Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние холинергических средств на стимулированный транспорт воды в АДГ-чувствительном эпителии мочевого пузыря лягушки Rana temporaria L

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние холинергических средств на стимулированный транспорт воды в АДГ-чувствительном эпителии мочевого пузыря лягушки Rana temporaria L"

На правах рукописи

УДК 612.467.014.462; 615.217.32; 577.175.822

ВЛИЯНИЕ ХОЛИНЕРГИЧЕСКИХ СРЕДСТВ НА СТИМУЛИРОВАННЫЙ ТРАНСПОРТ ВОДЫ В АДГ-ЧУВСТВИТЕЛЬНОМ ЭПИТЕЛИИ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ЛЯГУШКИ Rana temporaria L

03.00.13 - Физиология человека и животных

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дмитриева Наталия Игор

АВТОРЕФЕРАТ

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена в Институте эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Сеченова РАН

Научный руководитель: доктор медицинских наук Я.П.Багров

Официальны.? оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Пушкарев Ю.П. доктор биологических наук Шелковников С.А.

Ведущая организация: Институт физиологии им.И.М.Павлова РАН

Защита состоится 1996 г. в часов

на заседании диссертационного совета К 002.89.01 при Институте эволюционной физиологии и биохимии им.И.Ы.Сеченова РАН (194223, Санкт-Петербург, пр. М.Тореза, 44). С диссертацией моано ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии им.И.М.Сеченова.

Автореферат разослан «/<£»

1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Л.В.Зуева

- г -

Актуальность проблеиы. Холинергическая система, главным элементом которой является ацетилхолин, контролирует огромное число функций организма. Свое действие ацетилхолин оказывает связываясь с никотиновыми и мускариновыми рецепторами клеток-мишеней. В настоящее время не вызывает сомноний, что мускариновые холинорецеп-торы (М-ХР) присутствуют в клетках АДГ чувствительного эпителия собирательных трубок млекопитающих, мочевого пузыря и кожи амфибий. Однако, сведения о роли холинергаческой системы в регуляции стимулированного водного транспорта (СВТ) в АДГ-чувствительном эпителии единичны и получены без использования селективных лиган-дов М-ХР. На мочевом пузыре кабы было показано, что карбахолин (0.1-1 мМ) угнетает водный транспорт, стимулированный аргинин-ва-зопрессином (Arruda, Sabatlnl.1980). Авторы связывали этот эффект с активацией М-ХР и с усилением входа кальция в эпителиальные клетки. Это било подтверждено исследованиями Snyder et al (1991), показавшего роль фосфоинозитидов в торможении карбахо-лином АДГ-стимулированного водного транспорта. Ранее в нашей лаборатории было установлено, что высокие дозы ацеталхолина (1 мМ) угнетают СВТ через стенку мочегого пузыря лягушки (Багров,Манусо-ва,1Э78; Багров и соавт,1991). Этот эффект ацеталхолина не снимался ни атропином, ни кальциевыми блокаторами,, как в опытах Аггийа, Sabatlni,1980, но парадоксально тормозился ингибиторами ацетилхолинэстеразы, что позволило объяснить его взаимодействием ацэтилхолина с ацетилхолинэстеразой и предположить ее наличие в эпителии мочевого пузыря лягушки.

Помимо большого научного интереса, который представляют механизмы действия хсшшергических средств на СВТ в эпителии мочевого пузыря амфибий, широко используемого в экспериментах функционального аналога собирательных трубок, изучение этих механизмов должно внести вклад в решение фундаментального вопроса о принципах и механизмах взаимодействия нервной и эндокринной сис-' темы в процессе контроля за конкретной физиологической функцией (здесь - гидроосмотический транспорт воды и поддержание водно -солевого баланса). В настоящее время решение этой проблемы выходит на новый уровень. Для многих гормонов и биологически активных веществ активно исследуются внутриклеточные механизмы, которые обеспечивают возможность воздействия на них. После обнаружения в конце 80-х годов пяти подтипов М-ХР, началось бурное изуче-

ние способов сопряжения различных М-ХР с внугриклэточными системами передачи сигнала. Эти работы проводятся в основном на культурах клеток различных тканей иди на клетках с экспрессиро-ванными в них М-ХР определенного типа. К настоящему моменту назрела необходимость проверки того, как реализуются обнаруженные на культурах клеток закономерности при обеспечении конкретных функций.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является определение типов М-ХР эпителия мочевого пузыря лягушки Rana temporaria, характера их регулирующего влияния на стимулированный вазопрессином водный транспорт, а также способов сопряжения этих рецепторов с компонентами внутриклеточной системы передачи сигнала, которые участвуют в осуществлении анткдауретической реакции. Были поставлены следующие задачи:

1. Определение характера влияния различных подтипов М-ХР на стимулированный АВП водный транспорт при использовании селективных агонистов и антагонистов М1 и М2 холинорецепторов;

2. Анализ внутриклеточных механизмов, которые обеспечивают модуляцию СВТ холкномиметиками, при помощи ингибиторов и активаторов внутриклеточных ферментов, задействованных в гидроосмотическом эффекте АДГ: аденилатциклазы, фосфодиэстеразы цАЫФ, фосфолипазы С, фосфолипазы А2, протоинкиназы С, кальмодулина, тирозинкиназы.

3. Характеристика эндогенной холинергической системы мочевого пузыря лягушки: проверка эпителия на наличие в нем ацотилхолинэсте-разы, а также способности эндогенного ацетлхолина модулировать СВТ через разные типы М-ХР.

