Влияние гуминовых кислот на устойчивость растений и микроорганизмов к воздействию тяжелых металлов

Семенов, Андрей Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние гуминовых кислот на устойчивость растений и микроорганизмов к воздействию тяжелых металлов
ВАК РФ 03.00.27, Почвоведение

Автореферат диссертации по теме "Влияние гуминовых кислот на устойчивость растений и микроорганизмов к воздействию тяжелых металлов"

На правах рукописи

Семенов Андрей Александрович

Влияние гуминовых кислот на устойчивость растений и микроорганизмов к воздействию тяжелых металлов

Специальность 03.00.27 - почвоведение

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003489166

Москва 2009

003489166

Работа выполнена на кафедре химии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Трофимов СЛ.

доктор биологических наук, профессор Чуков С.Н.

доктор биологических наук, Вызов Б.А.

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Почвенный институт им. В.В. Докучаева

Защита диссертации состоится 29 декабря 2009 г. в 12ч. в аудитории 398М н заседании Диссертационного Совета Д 501.001.57 при МГУ имени М.В. Ломоносова

Адрес: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносов факультет почвоведения

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ.

Автореферат разослан «?т» ноября 2009 г.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседаш Диссертационного Совета. Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах просим направля по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ имени М.В.Ломоносов факультет почвоведения.

Ученый секретарь диссертационного совета

Доктор биологически наук, профессор

А.С. Никифорова

Актуальность темы. Биологическая активность гуминовых кислот (ГК) интенсивно изучается в течение длительного времени. Многочисленные исследования позволяют констатировать наличие положительного отклика живых организмов на присутствие малых доз ГК в окружающей среде (Христева, 1951; Кононова, 1963; Александрова, 1972; Орлов, 1993; Горовая и др.1995; Чуков, 2001; Попов, 2004; Куликова, 2008). В отличие от пестицидов и агрохимикатов, гумусовые вещества являются естественными жизненно необходимыми компонентами почвы, выполняющими в ней разнообразные функции (Орлов, 1993). Это сделало их крайне привлекательными для использования в различных отраслях народного хозяйства. Однако такие сложные по химическому строению вещества как ГК не могут не обладать двояким эффектом и оказывают в определенных условиях и негативное воздействие на живые организмы (КиПкоуа е1 а!.,

В настоящее время на рынок поступает большое количество препаратов гуматов, для получения которых используются разные технологии и виды сырья. Ведется активная реклама и пропаганда их использования, однако до настоящего времени остается открытым вопрос о критериях оценки их качества и биологической активности. Использование только физико-химических методов для характеристики не дает комплексную оценку этих сложных объектов. Поэтому в настоящее время остается актуальным вопрос о критериях контроля биологической активности гуматов и разработке методик биологического тестирования препаратов ГК. Вероятно, одним из первых шагов в решении этой проблемы является сравнительное исследование различных коммерческих препаратов гуматов и гуминовых кислот почв в аналогичных экспериментальных условиях, проводимых на одинаковых тест-объектах. Этот подход был использован рядом авторов (Жилин, 1998; Перминова, 2000), и предложен ряд способов оценки детоксицирующих свойств гуминовых веществ по отношению к этотоксикантам. Однако область использования предложенных критериев ограничена, и требуются дальнейшие исследования в этой области.

Настоящая работа посвящена исследованию протекторных свойств гуминовых кислот, выделенных из различных коммерческих образцов гуматов и почв, по отношению к ионам меди и кадмия, ингибирующих рост живых организмов.

Цель работы: исследование способности гуминовых кислот из коммерческих препаратов гуматов и почв снижать токсическое действие ионов меди и кадмия на живые организмы: проростки кресс-салата (Lepidium sativum) и дрожжи (Saccharomyces cerevisiae).

1. Исследовать химический состав и свойства гуминовых кислот, выделенных из коммерческих препаратов гуматов и почв.

2. Изучить реакции комплексообразования гуминовых веществ с ионами меди и кадмия.

3. Исследовать биологическое действие гуминовых кислот на тест-культуры: проростки кресс-салата (Lepidium sativum) и дрожжи (Saccharomyces cerevisiae).

4. Исследовать действие ионов меди и кадмия на проростки кресс-салата (Lepidium sativum) и дрожжи (Saccharomyces cerevisiae).

5. Оценить эффективность протекторного действия гуминовых кислот на проростки кресс-салата (Lepidium sativum) и дрожжи (Saccharomyces cerevisiae), подвергнутые воздействию ионов меди и кадмия.

2005).

Задачи:

Научная новизна работы. Исследована взаимосвязь химического состава гуминовых препаратов, выделенных из различных источников, с их биологическим действием и детоксицирующей способностью на тест-культуры: проростки кресс-салата (Lepidium sativum) и дрожжи (Saccharomyces cerevisiae), подвергнутые действию ионов меди и кадмия. Исследование протекторных свойств гуминовых кислот показало, что ГК, имеющие более высокие показатели максимальной емкости связывания металлов и стимулирующего действия, обладают более эффективными детоксицирующими свойствами. Эти свойства ГК проявляются в тех случаях, когда в комплексы с ГК связываются более 20% свободных ионов металла от исходного содержания в растворе.

Практическая значимость работы. Полученные данные можно использовать для увеличения эффективности применения различных типов гуминовых препаратов в промышленном и декоративном растениеводстве, биотехнологических процессах, рекультивации сельскохозяйственных земель и городских территорий, загрязненных тяжелыми металлами, а также для разработки систем контроля и мониторинга качества коммерческих гуминовых препаратов.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2009», на заседаниях кафедры химии почв.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы, в том числе 1 в реферируемом журнале ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, глав, выводов, списка литературы и приложений. Материалы диссертации изложены на страницах текста, содержат рисунков, таблиц. Список литературы включает

источника, в том числе на иностранном языке.

Автор выражает благодарность за помощь и поддержку сотруднику Института экологического почвоведения МГУ к.б.н. В.В.Демину, а также сотрудникам кафедры химии почв ф-та почвоведения МГУ д.б.н. Т.А. Соколовой, , к.б.н. Ю.А. Завгородней, к.б.н. М.С. Розановой, а также аспирантам кафедры биологии почв A.B. Якушеву и В.В. Тихонову.

1. Объекты и методы исследования

1.1. Выделение и характеристика гуминовых кислот и препаратов гуматов

В экспериментах были использованы широко применяемые в сельскохозяйственной практике и биотехнологических процессах коммерческие препараты гуматов, полученные из бурого угля, и гуминовые кислоты:

• препарат из выветрелого угля, коммерческое название «гумат натрия» (ТУ 2189-001-58758374-05)-(У)

• препарат из сильновыветрелого каменного угля Канско-Ачинского угольного бассейна (ТУ 211-06-18-94) - (VAT)

• препарат из леонардита, коммерческое название «POWHUMUS» - (POW)

• препарат из выветрелого угля, коммерческое название «Гумат-70» (2189-004417646443-98) - (70)

• гуминовая кислота из горизонта А] чернозема обыкновенного (200-летняя некосимая залежь, Каменная степь, Таловский р-н, Воронежская обл.) - (ГКЧ)

• гуминовая кислота из торфа (препарат фирмы Merck) - (ГКТ)

• гуминовая кислота из препарата «гумат натрия» - (ГКУ)

• гуминовая кислота из препарата «VAT» - (ГКУAT)

• гуминовая кислота из препарата «POWHUMUS» - (TKPOW)

• гуминовая кислота из препарата «Гумат-70» - (ГК70)

Гуминовые кислоты из почв были выделены по стандартной методике и очищены от органо-минеральных примесей высаливанием и переосаждением (Орлов, Гришина, 1981).

Промышленные образцы гуматов растворяли в дистиллированной воде, гуминовые кислоты осаждали соляной кислотой при pH 2, затем растворяли в 0,1N NaOH и дополнительно очищали от органо-минеральных примесей высаливанием и переосаждением (Орлов, Гришина 1981).

Элементный состав выделенных препаратов был определен на CHNS-анализаторе Vario EL III (Elementar) (t=1150°C). Содержание золы определялось методом ручного сжигания в атмосфере кислорода при (t=850°C) в течение 5 часов. Содержание элементов пересчитывали на беззольную навеску и выражали в массовых и атомных процентах.

Электронные спектры поглощения растворов гуминовых веществ были исследованы при pH 11-12 на спектрофотометре SPECORD 50 (Analitik Jena) в диапазоне длин волн 250-700 нм. Коэффициенты экстинкции (Е465°00'%С) определяли при длине волны 465 нм. Значения оптической плотности при 465 нм и при 650 нм использовались для определения коэффициентов цветности (Е4/Е6) (Орлов, Гришина 1981).

Инфракрасные спектры препаратов гуминовых кислот в диапазоне 4000 - 400 см"' были получены с применением KBr-техники (Орлов, Гришина, 1981) на FTIR-спектрометре спектрофотометре Tenzor 27 (Bruker).

Молекулярно-массовые распределения гуминовых веществ были получены методом ВЭЖХ на хроматографе Agilent 1100 (Agilent Technologies) с диодноматричным детектором. Колонка TSK 2000SW (600*7,5мм) (Tosoh Bioscience), элюент - 0,1 М Na-

фосфатный буфер (рН 7) + 0,1% ДДС-Na, длина волны детектирования - 280 и 465 нм. Все образцы предварительно пропускали через колонку с гелем Sephadex G-10 для очистки от низкомолекулярных примесей (с ММ<700) и перевода пробы в рабочий элюент. Молекулярные массы фракций рассчитывали по формуле Детермана для глобулярных белков (Детерман, 1970). Также были получены молекулярно-массовые распределения: среднечисловая молекулярная масса Мп, средневесовая молекулярная масса Mw и их отношение Mn/Mw, представляющее степень дисперсности биополимеров.

Содержание функциональных групп и константы их диссоциации во всех препаратах определяли методом потенциометрического титрования на рН-метре F-16 (Horiba) при 25 ± 0Д°С в атмосфере N2. Концентрация препаратов была равна 0,5 мг/мл, ионная сила 0,1 (Заварзина, Демин, 1999).

1.2. Исследование взаимодействия ионов металлов с гуминовымн веществами

Потенциометрическое титрование с использованием ион-селективных электродов. Связывание ионов меди Си2+ и кадмия Cd2+ гуминовыми кислотами изучали при значениях рН раствора 6,0 и 4,0. Препараты гуминовых кислот и гуматов (15 мг для растворов с рН 6,0 и 25 мг для растворов с рН 4,0) растворяли в 75 мл 0,01М NaOH, затем раствор доводили до нужного значения рН 0,1М HNO3 и конечного объема 100 мл бидистиллированной водой. Полученный раствор продували азотом и оставляли на сутки для полного растворения препарата. Титрант, содержащий Си2+-ионы, готовили из стандартного раствора 0,1М Cu(N03)2, а содержащий Cd2+-HOHbi из стандартного раствора 0,1М Cd(N03)2.

Приготовленные растворы с заданным значением рН 4 и рН 6 вносили в термостатируемую (t = 25°С) ячейку объемом 150 мл и добавляли 2 мл стандартного ионного буфера (5М NaN03, I.S.A. Orion 94001). Титрование ионов меди и кадмия проводили на иономере pH/ISE model 710 (Thermo Orion) с помощью электродов Orion 94-29 Cupric Half-Cell Electrode (Thermo Orion) и Orion 94-48 Cadmium Half-Cell Electrode (Thermo Orion), в качестве электрода сравнения использовали Orion 90-02 Double Junction Reference electrode (Thermo Orion) с внешним электролитом 10% KN03. Титрование проходило в атмосфере N2.

