Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние интеграции генных конструкций MT1-GRF и WAP-hGH на биологические и хозяйственно-полезные признаки трансгенных свиней разных поколений

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Влияние интеграции генных конструкций MT1-GRF и WAP-hGH на биологические и хозяйственно-полезные признаки трансгенных свиней разных поколений"

На правах рукописи

РАЛКОВ Иван Александрович

ВЛИЯНИЕ ИНТЕГРАЦИИ ГЕННЫХ КОНСТРУКЦИЙ

МП-СШ? И WAP-hGH НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ И

\___

ХОЗЯЙСТВЕННО-ПОЛЕЗНЫЕ ПРИЗНАКИ ТРАНСГЕННЫХ СВИНЕЙ РАЗНЫХ ПОКОЛЕНИЙ

03.02.07-ГЕНЕТИКА 03.03.01 - ФИЗИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровицы-2011

4851046

Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научные руководители: доктор сельскохозяйственных наук,

академик РАСХН Эрнст Лев Константинович; доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАСХН Зиновьева Наталия Анатольевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Калашникова Любовь Александровна; доктор биологических наук, профессор Шихов Игорь Яковлевич

Ведущее учреждение - ФГОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К Л. Скрябина.

Защита состоится июля 2011 года, в 10 часов, на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Адрес института: 142132, Московская область,

Подольский район, пос. Дубровицы, ГНУ ВИЖ. т/факс (4967) 651101

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан » июня 2011 года.

Ученый секретарь Совета Д 006.013.03

И.В. Гусев

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Разработка методов интеграции чужеродных генов в геном организмов открыла новый этап исследований в области генетики сельскохозяйственных животных (Hammer R.E. et al., 1985, Brem G. et al., 1985). С использованием таких методов были получены трансгенные животные разных видов (Church R.B., 1989, Brem G. et al., 1993, Pursei V.G. et al., 1993, Зиновьева H.A. и др., 1998, Эрнст JI.K. и др., 2002), что явилось доказательством возможности функционирования интегрированных единиц наследственности в организме реципиента. Благодаря технологиям трансгенеза человек получил совершенно новые, неизмеримо более эффективные системы изменения генома животных (Эрнст JI.K. и др., 1993, Эрнст JI.K., 1995). На современном этапе развития науки перспективным является создание трансгенных животных, обладающих заданными продуктивными качествами (Эрнст JI.K., Зиновьева H.A., 2008). Вместе с тем, взаимодействие интродуцированной конструкции и генома-хозяина не может быть сведено к простому суммированию различных генетических задатков. Интеграция чужеродных генов, являясь по своей природе сходной мутации (инсерции), может привести к изменению в системе морфологических корреляций, затрагивая, тем самым, известную область процессов индивидуального развития, а не изолированный процесс отдельного признака (Кленовицкий П.М., 1997, Калашникова Л.А., 1998).

Исходя из выше изложенного, аюуальным является изучение биологических и продуктивных особенностей живых организмов, стабильно интегрировавших чужеродную ДНК.

Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы явлось изучение влияния интегрированных в геном генных конструкций рилизинг-факгора гормона роста человека (MT1-GRF) и гормона роста человека (WAP-hGH) на физиолого-биохимические и иммунологические особенности, а также хозяйственно-полезные признаки трансгенных свиней разных поколений.

Для достижения цели диссертационной работы были поставлены следующие задачи:

• Выполнить исследование уровня соматотропина в крови свиней, трансгенных по WAP-hGH, MT1-GRF (генерации II и VIII), а так же их аналогов.

• Изучить особенности роста и развития опытных и контрольных свиней.

• Оценить биохимический статус трансгенных свиней и их аналогов.

• Изучить особенности гуморального иммунитета трансгенных свиней в норме и при повышенной иммунной нагрузке (вакцинация комплексной вакциной ОКЗ).

• Выполнить гистологические и морфометрические исследования некоторых внутренних органов и тканей опытных и контрольных свиней в пренатальный и постнатальный периоды.

• Изучить показатели мясной и откормочной продуктивности опытных и контрольных свиней.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное исследование свиней, трансгенных по генной конструкции MT1-GRF 2-й и 8-й генераций, а так же свиней, трансгенных по WAP-hGH 4-й генерации. Показано стабильное сохранение повышенного уровня соматотропина в сыворотке крови трансгенных свиней разных генераций. Установлено влияние интеграции и экспрессии трансгенов на изменение ряда физиолого-биохимических показателей индивидуумов: показателей сыворотки крови, характеризующих уровень обмена веществ (концентрации общего белка, активности АЛТ и ACT, содержания полиненасыщенных жирных кислот), гистологических и морфометрических показателей внутренних органов в пренатальный (поздний плодный) и постнатальный периоды (диаметр мышечных волокон, диаметр фолликулов щитовидной железы), титров антител к возбудителям острых кишечных инфекций в норме и при повышенной иммунной нагрузке (вакцинация комплексной вакциной ОКЗ).

Практическая значимость. Показано сохранение интеграции и экспрессии трансгенов в ряде поколений, что служит основой создания стабильных линий трансгенных животных. Установлены повышенные темпы роста свиней, трансгенных по MT1-GRF, начиная с возраста 200 дней, что позволяет их рекомендовать для откорма до тяжелых кондиций.

Положения, выносимые на защиту ■S Повышенный уровень соматотропина в крови трансгенных свиней S Более высокие темпы роста свиней, трансгенных по MT1-GRF, при откорме до тяжелых кондиций

S Изменение некоторых биохимических показателей крови трансгенных свиней

^ Повышение содержания антител к антигенам возбудителей острых кишечных заболеваний у трансгенных свиней по сравнению с аналогами

S Изменение гистологических и морфометрических показателей некоторых внутренних органов трансгенных свиней.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на конференциях:

• Ш международной научно-практической конференции «Современные технологические и селекционные аспекты развития животноводства России», п. Дубровицы, ВИЖ, 2005;

• конференции Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, п. Дубровицы, май 2011 г.

Структура и объем работы. Диссертация написана на 105 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Диссертационная работа содержит 20 таблиц и 10 рисунков. Список литературы включает 161 источник, в том числе 82 источника на иностранном языке.

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ (Достижения науки и техники АПК, Свиноводство).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследования проводили в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии в период с 2003 по 2010 гг. по схеме, представленной на рисунке 1.

Рис. 1. Схема исследований

Свиньи были получены в экспериментальном хозяйстве института ФГУП э/х «Кленово-Чегодаево» методом искусственного осеменения

трансгенных и нетрансгенных маток семенем трансгенных хряков. Для проведения научно-хозяйственного опыта по достижении свиньями живой массы 25-30 кг они были перевезены на физиологический двор ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, где были сформированы группы по принципу одногнездовых аналогов. Откорм проводили до достижения свиньями возраста 280 дней. Кормление осуществляли два раза в день полнорационным комбикормом СК-5 с повышенным (на 20%) за счет добавления рыбной муки уровнем протеина в сравнении с детализированными нормами кормления.

Содержание соматотропина в крови свиней определяли в возрасте 5-и 9-и месяцев методом иммуноферментного анализа. Биохимический анализ крови свиней проводили в возрасте 9-и месяцев совместно с сотрудниками лаборатории биохимии ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии. Для изучения иммунного ответа животные были вакцинированы вакциной ОКЗ, согласно наставлению по применению, с последующей ревакцинацией (исследования были проведены совместно с лабораторией болезней молодняка МГАВМиБ им. К.И. Скрябина под руководством академика Воронина Е.С.). По окончании опыта и при достижении свиньями живой массы 110-120 кг в условиях убойного пункта фермы «Дубровицы» был произведен контрольный убой подопытных животных по методике ВИЖ с детальным изучением развития и гистологической структуры некоторых внутренних органов, анэтомо-морфологического состава туш.

Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым методикам, принимая за минимальный порог достоверности р<0,05.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Анализ содержания соматотропного гормона в крови свиней

Уровни соматотропина в крови свиней изучаемых групп в 5- и 9-месячном возрасте представлены в таблице 1.

_Табл. 1. Содержание соматотропина в крови свиней_

Группы Содержание соматотропина, нг/мл, в возрасте:

145 дней 260 дней

Опыт (п=3) Опыт-контроль Опыт в % к контролю Опыт (п=3) Опыт-контроль Опыт в % к контролю

I Контроль 0,68±0,3 0,65±0,3

П WAP-hGH 1,53±0,2 0,85 +125,0 3,10±0,9 2,45 +376,9

Ш MT1-GRF (F2) 1,00±0,5 0,32 +47,1 1,10±0,5 0,45 +69,2

IV MT1-GRF (F8) 0,93±0,4 0,25 +36,8 1,76±1,0 1,10 +170,8

Как показано в таблице 1, содержание соматотропина в крови трансгенных животных всех групп было выше, чем в контроле. Наибольшее содержание соматотропина отмечалось у свиней, трансгенных по АР-ИОН (группа П), и было в возрасте 5 месяцев в 2,25 раза выше, чем в контроле. У

свиней, трансгенных по MT1-GRF 2-й и 8-й генераций (группы Ш, IV), разница составила 47,1 и 36,8%, соответственно. В возрасте 9-и месяцев в контрольной группе отмечалась тенденция к снижению уровня соматотропина в 1,1 раза, по сравнению с показателями 5-месячного возраста, в то время как в группах трансгенных животных (группы П, III и IV) этот показатель увеличивался и составил, соответственно, +376,9, +69,2 и +170,8% по отношению к контролю. Следует отметить, что максимальное содержание СТГ, как в 5-и, так и в 9-и месячном возрасте наблюдалось в крови свиней, трансгенных по WAP-hGH.

Таким образом, становится очевидным, что трансгенные животные характеризуются более высоким содержанием соматотропина. В то время как у контрольных животных в условиях преобладания катаболических процессов уровень соматотропина снижается, у трансгенных животных этот показатель увеличивается и, возможно, говорит о преимущественно анаболических процессах в организме.

3.2. Рост и развитие трансгенных свиней

Результаты изменения живой массы свиней представлены на рисунке 2. Как показано на рисунке 2А, более существенные различия в живой массе по сравнению с контролем наблюдались у свиней, трансгенных по MT1-GRF (группы Ш, IV). Животные этих групп превышали контрольных по живой массе на 22,5-54,0 и 16,1-43,8%. Наибольшие различия отмечались в возрасте 200 и 240 дней, в котором живая масса трансгенных свиней превышала живую массу контрольных свиней, соответственно, на 54,0 и 43,8% (группа III) и 45/7 и 29,3% (группа IV) (рис. 2Б).

