Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние ингибиторов цитоскелета на водный обмен корней озимой пшеницы при последствии водного стресса

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Волобуева, Ольга Васильевна, Казань

КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи УДК 581.176:542.63:539.143.3

Волобуева Ольга Васильевна

ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРОВ ЦИТОСКЕЛЕТА НА ВОДНЫЙ ОБМЕН КОРНЕЙ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ НРИ ПОСЛЕДЕЙСТВИИ

ВОДНОГО СТРЕССА

Специальность 03.00.12 - физиология растений

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -доктор биологических наук, профессор Л.П. Хохлова

Научный консультант -доктор биологических наук Г.А. Великанов

Казань - 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...............................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Влияние водного дефицита на водный обмен растений

1.1.1 Изменение состояния воды и ее компартментализации..................10

1.1.2 Системы межклеточного транспорта воды......................................20

1.2 Строение и функции цитоскелета растений

1.2.1 Общая характеристика.....................................................................28

1.2.2 Микротрубочки................................................................................30

1.2.3 Микрофиламенты.............................................................................36

1.3 Водный стресс и цитоскелет растений.................................................43

1.4 Влияние цитоскелета на состояние и транспорт, воды........................46

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, СХЕМА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Условия выращивания растений и схема опытов..............................55

2.2 Характеристика и механизм действия ингибиторов полимеризации цитоскелетных белков..............................................................................57

2.3 Определение водоудерживающей способности..................................58

2.4 Измерения биофизических показателей водного обмена импульсным методом ЯМР.......................................................................61

2.5 Определение суммарной активности дегидрогеназ.............................65

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1.Методический подход к изучению самодиффузии воды

внутри вакуолярного и цитоплазматического симпластов.....................68

3.2 Влияние ингибиторов полимеризации белков цитоскелета на водный обмен корней разных по устойчивости генотипов озимой

пшеницы....................................................................................................77

3.2.1 Временная динамика действия колхицина и винбластина на биофизические показатели водного обмена растений - Т2 и Вэ фф.....................................................................................................77

3.2.2 Влияние колхицина на физиологические и биофизические

показатели водного обмена корней разных по устойчивости сортов озимой пшеницы при последействии нарастающего водного стресса

3.2.2.1 Изменение ВС................................................................................84

3.2.2.2 Изменение Т2 и Д,фф.......................................................................92

3.2.2.3 Интерпретация зависимости между Тг и Афф..............................101

3.2.3 Влияние цитохалазина Б на физиологические и биофизические

показатели водного обмена корней разных по устойчивости сортов озимой пшеницы при последействии нарастающего водного стресса

3.2.3.1 Изменение ВС...............................................................................105

3.2.3.2 Изменение Т2 и Афф......................................................................114

3.2.3.3 Радиальная самодиффузия воды в корне у различных по устойчивости сортов озимой пшеницы при восстановлении

оводненности в присутствии цитохалазина Б........................................123

3.3 Активность дегидрогеназ как тест на жизнеспособность корней, обработанных цитоскелетмодифицирующими веществами после действия

водного стресса разной силы...................................................................139

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.....................................................................................150

ВЫВОДЫ................................................................................................160

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................162

Сокращения

ВМЧ - внутримембранные частицы

ВС - водоудерживающая способность

МТ - микротрубочки

МФ - микрофиламенты

ПФ - промежуточные филаменты

МАРб - микротрубочко-ассоциированные белки

МТОЦ - микротрубочко-организующий центр

ОДА - осмотически действующий агент

КСД - коэффициент самодиффузии

Т2 - времена спин-спиновой релаксации протонов воды

ТТХ - хлористый 2,3,5-трифенилтетразолий

Афф - эффективный коэффициент самодиффузии воды

рй - диффузионная проницаемость мембран для воды

розт - осмотическая проницаемость мембран для воды

V}/ - водный потенциал

\|/я - осмотический потенциал

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность В настоящее время около одной трети пахотных земель в мире недостаточно или неравномерно обеспечиваются влагой вследствие частых и длительных засух, которые в отдельные годы вызывают резкое снижение продуктивности зерновых культур. На территории нашей страны за последние пять столетий засухи отмечались в среднем один раз в 10 лет, однако проявляется тенденция к их более частому повторению. Несмотря на достигнутые успехи в познании природы засухоустойчивости растений и разработку приемов и методов борьбы с засухой, эта проблема продолжает оставаться одной из самых трудных и важных.