Каждый раз перед титрованием проводили калибровку иономера по стандартным растворам Cu(N03)2 и Cd(N03)2. В ходе титрования в анализируемый раствор последовательно добавляли аликвоты титранта (100 мкл 0,01М Cu(N03)2 или Cd(N03)2). После каждого внесения аликвоты титранта раствор перемешивали в течение 15-20 минут до достижения равновесия, измеряли значение потенциала (mV). Концентрацию свободных ионов металла определяли по калибровочному графику. В ходе титрования исходные значения рН раствора изменялись в пределах ± 0.1 единиц, поэтому специальных мер для стабилизации рН не применялось.

Определение констант устойчивости и максимальной емкости связывани: гуминовых кислот с ионам CuJ+ и Cd2+.

Для расчетов констант устойчивости соединений гуминовых кислот с ионами Си2 и Cd2+ и определения величины связывания металла ГК использовалась модел

образования комплекса, в котором роль центрального иона играет анион гуминовой кислоты (А), а катион Си2+ или Cd2+(M):

А+ M <->АМ А+2М<-*АМ2 А+пМ *-+АМп

Для расчета констант устойчивости гуминовых кислот и максимальной емкости связывания были использованы графические методы: двойная изотерма Ленгмюра и метод Скэтчарда (Fitch & Stevenson, 1985). 1.3. Биотестированне гуминовых кислот

1.3.1. Эксперименты на культуре клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Гуминовые кислоты и металлы

Концентрации гуминовых кислот, на которых изучалось биологическое действие на клетки дрожжей, составили 1, 5, 10, 50 мг ГК/л питательной среды. Токсическое действие ионов меди и кадмия на клетки дрожжей изучалось при концентрациях 0,1,1, 5, 10 мг/л металла в питательной среде. Перед использованием исходные растворы, содержащие гуминовые кислоты и ионы металлов, стерилизовались фильтрованием через бактериальный мембранный фильтр (0,22 мкм).

Выращивание клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae штамм КБП-3832 проводили в пенициллиновых флаконах на качалке при 180 об./мин, t=28°C в течение суток до концентрации «107 клеток/мл. Использовали жидкую питательную среду Чапека-Докса: D-глюкоза - 10,0 г, гидролизат казеина 0,2 г, КН2Р04- 0,7 г, MgS04*7H20 - 0,5 г, NaN03 - 2,0 г, КС1 - 0,3 г, Н20 диет. - 1 л. (рН=6). В предварительных экспериментах было установлено, что Cu(II) и Cd(II) в использованной питательной среде находятся (>90%) в виде свободных ионов.

По достижении заданной концентрации («107) суспензия клеток (10 мкл) вносилась в ячейки микропланшета, содержащего ту же питательную среду (150 мкл). В контрольном варианте 40 мкл занимала вода, в варианте с ГК - 20 мкл исходного раствора ГК и 20 мкл вода, в варианте с металлами - 20 мкл исходного раствора ионов металла и 20 мкл вода, в варианте с металлами и ГК - 20 мкл исходного раствора ионов металла и 20 мкл исходного раствора ГК. Суммарный объем ячейки микропланшета в итоге составлял 200 мкл. Исследование роста S. cerevisiae проводили на микропланшетном (96 ячеек) спектрофотометре Sunrise (Тесап) при длине волны 620 нм. Время каждого эксперимента составляло 96 часов, повторность шестикратная.

Чтобы учесть поглощение гуминовой кислоты и остальных компонентов среды, значение первой отснятой точки вычиталось из всех последующих. Поэтому кривая роста оптической плотности начиналась из нулевого значения и представляла собой изменение плотности дрожжей.

Количество клеток в суспензии определялось по калибровочному графику, предварительно построенному в координатах количество клеток (подсчет в камере Горяева)/мл vs. D62o„„. Для оценки значимости различий между полученными данными проводилась статистическая обработка.

1.3.2. Схема эксперимента на семенах кресс-салата Lepidium sativum сорта "Дукат"

Биологическое действие и детоксицирующую способность препаратов ГК по отношению к ионам меди и кадмия оценивали с помощью биотестирования по методу

проростков. Тест-культурой служили семена кресс-салата Lepidium sativum сорта "Дукат". Измеряли сухую биомассу побегов и корней проростков. Продолжительность эксперимента 96 часов, температура проращивания семян 25°С, pH растворов «6, повторность трехкратная.

В начале микровегетационного опыта на дно чашки Петри укладывали 2 листа фильтровальной бумаги, на которые помещали 15 семян. Затем добавляли 5 мл вегетационного раствора, содержащего 100 мг/л KN03 в качестве питательного компонента и в зависимости от эксперимента различные концентрации меди, кадмия и гуминовых кислот. После окончания проращивания (96 ч) проростки извлекали из чашки Петри и переносили в стеклянные пробирки, их помещали в термостат для высушивания (t=105°C) и доводили до постоянной массы.

Концентрация гуминовых кислот, на которых изучалось биологическое действие на клетки дрожжей, составила 5, 10, 50 мг ГК/л питательной среды. Концентрация гуминовых кислот, на которых изучалась способность гуминовых кислот к детоксикации по отношению к ионам меди и кадмия, составили 5 и 10 мг ГК/л питательной среды. Токсическое действие ионов меди и кадмия на проростки салата изучалось при концентрации 5 мг/л металла в питательной среде.

2. Результаты и обсуждение 2.1. Элементный состав гуминовых веществ

После очистки было получено около 5 г каждого препарата с содержанием золы 26%. Содержание элементов после проведения анализа пересчитывали на беззольную навеску и выражали в массовых и атомных процентах (табл. 1-2). Результаты элементного анализа почвенных гуминовых кислот в основном согласуются с приводимыми в литературе (Орлов, 1990; Schnitzer, 1978; Stevenson, 1982; Rice, McCarthy, 1991). Невысокие значения отношения Н:С (0,8-1,1) указывают на преобладание в составе всех ГК ароматических структур.

Гуминовые кислоты из торфа и угля отличаются от почвенных низким содержанием азота, а ГК угля также и высокой степенью окисленности. Малое содержание азота (1-2%) является характерной особенностью гуминовых кислот, выделяемых из торфов и углей (Драгунов, 1959; Кухаренко, 1959; Лебедев, 1959; Бамбалов, Лукошко, 1988; Жмакова и др., 1993; Покуль и др., 1993), по этому показателю Д.С.Орлов с соавт. (Орлов и др., 1993) считает возможным выделять их в особую группу гуминовых веществ. Высокое содержание кислорода также типично для гуминовых кислот бурых углей (Григорьева, Караваев, 1969; Мотовилова, Хренкова, 1988; Аляутдинова и др., 1991; Орлов и др., 1993).

Таблица 1. Элементный состав гуминовых кислот масс.%

Препарат Зола,% С H N О

гкч 6,2 55,9 3,9 5,1 35,1

гкт 1,9 51,2 4,8 2,8 41,2

ГКУ 3,8 55,8 3,3 1,8 39,1

PKVAT 2,5 55,2 3,6 1,1 40,0

PKPOW 2,7 46,5 3,0 1,2 49,3

ГК70 5,4 55,8 4,0 1,4 38,9

У 27,2 46,6 4,2 1,3 48,0

VAT 26 47,6 4,3 0,9 47,2

POW 26,8 51,5 4,2 1,5 42,8

70 23,9 52,7 3,8 1,1 42,4

Таблица 2. Элементный состав гуминовых кислот от. %

Препарат С II N О Н:С о.с C.N Степень окислешюсти, w

гкч 41,8 35,3 3,2 19,7 0,8 0,5 13,1 0,1

гкт 35,9 40,7 1,7 21,7 1,1 0,6 21,1 0,1

ГКУ 44,1 31,5 1,2 23,2 0,7 0,5 36,9 0,3

ГКУАТ 42,7 33,3 0,7 23,2 0,8 0,5 57,2 0,3

TKPOW 38,7 29,7 0,9 30,7 0,8 0,8 44,0 0,8

ГК70 41,6 35,8 0,9 21,7 0,9 0,5 47,5 0,2

У 34,7 37,6 0,8 26,9 1,1 0,8 42,7 0,5

VAT 35,2 38,0 0,6 26,2 1,1 0,7 63,0 0,4

POW 38,1 37,2 1,0 23,8 1,0 0,6 39,5 0,3

70 40,0 35,1 0,7 24,2 0,9 0,6 55,1 0,3

2.2. Электронные спектры поглощения гуминовых веществ

Высокую оптическую плотность (0,13-0,18) имеют очищенные ГК из углей (табл.3), что хорошо согласуется с высоким содержанием кислорода в их составе. Электронные спектры поглощения гуминовых кислот имеют пологий характер, оптическая плотность монотонно возрастает с уменьшением длины волны. Для гуминовых кислот углей отмечено нарастание оптической плотности при увеличении содержания в них кислорода (Кухаренко и др., 1967; Кухаренко, Екатеринина, 1968). Также это можно объяснить наличием в молекуле большого количества сопряженных двойных связей.

Таблица З.Оптические свойства гуминовых кислот

Препарат Е4/Е6 Е465-0.001%С

ГКЧ 5,0 0,09

гкт 8,8 0,05

ГКУ 7,7 0,11

ГКУАТ 5,9 0,14

ПСРОШ 6,3 0,15

ГК70 6,4 0,13

У 5,9 0,11

VAT 5,0 0,13

POW 8,0 0,09

70 6Д 0,09

2.3. Инфракрасные спектры гуминовых кислот

Вид ИК-спектров всех препаратов однотипен и содержит характерные для гуминовых кислот полосы поглощения (рис.1). Очень широкая и хорошо выраженная полоса при 3390 см"1, обусловленная валентными колебаниями

гидроксильных групп, имеет примерно одинаковую интенсивность для всех препаратов. Полосы поглощения при 2920 и 2860 см'1 связанны с валентными колебаниями СН2-, СНггрупп.

Рис. 1. ИК-спектры гуминовых веществ.

Полоса при 1710 см"1, которую для гуминовых кислот и относят к группам СООН (Лях, 1981; Орлов, Осипова, 1988), присутствует на спектрах всех очищенных препаратов (ГKЧ-ГKT-ГKУ-ГKVAT-ГKPOW-ГK70).

Сильная полоса при 1610 см"1, вызываемая колебаниями ароматических С=С связей, возможно, сопряженных с карбонильными группами, видна на всех спектрах ГК из чернозема, угля и торфа, что хорошо коррелирует с высокими значениями их Е-величин (0,13-0,18) и элементным составом, указывающим на преобладание

ароматических фрагментов в составе препаратов. Напротив, для ГКТ со значением Е-величины (0,05), полоса при 1610 см"1 выражена слабо.

Низкое содержание азота (0,5-1,5%), характерное для гуминовых кислот, выделяемых из углей, хорошо коррелирует с отсутствием на ИК-спектре ГК полосы поглощения при 1530 см'1 и 1650см'1 (амидные связи).

Спектры ГК чернозема и торфа, с содержанием азота 5% и 2,8%, соответственно, отличаются от спектров препаратов из угля наличием полосы поглощения при 1530 см'1, обусловленной присутствием амида II, кроме того, наблюдается слабое поглощение амида I при 1650 см"1, что коррелирует с высоким содержанием азота в составе препаратов ГКЧ и ГКТ. (Малама с соавт. 1975) считают, что зависимость между интенсивностью этих полос и содержанием азота может быть доказательством принадлежности, по крайней мере, части азота к аминокислотным радикалам.

На спектрах всех очищенных препаратов, (ГКЧ-ГКТ-ГКУ-ГКУАТ-ГКР(Ж-ГК70) присутствует слабая широкая полоса при 1200-1260 см"1. Для гуминовых кислот ее относят к деформационным колебаниям С=0 и 0=Н в карбоксилах (Запрометова и др., 1971; Орлов, Осипова, 1988). Полосы поглощения при 1440 и 1380 см"1, рассматриваемые, как правило, как доказательство присутствия метальных групп, имеют приблизительно равную интенсивность для всех препаратов, только для ГК из углей они выражены немного слабее. Отсутствие сильного поглощения в области 1050-1080 см"1, вызываемого наличием полисахаридов, указывает на невысокое содержание этих компонентов в составе препаратов.