Примечание: группы свиней: I - контроль; II - 1¥АР-!гОЯ; III - МП-ОКР, /"2; IV - МП-вК¥, Ж Рис. 2. Динамика (А) и различия в живой массе трансгенных свиней по сравнению с контрольными (Б) по периодам выращивания

Данные о среднесуточных приростах трансгенных свиней по периодам выращивания обобщены в таблице 2.

Табл. 2. Среднесуточные приросты трансгенных и контрольных свиней

на откорме

Группа Среднее уточные привесы (г) по возрастам

116 дн. 170 дн. 200 дн. 240 дн. 266 дн. 280 ДН. За весь период

I. Контроль 241±13 242±11 486±13 379±57 570±10 607±66 421±65

II. \УАР-ЬОН 204±16 246±42 634±24 459±57 644±12 573±11 460±79

III. МТ1-а1Р, ¥2 198±13 374±27 960±63 518±67 757±52 961±59 628±29

IV. МП-вЯТ, Б8 281±15 314±36 665±65 507±56 695±12 800±47 544±86

Как следует из данных таблицы 2, наиболее высокими среднесуточными приростами отличались свиньи, трансгенные по генной конструкции МП-ОМ7: у свиней 2-й генерации (группа Ш) среднесуточный прирост за весь период выращивания составил 628 г, а у свиней 8-й генерации (группа IV) - 544 г против 421 г в контроле. Существенных различий в среднесуточных приростах между свиньями, трансгенными по \VAP-hGH и контролем выявлено не было. Следует отметить, что экспрессия ОКР оказывала положительное влияние на прирост живой массы в более позднем возрасте, когда экспрессия эндогенного соматотропина снижалась. Это позволяет рассматривать вариант технологии откорма трансгенных свиней до более высоких, по сравнению с общепринятыми, кондиций.

Абсолютная и относительная величины массы внутренних органов животных являются важными параметрами, позволяющими судить о причинах изменения продуктивности животных. В таблице 3 суммированы данные о процентном отношении массы органов трансгенных животных к их аналогам в сравнении с другими авторами.

Табл. 3. Отношение массы органов трансгенных животных к аналогам в

различных поколениях (опыт в %% к контролю)

Разница (опыт в %% к контролю)

Поколение II* III IV IV V V У1геми VI гомо VII VIII*

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Возраст, дн 280 353 314 140 212 212 280

Масса (опыт/ 95/122 124/125 141/146 158/150 163/167 103/105 121/114 117/114 103/106 95/111

контроль), кг

Число голов 3/6 6/3 13/14 4/4 4/5 5/5 6/3 3/3 20/12 3/6

(опыт/контроль)

Голова 3,6 -2,2 1,4 17,2 -1,4

Сердце 0,0 -1,9 -5,9

Легкие 3,9 -10,3 6,9 27,2 1,1 -9,9™ зд -17,6 17,3 -13,2

Печень 11,4 -658: . -О -1,5 3,5 7,5 -1,6 4,4

Почки 19,2 4,3 -1,3 -3,6 5,4 3,6 -1,5 2,5 10,3 3,8

Селезенка -20,0 -25,0 4,7 18,7 -3,2 7,5 1,3 17,5 -9,9 -6,7

Матка 8,7 38,8 30,9 -24,4 -0,9 121,4

Пр. яичник 75,8 -26,8 12,6

Лев. яичник 90,2 -28,4

Продолжение табл.3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Мочев. пузырь -12,2 -8.7 -17,2

Поджал, жел. 7,7 ..-44, 2,4 -ад ■.. -2,8 -7,1 -2,1

Сальник -21,7 -24,3 -15,4

Желчный пузырь Л,9

Щитов, железа 32,4 -10,9 •16,2 : 11,9 ; ГШ 3,6 2,4

Гипофиз 0 12,8 12,8

Надпочечник 1 19,3 -11,4 1,2 -4,7 -13,2 0,9 -25,9

Надпочечник 2 4,8 48 3,7

Брыжейка _-29,7 -7,8 -52,6

Околопоч. жир -11,7 -11,7 -31,7

Внутрен. жир -33,8 -24,6 -19,4 -31,7 10,6 -20,3 7,4

ЖКТ без содкрж. -0,4 -7,8 10,3 3,0

Желудок 3,3 4,7 53,6 0,5 -16,8

Тонкий кишечник -9Д 21,9 1,6 -0,5

Толстый кишечн. -10,6 -1,7 -8,4 12,5

Примечание: *резулътаты собственных исследований.

Анализируя данные таблицы 3, следует отметить тенденцию уменьшения у трансгенных животных массы внутреннего жира, сальника, брыжейки, околопочечного жира, печени, мочевого пузыря. По массе сердца и желчного пузыря, трансгенные животные в ряде поколений, наоборот, превосходили контрольных аналогов. Анализ массы желез внутренней секреции позволяет проследить тенденцию снижения массы поджелудочной железы в ряде генераций (табл. 3, 4). Весовые характеристики щитовидной железы, надпочечников и гипофиза трансгенных и контрольных свиней различались, однако выявленные различия носили разнонаправленный характер (табл. 3, 4).

Табл. 4. Весовые характеристики некоторых желез внутренней секреции

трансгенных свиней и их аналогов

Группа Железы Масса, г Опыт - контр. Опыт в % к контр. СУ, %

I. Контроль (п=6) Поджелудочная 0,13±0,01 0,01 7,7 19,04±5,5

Щитовидная 6,67±1,4 2,16 32,4 46,15±13,3

Надпочечники 5,17±0,4 1 19,3 19,03±5,5

Гипофиз 0,39±0,03 0 0 15,8±4,5

11. \VAP-hGH (п=3) Поджелудочная 0,13±0,01 0 0 8,11±3,3

Щитовидная 8,0 1,33 19,9 0*

Надпочечники 7,5±1,5 2,33 45,1 29,06±11,9

Гипофиз 0,4±0,1 0,01 2,6 18,06±7,4

ей о Я5? 1= ~ Н со 2 Поджелудочная 0,14±0,01 0,01 7,7 8,88±3,6

Щитовидная 8,83±0,9 2,16 32,4 14,24±5,8

Надпочечники 6,17±0,5 1 19,3 12,39±5,1

Гипофиз 0,39±0,02 0 0 7,74±3,2

IV. МТ1-ОКР Р8 (п=3) Поджелудочная 0,12±0,03 -0,01 -7,7 32,52±13,3

Щитовидная 6,83±1,1 0,16 2,4 23,52±9,6

Надпочечники 3,83±1,7 -1,34 -25,9 64,34±26,3

Гипофиз 0,44±0,01 0,05 12,8 3,84±1,6

3.3. Характеристика биохимического статуса трансгенных животных

Анализ содержания в сыворотке крови свиней продуктов метаболизма позволил установить, что их концентрация во всех группах находилась в пределах физиологической нормы. Вместе с тем, целью изучения биохимических показателей крови является выявление даже незначительных сдвигов в обмене веществ, происходящих в пределах физиологических границ изучаемых показателей.

3.3.1. Особенности белкового и минерального обмена Результаты анализа показателей белкового и минерального обмена обобщены в таблице 5.

Показатели Ед. измерен. Группы

контроль \VAP-hGH

I П Ш IV

Общий белок г/л 64,2± 10,4 65,4±1,12 67,3±3,78 65,0±3,06

Альбумины г/л 28,7±2,4 26,2±2,92 28,2±4,6 30,3±1,6

Мочевина Ммоль/л 2,85±1,2 3,13±2,3 3,8±1,7 2,5±0,59

Креатинин Ммоль/л 0,10±0,02 0,09±0,006 0,11±0,0009 0,10±0,0009

Глюкоза Ммоль/л 5,039±0,214 5,483±0,543 6,304±0,044 5,422±0,038

Кальций Ммоль/л 2,92±0,037 2,92±0,132 2,85±0,117 3,0±0,065

Фосфор Ммоль/л 2,55±0,24 2,68±0,25 2,141±0,048 2,228±0,300

Как показано в таблице 5, концентрация общего белка в сыворотке крови трансгенных свиней имела тенденцию к повышению по сравнению с контрольной группой. Во II группе (\¥АР-ЬОН) данное значение было выше на 1,9%, в III группе (МП-ОКБ, Р2) - на 4,8% и в IV группе (МТ1-ОШ% Р8) -на 1,2%. Повышение белка в группе II было связано с повышением доли глобулиновых фракций, поскольку значение альбуминов в данной группе ниже на 8,7%, чем в контроле. Аналогично, в III группе повышение доли общего белка было вызвано увеличением глобулиновых фракций, поскольку значение альбуминов в данной группе ниже на 1,7% по сравнению с контролем. В IV группе (8-я генерация), наоборот, значение альбуминов на 5,6% выше, чем в контроле. Полученные нами результаты анализа белкового обмена полностью согласуются с данными, полученными на других генерациях трансгенных свиней.

При относительно равной переваримости и усвояемости протеина корма концентрация мочевины в крови свиней коррелирует с интенсивностью белкового обмена в организме. Так, в группе II уровень мочевины выше на 9,9%, а в Ш - на 33,3%, чем в контроле. У свиней IV группы данное значение ниже на 12,3% (табл. 5). В группе IV, низкое значение мочевины прямо коррелировало с увеличением альбуминов в сыворотке крови свиней, что является отражением более активных процессов белкового синтеза в печени животных данной группы по сравнению с контролем.

Дополнительным показателем интенсивности белкового и энергетического обмена в печени и мышечной ткани животных является активность аминотрансфераз. При сравнительном анализе активности AJIT установлено, что во всех группах трансгенных свиней содержание данного фермента было выше по сравнению с аналогами из контрольной группы на 37,2% в группе П и на 20,9% в группах 1П и IV (рис. 4). Необходимо подчеркнуть, что активность фермента АЛТ у трансгенов положительно коррелировала с уровнем глюкозы в плазме крови. В группе II концентрация глюкозы была на 8,8%, в III - на 25,1% и в IV - на 7,6% выше по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе. Активность ACT также имела несколько более высокое значение в сыворотке крови свиней опытных групп. В группе II активность ACT была выше на 16,7%, в группе Ш - на 27,8% по сравнению с контролем. В группе IV активность данного фермента имела одинаковое значение, что и в контрольной группе (рис. 4). Тенденция к росту активности ACT у трансгенов, связана с интенсификацией биосинтетических процессов в тканях.

Из показателей

минерального обмена были определены содержание в сыворотке крови кальция и фосфора. По содержанию кальция группы не различались, тогда как концентрация фосфора в группах II была на 5,0% выше, а в группах П1 и IV соответственно, на 16,1% и 12,7% ниже, чем в контрольной группе.

Таким образом, проведенные исследования позволили выявить некоторые различия в содержании отдельных метаболитов в сыворотке крови трансгенных свиней по сравнению с контролем.

