Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние глицерина на функциональные свойства лактатдегидрогеназы и структуру пигмент-белковых комплексов ФСII микроводорослей, различающихся посолеустойчивости

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние глицерина на функциональные свойства лактатдегидрогеназы и структуру пигмент-белковых комплексов ФСII микроводорослей, различающихся посолеустойчивости"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ^ ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ

I 5 0 .1

3 ¡^'о

На правах рукописи

Симонова Нина Борисовна

УЖ 377.151.042

ВЛИЯНИЕ ГЛИЦЕРИНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ И СТРУКТУРУ ПИГМЕНТ-БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ОСИ

МИКРОВОДОРОСЛЕЙ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО СОЛЕУСТОЙЧИВОСТИ.

#

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Пущино 1996

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Научные руководители: кандидат физ.-мат. наук Е.А.Сабурова, доктор биол.наук. Н.А.Пронина кандидат биол. наук М.С.Христин.

Официальные оппоненты:

Локтор биол. наук Балнокин Ю. В.

Доктор биол. наук Ладыгин В. Г.

Ведущая организация Воронежский Государственный Универоитет

заседании Специализированного Совета СД 200. 29.01Э в Институте почвоведения и фотосинтеза РАС по адресу: г. Пущино, Московской области. Институт почвоведения и фотосинтеза РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института почвоведения и фотосинтеза РАН.

Автореферат разослан' "_"_1996г.

июня

1996г. в

час. на

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Б-. Н. Иванов

Общая характеристика работы. I Одной из важнейших задач в исследовании обменных процессов в живых организмах является изучение механизмов их адаптации к изменениям окружающей среды.

В ответ на стрессовые условия внешней среды Сповышенной солености, изменения температуры, аноксии, обезвоживания} растения синтезируют различные осмолиты: сахарозу, фруктозу, маннит, глицерин, про лин, бетаин-и др.

Одноклеточная зеленая водоросль D.salina с высокой адаптационной способностью к большим изменениям содержания соли в среде обитания: от десятых долей моля до насыщенных концентраций в качестве осмолита вырабатывает внутриклеточный глицерин до концентраций 4-5 М, который и предохраняет клетки от осмотического шока. В результате приспособ ления галотолерантных организмов к повышению внутриклеточного содержания глицерина следует ожидать существенных изменений функциональных свойств ферментов и надмолекулярных комплексов.

Биохимические адаптивные механизмы клетки при изменении физических и химических факторов .среды могут проявляться в изменениях структуры, а также метаболической активности макромолекул.

В настоящее время мало известно о свойствах ферментов из галофитов, которые в качестве оснолита синтезируют глицерин. В связи с этим представляет большой интерес исследования молекулярных механизмов взаимодействия осиолитов с цитозольными белками клетки особенно с позиций термодинамики и кинетических особенностей процесса, а также изменения структурно-функциональной организации хлорофилл белковых комплексов хлоропласта. Эти исследования позволяют внести вклад в понимание молекулярных механизмов адаптации галотолерантных СсолеустойчивыхЭ организмов к стрессам.

Исследование особенностей функционирования цитоплазматических и хлоропластных белков галотолерантной водоросли D.salina на примере лактатдегидрогеназы и пигмент-белковых комплексов ФСП, является перспективным подходом для понимания проблем регуляции активности ферментов и их стабилизации, а также биохимических адаптивных механизмов клетки в условиях, вызывающих накопление глицерина;__________

Сокращения: D.salina -D^inaliella salina, С. reinhardtii- Chlamydomo-nas reinhardtii, ПБК ©CII- пигмент-белковый комплекс фотосистемы II, CCK- свето-собирающий комплекс.

г

Цель_£аьиты Исследование особенностей функционирования ЛДГ и структурных изменений ПБК ОСИ микроводорослей О.salina и

C.reinhardtii, отличающихся галотолерантностью, в присутствии высоких концентраций глицерина.

Основныедачи исследования._

1.Влияние глицерина, pH, концентраций KCl, NaCl на кинетические характеристики ЛДГ из D.salina и С.reinhardtii

2.Действие глицерина на термодинамические параметры катализа и тепловой денатурации ЛДГ из D.salina и С. reinhardtii.

3. Влияние глицерина на структурные изменения ПБК ФСП из D.sa-1 ina.

Научная новизна.