Научная новизна работы. Впервые охарактеризованы компоненты холинергической системы АДГ-чувствительного эпителия и проведено всестороннее исследование роли различных типов М-ХР в регуляции стимулированного водного транспорта и внутриклеточных механизмов, с помощью которых эта регуляция осуществляется. Так, никогда ранее не было показано наличие ацетилхолинэстеразы в эпителиальных тканях. Впервые обнаружено и проанализировано стимулируодее действие хожьлфгичаских средств на СНГ. На эпителии мочевого пузыря впервые обнаружено стимулирующее действие протеинкиназы С на заключительных этапах внутриклеточного каскада антвдиуретаческой реакции. Абсолютно новыми являются данные об участии тирозинкиназ в передаче сигнала с рецепторов вазопрессина.

Научно-практическая ценность. Мочевой пузырь амфибия является функциональным аналогом дисталыюго сегмента нефрона млекопитающих и широко используется в качестве тест-объекта для исследования механизмов действия антидиуратичаского гормона (АДГ), альдос-терона и ряда других биологически активных веществ. Получешше в работе результаты расширяют современные представления о механизмах развития и регуляции гидроосмотического действия вазопресси-на, о роли нервной системы в этой регуляции. Это дает дополнительные сведения о возможных механизмах нарушения водно-солевого равновесия и способах их фармакологической коррекции. Апробация работы. Основное результаты диссертационной работы докладывались на XII Международном конгрессе по фармакологии (Монреаль, 1994); Симпозиуме "Мембранный транспорт и функции клетки" (Санкт-Петербург, 1994); IV Всероссийской конференции "Нейроэн-докринология-95" (Санкт-Петербург, 1995); Международной школе по обработке информации в клетках и тканях (Ливерпуль.1995). По материалам диссертации опубликованы 3 статьи в реферируемых научных журналах.

Структура и оОъеы диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и списка цитируемой литературы. Объем диссертации составляет /3^2. страниц. Диссертация содержит 31 рисунок на 31 странице. Список цитируемой литературы содержит /<Г/ наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. В качестве объекта исследования была выбрана лягушка Rana temporaria L. Отловленные в естественных условиях животные выдерживались в условиях вивария при температуре 6-10°С. Для исследования отбирали взрослых самцов. Оценка водного транспорта через стенку мочевого пузыря лягушки. Исследование было проведено в осенне-зимнее время на мочевых пузырях лягушек Rana temporaria L., выделенных по методу Бентли (Bentley, 1958). Препаровка производилась на лягушках с разрушенным головным и спинным мозгом. Мочевой пузырь заполнялся с помощью катетера, введенного в него через заднепроходное отверстие, раствором рингера, разведенным в пять раз дистиллированной водой. В процессе препаровки какдай мочевой пузырь делился на две одинаковые половины. Одна из половинок пузыря (в дальнейшем просто

"пузырь") служила контролем для другой. Изолированные пузыри инкубировались при комнатной температура в аэрируемом растворе Рингера следующего состава (мМ): 112; С1~- 113; К+ -5.7; Са2+-0.89; Н2Р0Д~ 0.6; НР0Д- 2.4; рН 7.3; 220 моем. Стимуляторы водного транспорта вводились в серозный раствор после 60 минут контрольного периода. После добавления стимулятора в серозный раствор вода по осмотическому градиенту выходила из пузырей. Величина водного транспорта оценивалась гравиметрически и выражалась в мкл/см2 стенки мочевого пузыря за 60 минут инкубации. Вещества, влияние которых на водный транспорт исследовалось, вводились или в инкубационную среду (серозный раствор), или через катетер внутрь пузырей ■ (мукозный раствор) за 10 - 20 минут до АВП или иного стимулятора водного транспорта.

Получение препарата эпителия мочевого пузыря. Транспортирующий воду эпителий составляет внутренний слой клеток стенки мочевого пузыря амдриоии. Для снятия этого эпителия пузыри наполнялись взвесью кварцевого песка (диаметр песчинок < 0.4 мм) в растворе Рингера описанного состава. Механический контакт с песчинками приводил к отслаиванию эпителия. Чтобы исключить возможное попадание в препарат эритроцитов, нервных и гладаомышечных клеток проводилось его микроскопическое исследование. После гомогенизирования препарата песок осаадался центрифугированием в течение Б мин. со скоростью 3000 об/мин.

Получение препарата эпителия кош лягушки. Кусочки коки Срипка лягушки замораживались в жидком азоте. В процессе оттаивания эпителий отслаивался и легко снимался скальпелем. Гомогенизирование проводилось в растворе Рингера описанного состава. Определение активности ацэтилхолинастеразы в эпителии мочевого пузыря и кола лягушек. Активность ацетилхолинэстеразы определяли методом Эллмана (ЕИтал е1; а1, 1961). Метод основан на измерении количества тиохолина, образующегося в результате ферментативного гидролиза ацетилтиохолша.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование характера влияния ыускаривовых агонистов н антагонистов на СВТ. Задачей первого этапа исследования рола М-ХР в модуляции СБТ в мочевом пузыре лягушки было выявление типов М-ХР и характера их влияния на СЗТ. Исследуя действие кагвдролизуемого

аналога ацетилхолкна карбахолина (0.1мкМ), ш обнаруяили, что ого действие на СВТ, вызванный ABII (0.3 мкМ) было непостоянным. Он мог оказывать как стимулирующее, так и тормозящее влияние на СВТ, однако типичный*результат - отсутствие действия (рис.1). В данной ситуации логично било предположить, что такая вариабельность связана с юселоктивностью карбахолина. Так как он действует сразу на все подтипы М-ХР, то результирующий эффект зависит от их соотношения и чувствительности в данный момент. И действительно, в присутствии селективного М! антагониста гшрензипина (0.1 мкМ), карбахолин всегда увеличивал СВТ(рис.1).