3.3.2. Особенности липидного обмена у трансгенных свиней

Концентрация общих липидов в сыворотке крови подопытных животных находилась в пределах физиологической нормы и не имела значительных различий в трех группах, за исключением животных,

■ АЛТ «ACT

I II Ш IV

Примечание: группы свиней: I -контроль; II - ШАР-ИвН,; 111 - МП-СЩ F2; IV- МТ1-вЩ ГО. Рис. 4. Активность аминотрансфераз (ИЕ/л) в крови свиней

трансгенных по \VAP-hGH, где содержание общих липидов было на 5,6% выше, чем в группе контрольных животных.

При сравнении классного состава липидов отмечена определенная тенденция к снижению процентного содержания классов липидов для всех групп трансгенных животных в сравнении с контролем. Исключение составило лишь повышенное содержание эфирного холестерола. У свиней, трансгенных по МП-ОМ7 2-й генерации (группа Ш), содержание фосфолипидов было на 13,6%, мобильных и депонированных глицеролов - на 30,0%, холестерола - на 32,0%, триглицеролов - на 6,9% и неэстерифицированных жирных кислот - на 10,0% ниже по сравнению с контролем. У свиней, трансгенных по М'Г 1 -ОИ? 8-й генерации, эта разница в сторону уменьшения по сравнению с контролем составила, соответственно, 11,5, 38,7, 30,6, 6,5 и 5,8%. Пониженный уровень фосфолипидов и триглицеролов в группах трансгенных животных, вероятно, связан со снижением транспорта насыщенных и ненасыщенных жирных кислот.

Обращает на себя внимание увеличение содержания в крови трансгенных свиней

полиненасыщенных жирных кислот -линолевой, линоленовой и арахидоновой (рис. 5). Так, на долю этих жирных кислот у контрольных свиней суммарно

приходилось 7,90%, в то время как у трансгенных свиней П, Ш и IV их содержание составило, соответственно, 1,44, 1,50 и 1,42%. Следует отметить, что суммарное увеличение происходило в результате повышения содержания каждой из вышеназванных жирных кислот, сыворотке крови свинеи, ~/о

3.4. Иммунный статус трансгенных свиней

Для характеристики иммунного статуса трансгенных свиней были исследованы особенности гуморального иммунитета в норме и при повышенной иммунной нагрузке (иммунизация бактериальной вакциной против сальмонеллеза, колибактериоза, клебсиеллеза и протейной инфекции

С18/2 С18/3 С20/4

Примечание: группы свиней: I -контроль; II- WAP-hGH; III -MT1-GRF, F2; IV - MT1-GRF, F8; жирные кислоты: С18/2 -линолевая, С18/3 - линоленовая, С20/4 -арахидоновая

Рис. 5. Содержание полиненасыщенных жирных кислот - линолевой, линоленовой и арахидоновой в

молодняка (вакцина ОКЗ)). В таблице 6 суммированы титры антител к антигенам у свиней контрольной и опытных групп.

Табл. 6. Титры антител к антигенам в сыворотке крови трансгенных и _контрольных свиней после вакцинации вакциной «ОКЗ»_

Тип Группа животных.

антигена I Ш IV П

и сроки Контр. MT1-GRF, F2 MT1-GRF, F8 WAP-hGH

взятия крови Титр Титр % к конт. Титр % к конт. Титр % к конт.

1 107±47 107±32 0 40 -62,5 93±43 -12,5

Е. Coli 2 200±44 267±65 33,3 640± 392 220 267±65 33,3

3 320±78 533±131 66,7 1707±522 433,3 853±261 166,7

Salmonella 1 213±37 187±86 -12,5 187±86 -12,5 187±86 -12,5

2 907±398 1067±261 17,6 2560 182,4 1173±857 29,4

3 853±147 2133±522 150 2560 200 1280 50

1 27±5 53± 16 100 27±8 0 47±22 75,0

Klebsiella 2 420±212 240± 98 -42,9 453±229 7,9 213±65 -49,2

3 560±180 533±131 -4,8 853±261 52,4 533±131 -4,8

1 187±49 133±33 -28,6 80±49 -57,1 133±33 -28,6

Proteus 2 1813±380 1067±261 -41,2 2133±522 17,6 960±392 -47,1

3 1600±351 1280 -20 2560 60 1280 -20

Примечание: 1 -до вакцинации, 2- через 14 дней после 1-й вакцинации, 3-через 14 дней после 2-й вакцинации.

Как следует из данных таблицы 6, наивысший иммунный ответ наблюдался в IV группе (MT1-GRF, F8). В группах П и III наблюдалось повышенное по отношению к контрольным животным содержание антител к E.coli и Salmonella, а к Klebsiella и Proteus - сниженное по отношению к первой и третьей группам. Исходя из этого, можно сделать предположение, что в течение ряда поколений у трансгенных животных происходит перестройка нейроэндокринной рефляции иммунного ответа в сторону усиления последнего. Данное предположение подтверждается аналогичными исследованиями иммунного статуса свиней, трансгенных по MT1-GRF, других генераций.

3.5. Цнтоморфологнческие особенности органов и тканей трансгенных свиней Исходя из теоретических предпосылок, можно утверждать, что организм трансгенных животных подвержен определенным морфологическим изменениям внутренних органов на клеточном уровне. Для выявления данных изменений у подопытных трансгенных животных нами было проведено изучение гистологических характеристик некоторых желез внутренней секреции и мышечной ткани.

В таблице 7 обобщены результаты морфометрических исследований мышечной ткани трансгенных свиней и их аналогов. Полученные данные позволяют выделить группу свиней, трансгенных по МП-ОМ7 8-й генерации, характеризующуюся превосходством по толщине мышечных волокон в сравнении с контролем на 9,4%. Это говорит о более хорошем развитии мышечного каркаса. Худшими показателями обладают животные П группы ^АР-ИОН) при толщине мышечного волокна в среднем 43,7±1,04 мкм, что на 8,8% меньше контроля. Сравнивая между собой группы свиней, трансгенных по МП-ОЮ7 2-й и 8-й генераций, нельзя также не отметить разницу коэффициента вариабельности, который у животных 2-й генерации выше на 7,4%.

Табл. 7. Морфометрические характеристики мышечной ткани

трансгенных свиней и их аналогов

Диаметр мышечного Площадь сечения

Группа волокна, ш мышечного волокна, мкм2

М ±т СУ (%) М ±т Су (%)

I Контроль 47,9 1,3 20,7 2780,3 137,7 38,2

П АУАР-ЬСН 43,7 1,04 18,4 2040,7 92,7 35

Ш МП-ОЯТ, Б2 48,9 1,5 23,5 2740,5 166,3 46,3

IV МП-СЫ7, 52,4 1,5 22,1 3172,7 161,1 38,9

Гистологические исследования желез внутренней секреции позволил установить некоторые изменения и в их структуре у трансгенных свиней по сравнению с контролем. Данные изменения проявлялись как в эмбриональный, так и постнатальный периоды развития.

Изучение гистоструктуры органов 45 и 90-дневных эмбрионов показало, что наличие определённых изменений в исследуемых органах проявлялось только в поздний плодный период (90 дней). У 45-дневных эмбрионов различия между трансгенными и нетрансгенными плодами по данному показателю были незначительными (табл. 8). Табл. 8. Морфометрические показатели функциональных отделов желез

трансгенных и контрольных свиней в период эмбриогенеза

Показатели 45-дн. эмбрионы 90-дн. эмбрионы

опыт контр. опыт контр.

1 2 3 4 5

Печень

толщина балок, мкм; площадь ядра клеток, мкм2; площадь цитоплазмы, мкм2; ядерно-плазматическое отношение 10,8±0,2 25,0±0,4 78,2±1,6 0,34 11,1±0,1 25,6±0,4 77,8±1,3 0,34 8,6±0,10 32,0±0,4 67,7±0,2 0,48 8,7±0,06 32,9±0,5 58,7±0,2 0,56

Поджелудочная железа

диаметр ацинуса, мкм; площадь ядра клеток, мкм2; площадь цитоплазмы, мкм2; ядерно-плазматическое отношение - - 33,9±1,1 15,0±0,1 29,8±0,3 0,50 37,8±0,7 15,7±0,1 27,2±0,3 0,58

Продолжение табл.8

1 2 3 | 4 5

Щитовидная железа

диаметр фолликулов, мкм; площадь ядра клеток, мкм2; площадь цитоплазмы, мкм2; ядерно-плазматическое отношение 34,5±1,2 18,1 ±0,4 32,0±0,5 0,56 33,6±1,4 17,2±0,3 31,7±0,8 0,54 39,3±1,3 14,9±0,3 26,7±0,3 0,56 40,4±2,1 15,1±0,2 25,6±0,6 0,59

Желудок: толщина железистого слоя, мкм; число ядер клеток на 100 мкм среза 30±2,1 12±0,1 31±1,9 13±0,2 142±3,3 11±0,29 153±3,6 10±0,30

Кишечник: высота ворсинок, мкм; число ядер клеток на 100 мкм среза 58±1,7 16±0,5 60±2,0 15±0,7 182±7,5 13±0,28 199±8,8 11±0,30

Анализ гистоструктуры железистых органов трансгенных свиней и их аналогов в постнатальный период показал, что наиболее значительные структурные изменения наблюдались в щитовидной железе (табл. 9).

Табл. 9. Структура фолликулярного аппарата щитовидной железы

Группа Диаметр фолликула миним., мкм Диаметр фолликула сред., мкм Площадь фолликула, мкм2

М ±т СУ(%) М ±ш СУ (%) М ±т Су (%)

I Контроль 150 7 38 185 8 35 26745 3088 88

П \VAP-hGH 171 10 46 215 12 42 39069 6357 110

Ш МТ1-ОЯР, ?2 163 8 37 197 9 34 30821 3593 84

IV МП-ОЯТ, Б8 144 6 35 176 7 32 24522 2321 71

Так, у свиней, трансгенных по МТЬОШ7 8-й генерации, фолликулы были сравнительно мелкие, с хорошо развитой структурой тиреосинтеза, что позволяет предположить наиболее активную выработку тироксина. Сравнивая группы трансгенных животных 2-й и 8-й генерации, можно отметить достаточно заметную разницу. Животные 8-й генерации отличаются наименьшим коэффициентом вариабельности и наиболее плотной морфологической структурой фолликулярного аппарата щитовидной железы. Так, диаметр средних фолликулов щитовидной железы свиней 8-й генерации меньше на 8,9% по сравнению с животными 2-й генерации. Животные группы II (\VAP-hGH) характеризуются наиболее крупными фолликулами и их рыхлой структурой, а также, самым большим коэффициентом вариабельности, что, возможно, говорит о более активных адаптивных перестройках гормонального баланса.