1.Впервые было проведено сравнительное исследование функциональных свойств ЛДГ из галофильной и гликофильной водорослей

D.salina и С. reinhardtii, отличающихся по устойчивости к высоким концентрациям солей. Детально проанализирован механизм, по которому глицерин влияет на кинетические характеристики фермента-

КМ И VMax"

2.Выявлены функциональные различия в ионной регуляции гомологичных- ферментов in vitro из D.salina и С.reinhardtii. Показана разная чувствительность каталитических констант К^ и V а к изменению концентрации NaCl и KCl у ЛДГ из клеток этих микроводорослей.

3. Установлено, что солюбилизация ПБК из D.salina зависит от содержания полиолов в среде выделения. В присутствии глицерина и сахарозы прочность связи ССК ФСП с мембранами хлоропласта увеличивается.

4. Показана корреляция между солеустойчивостью водорослей и стабильностью белков к действию глицерина.

Проведенная экспериментальная работа углубляет представления о структурно-функциональных характеристиках белков и белковых комплексов в галотолерантных водорослях и позволяет интепретировать данные по взаимодействию белков с глицерином и другими полиспиртами. Результаты по влиянию глицерина на термостабильность ферментов могут бьггь использованы при разработке биотехнологических процессов, связанных с применением ферментов, а также в криобиологии и криомедицине. Солюбилизация ПБК ФСП в присутствии глицерина позволяет разделить ССК и РЦ, что может использоваться при исследовании структуры Фотосинтетических мембран, при реконструкции ПБК и т.д. Экспериментальные данные и выводы работы могут быть применены для решения экологических

проблем, связанных с вопросами солеустойчивости.

Публикации. Материалы диссертации изложены в 9 печатных работах. Результаты докладывались на 111 съезде Всерос. общества физиологов растений, ССанкт-Петербург,19933, на конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами СМосква,19933, на конференции "Физико-химические основы физиологии растений" СПенза, 19963, на ежегодных научных конференциих ИТЭБ РАН. Ст££кт££а_диссе£тации. Диссертация состоит из 4 частей, включающих обзор литературы, экспериментальную часть, описывающую объекты и методы, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы. Диссертация содержит 156 страниц , включая 42 рисунка, 11 таблиц и список литературы из 205 наименований.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Основный объектом исследования служила одноклеточная галофильная зеленая водоросль Dunaliella salina Teod.IPPAS D-209 из коллекции культур микроводорослей Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН - IPPAS (Семененко, 19913. Объектом исследования служила также Chlamydomonas reinhardtii ■ Dang. из коллекции водорослей Института почвоведения и фотосинтеза РАН Пу пшно С Ладыгин, 19913 .

Культивирование водорослей проводили в накопительном режиме в стерильных условиях при круглосуточном освещении, температуре 27 С и непрерывном барботировании газо-воздушной смесью, содержащей 1.7-27. С0о СВладимирова, Семененко, 1962; Ладыгин, 19703

Для получения клеточного экстракта отмытые в 0.9"/. растворе NaCl клетки водорослей растирали в присутствии ингибиторов протеаз PMSF, ImM бензомедина, 5тМ аминокапроновой кислоты, а также ImM ЭДТА, 5тМ ДТТ, при температуре 0°С. Полученный бесклеточный гомогенат центрифугировали в течение 15 мин при 25 тыс. об/мин. Для лучшего сохранения полученный экстракт клеток разбавляли на 5055 по объему глицерином и хранили при 0°С. Частичную очистку ЛДГ из D.salina и С.reinhardtii осуществляли путем последовательного фракционирования высаливанием в О- ЗОН, 30-50К, 50- 70>; сульфата аммония.

Кинетику реакции восстановления НАДН, катализируемой ЛДГ, регистрировали по изменению оптической плотности в полосе поглощения НАДН при 340 нм на спектрофотометре "Specord М-40" в термостатируемой кювете. Реакционная смесь содержала Na-фосфатный буфер, пируват, НАДН. Реакцию запускали добавлением клеточного

экстракта. Контролен служила активность, получаемая при добавлении клеточного экстракта в тех же условиях, но при отсутствии пирувата.

Электрофорез суммарных фракций растворимых белков и частично очищеных фильтрацией через сефадекс G-25 проводили в нативных условиях в 7V. ПААГ. Гель-электрофорез ПЕК проводился по методике CPeter, Tomberg,1987). Определение молекулярных масс полипептидов осуществляли с помощью электрофореза в SDS-ПААГ по методу Laemmlí (1970). Для выявления ЛДГ в смеси белков после электрофореза использовали метод окрашивания с участием водорастворимых солей тетразолия С Harris,Hopkins,1970).