Чтобы выяснить в какой мере стимуляция эффекта АВП была обусловлена возникшим доминированием других подтипов мускарино-внх рецепторов, исследовалось влияние на него оксотреморина , обладающего преимущественным сродством к М2 рецепторам. Как видно из рисунка 2 действие оксотреморина на СВТ имеет двухфазный характер: доза в 0.5-5 мкМ ингибируют его, а 10-100 мкМ - усиливает. Оба эффекта блокируются М2 антагонистом AF-DX 116 (0.1 мкМ), что подтверждает их связь с активацией М2 холикорецепторов.

Рис Л. Влияние карбахолина на стимулированный аргинин-вазоп-ре ссинсм водный транспорт. СИЗ АВП (0.5 мкМ) В5ЙЗ карбахолин(100 мкМ) + АВП « - Р<0.05 (парный критерий

Стьюдента) Данные на рисунках представлены в измерений ± средняя хвадратическая

150 г

-50"--

0.2 1 5 10 100

концентрация оксотреморина,мкМ

Рис.2. Влияние М2-холиномиме-тика оксотреморина на стимулированный АВП водный транспорт.

контроль: АВП (0.5 мкМ)

оксотреморин + АВП

виде среднего значения из 4-6 ошибка.

Для изучения роли М1 холинорсцэпторов в с-гимуляросашом вод-иа транспорте использовался ?»! агонйст ¡¡сИ А343 (60 яхЫ). Как и е с,датах с к&'нжхс.'.даом, ш йзблядым всэ варианты влияний: и с-х:л1улйЩ1н, и гор,'.ю;,-эн.ад, в отсутствий ль^кля -на силулировал-шп вызопресскном годный транспорт, что и с>таа давало пудовое отклонение Сриа.З). Основываясь на прэдяадозгеяни, что узкая ва-рнабельнооть ь:о;«е? возникнуть в результате неабсолзоггаой селективности 1-!сН А343. ш исследовала его дойствиэ на СВТ на фоне У2-ан-таюниста д* т. 116 (0.1 мч?л. сказалось, что в условиях заблокированных рецепторов Ыс" ¿343 тормозит СВТ (рис.3).

Полученнао результаты позволяют говорить о наличии в впито-лии мочевого пузнря лягупек Н. :ешрогаг1а ?.!1 и тг холикорецепто-ров, через которые холинергическая система :.:о;;ат оказывать слоа-Н08 воздействие, включающее л йктяваци», л угнетение, на цепь внутриклеточных реакций, шициируешх вазоцрессином.

А. А. Ч мим^нн ш V.« «.-г.- — .- .. —. —---

эффекте АВП а ого лэдуавда* зюшшоииавяпаия. Роль йосфоннозитЕДзого пу'.ы. ¥в основе данных с сопряаанности мускариновш холинорецепторов а 71 рецепторов вазопрессина с гидролизом фосфоииозитидов (8Ы.опс1ог11,1985; Ни1ше ег а1, 1990) было проведано исследование роли этого пути передачи сигнала в модуляции гидроослютичоского эффекта вазопрессина холиномметикаш. Для выяснения характера участия фосфолипази С в обоих вариантах ответа на оксотреморин, последний вводился в среду на фоне ингибитора этого фэр?.?анта неомицина. Сказалось, что неомицин (0.5 мМ) снимает как тормозное, так и стимулярунцео действие оксотремори-на на СВТ (рис.5), то есть оба эффекта опосредуются через гидролиз фосфоинозитидов.

Гидролиз фосфоинозитидов приводит к активации целого ряда

и70

о

Рис.3. Влияние М1-х0лин0ми-метика йсН А343 на стимулированный АВП водный транспорт.

о АВП (0.5 мкМ)

о

• Ыс.Ч АЗ43 (50 мкм) + АВП

* - Р<0.01 (паршй критерий

АР-ОХ 116

Стьвдента)

вторичных мвссещо'.ероп к клетке. Это и протешкиказа С, активируемая даацклглщериноч, шозитодтрифосфат. стгедудиругкиГ. оепо-боздвнив Са2* кз вяутрлуюточшк. депо и кальмолудии, повьгаакжй';: свою активность в результате вихода Са2^ кз депо. В свой очередь, повышение концентрация Са2* внутри клетки приводит к изменений активности многих фэрмаптов, относящихся к другим системам передачи сигнала в клетке. 3 связи с этим бил проведен анализ возможного участия этих мессэндаров в эффектах холиномиметиков. йзучеяка роля протоиккнказн С (1К-С). Чтобн выяснить. находится лк антидиуретическяй эффект под контролем Ш-О, мы исследовали СВТ посла инкубация, пузырей с ее ингибитором стауроспорином, до-Оавлешшм с серозной стороны за 30 мин до АВП. Как видно кз рис.4А, при увеличении концентрации стауроспорина в серозном растворе наблюдается градуальный рост гидроосмотического ответа на АВП, подтверждающий данные о тормозной роли ПК-С в контоле над СВТ. Однако, в последнее время начали появляться сообщения о тон, что стимулятора ПК-С при их добавлении к апикальной мембране могут, так же как вазопрессин, вызывать встраивание водных каналов

Рис.5.Влияние ингибиторов фос-фолипазы С неомицшт (0.5 мкМ) и протеинкиназы С стауроспорина <10вМ) на (А) тормозящее (5 мкЫ) и (Б) стимулирувдее (200 мкМ) действие оксотреморива на СВТ.