Исследования водного обмена и засухоустойчивости растений охватывают много аспектов и направлений, что нашло отражение в книге A.M. Алексеева «Водный режим растений и влияние на него засухи» (1948). Современные представления о роли воды в жизнедеятельности растений и об их реакции на водный дефицит изложены в ряде фундаментальных работ (Самуилов, 1972; Петинов, 1972; Гусев, 1974; Шмать-ко, Шведова 1977; Генкель, 1982; Зялалов, 1985; Шматько и др., 1989; Жолкевич и др., 1997; Кузнецов и др., 1997). В этих работах получило развитие, главным образом, физиолого-биохимическое направление. В последние годы большое внимание уделяется выяснению молекулярных ответов растительных клеток на водный стресс (Кузнецов и др., 1992; Rascio et al., 1992; Hans et al., 1995; Shinozaki, Yamaguchi, 1996; Maeda, 1996).

Был достигнут определенный прогресс в плане разработки методических подходов к изучению водного обмена растений, и особенно к исследованию биофизичкских аспектов транспорта воды, благодаря использованию импульсного метода ЯМР, который при малом возмущающем воздействии позволяет получить информацию на молекулярном уровне в интактных клетках и тканях (Федотов и др., 1969; Велика-

нов, 1977; Анисимов, 1977; Аксенов, 1987; Анисимов, Раткович, 1992; Ионенко с сотр., 1998).

Особая роль в координации внутриклеточных процессов и в реакциях клеток на изменяющиеся условия внешней среды принадлежит системе цитоскелета (Cerr, Carter, 1990; Beese, 1991; Lloyd, 1991; Chowdhury et al., 1992; Goddard et al., 1994; Pihakasky-Maunsbach, Puhakainen, 1995; Bokros et al., 1996; Nick, 1998). Вопрос о влиянии микротрубочек и микрофила-ментов на водный статус клеток является малоизученным, и в основном эти исследования проводились на животных тканях (Clegg, 1984; Сниги-ревская, 1990; Комиссарчик, 1996). Такого рода информация для растительных клеток содержится в единичных работах (Wayne, Tazawa, 1988; Жолкевич, Чугунова, 1987; 1995; Хохлова с сотр., 1997). В настоящее время совершенно открытым остается вопрос о роли цитоскелета в во-обмене растительных клеток в условиях водного дефицита.

Цель работы: Установить зависимость водного обмена корней от направленной модификации цитоскелета при последействии нарастающего обезвоживания у отличающихся по устойчивости генотипов озимой пшеницы.

Были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методический подход к выявлению участия цитоскелета в процессах водообмена корней проростков с использованием ингибиторов полимеризации актиновых и тубулиновых белков в условиях последействия водного стресса разной силы (слабого, среднего, сильного).

2. Соотнести коэффициенты самодиффузии (КСД) воды, полученные на основе компьтерного разложения мультиэкспоненциального диффузионного затухания намагниченности стимулированного эха с различными по подвижности фракциями воды в клетках корней.

3. Изучить временную динамику действия антимитотических веществ -колхицина и винбластина на трансмембранный перенос воды в корнях.

4. Исследовать влияние модификаторов цитоскелета - колхицина и ци-тохалазина Б на физиологические и биофизические показатели (водоудерживающую способность - ВС, времена спин-спиновой релаксации - Т2 и эффективный коэффициент самодиффузии - Афф) водного обмена корней разных по устойчивости сортов озимой пшеницы.

5. Изучить радиальную самодиффузию воды в корнях и оценить пути межклеточного транспорта воды на уровне плазмодесм и плазмалем-мы в норме и при восстановлении оводненности после обезвоживания в присутствии цитохалазина Б.