Некоторые изменения были установлены и в структуре печени и надпочечников трансгенных свиней по сравнению с контролем, однако выявленные различия были не существенны.

3.6. Мясная продуктивность и качество туш трансгенных и контрольных свиней

Показатели толщины шпика в исследуемых группах свиней представлены в таблице 10. Как показано в таблице 10, свиньи, трансгенные по МТЬСКБ, как 2-й, так и 8-й генераций, характеризовались большей толщиной шпика по сравнению с аналогами, что, по всей видимости, является следствием более высокой живой массы свиней этих опытных групп (предубойная живая масса в группах Ш и IV составила 121,9 и 110,6 кг, соответственно).

Табл. 10. Характеристика туш опытных и контрольных свиней по

толщине шпика

Показатель Контроль Опытные группы

II III IV

Ед Ед к контр. Ед к контр. Ед к контр.

Ед % Ед % Ед %

длина туши, см 96±1 120±16 24,7 25,7 97±4 1,3 1,4 109±4 12,7 13,2

длина беконной половины, см 80±1 103±15 23,8 30 83±2 3,5 4,4 91±14 11,2 14,1

толш. шпика, см: на холке 4,1±0,4 4,8±1,1 0,7 17,2 4,5±0,4 0,46 11,3 4,7±0,4 0,63 15,5

над 6-7 гр. позвонком 3,2±0,4 3,2±0,4 -0,05 -1,6 3,8±0,6 0,58 18 3,3±1,0 0,05 1,6

на пояснице 2,9±0,4 3,2±0,5 0,28 9,5 3,3±0,2 0,35 11,9 3,2±0,4 0,18 6,1

на крестце 2,8±0,6 2,7±0,4 -0,05 -1,8 3,6±0,7 0,85 30,6 2,8±0,8 -0,01 -0,4

Проведенные исследования состава туш не выявили достоверных различий между опытными и контрольными животными (табл. 11). _Табл. 11. Состав туш опытных и контрольных свиней_

Показатель Контроль Опытные группы

II III IV

Ед Ед К контр. ЕД К контр. Ед К контр.

Ед % Ед % Ед %

Вес полутуши 35,4±6,1 33,6±5,2 -2,2 -6,0 40,5±2,7 5,1 14,6 35,7±1,7 -0,3 -1,0

Вес мяса 19,8±3,5 17,3±2,1 -2,5 -12,7 21,9±1,4 2,1 10,8 20,1±0,7 0,3 1,5

% мяса 55,9 51,5 -4,4 -7,9 54,1 -1,8 -3,2 56,3 0,4 0,7

Вес сала 11,4±2,4 12,3±2,8 0,9 8,2 13,8±1,2 2,4 21,7 11,1±1,6 -0,3 -0,2

% сала 32,2 36,6 4,4 13,6 34,1 1,9 5,9 31,1 -1,1 -3,4

Вес костей 4,2±0,3 4,0±0,4 -0,2 -4,8 4,8±0,2 0,7 17,8 4,5±0,2 0,3 8,6

% костей 11,9 11,9 0 0 11,8 -0,1 -0,8 12,6 0,7 5,9

Таким образом, результаты проведенных нами исследований физиолого-биохимических и продуктивных особенностей трансгенных свиней свидетельствуют о том, что интеграция и последующая экспрессия генов соматотропного каскада существенным образом влияет на различные процессы, происходящие в организме животных.

4. ВЫВОДЫ

1. Анализ содержания соматотропина в крови свиней в возрасте 5-и месяцев выявил повышение уровня соматотропина в крови свиней, трансгенных по WAP-hGH (группа II), MT1-GRF 2-й генерации (группа III) и MT1-GRF 8-й генерации (группа IV), соответственно, в 2,25, 1,47 и 1,37 раза по сравнению с контролем. В возрасте 9-и месяцев в контрольной группе отмечается тенденция к снижению уровня соматотропина в 1,1 раза, в то время как в группах трансгенных свиней этот показатель увеличивается в 4,77,1,69 и 2,71 раза, соответственно.

2. Показаны более высокие темпы роста свиней, трансгенных по МТ1-GRF: среднесуточные приросты живой массы за период откорма с 80 до 280 дней составили у трансгенных свиней 2- и 8-й генераций, соответственно, 628 и 544 г против 421 г в контроле. Различия в темпах роста носили более выраженный характер, начиная с 200-дневного возраста.

3. Выявлены некоторые различия в показателях белкового обмена трансгенных свиней по сравнению с контрольными животными. Концентрация общего белка в сыворотке крови трансгенных свиней имела тенденцию к повышению на 1,9, 4,8 и 1,2% в группах П, Ш и IV, соответственно, при этом в группах П и П1 повышение данного показателя происходило за счет глоублиновых фракций, в то время как в группе IV - за счет альбуминов. Установлено повышение активности AJIT в крови трансгенных свиней на 37,2, 20,9 и 20,9% в группах II, Ш и IV, соответственно, что положительно коррелировало с уровнем глюкозы в сыворотке крови: повышение концентрации глюкозы в группах трансгенных свиней составило 8,8,25,1 и 7,6%, соответственно.

4. Анализ содержания кальция и фосфора в крови трансгенных свиней при отсутствии различий в уровне кальция выявил тенденцию повышения уровня фосфора на 5,0,16,1 и 12,7% в группах П, Ш и IV, соответственно.

5. Выявлено снижение содержания фосфолипидов, мобильных и депонированных глицеролов, холестерола, триглицеролов и неэстерифицированных жирных кислот в группах свиней, трансгенных по MT1-GRF, соответственно, на 13,6, 30,0, 32,0, 6,9 и 10,0% у свиней 2-й генерации (группа Ш) и 11,5, 38,7, 30,6, 6,5 и 5,8% у свиней 8-й генерации (группа IV). Показано увеличение содержания в крови трансгенных свиней полиненасыщенных жирных кислот - линолевой, линоленовой и арахидоновой, на долю которых у контрольных свиней суммарно приходилось 7,90%, в то время как у трансгенных свиней групп II, Ш и IV их содержание составило, соответственно, 1,44,1,50 и 1,42%.

6. По результатам вакцинации свиней к возбудителям острых кишечных заболеваний (вакцина ОКЗ) показано, что трансгенные животные характеризуются высокой степенью специфического иммунного ответа к возбудителям сальмонеллеза, колибактериоза, клебсиеллеза и протейной инфекции, а так же лучшей по сравнению с контролем готовностью к специфической защите на ранней стадии вакцинации.

7. Выявлено повышение диаметра мышечных волокон у свиней, трансгенных по MT1-GRF 2й и 8-й генераций, соответственно, на 2,1 и 9,4%, в то время как в группе свиней, трансгенных по WAP-hGH, данный показатель был ниже на 8,8%.

8. Гистологические исследования 45 и 90-дневных плодов и взрослых трансгенных свиней выявили некоторые различия в гистоструктуре печени, поджелудочной и щитовидной желез в поздний плодный (90 дней) и посгаатальный периоды, при этом наиболее существенные различия установлены в морфометрических показателях фолликулов щитовидной железы взрослых животных.

9. Отсутствие достоверных различий по мясным качествам и составу туш между группами трансгенных и контрольных свиней позволяют предположить наличие в организме трансгенных свиней компенсаторного эффекта, направленного не нивелирование повышенных концентраций соматотропина в крови.

5. Практические предложения.

Лабораториям, занимающимся вопросами трансгенеза в животноводстве, для создания стабильных линий трансгенных сельскохозяйственных животных рекомендуем оценивать весь спектр изменений в организме, обусловленный интеграцией чужеродных генов.

Публикации по теме диссертации

В журналах, рекомендованных ВАК РФ.

1. Эрнст, JI.K. Хозяйственно-ценные признаки трансгенных и дитрансгенных свиней / Эрнст Л.К., Зиновьева H.A., Волкова H.A., Ралков И.А., Брем Г. // Достижения науки и техники АПК - 2006 - № 12. - С. 34-36.

2. Эрнст, Л.К. Мясные и откормочные качества трансгенных свиней / Эрнст Л.К., Зиновьева H.A., Багиров В.А., Волкова H.A., Волкова Л.А., Пархоменко Е.Г, Ралков И.А. // Свиноводство - 2007 - №2. - С. 2-5.

В других изданиях.

3. Ралков, И.А. Нейроэндокринная регуляция иммунного ответа трансгенных по соматотропиновой оси свиней разных поколений / Ралков И.А. // Материалы III международной научно-практической конференции «Современные технологические и селекционные аспекты развития животноводства России». Научные труды ВИЖа. 2005. - Выпуск 63. - Том 2. -С. 166-169.

4. Ралков, И.А. Влияние интеграции гена соматолиберина на клеточную структуру некоторых внутренних органов свиней в онтогенезе / Ралков И.А., Волкова H.A., Зиновьева H.A., Эрнст Л.К. // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук - 2011, №4 - С. 56-59.

Издательство ГНУ ВИЖ Россельхозахадемии Тел. (8-4967)65-13-18 (8-4967)65-15-97

Сдано в набор 02.06.2011. Подписано в печать 03.06.2011. _Заказ № 31. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз._

Отпечатано в типографии ГНУ ВИЖ Россельхозахадемии

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ралков, Иван Александрович

ВВЕДЕНИЕ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние интеграции генных конструкций MT1-GRF и WAP-hGH на биологические и хозяйственно-полезные признаки трансгенных свиней разных поколений"

Как предполагается, жизнь на Земле появилась около 4 млрд. лет назад. Примерно половину этого срока организмы воспроизводились простым делением клетки, которое редко приводило к возникновению новых форм жизни в результате случайных мутаций. В период, предшествующий возникновению полового процесса, жизнь находилась на одноклеточном, вероятно, гаплоидном уровне. Главный способ размножения был бесполый, базирующийся на митозе. Допускается, что возникновение полового процесса привело к формированию двух крупнейших ароморфозов: диплоидности и мейоза. Эти ароморфозные акты явились материальной основой для формирования нового мощного источника наследственной изменчивости - комбинативной изменчивости (Петров Д.Ф., 1971, Медников Б.М., 1980). Значение комбинативной изменчивости в ходе последующего эволюционного развития невозможно переоценить. Так, по имеющимся оценкам, до 90-95% всей наследственной изменчивости у видов, размножающихся половым путем, приходится именно на комбинативную изменчивость, и именно этому мы обязаны бесконечным разнообразием форм жизни и видов (Филипченко Ю.А., 1978, Изменчивость и отбор, 1980).