2.4. Молекулярно-массовые распределения гуминовых кислот

Величины молекулярных масс в составе препаратов приведены в таблице 4.

Таблица 4. Молекулярно-массовые распределения ГКи препаратов

Препарат Мп, среднечисловаи ММ, кДа М», сред невесовая ММ, КДа Ми/Мп, степень дисперсности

ГКЧ 9 23 2,6

ГКТ 10 27 2,7

ГКУ 4 15 3,8

ГКУАТ 4 11 2,8

ГКРО\У 4 12 3,0

ГК70 4 11 2,8

У 5 15 3,0

УАТ 4 11 2,8

РО\У 4 16 4,0

70 5 16 3,2

В составе гуминовых кислот из углей преобладает фракция со средневесовой ММ в диапазоне 11-15 кДа. Величина ММ нарастает в ряду ГКУАТ-ГК70 - ГКРО\У-ГКУ. В такой же последовательности увеличиваются Е-величины ГК. Возрастание молярных коэффициентов погашения при уменьшении молекулярного веса гуминовых кислот почв (г = -0,9) (Орлов, 1974) связывает с уменьшением доли слабоокрашенных

периферических звеньев в молекулах ГК. На наличие обратной корреляции между

значениями Е-величины и молекулярным весом гуминовых кислот указывают (Butler and Ladd, 1969) и (Chen et al., 1977).

2.5. Кислотно-основные свойства и содержание функциональных групп гуминовых кислот

Как видно из табл. 5, для очищенных гуминовых кислот наименьшая общая кислотность и минимальное содержание карбоксильных групп оказались в препарате из торфа ГКТ 529 и 269 (ммоль(-)/100 г ГК) и в препарате из угля ГКУ 593 и 273 (ммоль(-)/100 г ГК). Остальные гуминовые кислоты ГКЧ, ГКУ AT, TKPOW и ГК70 характеризовались сходными значениями общей кислотности 600-700 (ммоль(-)/100г ГК) и содержанием СООН-групп 300 (ммоль(-)/100 г ГК). Максимальные значения общей и карбоксильной кислотности были у ГК70 из бурого угля 696 и 362 (ммоль(-)/100 г ГК), соответственно. Для исходных коммерческих препаратов гуматов наименьшая общая кислотность и минимальное содержание карбоксильных групп оказалось в препарате из леонардита POW 496 и 260(ммоль(-)/100г ГК). Остальные препараты У, VAT, 70 характеризовались сходными значениями общей кислотности 600-700 (ммоль(-)/100 г ГК) и содержанием СООН-групп -300 (ммоль(-)/100 г ГК). Максимальные значения общей и карбоксильной кислотности были у препарата VAT из бурого угля -702 и 338 (ммоль(-)/100 г ГК). Как следует из представленных данных, отчетливой взаимосвязи между общей кислотностью препаратов и источником их происхождения не наблюдалось. Константы диссоциации гуминовых кислот и препаратов (рКа) в целом сходны между собой и находятся в пределах 4,4-4,7; 6,5-6,6; 9,2-9,8.

Таблица 5. Содержание функциональных групп в гуминовых кислотах

Препарат Содержание функциональных групп (ммоль(-)/100 г ГК) Константы диссоциации

рКа

общее Карбоксильные СООН Фенольные Аг-ОН 1 2 3

ГКЧ 611 311 300 4,7 6,5 9,8

ГКТ 529 269 260 4,6 6,5 9,2

ГКУ 593 273 320 4,5 6,4 9,7

ГКУАТ 633 304 329 4,6 6,5 9,7

TKPOW 673 313 360 4,5 6,5 9,7

ГК70 696 362 333 4,5 6,6 9,5

У 593 293 300 4,6 6,6 9,8

VAT 702 338 364 4,6 6,6 9,6

POW 496 260 236 4,5 6,5 9,5

70 700 330 370 4,4 6,5 9,7

2.6. Величины констант устойчивости и максимальной емкости связывания гуминовых кислот с ионам Си2+и Cd2+

В таблицах 6 и 7 приведены данные по комплексообразованию (при рН=6,0 и рН=4,0) ионов меди и кадмия с участием двух типов активных центров исследуемых гуминовых кислот и препаратов гуматов.

Таблица 6. Максимальная емкость связывания и константы устойчивости гуминовых кислот с ионами меди Си2*.

Лигаид лН6 pH4

Lo gK MEC* мг(Си2+)/г(ГК) Lo MEC* мг(Си2+)/г(ГК)

LogKl LogKl Tlinl тип2 LogKl LogKl iinil Tiiri2

ГКЧ 5,1 3,1 14 57 3,2 2,0 7 10

ГКТ 4,3 2,3 15 58 2,0 1,7 5 2

ГКУ 5,1 3,1 16 49 3,8 1,6 8 28

ГКУАТ 5,3 2,4 14 56 3,9 1,8 7 21

TKPOYV 5,7 2,5 13 108 3,7 1,9 8 21

ГК70 4,7 3,0 17 86 3,4 2,1 7 11

У 4,3 2,5 14 35 2,5 1,8 5 3

VAT 4,6 3,0 16 84 2,7 1,7 11 16

POW 4,0 2,8 18 77 2,9 1,5 8 10

70 3,2 2,2 15 85 2,8 2,0 9 8

МЕС* - максимальная емкость связывания

Таблица 7. Максимальная емкость связывания и константы устойчивости гуминовых кислот с ионами кадмия

Лигаид [)Н6 рН4

LogK МЕС* Mr(Cd2+)/r(rK) LogK МЕС* мг(Сс12+)/г(ГК)

LogKl LogKl Tlllll тнп2 LogKl LogK2 Tlllll тип2

ГКЧ 2,3 1,7 29 62 - - - -

ГКТ 1,7 1,1 20 22 - - - -

ГКУ 2,5 1,8 22 22 - - - -

ГКУАТ 2,9 1,8 27 58 - - - -

TKPOW 2,5 1,7 27 48 - - - -

ГК70 2,5 1,6 28 48 - - - -

У 2,5 1,8 23 44 - - - -

VAT 2,3 1,6 28 52 - - - -

POVV 2,3 1,2 20 46 - - - -

70 2,5 1,3 L 18 58 - - - -

МЕС* - максимальная емкость связывания * - связывание не происходит

При анализе данных видно, что величины констант устойчивости при рН=6 гуминовых веществ с медью {LogKl"5 LogKl ~Ъ) примерно в 2 раза выше аналогичных величин для кадмия (LogKlx3 LogK2^ 1,7) для обоих типов активных центров. Эти результаты хорошо согласуются с литературными данными Cu»Cd (рН=4 - 6) (Stevenson, 1977).

Величины максимальной емкости связывания при рН=6 гуминовых веществ с медью на первом типе активных центров (13-18 мг(Си2+)/г (ГК)) примерно в 1,5 раза ниже аналогичных величин с кадмием (20-28 мг(Си2+'/г(ГК)). Для второго типа активных центров при (рН=6) величины максимальной емкости связывания с медью имеют близкие значения аналогичных величин с кадмием в вариантах ГКЧ, ГКУАТ, в остальных вариантах эти значения примерно в 2 раза выше.

При снижении значений рН 6 до 4 в вариантах с медью также снижаются величины констант устойчивости на обоих типах активных центров в среднем в 1,5-2 раза, а

максимальная емкость связывания примерно в 2 раза меньше для активных центров первого типа и до 8 раз для активных центров второго типа. Этот эффект может быть вызван протеканием конкурирующих реакций, обусловленных протонированием свободных карбоксильных группировок СОО" + Н+ —» СООН. В вариантах с кадмием снижение уровня рН до 4 привело к невозможности определения констант устойчивости и емкости связывания данным методом (кривые на графиках имели выпуклость). По всей видимости, это может быть обусловлено очень низкими значениями этих величин при заданном низком значении (рН=4), при котором большая часть карбоксильных группировок находится в протонированном состоянии.

В итоге основные выводы по результатам исследования металл-гумусовых взаимодействий можно сформулировать следующим образом: исследованные препараты могут связывать в среднем 50-100 мг (Ме2+)/г ГК, константы устойчивости гуминовых веществ с медью выше чем с кадмием.

2.7. Биотестирование гуминовых кислот

2.7.1. Биологическое действие ГК на дрожжи Saccharomyces cerevisiae

Для культивирования клеток дрожжей мы использовали стандартную, сбалансированную по микроэлементам и насыщенную питательными веществами питательную среду с единственным источником углерода - глюкозой. Биологическое действие гуминовых кислот на клетки дрожжей изучалось в диапазоне концентраций 15-10-50 мг/мл ГК. Для оценки биологического действия ГК на клетки дрожжей были использованы параметры итоговой численности клеток после инкубации (96ч) и времени их удвоения на экспонициальной фазе роста. Последний параметр можно рассматривать как вспомогательный, т.к. его значение сильно зависит от количества точек на кривой роста культуры принятых в расчет.

Численность клеток дрожжей при росте на среде с ГК приведена на рис. 2. Оптимум биологического действия, при котором происходит стимуляция роста популяции, находится при 5 мг ГК/л. При 1 мг ГК/л значимой разницы между вариантами с ГК и контролем не наблюдается. При увеличении концентрации до 10 мг ГК/л эффект стимуляции снижается, а при концентрации 50 мг ГК/л проявляется ингибирующее действие.

Рис. 2. Численность клеток дрожжей Засскаготусея сегем1я1ае после инкубации (96 ч) на среде, содержащей гуминовые кислоты.

Можно отметить, что численность клеток при концентрациях ГК 1, 10 мг ГК/л близки к контрольным, а при концентрации 5 мг ГК/л стимулирующий эффект меняется в ряду ГКТ>ГКЧ>ГКУ>ГК70>ГКУАТ>ГКР(Ж.

Т,час

□ 1 мг ГК/л □ 5 мг ГК/л □ 10 мг ГК/л В 50 мг ГК/л

Контроль ГКЧ ГКТ ГКУ ГКУАТ ГКРСОТ ГК70

Рис. 3. Времена удвоения клеток дрожжей 8асс1гаготусе$ cerevisiae на среде, содержащей гуминовые кислоты.

Значения времен удвоения числа клеток дрожжей в данном эксперименте хорошо согласуются с величиной по итоговой численности клеток. ГК в концентрации 50мг ГК/л достоверно вызывают примерно двукратное замедление времени удвоения, а в концентрации 5 мг ГК/л, наоборот, способствует ускоренному росту числа клеток. Для этих концентраций ГК наблюдается хорошая обратная корелляция между значениями Т и N (Я = - 0,8). культуры.

Результаты корелляционного анализа показали, что значения итоговой численности клеток после инкубации с ГК (5 мг ГК/л), когда наблюдается достоверный стимулирующий эффект, имеют тесную связь со значениями С/Ы (Я = -0,83), общей кислотностью (Я = -0,83), оптической плотности Е4650001%с (II = -0,91) и среднечисловой ММ М\у(Я = 0,86).

По данным этих экспериментов были выбраны концентрации гуминовых кислот для исследования детоксицирующего действия: 5 и 10 мг ГК/л. Гуминовые кислоты, присутствующие в среде в этих количествах, с одной стороны, проявляют заметную положительную биологическую активность (5 мг ГК/л), а с другой - могут значимо снижать токсичные концентрации ионов Си2+ и Сё2+в среде (10 мг ГК/л).

2.7.2. Детоксицирующие действие гуминовых кислот по отношению к ионам кадмия Сс1 (ГГ).