ФС11 получали при солюбилизации хлоропластных мембран с помощью Тритона Х-100 по методу Мурата С19833. ПЕК ФСП получали солюбилизацией 0CII с помощью тритона Х-100 при соотношении тритон:хлорофилл 10:1 в присутствии IM NaCl и 4 М глицерина или 1 И сахарозы.

Разделение ПЕК ФСН проводили методом гельфильтрации на колонке с фрактогелем 650 S ДЕАЕ.

Спектры флюоресценции ПЕК измеряли на флюоресцентном спектрофотометре "Hitachi" 850.

Спектры кругового дихроизма растворов ЛДГ измеряли на дихрографе "Jasco," М-20

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1:__§лияние_глице£ина__на__$®EÍͧ!ÍIÍIÍI!I!S£Í!______D^sa^ina^

Ü.C^reinhardtii

Исследовано влияние глицерина на активность ЛДГ на стадии реакции восстановления пирувата: образование фермент-субстратного комплекса и стадию конформационных превращений тройного комплекса. Получены кривые насыщения фермента от концентрации пирувата и НАДН в реакции восстановления пирувата, катализируемой ЛДГ из D.salina

----*-----*

—-i—4

*----"í-—%

----1--4 4

—г IPhc.1 Зависимость начальной §

¡[скорости реакции CV3, катализируемой ЛДГ из D.salina, |от концентрации пирувата 07., 2- 12,53-25*; 50Я; 5-63* глицерина; I 0,1 И Na-фосф.буф.,рН 7,5.

Sc S3 : 1

а/.мм

и С.reinhardtii, Срис.1, табл.12. Все кривые описываются

уравнением Михаэлиса: V=Vma,S/CS5 . что позволило расчитать

величины К.. и V Стабл.15. Из табл.1 видно, что повышение

М мах

концентрации глицерина в растворе приводит к росту сродства ЛДГ к

Таблица 1. Значения К и V в реакции Boccfановления пирува-м мах

та, катализируемой ЛДГ из D.salina и С.reinhardtii.

глицерин, D salina С.reinhardti i

С У. v/v) К^.мкИ пируват VMax "Л К ,мкМ НАДН Умах Км,мкМ пируват VMax К .мкМ НАДН VMax, У.

0 700170 100 50 + 5 100 650+50 100 30±5 100

12. 5 550+50 95 43±5 95 37±5 90

25 420±40 75 420+50 58

33 360+40 56 30 + 5 60 300+50 48 39±5 56

50 260+30 45 200+50

63 180±20 28 90 ±50

пирувату, что отражено в снижении для обеих водорослей.

Сродство же к НАДН ЛДГ из D.salina и С.reinhardtii - изменяется незначительно. Поскольку для ЛДГ из мышцы свиньи (Сабурова, 19893 было показано, что сродство конкурентных к субстрату анионов повышается с уменьшением энергии гидратации аниона, то одной из пр>ичин увеличения срюдства пирувата к ЛДГ из водорослей при добавлении глицерина может быть изменение энергии гидратации пирувата при добавлении глицерина.

Значения V С табл. 13. полученные экстраполяцией кривых на графиках Лайнуивера-Берга, построены как функция вязкости в логарифмиуеских координатах и приведены на рис.2. Анализ экспериментальных данных показал, ■ что скорость реакции V_

является степенной функцией вязкости среды С гр

шах может быть

описана уравнением Крамерса О .

к=А r¡

.-<5 -Еа/кТ

з 1пп 1сПз1

Рис.2 Зависимость максимальной скорости реакции восстановления пирувата CV 3, катализи-мах

руёмой ЛДГ из разных по соле-толерантности организмов, от вязкости среды в двойных логарифмических координатах: 1-D.salina; 2- С.reinhardtii; 3-мышца свиньи; 0,1М Na-фосф. буфер, рН 7,5; 10 мМ пируват; 0,25 нМ НАДН;

экспериментальные параметры. Из наклона прямых Срис. 23 было определено значение показателя степени при вязкости- <5, которое составляет для ЛДГ из D. salina <5=0.42, из С. reinhardtii- <5=0.60, из мышц свиньи- <5=0. 90.

Действие вязких растворов на скорость реакции полностью обратимо Сразбавление реакционной смеси, содержащей глицерин, буфером приводит к соответствующему возрастанию скорости реакции}.

Таким образом, эффект влияния глицерина на активность ЛДГ

микроводорослей является сложным и представляет собой активацию

фермента через увеличение сродства к пирувату CKj^ уменьшается с

ростом концентрации глицерина} и его ингибирование через

уменьшение к Спадение V почти в два раза при содержании в кат мах

растворе 33У. глицерина}.