Начало генной инженерии было положено открытием искусственного оплодотворения. 2 и 18 декабря 1899 г. Иванов И.И. сделал в Петербурге два доклада: на заседании Общества русских врачей и на заседании Петербургского общества естествоиспытателей об искусственном осеменении млекопитающих и применении его в скотоводстве и коневодстве. В этих докладах Иванов обратил внимание на то, что выдающееся биологическое открытие XVIII в. - метод искусственного осеменения животных - в конце XIX в. использовался лишь в экспериментальных исследованиях, а практически его применяли только в рыбоводстве.

Работа И.И.Иванова по проблеме искусственного осеменения с целью практического применения в животноводстве началась осенью 1896 г. в

Пастеровском институте в Париже. Там он пишет историю открытия метода 4 искусственного осеменения, дает подробный обзор работ в данной области и анализ причин, мешавших его применению в практическом животноводстве в XVIII и XIX вв. Позднее этот очерк он представит в монографии по искусственному осеменению. В конце 1898 г. И.И. Иванов возвращается в Россию и начинает свои исследования в Институте экспериментальной медицины. Чтобы расширить масштабы своих исследований, он получает у академика А.О.Ковалевского разрешение работать в руководимой последим Особой зоологической лаборатории Академии наук, где он делает два важных экспериментальных обобщения, которые легли в основу метода искусственного осеменения: 1) естественная жидкая среда спермы, выделяемая придаточными половыми железами не является безусловно необходимой для встречи и соединения спермиев с яйцеклепсами; 2) спермии в течение некоторого времени могут сохранять вне организма не только жизнеспособность и подвижность, но и способность нормально оплодотворять яйцеклетки, если условия, в которых они сохранялись, были благоприятными. Исходя из этих основных предпосылок, он разработал метод искусственного осеменения млекопитающих и птиц в двух вариантах: искусственное осеменение сперматозоидами в естественной среде и искусственное осеменение сперматозоидами в искусственной среде (физиологические синтетические среды-разбавители) (Иванов И.И., 1900, 1907, 1926, 1929). Изложенный на заседании Общества русских врачей доклад Иванова вызвал большой интерес у присутствующих, среди которых были такие выдающиеся ученые, как И.П.Павлов, А.О.Ковалевский, Н.В.Введенский и др.

В 1910 г. развертываются работы по искусственному осеменению на специальной Зоотехнической опытной станции в "Аскании-Нова". Здесь были проведены исследования по гибридизации сельскохозяйственных животных с дикими видами с целью выяснения границ скрещиваемости между различными отдаленными видами животных, а также установления хозяйственно полезных свойств полученных гибридов (Труды научно-исследовательского института гибридизации и акклиматизации животных Аскания-Нова имени акад. М. Ф. Иванова, 1935-49).

В 1923 г. в Англии была опубликована статья И.И. Иванова о возможности скорейшего увеличения поголовья пушных зверей в условиях клеточного разведения методом искусственного оплодотворения. В сущности, это можно было назвать началом эры биотехнологии в животноводстве

Величайшим открытием 20 века стала расшифровка Джеймсом Уотсоном и Френсисом Криком структуры ДНК живых существ. Были научно обоснованы принципы строения основной единицы генома - гена.

Новым этапом исследований в области биотехнологии стала разработка методов интеграции чужеродных генов в геном организмов. В короткие сроки был разработан ряд методов, позволяющих интегрировать чужеродные гены (Evans M.J. et al., 1985, Glosser A. et al., 1986, Pursei V.G. et al., 1987, 1989, Church R.B., 1987, Brem G., 1993, Mannino R.J., Gould-Fogerite S., 1988, Lavitrano M. et al., 1989, Gavora J.S. et al., 1991, Брем Г. и др., 1993, Brem G., Muller M., 1994). С использованием таких методов были получены трансгенные организмы многих видов (Brem G. et al., 1985, Hammer R.E. et al., 1985, Вайсман Б. и др., 1988, Pursei V.G. et al., 1993, Church R.B., 1989, Эрнст Л.К. и др., 2002). Стало очевидным, что интегрированные единицы наследственности могут функционировать в организме реципиента. Благодаря технологиям трансгенеза человек получил совершенно новые, неизмеримо более эффективные системы изменения генома организмов, что создало предпосылки для расширения возможностей селекции микроорганизмов, растений и животных (Эрнст Л.К. и др., 1993, Эрнст Л.К., 1995).

Шмальгаузен И.И. (1946) считал, что каждая мутация означает изменение в системе морфологических корреляций. Поэтому каждая мутация захватывает известную область процессов индивидуального развития, а не изолированный процесс отдельного признака.

Следовательно, перестройка системы морфологических корреляций является обязательным условием эволюции органических форм. Это касается важнейших признаков, связанных с ключевыми звеньями развития организма.

Интеграция чужеродных генов может рассматриваться как процесс, сходный, в принципе, с мутированием - и в том и в другом случае происходит изменение генома.

На современном этапе развития биотехнологии перспективным является создание трансгенных животных, обладающих заданными продуктивными и биологическими свойствами или продуцирующих биологически активные вещества и фармакологические препараты (Brem G., 1993, Эрнст Л.К. и др., 1994, Brem G., Mueller М., 1994). Это направление дает результаты, которые уже сегодня реализуются в практике. Наиболее интенсивно проводятся исследования по созданию животных с повышенной продуктивностью, наследованной устойчивостью к заболеваниям, продуцирующих биологически активные вещества для перерабатывающей промышленности и медицины (инсулин, эритропоэтин, урокиназа и др.) (Эрнст Л.К. и др., 2002).

Эксперименты по получению и изучению- -трансгенных животных проводятся во многих странах мира. Многочисленные успешные работы в области трансгенеза лабораторных и сельскохозяйственных животных во всем мире продемонстрировали широчайшие возможности использования метода генетической трансформации генома организма (Эрнст Л.К. и др., 2002).

Несмотря на многочисленность и многообразие исследований в области трансгенеза, многие факторы, определяющие эффективность экспрессии чужеродных генов в клетках целостного организма остаются недостаточно изученными. На ранних этапах исследований стало ясно, что взаимодействие интродуцированной конструкции и генома-хозяина не может быть сведено к простому суммированию различных генетических задатков. Как оказалось, интеграция чужеродного гена часто влечет за собой целый спектр непредсказуемых явлений модификационной и мутационной природы (Mehtali

N., 1990, Brem G. et al., 1991, Brem G„ 1993, Клеповицкий П.М., Некрасов A.A., 1998, Калашникова Л.А., 1997, 1998, 2000).

В связи с этим, изучение экспрессии введенных генов и изучение их взаимосвязи с физиолого-морфологическими признаками у трансгенных животных является актуальной задачей, как в биотехнологии, так и селекции сельскохозяйственных живо гных.

Цель и задачи исследований

Целью диссертационной работы явлось изучение влияния интегрированных в геном генных конструкций рилизинг-фактора гормона роста человека (MT1-GRF) и гормона роста человека (WAP-hGH) на физиолого-биохимические и иммунологические особенности, а также хозяйственно-полезные признаки трансгенных свиней разных поколений.

Для достижения цели диссертационной работы были поставлены следующие задачи:

• Выполнить исследование уровня соматотропина в крови свиней, трансгенных по WAP-hGH, MT1-GRF (генерации II И-VIII), а так же их аналогов.

• Изучить особенности роста и развития опытных и контрольных свиней.

• Оценить биохимический статус трансгенных свиней и их аналогов.

• Изучить особенности гуморального иммунитета трансгенных свиней в норме и при повышенной иммунной нагрузке (вакцинация комплексной вакциной ОКЗ).

• Выполнить гистологические и морфометрические исследования некоторых внутренних органов и тканей опытных и контрольных свиней в пренатальный и постнатальпый периоды.

• Изучить показатели мясной и откормочной продуктивности опытных и контрольных свиней. i I

8 , i ч ч

Научная новизна

Впервые проведено сравнительное исследование свиней, трансгенных по генной конструкции МП-вИР 2-й и 8-й генераций, а так же свиней, трансгенных по \VAP-hGH 4-й генерации. Показано стабильное сохранение повышенного уровня соматотропина в сыворотке крови трансгенных свиней разных генераций. Установлено влияние интеграции и экспрессии трансгенов на изменение ряда физиолого-биохимических показателей индивидуумов: показателей сыворотки крови, характеризующих уровень обмена веществ (концентрации общего белка, активности АЛТ и АСТ, содержания полиненасыщенных жирных кислот), гистологических и морфометрических показателей внутренних органов в пренатальный (поздний плодный) и постнатальный периоды (диаметр мышечных волокон, диаметр фолликулов щитовидной железы), титров антител к возбудителям острых кишечных инфекций в норме и при повышенной иммунной нагрузке (вакцинация комплексной вакциной ОКЗ).

Практическая значимость

Показано сохранение интеграции и экспрессии трансгенов в ряде поколений, что служит основой создания стабильных линий трансгенных животных. Установлены повышенные темпы роста свиней, трансгенных по МП-СИР, начиная с возраста 200 дней, что позволяет их рекомендовать для откорма до тяжелых кондиций.

Положения, выносимые на защиту Повышенный уровень соматотропина в крови трансгенных свиней Более высокие темпы роста свиней, трансгенных по МП-СИР, при откорме до тяжелых кондиций Изменение некоторых биохимических показателей крови трансгенных свиней

Повышение содержания антител к антигенам возбудителей острых кишечных заболеваний у трансгенных свиней по сравнению с аналогами

Изменение гистологических и морфометрических показателей некоторых внутренних органов трансгенных свиней.

Апробация работы

Результаты исследований были доложены и обсуждены на конференциях:

• III международной научно-практической конференции «Современные > технологические и селекционные аспекты развития животноводства России», п. 5 Дубровицы, ВИЖ, 2005;

• конференции Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, п. Дубровицы, май 2011 г.

Структура и объем работы

Диссертация написана на 104 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения," список литературы. Диссертационная работа содержит 20 таблиц и 10 рисунков. Список литературы включает 161 источник, в том числе 82 источника на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Ралков, Иван Александрович

4. ВЫВОДЫ

1. Анализ содержания соматотропина в крови свиней в возрасте 5-и месяцев выявил повышение уровня соматотропина в крови свиней, трансгенных по WAP-hGH (группа II), MT1-GRF 2-й генерации (группа III) и MT1-GRF 8-й генерации (группа IV), соответственно, в 2,25, 1,47 и 1,37 раза по сравнению с контролем. В возрасте 9-и месяцев в контрольной группе отмечается тенденция к снижению уровня соматотропина в 1,1 раза, в то время как в группах трансгенных свиней этот показатель увеличивается в 4,77, 1,69 и 2,71 раза, соответственно.