Начиная с концентрации 0,1 мг СсГ/мл, проявляется ингибирующее действие на рост клеток дрожжей. Сравнение контрольных вариантов с вариантами, в которых присутствуют ГК и токсикант по критерию НСР (наименьшая существенная разность) показало, что во всех случаях между ними наблюдаются достоверные различия.

5 мг ГК/л ГКЧ ГКТ ГКУ ГКУАТ ГКРОУ/ ГК70

/?-уровень 0,001 \1кооГ 0,000 0,522 0,370 0,092

10 мг ГК/л ГКЧ ГКТ ГКУ ГКУАТ ГКРОШ ГК70

Рис. 4. Численность клеток дрожжей 5асс/1аготусе5 сегеу1Я1ае после инкубации (96 ч) на среде, содержащей гуминовые кислоты (5 и ¡0 мг/л) и ионы кадмия (Сс?*) (0,1 мг/л). В таблице цветом отмечены разности (I-критерий) между вариантами с различным содержанием ГК в среде, значимые на уровне р< 0,05 (п=б).

На рис. 4. видно, что при концентрациях ГК 5 и 10 мг/л токсицирующее действие кадмия полностью снимается, при этом количество клеток в вариантах «ГК+металл» превышает значение контроля. Наибольшее количество клеток после инкубации наблюдается при концентрации ГК 5 мг/л для препаратов ГКТ-ГКЧ-ГКУ, для вариантов ГКТО-ГКУАТ-ГКРСЖ разница с 10 мг ГК/л недостоверна. Можно предположить, что при низкой концентрации металла определяющее значение имеет стимулирующий эффект гуминовых кислот. Для количественной оценки детоксицирующего действия гуминовых веществ рассчитывали коэффициент детоксикации О (Жилин, 1998):

В= и^-к^у^о- Я,)

Где Ло - тест-отклик в контроле, Л, -.тест отклик в присутствии токсиканта, 1^+1 -тест отклик при совместном присутствии токсиканта и детоксиканта. Тест откликом (Я) служила итоговая численность клеток дрожжей (N1*106 кл/мл) после инкубации (96 ч).

" □ 5мг ГК/л + са 0,1 мг/л

О 10мг ГК/л + С<1 0,1 мг/л

о -——-,-—£—-,----,----,----1----,

ГКЧ ГКТ ГКУ ГЮ/АТ ГКРОУУ ГК70

Рис 5. Детоксицирующий эффект гуминовых кислот на клетки дрожжей, подверженных воздействию ионов кадмия (Сс/2* 0.1 мг/л).

Значения коэффициента детоксикации полностью согласуются с полученными данными по численности клеток. Высокие значения (>[) при данных условиях можно объяснить относительно невысокой токсичностью кадмия (небольшая разница с контролем), которая в совокупности со стимулирующим действием ГК, способствует увеличению клеток в варианте «металл+ГК» с превышением значения в контроле.

N'10 кл/мл

□ 5мг ГК/л * Сй 1 мг/л

□ 10мг ГК/л + Сс1 1 мг/л

гЬп

Г*1 гЬ

Контроль Сс11 мг/л

ГКУ ГЮ/АТ ПСРОИ/ ГК70

5 мг ГК/л ГКЧ ГКТ ГКУ ГКУАТ ПСРОШ ГК70

/7-уровень 0,000 0,000 0,000 0,757 0,003 0,002

10 мг ГК/л ГКЧ гкт ГКУ ГКУАТ ПСРО\¥ ГК70

Рис. 6. Численность клеток дрожжей ЗассИаготусез сеге\>!$1ае после инкубации (96 ч) на среде, содержащей гуминовые кислоты (5 и 10 мг/л) и ионы кадмия (С<£*) (1 мг/л). В таблице цветом отмечены разности (I-критерий) между вариантами с различным содержанием ГК в среде, значимые на уровне р < 0,05 (п=6).

0 о 5мг гк/л + са 1 мг/л

0,81 □ 10мг ГК/л *СЛ 1 мг/л

0,4

О ----1----1----.----,----1----1

ГКЧ ГКТ ГКУ ГЮ/АТ ГКРО\П/ ГК70

Рис. 7. Детоксицирующий эффект гуминовых кислот на клетки дрожжей, подверженных воздействию ионов кадмия (СсI2 I мг/л).

На рис. 6-7. видно, что при концентрациях ГК 5 и 10 мг/л токсицирующее действие кадмия уменьшается в ~2 раза в варианте «металл+ГК», при этом количество клеток меньше чем в контроле. Наибольшее количество клеток вместе со значениями коэффициента детоксикации наблюдается при концентрации 10 мг ГК/л для препаратов ГКТ-ГКЧ-ГКУ-ГК70-ГКР(Ж, для варианта ГКУАТ разница 5 и 10 мг ГК/л недостоверна. Можно предположить, что при увеличении концентрации металла

решающей становится способность ГК к связыванию металла в нетоксичный комплекс, а , стимулирующий эффект гуминовых кислот уходит на второй план.

N*10 кл/мл

D 5мг ГК/л + Cd 5 мг/л □ 10мг ГК/л + Cd 5 мг/л

rfn

Контроль Cd 5 мг/л

5 мг ГК/л ГКЧ ГКТ ГКУ TKV AT TKPOW ГК70

уровень 0,000 0,000 0,003 0,000 0,000 Гöjöo

10мг ГК/л ГКЧ ГКТ ГКУ ГКУ AT TKPOW ГК70

0,4 -

0,2

0,1

Р 5мг ГК/Л + Cd 5 мг/л О 10мг ГК/л +Cd 5 мг/л

Рис. 8. Численность клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae после инкубации (96 ч) на среде, содержащей гуминовые кислоты (5 и 10 мг/л) и ионы кадмия (Cef*) (5 мг/л). В таблице цветом отмечены разности (t-критерий) между вариантами с различным содержанием ГК в среде, значимые на уровне р < 0,05 (п=6).

0,5

ГКЧ ГКТ ГКУ ГКУАТ ГКРО\« ГК70

Рис.9. Детоксицирующий эффект гуминовых кислот на клетки дрожжей, подверженных воздействию ионов кадмия (С<?* 5 мг/л).

На рис. 8-9. видно, что при концентрациях ГК 5 и 10 мг/л токсицирующее действие кадмия (5 мг/л) уменьшается в 2-3 раза в варианте «металл+ГК». Наибольшее количество клеток после инкубации наблюдается при концентрации 10 мг ГК /л. Значения коэффициента детоксикации при данной концентрации превышают значения при 5 мг ГК /л примерно в 1,5 - 2раза. По-прежнему решающей остается способность ГК к связыванию металла в нетоксичный комплекс. Для препаратов ГКТ и ГКУ детоксицирующее действие меньше, чем у других препаратов, что согласуется с невысокой максимальной емкостью связывания кадмия для этих ГК.

Токсицирующее действие кадмия (10 мг/л) приводит к полному подавлению роста клеток в варианте без ГК. При концентрации ГК 5 мг/л рост клеток также отсутствует, а при концентрации ГК 10 мг/л детоксицирующий эффект (О < 10%) наблюдается у

гуминовых кислот выделенных из углей и чернозема. Отсутствие детоксицирующего действия у гуминовых кислот при такой высокой концентрации можно объяснить тем, что ГК при данных условиях могут максимально связать 10% токсиканта в растворе. Следовательно, практически весь металл находится в виде свободных токсичных ионов Сс12+(на долю гидроксокомплексов при рН=6 приходится менее 1% от общего количества ионов Сс12+.(Лурье, 1979)).

2.7.3. Детоксицирующие действие гуминовых кислот на дрожжи, подвергнутые воздействию ионов меди Си (II).

С концентрации 0,1 мг Си2+/мл проявляется ингибирующее действие на рост клеток дрожжей. Сравнение контрольных вариантов с вариантами, в которых присутствуют ГК и токсикант по критерию НСР показало, что во всех случаях между ними наблюдаются достоверные различия. Также ионы меди во всех случаях сильнее ингибируют рост клеток, чем в вариантах с кадмием.

ИПо'кл/мл

О 5мг ГК/л + Си 0,1 мг/л □ 10мг ГК/л + Си 0,1 мг/л

-Ь

пН

-ь

Контроль Си 0,1 мг/л ГКЧ ГКТ ГКУ ГКУАТ ГКР01Л/ ГК70

5 мг ГК/л ГКЧ ГКТ ГКУ ГКУАТ ГКРО\У ГК70

р-уровень 0,000 0,000 0,000 0,0 и 0,000 0,005

10 мг ГК/л ГКЧ ГКТ ГКУ ГКУАТ ГКРОШ ГК70

Рис. 10. Численность клеток дрожжей ЗассИаготусез сегеу1з1ае после инкубации (96 ч) на среде, содержащей гуминовые кислоты (5 и 10 мг/л) и ионы меди (Си2 ) (0,1 мг/л). В таблице цветом отмечены разности (I-критерий) между вариантами с различным содержанием ГК в среде, значимые на уровне р < 0,05 (п=6). о

1,4

1,2 1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

□ 5мг ГК/л + Си 0,1 мг/л

□ 10мг ГК/л + Си 0,1 мг/л

Рис. 11. Детоксицирующий эффект гуминовых кислот на клетки дрожжей, подверженных воздействию ионов меди (Си2' 0,1 мг/л).

На рис. 10-11 видно, что при концентрации 5 мг ГК/л токсицирующее действие меди во всех вариантах снижается сильнее, чем при концентрации 10 мг ГК/л. Эффективнее это происходит в варианте с ГКТ, которая обладает высоким стимулирующим действием. Как и для варианта с кадмием, при низкой концентрации ионов металла определяющее значение имеет стимулирующий эффект гуминовых кислот.

□ 5мг ГК/л + Си 1 мг/л

□ ЮмгГК/л + Си 1 мг/л

-П

Нп

Контроль Си 1 мг/л

ГКЧ

ГКРОМ/

5 мг ГК/л ГКЧ ГКТ ГКУ ГКУАТ ГКРСЖ ГК70

р-уровень 0,004 0,000 0,000 0,901 0,002 0,490

10 мг ГК/л ГКЧ ГКТ ГКУ ГКУАТ ГКРО\У ГК70

Рис. 12. Численность клеток дрожжей ЗассИаготусея сегем1$1ае после инкубации (96 ч) на среде, содержащей гуминовые кислоты (5 и 10 мг/л) и ионы меди (Си2*) (1 мг/л). В таблице цветом отмечены разности (¡-критерий) между вариантами с различным содержанием ГК в среде, значимые на уровне р < 0,05 (п=6).

О 5мг гк/л + Си 1 мг/л а 10мг гк/л + Си 1 мг/л

0,3

0,2

ГКЧ ГКТ ГКУ ГКУДТ ГКРО\/У ГК70

Рис. 13. Детоксицирующий эффект гуминовых кислот на клетки дрожжей, подверженных воздействию ионов меди (Си2* I мг/л).

0,1

□ 10мг ГК/л + Си 5 мг/л

0,08

0,02

гкт

ГКУ

Рис.14. Детоксицирующий эффект гуминоеых кислот на клетки дрожжей, подверженных воздействию ионов меди (Си2' 5 мг/л).

На рис. 12-14 видно, что при изменении концентрации меди с 1 до 5 мг/л нарастает ингибирующее действие ионов металла. В концентрации 5 мг/л медь полностью подавляет рост дрожжевых клеток. Решающее значение на снятие токсического эффекта оказывает более высокая концентрация гуминовых кислот. Наибольшим детоксицирующим эффектом при высоких концентрациях металлов обладает ПСРО^* из леонардита, обладающая максимальной емкостью связывания меди.