Эти данные показывают,■ что глицерин является действительно нейтральным осмолитом, т.е. незначительно влияет на кинетические характеристики фермента. Однако, нейтральность достигается путем компенсации эффектов с разным знаком Сувеличения К^ и снижения ^махЭ Сравнение кинетических данных у двух водорослей, различающихся галотолерантностью показывает, в условиях насыщения влияние глицерина минимально для галотолерантной D.salina. у которой "нейтральность" осмолита выражена наиболее ярко. 2.Влияние_глице£ина_на_£Н_зависимость_ак^ лей^

Для многих ферментов показано, что незначительные отклонения pH на 0.2-0.4 ед. в животных CMalan, 19В5) и растительных (Raven, 1990) клетках оказываются достаточными, чтобы изменить состояние связанности ферментов на мембранах или в энзиматических компартментах путем неспецифического изменения растворимости белков. Кроме того, величина pH влияет на ст^рическую конфигурацию активного центра и, соответственно, на гибкость данной конфигурации и, таким образом, изменяет величину сродства фермента к субстратам.

На рис.3 приведена зависимость от pH величины активности ЛДГ, определяемой по скорости восстановления пирувата в реакции , катализируемой ЛДГ, для фермента из D.salina (кривые 2,33 и

C.reinhardtii (кривая 1}. Активность фермента не менялась в диапазоне pH 5.4-8.0. Из pH-зависимости следует отметить значительные различия активности фермента в двух водорослях при рН>8. ЛДГ из

D.salina при рН>8 не стабильна. Для изучения npoueccá инактивации ЛДГ из D.salina при рН>8 были получены кинетические кривые "продукт-время". Зависимость скорости реакции от времени,

Рис.3 рН-зависимость начальной скорости реакции восстановления пирувата катализируемой ЛДГ из 1 -С.reinhardtii, 2- D.salina, 3-активность ЛДГ из D.salina в 25У. р-ре глицерина; О,1М Na-фосф.буфер, рН 7,5; 10 мМ пируват;О,25 мМ НАДН.

4 5 6 7 8 9 Ю

рН

полученной из касательных к кривым "продукт-время", хорошо апроксимировалась одной экспонентой с показателем степени, соответствующим константе скорости инактивации Ск Э при данном рН. Кин практически равна нулю в нейтральной области рН, где кривые "продукт-время" линейны, и резко увеличивается при рН>8. В присутствии 4.5 М глицерина при всех исследуемых значениях рН кин значительно ниже в глицерине, чем без глицерина.

Из этих данных следует, что глицерин особенно существенней для стабилизации фермента в клетках D.salina при повышении рН, которое может происходить при изменении внешних условий: освещенности, солевого стресса и т.д.

Изучение связывания субстратов Спирувата и НАДЮ при разных рН

показывает большое различие в рН зависимости сродства к субстратам у ЛДГ из разных микроводорослей Срис.4Э. Сродство ЛДГ к коферменту

резко снижалось с увеличением рН от 7.0 до 8.5 у D.salina Св 10 разЗ, и не изменялось у С.reinhardtii в диапазоне рН от 7.0 до 9.5. Сродство к пирувату менялось одинаково у обоих штаммов.

В результате проведенного анализа можно сделать основной вывод о том, что у галотолерантной водоросли D.salina а-статная регуляция активности ЛДГ осуществляется путем изменения сродства фермента к НАДН в области физиологически значимых значений рН 7.08.5, а не пирувата, как у С.reinhardtii и других организмов. 3.___Влияние__КС1__и__NaCl__на__ф е£Ментативн^ю__§КХ£5Н°£1Ь_ЛДГ_ИЗ_

Известно, что изменение концентрации солей во внешней среде

вызывает кроме накопления глицерина ССемененко, 1973Э, увеличение

концентрации КС1 в клетках галотолерантных микроводорослей с

последующим снижением ее до стационарного состояния. В связи с

этим исследована зависимость начальной скорости реакции

ферментативного восстановления пирувата от концентрации пирувата и

НАДН при различных концентрациях NaCl и КС1. Из Кривых

Лайнуивера-Берка раааитаны величины К^ и V х> как Функции

концентрации соли С таб.2}. В таблице приведены кинетические

характеристики ЛДГ в присутствии К.С1, поскольку значения К„ и V

п мах

не отличаются в растворах NaCl и КС1. Значения V„ax в0 всем исследованном диапазоне

Таблица2. Влияние KCl на кинетические параметры ЛДГ из D.salina и С.reinhardtii.

Лактатдегидрогеназа KD.C1~ по конк.