Научная новизна. Впервые установлена зависимость водного обмена корней проростков озимой пшеницы от ингибиторов полимеризации белков цитоскелета в условиях последействия водного стресса. Показано, что направленность и степень проявления этой зависимости геноти-пически детерминированы и определяются уровнем обезвоживания тканей. Разработан принципиально новый подход к изучению водопрово-димости плазмодесм, основанный на компьютерном анализе мульти-компонентного диффузионного затухания намагниченности стимулированного эха в тканях корня. Была объяснена природа трех коэффициентов самодиффузии (КСД), характеризующих разные по подвижности фракции воды. Выдвинуто новое представление о регуляции межклеточного транспорта воды по плазмодесмам, согласно которому нарастающее обезвоживание вызывает компенсаторное перераспределение диффузионных потоков воды между цитоплазматическим и вакуолярным симпластами в направлении усиления по первому пути, а также притока воды в апопласт вследствие повышения проницаемости плазмалеммы. Деполимеризация актиновых белков под влиянием цитохалазина Б, индуцируя деструкцию акто-миозиновых сфинктеров плазмодесм, усиливает эффект умеренного обезвоживания (5-10%), а после значительной

потери воды (20%), блокирует цитоплазматическое русло и увеличивает локализацию воды в апопласте. Механизмы регуляции межклеточного переноса воды на уровне плазмодесм являются более чувствительными в корнях устойчивых растений по сравнению с малоустойчивыми. Теоретическая и практическая значимость работы. На основе разработанных новых подходов к выяснению физиологической роли цитоскеле-та в процессах водообмена (ингибиторный анализ, регистрация ВС, Тг, Афф) и к изучению водопроводимости плазмодесм (анализ мультиком-понентного диффузионного затухания намагниченности, регистрация трех КСД) в корнях проростков разных по устойчивости сортов озимой пшеницы при последействии нарастающего обезвоживания выявлены осмоадаптивные характеристики термодинамического состояния воды и ее межклеточного транспорта. Эти характеристики, более выраженные у устойчивых сортов, могут быть использованы в качестве чувствительных диагностических критериев при отборе и создании более засухоустойчивых сортов пшеницы.

Компьютерный анализ неэкспоненциального диффузионного затухания намагниченности при больших временах наблюдения в корнях рекомендуется включить в пакет программ при разработке автоматизированных систем для массовой экспресс-диагностики засухоустойчивости пшеницы на ранних этапах селекционного процесса.

Целесообразно также использовать представленные в работе теоретические обобщения при чтении спецкурсов по водному обмену и по физиологии устойчивости растений.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Международном XXVII конгрессе Ампера («Magnetic resonanse and related phenomena» Kazan, August, 21-28, 1994); на Международной коферен-ции студентов и аспирантов «Ленинские горы-95» (Москва, 12-14 апреля, 1995); на ежегодном симпозиуме «Физико-химические основы физиологии растений (Пенза, 1996); на II Республиканской конференции молодых

ученых и специалистов (Казань, 28 июня-1 июля, 1996); на V Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, Мари-Эл, 22-26 июня, 1998), на Международном симпозиуме «The Plant Cytoskeleton: Molecular Keys for Botechnology» (Yalta, Crimea, Ukraine, September, 14-19, 1998), на Итоговых научных конференциях Казанского государственного университета 1995-1998 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, 1 находится в печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, списка литературы, изложена на 186страницах, содержит 32 рисунка и 6 таблиц. Список литературы включает266наименова-ния, из которых! 35иностранных работ.

10

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Влияние водного дефицита на водный обмен растений 1.1.1. Изменение состояния воды и ее компартментализации

A.M. Алексеев (1940, 1941, 1948) предложил новый термодинамический подход к изучению водного обмена растений, суть которого заключается в необходимости использования для характеристики водного режима не только факторов емкости, каковыми является общее содержание воды, но и факторов напряжения, которые определяют энергетическое состояние воды в клетках и тканях и, таким образом, дают качественную характеристику водного режима. По мнению A.M. Алексеева, с термодинамической точки зрения такими факторами являются парциальный химический потенциал находящейся в растении воды и ее активность, то есть способность воды участвовать в осмотических, поверхностных и химических процессах. В качестве обратного показателя активности воды A.M. Алексеев предлагает использовать сосущую силу клетки. Автор развивает мысль о том, что активность воды зависит от степени ее связанности, то есть от гидратации как растворенных веществ (осмотически связанная вода), так и гидрофильных коллоидов (коллоидно-связанная вода).