При увеличении концентрации меди до 10 мг/л наблюдалось полное ингибирование роста дрожжевых клеток, как в варианте «металл», так и в варианте «металл+ГК». Как и в случае с кадмием это происходит в той области концентрации ионов Си2+, при которой гуминовые кислоты несущественно снижают содержание металла в растворе (на долю гидроксокомплексов при рН=6 приходится менее 10% от общего количества ионов Си2+.(Лурье, 1979)).

2.7.4. Биологическое и детоксицирующее действия ГК на проростки кресс-салата

Lepidium sativum, подвергнутого действию тяжелых металлов.

Биологическое действие гуминовых кислот на растение кресс-салата изучалось в диапазоне концентраций 5-10-50 мг/мл ГК (рис.15).

Рис. 15. Изменение сухой массы проростков семян кресс-салата Lepidium sativum в процентах по отношению к контролю после проращивания (96 ч) на среде, содержащей гуминовые кислоты (5 - 10 -50 мг/л).

Оптимум биологического действия для проростков, при котором происходит стимуляция роста, находится в области 10 мг ГК/л. При меньшей концентрации 5 мг ГК/л значимой разницы между вариантами с ГК и контролем не наблюдается. При увеличении концентрации до 10 мг ГК/л эффект стимуляции достоверно нарастает в ряду ГКТ>ГКЧ>У>РО\У. При концентрации 50 мг ГК/л проявляется ингибирующее действие. При концентрации 10 мг ГК/л стимулирующий эффект.

Результаты корелляционного анализа показали, что значения итоговой численности клеток после инкубации с ГК (10 мг ГК/л), когда наблюдается достоверный стимулирующий эффект, имеют связь со значениями С/Ы (Л = -0,71), общей кислотностью (Я = -0,65), оптической плотности Е465000|/°с (Я= -0,7) и среднечисловой ММ М\у (Л = 0,81). Те же закономерности наблюдались в экспериментах с клетками дрожжей, что может свидетельствовать о возможном влиянии этих параметров на стимулирующий эффект ГК.

По данным этих экспериментов были выбраны концентрации гуминовых кислот для исследования детоксицирующего действия по отношению к тяжелым металлам'. 5 и 10 мг ГК/л. Гуминовые кислоты, присутствующие в среде в этих количествах, с одной стороны, проявляют стимулирующие свойства, а с другой снижают токсичные концентрации ионов Си2+ и Сй2+.

% к котнролю

О Бмг ГК/л + Cd Б мг/л О 10мг ГК/л + Cd б мг/л

120 100

[Ь

if!

■i

Контроль Cd б мг/л ГКЧ

ГКУАТ rXPOW

Рис. 16. Изменение сухой массы проростков семян кресс-салата Lepidium sativum в процентах по отношению к контролю после проращивания (96 ч) на среде, содержащей гуминовые кислоты (5 и 10 мг/л) и ионы кадмия (Cd2*) (5 мг/л).

% к котнролю

О Бмг ГК/л + Си Бмг/л о 10мг ГК/л + Си бмг/л

rfi

ri]

rf]

ffl

Контроль Си 5мг/л ГКЧ ГКТ ГКУ TKVAT rKPOW ГК70 у VAT POW 70

Рис. 17. Изменение сухой массы проростков семян кресс-салата Lepidium sativum в процентах по отношению к контролю после проращивания (96 ч) на среде, содержащей гуминовые кислоты (5 и 10 мг/л) и ионы меди (Си2*) (5 мг/л).

□ 5 мг ГК/л + Си 5 мг/л

□ 10 мг ГК/л + Си 5 мг/л

0,4 -

ПО/AT TKPOW

Рис. 18. Детоксицирующий эффект гуминовых кислот на проростки кресс-салата, подверженных воздействию ионов меди (>Си2' 5 мг/л).

1,8

1,2

□ 5 мг ГК/л + Cd 5 мг/л _ □ 10 мг ГК/л + Cd 5 мг/л

гкт

TKVAT PKPOW

Рис. 19. Детоксицирующий эффект гуминовых кислот на проростки кресс-салата, подверженных воздействию ионов кадмия (Cef* J мг/л).

На рис. 16-19 видно, что медь (как и в экспериментах с клетками дрожжей) оказывает токсическое действие на проростки кресс-салата сильнее кадмия. Детоксикация ионов кадмия и меди (5 мг/л) достоверно и наиболее полно протекает при 10 мг ГК/л. При 5 мг ГК/л разница в вариантах «металл» и «металл+ГК» наблюдается лишь в 2-х случаях из 10-ти для меди (ГКУ и TKPOW) и в 3-х случаях из 10-ти для кадмия (ГКУАТ, У и POW). Эти результаты во многом сходны с полученными в экспериментах с дрожжами, где при высоких концентрациях металла основное значение имеет высокая концентрация ГК, способствующая более полному связыванию ионов токсиканта.

Заключение

В исследовании стимулирующего и протекторного действия гуминовых кислот помимо проростков кресс-салата для кторого почва является естественным местом обитания, были использованы хорошо изученные дрожжи S. cerevisiae, практически не встречающиеся в почве. Тем не менее, обнаруженные закономерности, теоретически можно распространить и на более широкий круг биологических объектов. Это возможно в силу того, что клеточные стенки любого живого организма включают органические соединения, в состав которых входят кислород и азотсодержащие группировки, а также различные гидрофобные фрагменты. Реакции ГК с такими соединениями могут протекать неспецифично за счет водородных связей и гидрофобных взаимодействий и, следовательно, общие закономерности должны соблюдаться для различных типов живых клеток.

Суммируя полученные данные по биологическому действию гуминовых кислот на тест-культуры: проростки кресс-салата (Lepidium sativum) и дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) можно отметить, что оптимум положительно действия этих биополимеров находится в области концентраций 5 мг ГК/л для клеток дрожжей и 10 мг ГК/л для кресс-салата. В данной концентрации ГК оказывают детоксицирующее действие в отношении изученных тест-объектов, подвергнутых действию ионов Си2+ и Cd2+, за счет совместного вклада стимулирующего и детоксицирующего эффекта. При более высоких концентрациях токсикатов в растворе детоксикация может происходить только при более высокой концентрации ГК, когда на первый план выходит способность этих соединений связывать ионы металлов в нетоксичные соединения, т.е. чисто химические свойства гуминовых веществ.

Выводы

1. Исследованные гуминовые вещества различаются по ряду химических показателей: элементному составу; содержанию функциональных групп; молекулярно-массовому распределению и оптическим свойствам.

2. Исследование комплексообразования гуминовых кислот с ионами меди и кадмия показало, что константы устойчивости комплексов меди на 2-3 порядка выше аналогичных величин для кадмия, а параметры максимальной емкости связывания ионов металлов ГК лежат в интервале 50-100 мг (Ме2+)/г ГК.

3. Установлено, что ГК в концентрации 5 мг/л стимулируют рост дрожжей Saccharomyces cerevisiae, для проростов кресс-салата Lepidium sativum эта концентрация составляет 10 мг/л, при более высоких концентрациях ГК начинают проявлять ингибирующие свойства. Наибольшим стимулирующим эффектом обладают гуминовые кислоты, выделенные из чернозема, торфа и угля (ГКУ).

4. Исследование роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae и проростов кресс-салата Lepidium sativum в присутствии ионов меди и кадмия показало, что ионы меди оказывают больший токсический эффект во всем диапазоне исследованных концентраций.

5. Исследование протекторных свойств гуминовых кислот в оптимуме биологического действия (5-10 мг ГК/л) показало, что гуминовые кислоты могут защищать дрожжи Saccharomyces cerevisiae и кресс-салат Lepidium sativum при концентрации ионов кадмия и меди в растворе 0,1-5 мг/л, когда в комплексы с ГК связываются 20 - 100% ионов металла от исходного содержания в растворе.

6. Препараты гуминовых кислот, имеющие более высокие показатели максимальной емкости связывания металлов и стимулирующего действия, обладают более эффективными детоксицирующими свойствами, что может быть использовано для оценки сравнительной эффективности коммерческих препаратов.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Семенов A.A., Демин В.В., Бирюков М.В., Завгородняя Ю.А. Локализация биопротекторного действия гуминовых веществ в почвах // Естественные технические науки, 2008, №4, стр. 84-93.

2. Семенов A.A., Демин В.В., Бирюков MB., Завгородняя Ю.А. Природа биологического действия гуминовых веществ «Роль почв в биосфере // Труды института экологического почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова, 2005, Вып.6, стр. 86 - 98.

3. Семенов A.A. Тихонов В.В. Протекторные свойства гуминовых кислот// Материалы международной конференции студентов и аспирантов «Ломоносов 2009», Москва, 2009, Тез. докл. секции почвоведение, стр. 35-36.

Подписано в печать 26.11.09 Формат 60x88 1/16. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 892 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Семенов, Андрей Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Металл-гумусовые взаимодействия и природа биологического действия гуминовых кислот.

1.1. Взаимодействие ионов тяжелых металлов с гумусовыми кислотами

1.2. Устойчивость металл-гумусовых комплексов.

1.3. Функции гуминовых веществ в биосфере.

1.4. Биологическое действие гуминовых веществ.

1.5. Основные гипотезы природы биологического действия гуминовых веществ.

1.6. Детоксицирующие свойства гумусовых кислот по отношению к живым организмам, подвергнутым воздействию тяжелых металлов.

1.7. Использование биологических объектов в тестировании.

ГЛАВА 2. Объекты и методы.

2.1. Выделение и характеристика гуминовых кислот и препаратов гуматов

1.1. Источники, методы выделения и очистки гуминовых кислот.

1.2. Элементный состав гуминовых веществ.

1.3. Электронные спектры поглощения гуминовых веществ.

1.4. Инфракрасные спектры гуминовых веществ.

1.5. Молекулярно-массовые распределения гуминовых веществ.

1.6. Кислотно-основные свойства и содержание функциональных групп в гуминовых веществах.

2.1.7. Металл-гумусовые взаимодействия.

2.1.7.1. Потенциометрическое титрование гуминовых веществ с использованием ион-селективных электродов.

2.1.7.2. Определение констант устойчивости и максимальной емкости связывания гуминовых веществ с ионам Си" и Cd".

2.2. Биотестирование гуминовых кислот.

2.2.1. Эксперименты на культуре клеток дрожжей Saccharamyces cerevesiaeA

2.2.2. Эксперименты на семенах кресс-салата Lepidium sativum сорта "Дукат"

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Характеристика гуминовых кислот и препаратов гуматов.

3.1.1. Элементный состав гуминовых веществ.

3.1.2. Электронные спектры поглощения гуминовых веществ.

3.1.3. Инфракрасные спектры гуминовых веществ.

3.1.4. Молекулярно-массовые распределения гуминовых веществ.

3.1.5. Кислотно-основные свойства и содержание функциональных групп в гуминовых веществах.

3.1.6. Величины констант устойчивости и максимальной емкости связывания гуминовых кислот с ионам Си и Cd

3.2. Биотестирование гуминовых кислот.

3.2.1. Биологическое действие ГК на дрожжи Saccharomyces cerevisiae

3.2.2. Детоксицирующие действие гуминовых кислот по отношению к ионам кадмия Cd (II).

3.2.3. Детоксицирующие действие гуминовых кислот на дрожжи, подвергнутые воздействию ионов меди Си (II).