пируват НАДН

[KCl 3, М W К„,мМ Г1 ""мах'" с пир. с НАДН

0. salina 0 0.2 0.7 1.7 0.77+0 0.9610 1.56+0 1.9310 07 10 15 20 100 99 93 92 ' 0.03810. 0.07710 0.13 10 004 007 012 100 100 100 1.21 0.1 0. 721 0. 1

С. reinh. 0 0.7 1.7 0.65+0 1.85+0 3. 7 10 07 18 40 ' 100 100 100 0.03410 0.15 10 0.30 10 003 015 030 100 100 100 0. 431 0. 05 0. 281 0.05

концентраций KCl от 0 до 1.7 М меняются незначительно, тогда как сродство к пирувату и НАДН увеличивается у D.salina и С.reinhardtii. Из представленных данных следует, что соли NaCl и KCl являются конкурентными ингибиторами фермента у обеих микроводорослей. Анионы С1 конкурируют с пируватом и с НАДН в реакционном центре ЛДГ, что приводит к ингибированию активности фермента. Используя уравнение для конкурентного ингибирования,

ыли рассчитаны значения констант диссоциации СК^Э для иона С1 таб.25. Полученные значения К^ лежат в диапазоне физиологически эпустимых концентраций соли в клетке, но различаются по величине: ля D.salina значения К^ в'2 раза выше, чем для С.reinhardtii.

Полученные результаты свидетельствует о том, что ЛДГ из алотолерантной D.salina менее чувствительна к изменению энцентрации KCl, NaCl, чем С.reinhardtii.

■ _____а кхивации__

Проведено исследование влияния водных растворов глицерина на эрмодинамические параметры катализа, а также термодинамические зраметры активации процесса тепловой денатурации ЛДГ из D.salina С.reinhardtii. В этой части работы мы выполнили аналогичные гследования для ЛДГ из мышц свиньи с известной пространственной груктурой и аминокислотной последовательностью. На рис.5 эедставлена зависимость от температуры активности ЛДГ из ■salina, С.reinhardtii и из мышц свиньи. Фермент из D.salina, /нкционирующий in ^ivo при 4-5 М глицерина, является раименее габильным, т.е. имеет самый низкий температурный оптимум С31°СЭ.

100| 1 2

о 80-\

i 60-о

N

? 2<Н

Рис.5 Зависимость активности ЛДГ из 1-D.salina, 2-С.reinhardtii от Т°; 1'.2'- то же, что 1 , 2 +50'/. глиц. Величина VCT3 экстраполирована к нулевому моменту времени.

- 1 —'—. о

10 20 30 АО 50 60 ТС

>бавление глицерина в реакционную смесь уменьшало V в

таи

ютветствии со степенным законом от вязкости, но почти не влияло i величину Т

орт

Для интервала температуры от 8 до Т т этн кривые были

'строены в координатах Аррениуса для ЛДГ из D.salina, C.reinhard-

i и мышечного белка в присутствии глицерина и без глицерина. Y

ергия активации Е , рассчитаная из наклона этих кривых С табл. 35 изменяется с увеличением концентрации глицерина для ЛДГ из salina. Для ЛДГ из С.reinhardtii и из мышцы свиньи энергия тивации слегка увеличивается в присутствии глицерина.

ТАБЛИЦА 3.

г-*

Значения энергии активации реакции восстановления пирувата - Е

* 1

и энергии активации процесса денатурации ЛДГ - Е, полученные из температурной зависимости констант скоростей в растворах с разным содержанием глицерина.

Вид Глиц. * E^ катализа тепл. активация. СкДж/моль] Е*. [кДж/моль] тепловая денатурация Т опт °С

организма Ч (V/V) 4 Е*(НАДН) Е* (НАДН-пир )

D.salina 0 67 + 6 0 67 + 6 155 ± 15 168 ± 15 31

10 67 ± 6 0 84 + 8 31

50 67 ± 6 0 96 + 9 32

0 50 ± 5 0 218 + 20 231 ± 20 243 ± 20 50

С.rein- 10 55 ± 5 0 235 + 20 50

hardtii 50 59 ± 5 0 275 + 20 51

Pig 0 38 + 3 0 118 + 10 59

muse le 10 42 ± 4 0 246 + 20 60

50 50 + 5 0 294 + 20 61

Тепловая инактивация фермента при температурах выше Т

сопровождается разрушением вторичной структуры, что было показано методом кругового дихроизма СКДЭ в полосе пептидных групп для ЛДГ из мышцы свиньи С Сабурова,19905. Инактивация фермента при температуре выше Topt являлась необратимой для ЛДГ из всех трех исследованных объектов.