2. Показаны более высокие темпы роста свиней, трансгенных по МТ1-GRF: среднесуточные приросты живой массы за период откорма с 80 до 280 дней составили у трансгенных свиней 2-й и 8-й генераций, соответственно, 628 и 544 г против 421 г в контроле. Различия в темпах роста носили более выраженный характер, начиная с 200-дневного возраста.

3: Выявлены некоторые различия в показателях белкового обмена трансгенных свиней по сравнению с контрольными животными. Концентрация общего белка в сыворотке крови трансгенных свиней- имела тенденцию к повышению на 1,9, 4,8 и 1,2% в группах II, III и IV, соответственно* при этом в группах II и III повышение данного показателя происходило за счет глобулиновых фракций, в то время как в группе IV - за счет альбуминов. Установлено повышение активности AJ1T в крови трансгенных свиней на 37,2, 20,9 и 20,9% в группах II, III и IV, соответственно, что положительно коррелировало с уровнем глюкозы в сыворотке крови: повышение концентрации глюкозы в группах трансгенных свиней составило 8,8, 25,1 и 7,6%, соответственно.

4. Анализ содержания кальция и фосфора в крови трансгенных свиней при отсутствии различий в уровне кальция выявил тенденцию повышения уровня фосфора на 5,0, 16,1 и 12,7% в группах II, III и IV, соответственно.

5. Выявлено снижение содержания фосфолипидов, мобильных и депонированных глицеролов, холестерола, триглицеролов и

85 неэстерифицированных жирных кислот в группах свиней, трансгенных по MT1-GRF, соответственно, на 13,6, 30,0, 32,0, 6,9 и 10,0% у свиней 2-й генерации (группа III) и 11,5, 38,7, 30,6, 6,5 и 5,8% у свиней 8-й генерации (группа IV). Показано увеличение содержания в крови трансгенных свиней полиненасыщенных жирных кислот - линолевой, линоленовой и арахидоновой, на долю которых у контрольных свиней суммарно приходилось 7,90%, в то время как у трапсгенных свиней групп II, 111 и IV их содержание составило, соответственно, 1,44, 1,50 и 1,42%.

6. По результатам вакцинации свиней к возбудителям острых кишечных заболеваний (вакцина ОКЗ) показано, что трансгенные животные характеризуются высокой степенью специфического иммунного ответа к возбудителям сальмонеллеза, колибактериоза, клебсиеллеза и протейной инфекции, а так же лучшей по сравнению с контролем готовностью к специфической защите на ранней стадии вакцинации.

7. Выявлено повышение диаметра мышечных волокон у свиней, трансгенных по MT1-GRF 2-й и 8-й генераций, соответственно, на 2,1 и 9,4%, в то время как в группе свиней, трансгенных по WAP-hGH, данный показатель был ниже на 8,8%.

8. Гистологические исследования 45 и 90-дневных плодов и взрослых трансгенных свиней выявили некоторые различия в гистоструктуре печени, поджелудочной и щитовидной желез в поздний плодный (90 дней) и i постнатальный периоды, при этом наиболее существенные различия установлены в морфометрических показателях фолликулов щитовидной железы взрослых животных.

9. Отсутствие достоверных различий по мясным качествам и составу туш между группами трансгенных и контрольных свиней позволяют предположить наличие в организме трансгенных свиней компенсаторного эффекта, направленного не нивелирование повышенных концентраций соматотропина в крови.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Лабораториям, занимающимся вопросами трансгенеза в животноводстве, для создания стабильных линий трансгенных сельскохозяйственных животных рекомендуем оценивать весь спектр изменений в организме, обусловленный интеграцией чужеродных генов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ралков, Иван Александрович, Дубровицы

1. Андреева Л.В., Хайдарова Н.В. и др. Микроинъекция гена релизинг-фактора гормона роста человека в зиготы и эмбрионы свиней // Доклады ВАСХНИЛ. 1990. № 7. - с. 46 -51.

2. Балаболкин М.И. Секреция гормона роста в норме и патологии // М.: Медицина. 1978. 173 с.

3. Берман В.М. Возрастная реактивность в инфекционных процессах. В кн.: Вопросы возрастной реактивности в инфекционных и иммунологических процессах // Д.: Медицина. 1955. с. 5-12.

4. Блинов Н.П. Основы биотехнологии // С.-Пб.: Наука. 1995. 600 с.

5. Богатырев А.Н., Эрнст JI.K. Генная инженерия сельскохозяйственных животных мощный рычаг селекции XXI века // Генноинженерные сельскохозяйственные животные. Сб. науч. тр. 1995. - Вып. 1.-е. 3-13.

6. Брем Г., Зиновьева H.A., Эрнст Л.К. Генные формы новый путь производства биологически активных протеинов трансгенными животными // Сельскохозяйственная биология. 1993. - № 6 - с. 3- 27.

7. Брем Г., Эрнст Л.К., Андропов Л.А. и др. Трансгенные свиньи (mMTl-hGRF): оценка качества туш и химического состава мяса при убое животных // Генноинженерные сельскохозяйственные животные. Сб. науч. тр. 1995. Вып. 1.-е. 26- 33.

8. Брондз Б.Д. Иммунологическое распознавание и реакции клеточного иммунитета// Успехи современной биологии. 1972. т. 73. - вып. 1.-е. 42-58.

9. Вайсман Б., Капелинская Т., Городецкий С, Дыбан А. Возможность получения животных продуцентов биологически активных препаратов путем микроинъекции клонированных генов в яйцеклетки // Антибиотики и химиотерапия. 1988. - т. XXXIII. - № 2. - с. 11-14.

10. Верховский O.A., Федоров Ю.Н., Сологуб B.K. и др. Использование моноклональных антител для оценки антигенных свойств иммуноглобулинов животных // Сельскохозяйственная биология. 1995. № 4. - с. 94-100.

11. П.Волкова О.В., Елецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологическойтехникой // М.: Медицина. 1982. - 345 с. /

12. Волкова О.В., Елецкий Ю.К., Дубовая Т.К. и др. Гистология, цитология и эмбриология: Атлас // М.: Медицина. 1996. 208 с.

13. Воловинская В.П., Кельман Б.Я. Определение влагоудерживающей способности мяса // Мясная индустрия СССР. 1960. № 6. - с. 47.

14. Газарян К. Трансгенные животные: перспективы использования в животноводстве// Сельскохозяйственная биология. 1988. № 2. - с. 31-39.

15. Гоголевский П.А., Гольдман И.Л., Гусев В.В. и др. Исследование экспрессии гена В галактозидазы в трапсгенных ранних эмбрионах кроликов // Доклады ВАСХНИЛ.- 1991.- № 10,- С.38-42.

16. Гольдман И.Л., Башкеев Е.Д., Гоголевский П.А. Прогрессивная технология получения трансгенных овец // Доклады РРАСХН. 1992. № 9-10. -с. 25-30.

17. Гольдман И.Л., Эрнст Л.К., Гоголевский П. и др. Теоретические вопросы получения трансгенных животных. Эксперименты на кроликах // Генноинженерные сельскохозяйственные животные. Сб. науч. тр. 1995. Вып. 1. - с. 93-102.

18. ГОСТ 19496-93. Мясо. Метод гистологического анализа. М.: «Стандарты», 1993.

19. Грезина Н.М. Приготовление гистологических препаратов молочной железы кроликов // Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных, ред. H.A. Зиновьева. Дубровицы: ВИЖ. 2005. -с. 11-17.

20. Дворянчиков Г.А., Иванов Л.Ю., Рудько Н.П. и др. Идентификация и анализ интегрированного в геном животных трансгена методом ПЦР-амплификации и с помощью блот-гибридизации // Сельскохозяйственная биология. 1993. № 4. - с. 39-46.

21. Држевицкая И.А. Основы физиологии обмена веществ и эндокринной системы // М.: Высшая школа. 1983. 272 с.

22. Дыбан А.П., Городецкая С.И. Трансгепные млекопитающие: изучение фенотипических эффектов гормона роста человека, индуцированного животным // Биотехнология. 1987. № 3.- с. 352-357.

23. Жданов А.Б., Дворянчиков Г.А. Амплификация интегрированного трансгена гена гормона роста быка методом полимеразной цепной реакции (PCR) // Генетика. 1993. т. 29. - с. 905-913.

24. Зенбуш П. Молекулярная и клеточная биология. М.: Мир. 1982. 440с.

25. Зиновьева Н.А., Попов А.Н., Эрнст Л.К. и др. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве // Дубровицы: ВИЖ. 1998. 47 с.

26. Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К. Проблемы биотехнологии и селекции сельскохозяйственных животных // Дубровицы: ВИЖ. 2004. 316 с.

27. Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К., Брем Г. Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно- генетические аспекты трансгенеза в животноводстве // Дубровицы: ВИЖ. 2000. 128 с.

28. Иванов И.И. К вопросу о функции Vesicle seminales unglanduiae prostaticac в процессе оплодотворения у млекопитающих // Тр. общества русских врачей в СПб. 1900. № 11.-е. 56-58.

29. Иванов И.И. Искусственное оплодотворение млекопитающих // Тр. общества русских врачей в СПб. 1907. № 3. - с. 38-50.

30. Иванов И.И. Продолжительность сохранения .оплодотворяющей способности сперматозоидов млекопитающих в придатке семенника, отделенного из организма // Доклады АН СССР. 1926. Вып. 184. - с. 37-42.

31. Иванов И.И. Искусственное осеменение млекопитающих как зоотехнический метод // Тр. V съезда зоотехников Моск. зоотехническ. ин-та. 1929. Вып. 1.-е. 86-95.

32. Иванов И.Ф., Ковальский П.А. Цитология, гистология, эмбриология // М.: Колос. 1969.-695 с.

33. Калашникова Л.А. Получение и размножение трансгенных животных // Современные аспекты селекции, биотехнологии, информатизации в племенном животноводстве. Лесные Поляны: Всерос. НИИ плем. дела. 1997. -с. 257-264.

34. Калашникова Л.А. Использование ДНК-технологий для оценки и изменения генома сельскохозяйственных животных // Автореф. дис.д-ра биол. наук, Лесные Поляны: Всерос. НИИ плем. дела. 1998. 41 с.

35. Калашникова Л.А. Проблемы и перспективы использования генетически модифицированных сельскохозяйственных животных // Аграрная Россия. 2000. №5 - с. 11-19.

36. Карпуть И.М. Динамика Т и В - лимфоцитов у свиней в онтогенезе // Ветеринария. 1977. - № 4. - с. 25-28.

37. Карпуть И.М. Кроветворение и иммунологическая реактивность у свиней //Ветеринария. 1975, № 2. с. 17-21.