3.2.4. Биологическое и детоксицирующее действия ГК на проростки кресссалата Lepidium sativum, подвергнутого действию тяжелых металлов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние гуминовых кислот на устойчивость растений и микроорганизмов к воздействию тяжелых металлов"

Биологическая активность гуминовых кислот (ГК) интенсивно изучается в течение длительного времени. Многочисленные исследования позволяют констатировать наличие положительного отклика живых организмов на присутствие малых доз ГК в окружающей среде (Христева, 1951; Кононова, 1963; Александрова, 1972; Орлов, 1993; Горовая и др. 1995; Чуков, 2001; Попов, 2004; Куликова, 2008). В отличие от пестицидов и агрохимикатов гумусовые вещества являются естественными, жизненно необходимыми компонентами почвы, выполняющими в ней разнообразные функции (Орлов, 1993). Это сделало их крайне привлекательными для использования в различных отраслях народного хозяйства. Однако такие сложные по химическому строению вещества как ГК не могут не обладать двояким эффектом и оказывают в определенных условиях и негативное воздействие на живые организмы (КиНкоуа et а1., 2005).

В настоящее время на рынок поступает большое количество препаратов гуматов, для получения которых используются разные технологии и виды сырья. Ведется активная реклама и пропаганда их использования, однако до настоящего времени остается открытым вопрос о критериях оценки их качества и биологической активности. Использование только физико-химических методов для их характеристики не дает комплексную оценку этих сложных объектов. Поэтому в настоящее время остается актуальным вопрос о критериях контроля биологической активности гуматов и разработке методик биологического тестирования препаратов ГК. Вероятно, одним из первых шагов в решении этой проблемы является сравнительное исследование различных коммерческих препаратов гуматов и гуминовых кислот почв в аналогичных экспериментальных условиях, проводимых на одинаковых тест-объектах. Этот подход был использован рядом авторов (Жилин, 1998; Перминова, 2000), и предложен ряд способов оценки детоксицирующих свойств гуминовых веществ по отношению к экотоксикантам. Однако область использования предложенных критериев ограничена, и требуются дальнейшие исследования в этой области.

Цель работы: исследование способности гуминовых кислот, выделенных из коммерческих препаратов гуматов и почв, снижать токсическое действие ионов меди и кадмия на живые организмы: проростки кресс-салата (Lepidium sativum) и дрожжи {Saccharomyces cerevisiae).

Задачи:

2. Изучить реакции комплексообразования гуминовых веществ с ионами меди и кадмия.

3. Исследовать биологическое действие гуминовых кислот на тест-культуры: проростки кресс-салата {Lepidium sativum) и дрожжи ()Saccharomyces cerevisiae).

4. Исследовать действие ионов меди и кадмия на проростки кресс-салата {Lepidium sativum) и дрожжи {Saccharomyces cerevisiae).

5. Оценить эффективность протекторного действия гуминовых кислот на проростки кресс-салата {Lepidium sativum) и дрожжи {Saccharomyces cerevisiae), подвергнутые воздействию ионов меди и кадмия.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы, в том числе 1 в реферируемом журнале ВАК.

Заключение Диссертация по теме "Почвоведение", Семенов, Андрей Александрович

выводы

2+ емкости связывания ионов металлов ГК лежат в интервале 50-100 мг (Me )/г ГК.

Благодарности

Автор выражает благодарность за помощь и поддержку доктору биологических наук, профессору С.Я. Трофимову,сотруднику Института экологического почвоведения МГУ к.б.н. В.В.Демину, а также сотрудникам кафедры химии почв ф-та почвоведения МГУ д.б.н. Т.А. Соколовой, к.б.н. Ю.А. Завгородней, к.б.н. М.С. Розановой, а также аспирантам кафедры биологии почв A.B. Якушеву и В.В. Тихонову.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Суммируя полученные данные по биологическому действию гуминовых кислот на тест-культуры: проростки кресс-салата (Lepidium sativum) и дрожжи {Saccharomyces cerevisiae), можно отметить, что оптимум положительного действия этих биополимеров находится в области концентраций 5 мг ГК/л для клеток дрожжей и 10 мг ГК/л для кресс-салата. В данной концентрации ГК оказывают детоксицирующее действие в отношении изученных тест-объектов, подвергнутых действию ионов Си2+ и Cd" (в концентрации 0,1 - 1 мг/л), за счет совместного вклада стимулирующего и деактивирующего эффекта. При более высоких концентрациях металлов в растворе (5 — 10 мг/л) детоксикация может происходить только при высокой концентрации ГК, когда на первый план выходит их способность связывать ионы металлов в нетоксичные соединения.

В исследовании детоксицирующего действия гуминовых кислот были использованы 2 разных типа тест-объектов: высшие растения (проростки кресс-салата) и эукариотные микроорганизмы (дрожжи). Обнаруженные закономерности в биологическом действии ГК оказались сходны для изученных объектов. Вероятно, это может происходить в силу того, что клеточные стенки любого живого организма включают органические соединения, в состав которых входят О- и N-содержащие полярные группировки, а также различные гидрофобные фрагменты. Реакции ГК с такими соединениями могут протекать неспецифично за счет водородных связей и гидрофобных взаимодействий, и, следовательно, общие закономерности должны соблюдаться для различных типов живых организмов.

Следовательно, использованный подход к биотестированию гуминовых препаратов, учитывающий одновременно как физиологическое действие гуминовых веществ, так и их способность деактивировать токсиканты, можно распространить на более широкий круг тест-объектов. Данный подход, на наш взгляд, целесообразно использовать и при разработке технологий применения промышленных гуматов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Семенов, Андрей Александрович, Москва

1. Александрова И. В. О физиологической активности гумусовых веществ и продуктов метаболизма микроорганизмов // Органическое вещество целинных и освоенных почв М.: Наука, 1972. - С.30-69

2. Алёшин С.Н., Тюнеева Т.Н. О питании растений молекулярными органическими соединениями почвы // Изв. Тимирязев, с.-х. акад. 1956 Вып.2(12)

3. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1987.-Т.5.-231 с.

4. Аляутдинова Р.Х., Гагарин С.Г., Екатеринина JI.H. Корреляция физиологической активности и физико-химических свойств гуминовых препаратов//Химия твердого топлива, 1991, №3, с. 16-21

5. Антипов-Каратаев И.Н., Цюрупа И.Г. О формах и условиях миграции веществ в почвенном профиле: (обзор иностранной литературы)//Почвоведение. 1961, N 8, с. 1-12.

6. Б амбалов H.H., Лукошко Е.С. Состав и свойства гуминовых кислот начального периода торфообразования // Химия твердого топлива, 1988, №5, с.3-7

7. Баталкин Г.А., Галушко A.M., Махно Л.Ю., Христева Л.А. О природе действующего начала физиологически активных гуминовых кислот. // Тр. Междунар. симпоз. IV и II Комис. МТО «Торф, его свойства и перспективы применения». Минск, 1982. С. 115-117.

8. Бобырь Л.Ф. Влияние физиологически активных гумусовых веществ на фотосинтетические процессы у растений; Автореф. Дис. канд. биол. наук. -Кишинев, 1984. 24 с.

9. Варшал Г.М., Велюханова Т.К., Кощеева И.Я. Геохимическая роль гумусовых кислот в миграции элементов. В кн.: Гуминовые вещества в биосфере. -М.: Наука, 1993. С.97-117.

10. Вахмистров Д.Б., Зверкова O.A., Дебец Е.Ю., Мишустина Н.Е. Гуминовые кислоты: Связь между поверхностной активностью и стимуляцией роста растений // Докл. АН СССР. 1987, Т.293, №5. - С.1277-1280.

11. Гаузе Г.Ф. Борьба за существование. М.: Изд-во РХД, 2002. — 159 с.

12. Гедройц К.К. Избранные научные труды.- М. Наука, 1975. -640 с.

13. Горбатов B.C. Трансформация соединений и состояние цинка, свинца и кадмия в почвах. Канд. дис. М., 1983.

14. Горовая А.И. Роль физиологически активных гуминовых веществ в адаптации растений к действию ионизирующей радиации // Гуминовые вещества в биосфере. М.: Наука, 1993. - С. 144-150.

15. Горовая А.И., Орлов Д.С., Щербенко О.В. Гуминовые вещества. Строение, функции, механизмы действия, протекторные свойства, экологическая роль. — Киев: Наукова думка, 1995. — 304 с.

16. Григорьева З.В., Королева Р.П., Ларина Н.К., Назарова H.H., Недошивин Ю.Н., Касаточкин В.Н. Физико-химические исследования взаимодействия гуминовых кислот с солями металлов.//Химия тв. топлива. -1967, N2.

17. Григорьева К.В., Караваев Н.М. Влияние условий щелочной экстракции углей на состав гуминовых кислот // Доклады АН СССР, 1969, т.188, №1, с.160-169

18. Гринберг A.A. Введение в химию комплексных соединений. -JL: Химия, 1971.-632 с.

19. Гуминский С.А. Механизм и условия физиологического действия гумусовых веществ на растительный организм // Почвоведение. 1957, № 12. с. 72-78

20. Детерман Г. Гель-хроматография. М.: Мир, 1970.

21. Дорфман Э.М. Природа соединений ионов железа и алюминия с гумусовыми кислотами почв. Автореф. Дис. канд. биол. наук. М., 1968.

22. Драгунов С.С. Образование гуминовых кислот в различных природных условиях // В кн.: Генезис твердых горючих ископаемых. М., 1959, с.5-15

23. Дроздова Т.В. Значение гуминовых кислот в концентрировании редких элементов в почвах //Почвоведение. 1968, N 10. - С.60-64.

24. Евдокимова Г.А., Морозова Н.М. Миграция тяжелых металлов из почвы в сельскохозяйственные культуры. В сб.: Тяжелые металлы в окружающей среде и охрана природы. Мат. II Всесоюзн. конф., 28-30 дек. 1987 г., ч. II, М., 1988, с. 204-209.

25. Жилин Д.М. Исследование реакционной способности детоксицирующих свойств гумусовых кислот по отношению к соединениям ртути (II). Автореф. Дис. канд. хим. наук. Москва, 1998, с.22

26. Жмакова H.A., Наумова Г.В., Косоногова JI.B. Влияние окисления на физико-химические свойства гуминовых кислот торфа // В кн.: Гуминовые вещества в биосфере. М.: Наука, 1993, с.45-49

27. Заварзина А.Г., Демин, В.В. Кислотно-основные свойства гуминовых кислот различного происхождения по данным потенциометрического титрования // Почвоведение. 1999, №10. - С. 1246-1254.

28. Ибрагимов Ш.К., Фокин А.Д. Поступление в растения индивидуальных органических веществ в условиях естественного ценоза на почвах подзолистого типа // Изв. Тимирязев, с.-х. акад. 1974, Вып. 4.

29. Кабата-Пендиас А., Пендиас X. Микроэлементы в почвах и растениях. М., 1989, 439 с.

30. Карпухин А.И. Влияние фульвокислот на урожай некоторых сельскохозяйственных растений // Изв. Тимирязев, с.-х. акад. — 1979, Вып. 2.

31. Колесников М.П., Егоров И.А. Металлпорфирины в отложениях докембрия.//Докл. АН СССР. 1977, Т.233, N 3.

32. Комиссаров И.Д., Климова A.A., Логинов, Л.Ф. Влияние гуминовых препаратов на фотосинтез и дыхание растений // Науч. труды Тюменьского с.-х. ин-та. 1971, Т. 14.

33. Комиссаров И.Д., Логинов Л.Ф. Химическая природа и молекулярное строение гуминовых кислот. В сб.: Химия гумусовых кислот: Их роль в природе и перспективы использования в народном хозяйстве: Тез. докл. зональной науч.-техн. конф. Тюмень, 1981, С.4.

34. Кононова М.М. Органическое вещество почвы. М.: Изд-во АН СССР, 1963.-314 с.

35. Корнилович Б.Ю., Пшинко Г.Н., Ковальчук И.А. Влияние фульвокислот на взаимодействие U (VI) с глинистыми компонентами почв. Радиохимия, 2001, 43, № 5, 464.

36. Красильников H.A. Микроорганизмы почвы и высшие растения. М., 1958

37. Краткий справочник по геохимии. М.:Недра, 1977. - 184с.