Прединкубация ЛДГ с коферментом НАДН значительно стабилизировало фермент из D.salina, снижая константу скорости инактивации почти в 10 раз:от 0.45 мин 1 до 0.037 мин 1 при 30°С. Длл ЛДГ из С.reinhardtii добавление к инкубационному раствору кофермента почти не изменяло стабильность фермента и только образование тройного комплекса увеличивало стабильность фермента ^кин уменьшалась от 0.14 мин 1 длл апофермента до 0.06 мин 1 для тройного комплекса}.

Как следует из данных по изучению тепловой инактивации, особенность фермента из D.salina состоит в том, что среди субстратов основным стабилизирующим фактором является кофермент

НАДН. В ЛДГ других организмов таким фактором является пируват в ,-НАДН

комплексе Е .

пир

При исследовании инактивации ЛДГ в широком интервале температур* от 0 до 70°С нами было обнаружено большое различие между скоростью инактивации ЛДГ в присутствии глицерина и без

глицерина при низких температурах: константа скорости К в 50И

о ^^

растворе гпицерина пр*и 0 С на 5 порядков ниже, чем Í' фериента в

гсутствии глицерина. Для ЛДГ из С.ге1пЬагсШ1 и мышц свиньи 50У. аствор глицерина также является стабилизатором ЛДГ при низких

гмпературах Срис.бЭ. Из этих данных гмпературах глицерин выполняет габилизатора.

2

D. salina

следует, что при низких роль конформационного

Рис.6 Зависимость логарифма константы скорости инактивации ЛДГ из микроводорослей :0.salina и C.rein-hardtii.H мышц свиньи от температуры;без глицерина открытые символы, в присутствии 50У. глицерина-заполненные символы.

3.7

10 /Т.К

Существенным результатом этих исследований является то, что :ривые Аррениуса, полученные в присутствии глицерина и без него |ересекаются примерно при одной температуре - около 50°С, для ЛДГ 13 всех изученных нами организмов Срис.бЭ. Из этих данных следует, (то при температурах ниже 50°С глицерин является стабилизатором ¡■ерментов к тепловой денатурации, и тем сильнее, чем ниже температура, а при Т>50°С скорость инактивации ЛДГ в водных эастворах глицерина увеличивается и глицерин уже выступает в сачестве денатурирующего фактора.

На основании вычисленных значений изменения свободной энергии активации процесса денатурации ДДВ# при 27^С в присутствии -лицерина сделан вывод о том, что стабилизирующий эффект глицерина з процессе тепловой денатурации ЛДГ

увеличивается в следующей % % %

последовательности AAG_ , < AAG_ < AAGr, ,

D.sal. С.rein. P.muscle

Исходя из литературных данных nc¡ влиянию глицерина на тепловую денатурацию глобулярных белков и сопоставляя индекс гидрофобности для ЛДГ, вычисленный нами по методу Бигелоу с величиной гидрофобности для других белков, можно сделать вывод, что ЛДГ из галотолерантной водоросли D.salina является наименее гидрофобным белком среди трех изучённых нами белков. Изменение AAG и Ег С таб. 33 для ЛДГ из D.salina при добавлении глицерина значительно меньше, чем для ЛДГ из негалофильной водоросли С. rein-

hardtii, н.тем более ЛДГ из мышц свиньи. На основании этих данных ножно предполагать, что более низкая гидрофобность фермента D.salina, функционирующего in vivo при высокой концентрации глицерина необходима для увеличе- ния конформационной подвижности фермента в присутствии глицерина.

5глице£ина_на_ст^^кт^£ные_изменения_ПБК_Ф

Известно, что глицерин, сахароза, некоторые соли и рН могут влиять на экстракцию мембранных белков, механизм которого.до конца не понят. Влияние полиолов на структурно-функциональную организацию ПБК ФСН D.salina было изучено в процессе экстракции ПБК ФСН тритоном Х-100 в присутствии глицерина или сахарозы.

Полипептидный состав полученной фракции был характерен для комплексов ФСН из высших растений и D.salina САллахвердиев и др. , 1993, Фалькович и др.,19953. Полипептидный состав и спектральные характеристики выделенной в присутствии глицерина ФСН значительно отличались от контроля. Электрофоретический анализ показал, что ПБК ФСН, экстрагированный в присутствии глицерина, содержит характерные для РЦ полипептиды с молекулярными массами 47, 43, 34, 32 и 10 кДа. В спектре поглощения Срис.7,кривая 33 отсутствовала

Fhc.7 Спектры поглощения препаратов ПБК, полученных: 13-со-любилизацией мембран D.salina с тритоном Х-100 23- тоже, что и 1 с добавкой 1 М NaCl,33- то же, что 2 с добавкой 4 И глицер 4)-то же, что 3, очищенного на фрактогеле DEAE 650 S.

характерная для Хл "в" полоса поглощения при 652 нм.

Фракционирование ФСН, выделенной в присутствии глицерина, 35 мМ раствором NaCl в MES-NaOH буфере с 0.05% тритоном приводило к злюи- рованию хлорофилл "а" связывающих белков с мол. массой 43. 47 кДа. Фракционирование ФСП 120 мМ раствором NaCl приводило к элюированию препарата, близкого по своим характеристикам к ПБК реакционного центра Срис. 7,кривая 33. Эти данные указывают, что в присутствии глицерина ССК ФСН не экстрагируется тритоном Х-100.

100 500 G0 0 700

ДЛИНА ВОЛНЫ, НМ

¡ероятно, в нативном состоянии в присутствий глицерина величивается прочность связи ПЕК с мембраной у галотолерантной икроводоросли D.salina.

Влияние глицерина на структуру ПЕК ФСИ исследовали с помощью 1лектрофоретического разделения комплекса на составляющие омпоненты в присутствии глицерина (рис.85. Присутствие глицерина i ПААГ приводило к изменению электрофоретической подвижности олипептидов Спунктирная криваяЭ. Полученные данные

1лектрофоретического анализа ПБК ФСН в присутствии глицерина южет указывать, что глицерин влияет также на структуру РЦ появление полос З'.З'О.

Рис.8 Дерифат- .гктрофорез препарата РЦ ФСИ в присутствии СбЭ и без Caí 1 М глицерина в ПААГ. 1-низкомолекулярные белки, 2- белки 43 и 47 кДа, З.З'.З"-белки РЦ ФСН. Условия: 77..ПААГ, температура 4^С.

ДЛИНА ГЕЛЯ, НИ

Такое специфическое влияние глицерина Сили сахарозьО на РЦН Д1-Д2-цитохром В^д^З можно было бы объяснить ассоциацией- ПБК с 1изкомолекулярными пептидами в прис-- "ствии глицерина Сподвижность голос З'.З'" меньше чем юдтверждается исследованиями рис.93. В присутствии 4 М |аксимумами флуоресценции при

а

ГС UJ

(X. §

о

пс ы 33. Это предположение спектров флуоресценции РЦ II глицерина появляются полосы с 64В, 660, 678, 690 и 710 нм,

Рис.9 Влияние глицерина на спектры флуоресценции РЦН. 1-контроль,2-в присутствии 4М глицерина, 3- к 2 прибавлен 0.057. раствор тритона. Х=450 нм

600 650 700 750

ДЛИНА ВОЛНЫ, НМ

3

2

1

□

которые исчезают при добавлении 0.057. раствора тритона Х-100. Максимум флуоресценции РЦ II в контроле Сбез глицерина} лежит в области 67В нм. Этот эффект можно объяснить образованием ассоциатов ПБК в присутствии глицерина и обратимой диссоциацией их в 0.05'/. раствора тритона Х-100.

Таким образом, полученные нами данные,- вероятно, свидетельствуют о влиянии высоких концентраций глицерина на стабильность связанных с мембранами ПБК через гидрофобные взаимодействия между белками ПБК. что приводит к устойчивости мембранных белков к диссоциации. Вероятно глицерин и его накопление в условиях стресса у микроводо- рослей D.salina играет существенную роль в функционировании ФСП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Исследование функционирования ЛДГ показало меньшую конформационную стабильность белков галотолерантных водорослей по сравнению с гликофильными. Способность белков к сохранению стабильности в присутствии осмолитов, вероятно, обеспечивает возможность адаптации клеток к изменению условий среды, которое часто сопровождается накоплением у галофитов глицерина. Эти отличительные свойства могут способствовать сохранению фотосинтетической активности хлоропласта и поддержанию гомеостаза клетки у галотолерантных микроводорослей в условиях стресса, т.е. при больших изменениях концентрации глицерина в клетке. Полученные данные позволяют предполагать, что основным механизмом влияния глицерина на структурную и функциональную организацию клетки является изменение гидрофобных взаимодействий белков.

ВЫВОДЫ.

1.Сравнительное исследование влияния осмолитов на кинетические характеристики ЛДГ из галотолерантной водоросли D.salina и гликофильной водоросли С.reinhardtii показало, что клетки галотолерантных микроводорослей способны сохранять метаболизм и гомеостаз при высоких внутриклеточных концентрациях глицерина путем изменения каталитических констант ферментов на стадии связывания субстратов и относительной стабилизации на Стадии

конформационных превращений.

2. Анионы нейтральных солей NaCl и KCl являются ингибиторами ЛДГ, конкурентными пирувату и НАДН и имеют разное сродство к пируват- и НАДН- связывающим центрам фермента. Глицерин нейтрализует действие солей увеличивая сродство ЛДГ к пирувату.

3. Изучение связывания субстратов Спирувата и НАДЮ с ЛДГ при 1зных рН приводит к заключению, что а-статная регуляция фермента

клетках О,salina осуществляется с помощью изменения сродства к кДН, а не пирувата, как у С.reinhardtii и других организмов, чицерин в клетках галотолерантной микроводоросли предотвращает (активацию фермента при увеличении рН.

4. ЛДГ D.salina имеет более низкий температурный оптимум C31°C3 :тявности и менее выраженную зависимость от концентрации шцерина энергии активации ферментативной реакции и ■рмодинамических параметров тепловой денатурации по сравнению с

reinhardtii. Меньшая зависимость термодинамических характеристик 1Г клеток D. salina к изменениям концентрации внутриклеточного шцерина определяет более высокие адаптивные возможности этого >ганизма в среде с повышенной кЬнцентрацией соли.

5. Установлено, что солюбилиэация ПБК из D.salina зависит от >держания полиолов в среде выделения. В присутствии глицерина и [харозы прочность связи ССК ОСИ с мембранами хлоропласта >еличивается.

в. Комплексные исследования кинетических, термодинамических и (ектрофоретических характеристик белков в присутствии глицерина >зволяют сделать вывод о корреляции между солеустойчивостью >дорослей и стабильностью цитоплазматических и мембраносвязанных >лков к действию глицерина.

1ИС0К ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Сабурова Е.А., Симонова Н.Б., Пронина H.A., Фолькович Т.Н., Семененко В.Е. "Влияние вязкости на функциональные свойства лактатдегиДрогеназы из Dunaliella salina. "-ДАН, 1992, т.325, с.1239-1264. •

2. Симонова Н.Б., Сабурова Е.А., Трошина О.Ю., Семененко В.Е. "Влияние вязкости на функциональные свойства лактатдегидро-

геназы из одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii" -ДАН,1993,т.332,с.378-381.

3. Симонова Н.Б., Сабурова Е.А., Пронина H.A. и др. "Исследование молекулярных механизмов адаптации экстремально -галофильных микроводорослей к изменению солевой среды" -Сб. тезисов 111 съезда Всероссийского общества физиологов растений , Санкт-Петербург,1993,с.722

4. Симонова Н.Б., Сабурова Е.А "Лактатдегидрогеназа из Dunaliella salina и Chlamydomonas reinhardtii. Сравнительное исследование. Функция и стабильность."- Сб. тезисов конф. "Биосинтез ферментов микроорганизмами", Москва,1993,с.99

5. Симонова Н.Б, Сабурова Н.Б., Фалькович Т.Н., Семененко В.Е. "Кинетика и стабильность ЛДГ из двух видов водорослей, живущих в среде с разным содержанием соли: Dunaliella и Chlamydomonas. PH-зависимость." -ДАН, 1974, т.334, с.116-119.

6. Симонова Н.Б., Сабурова Е.А., Пронина H.A., Фалькович Т.Н., Семененко В.Е. "ЛДГ из микроводорослей:галофильной Dunaliel-ла и негалофильной Chlamydomonas. Функция и стабильность."-Прикл. биохиния и микробиология, 1996. в печати.

7. Симонова Н.Б., Сабурова Е.А., Ширшикова Г. Н. , Елфимова Л.Ц.. Пронина H.A., Фалькович Т.Н., Семененко В.Е. "Тепловая стабильность ЛДГ из халофильной водоросли Dunaliela salina

и негалофильной Chlamydomonas reinhardtii в водных растворах глицерина. "- ДАН. 1995, т.345, N.4, стр.. 549-554.

8. Христин М.С., Симонова Н.Б."Влияние полиолов на селективную солюбилизацию и структурные изменения пигмент-белковых комплексов ФСП из мембран галофильной водоросли Dunaliella salina." -Биологические мембраны, 1995,. в печати

9. Сабурова Е. А. , Симонова Н.Б и др. "Полиоя-белковые взаимо-ствия. Стабилизация лактатдегидрогеназы из галофильных водорослей Dunaliella salina глицерином" Сб. тезисов конф. Физико-химические основы физиологии растений". Пенза, 1996