38. Карпуть И.М. Возрастная реактивность кроветворно лимфоидных органов у вакцинированных и больных паратифом поросят и влияние на нее антибиотиков // Тр. 5 Всесоюз. Конф. по патологической анатомии с/х жив. 1973.-е. 268-271.

39. Кленовицкий П.М., Некрасов A.A. Мутационные изменения у трансгенных животных // Актуальные проблемы развития животноводства. Дубровицы: ВИЖ. 1998.-е. 184-191.

40. Кудрявцев A.A., Кудрявцева J1.A. Клиническая гематология животных //М.: Колос. 1974.-405 с.

41. Лашас Л.В., Лашене Д.Г. Соматотропин человека // Вильнюс: Мокслас. 1981.- 143 с.

42. Медведев С.Ю., Козикова Л.В., Бавин В.Г., Яковлев А.Ф. Рост и развитие трансгенных кроликов и свиней с перенесенным геном релизинг-фактора гормона роста человека // Сельскохозяйственная биология. 1995. № 6. -с. 43-48.

43. Медников Б.М. Закон гомологической изменчивости // М.: Познание, 1980.-97 с.

44. Меркурьева Е. К. Биометрия в селекции и генетике е.- х. животных // М.: Колос. 1970.-424 с.

45. Мертвецов Н.П. Гормональная регуляция экспрессии генов // М.: Наука. 1986. 207 с.

46. Методические указания по изучению качества туш, мяса и подкожного жира убойных свиней // М.: Колос. 1978. 26 с.

47. Кондрахин И.П., Архипов A.B., Левченко В.И., Таланов Г.А., Фролова Л.А., Новиков В.Э. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник, под ред. проф. И.П. Кондрахина // М.: Колос. 2004. -520 с.

48. Науменко П.А., Владимиров В.Л., Фридберг Р.В., Школьник Г.С. Биохимические показатели крови, органов и тканей у трансгенных (mMTl-hGRF) и интактных свиней // Генноинженерные сельскохозяйственные животные. Сб. науч. тр. 1995. Вып. 1.-е. 54-57.

49. Панков Ю.А. Проблемы эндокринологии. 1996. Вып. 61, с. 984-992.

50. Петров Д.Ф. Генетика с основами селекции // М.: Высшая школа. 1971.-467 с.

51. Петров Р.В. Иммунология // М.: Медицина. 1978. -415 с.

52. Попов А.Н., Зиновьева H.A., Брем Г. Экспресс- метод тестирования новорожденных поросят на интеграцию в геном чужеродных генов // Сельскохозяйственная биология. 1995.- № 6. с. 136-138.

53. Росохатский С., Смирнов А.Ф., Ефимов А.Ф. и др. Повышение скорости роста кроликов, трансгенных по гену РФГР человека // Доклады РАСХН. 1994.-№2.- с. 24-26.

54. Рядчиков В., Солодухина Л., Соколов Н. и др. Трансгенные свиньи с геном mMTl-hGRF и перспективыих использования в селекции // Генноинженерные сельскохозяйственные животные. Сб. науч. тр. 1995. Вып. 1. - с. 73-84.

55. Сиротинин H.H. Реактивность и резистентность организма. Многотомное руководство по патологической физиологии // М.: Медицина. -1966. т. 1. — с. 32-36.

56. Скалинский Е.И., Белоусов A.A. Микроструктура мяса // М.: Пищевая промышленность. 1978. 265 с.

57. Татулов Ю.В., Ивашов В.И., Немчинова И.П. Особенности качества свинины, производимой по интенсивной технологии выращивания и откорма //

58. XXXVI Международный конгресс по проблемам науки и технологии мяса и мясопродуктов. Гавана. 1990. - с. 35-39

59. Тейлор Д., Грин Н., Стаут У. Биология // М.: Мир. 2002. т. 3. - с. 234235.

60. Томмэ М.Ф. Методика изучения убойных выходов и мяса // М.: ВАСХНИЛ. 1956. 16 с.

61. Труды научно-исследовательского института гибридизации и акклиматизации животных Аскапия-Нова имени акад. М. Ф. Иванова, М.: ВАСХНИЛ. т. 1-3. 1935-1949.

62. Фаворская Ю.Н., Крымский Л.Д., Нестойко Г.В. Поверхностная структура макрофагов и лимфоцитов при их взаимодействиях // Архив патологии. 1975. № 8. - с. 33-39.

63. Федоров H.A., Суханов Ю.С., Асади Мобархан А.Х., Артемьев М.И. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Методическое пособие //М., 1996.

64. Филипченко Ю. А. Изменчивость и способы её исследования // М.: Наука. 1978.-342 с.

65. Фриденштейн А.Я., Чертков И.Л. Клеточные основы иммунитета.// М.: Медицина. 1969. 285 с.

66. Хвыля С.И., Авилов В.В., Кузнецова Т.Г. Практическое применение гистологических методов анализа // Мясная промышленность. 1994. № 6. - с. 9-11.

67. Хвыля С.И., Авилов В.В., Кузнецова Т.Г., Тимин E.H. Компьютерная приставка к человеческому глазу // Мясная промышленность. 1995. № 1.-е. 23-25. ,

68. Хвыля С.И., Кузнецова Т.Г., Авилов В.В. Оценка мясного сырья и определение состава мясопродуктов микроструктурными методами // М.: РАСХН. 1998.-38 с.

69. Чабан И.М. Продуктивные и биологические особенности свиней с интегрированным в геном чужеродным геном релизинг-фактора соматотропного гормона // Дис.канд. биол. наук, п. Дубровицы Моск. обл., 2000. 141 с.

70. Шатайло В.Н. Продуктивные и физиолого-биохимические качества трансгенных свиней // Дис. канд. биол. наук, п. Дубровицы Моск. обл., 2001. -163 с.

71. Шихов И .Я., Эрнст Л.К., Некрасов A.A., Кущ A.A., Семеняченко В.П., Васильев И.М., Гращук М.А. Получение трансгенных свиней // Генноирженерные сельскохозяйственные животные. М.: РАСХН. 1995. Вып. 1. - с. 85-90.

72. Шмальгаузен И.И. Факторы эволюции (теория стабилизирующего отбора) // М.-Л.: Изд-во АН СССР. 1946. 396 с.

73. Эрнст Л.К. Проблемы селекции и биотехнологии сельскохозяйственных животных // М.: РАСХН. 1995. - 359 с.- 74. Эрнст Л.К., Брем Г., Зиновьева Н. Генноинженерные технологии новый путь развития животноводства // Зоотехния. 1994. - № 5. - с. 2-4.

74. Эрнст Л.К., Брем Г., Махаев Е.А. Результаты выращивания и изучения обмена веществ трансгенных по гену релизинг- фактора гормона роста свиней 1 поколения // Генноинженерные сельскохозяйственные животные. Сб. науч. тр. 1995.-Вып. 1.-е. 48-57.

75. Эрнст Л.К., Волкова H.A., Зиновьева H.A. Фепотипический эффект экспрессии рекомбинантных генов в организме трансгенных животных разных видов // М.: РАСХН. 2008. 251 с.

76. Эрнст Л.К., Зиновьева H.A. Биологические проблемы животноводства в XXI веке // М.: РАСХН. 2008. 501 с.

77. Эрнст J1.K., Зиновьева Н.А., Брем Г. Современное состояние и перспективы использования трансгенных технологий в животноводстве // М.: РАСХН. 2002.-341 с.

78. Эрнст Л.К., Шихов И.Я., Зиновьева Н.А., Брем Г. Морфо-функциональные особенности интерьера свиней, трансгенных по генам каскада гормона роста // Дубровицы: ВИЖ. 2004. 64 с

79. Agellon L.B., Davies S.L., Chen Т.Т., Powers D.A. Structure of fish (rainbow trout) grows hormone gene and its evolutionary implications // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1988.-V. 21.-p. 1311 - 1315.

80. Arimura A., Sato H., Dupont A., Nishi N., Schally A.V. Somatostatin: abundance of immunoreactive hormone in rat stomach and pancreas // Science. 1975.- 189 (4207).-p. 1007- 1009.

81. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E. et al. Current protocols in molecular biology // N-Y.: Join Wiley and Sons. 1987. - p. 311.

82. Baker A.R., Hellingshead P.G. et al. Osteoblastspecific expression of growth hormone stimulates bone growth in transgenic mice // Moll. And Cell. Biol. 1992.-V. 12.-p. 5541 5547.

83. Baumann G. Growth hormone heterogeneity: genes, isohormones, variants and binding proteins // Endocr Rev 1991; 12:424.

84. Behringer R.R., Ryan T.M., Reilly M.P. et al. Synthesis of functional human hemoglobin in transgenic mice // Science 245. 1989. - p. 971 - 973.

85. Bennis R.M. Cellular immunology in the pig // Proc. Roy. Soc. Med., 1963,- V. 66, N 12, p. 1155 - 1160.

86. Bishop J., Smith R. Mechanism of chromosomal integration of microinyection DNA // Mol. Biol. Med. 1989 - V. 6.- p.283 - 298.

87. Brameld J.M., Weller P.A., et al. Hormonal control of insulin- like growth factor- I and growth hormone receptor mRNK expression by porcine hepatocytes in culture // J. Endocrinol. 1995. - 146. - p.239 - 245.

88. Brazeau P, Vale W, Burgus R, Ling N, Butcher M, Rivier J, Guillemin R. Hypothalamic polypeptide that inhibits the secretion of immunoreactive pituitary growth hormone. Science. 1973 Jan 5; 179(68):77—79

89. Brem G. lnterifance and tissue-specific expression of transgenes in rabbits and pigs // Mol. Deprod. and Dev. 1993. - 36. - N 2. - p.242 - 244.

90. Brem G. Transgene Nutztiere // Zuchtungkunde. 1988. V. 60. - N 3.-p.248 - 262.

91. Brem G. Transgenic animals In Biotechnology. A Multy Volume Comprehensive Treatise. Edited by H.J.Rehm and G.Reed in cooperation with A.Puhler and. P.Stadtler. VCH. Weinhein,New York, Basel, Cambridge. 1993, -p.745 - 832.

92. Brem G., Brening B., Goodman H.M. et.al. Production of transgenic mice, rabbits and pig by microinjection into pronuclei // Zuchthug. 1985. - V.20. - p.251 -252.

93. Brem G., Brenning B., Salamons B. et al. Unerwartets transgene Expression eines gesaengespezifischen Wachstumshormon Genkonstruktes in den Bergmann- Gliazellen der Maus // Tiwrarztl. Prax. 1991. - V. 19. - p. 1 - 6.

94. Brem G., Muller M. Large transgenic mammals // Animals with novel genes / by Ed.N.Maclean,- Cambridge University Press. 1994. - p. 179 - 224.

95. Church R.B. / Possibilities for genetic engineering of animals // Inf. J. Anim. Sci. 1989. - V.4. - p.l - 6.

96. Church R.B. Embryo manipulation and gene transfer in domestic animal. Trends Biotechnol. 5. - 1987. - p. 13 - 19.

97. Clark A., Bissinger P., Bullock D. et.al. Chromosomal position effects and modulation of transgene expression // Reprod. Fertil. Dev. 1994. - V.6. — N 5. -p.589 - 598.

98. Cunningham, B.C., Mulkerrin, M.G., Wells, J.A. Dimerization of Human Growth Hormone by Zinc // Science, 1991, 253, 545-548,

99. Cunningham, B.C., Wells, J.A. Rational design of receptor specific variants of human growth hormone // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 34073411.

100. Eriksen E.F., Kassem M., et al. Growth hormone, insulin-like growth factors and bone remodeling // Braz. J.Med, and Biol. Res. 1996. - 29. - N 6. -p.525 - 534.

101. Erlich IT.A. PCR technology: principles and application for DNA amplification. Stockton press, New York. 1989.

102. Eva D., Hans T., Hans E., et al. Growth hormone signaling in hepatocytes // (Abstr.) Keystone Symp. "Adipose Cell".- Park City. Utah. Jan. 14 -21. - 1994. - J.Cell.Biochem. - Suppl.l 8a. - p. 152.

103. Evans M.J., Bradley A., Robertson E.J. Genetic manipulation of the mammalian ovum and early embryos // Bandbury Report. Gold Spring Harbor, New York, 1985.

104. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos //Nature 292. 1981. - p. 154 - 156.

105. Frohman L, Jansson J-0 Growth hormone-releasing hormone. Endocr Rev 1986 7:223-253

106. Frohman LA, Szabo M, Berelowitz M, Stachura ME. Partial purification and characterization of a peptide with growth hormone-releasing activity from extrapituitary tumors in patients with acromegaly. J Clin Invest. 1980 Jan;65(l):43-54.

107. Fuh G., Cunningham B.C., et al. Rational design of potent antagonists to the human growth hormone receptor // Science. 1992. - V.256. — N 5064. - p. 1677 -1680.

108. Gavora J.S., Benkel B., Sasada H. et.al. An attempt at sperm mediated gene transfer in mice and chikens // Can. J. Anim. Sci. 71. - 1991. - p.287 - 291.

109. Glosser A., Doetschman T., Korn R. et.al. Transgenessis by means of blastocyst derived embrionic stem cell lines // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. -V.83.-p.9065 - 9069.

110. Gordon J.W., Ruddle F. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei // Science. 1981. - V.214. - p. 1244 - 1246.

111. Hammer R.E., Palmiter R.D., Brinster R.L. Partial correction of murine hereditary growth disorder by germ line incorporation of a new gene // Nature.-V.311.- 1984. -p.65 67.

112. Hammer R.E., Pursel V., Rexroad C et.al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection // Nature. 1985. - V.315. - p.680 - 683.

113. Hettiarachchi M., Watkinson A., et al. Growth hormone- induces insulin resistance and its relationship to lipid aviability in the rat // Diabetes. 1996. - 45. -N4. -p.415 -421.

114. Huzar D., Balling R., Kothary R. et al. Insertion of a bacterial gene into the mouse germ line using an infections retro virus vector // Proc. Natl. Acad. Sci. 82. 1985. -p.8587 - 8591.

115. Jaehner D., Haase K., Mulligan R. et al. Insertion of the bacterial gpt gene into germ of mice by retro viral infection // Proc. Natl. Acad. Sci. 82. 1985. -p.6927 - 6931.

116. Kostyo L.J., Nutting D.K. Grows hormone and protein metabolism. In: Handbook of physiology. 1979. - p. 187 - 210.

117. Krulich L, Dhariwal AP, McCann SM. Stimulatory and inhibitory effects of purified hypothalamic extracts on growth hormone release from rat pituitary in vitro. Endocrinology. 1968 Oct;83(4):783-790

118. Lavitrano M., Camaioni A., Fazio V.M. et.al. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: genetic transformation of mice. Cell 57. 1989. -p.717 - 723.

119. Mannino R.J. and Gould-Fogerite S. Liposome mediated gene transfer // Bio Technigues 6. 1988. - p.682 - 690.

120. Mansour S.L. Gene targeting in mouse embryonic stem cells: introduction of specific alteration into the mammalian genome // Gene- Anal. Tech. -7.- 1990.-p.219-227.

121. Mansour S.L., Thomas K.R. and Capecchi M.R. Diruption of the proto-oncogene int -2 in the mouse embrio derived stem calls; a general strategy for targeting mutations to nonselectable genes // Nature 336.- 1988.-p.348-352.

122. Mehtali N., LeMeur V., Lathe R. The methylationfree ststus of ahouskeeping transgene is lost at high copy number // Gene. 1990. - V.91. - p. 179 -184.

123. Mol J.A., Van Garderen E., Selman P.J., Wolfswinkel J., Rijnberk A., Rutteman G.R. Growth hormone mRNA in mammary gland tumour of dogs and cats. J Clin Invest. 1995. 95: 2028-2034.

124. Okada S., Kopchich J.J. Anti- diabetogenic effect of growth hormone antagonists // J. Cell. Biochem. 1994. - p.171 - 178.

125. Palmiter R.D., Brinster R.L. Germ- line transformation of mice // Ann. Rev. Genet. 1986. - V.20. - p.465 - 499.

126. Palmiter R.D., Brinster R.L., Hammer R.E. et al. Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes // Nature. 1982."- V.306. -p.611-615.

127. Palmiter R.D., Norstedt R.E., Gelinas R.E. et al. Metallothionein-human GH fusion genes stimulate growt of mice // Science. 1983. - V.222. - p.809 - 814.

128. Panthier J.J., Condamine H. and Jacob F. Inoculation of newborn SWR/J gemales nith an ecotropic murine llucemia virus can produce transgenic mice // Proc. Natl.Acad. Sei. 85. 1988. - p. 156 -1160.

129. Pace CS, Tarvin JT. Somatostatin: mechanism of action in pancreatic islet beta-cells. Diabetes. 1981 Oct;30(10):836-842.

130. Penman E, Wass JA, Butler MG, Penny ES, Price J, Wu P, Rees LH. Distribution and characterisation of immunoreactive somatostatin in human gastrointestinal tract. Regul Pept. 1983 Sep;7(l):53-65

131. Pradayrol L, Jörnvall H, Mutt V, Ribet A. N-terminally extendedsomatostatin: the primary structure of somatostatin-28. FEBS Lett. 1980 Jan 1;109(1):55—58.

132. Pohja M.S., Niinivaara F.P. Determination of the water holding of meat by constant pressure method // Fleischwirtschaft 1957. - V. 9. - N 4 - p. 193.

133. Pursel V.G., Bolt D.J., Mileer K. Expression and performance in transgenic pigs // J.Reprod. Fert. Suppl. 1990. - V.40. - p.235 - 245

134. Pursel V.G., Pincert C, Mileer K. et al. Genetic engineering of livestock // Science. 1989. - V.244. - p. 1281 - 1288.

135. Pursel V.G., Pinkert C, Rexroad C, Mileer K. Animal growth regulation // Et by D.K.Campion, C.J.Hausman, K.J.Martin. New York. London. 1989.

136. Pursel V.G., Rexroad C, Pincert C. et al. Progress on gene transfer in animals// Vet.Immunol. Immunopathol. 1987. - V.17. - p.303 - 312.

137. Pursel V.G., Rexroad C. Status of research with transgenic farm animals // J.Anim.Sci, 1993.-V.71.-p.l0- 19.

138. Reichlin S. Somatostatin (second of two parts). N Engl J Med. 1983 Dec 22;309(25): 1556-1563.

139. Rexroad C.E. Transgenic technology in animal agriculture // Animal Biotechnology. 1992. - V.3. - N 1. - p. 1 - 13.

140. Rexroad C.E., Pursel V.G. Status of gene transfer in domestic animals // Proc. of 11th inter, congress on animal reproduction and artifical insemination. Dublin, 1988. V.5.-p.28 - 35.

141. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., et al. Primer- directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA- polymerase // Science. 1988. -V.239. - p.487 - 491.

142. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F. et al. Enzymatic amplification of B-globulin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia//Science. 1985. - V.230. - p. 1350 - 1354.

143. Sippel A.E., Saueressing K, Winter D. et.al. Transgenic animals. N.Y.L: Academic Press Inc. 1992. - p.3 - 26.

144. Smith, P. E. Effect of hypophysectomy upon the involution of the thymus in the rat. Anat. Rec. (1930). 47, 119-126.

145. Thompson S., Clarke A.R., Row A.M. et al. Germ line transmission and expression of corrected HPRT gene produced by gene targeting in embryonic stem cells//Cell 56. 1989. - p.313 - 321.

146. Tyrreil H.F., Brown A.C., Peynolds P.J. Effect of bovine, somatotropin on metabolism of lactating dairy cows: energy and nitrogen utilization as determined by respiration calorimetry // J.Nutr. 1988. - V.l 18. -N 8. - p. 1024 - 1030.

147. Vernon R.G. Influence of somatotropin on metabolism // Use Somatotropin Livestock-Prod. Semin. Brussels. 27-29 Sept. - 1988. - London. -1989.-p.31 -50.

148. Wall R.J., Hawk H.W., Nel Neil. Varking transgenic livestok: genetic engineering on a large seale // J.Cell. Biochem. 1992. - 49. - N 2. - p. 13 - 120.

149. Wall R.J., Pursel V.G. et al. High- level synthesis of a heterologous milk protein in the mammary glands of transgenic swine // Proc. Natl. Acad. Science USA. 1991.-p.1696 - 1700.

150. Ward K.A., Nancarrow CD. The genetic engineering of production traits in domestic animals // Experienta. 1991. - V.47. - p.913 - 922.

151. Wehrenberg, W. B. & Ling, N. In vivo biological potency of rat and human growth hormone-releasing factor and fragments of human growth hormonereleasing factor. Biochemical and Biophysical Research Communications (1983). 115, 525-530

152. Weigent, D. A., Blalock, J. E., and LeBoeuf, R. D. (1991). An antisense oligodeoxynucleotide to growth hormone messenger ribonucleic acid inhibits lymphocyte proliferation. Endocrinology 128, 2053-2057.

153. Wilmut I., Archibald A.L. et al. Production pharmaceutical proteins in milk//Experientia. 1991. - V.47. - p.905 - 912.