Многие авторы отмечали повышение содержания связанной и снижение свободной воды в растениях при уменьшении влажности почвы (Лебединцева, 1929; 1930; Васильева, 1955; 1957; Гусев, 1959; Петинов, 1959). Детальные исследования в этом направлении проведены A.M. Алексеевым (1948) на пшенице, установившим, что под влиянием засухи в листьях увеличивается содержание связанной воды за счет повышения количества осмотически связанной. Уровень коллоидно-связанной воды, наоборот, уменьшался и особенно значительно при расчете на сухой вес.

Увеличение содержания осмотически связанной воды A.M. Алексеев объясняет двумя причинами: повышением абсолютного количества осмотически связанной воды за счет новообразования в клеточном соке и протоплазме осмотически активных веществ и повышением относительного содержания осмотически связанной воды за счет потери листьями при транспирации свободной воды. Уменьшение коллоидно-связанной воды, по мнению A.M. Алексеева, может объясняться лишь потерей воды коллоидами протоплазмы, поскольку вероятность значительных изменений свойств целлюлозной оболочки при сравнительно слабом ее подсушивании очень мала. Потеря воды коллоидами протоплазмы может зависеть, во-первых, от уменьшения степени гидратации коллоидов вследствие потери части свободной воды в процессе транспирации и, во-вторых, от уменьшения числа гидратируемых частиц или степени дисперсности коллоидов протоплазмы.

Известно, что неблагоприятное действие стресс-фактора на растение зависит от его дозы, обусловленной степенью, глубиной и продолжительностью воздействия данного фактора. Г. Селье (1972; 1979) разделил весь адаптационный процесс живых организмов на три стадии. Реакция тревоги - это первоначальный ответ клеток, характеризуется активацией защитных сил организма. В ходе длительного воздействия любого повреждающего агента, способного вызвать эту реакцию, наступает вторая стадия - стадия адаптации или резистентности. После еще более длительного воздействия стрессора достигнутая адаптация снова теряется. Организм переходит в третью фазу - стадию истощения, симптомы которой напоминают реакцию тревоги.

Безусловно, применительно к растениям первая фаза стрессовой реакции не может быть названа фазой тревоги, так как у них нет ни нервной системы, ни тех гормонов, которые участвуют в стресс-реакциях у животных (Урманцев, Гудсков, 1986; Полевой, 1989). В фитофизиологии первый этап адаптационного синдрома получил самые разнообразные названия: реакция тревоги (Tietz, Tietz, 1982), фаза повреждения

(Удовенко, 1979), реакция защитного торможения метаболизма (Мелехов, 1985), деэнергизованное состояние (Пахомова, Гордон, 1984), первичная стрессовая реакция (Полевой, 1989), состояние физиологической депрессии (Пахомова, 1992), фаза шока (Пахомова, Пахомов, 1991), активное состояние (Гордон, 1992).

Вторая фаза адаптационного синдрома растений - фаза адаптации характеризуется снижением гидролитических и катаболических процессов, восстановлением исходных физиологических параметров и структур (мембран, органелл), включением шунтовых механизмов (увеличение числа изоферментов, повышение активности одних ферментов при снижении других), полной мобилизацией потенциальных возможностей различных реакций, компенсаторными изменениями сопряженных реакций (Гринева, 1975; Хохлова, 1976; Удовенко, 1979; Савич, 1989). Эта фаза получила также различные названия: состояние гетеростаза (Генкель, 1982), суперкомпенсация (Пахомова, Пахомов, 1992), энергизованное состояние (Пахомова, Гордон, 1984), состояние стабилизации (Пахомова и др., 1992), состояние покоя (Лыгин и др., 1990), со