ССс -стауроспорин в серозном растворе; ССМ -стауроспорин в мукозном растворе.

Рис.4. Влияние стауроспоржа на стимулированный АВП водный транспорт при его добавлении в (А) серозный и (Б) мукозный растворы.

СШЗ АВП (5 мкМ) Е2Я стауроспорин + АВП

в апикальную мембрану (Maaur, Masэагйо,1987; lila et al, 1994). В связи с этим у нас возникло предположение о возможном участии ПК-С в заключительных этапах действия АВП, происходящих в области апикальной мембраны. Для проверки этого предположения мы попытались выяснить характер влияния стауроспорина, добавленного к мукозшй поверхности пузыря. Из рис.4Б видно, что малые дозы стауроспорина (2 им), добавленные к мукозной поверхности пузыря почти полностью снимают СВ'Г. По мере увеличения дозы снижается степень яягибирования, которое при 15 ra.i сменяется активацией. Полученные результаты дают возможность предполагать, что влишше Ш-С на различные звенья антидауретической реакции может быть различным. Очевидно, на уровне аденилатцшишзи влияние ПК-С является ингибируюцим, на дальнейших же этапах" внутриклеточного каскада реакций, стимулированного АВП, действие ПК-С становится потенцирующим. Мы предполагаем, что по мере повышения концентрации стауроспорина в мукозном растворе, все больше его количества достигают аденилатцшиази, расположенной на Сазальной мембране, что и обуславливает переход ингибирования СВТ стауроспорином в потенцирование. Вывод о различной роли ПК-С у базалъной и апикальной мембраны подтвердился и в опытах с активатором ПК-С фор-боловым эфиром РМА. Оказалось, что активация апикальной ПК-С добавлением РМА (50нМ) в мукозшй раствор приводят к увеличению водного транспорта в том,случае, если базальная ПК-С заторможена стауроспорином. Этот факт подтверждает стимулирующую роль апикальной ПК-С в эпителии мочевого пузыря.

С целью изучения вопроса об участии ПК-С в модулирующих СВТ эффектах оксотреморина, последний вводился в среду после инкубации пузырей со стауроспорином, добавленным или в серозный, или в мукозшй раствора. Оказалось, что на фоне стауроспорина стимулирующее СВТ действие Сольиих доз оксотреморина сохраняется, в то время как янгибирующэе влияние исчезает. При этом те-же малые дозы оксотреморина становятся стимулирушимя (рис.5). Таким обрезом, только ингиоируюцве действие оксотреморина опосредовано через ПК-с. , '

Исследование роли кальмодулина. Активация обмена фосфоянозитидов, наряду с активацией ПК-С,приводит к образованию ивозитолтрифосфа-та и увеличению концентрация Ca2f внутри клетки за счет его освобождений из внутриклеточных -депо. Одшда из важнейших последствий

этого является образование комплекса С<ч2+ с белком кальмоду„чином, играющим важную роль в заключительных этапах эффекта вазопресси-на, а также активирующим целый ряд кальмодулин-зависимых ферментов, участвующих в передаче сигнала от рецепторов вазопрессина. Это может быть нальмодулин-чувствительная аденилатциклаза (Iyengar, 1993), кальмодулин-зависимые протешпданазы, фосфодиэсто-раза цАМФ (Gnegy, 1993), фосфолштаза А2 (Bonventre, Nemenol/, 1991). Кроме того, известно, что через М-ХР может повышаться уровень цАМФ в клетке путем активации кальмодулян-зависимой адени-латциклазы. В связи с такими широкими модулирующими возможностями кальмодулина была исследована его роль в стимулирующем действии ■оксотреморина на СВТ.

Для выяснения роли кальмодулина в стимуляции водного транспорта большими дозами оксотреморина пузыри инкубировались с ингибитором кальмодулина ЧП в течение 15 мин., а затем к опытным пузырям добавлялся оксотреморин. Результаты этих экспериментов отражены на рис.6. Оказалось, что стимулирующее действие оксотре-

5ioo

о

10 75

50

[25

о 1

1

5 20100 коянентращ'.я V/7. мхМ Рис.6. Влияние ингибитора кальмодулина Vi?, добавленного (А) в серозный раствор и (Б) в мукозный раствор на стимулированный АВП водный транспорт и его потенцирование высокими концентрациями оксотреморина (200 мкМ).

CID W7 +■ АВП (0.6 мкМ) ШШ WT + оксотреморин * АВП * - Р<0.05 (парный критерий Стьюдента)

*

ft

мк

мк

Рис.7. Влияние мепакрина (МК, 50 мкМ) на (А) гидроосмотический эффект АВП , (Б) стимулирующее (200 мкМ) И (В) тормозящее действие оксотреморина на СВТ. СШ АВП

ШШ А - мепакрин + АВП; Б - оксотреморин(200 мкМ)+АВП; В - оксотреморин (5 мкМ)+АВП * - Р<0.05 (парный критерий Стьюдента)

морша сохраняется при применении WT как с базальной, так и с апикальной стороны даже на фоне сниженного СВТ. Однако, W, взятый в концентрации, которая не влияет на СВТ (1 мкМ), вызывает достоверное снижение степени стимуляции потока оксотреморином (рис.6). Это позволяет связать усиление антидиуретического аффекта оксотреморином с активацией какого-то кальмодулин-зависимого фермента. При анализе возможности участия в этой стимуляции кальмодулин - зависимых фосфодиестеразы цАМФ, аденилатциклазы I или Iii типов, фосфолипазы А2, ш обнаружили, что стимуляция потока большими дозами оксотреморина исчезает на фоне ингибитора фзсфолипазы А2 мопакрдаа (50 мкМ). При этом та-же концентрация ОКСО становится ингибируодей (рис.7). Интерпретация получешшх результатов затруднена в связи с неабсолютной селективностью ме-накрина. Дело в том, что мепакрин, хотя и в меньшей степени, но тормозит также и фосфолипазу С, через которую, как было поназано выше, опосредуются т.путрутив СВТ эффекты оксотреморина. Однако, тот факт, что кзомицин и мепакрин по разному влияют на эффекты оксотреморина (неомицик снимает обе фазы действия оксотреморина (рис.5), а мепакрин предотвращает только стимуляцию СВТ оксотреморином (рис.7), позволяет заключить, что обнаруженное снятие стимуляции СВТ оксотреморином связано с торможением мепакрином фосфолипазы А2. Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что стимулирующее действие больших доз оксотреморина на гидроосмотическое действие вазопрессина опосредовано через фосфолшазу С, кальмодулин и фосфолилазу А2. Роль тирозинхиназа в гвдроосметгеескоы эффекте АШ и его модуляции холкномиивтикама. Вазопросшн наряду с антцдауреткческим и првссорным эффектами, обладает выраженным митогенным действием (Воег,198Т). Оно было обнаружено в клетках различного типа, включая почечный эпителий (Walsh-Relz, TobacX,1983). Общее свойство большинства вешоств, обладаащим митогенным эффоктом - участие ти-розянкиназы в передаче сигнала (Cadena,Gill,1992: Yarden,Ullrich, 198íi). в связи с этим было проведено исследование роли тирозин-кхшаза в ^ущоствлении гидроосмотичесного эффекта вазопрессина. Для этого использовался ингибитор рецепторной и цитозольной форм тирэ;>1шкшгязы - генистенн (Ак1уг.та,1987). оказалось, что на öa-залькый, то есть на шсткмулирозантй поток генистеин не влияет. При этом он сильно поте;:'тру от водный транспорт, вызванный не

только АВП, но такке агонистом 42 рецепторов десмопрэсснном, активатором аденилатциклазы форсколином, а также серозной гипертонией. вызванной маннитом (рис.8). Однако, оказалось, что при стимуляции потока ЦАМФ геикстеин его тормозит, а не потенцирует. Полученные результаты позволяют заключить, что тирозинкиназа подавляет эффект АВП на этапах передачи сигнала, предшествующих образованию цАМФ и потенцирует его на последующих этапах.

Известно, что тирозинкиназа может активироваться через М-ХР (Сизоуэку ег а1, 1993). В связи с этим, было исследовано, не участвует ли она в модулирующих эффектах холиномиметиков. Оказалось, что на стимуляцию потока оксотреморином генистеин не влияет. Однако,торможение водного транспорта оксотреморином на фоне генистеина исчезает и та-же концентрация оксотреморина ста-

250

1 2 Э А 5 12 4 5

Рис.8. Влияние ингибиторов (А) тирозинкиназа генистеина (20 мкМ) н (Б) протеинюшазы С стауроспорина (15 нМ) на водный транспорт, стимулированный различными агентами:

1 - арганин-вазопрессин(О.БмкМ)

2 - досмопроссин (1 мкм)

3 - форсколин (50 мкМ)

4 - 8-0ром-цАМФ (80 мкМ)

5 - манкит (300 мОсм) Г"~~П стимулятор

ИШЗ Л) генистеин + стимулятор Б) стауроспорин + стимулятор « - 140.02 (парный критерий Стыадеята)

•н 1

га

сс

сс

Рис.9. Влияние стауроспорина (СС. 10нМ) на стимулирующее СВТ действие Н2-антагониста АР-БХ 116 (0.1 мкМ) в условиях заторможенной йкзостигмином (I мкЫ) ацетялхолинэстеразы.

(A) - усредненные величины

(B) - индивида а льны э ошти

СПИ АВП (0.8 мкМ) £223 А?--ВХ 116 + АВП

?<0.05 (парный Стьюдеита)

критерий

новится стимулирующей. Это свидетельствует о вовлечении тарозин-киназ в торможение стимулированного вазопрессином водного транспорта малыми дозами оксотреморина.

Изучение собственной холинаргической системы мочевого пузыря лягушек. Описанные в предыдущих разделах данные свидетельствуют о возможности модуляции СВТ олинергическими средствами. Однако, наиболее ингэресным является вопрос о том, какие из полученных эффектов отражают реальную физиологическую роль эндогенной холин-ергической системы в контроле над СВТ.

Ацетилхолинэстераза эпателнез мочевого пузыря и кожи лягушек.

Ацетилхолинэстераза хорошо известна как фермент, который катализирует гидролиз ацетилхолина в синаптической щели. В нашей лаборатории было установлено, что высокие дозы ацетилхолина (1мМ) угнетают СВТ. Этот эффект ацетилхолина не снимался' ни атропином, ни кальциевыми блокаторами, но парадоксально тормозился ингибиторами ацегилхолинэсгеразы, что позволило об§яснить его взаимодействием ацетилхолина и ацетилхолинэстеразы (Багров, Манусова,19?а; Багров и соавт.,1991). Наличие же ацетилхолинэстеразы в АДГ-чувствительных эпителиях ранее не было установлено. Поэтому была предпринята попытка обнаружения холинэстеразной активности в эпителиях мочевого пузыря и кожи лягушек Rana temporaria. Активность ацетилхолкнэстеразы определялась по методу Эллмана и соавторов (Ellman at al.,1961) в гомогенате исследуемых эпителиев.

Было обнаружено, что оба препарата осуществляют ферментативный гидролиз ацетилхолтиохолина (1 мМ) со скоростью 0.56 i 0.08 и 1.01 ± 0.05 нЫ/мг(белка) в минуту для мочевого пузыря и кожи соответственно, при этом оптимум концентрации ацетилтиохолина находится в диапазоне от 1 до 5 мМ для обоих препаратов эпителия. При более высоких концентрациях ацетилтиохолина наблюдается субстратное торможение. Таким образом, полученные результаты доказывают наличие ацетилхолинестеразы в АДГ-чувствительных эпителиях мочевого пузыря и кожи лягуики Rana temporaria, что является прямым подтверждением возможности ее участия в упомянутой выше холинер-гической регуляции АДГ-зависимого транспорта воды (Багров и соавт, 1991), а также являются косвенным подтверждением возможное™ участия эндогенной холинергической системы в модуляции СВТ. Роль собственной холянергической система в регуляции СВТ. Полученные в предыдущих разделах данные доказывают наличие компокен-

- и -

тов холинерх'ической системы" в эпителии мочевого пузыря: М1 и М2 рецепторов и ацетилхолинэстеразы. В связи с этим возникает вопрос, отражают от эффекты М1, Ш агонистов реальную физиологическую роль М1, М2 холинорецепторов в контроле над СВТ, или это только фармакологические эффекты? Чтобы ответить на этот вопрос, был проведен анализ результатов активации собственной холинерги-ческой системы мочевого пузыря путем угнетения ацетилхолинэстера-зы ее ингибитором физостигмином. Предполагалось,' что торможение ацетшшшшэстераза приведет к накоплению эндогенного ацетилхоли-на и позволит ему проявить свою роль в модуляции гидроосмотического эффекта вазопрессина. Чтобы вычленить роль различных типов М-ХР в модуляции СВТ эндогенным ацетшшшгаом, использовались селективные антагонисты М1 и М2 холинорецепторов: пирензепин (0.1 мкМ) и АР-БХ 116 (0.1 икМ) соответственно. Было обнаружено, что на фоне физостигмина блокада как М1-ХР, так и М2-ХР приводи к увеличению СВТ, что свидетельствует о тормозной роли М1 т М2 холинорецепторов в контроле над СВТ. Однако, увеличения водного транспорта не происходит если перед блокадой М2-рецептор_ов затормозить стаурослорином ПК-С. Более того, в отдельных опытах блокада М2-ХР приводит к торможению водного транспорта (рис.Э). Этот факт свидетельствует о том, что в условиях низкой активности ПК-С •эндогенный ацетилхолии способен стимулировать водный транспорт через М2-ХР.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что гидроосмотический эффект ваэопрессина находится под контролем холинерга-чэской системы. Физиологическая роль эндогенного ацетилхолина заключается в торможении СВТ через Ш и М2 рецепторы и стимуляции СВТ через М2 рецепторы.

Вариабельность гадроосиотического эффокта вазопрассинэ. Давно известно о сезонных изменениях чувствительности эпителия мочевого пузыря амфибий к вазопрессину. Дело в том, что в весенний период гидроосмотический эффект вазопрессина сильно падает, и это сощг возкдается раскрытием плотных контактов. Однако,нет ясности какие именно изменения в системе внутриклеточной передачи сигнала приводят к таким результатам. В процессе работы да обратили внимание, что постоянно происходят изменения в чувствительности эпителия не только к вазопрессину, но также и к используемым нами ингибиторам различных сигнальных молекул.

- 1Б ~

^ обратили внимание на нестабильность действия иэ СВ? к.»-гибктора 4.осС^йОТ£Иь: С неомиилка. Оказалось, что в зклке-во сектой'. паркод, тохмшюо дакствкэ кеошиикг сменяется активируют«'., го есть в ЗЕЛне-весениЕй парад через VI рецепторы осуществляемся торк'.окенкэ гидроосмотнческого эффекте ВГЕ, а в осеше-^етю'Л -стимуляция. Такое изменение действия неошщна сопровождается т: кзмеквнйег,. чувствительное«: СЗТ к ингибитору ПК-С стауроспорику. Оказалось, что в зимкэ-весенний период стауроспорин очень сильно стимулирует СВТ, з то время как в осенне-летний практически но влияет на него (рис. 10). Таим образом, через VI рецептор;: к фэс-фолилазу С осуществляется двоякая регуляция СВТ: торможение через ПК-С и стимуляция, вероятно, через путь инозитолтрифосфат -Саг+ - кальыодулш. Характер модулирующего влияния, осуществляемого через 71 рецепторы, зависит от соотношения активности этих путей. Логично было бы предположить, что должна меняться к чувствительность гидроосмотического эффекта вазопрессина к модулирующим влияниям, которые осуществляются через эти ферменты. И действительно, мы столкнулись с сезонными изменениями чувствительности водного транспорта к модулирующим влияниям холиномиме-тиков. Как видно, из рис.11 стимулирующее действие оксотреморина

200

3 150

&

н к 100

о

к 50

к

V- 0

-50

1

»УАуу&У^ .гттякге *'»»^ ^

10 11 12 1 2 3 4 месяцы Рис.10. Сезонные изменения действия на стимулированный АВП водный транспорт ингибиторов фосфолипазы С (неомицин, 0.5 мМ) и протеинкиназы С (стауроспорин, 15 рМ). контроль: АВП СИЗ стауроспорин + АВП неомицин + АВП

Б

12 1 2 Э

месяц« Рис.11. Сезонные изменения тормозящего и потенцирующего действия оксотреморина на стимулированный АВП водный транспорт.

контроль: АВП

С-ГП оксотреморин (200мкМ)+АВП оксотреморин (5 мкМ)+АВП

- î '5 -

Я&2С0Л80 ярко ифанено п зншее про?«:, когда wptc<r-»H*îo СЕГ nvm-iVA дозвмя оксотреморниа отсутствует 't : :зкслмольпсЛ ¡готовя доо-r m»f ч?зствителы!осг> CET к cTûypocrcpanva отл r.so.-. :aim г.оз-годит чем сформулировать хоцелшга об иемгиоз-и-х г структуре птд-pcccv.oT.viQcxovo ¡>ф№к?я ваоспреосгла. Под структурой гдлеэогаютя-еэпкего ¡хЭДокта ш нанимаем соопсаеяне глстивирукда ч тордозя-ишх ?.:зханизлюз, определяющих ого величину. IÎ тскам фактором относа гея активность аденилатцянлакы, фоссродигсгерзон, протоинташазы С, фосфолипазы С, кальмодулина и т.д.

Обобщая все сказанное od изменениях с структура систеии, перэдакцей сигнал от рецептора к эффектору, следует остановиться на вопросе о еозмо:<коЯ роли этих изменений в холинергаческом контроле над гидроосмотическтод эффектом вазопрэссяна. Как било показано зыше, эндогенная зкмшнергичоская система способна как тору.о-зать (через М1 и М2-ХР), так я стимулировать (через М2-ЗР) СЗТ, чепользул при это?-! всего одга вещество - ацетгихо.тлн, котор' 1 ак-тлиирует одинаково все подтипы ¡¿-X?. Какой г.з этих эффектов проявится зависят, вероятно, от TSKyiKîîx потребностей, з соответствии с которыми ч изменяется структура систем передачи сигнала. Хдет-:са сама готовится к тет.*у , чтобы ответить на ацотилхолин так, как ото необходимо в данный конкретный момент.

ВЫВОДИ

1. Обнаружено, что эпителий мочевого пузыря .1 я гулки Нагл temporarla содераит эндогенную холикергическую систему, в хото-рую входят MI и М2 холинорецепторн и ацетилхолинэстераза.

2. Угнетение ацеталхолинзетераза фазостигмином (1 мсМ), приводящее к накоплению эндогенного ацэтилхолина. позволяет выяеить его (физиологическую роль в контроле над антидауретическим эффектом вазопрессина. На фоне физостигмина М1-антагонист пирензепин (Q.1 мкМ) стимулирует СВТ, а М2 - антагонист AF-DX 116 (0.1 да.«) может как стимулировать, так и тормозить СВТ, что указывает на то, что физиологическая роль эндогенного ацетилхолина заключается в торможении СВТ через Mt и Ш рецептора и стимуляции СВТ через MZ рмепторы.

3. Холинергические вещества через М1 -холгаорецепторы тормозят СВТ. Характер действия М2-холиномимэтика оксотреморина на стимулированный вазопрессином водный транспорт зависит от его концентрации: низкие концентрации оксотреморина (2 - 10 мкМ) тормозят СВТ, в то время как более высокие концентрации оксотреморина (20 - 300 мкМ) стимулируют СВТ. Оба эффекта снимаются М2-антагонистом AÍ-DX 116, то есть осуществляются через М2 холинорецепторы.

Тормозное действие малых доз оксотреморина на СВТ снимается ингибитором фосфолипазы С неомицином (0.5 мМ)'. На фоне ингибиторов протекнкиназы С стауроспорина (Ю нМ) и тирозинкиназы генис-теина (10 MKf.f) то же концентрации оксотреморина становятся стимулирующими. Стимулирующее действие больших доз оксотреморина снимается ингибитором'фосфолипазы С неомицином (0.5 мкМ) и снижается на фоне ингибитора кальмодулина W7 (1 мкМ). В присутствии ингибитора фосфолипазы А2 мепакрина (50 мкМ) те s:e концентрации оксотреморина становятся ингиоирущими.

5. С помощью ингибитора прот&шкиназц С стауроспорина и активатора РИА показано, что влияние протеинкиназы С на антидиуретический эф!ект вазопрессина может быть как угнетающим, так и потенцирующим. Очевидно, з-то определяется различной функцией,протеинкиназы С, связанней с базальной я апикальной мембраной.

в. Ингибитор тирозинкиназы генистёин (10-20 мкМ) оказывает выраженное стимулирующее действие на водный транспорт, вызванный аргинин - вазопрессином (0.5 мкМ), V2 - агонистом десмопрессином (1мкМ), активатором аденилатциклазы форсколином (50 мкМ) и тормозит водный транспорт, стимулированный -8-Ором-цАМФ (100 мкМ). Видимо, тирозинкиназа подавляет эффект АВЛ на этапах передачи сигнала, предшествующих образованию ЦАМФ и потенцирует его на последующи этапах. , • ,

7. Полученные данные свидетельствуют о вовлечении холшергнчес-кой системы б контроль над гидроосмотическим эффектом вазопрессина в мочевом пузыре лягушек Rana temporaria. Активируя Mi и М2 холинорецепторы холгаергическая система способна как тормозить (через фосфолипазу С, протеинкинэзу С, тирозинкинззу), так и стимулировать (через фосфолипазу С, кальмодулин, фосфолипазу А2) СВТ.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БАГРОВ Я.Ю., МАИУСОВА Н.Б. // Бшл.эксперим.Оиол.мед.- Т.86(9).-С.321-327.- 1978. БАГРОВ Я.Ю., МАНУСОВА Н.Б., ОСТРЕЦОВА И.Б.//Цитология.- Т.33(11).

- С. 141 -152,- 1991.

AKIYAMA T..ISHIDA Y., NAKAGAVA A., et al. //J.Biol.Chem.- V.262

(12).- P.5592-5595.-1987. ARRUDA J.A.L., SABATINI S.// Am.J.Physiol.- V.239.-P.P154-159

- 1980.

BENTIEY P.J.// J.Endocrinol.- V.17.- P.201-204.- 1958.

BOER G.Y. // Vasopressin. Prlncples and. properties. Hew York,

1987.- P. 117-174. BONVENTHE J.V.,NEMEN0FF H.//Kidney Int.- V.39.- P.438-449.- 1991. CADENA D.L., GILL G.N. // PASEB J.- V.6(6).- P.2332-2337.- 1992. ELLMN G.L., COURTNEY K.D.. ANDRESS 7., PEATHERSTOHE П.М. // Blo-chem Pharmacol.- 7.180.- P249.- 1961. GUSOVSKY ?., LEUDERS J.E., KOHN E.S., FELDER C.C.//J.Biol.Chem.-7.268.- P.7768-7772.- 1993.

HULME B.C., BIRDSALL N.J.M.. BUCKLEY N.J.// Annu.Rev.Pharroacol. Toxicol.- V.30.-P.633-673.-1990. IYENGAR R.// PASEB J.- V.7.- P.768-775.- 1993. GNEGY M.S. // Annu.Rev.Pharroacol.Toxicol.- 7.32.- P.45-T0.- 1993. HASiro S.K., MASSAHDO S.// J.Menforme Biol.- 7.96.- P. 123-198.1987.

MIA A.J., OAKPORD L.X., DA7IDS0N A.D., YORIO Г.//PASEB J.-V.8(4). -P.A350(abstract 2026).- 1994.

SHLOMTOHFF D./ In Vasopressin, ed.by Schrler R.V. - Raven press, New York: 1985.- P.113-123.

SNYDER H.M., PREDIN D.M.. BREYER M.D.// Am. J.Phyalol.- V.260 (Renal PluldElectrollts Physiol.29).- F.929-P936.- 1991. ¥?ALSH-REIZ М.И., TOBACK F.G. // Amer.J.Phyalol.- 7.245(5)-P.C365-C370.- 1983.

YABDEM Y., ШШСН к JI Ann.Rev.BlOChem.- V.57.- P.443-478.-1988.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ

1. Dmitrleva íí.I., Manusova N.B., Bagrov Y.Y. Eííects oí muscarinic cholinergic system on the arglnlne-vasopresaln stimulated water transport In the urunary bladder or a frog Rana temporaria. // Can. J. Phya. Pham. - 1994,- v.72 (Suppl.1).-Abstr.P19.1T-. p.564.

2. Багров Я.Ю., Дмитриева Н.И., Манусова Н.Б. Влияние мускаривдвых агонистов и антагонистов на стимулированный вазопрессином водный транспорт в мочевом пузыре амфибий. // Бшл. Экспер. Биол. Мед.- 1995.- т. i 20, -с 25Z-

3. Багров Я.Ю., Дмитриева Н.И., Манусова Н.Б. О роли протеинкиназы С и мускариновых холинорецепторов в стимулированном вазопрессином водном транспорте. // Экспер. Клин. Фармакол. -1005.-T.5S<4).-С.33-35=

4. Я.Ю.Багров, Н.И.Дмитриева, Н.Б.Ыанусова. Роль протеинкиназы в стимулированном вазопрессином водном транспорте и его медитации М-холиномиметиками.// Цитология.-т.34.N4.-1995,-0.361-362.

5. Я.Ю.Багров, Н.И.Лмитриева, Н.Б.Манусова. Механизмы вариабельности гидроосмотического эффекта вазопрессина и его фармакологической модуляции.// Тезисы докладов IV Всероссийской конференции "Нейроэндокринология-95".-Н-13 апреля, 1995.-с. 18.

6. Dmitrleva N.I., Manusova N.B., Bagrov Ya.Yu. Water transport In amphibian urinary bladder and Its cholinergic modulation: role oí protelnXlnase С and calmodulin.// International Workshop on Information Processing in Cells and Tissues (IPCAT'95), 6-8 September, 1995, The University of Liverpool.- p.619.

7. Багров Я.Ю., Дмитриева Н.И., Манусова Н.Б. Ингибитор тирозан-киназы генистеин усиливает антидиуретический эффект вазопрессина и его аналогов.//аизиологический журнал - т.82. И 4,- 1996,-

с.70-74