м кг/мл

Рисунок 6 - Абсолютное количество клеток БР после инкубации изучаемых культур с метотрексатом в различных концентрациях в течение 48 ч * р<0,05 по критерию Манна-Уитни по сравнению с интактным контролем, ** р<0,01 по критерию Манна-Уитни по сравнению с интактным контролем

Относительное и абсолютное количество клеток вР и N8? линии МСР-7 после инкубации с цисплатином и салиномицином.

На более резистентной к метотрексату культуре, МСБ-7, было изучено действие цисплатина и салиномицина. Под влиянием обоих химиопрепаратов происходило статистически значимое уменьшение абсолютного количества клеток N8? во флаконах (данные не показаны). При этом доля клеток БР статистически значимо возрастала под действием цисплатина, и практически не менялась после инкубации с салиномицином (рисунок 7). Этот факт свидетельствует о более сильном цитотоксическом действии цисплатина на клетки ИБР, чем на клетки БР, в то время как салиномицин показывает примерно одинаковую эффективность в отношении элиминации обеих популяций.

ш

.о С/)

о- +1 - 0> О. 5 СО I 0> т ГО

ъе О

I8

2 о £ * о.

**

**

I I Салиномицин У////У/Л Цисплатин

Ж

ш

т

Контроль 1-кратная 5-кратная

[С] препарата [С] препарата

Рисунок 7 - Доля клеток БР через 48 ч инкубации культуры МСР-7 с салиномицином и цисплатином в однократной (7,5 мкг/мл и 2,5 мкг/мл) и пятикратной (37,5 мкг/мл и 12,5 мкг/мл, соответственно) концентрациях ** - р<0,01 по критерию Манна-Уитни по сравнению с соответствующим

контролем

Механизмы высокой резистентности клеток БР к действию редкоионизирующего излучения но сравнению с остальной массой клеток.

Выяснены особенности клеток БР, участвующие в формировании их более высокой резистентности к редкоионизирующему излучению по сравнению с остальными клетками. Поиск таких особенностей производился с учетом общих факторов радиорезистентности клеток, роль которых установлена для многих биологических объектов, но для БР исследована недостаточно или совсем не исследована.

Распределение клеток изучаемых популяций по фазам клеточного цикла.

Полученные результаты свидетельствуют о существенных различиях в распределении клеток БР и КБР по фазам клеточного цикла, в частности, о состоянии относительного пролиферативного покоя клеток БР меланомы линии В16 и аденокарциномы молочной железы МСР-7 по сравнению с клетками ЫБР (таблица 1).

Известно, что фазы 01(00) являются относительно радиорезистентными, а при прохождении Б-фазы радиочувствительность клеток достаточно сильно изменяется, достигая максимума в ранней Б-фазе и минимума - в поздней. Различие в радиочувствительности клеток БР и ИБР, по крайней мере, частично

может объясняться разным распределением клеток изучаемых популяций по фазам цикла.

Таблица 1 - Доля отсортированных клеток БР и ИБР линий В16 и МСБ-7 в разных фазах цикла

Популяция клеток Доля клеток в соответствующих фазах цикла, среднее значение ±8Е, %

С1(С0) Б С2+М

В16 N8? 38,4±5,5 20,4±4,8 41,2±8,5

В16 вР 85,5±3,7* 0,4±0,4* 14,1±4,1*

МСР-7 N8? 51,7±1,9 40,1±1,6 8,2±0,6

МСР-7 БР 83,6±0,9* 16,3±1,0* 0,1±0,1*

* р<0,01 по сравнению с долей клеток ЫБР в соответствующей фазе цикла

Сравнительная оценка спонтанных и радиационно-индуцированных двунитевых повреждений ДНК но количеству фокусов уН2АХ в клетках БР и КБР.

Результаты поклеточного определения количества фокусов уН2АХ с помощью лазерной конфокальной микроскопии представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Среднее количество фокусов уН2АХ в клетках линии В16 до и через 60 мин после облучения в дозе 3,0 Гр

Популяция клеток Количество фокусов уН2АХ в клетке

Контроль (среднее значение±8Е) После облучения (среднее значение±8Е)

8Р 7,2 ± 1,6 24,4 ± 3,7

N8? 4,0 ± 1,3 40,3 ± 3,4

Примечание: различия значимы между всеми группами при р<0,05 по критерию Манна-Уитни

Для интактных клеток БР характерно значимо большее количество двунитевых повреждений ДНК, чем для ЫБР. Облучение в дозе 3,0 Гр статистически значимо увеличивало количество уН2АХ-фокусов в обеих группах. Действие облучения на клетки меланомы В16 проявлялось значительно сильнее в группе ЫБР: количество уН2АХ-фокусов увеличивалось в 10,1 раз; при этом в клетках БР количество уН2АХ-фокусов после облучения всего в 3,4 раза превышало контрольное значение.

Полученные данные согласуются с информацией о распределении по фазам клеточного цикла клеток БР и КБР. Известно, что количество радиационно-индуцированных фокусов уН2АХ в 2-3 раза выше при облучении клеток в фазе 02, чем в в1 (Как) Т.А. е1 а1., 2009). Поэтому вполне закономерно, что в клетках БР, находящихся в основном в 01(00)-фазах, возникает меньшее количество таких фокусов после облучения, чем в ИБР.

Содержание оксида азота (II) в клетках сравниваемых популяций.

Установлено, что содержание N0 в клетках БР обеих клеточных культур статистически значимо меньше, чем в клетках КБР (р<0,05). Известно, что оксид азота и продукты его окисления повреждают ДНК и ингибируют ферменты репарации ДНК, поэтому обнаруженные различия по содержанию оксида азота в разных популяциях могут быть одной из причин разной радиочувствительности БР и КБР.

Конститутивный и радиационно-индуцированный уровень БТШ27 и БТШ70 в изучаемых популяциях клеток.

Как и в контроле, после облучения содержание БТШ27 было выше в клетках БР по сравнению с N8? (р<0,01). При этом увеличение этого показателя после облучения в клетках БР было выражено сильнее - средний уровень увеличивался на 56% относительно контроля, в то время как в N8? лишь на 25% (рисунок 8) .

5 ч

0)

3"

X X

О I-

и о

о

о а. о ИГ <0 160 -

>< +1

с; Ф

-е- X 140 -

л ф

ь У

о о п X 120 -

X С")

ш ф ф 100 -

О X

X ф Ч

IX о. 0 - -

з: о

ЭР, БТШ27 ^Р, БТШ27

Контроль

Облучение, 5 Гр

Рисунок 8 - Содержание БТШ27 в клетках БР и КБР линии МСР-7 в контроле и через 20 ч после облучения в дозе 5,0 Гр ** р<0,01 по критерию Манна-Уитни по сравнению с соответствующим

контролем

Уровень экспрессии БТШ70 после облучения возрастал лишь в клетках БР (на 121% от контроля, р<0,01), а в ЫБР статистически значимо не менялся.

Учитывая, что БТШ являются известным фактором клеточной радиорезистентности, данные о более выраженном увеличении содержания изучаемых БТШ в клетках БР по сравнению с КБР под влиянием облучения являются первым доказательством участия БТШ27 и БТШ70 в формировании повышенной резистентности клеток БР к редкоионизирующему излучению.

выводы

1. Резистентность клеток БР линии В16 меланомы и линии МСР-7 рака молочной железы к действию у-излучения 60Со значимо выше, чем таковая клеток МБР, в широком диапазоне доз до 20,0 Гр.

2. Чувствительность клеток БР линии В16 меланомы и линии МСР-7 рака молочной железы к действию нейтронного излучения значительно выше по сравнению с таковой к действию у-излучения. Чувствительность клеток БР и ЫБР к нейтронному излучению не отличается в обеих клеточных линиях.

3. Метотрексат в концентрации 1 мкг/мл оказывает цитотоксическое действие на основную массу клеток (ЪГБР) обеих культур, но является неэффективным с точки зрения воздействия на клетки БР. Цисплатин в концентрации 2,5 мкг/мл и выше также преимущественно воздействует на ЫБР, увеличивая долю БР в культуре МСР-7 более чем 3 раза. Салиномицин является наиболее эффективным препаратом для элиминации БР по сравнению с цисплатином и метотрексатом.

4. Для клеток БР характерно состояние относительного пролиферативного покоя, о чем свидетельствует распределение по фазам клеточного цикла: суммарная доля клеток в Б, в2+М фазах была многократно ниже в БР, чем в ЫБР, составляя в БР обеих клеточных линий не более 16,5 %. Этот результат частично объясняет более высокую резистентность клеток БР, чем КБР, обеих клеточных культур к действию редкоионизирующего излучения и некоторых химиопрепаратов.

5. Содержание N0, одного из показателей состояния окислительно-восстановительной системы, в клетках МБР обеих клеточных культур статистически значимо выше, чем в БР, что также может являться одной из причин более высокой резистентности клеток БР к редкоионизирующему излучению.

6. Количество радиационно-индуцированных двунитевых повреждений ДНК, регистрируемое по числу фокусов уН2АХ после у-облучения в дозе 3,0 Гр, значимо меньше в клетках БР по сравнению с ЫБР (24,4±3,7 УБ 40,3±3,4 на клетку, соответственно). Увеличение числа двунитевых повреждений ДНК по сравнению с контрольным уровнем выражено значительно сильнее в клетках МБР, чем БР (в 10,1 и 3,4 раз, соответственно), что также частично объясняет более высокую радиорезистентность последних.

7. Содержание БТШ27 и БТШ70 в клетках БР после облучения в дозе 5,0 Гр статистически значимо увеличивается по сравнению с контрольным значением (на 56% и 121%, соответственно). Содержание БТШ27 в клетках №Р увеличивается в ответ на радиационное воздействие в меньшей степени, чем в клетках БР (на 25% УБ 56% по сравнению с контролем), а содержание БТШ70 в клетках МБР не меняется после облучения. Полученные результаты подтверждают предположение об участии БТШ27 и БТШ70 в формировании радиорезистентности клеток БР на примере линии МСР-7.

8. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности разработки в дальнейшем противоопухолевых средств или способов с направленным действием на БР на основе использования плотноионизирующих излучений, модификаторов синтеза N0, ингибиторов БТШ27 и БТШ70.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Проскуряков, С.Я. Современное состояние и перспективы разработки новых подходов к лечению меланом / С.Я. Проскуряков, О.Н. Матчук, И.А. За-мулаева// Вестник РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. -2011. -Т. 22, № 2. - С.31-40.

2. Матчук, О.Н. Чувствительность клеток SP линии меланомы В16 к действию редко- и плотноионизирующего излучений / О.Н. Матчук, И.А. Замулаева, Е.И. Селиванова, Н.М. Липунов, К.А. Пронюшкина, С.Е. Ульяненко, А.А. Лычагин, С.Г. Смирнова, Н.В. Орлова, А.С. Саенко // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2012. - Т. 52, № 3. - С. 261-267.

3. Матчук, О.Н. Механизмы радиорезистентности клеток SP культуры мышиной меланомы В16 / О.Н. Матчук, И.А. Замулаева, О.А. Ковалев, А.С. Саенко // Цитология. - 2013. - Т. 55, № 8. - С. 553-559.

4. Матчук, О.Н. Влияние редкоионизирующего излучения и химиопрепаратов на опухолевые стволовые клетки (SP) меланомы В16 и аденокарциномы молочной железы MCF-7 / О.Н. Матчук, А.С. Саенко // Радиация и риск. Бюллетень Национального радиационно-эпидемиологического регистра. - 2013. - Т. 22, № 2. - С. 67-76.

5. Matchuk, O.N. Radioresistance mechanisms of side population cells in mouse melanoma cell line B16 / O.N. Matchuk, I.A. Zamulaeva, O.A. Kovalev, | A.S.] jSaenko [ // Cell and Tissue Biology. - 2013. - V. 7, № 6. - P. 556-562.

6. Замулаева, И.А. Увеличение количества опухолевых стволовых клеток под воздействием редкоионизирующего излучения / И.А. Замулаева, О.Н. Матчук, Е.И. Селиванова, В.Г. Андреев, Н.М. Липунов, С.А. Макаренко, Л.П. Жаворонков, j А.С. Саенко Радиационная биология. Радиоэкология. - 2014. -Т. 54, №3.-С. 256-264.

7. Colvin, Т.А. Hsp70-Bag3 interactions regulate cancer-related signaling networks / T.A. Colvin, V.L. Gabai, J. Gong, S.K. Calderwood, H. Li, S. Gummuluru, O.N. Matchuk, S.G. Smirnova, N.V. Orlova, I.A. Zamulaeva, M. Garcia-Marcos, X. Li, Z. Young, J.N. Rauch, J.E. Gestwicki, S. Takayama, M.Y. Sherman // Cancer Res. - 2014. - V. 74, № 17. - P. 4731-4740.

8. Kondrasheva, I. Molecular features of the human melanoma side population sensitivity to the antitumor drugs and gamma-irradiation / I. Kondrasheva, E. Moskaleva, I. Zamulaeva, A. Saenko, S. Smirnova, N. Orlova, E. Selivanova, O. Matchuk, S. Severin // Abstracts of the 4th International Congress of Molecular Medicine. - Istanbul, Turkey, 2011. - P. 324.

9. Замулаева, И.А. Низкая радиочувствительность опухолевых стволовых клеток меланомы В16, выявляемых по способности исключать Хехст33342 / И.А. Замулаева, О.Н. Матчук, Н.М. Липунов, А.С. Саенко // Материалы XV Российского онкологического конгресса. - Москва, 2011. - С. 209-210.

10. Липунов, Н.М. Сопоставление результатов лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и проточной цитометрии при регистрации редких событий / Н.М. Липунов, О.Н. Матчук // Материалы первой международной научно-технической конференции «Компьютерная биология — от фундаментальной науки к биотехнологии и биомедицине». - Пущино, 2011. -С. 57-58.

11. Matchuk, O.N. Sensitivity of Melanoma B16 Side Population Cells to Ionising Radiation and Methotrexate / O.N. Matchuk, A.S. Saenko // Abstracts of the 39th Annual Meeting of the European Radiation Research Society. - Vietri sul Mare, Italy, 2012,- P. 242.

12. Матчук, O.H. Разработка и апробация модели опухолевых стволовых клеток для тестирования эффективности новых противоопухолевых воздействий / О.Н. Матчук // Тезисы докладов итогового заседания регионального конкурса молодежных инновационных научно-технических проектов по Программе «У.М.Н.И.К.». - Обнинск, 2012. - С. 35-42.

13. Матчук, О.Н. Чувствительность клеток боковой популяции (SP) меланомы В-16 к действию метотрексата и у-излучения / О.Н. Матчук // Материалы VII съезда онкологов и радиологов стран СНГ. - Астана, Республика Казахстан, 2012. - С. 499-500.

14. Матчук, О.Н. Изучение экспрессии БТШ 27, 70 в ОСК клеточных культурах опухолевых линий / О.Н. Матчук // Сборник тезисов работ участников Всероссийской научной школы для молодежи «Современные методы флуоресцентной визуализации в биомедицинских и биотехнологических исследованиях». — Москва, 2012. — С. 50.

15. Матчук, О.Н. Особенности экспрессии БТШ27 и БТШ70 в опухолевых стволовых клетках на примере рака молочной железы линии MCF-7 / О.Н. Матчук // Сборник тезисов VIII Всероссийского Съезда онкологов «Онкология XXI века - от научных исследований в клиническую практику». -Санкт-Петербург, 2013. - С. 304.

16. Zamulaeva, I.A. Features of HSP27 and HSP70 expression in SP of breast cancer cell line MCF-7 / I.A. Zamulaeva, O.N. Matchuk, L.P. Zhavoronkov, A.S. Saenko // Abstracts of the 4th International Conference on Stem Cells and Cancer (ICSCC-2013): Proliferation, Differentiation and Apoptosis. - Mumbai, Maharashtra, India, 2013.-P. 127.

17. Пронюшкина, К.А. Сравнительный анализ изменений хроматина в стволовых и не стволовых клетках рака молочной железы линии MCF-7 под действием ионизирующего излучения / К.А. Пронюшкина, О.Н. Матчук, И.А. Замулаева // Сборник тезисов Международной научной конференции «Радиобиологические основы лучевой терапии опухолей» памяти Александра Семеновича Саенко. - Москва, 2013. - С. 18.

18. Selivanova, E.I. Evaluation of photodynamic treatment effects on cancer stem cells in vitro / E.I. Selivanova, S. Makarenko, O. Matchuk, A. Mihailovskaya, I. Zamulaeva // Abstracts of the 39th ESMO Congress: Annals of oncology. - Madrid, Spain, 2014.-P. 1661.

19. Замулаева, И.А. Гетерогенность опухолевых клеток по чувствительности к радиационным и химическим воздействиям: результаты экспериментальных и клинических исследований с позиции гипотезы опухолевых стволовых клеток / И.А. Замулаева, О.Н. Матчук, С.А. Макаренко, Е.И. Селиванова, Н.М. Липунов, С.Е. Ульяненко, М.А. Каплан, Н.П. Ткаченко, В.Г. Андреев // Материалы докладов VII съезда по радиационным исследованиям. — Москва, 2014. — С. 33.

Заказ № 402 от 10.03.2015. Тираж 100 экз. Объём 1 п.л. Формат 60x84 'Дб. Печать офсетная.

Отпечатано в МП «Обнинская типография» 249035 Калужская обл., г. Обнинск, ул. Комарова, 6