38. Куликова H.A. Защитное действие гуминовых веществ по отношению к растениям в водной и почвенной средах в условиях абиотических стрессов. Автореф. Дис. докт. биол. наук. Москва, 2008. с.43-46.

39. Кухаренко Т.А. Реакции гуминовых кислот с нейтральными солями. Сообщение 1.//Химия тв. топлива. 1937, Т.VIII, Вып.9.

40. Кухаренко Т.А. Реакции гумусовых кислот с солями тяжелых металлов.//Ж. прикладной химии. 1946, T.XIX, N. 2.

41. Кухаренко Т.А. Изменение структуры и свойств гуминовых кислот в углеобразовательном процессе // В кн.: Генезис твердых горючих ископаемых. М., 1959, с.319-337

42. Кухаренко Т.А. Исследование кинетики реакции обмена гуминовых кислот с уксуснокислым кальцием как характеристика их коллоидно-химической природы.// Труды ин-та гор. ископ. АН СССР. -1950, Т. 2.

43. Кухаренко Т.А., Бороздина Л.А. К вопросу о сущности реакции обмена гуминовых кислот с ацетатом кальция./ЛСолл. журнал. -1949, Т.П. N.4.

44. Кухаренко Т.А., Екатеринина Л.Н. Сравнительное исследование растворимых и не растворимых в ацетоне фракций гуминовых кислот торфов, бурых и выветрившихся углей // Химия твердого топлива, 1968, №3, с. 12-18

45. Кухаренко Т.А., Толчинская Р.Я., Чеснокова Т.В., Левина И.В. Особенности окисления бурых углей Канско-Ачинского бассейна в пласте//Химия твердого топлива, 1967, с.22-25

46. Ларина Н.К., Касаточкин В.Н. Ионный обмен и строение гуминовых кислот.//Почвоведение. 1957, N 9. с.28-32

47. Лебедев К.К. О роли минеральных компонентов в формировании торфяных отложений // В кн.: Генезис твердых горючих ископаемых. М., 1959, с.16-30

48. Линник П.Н., Набиванец Б.И. Формы миграции металлов в пресных поверхностных водах. Гидрометеоиздат. Л., 1986, 268 с.

49. Лурье Ю. Ю. Справочник по аналитической химии. М.: Химия. 1979., с. 328-341.

50. Мажуль В.М., Прокопова Ж.В., Ивашкевич Л.С. Механизм действия гуминовых препаратов из торфа на структурное состояние мембран и функциональную активность клеток дрожжей. В кн.: Гуминовые вещества в биосфере. М.: Наука, 1993. - С. 151-157.

51. Малама A.A., Храменко Г.Б., Орлов Д.С., Юхнин A.A. Элементный состав и инфракрасные спектры меланиновых пигментов некоторых микроорганизмов // Известия АН СССР. Сер. биол., 1975, №5, с.766-768

52. Манская СМ., Дроздова Т.В., Емельянова М.М. Связывание меди различными формами природных органических соединений .//Почвоведение. 1958, N6. с. 41-48

53. Маякова Е.Ф. Синтез биологически активного препарата БСТ из торфа и его применение. — В кн.: Теория действия физиологически активных веществ: Тр. ДСХИ. Днепропетровск, 1983, т. VIII, с. 87—89.

54. Мидгли Д., Торренс К. Потенциометрический анализ воды. М.: Мир, 1980,512 с.

55. Милановский Е.Ю. Применение ионного детергента в гель-хроматографии гумусовых кислот почв//Почвоведение, 1984, №8, с. 142146

56. Мотовилова Л.В., Хренкова Г.М. Состав и свойства ГК, полученных при механодеструкции бурых углей//Химия твердого топлива, 1988, №2, с.36-41

57. Наумова, Г.В., Райцина, Г.И., Лях, В.В. Биологическое действие торфяных гидролизатов на дрожжи. , В кн.: Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения: Тр. ДСХИ. Днепропетровск, 1983, т. IX, с. 102-105.

58. Овчинникова Т.Ф. Влияние гидрогумата гуминового препарата из торфа на пролиферативную активность и метаболизм дрожжевых микроорганизмов// Научн. докл. высш. школы, Серия биол. науки. - 1991, № 10. - С.87-90.

59. Овчинникова Т.Ф., Кудряшов А.П., Мажуль В.М., Наумова Г.В., Райцина Г.И. О мембранотропной активности гидрогумата гуминового препарата из торфа // Научн. докл. высш. школы, Серия биол. науки.- 1991, № 10.-С.103-109.

60. Озол A.A. Исследование поглощения из растворов глинистыми коллоидами тяжелых металлов методом электронного парамагнитногорезонанса./Физические методы исследования осадочных пород и минералов.- М. :Изд-во МГУ, 1962.

61. Орлов Д.С, Нестеренко Н. В. Образование гуматов кобальта, никеля, меди и цинка. //Научные докл. высш. школы. Серия биол. науки. 1960, N 3.

62. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации -М.: Изд-во МГУ, 1990. 325 с.

63. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв. М.: Изд-во МГУ, 1974, 334 с.

64. Орлов Д.С. Кинетическая теория гумификации и схема вероятного строения гуминовых кислот.//Научн. докл. высш. школы, Серия биол. науки.- 1977, N9.

65. Орлов Д.С. Свойства и функции гуминовых веществ // Гуминовые вещества в биосфере М.: Наука, 1993. - С.16-27

66. Орлов Д.С. Теоретические и прикладные проблемы химии гумусовых веществ./Итоги науки и техники, Серия почвоведение и агрохимия. М., 1979.-Т. 2.

67. Орлов Д.С., Гришина Л.А. Практикум по химии гумуса М.: Изд-во Моск. ун-та, 1981.-272 с.

68. Орлов Д.С., Демин В.В., Завгородняя Ю.А. Влияние молекулярных параметров гуминовых кислот на их физиологическую активность // Доклады Академии Наук, 1997. 354, 6 - С.843-845

69. Орлов Д.С. Химия почв. М.: МГУ, 1992, 399с.

70. Перминова И.В. Анализ, классификация и прогноз свойств гумусовых кислот. Автореф. Дис. докт. хим. наук. Москва, 2000.

71. Пивоваров Л.Р. , Ярчук И.И. Ответные реакции дрожжей на гумусовые вещества В кн.: Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения: Изд-во «Урожай», Киев-34, 1967, т. IX,

72. Покуль Т.В., Парамонова Т.Г., Крюкова В.Н., Мицук Г.Е. Гуминовые вещества бурых углей Хандинского месторождения // В кн.: Гуминовые вещества в биосфере. М.: Наука, 1993, с.54-57

73. Попов А. И. Гуминовые вещества: свойства, строение, образование -СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2004. 248 с.

74. Прат С. Влияние гумусовых соединений на метаболизм растений// Вестн. Моск. ун-та. 1965. Сер.6, №1

75. Прат С. Воздействие гумусовых веществ на растения. Л., 1963.

76. Прат С. Проблема проникновения и воздействия гумусовых веществ на клетки растений. JL, 1963

77. Рыжиков С.В., Стрелков В.М., Ведерников H.A., Гайлитис Ю.Н. Фракционный состав продуктов механохимической деструкции гуминовых веществ торфа // Научн. докл. высш. школы, Серия биол. науки. 1991, № 10. - С.23-28.

78. Семенов A.A., Демин В.В., Бирюков М.В., Завгородняя Ю.А. Локализация биопротекторного действия гуминовых веществ в почвах // Естественные технические науки, 2008, №4, стр. 84-93.

79. Славинская Г.В., Селеменев В.Ф. Фульвокислоты природных вод. Воронеж: Воронеж. Ун-т., 2001, 165с.

80. Стрелков В.М., Гайлитис Ю.Н., Шмит У.Я. Стимулирующее влияние продуктов механохимической деструкции гуминовых веществ торфа на рост кормовых дрожжей // Научн. докл. высш. школы, Серия биол. науки. 1991, № Ю.-С.81-87.

81. Тишкович A.B., Бамбалов H.H., Шатихина Т.А., Стригуцкий В.П., Навоша Ю.Ю. Исследование физико-химических свойств и физиологической активности некоторых фракций гуминовых кислот низинного торфа //Весщ АН БССР, сер. сельскагспадарчых навук, №3, Минск

82. Ткаченко Л.К., Филиппова Т.В., Горовая А.И., Давыдовский A.A., Сулиман Г.Ф. и Христева Л.А.//Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения в растениеводстве и животноводстве, 1977, 6, С.31-45.

83. Тэнфорд Ч. Физическая химия полимеров. М.: Химия, 1965, 572 с.

84. Фокин А.Д., Бобырь Л.Ф., Епишина, Л.А., и др. О проникновении гумусовых веществ в клетки растений / Гуминовые удобрения: Теория ипрактика их применения. Днепропетровск: Изд-во Днепропет. с.-х. ин-та, 1975. - С.57-58.

85. Христева JI.A. Об участии гуминовых кислот и других органических веществ в питании высших растений. Почвоведение, 1953, №10

86. Христева Л.А. Роль гуминовой кислоты в питании растений и гуминовые удобрения // Труды Почв, ин-та им. В.В. Докучаева. 1951, Т.38. -С.108-184.

87. Христева JI.A. Физиологическая функция гуминовой кислоты в процессах обмена веществ высших растений. В кн.: Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения. Изд-во Харьковского ун-та, 1957

88. Христева Л.А., Горовая А.И. // Способ детоксикации ядохимикатов. Авторское свидетельство №460037, 1974.

89. Христева Л.А. Действие физиологически активных гуминовых веществ на растения при неблагоприятных внешних условиях //Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения. Изд. Днепропетровского с.-х. инст-та, 1973, Т4, С.5-23.

90. Чуков С.Н. Структурно-функциональные параметры органического вещества почв в условиях антропогенного воздействия. СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2001. - 216 с.

91. Adhikari M., Chakravorty G., Harza G.C. //Agrochemica. -1977, Vol.21, No. 1-2. -P. 134-139.

92. Adhikari M., Chakravorty G., Harza G.C. Stadles on chela-tlon of alcohol soluble soil organic matter fractions with me-tals//J. Indian Chem. Soc. 1972 6, Vol.49, No. 5. - P. 499-508.

93. Adhikari M., Harza G.G. Humus-metal complex: spectral studies.//J. Indian Chem. Soc. 1976, Vol.53, No. 5. - P. 513-515.

94. Adhikari M., Chakravorty G., Harza G.C. Fulvic and metal complexes/Л. Indian Soc. Soil Scl. 1972, Vol.20, No. 4. -P. 311-321.

95. Andrzejewski M., Rosikiewicz D. Badania nad notavzenlam substaneji prochnivznych roznego pochodzenia z kilku mickroele-mentami. //Rocz. nauk. vol. 1974, A 100,No.l. -P. 17-29.

96. Banerjee S.K., Sengupta M. Studies on the interaction of some metal ions with different fractions of humic acid.//Fertil. Technol. 1977, Vol.14, N0.3. - P. 279-282.

97. Bartoc Katalin, Trif E. Les complexes chelatiques de l'acid humique etudies par la methode.//Trav. Mus.hist hatur. Ar-tipa. 1978, Vol.19. - P. 35-38.

98. Bloom P.R., McBride M.B. Metal ions binding and exchange with hydrogen ions in acid-washed peat.//Soil Sci.Soc.AmerJ. 1979, Vol.43, No. 4. P. 687-692.

99. Blume H. P., Brummer G. Prediction of heavy metal behavior in soil by means of simple field tests Ecotoxic. Environ. Saf., 1991, v. 22, p. 265-285.

100. Boyd S.A., Sommers I.E., Nelson D.W. Copper(II) and iron(III) complexation by the carboxylate group of humic acid.//Soil Sci. Soc. Amer. J. -1981, Vol.45, No.6.

101. Buchwalter, D.B., G. Linder, and L.R. Curtis. Modulation of cupric ion activity by pH and fiilvic acid as determinants of toxicity in Xenopus laevis embryos and larvae. Environ. Toxicol. Chem. 1996, Vol. 15(4): 568-573.

102. Butler J.H.A., Ladd J.N. Effect of extractant and molecular size on the optical and chemical properties of soil humic acids//Aust. J. Soil Res., 1969, V.7, p.229-239

103. Cacco G., DellAgnola G., Plant growth regulator activity of soluble humic complexes // Can. J. Soil. Sci. 1984, Vol. 64, No. 1.

104. Chen Y., Senesi N., Schnitzer M. Information provided on humic substances by E4/E6 ratios // Soil Sci. Am. J., 1977, V.41, p.352-358

105. Davis H., Mott C.J.B. Titrations of fulvic acid fractions. I: Interactions influencing the dissociation / reprotonation equilibria // Journal of Soil Science, 1981, N 32, p.379-391

106. Ephraim J.H., Boren H., Arsenie I., Pettersson C., Allard B. A combination of acid-base titrations and derivatization for functional group determinations of an aquatic fulvic aci. Sci. Total Environ., 1989, v. 81/82, p. 615-624.

107. Fitch A, Stevenson F. J. and Chen Y. Complexation of Cu(II) with a soil humic acid: Response characteristics of the Cu(II) ion-selective electrode and ligand concentration effects. // Org. Geochem. Vol. 9, No. 3, pp. 109-116, 1986.

108. Gamble D.S., Schnitzer M., Skinner D. S.//Can. J. Soil Sci. 1977, Vol.57, No. l.-P. 47-53.

109. Giesy, J. P., Newell, A., and Leversee, G. J. Copper speciation in soft, acid, humic waters: effects on copper bioaccumulation by and toxicity to Simocephalus Serrulatus (Daphnidae) // Sci. Total. Environ., 1983,28: 23-36.

110. Gjessing E.T. The effect of aquatic humus on the biological availability of cadmium. //Arch Hydrobiol, 1981, 91:144-149.

111. Goodman B.A., Cheshire M.V. The occurence of copper-porp-hyrin complexes in soil humic acids.//J.Soil Sci. 1976, Vol.27, N0.3. - P. 337-347.

112. Hammock D., Huang C. C., Mort G., and Swinehart, J. H. The effect of humic acid on the uptake of mercury(II), cadmium(II), and zinc(II) by chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) eggs. // Arch. Environ. Contam. Toxicol., 2003, 44: 83-88.

113. Irving H.M.N.H; Williams RJ.P. (1953). The stability of transition-metal complexes. // J. Chem. Soc.: p. 3192-3210.

114. Khan S.U. Interaction between the humic acid fraction of soils and certain metalic cations.//Soil Sci.Soc.Amer.Proc. 1969. Vol.33, No. 6.

115. Koukal B., Gueguen C., Pardos M., and Dominik J. Influence of humic substances on the toxic effect of cadmium and zinc to the green algae Pseudokirchneriella subcapitata. // Chemosphere, 2003, 53: p. 953-961.

116. Krebs F.The luminescent bacteria test for clean water legislation. //Schriftenr. Ver. Wasser Boden Lufthyg. 1992. V. 89. P. 591-297.

117. Kulikova N.A., Stepanova E.V., Koroleva O.V. Mitigation activity of humic substances: direct influence on biota. In: Use of Humic Substances to Remediate

118. Polluted Environments: From Theory to Practice. I.V. Perminova et al. (eds.) -Netherlands, Springer, 2005. P.285-309.

119. Lakatos B., Tibai T., Meisel J. Comparative studies on EPR spectra of transition metal complexes of peat humic substances and polyuronic acids./Proc. 5th Int. Peat Congr. Poznan 1976. Warszawa, 1976, Vol.2. -P. 330.

120. Levesque M., Schnitzer M. Organo-metallic interactions in soils. 6. Preparation and properties of fiilvic acid metal phosphates. //Soil Sci. 1967, Vol.103.-P. 183-190.

121. Manning P.E., Ramamoorthy S. Equilibrium studies of metal Ion complexes of Interest to natural waters. VII //J.Inorg.Nucl.Chem. 1973, Vol.35. - P. 15771581.

122. Marinsky J.A.; Wolf A.; Bunzl K. The binding of trace amounts of lead(II), copper(II), cadmium(II), zink(II), and calcium(II) to soil organic matter. J. Talant. 1980, 27, 461.

123. Masini J.C. Evaluation of neglecting electrostatic interactions on the determination and characterisation of the ionizable sites in humic substances // Analytica Chimica Acta, 1993, V.283, p.803-810

124. Mato M.C., Olmedo M.G., Mendez J. Inhibition of indolleacetic acidoxidase by soil humic acids fractionated on Sephadex // Soil Biol. Biochem. 1972, Vol. 4.

125. McBride M. B. Exchange and hydratatlon properties of Cu~ on mixed-ion Na+-Cu2+ smectites.//Soil Sci.Soc.Amer.J. 1976, Vol.40, No. 3. - P. 452-456.

126. McBride M. B. Retention of Cu2+, Ca2+, Mg2+ and Mn2+ by amorphose aluminia.//Soil Sci.Soc. Amer. J. 1978. Vol. 42, No.l. - P. 27-31.

127. McBride M.B. Copper(II) interactios with kaolinite: factors controlling adsorption.//Clays and Clay Miner. 1978, Vol.26, No. 2. - P. 101-102.

128. McBride M.B. Cu2+-adsorption characteristics of aluminium hydroxide and oxyhydroxides. //Clays and Clay Miner. 1982, Vol.30, No. 1. - P.21-28.

129. McBride M.B. Hydrolysis and dehydrotation reactions of exchangable Cu on hectorite.//Clays and Clay Miner. 1982, Vol.30, No.3. - P. 200-206.

130. McBride M.B. Origin and position of exchange sites in kaolinite: an ESR study.//Clay and Clay Miner. 1976, Vol.24, No. 2. - P. 88-92.

131. McBride M.B. Transition! metal bonding in humic acid: an ESR study.//Soil Sci. 1978, Vol.126, No. 4. - P. 200-209.

132. McBride M.B., Mortland M.M. Copper(II) interactions with montmorillonite. Evidence from physical methods.//Soil Sci.Soc. Amer.Proc. -1974, Vol.38.-P. 408-415.

133. Nardi S., Pizzeghello D., Muscolo A., Vianello A. Physiological effects of humic substances on higher plants: review // Soil Biol. Biochem. 2002, Vol. 34, N 11.

134. Ong H.L., Bisque R.E. Coagulation of humic colloids by metal ions.//Soil Sci. 1968, Vol.106, No.3. - P. 220-224.

135. Peng A. The role of humic substances in drinking water in Kashin-Beck disease in China // Environ.Health Perspect. SKLEAC, Research Center for Eco-environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, P. R. China, 1999. 107,4 ,p.293-296

136. Perdue E.M. Analytical constraits on the structural features of humic substances. //Geochim. Cosmochim. Acta, 1984, 48, p.1435.

137. Perminova I.V. Size-exclusion chromatography of humic substances: complexities of data interpretation attributable to non-size exclusion effects. // Soil Science, 1999, V. 164(11), P.834-840.

138. Piccolo A., Nardi S., Conchieri G. Structural characteristics of humic substances as related to nitrate uptake and growth regulation in plant system // Soil Biol. Biochem. 1992, Vol. 24.

139. Piccolo A., Stevenson F.J. Infrared spectra of Cu2+ Pb2+ and Ca2+ complexes of soil humic substances.// Geoderma. 1982, Vol.27, No.3. - P. 195-208.

140. Ramamoorthy S., Manning P. G. Uptake of Zn,Cd and Hg by Fish in the presence of competing compartments J. Inorg. Nucl. Chem., 1973, v. 35, No. 5, p.1577-1585.

141. Rashid M.A. Geochemistry of marine humic compounds. Springer-Verlag, Oxford, 1985, 243 p.

142. Rerabek J. The relation of humic acids to the inhibition of plant straight growth // Naturwissenschaften 1963, Bd. 50.

143. Rice J.A., McCarthy P. Statistical evaluation of the elemental composition of humic substances//Org. Geochem., 1991, V.17, N 5, p.635-648.

144. Rossel R.A. Materia organica y sustancias humicas del suelo. II//Cienc. e envest. 1970, Vol.26, No. 4. - P. 167-173.

145. Saar R. A. and Weber J. H. Complexation of cadmium(II) with water- and soil-derived fulvic acids: Effect of pH and fulvic acid concentration. //Can. J. Chem. 57, p.1263-1268, 1979.

146. Schnitzer M. Humic substances: chemistry and reactions // Soil organic matter. Elsevier, Amsterdam, 1978. P. 1-64.

147. Schnitzer M. Reactions between organic matter and Inorganic soil constltutlents./9-to Int. Congr. Soil Sei. Trans., Adelaide, 1968. Vol.1. Sydney e.a., 1968.-P. 635-644.

148. Schnitzer M. Recent advances in humic acid research. /Proc. Int. Peat Syrap. Bemidji. Minn. Oct. 21-23, 1981. -. Bemidji, Minn., 1982. P.17-44.

149. Schnitzer M., Skinner S. Organo-metallic interactions in soil. 4. Carboxyl and hydroxyl groups in organic matter and me-tall retention.//Soil Sei. 1965, Vol.99, No.4. - P. 278-284.

150. Steelink C. & Tollin G. Free radicals in soil // Soil Biochemistry. New York: Marcel Dekker, 1967. - P. 147-169.

151. Stevenson F.J. Geochemistry of soil humic substances. In Humic Sabstances in Soil, Sediment, and Water: Geochemistry, Isolation, and Characterization. Eds. Aiken G.R., McKnight D.M., Wershaw R.L., MacCarthy P. John Wiley & Sons, New York, 1985, 13.

152. Stevenson FJ. Humus chemistry. Genesis, composition, reactions. A Willey-Interscience Publication, New York, 1982.

153. Stevenson F.J. Nature of divalent transition metal complexes of humic acids as revealed by a modified Potentiometrie titration method. // Soil Sei. 1977, Vol.123, No. 1.-P. 10-17.

154. Takamatsu T., Yoshida T. Determination of stability constants of metal-humic acid complexes by Potentiometrie titration and ion-selective electrodes // Soil Science, 1978, V.125, N 6, p.377-386

155. Tan K.H. Infrared spectra of humic and fulvic acids, contaning silica, metal ions, and hydroscopic moisture. // Soil Sei. -1977, Vol.123, No. 4. P. 235-240.

156. Tuschall Jr. J. R. and Brezonik P. L. Application of continuous-flow ultrafiltration and competing ligand/ differential spectrophotometry for measurement of heavy metal complexation by dissolved organic matter. //Anal. Chim. Acta 149, 47-58, 1983.

157. Vaughan D., Ord, B.G. Uptake and incorporation of C-labelled soil organic matter by roots of Pisum sativum L. // J. Experimental Bot. 1981, Vol.32.

158. Vinkler P., Lakatos B., Meisel G. Infrared Spectroscopic Investigations of Humic Substances and their Metal Complexes // Geoderma. 1976, Vol.15, No.3. -P. 231-242.

159. Visser S.A. Effect of humic substances on mitochondrial respiration and oxidative phosphorylation // Sei. Total Environment. 1987, Vol. 62.

160. Vymazal J. Short-term uptake of heavy metals by periphyton algae //Hydrobiologie 1984,119, p. 171-179.

Информация о работе

Семенов, Андрей Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.27

Диссертация

Влияние гуминовых кислот на устойчивость растений и микроорганизмов к воздействию тяжелых металлов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы