Влияние экспрессии гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов в трансгенных растениях томата (Solanum lycopersicum L.) на повышение их устойчивости к фитопатогенам

Халилуев, Марат Рушанович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние экспрессии гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов в трансгенных растениях томата (Solanum lycopersicum L.) на повышение их устойчивости к фитопатогенам
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Влияние экспрессии гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов в трансгенных растениях томата (Solanum lycopersicum L.) на повышение их устойчивости к фитопатогенам"

На правах рукописи

ХАЛИЛУЕВ МАРАТ РУШАНОВИЧ

Влияние экспрессии гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеии-подобных антимикробных пептидов в трансгенных растениях томата (Solatium lycopersicum L.) на повышение их устойчивости к

фитопатогенам

Специальность 03.01.06. - биотехнология (в том числе бионанотехнология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 6 МАЙ 2011

Москва - 2011

4848133

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии растений Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИСБ РАСХН).

Научный руководитель: кандидат сельскохозяйственных наук

Сергей Владимирович Долгов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Александр Александрович Соловьев,

доктор биологических наук Илья Александрович Шилов.

Ведущая организация: Институт общей генетики

имени Н.И. Вавилова РАН.

Защита состоится « » _2011 г. в " » часов на

заседании диссертационного совета Д.006.027.01 при ГНУ Всероссийского НИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42.

Тел.: 8 (499) 977 6544; Факс: 8 (499) 977 0947; e-mail: iab@iab.ac.ru Автореферат разослан «_» мая 2011 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийского НИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Ученый секретарь диссертационного совета:

А кандидат биологических наук

' Светлана Александровна Меликова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Томат (Solatium lycopersicum L.) является одной из важнейших продовольственных культур, занимающих первое место среди продуктов овощеводства как по своему значению, так и по объему производства. По данным ФАО, в 2009 г. томат в России промышленно выращивался на площади 117 тыс. га, а валовой сбор товарной продукции составил около 2,2 млн. т. Высокий спрос на эту культуру обуславливает непрерывное совершенствование сортимента, что, в свою очередь, требует постоянного улучшения целого ряда хозяйственно-ценных признаков и может быть достигнуто как традиционной селекцией, так и методами генетической инженерии. Применение трансгенных форм томата может существенно повысить окупаемость сельскохозяйственного производства, резко сократить загрязнение окружающей среды пестицидами, а также, во многих случаях, реализовать потенциальную урожайность культуры.

Устойчивость к биотическим стрессам и, в частности, к грибным и бактериальным патогенам - одно из приоритетных требований, предъявляемых к современным сортам и гибридам томата. Несмотря на достигнутые успехи в получении генотипов с повышенной устойчивостью к отдельным болезням, проблема комплексной устойчивости к неблагоприятным факторам биотической природы по-прежнему остается неразрешенной. Это относится также и к наиболее опасным болезням, таким как фитофтороз.

Прямые потери урожая томата от фитофтороза в годы эпифитотии составляют больше, чем от всех других болезней вместе взятых и в полевых условиях достигают 100%. Фитофтороз приносит значительные экономические убытки в России, особенно в ее Средней полосе, где потери достигают критических величин, а также во многих странах Европы и США. Одной из приоритетных возможностей противостояния фитофторозу томата является получение и последующее промышленное выращивание устойчивых сортов.

В последние десятилетия для повышения устойчивости растений томата к фитопатогенам все более широкое применение находят методы генетической инженерии. Этому способствовал прогресс в частичном установлении молекулярной природы защитных механизмов, обеспечив возможность разработки новых стратегий борьбы с заболеваниями в дополнение к существующим традиционным подходам. Одной из них является привнесение в геном томата чужеродных генов, кодирующих защитные PR-белки и

антимикробные пептиды (Broekaert et al., 1997; Edreva et al., 2005; Van Loon et al., 2006).

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось получение трансгенных растений томата (Solatium lycopersicum L.), содержащих гены PR-4 семейства хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов, и оценка влияния экспрессии гетерологичных генов на устойчивость к фитопатогенам.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) получение трансгенных растений томата селекционной линии ЯЛФ с генами хитинсвязывающих белков из растений рода Amaranthus и гевеин-подобных антимикробных пептидов из Stellaria media L.;

2) оценка экспрессии гетерологичных генов в полученных трансгенных растениях томата селекционной линии ЯЛФ и изучение ее влияния на устойчивость к возбудителю фитофтороза;

3) изучение характера наследования селективного гена в потомстве трансгенных растений томата селекционной линии ЯЛФ;

4) разработка методики эффективной регенерации и генетической трансформации растений из различных типов эксплантов томата промышленного сорта Рекордсмен.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые получены трансгенные растения томата, содержащие гены PR-4 семейства хитинсвязывающих белков из растений рода Amaranthus (A. caudatus L. и A. retroflexus L.), а также гевеин-подобных антимикробных пептидов из Stellaria media L. Впервые продемонстрировано влияние экспрессии гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов в трансгенных растениях томата на повышение устойчивости к оомицету Phytophtora infestans (Mont.) de Вагу. В результате проведенных экспериментов разработана система эффективной регенерации растений из различных типов эксплантов томата промышленного сорта Рекордсмен с частотой более 85%. Методом агробактериальной трансформации получены растения томата сорта Рекордсмен, экспрессирующие репортерный ген gfp. Полученные экспериментальные данные являются основой для проведения фундаментальных исследований в области изучения механизмов действия белков PR-4 семейства и гевеин-подобных антимикробных пептидов в защитных реакциях растений против фитопатогенов, а также использования

вышеперечисленных генов для повышения устойчивости к биотическим стрессам генно-инженерными методами промышленных сортов томата и других представителей рода Solatium.

Апробация работы. Результаты исследований представлены на VII, IX и XI молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеренарии» (2007, 2009, 2011), III Всероссийском симпозиуме «Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности» (2010), Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, входящих в перечень научных изданий, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка используемой литературы. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 21 рисунок. Библиографический список включает 286 источников, из них 259 на иностранном языке.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Растительный материал. В качестве растительного материала для экспериментов использовали следующие образцы томата: селекционную линию ЯЛФ и промышленный сорт Рекордсмен. Для введения томата в культуру in vitro использовали семена. Стерилизованные семена помещали в культуральные сосуды с питательной средой MS (Murashige and Skoog, 1962), дополненной 30 г/л сахарозы и 7 г/л агара. Донорные растения и экспланты культивировали при температуре 23-25°С, освещенности 2500 люкс и фотопериоде 16/8 часов (день/ночь).

Штаммы Agrobacterium tumefaciens и бинарные векторы. Для проведения экспериментов по генетической трансформации томата применяли следующие обезоруженные супервирулентные штаммы Agrobacterium tumefaciens:

1)СВЕ21 (Ревенкова и др., 1993) с бинарными векторами pBINmGFP5ER, рВП21ас и pR830;

2) AGLO с бинарными векторами рВ-АМР1 и рВ-АМР2 .

В состав Т-ДНК бинарного вектора pBINmGFP5ER входит оптимизированный для экспрессии в растениях ген gfp, содержащий N-концевой сигнальный пептид хитиназы Arabidopsis thaliana и С-концевой пептид HDEL, обеспечивающие локализацию продукта в эндоплазматическом ретикулуме.

Бинарные векторы рВ1121ас и pR830 содержат соответственно хитинсвязывающий ген ас из Amaranthus caudatus L. и гибридный ген RS-intron-Shir, кодирующий сигнальную последовательность и первые шесть аминокислот дефензина редьки (Rs) с интроном, а также хитинсвязывающий белок из Amaranthus retrojlexus L. (Shir).

Бинарный вектор рВ-АМР2 содержит ген атр2, кодирующий лидерный пептид, два гевеин-подобных антимикробных пептида (SmAMPl и SmAMP2), разделённых спейсером, и С-концевую часть из звездчатки (Stellaria media L.). В отличие от рВ-АМР2, несущего полную копию кДНК гена звездчатки, рВ-АМР1 содержит ген ampl, кодирующий только лидерную последовательность и один из антимикробных пептидов (SmAMPl).

Все целевые гены находились под контролем сильного конститутивного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV35S). Для отбора трансгенных растений векторные конструкции содержали селективный ген nptll, обуславливающий устойчивость к антибиотику канамицину.

Бинарные векторы с генами хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов сконструированы во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной биотехнологии и любезно предоставлены А.А. Гулевичем (рВ1121ас), В.Г. Луниным (pR830) и А.В. Бабаковым (рВ-АМР1, рВ-АМР2).

Регенерация побегов томата. Ранее сотрудниками лаборатории генной инженерии растений ГНУ ВНИИСБ РАСХН (И.В. Корнеевой, Е.В. Парашиной) были проведены исследования, позволившие оценить регенерационную способность селекционной линии ЯЛФ томата. Было установлено, что оптимальной средой для регенерации побегов томата из семядолей является среда MS, содержащая 5,0 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л ИУК.

Для изучения регенерационной способности томата сорта Рекордсмен в качестве эксплантов использовали семядоли и сегменты гипокотилей длиной 7-10 мм, полученные от асептически выращенных 10-12 дневных проростков.

Индукцию органогенеза побегов осуществляли как на базовой питательной среде, составленной по прописи MS (MS0), так и на средах с добавлением различных типов и концентраций регуляторов роста (MS,-MSi5) (табл. 1).

Таблица 1.

Состав питательных сред MS для индукции регенерации побегов томата сорта

Рекордсмен.

Вариант Вид и концентрация регулятора роста, мг/л

зеатин 6-БАП ИУК НУК

MS0 - - - -

MS, 1,0 - 0,1 -

MS2 1,0 - 0,2 -

MS3 1,0 - 0,5 -

MS4 1,0 - - од

MS5 1,0 - 0,5

MS6 2,0 - 0,1 -

MS7 2,0 - - од

MS8 3,0 - 0,1 -

MS, 4,0 - 0,1 -

MSio 5,0 - од -

MS,, - 5,0 0,1 -

MS,2 - 5,0 - од

MS,3 - 2,5 0,1 -

MS ,4 - 2,5 - од

MS,5 1,0 2,5 0,1 -

Культивирование эксплантов проводили на чашках Петри, которые содержали 30 мл среды. Каждый вариант опыта включал 3 повторности, количество эксплантов составляло 10 штук в каждой повторности.

Оценку эффективности морфогенеза побегов проводили после 45 дней культивирования эксплантов по показателю частоты каллусообразования и регенерации побегов, количеству регенерантов, полученных от одного экспланта, а также по их морфометрической характеристике.

Агробактериальная трансформация томата. Эксперименты по трансформации растений томата проводили методом кокультивации эксплантов с суспензией агробактерии. Ночную культуру агробактерии наращивали в 20 мл неагаризованной среды LB (Sambrook et. al, 1989), дополненной соответствующими селективными антибиотиками, на качалке (180 мин"1) в течение 24 часов при 26°С в темноте. В экспериментах по трансформации использовали экспланты 10-12 дневных проростков. За трое суток до инфицирования их помещали на агаризованную питательную среду для

прекультивации. В случае использования семядолей перед инокуляцией у эксплантов отсекали небольшую часть у основания и верхушки, а на абаксиальную поверхность наносили 2-5 поперечных надсечек. Экспланты переносили в подготовленную бактериальную суспензию (OD6oo=0,4-0,6) и, периодически перемешивая, выдерживали в течение 30 мин. Подсушенные на воздухе экспланты переносили на бумажные фильтры, помещённые на поверхность чашки Петри со средой MS, и кокультивировали в темноте при температуре 18 °С в течение 48 часов. После периода кокультивации экспланты отмывали неагаризованной средой MS с добавлением 300 мг/л тиментина (тикарциллин + клавулановая кислота) и переносили на питательную среду для элиминации агробактерии, содержащую регуляторы роста в оптимальных концентрациях. В последующих пассажах для отбора трансгенного каллуса в состав питательной среды вводили селективный антибиотик канамицин в концентрации от 10 до 25 мг/л. Длительность каждого пассажа составляла 15 дней. По достижении регенерирующими предположительно трансгенными побегами размера 1,5 см их отделяли от каллусной ткани и переносили на среду для ризогенеза, содержащую Уг дозы макросолей от прописи MS, 2% сахарозы, 0,7% агара, 0,2 мг/л ИМК и канамицин в концентрации 50 и 100 мг/л.

Молекулярно-генетический анализ трансгенных растений томатов. Для

экстракции тотальной геномной ДНК томата использовали листья растений in vitro. Выделение проводили по модифицированной методике Edwards с соавторами (Edwards et al., 1991) с дополнительной экстракцией фенолом.

Подтверждение интеграции чужеродных генов проводили с помощью ПЦР-анализа. Реакционная смесь общим объемом 25 мкл состояла из следующих компонентов: по 2,5 тМ каждого из четырех дезоксирибонуклеотидов, 1мкл Гад-полимеразы с активностью 5 ед/мкл, 10 пмоль прямого и обратного праймеров, 2,5 мкл 10х ПЦР-буфера для Гад-полимеразы, 3 мкл ДНК и стерильной бидистиллированной воды.

Интеграцию в растительный геном селективного гена nptH определяли при помощи праймеров 5'-CGCGGGTTTCTGGAGTTTAATGAGCTAAG-3' и 5'-GCATGCGCGCCTTGAGCCTGG-3'. Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента - 742 п.н.

Интеграцию в растительный геном репортерного гена gfp определяли при помощи праймеров 5 '-GGACGACGGGAACTACAAGA-3' и

5'CATGCCATGTGTAATCCCAG-3'. Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента - 397 п.н.

Для идентификации присутствия гена ас использовали праймеры к последовательности промотора CaMV35S (5-

CTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCC-3') и целевого гена (5'-TTGAACACATTCACCAACTCCCATAGAT-3'). Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента - 300 п.н.

Для амплификации последовательности гена Rs-intron-Shir использовали олигонуклеотиды на лидерную часть гибридного гена (5'-CTCTCTTCTAGAATGGCTAAGTTTGCTTCTATCGTC-3') и терминатора pA35S (5'-TGTCACTGGATTTTGGTTTTAGGAA-3'). Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента - 1050 п.н.

Интеграцию генов антимикробных пептидов определяли при помощи пары праймеров 5'-ТС АТТСС ATAG ACTTGTTTATG А-3' и 5'-

CTTACATACAAAAGCTAGTCAC-3'. Размеры амплифицируемых фрагментов у образцов, трансформированных конструкцией рВ-АМР1 и рВ-АМР2, составляют соответственно 445 и 765 п.н.

Для амплификации фрагмента бактериального гена virB использовали пару праймеров 5'-GGCTACATCGAAGATCGTATGAATG-3' и 5'-GACTATAGCGATGGTTACGATGTTGAC-3'. Длина амплифицируемого фрагмента - 670 п.н.

Анализ экспрессии генов проводили с помощью метода ОТ-ПЦР. Выделение РНК проводили с использованием набора реагентов RNA-ExtraSorb (лаборатория молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ГНУ ВНИИСБ РАСХН) в соответствии с протоколом изготовителя. Синтез кДНК осуществляли в стандартных условиях (Маниатис и др., 1984) с использованием шестичленных случайных праймеров (Синтол, Россия) (метода рассеянной затравки). В качестве контроля был использован ген актина томата Тот52 (NCBI, U60482). Для его амплификации использовали пару праймеров 5'-GCCAGGTATTGTGCTGGACT-3' и 5'-ATCAGCAATACCAGGGAACA-3'. Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента - 450 п.н.

Для оценки экспрессии гена ас использовали пару праймеров 5'-GCGAGCTCGGTACCCCCGAA-3' и 5'-ACCTGGACTACCAGCACCAGCA-3'. Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента - 298 п.н.

Экспрессию на транскрипционном уровне гена Rs-intron-Shir определяли с помощью специфических праймеров 5'- CGCCCTTCTCTTCGCTGCTCT-3' и

5'-TGCCAGATGGGCATCTACCT-3\ Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента - 120 п.н.

Экспрессию генов ampl и атр2 определяли с использование праймеров, приведенных выше.

Визуализацию продуктов амплификации проводили методом электрофореза в агарозном геле с концентрацией 1% в 1х ТАЕ буфере с добавлением этидиум бромида. Размеры амплифицированных фрагментов определяли с помощью маркера FastRuler™ Low Range DNA ladder и GeneRuler™100 bp Plus DNA ladder (Fermentas, Литва).

Флуориметрический анализ активности GFP. Детекцию экспрессии гена gfp проводили под флуорисцентным микроскопом Leica MZ FLIII (Leica Microsystems, Германия), укомплектованным барьерными фильтрами, имеющими X = 450-490 нм (длина волны возбуждения) и X = 515-550 нм (длина волны экстинкции белка GFP).

Адаптация трансгенных регенерантов к условиям in vivo. Укорененные in vitro побеги отмывали от остатков агаризованной среды и высаживали в смесь торфа и песка (3:1). Адаптацию и последующее выращивание трансгенных растений проводили в теплице станции искусственного климата «Биотрон» ФИБХ РАН со следующими условиями: температура в пределах 22-25 °С днем и 18-19°С ночью, влажность 60-70%, освещенность 2500 люкс.

Лабораторная оценка устойчивости трансгенных растений томата к Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу. Лабораторную оценку устойчивости к фитофторозу проводили методом искусственного заражения отделенных сегментов листьев томата, полученных от взрослых вегетирующих Т0-растений, выращенных в условиях защищенного грунта. Инокуляцию осуществляли зооспорангиями (5000 шт./мл суспензии) 10-суточной культурой трех изолятов Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу, два из которых были выделены из плодов (ТПМ) и листьев (ТЛЗ) томата, а третий - из листьев картофеля сорта Ильинский (ИКЗ). Инфекционные капли объемом 50 мкл наносили на адаксиальную поверхность сегментов листа, помещенных в чашку Петри на фильтровальную бумагу, увлажненную раствором кинетина (10 мг/л). Чашки Петри помещали в климокамеру с оптимальной температурой для развития патогена (19-21°С). Через 24 часа после инокуляции остатки суспензии удаляли фильтровальной бумагой, а сегменты листа помещали абаксиальной стороной

вверх. Оценку развития инфекции осуществляли на 7 сутки после заражения по размеру инфекционного пятна (см2), а также наличию и интенсивности спороношения (балл). Опыт проводили в трехкратной повторности, каждая из которой содержала три сегмента листа.

Наследование селективного гена в поколении Tj томата. Отбор трансгенных растений в потомстве томата проводили по признаку устойчивости к канамицину (экспрессии гена nptll). Семена, полученные в результате самоопыления, вводили в культуру in vitro и помещали на питательную среду MS, содержащую 150 мг/л канамицина. Оценку результатов проводили после 4 недель селекции.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Агробактериальная трансформация томата селекционной линии

ЯЛФ бинарными векторами, содержащими гены хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов.

Ранее сотрудниками лаборатории генной инженерии растений ВНИИСБ разработана система агробактериальной трансформации селекционной линии ЯЛФ при использовании эксплантов семядолей (Корнеева и др., 2005). Установлено, что генотип обладает высокой отзывчивостью к интеграции чужеродных генов (Долгов и др., 2008; Komeeva et al., 2008).

Одним из основных этапов генетической трансформации является эффективная доставка векторных конструкций в клетки-мишени, компетентные к регенерации растений. Многочисленными исследованиями показано, что при проведении процедуры трансформации и последующем культивировании трансформированной ткани регенерационная способность существенно снижается. До настоящего времени неоднозначным является выбор системы селекции трансгенной ткани. С одной стороны, использование высоких концентраций селективных агентов сразу с первых этапов культивирования позволяет проводить жесткий отбор трансгенной ткани и с высокой вероятностью избавляться от эскейпов. С другой стороны, сильное стрессовое воздействие селективных агентов и высокая к ним чувствительность эксплантов томата влечет за собой существенную потерю морфогенетического потенциала в результате ингибирования закладки регенерационных зон даже у трансгенных клеток (Дрейпер и др., 1991). В связи с этим, в исследовании была

использована стратегия постепенной адаптации эксплантов к селективному агенту, исключающая их шок и массовую гибель (первый пассаж без канамицина, второй - 10 мг/л, третий и последующие - 25 мг/л).

За трое суток до инфицирования бактериальной суспензией экспланты семядолей помещали на среду для прекультивации, в результате чего происходило увеличение эксплантов в размере.

После инфицирования бактериальной суспензией и этапа кокультивации экспланты переносили на среду для каллусообразования и регенерации, в результате чего в конце пассажа по краям срезов и в местах поранений наблюдалось формирование светлой плотной каллусной ткани. Отмечено, что экспланты, трансформированные бинарными векторами с генами хитинсвязывающих белков ас и Rs-intron-Shir, отличались меньшей способностью к формированию каллуса по сравнению с семядолями, трансформированными рВ-АМР1 и рВ-АМР2 (табл. 2).

Таблица 2.

Эффективность каллусообразования и селекции эксплантов семядолей при трансформации генетическими конструкциями, содержащими гены хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов.

Бинарный вектор Количество эксплантов

общее образовавших каллус погибших прошедших селекцию

шт. % шт. % от бактерии от канамицина шт. %

шт. % шт. %

рВ1121ас 90 100 58 64,4 19 21,1 65 72,2 6 6,7

pR830 120 100 69 57,5 7 5,8 103 85,8 10 8,4

рВАМР2 125 100 109 87,2 38 30,4 70 56,0 17 13,6

pBAMPl 115 100 96 83,5 30 26,1 72 62,6 13 11,3

Несмотря на относительную легкость получения каллусных тканей, регенерация из них полноценных трансгенных побегов оказалась более трудной задачей. После переноса эксплантов на питательную среду с добавлением 10 мг/л селективного антибиотика происходило снижение интенсивности нарастания каллусных тканей, их частичная некротизация, причем степень ее значительно усиливалась при возрастании концентрации канамицина в последующих пассажах. Побеги, регенерировавшие на ранних этапах культивирования, впоследствии проявляли признаки хлороза и не были

трансгенными. В то же время на образовавшейся каллусной ткани некоторых эксплантов происходило формирование плотных зелёных глобулярных меристематически активных участков, не проявляющих признаков отрицательного воздействия селективного агента и интенсивно нарастающих на среде, содержащей канамицин в концентрации, сублетальной для нетрансгенной ткани (25 мг/л). Тем не менее, высокая чувствительность эксплантов и каллуса к селективному антибиотику являлась причиной гибели большей части растительной ткани, которая в зависимости от генетической конструкции составила от 56,0 до 85,8%. Кроме того, во всех экспериментах наблюдалась бактериальная контаминация части эксплантов, которая также служила причиной исключения их из дальнейшего культивирования.

Вынужденное длительное культивирование растительных тканей на питательных средах с целью получения регенерантов, устойчивых к канамицину, способствовало постепенному накоплению веществ токсического действия (фенольных соединений), что приводило к формированию растений с измененной морфологией. Наблюдались такие нежелательные эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование витрифицированных побегов и, как следствие, уменьшение или полная потеря их способности к укоренению.

В результате экспериментов по генетической трансформации бинарными векторами pBI121ac, pR830, рВ-АМР2 и рВ-АМР1 получено соответственно 6, 10, 17 и 13 независимых линий, интенсивно и полноценно развивающихся из каллусной ткани.

Для подтверждения интеграции целевого и маркерного генов в геном томата был проведен ПЦР-анализ. При амплификации с использованием специфических праймеров на последовательность гена nptll были получены фрагменты, соответствующие положительному контролю во всех случаях (рис. 1А, 2А). Интеграция целевых генов ас, Rs-intron-Shir (рис. 1Б) и атр! (рис. 2Б), как и в случае маркерного гена, показана во всех проанализированных образцах. Полноразмерная копия кДНК гена Stellaria media L., интегрированная в геном томата при трансформации бинарным вектором рВ-АМР2, отмечена только у 11 из 17 независимо регенерированных побегов.

Кроме того, у всех изученных образцов была проведена проверка препаратов тотальной ДНК на отсутствие бактериального гена virB с целью исключения ложноположительных результатов вследствие бактериальной

контаминации, агробактерии.

Все проанализированные образцы были свободны от

■«-742 п.и.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

«-1050 п.н.

Рисунок 1. Электрофореграмма продукта амплификации геномной ДНК регенерантов томата, трансформированных конструкциями с генами хитинсвязывающих белков, на наличие фрагментов маркерного (А) и целевых (Б) генов при помощи ПЦР-анализа: 1 - молекулярный маркер GeneRuler™100 bp Plus DNA ladder; 2 - вода; 3 - отрицательный контроль (дикий тип); 4-9 - регенеранты томата, трансформированные конструкцией рВН21ас; 11-20 - регенеранты томата, трансформированные конструкцией pR830; 10, 21 - положительный контроль (плазмиды рВ1121ас и pR830).

1 г 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1617 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Рисунок 2. Электрофореграмма продукта амплификации геномной ДНК регенерантов томата, трансформированных конструкциями с генами гевеин-подобных антимикробных пептидов, на наличие фрагментов маркерного (А) и целевых (Б) генов при помощи ПЦР-анализа: 1 - молекулярный маркер GeneRuler™ 100 bp Plus DNA ladder; 2 - вода; 3 - отрицательный контроль (дикий тип); 4-16 - регенеранты томата, трансформированные конструкцией рВ-АМР1; 18-34 - регенеранты томата, трансформированные конструкцией рВ-АМР2; 17, 35 - положительный контроль (плазмиды рВ-АМР1и рВ-АМР2).

Таким образом, эффективность трансформации по целевому гену при использовании векторных конструкций pBI121ac, pR830, рВ-АМР2 и рВ-АМР1 составила соответственно 6,7; 8,4; 8,8 и 11,3%.

Анализ экспрессии целевых генов у трансгенных растений проводили методом ОТ-ПЦР. Поскольку РНК значительно менее стабильна, чем ДНК, необходимым условием при проведении ОТ-ПЦР-анализа является использование так называемого внутреннего маркера, в частности, гена актина

для подтверждения сохранности РНК и синтезированной на её основе кДНК. При амплификации со специфическими праймерами на последовательность гена Тот 52 на электрофореграмме детектировались фрагменты соответствующего размера (450 п.о.) у всех изученных образцов (рис Зв, г, рис 4в, г).

1 2 а 3 4 5 6 7 8 9 10

23 24 В 25 26 27 28 24 30 31 32

«-298 п.н.

33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 Г

Рисунок 3. Анализ экспрессии генов, кодирующих хитинсвязывающие белки (ас - а; RS-mtron-Shir - б) и актин (Тот 52) (в, г), в трансгенных растениях томата методом ОТ-ПЦР: 1, 11, 23, 33 - молекулярный маркер FastRuler™ Low Range DNA ladder; 2, 12, 24, 34 - вода; 3, 13, 25, 35 - отрицательный контроль (нетрансгенное растение); 4-9, 26-31 - трансгенные растения, содержащие ген ас (соответственно линии 105, 106, 224, 250, 506, 702); 10, 32 - положительный контроль (плазмида рВ1121ас); 14-21, 36-43 - трансгенные растения, содержащие ген RS-intron-Shir (соответственно линии 3/1 lb, 5/12, 6/11, 7/12, 8/14, 8/25, 12/11, 12/32); 22, 44 - положительный контроль (плазмида pR830).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 П 12 13 14 а . _ — _ ~ т{ 1

29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 в

Рисунок 4. Анализ экспрессии генов, кодирующих гевеин-подобные антимикробные пептиды (ampl - а; атр2 - б) и актин (Тот 52) (в, г), в трансгенных растениях томата методом ОТ-ПЦР: 1,15, 29, 43 - молекулярный маркер FastRuler™ Low Range DNA ladder; 2, 16, 30, 44 - вода; 3, 17, 31, 45 - отрицательный контроль (нетрансгенное растение); 4-13, 32-41 - трансгенные растения, содержащие ген ampl (соответственно линии 2/11, 2/21, 3/35, 4/33, 4/42, 5/11, 6/17, 8/25, 9/11, 9/32); 14, 42 - положительный контроль (плазмида рВ-АМР1); 18-27, 46-55 - трансгенные растения, содержащие ген атр2 (соответственно линии 3/13, 4/34, 5/32, 5/48, 5/51, 6/41, 8/12, 8/24, 9/44, 11/24); 28, 56 - положительный контроль (плазмида рВ-АМР2).

Установлено, что экспрессия целевого гена на транскрипционном уровне отмечена у всех 6 регенерантов, содержащих в геноме хитинсвязывающий ген

ас, а также у 7 из 8 проанализированных растений, содержащих гибридный ген Rs-intron-Shir (рис За, б). Использование праймеров на нуклеотидную последовательность генов, кодирующих гевеин-подобные пептиды, позволило установить образование мРНК у 6 из 10 трансгенных растений с геном amp2 и у 8 из 10 трансгенных растений с геном ampl (рис. 4а, б).

Трансгенные регенеранты были клонально размножены, успешно адаптированы к условиям in vivo и выращены в условиях защищенного грунта (рис. 5).

Рисунок 5. Коллекция трансгенных линий томата с генами хитинсвязывающего белка ас (А) и гевеин-подобного антимикробного пептида атр2 (Б). Клональное размножение (В) и выращивание трансгенных линий томата в условиях защищенного грунта (Г).

В процессе выращивания были отмечены линии, фенотипически отличающиеся от контрольных растений, которые характеризовались большей высотой, количеством междоузлий, формированием утолщенных листовых пластинок. Установлено, что у ряда линий не происходило формирование плодов и соответственно семян. В некоторых случаях происходило образование бессемянных деформированных плодов.

Потомство Т|-трансгенных линий, полученных в результате самоопыления, проанализировано на определение характера наследования гена npt II по признаку устойчивости к канамицину. По результатам генетического анализа было установлено, что у большинства проанализированных линий соотношение канамицин-устойчивых к канамицин-чувствительным проросткам соответствует 3:1, что свидетельствует об интеграции в геном одной копии гена npt II. Установлено, что у линии с гибридным геном Rs-intron-Shir (8/14) большая часть потомства от самоопыления оказалась устойчивой к канамицину, что свидетельствует о присутствии в геноме двух вставок гена npt II. Кроме того, у одной линии, содержащей ген amp 2 (8/12), семенное

потомство проявляло канамицип-чувствительный фенотип, что свидетельствует о полной потери экспрессии гена npt II (табл. 3).

Таблица 3.

Анализ наследования гена npt II в поколении Т]-трансгенных растений томата.

Ген Линия Количество проростков, шт. х2 Расщепление

общее Ктк Кть

RS-intron-Shir 8/14 151 138 13 1,43 15:1

7/12 79 60 19 0,04 3 1

5/12 108 80 28 0,05 3 1

ampl 6/17 79 63 16 0,95 3 1

4/42 140 110 30 0,95 3 1

4/33 105 86 19 2,67 3 1

атр2 4/34 124 96 28 0,39 3 1

9/44 82 61 21 0,02 3 1

8/12 124 0 124 - -

Примечание: KmR - канамицин-устойчивые проростки;

Kms - канамицин-чувствительные проростки; X2 теор. = 3,84 (df=l; а=0,05)

Для лабораторной оценки на устойчивость к фитофторозу было отобрано по пять линий Т0 с каждым гетерологичным геном. Проанализированы растения, экспрессирующие гены хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов, исходная линия ЯЛФ (контроль №1), а также трансгенные линии, у которых не происходило образование мРНК целевых генов (контроль №2).

В результате заражения сегментов листа зооспорангиями P. infestans (Mont.) de Вагу установлено, что изоляты, выделенные из томата, обладают значительно большей агрессивностью, чем изолят, выделенный из картофеля. Первые симптомы развития болезни, выражающиеся в появлении инфекционного пятна у большинства трансгенных образцов в месте нанесения суспензии, проявились на вторые сутки после инокуляции изолятом ИКЗ. Следует отметить, что заражение контроля №1 происходило несколько позже (через 72 часа после инокуляции), но существенно активнее в динамике. В случае инокуляции тестируемых образцов «томатными» изолятами ТПМ и TJI3 первые симптомы проявления фитофтороза отмечались также позже, чем при заражении изолятом ИКЗ. Однако на 5 сутки отмечено активное проявление болезни (интенсивное спороношение на уровне 3-4 баллов) у всех трансгенных линий, экспрессирующих гены ас, Rs-intron-Shir, атр2 и ampl, а также

контрольных образцов. Это способствовало тому, что к завершению эксперимента их листовая ткань полностью некротизировалась. Таким образом, все изученные растения были сильно восприимчивы к изолятам ТПМ и TJI3 P. infestans. Статистически значимых различий по устойчивости между вариантами не установлено.

Существенные различия по степени устойчивости были обнаружены при инокуляции тестируемых линий изолятом ИКЗ (табл. 4; рис. 6). Установлено, что у двух линий, экспрессирующих соответственно ген amp] и атр2, на 7 сутки эксперимента не наблюдалось никаких признаков проявления болезни.

Таблица 4.

Оценка устойчивости трансгенных и контрольных растений томата к изоляту ИКЗ Phytophthora infestans (Mont.) de Baiy.

Ген Линия Площадь инфекционного пятна (см2)1 Класс устойчивости

ас 106 0,37 abed III

224 0,06 ab II

250 0,02 а II

506 0,10 abc II

702 0,49 abede III

Rs-intron-Shir 3/1 lb 0,90 cdef III

5/12* 0,25 abed III

6/11 1,28 efg III

7/12 0,85 bedef III

8/14 0,30 abed III

ampl 3/35 0a I

4/33* 0,35 abed III

4/42 2,46 h IV

6/17 1,53 fgh V

9/32 0,44 abede III

атр2 3/13 0a I

5/48 2,24 gh V

8/12 0,06 ab II

9/44* 0,37 abed III

11/24 0,02 a II

- ЯЛФ 0,96 def III

* - трансгенные растения без экспрессии целевого гена (контроль №2);

1 - площадь инфекционного пятна с учетом преобразования с помощью VX + 1; Примечание. Варианты, сопровождаемые одинаковыми буквами, статистически незначимо отличаются по критерию Дункана (а=0,05).

Рисунок 6. Сегменты листа устойчивой (А) и чувствительной (Б) трансгенных линий томата (соответственно линии 3/35 и 6/11), а также нетрансформированного контроля (В) на 7 сутки после инокуляции зооспорангиями изолята ИКЗ Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу.

Кроме того, у трех линий, содержащих ген ас, и у двух линий, содержащих ген атр2, площадь инфекционного пятна в месте нанесения инокулюма была минимальной (не превышала 0,1 см2) и существенно отличалась от соответствующего значения контрольного нетрансгенного образца (0,96 см2). Показано, что все линии, содержащие ген Rs-intron-Shir, не отличались повышенной устойчивостью к «картофельному» изоляту по сравнению с контролем №1.

Достоверное снижение устойчивости к изоляту ИКЗ P. infestans (Mont.) de Вагу по сравнению с нетрансформированной линией ЯЛФ в тесте с отделенными листьями наблюдали у 3 из 16 трансгенных растений (18,8%). Так, площадь инфекционного пятна у линий, экспрессирующих ген ampl (4/42) и атр2 (5/48), была существенно больше, чем у контроля №1. Кроме того, на поверхности сегментов листа линий 5/48 и 6/17 наблюдалось спороношение на уровне 2-3 баллов, которое не отмечено ни у нетрасформированного образца, ни у других тестируемых трансгенных линий. Причиной снижения устойчивости может служить негативное плейотропное воздействие трансгена, отмеченное также при интродукции гена хитиназы в геном картофеля (Шахбазов и др., 2008).

По результатам проведенной оценки испытуемых линий с использованием изолята ИКЗ P. infestance (Mont.) de Вагу все линии были подразделены на следующие классы, различающиеся по степени устойчивости (в порядке убывания): I - линии, у которых не отмечено симптомов развития болезни; II - линии, у которых в месте нанесения инокулюма наблюдалось образование инфекционного пятна, площадь которого не превышала 0,1 см2 и была существенно ниже, чем у контроля №1; III - линии, у которых в месте нанесения инокулюма наблюдалось образование инфекционного пятна.

площадь которого статистически незначимо отличалась по сравнению с контролем №1; IV - линии, у которых в месте нанесения инокулюма площадь инфекционного пятна была больше и существенно отличалась по сравнению с контролем №1; V - линии, у которых в месте нанесения инокулюма площадь инфекционного пятна была на уровне или больше, чем у контроля №1, а также наблюдалось спороношение.

Таким образом, установлено, что при инокуляции сегментов листьев изолятом ИКЗ P. infestance (Mont.) de Вагу три линии, экспрессирующие ген ас, три линии, экспрессирующие ген атр2, и одна линия, экспрессирующая ген ampl, достоверно отличались повышенной устойчивостью по сравнению с нетрансформированным контролем. Полученные результаты свидетельствуют о положительном влиянии экспрессии генов хитинсвязывающего белка из Amaranthus caudatus L. и гевеин-подобных антимикробных пептидов из Stellaria media L. в трансгенных растениях томата селекционной линии ЯЛФ на повышение устойчивости к возбудителю фитофтороза. Экспериментальные данные позволяют предположить перспективность использования вышеперечисленных гетерологичных генов для генетической трансформации промышленных сортов с целью повышения устойчивости к P. infestance (Mont.) de Вагу и соответственно увеличения их продуктивности и качества товарной продукции. Одним из таких перспективных промышленных сортов томата является Рекордсмен, включенный в 2004 г. в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию на территории РФ. Сорт предназначен для выращивания в открытом грунте и находит широкое применение в Астраханской, Волгоградской и ряде других областей, являющихся основными отечественными поставщиками томата на российский рынок. Товарная продукция рекомендована для приготовления томатопродуктов.

2. Разработка эффективной системы регенерации в условиях in vitro промышленного сорта томата Рекордсмен.

Одним из важнейших условий осуществления генетической трансформации является наличие высокой способности к регенерации полноценных фертильных побегов из культивируемых тканей и органов. При проведении агробактериальной трансформации растительные ткани подвержены целому ряду стрессовых факторов. Среди них можно отметить поранение экспланта,

непосредственный контакт с патогенным микроорганизмом, как правило, длительное культивирование на средах с регуляторами роста и селективными антибиотиками, а также сама инсерция Т-ДНК в геном. В связи с этим, регенерация целого растения является одним из наиболее критических этапов всей процедуры переноса гетерологичной ДНК, что требует проведения ряда экспериментов, направленных на разработку протокола эффективной и стабильной регенерации целых растений в культуре in vitro с частотой не ниже 80%.

Анализ литературных данных свидетельствовал о том, что ранее морфогенетическая реакция в культуре ткани томата сорта Рекордсмен не изучалась, поэтому одной из задач настоящего исследования было оценить регенерационную способность различных типов эксплантов и на ее основе разработать методику эффективной регенерации.

При помещении сегментов гипокотилей и семядолей на питательные среды различного состава наблюдалось увеличение размера клеток у обоих типов эксплантов. Так, уже на 5 сутки культивирования образовывались утолщения в виде разросшихся тканей, на которых впоследствии формировалась каллусная ткань.

Установлено, что добавление в состав питательной среды регуляторов роста оказывало существенное влияние на процесс каллусогенеза (рис. 7).

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

1 1

1 I

и MS0 MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 MS7 MS8 MS9 MS 10 MS11 MSI2 MS13 MS 14 MS15

семядоли 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

■ гипокотили 46,7 90 100 100 100 100 95.5 100 83,7 88.4 74.6 46,7 83,6 73.7 100 95,5

Рисунок 7. Эффективность каллусообразования эксплантов семядолей и гипокотилей при культивировании на питательных средах с различными типами и концентрациями регуляторов роста.

Так, на среде, не содержащей регуляторов роста (MS0), интенсивность нарастания каллусной ткани у гипокотилей была слабой, а у семядолей каллусогенез отсутствовал вовсе. В последнем случае наблюдалась массовая гибель клеток, в результате чего экспланты семядолей были полностью подвержены некрозу и прохождение дальнейших процессов морфогенеза отсутствовало.

При помещении семядолей на питательные среды с добавлением регуляторов роста частота каллусообразования была максимальной и составила 100%. Аналогичные результаты наблюдались и при культивировании сегментов гипокотилей на средах MS2, MS3, MS4, MS5 и MS7, содержащих 1 и 2 мг/л зеатина в сочетании с различными типами и концентрациями ауксина. Повышение концентрации зеатина (3-5 мг/л), а также использование большинства концентраций 6-БАП (MSn, MS12, MS13) в составе питательной среды существенно ингибировало процесс формирования каллуса у эксплантов гипокотилей. В целом, установлено, что каллусообразующая способность семядолей была существенно выше (93,8%), чем гипокотилей (86,2%).

Образующаяся на семядолях и гипокотилях каллусная ткань при культивировании на различных вариантах сред была преимущественно светло-зеленого или желто-зеленого цвета, плотной зернистой структуры (рис. 8).

Рисунок 8. Формирование каллусной ткани у эксплантов семядолей (А) и гипокотилей (Б) томата сорта Рекордсмен.

Данный тип каллуса обладал высокой морфогенетической способностью, в результате чего в конце первого - начале второго пассажей отмечалось образование большого количества меристематически активных участков, на которых впоследствии и происходила регенерация побегов.

Наибольшая частота регенерации побегов из семядолей отмечена при культивировании эксплантов на среде MSb содержащей 1 мг/л зеатина и 0,1 мг/л индолилуксусной кислоты (93,3%). Однако этот вариант статистически

незначимо отличался от питательных сред, содержащих 1 и 2 мг/л зеатина в сочетании с более высокими концентрациями ИУК (MS2, MS3, MS6), а также при использовании НУК в качестве ауксинового компонента (MS4, MS7) (табл. 5).

Таблица 5.

Эффективность органогенеза побегов томата сорта Рекордсмен и их морфометрическая характеристика.

Вариант среды Частота регенерации1, % Количество побегов на один эксплант2, шт. Длина побега3, см

семядоли гипокотили семядоли гипокотили семядоли гипокотили

MSo 0,0 а 39,3 efg 0а 2,65 de - 2,47 ±0,21

MS, 93,3 h 50,0 efg 2,28 fg 2,10 cde 1,67 ±0,1 0,9 ±0,17

MS2 90,8 gh 88,4 h 2,35 g 2,65 e 2,11 ±0,18 0,57 ± 0,01

MS3 77,8 fgh 61,8 fgh 2,06 efg 1,59 bcde 1,82 ±0,02 0,51 ±0,14

MS4 68,9 efgh 67,1 gh 1,82 defg 1,72 bcde 1,24 ±0,1 0,61 ±0,06

MS5 4,5 ab 1,2 a 0,61 abc 0,54 ab 0,65 ±0,15 0,6

MS6 58,7 cdefgh 36,0 defg 1,46 cdefg 1,34 abede 1,61 ±0,24 1,1 ±0,14

MS7 64,1 defgh 58,5 fgh 1,59 cdefg 1,37 abede 1,29 ±0,13 0,75 ± 0,04

MS8 16,4 abc 53,3 efg 0,80 abed 1,50 bcde 1,14 ±0,04 0,48 ± 0,02

MS, 34,8 bcdef 28,5 cdefg 1,19 bcdef 1,40 abede 1,02 ±0,37 0,54 ±0,18

MS,o 25,0 bcde 26,5 bcdef 0,90 bed 1,53 bcde 1,03 ±0,1 0,59 ±0,15

MS„ 19,3 abed 2,4 ab 0,99 bcde 0,30 a 0,81 ±0,16 1,25

MS,2 22,2 abede 4,5 abc 1,16 bcdef 0,61 ab 0,77 ±0,31 0,95 ±0,15

MS,3 10,8 ab 19,3 abede 0,69 abc 0,99 abc 2,9 ± 0,6 1,24 ±0,29

MS14 22,2 abede 4,5 abc 1,56 cdefg 0,46 ab 2,97 ± 1,72 0,5 ± 0,2

MS15 2,4 ab 23,2 bcdef 0,30 ab 0,99 abc 0,75 0,88 ±0,31

Средняя 38,2 a 35,3 a 1,24 a 1,36 a - -

1 - частота регенерации побегов с учетом преобразования с помощью угол - арксинус VX; г - количество побегов на одном экспланте с учетом преобразования с помощью л/Х + 1; 3 - длина побега ± ошибка средней;

Примечание. Варианты, сопровождаемые одинаковыми буквами, статистически незначимо отличаются по критерию Дункана (а=0,05).

Снижение процессов морфогенеза наблюдалось при применении высоких концентраций зеатина. Аналогичные результаты обнаружены и при культивировании сегментов гипокотилей, за исключением варианта с использованием среды MS2, где была достигнута максимальная частота

регенерации (88,4%), тогда как применение среды MS) было не столь эффективным (50,0%).

В результате проведенного исследования установлено, что высокая концентрация НУК (0,5 мг/л) способствовала сильному ингибированию пролиферации побегов как из эксплантов семядолей, так и из гипокотилей. Кроме того, регенеранты, полученные на этом варианте, имели редуцированный статус (менее 1 см в длину), а количество побегов, полученных от одного экспланта, было сравнительно низким. Отмечена значительно более высокая частота регенерации побегов и большее их число при культивировании семядолей и гипокотилей на средах, содержащих 1 и 2 мг/л зеатина в сочетании с ауксином в низких концентрациях (0,1 и 0,2 мг/л) по сравнению со средами, содержащими 6-БАП в качестве источника цитокинина. Кроме того, при использовании зеатина в низких концентрациях регенерация адвентивных побегов начиналась на 3-5 дней быстрее, чем в вариантах с 6-БАП.

Рядом авторов приводятся сведения о положительном эффекте двух типов цитокининов на клеточную дифференциацию эксплантов томата in vitro (Osman et al., 2010; Krasnyanski et al., 2001). В настоящем исследовании сочетание 1 мг/л зеатина и 2,5 мг/л 6-БАП не только не способствовало увеличению, а, наоборот, существенно редуцировало частоту регенерации побегов из эксплантов семядолей и гипокотилей, а также снижало их количество по сравнению со средой MS2, содержащей один источник цитокина (зеатин) в концентрации 1 мг/л.

Данные дисперсионного анализа не установили статистически значимых различий между типами эксплантов (в среднем по всем изученным вариантам питательных сред) по показателям частоты регенерации побегов (38,2% у семядолей и 35,3% у гипокотилей), а также по их количеству с одного экспланта (1,24 побега на семядолях и 1,36 побега на гипокотилях).

Таким образом, разработан протокол эффективной регенерации растений из соматических тканей томата промышленного сорта Рекордсмен. Использование 1 мг/л зеатина в сочетании с 0,2 мг/л ИУК обеспечивало наибольший выход регенерантов как из эксплантов семядолей, так и гипокотилей. Данный состав питательной среды впоследствии был использован в эксперименте по генетической трансформации.

3. Разработка системы агробактериалыюй трансформации томата промышленного сорта Рекордсмен.

Успех в получении трансгенных растений во многом зависит от выбора концентрации селективного агента, позволяющего проводить селекцию трансформированных клеток, которые составляют весьма небольшую часть среди всех клеток экспланта. Для определения оптимальной концентрации селективного агента была проведена оценка влияния канамицина на прохождение процессов морфогенеза из эксплантов семядолей и гипокотилей. Установлено, что привнесение канамицина в состав регенерационной среды приводило к возрастанию степени некротизации обоих типов эксплантов и ингибированию процессов морфогенеза. Определено, что оптимальной концентрацией канамицина для отбора трансформированных клеток является 25 мг/л.

В эксперименте по генетической трансформации бинарным вектором pBINmGFP5ER было использовано 150 эксплантов семядолей и 100 сегментов гипокотилей. После периода инокуляции и совместного кокультивирования с агробактерией экспланты помещали на регенерационную среду, содержащую регуляторы роста в оптимальном соотношении (1 мг/л зеатина и 0,2 мг/л ИУК) и антибиотик тиментин в концентрации 300 мг/л для элиминации агробактерии. В результате в начале первого пассажа происходило увеличение размера клеток растительной ткани и образование многочисленных глобулярных очагов каллусной ткани на всей поверхности трансформированных и контрольных семядолей. Частота каллусообразования эксплантов семядолей составила 90,0%. Что касается сегментов гипокотилей, формирование небольших очагов каллуса происходило по краям срезов и отмечалось лишь у 10,0% эксплантов.

После переноса эксплантов на среду с добавлением 10 мг/л селективного антибиотика наблюдалась некротизация каллусной ткани трансформированных и контрольных эксплантов, причем интенсивность ее значительно увеличилась при последующем культивировании на более высоких концентрациях канамицина (25 мг/л). Побеги, регенерированные в течение 1-го - 2-го пассажей, впоследствии проявляли признаки хлороза. Помимо высокой реакции чувствительности эксплантов к канамицину, у части семядолей наблюдалась бактериальная контаминация. Отмеченные явления приводили к тому, что после 1,5 месяцев культивирования большинство эксплантов погибло (табл. 6).

Таблица 6.

Эффективность каллусообразования и селекции трансформантов томата сорта Рекордсмен при использовании векторной конструкции pBINmGFP5ER.

Тип экспланта Количество эксплантов

общее образовавших каллус погибших прошедших селекцию

шт. % шт. % от бактерии от канамицина шт. %

шт. % шт. %

семядоли 150 100 135 90,0 18 12,0 131 87,3 1 0,7

гипокотили 100 100 10 10,0 0 0 100 100 0 0

В результате длительного культивирования на селективной среде (более 6 месяцев) из экспланта семядоли была сформирована одна интенсивно и полноценно развивающаяся каллусная ткань (рис. 9Б, 9В). Впоследствии из неё 1 было регенерировано 5 зелёных побегов. Вероятнее всего, они являются результатом одного трансформационного события, то есть представляют собой клоны. Регенерированные побеги образовали хорошо развитую корневую систему на среде для укоренения, содержащей 100 мг/л канамицина, и были 1 признаны как предположительно трансгенные (рис. 9Г).

® ""«х © Р ff—1--П-. —пжг.--

^ itr / "X .„Jb.

" | % "V |

А) ЯвВ Б1 ШШ В) Г)

ШШ^ШШ ЩШЁ

Рисунок 9. Этапы генетической трансформации томата сорта Рекордсмен при использовании вектора pBINmGFP5ER: А) трансформированные и контрольные экспланты семядолей; Б) формирование каллуса и начало регенерации побегов на селективной среде с I добавлением 25 мг/л канамицина; В) массовая регенерация канамицин-устойчивых побегов; Г) укоренение побегов на среде для ризогенеза с добавлением 100 мг/л канамицина.

В результате проведенного ПЦР-анализа было установлено, что все пять полученных канамицин-устойчивых регенерантов являются трансгенными как по селективному, так и репортерному генам (рис. 10).

Флуориметрический анализ установил наличие стабильной экспрессии репортерного гена GFP в листьях и корнях трансгенных растений (рис. 11).

Рисунок 10. Электрофореграмма продукта амплификации геномной ДНК канамицин-устойчивых регенерантов томата на наличие фрагментов генов gfp (A), nptll (Б) и virB (В) при помощи метода ПЦР-анализа: 1 - молекулярный маркер FastRuler™ Low Range DNA ladder; 2 - вода; 3 - отрицательный контроль (дикий тип); 4-8 - трансгенные регенеранты томата; 9 - положительный контроль (плазмида pBINmGFP5ER).

а Г^ J t' а б

белый свет ультрафиолетовый свет

a i - _ а б

Рисунок 11. Детекция экспрессии гена gfp в листьях и корнях растений томата: 1) контрольное (нетрансгенное) растение; 2) трансгенное растение; а) лист; б) корень.

Таким образом, в результате проведенных исследований разработана система агробактериальной трансформации томата промышленного сорта Рекордсмен. Эффективность трансформации при использовании эксплантов семядолей составила 0,7%, тогда как применение гипокотилей не привело к получению трансгенных растений. Полученные результаты согласуются с литературными данными, что коммерчески значимые сорта обладают меньшей, чем модельные генотипы эффективностью трансформации и требуют индивидуальной разработки протоколов агробактериальной трансформации (Дрейпер и др., 1991; Sharma et al., 2009; Chaudhry and Rashid, 2010). Разработанная система генетической трансформации позволяет впоследствии интегрировать гетерологичные гены в геном томата промышленного сорта Рекордсмен, в том числе, гены, кодирующие хитинсвязывающий белок из Amaranthus caudatus L. и гевеин-подобные антимикробные пептиды из Stellaria media L.

выводы

1) Методом агробактериальной трансформации получены трансгенные растения томата селекционной линии ЯЛФ (6, 7, 6 и 8 независимых линий с генами ас, Rs-intron-Shir, ampl и атр2 соответственно), у которых экспрессия гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов подтверждена молекулярно-генетическим анализом.

2) Экспрессия генов хитинсвязывающих белков из Amaranthus caudatus L. и гевеин-подобных антимикробных пептидов из Stellaria media L. в трансгенных растениях томата селекционной линии ЯЛФ приводит к повышению устойчивости к возбудителю фитофтороза.

3) Установлен различный характер наследования селективного гена npt II в поколении Ti-трансгенных растений томата селекционной линии ЯЛФ. У семи трансгенных линий содержится одна инсерция гена npt II, у одной линии - две инсерции гена npt II. У одной линии наблюдалось замолкание экспрессии селективного гена.

4) Разработана методика эффективной регенерации и агробактериальной трансформации томата промышленного сорта Рекордсмен.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Халилуев М.Р., Харченко П.Н., Долгов С.В. Разработка системы регенерации и изучение трансформационного потенциала томата промышленного сорта // Доклады РАСХН. 2010. № 3. С. 22-26.

2. Халилуев М.Р., Харченко П.Н., Долгов С.В. Генетическая трансформация томата (Solanum lycopersicum L.) генами защитных хитинсвязывающих белков и антимикробных пептидов // Известия ТСХА. 2010. № 6. С. 75-83.

3. Чабан И.А., Халилуев М.Р., Долгов С.В. Цитоэмбриологическое изучение трансгенных растений томатов с аномальным фенотипом // Тезисы III Всероссийского симпозиума «Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности» (Москва, 18-21 октября 2010 г). С. 84.

4. Халилуев М.Р., Мамонов А.Г., Смирнов А.Н., Долгов, С.В. Получение трансгенных растений томата (Solanum lycopersicum L.) с повышенной устойчивостью к фитофторозу // Тезисы Всероссийского симпозиума «Растение и стресс» (Москва, 9-12 ноября 2010 г). С. 373-374.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю благодарность всем соавторам по публикациям, которые оказывали неоценимую помощь на разных этапах работы. Благодарю за многочисленные ценные советы, помощь при проведении исследований и дружескую поддержку всех сотрудников лаборатории генной инженерии растений Всероссийского НИИ сельскохозяйственной биотехнологии. Особую признательность автор выражает всем своим близким, в особенности, родителям, за всестороннюю помощь, поддержку и терпение.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Халилуев, Марат Рушанович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Культура томата в условиях in vitro

1.2. Факторы, влияющие на процесс органогенеза побегов томата

1.2.1. Генетические факторы

1.2.2. Химические факторы

1.2.3. Физические факторы

1.3. Генетическая трансформация томата

1.3.1. Методы генетической трансформации

1.3.2. Факторы, влияющие на эффективность агробактериальной jg трансформации

1.4. Молекулярно-генетические механизмы устойчивости растений 23 к патогенам

1.5. Классификация и характеристика PR-белков растений 26 1.5.1. Хитинсвязывающие белки (PR-4)

1.6. Классификация и характеристика растительных антимикробных 3 j пептидов

1.7. Стратегии повышения устойчивости томата к грибным и 34 бактериальным патогенам методами генной инженерии

1.7.1. Использование генов катионных пептидных антибиотиков

1.7.2. Экспрессия генов, кодирующих фитоалексины

1.7.3. Использование генов устойчивости (R-генов)

1.7.4. Ингибирование токсичных продуктов патогена

1.7.5. Изменение структурных компонентов клеточной стенки

1.7.6. Активация защитных реакций растения

1.7.7. Использование PR-белков и антимикробных пептидов 43 растений

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние экспрессии гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов в трансгенных растениях томата (Solanum lycopersicum L.) на повышение их устойчивости к фитопатогенам"

Томат {Solarium lycopersicum L.) является одной из важнейших продовольственных культур, занимающих первое место среди продуктов овощеводства как по своему значению, так и по объему производства. По данным ФАО, в 2009 г. томат в России промышленно выращивался на площади 117 тыс. га, а валовой сбор товарной продукции составил около 2,2 млн. т.

Высокий спрос на эту культуру обуславливает непрерывное совершенствование сортимента, что, в свою очередь, требует постоянного улучшения целого ряда хозяйственно-ценных признаков и может быть достигнуто как традиционной селекцией, так и методами генетической инженерии. Применение трансгенных форм растений позволяет существенно повысить окупаемость сельскохозяйственного производства, резко сократить загрязнение окружающей среды пестицидами, а также, во многих случаях, реализовать потенциальную урожайность сельскохозяйственной культуры. В настоящее время методы генетической инженерии используются для создания новых высокопродуктивных генотипов томата с целью повышения устойчивости к абиотическим и биотическим стрессам (Fischhoff et al., 1987; Lu et al., 2010; Vannini et al., 2007; Wang et al., 2006; Zhang et al., 2001; Khoudi et al., 2009; Kaniewski et al., 1999; Stommel et al., 1998; Whitham et al., 1996) улучшения качества товарной продукции (Ye et al., 1996; Xiong et al., 2005; Rosati et al., 2000; Enfissi et al., 2005; Giliberto et al., 2005; Ralley et al., 2004), a также для создания биопродуцентов гетерологичных белков и съедобных вакцин (McGarvey et al., 1995; Ma et al., 2003; Щелкунов и др., 2004; Lou et al., 2007).

Прогрессирующее увеличение вредоносности фитофтороза наблюдается с середины 90-х гг. прошлого столетия. Причинами этого являются: появление половой стадии возбудителя, существенное возрастание агрессивности патогена на фоне увеличивающейся встречаемости ооспор (Goodwin, 1997; Долгова и др., 1996; Смирнов, 2003). Отсутствие решения данной проблемы обусловлено генетической сложностью признака, постоянными эволюционными процессами в системе «хозяин-патоген», а также возникновением высокоустойчивых биотипов на фоне применения повышенных объемов химических средств защиты (Pittis and Shattock, 1994).

Одной из приоритетных возможностей противостояния фитофторозу томата является получение и последующее промышленное выращивание устойчивых сортов. К настоящему времени охарактеризованы гены томата (Ph-1 - Ph-3), обеспечивающие вертикальную устойчивость (Diez and Nuez, 2008). Однако существенным недостатком их использования является исключительная расовая специфичность полученной резистентности. В связи с этим, в последние годы во всем мире наибольшее внимание уделяется получению сортов с горизонтальным (полигенным) типом устойчивости. В настоящее время выведены сорта с повышенным уровнем горизонтальной устойчивости, но они не представляют практического значения или не способны вызревать в климатических условиях России (Смирнов, Кузнецов, 2006). Создание районированных фитофтороустойчивых сортов томата возможно при введении в селекционный процесс диких доноров устойчивости, например, S. pimpinellifolium L. и S. habrochaites S. Knapp & D.M. Spooner (Гавриш, 1992; Бухарова, Бухаров, 2008). Несмотря на возможность скрещивания культурного томата с его дикими видами, применение отдаленной гибридизации является достаточно длительным и трудоемким процессом (Kaul, 1991).

В последние десятилетия для повышения устойчивости растений к биотическим стрессам все более широкое применение находят методы генетической инженерии. Этому способствовал прогресс в частичном установлении молекулярной природы защитных механизмов, обеспечив возможность разработки новых стратегий борьбы с заболеваниями в дополнение к существующим традиционным подходам. Одной из них является привнесение в геном растений и, в частности, томатов чужеродных генов, кодирующих защитные PR-белки и антимикробные пептиды (Broekaert et al., 1997; Edreva et al., 2005; Van Loon et al., 2006).

Среди представителей защитных белков и пептидов значительный практический интерес представляют хитинсвязывающие белки растений, классифицированные в PR-4 семейство, и гевеин-подобные антимикробные пептиды. В результате многочисленных исследований было установлено, что они в микромолярных концентрациях проявляют высокую активность in vitro против ряда бактериальных и грибных фитопатогенов, которая сравнима с применением химических препаратов (Broekaert et al., 1990; De Bolle et al., 1993; Theis and Stahl, 2004; Li et al., 2010). Большинство из них не оказывают токсического воздействия на клетки животных и человека, что является весьма важным аспектом в отношение биобезопасности трансгенных растений.

Таким образом, целью настоящего исследования являлось получение трансгенных растений томата (,Solanum lycopersicum L.), содержащих гены PR-4 семейства хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов, и оценка влияния экспрессии гетерологичных генов на устойчивость к фитопатогенам.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

3) Изучение характера наследования селективного гена в потомстве трансгенных растений томата селекционной линии ЯЛФ;

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Халилуев, Марат Рушанович

выводы

3) Установлен различный характер наследования селективного гена npt II в поколении Т]-трансгенных растений томата селекционной линии ЯЛФ. У семи трансгенных линий содержится одна инсерция гена npt II, у одной линии — две инсерции гена npt II. У одной линии наблюдалось замолкание экспрессии селективного гена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате серии экспериментов по генетической трансформации эксплантов семядолей селекционной линии ЯЛФ бинарными векторами, содержащими гены хитинсвязывающих белков из Amaranthus caudatus L. (рВ1121ас) и Amaranthus retroflexus L. (pR830), а также гевеин-подобных антимикробных пептидов из Stellaria media L. (pB-AMP2, pB-AMPl), получено соответственно 6, 10, 17 и 13 независимых линий, интенсивно и полноценно развивающихся из каллусной ткани.

Проведенный ПЦР-анализ подтвердил интеграцию в растительный геном целевых генов ас, Rs-intron-Shir и ampl, полученных при использовании бинарных векторов pBI121ac, pR830 и рВ-АМР1 соответственно, во всех проанализированных образцах. Полноразмерная копия к ДНК гена Stellaria media, интегрированная в геном томата при трансформации бинарным вектором рВ-АМР2, отмечена только у 11 из 17 независимых канамицин-устойчивых линий. Эффективность трансформации векторными конструкциями pBI121ac, pR830, рВ-АМР2 и рВ-АМР1 составила соответственно 6,7; 8,4; 8,8 и 11,3%.

Методом ОТ-ПЦР-анализа установлено, что экспрессия целевого гена на транскрипционном уровне отмечена у всех 6 регенерантов, содержащих в геноме хитинсвязывающий ген ас, а также у 7 из 8 проанализированных линий, содержащих гибридный ген Rs-intron-Shir. Использование специфических праймеров на нуклеотидную последовательность генов, кодирующих гевеин-подобные пептиды, позволило установить образование мРНК у 6 из 10 трансгенных растений с геном атр2 и у 8 из 10 трансгенных растений с геном ampl.

Трансгенные по целевым генам линии были клонально размножены, успешно адаптированы к почвенным условиям и выращены в условиях защищенного грунта. В процессе выращивания независимые трансгенные линии проанализированы на наличие соматических отклонений от растений селекционной линии ЯЛФ.

Потомство Ti-трансгенных линий, полученных в результате самоопыления, проанализировано на определение характера наследования гена npt II по признаку устойчивости к канамицину. По результатам генетического анализа было установлено, что у большинства проанализированных линий соотношение канамицин-устойчивых к канамицин-чувствительным проросткам соответствует 3:1, что свидетельствует об интеграции в геном одной копии гена npt II. Установлено, что у линии с гибридным геном Rs-intron-Shir (8/14) большая часть потомства от самоопыления оказалась устойчивой к канамицину, что свидетельствует о присутствии в геноме двух вставок гена npt II. У одной линии, экспрессирующей ген атр2, семенное потомство проявляло канамицин-чувствительный фенотип, что свидетельствует о полной потери экспрессии гена npt II.

По результатам оценки трансгенных и контрольных растений томата селекционной линии ЯЛФ на устойчивость к фитофторозу было установлено, что изоляты Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу, выделенные из плодов (ТПМ) и листьев (ТЛЗ) томата, обладают значительно большей агрессивностью, чем изолят, выделенный из картофеля сорта Ильинский (ИКЗ). В случае инокуляции тестируемых образцов зооспорангиями «томатными» изолятами ТПМ и ТЛЗ на 5 сутки отмечено активное проявление болезни (интенсивное спороношение на уровне 3-4 баллов) у всех трансгенных линий, экспрессирующих гены хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов, а также контрольных образцов. Таким образом, все изученные растения были достаточно восприимчивы к изолятам ТПМ и ТЛЗ P. infestans. Существенных различий по устойчивости между вариантами установлено не было.

Статистически значимые различия по степени устойчивости были обнаружены при инокуляции тестируемых линий изолятом ИКЗ. Установлено, что три линии, экспрессирующие ген ас, три линии, экспрессирующие ген атр2, и одна линия, экспрессирующая ген ampl, достоверно отличались повышенной устойчивостью к изоляту ИКЗ по сравнению с ^трансформированным контролем. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о положительном влиянии экспрессии генов хитинсвязывающих белков из Amaranthus caudatus L. и гевеин-подобных антимикробных пептидов из Stellaria media L. в трансгенных растениях томата селекционной линии ЯЛФ на повышение устойчивости к возбудителю фитофтороза, что позволяет предположить перспективность использования вышеперечисленных гетерологичных генов для генетической трансформации промышленных сортов с целью повышения устойчивости к P. infestans и соответственно увеличения их продуктивности и качества товарной продукции.

Одним из таких перспективных промышленных сортов томата является Рекордсмен. Он широко выращивается в Астраханской, Волгоградской и некоторых других областях, являющихся основными отечественными поставщиками томата на российский рынок. Анализ литературных данных свидетельствовал о том, что ранее морфогенетическая реакция в культуре ткани томата сорта Рекордсмен не изучалась, поэтому одной из задач настоящего исследования было оценить регенерационную способность различных типов эксплантов и на ее основе разработать методику эффективной регенерации.

В результате проведенных экспериментов изучена морфогенетическая реакция соматических тканей томата промышленного сорта Рекордсмен. Показано, что добавление в состав питательной среды экзогенных регуляторов роста положительным образом оказывало влияние на процессы каллусогенеза и регенерации побегов. Отмечена значительно более высокая частота регенерации побегов и большее их число при культивировании семядолей и гипокотилей на средах, содержащих 1 и 2 мг/л зеатина в сочетании с ауксином в низких концентрациях (0,1 и 0,2 мг/л) по сравнению со средами, содержащими 6-БАП в качестве источника цитокинина. Кроме того, при использовании зеатина в низких концентрациях регенерация побегов начиналась на 3-5 дней быстрее, чем в вариантах с 6-БАП. Использование 1 мг/л зеатина в сочетании с 0,2 мг/л ИУК обеспечивало наибольший выход регенерантов из эксплантов семядолей и гипокотилей. Таким образом, разработана эффективная система регенерации побегов томата промышленного сорта Рекордсмен с частотой регенерации побегов более 85%.

Впоследствии при использовании векторной конструкции pBINmGFP5ER была разработана система агробактериальной трансформации сорта Рекордсмен. Эффективность трансформации эксплантов семядолей составила 0,7%, тогда как применение гипокотилей не привело к получению трансгенных растений. Полученные результаты согласуются с литературными данными, что коммерчески значимые генотипы обладают меньшей, чем модельные объекты эффективностью трансформации и требуют индивидуальной разработки протоколов агробактериальной трансформации. Несмотря на низкую частоту трансформации, разработанная система позволяет впоследствии интегрировать гетерологичные гены в геном томата промышленного сорта Рекордсмен, в том числе гены, кодирующие хитинсвязывающий белок из Amaranthus caudatus L. и гевеин-подобные антимикробные пептиды из Stellaria media L.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Халилуев, Марат Рушанович, Москва

1. Бухарова А.Р., Бухаров А.Ф. Отдаленная гибридизация овощных пасленовых культур: Монография. Мичуринск: Изд-во МичГАУ. -2008.-274 С.

2. Гавриш С.Ф. Биологический потенциал культурного томата (Lycopersicon esculentum Mill.) и его использование в селекции сортов для защищенного грунта.: Автореф. дисс. доктора с.-х. наук. — СПБ. 1992. — 66 С.

3. Глинка Е.М., Проценко М.А., Буланцева Е.А., Салькова Е.Г. Действие белкового ингибитора полигалактуроназы из тканей плодов яблони на активность полигалактуроназы фитопатогенных грибов // Прикл. биохимия и микробиология. — 2001. — Т. 37. С. 607-611.

4. Дейнеко Е.В., Новоселя A.A., Загорская Е.А. и др. Нестабильность экспрессии маркерного гена nptll у трансгенных растений табака // Физиология растений. 2000. - Т. 47. - С. 446-452.

5. Дмитриев А.П. Сигнальные молекулы растений для активации защитных реакций в ответ на стресс // Физиология растений. 2003. - Т. 50. — № 3. — С. 465-474.

6. Долгов C.B., Тимербаев В.Р., Шестибратов К.А. и др. Использование механизма ПТИГ для модификации процесса созревания плодов // Молчание генов:Сб. науч. трудов. Пущино: Изд-во ОНТИ ПНЦ РАН, 2008.-С 253-269.

7. Долгова A.B., Смирнов А.Н., Дьяков Ю.Т. Популяции Phytophthora infestans (Mont.) De Вагу в России и некоторых странах бывшего СССР // Микология и фитопатология. — 1996. Т. 30. - № 3. - С . 55-59.

8. Дорохов Ю.Л. Умолкание генов у растений // Молекулярная биология. -2007. Т. 41. - № 4. - С. 579-592.

9. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта: (с основами статистической обработки результатов исследований). Изд. 4-е, перераб. и доп. - М.: Колос. - 1979.-416 С.

10. Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф. и др. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. Пер. с англ. под редакцией Дж. Дрейпера, Р.Скотта, Ф.Армитиджа, Р.Уолдена — М.: Колос. — 1991. — 408 С.

11. Еникеев А.Г., Копытина Т.В., Семенова Л.А. и др. Агробактериальная трансформация как комплексный биотический стрессирующий фактор. // Журнал стресс-физиологии и биохимии. — 2008. — Т. 4. — № 1. С. 11-18.

12. Кок Н.К., Кайим М., Етизир X. и др. Повышение устойчивости трансгенных томатов к возбудителю бактериальной точечности плодов методом трансформации с использованием Agrobacterium tumefaciens II Физиология растений. 2007. - Т. 54. - С. 102-110.

13. Корнеева И.В., Парашина Е.В., Лебедев В.Г. и др. Получение трансформированных растений томата (.Lycopersicon esculentum Mill.). Методические рекомендации. Москва, 2008. — 13 С.

14. Кулуев Б.Р. Новые промоторы каулимовирусов и конструирование их химерных форм: Автореф. дисс. канд. биол. наук. — Уфа. 2007. - 24 С.

15. Логинова Д.Б., Шумный В.К., Дейнеко Е.В. Особенности организации Т-ДНК-встройки у трансгенных растений табака линии NU 21 // Вестник ВОГиС. — 2010. — Т. 14.-№ 1.-С. 134-140.

16. Маниатис Т., Фрич Е.Ф., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 521 С.

17. Максимов И.В., Черепанова Е.А., Хайруллин P.M. «Хитин-специфичные» пероксидазы в растениях // Биохимия. 2003. - Т. 68. — № 1.-С. 133-138.

18. Медведев С.С. Кальциевая сигнальная система растений // Физиология растений. 2005. - Т 52. - № 1. - С. 1-24.

19. Парашина Е.В., Сердобинский Л.А., Калле Е.Г. и др. Получение трансгенных растений рапса и томата, экспрессирующих ген дефензина редьки // Физиология растений. 2000. - Т. 47. - С. 471-478.

20. Полещук С.В., Горбатенко И.Ю. Влияние синтетического антиоксиданта феноксана на процессы регенерации и онтогенез томата in vitro И Доклады РАСХН. 1995. - № 2. - С. 15-17.

21. Ревенкова Е.В., Багян И.Л., Позмогова Г.Е., Краев А.С. Разработка новой векторной системы на базе штамма Agrobacterium. tumefaciens А281 // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. — 1994. — Т. 5. -С. 36.

22. Смирнов А. Н., Кузнецов С. А. Фитофтороз томата // Защита и карантин растений. — 2006. № 3. - С. 20-23.

23. Смирнов А.Н. Ооспоры Phytophthora infestans II Микология и фитопатология. — 2003. — Т. 37. С. 3-21.

24. Чен С.Ч., Лиу А.Р., Чжоу Ц.Р. Экспрессия генов глюканазы и дефензина в трансгенных томатах приводит к повышенной устойчивости к Ralstonia solanacearum 11 Физиология растений. 2006. — Т. 53. - С. 756763.

25. Шахбазов А.В., Яковлева Г.А., Родькина И.А., Картель Н.А. Плейотропные эффекты гена хитиназы из Serratia plymuthica в трансгенном картофеле // Цитология и генетика. — 2008. — Т. 42. — № 2. — С. 3-9.

26. Шевелуха B.C., Калашникова Е.А., Дегтярев С.В. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. 1998. - М.: Высшая школа. - С. 154-212.

27. Щелкунов С.Н., Саляев Р.К., Рыжова Т.О. и др. Создание кандидатной съедобной вакцины против вирусов гепатита В и иммунодефицита человека на основе трансгенного томата. // Вестник РАМН. 2004. -№ 11.-С. 50-55.

28. Abbas D.E., Abdallah N.A., Madkour М.М. Production of transgenic tomato plants with enhanced resistance against the fungal pathogen Fusarium oxysporum II Arab. J. Biotech. 2009. V. 12. P. 73-84.

29. Abu-El-Heba G.A., Hussein G.M., Abdalla N.A. A rapid and efficient tomato regeneration and transformation system // Landbauforschung — vTI Agricult. and Forestry Res. 2008. V. 58. P. 103-110.

30. Abu-Goukh A.A., Labavitch J.M. The in vivo role of "bartlett" pear fruit polygalacturonase inhibitors // Physiol. Plant Pathol. 1983. V. 23. P. 123-135.

31. Afroz A., Chaudhry Z., Khan R. re al. Effect of a GA3 on regeneration response of three tomato cultivars (Lycopersicon esculentum) // Pak. J. Bot. 2009. V. 41. P. 143-151.

32. Afroz A., Chaudhry Z., Rashid U. et al. Enhanced regeneration in explants of tomato (Lycopersicon esculentum L.) with the treatment of coconut water // African J. of Biotech. 2010. V. 9. P. 3634-3644.

33. Albersheim P., Anderson A.J. Proteins from plant cell walls inhibit polygalacturonases secreted by plant pathogens // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1971. V. 68. P. 1815-1819.

34. Aparna I., Chowdhury J., Seraj Z.I. Establishment of optimal conditions for an Agrobacterium-medmted transformation in four tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) varieties grown in Bangladesh // J. of Bangladesh Acad, of Sci. 2010. V. 34. P. 171-179.

35. Assaad F., Tucker K.L., Singer E.R. Epigenetic repeat-induced gene silencing (RIGS) in Arabidopsis 11 Plant Mol. Biol. 1993. V. 22. P. 1067-1085.

36. Baker C.J., Orlandi E.W. Active oxygen in plant pathogenesis // Annu. Rev. Phytopathol. 1995. V. 33. P. 299-322.

37. Barg R., Pilowsky M., Shabtai S. et al. The TYLCV-tolerant tomato line MP-1 is characterized by superior transformation competence // J. Exp. Bot. 1997. V. 48. P. 1919-1923.

38. Bellini C.s Chupeau M.-C., Guerche P. et al. Transformation of Lycopersicon peruvianum and Lycopersicon esculentum mesophyll protoplasts by electroporation// Plant Sci. 1989. V. 65. P. 63-75.

39. Benveniste R., Davies J. Mechanisms of antibiotic resistance in bacteria // Annu. Rev. Biochem. 1973. V. 42. P. 471-506.

40. Berrocal-Lobo M., Segura A., Moreno M. et al. Snakin-2, an antimicrobial peptide from potato whose gene is locally induced by wounding and responds to pathogen infection // Plant Physiol. 2002. V. 128. P. 951-961.

41. Bertram L., Lercari B. Photochrome A and phytochrome B1 control the acquisition of competence for shoot regeneration in tomato hypocotyls // Plant Cell Rep. 2000. V. 19. P. 604-609.

42. Bevan M.W., Flavell R.B., Chilton M.D. A chimaeric antibiotic resistance gene as a selectable marker for plant cell transformation // Nature. 1983. V. 304. P. 184-187.

43. Bhatia P., Ashwath N., Senaranta T., Midmore D.J. Tissue culture studies of tomato (Lycopersicon esculentum) II Plant Cell, Tiss. and Org. Cult. 2004. V. 78. P. 1-21.

44. Bhatia P., Ashwath N. Effect of duration of light:dark cycles on in vitro shoot regeneration of tomato // Asian J. of Plant Sci. 2005. V. 4. P. 255-260.

45. Bhatia P., Ashwath N., Midmore D.J. Effects genotype, explants orientation and wounding on shoot regeneration in tomato // In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 2005. V. 41. P. 457-464

46. Bhatia P., Ashwath N. Improving the quality of in vitro cultured shoots of tomato (Lycopersicon esculentum Mill cv. Red Coat) // Biotech. 2008. V. 7. P. 188-193.

47. Bolton G.W., Nestor E.W., Gordon M.P. Plant phenolic compounds induce expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence // Science. 1986. V. 232. P. 983-985.

48. Bormann C., Baier D., Hon* I. et al. Characterization of a novel, antifungal, chitin-binding protein from Streptomyces tendae Tu901 that interferes with growth polarity//J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 7421-7429.

49. Bradley D.J., Kjellbom P., Lamb C.J. Elicitor- and wound-induced oxidative cross-linking of a proline-rich plant cell wall structural protein: A novel, rapid plant defense response // Cell. 1992. V. 70. P. 21-30.

50. Bravo J.M., Campo S., Murillo I. et al. Fungus- and wound-induced accumulation of mRNA containing a class II chitinase of the pathogenesis-related protein 4 (PR4) family of maize // Plant Mol. Biol. 2003. V. 52. P. 745759.

51. Brasileiro A.C.R., Willadino 1., Carvalheira G.G., Guerra M. Callus induction and plant regeneration of tomato (Lycopersicon esculentum cv. IPA5) via anther culture // Cienc. Rual. 1999. V. 29. P. 619-623.

52. Broekaert W.F., Lee H.-I., Kush A. et al. Wound-induced accumulation of mRNA containing a hevein sequence in laticifers of rubber tree (Hevea brasiliensis) //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 7633-7637.

53. Broekaert W.F., Marien W., Terras F.R.G. et al. Antimicrobial peptides from Amaranthus caudatus seeds with sequence homology to the cysteine/glycine-rich domain of chitin-binding proteins // Biochem. 1992. V. 31. P. 4308-4314.

54. Broekaert W.F., Cammue B.P.A., De Bolle M.F.C. et al. Antimicrobial peptides from plants // Crit. Rev. in Plant Sci. 1997. V. 16. P. 297-323.

55. Brownleader M.D., Hopkins J., Mobasheri A. et al. Role of extensin peroxidase in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) seedling growth // Planta. 2000. V. 210. P. 668-676.

56. Budar F., Thia-Toong L., Van Montagu M., Hernalsteens J.P. Agrobacterium-mediated gene transfer results mainly in transgenic plantstransmitting T-DNA as a single Mendelian factor // Genetics. 1986. V. 114. P. 303-313.

57. Bufe A., Spangfort M.D., Kahlert H. et al. The major birch pollen allergen, Bet v 1, shows ribonuclease activity // Planta. 1996. V. 199. P. 413-415.

58. Carolina C., Francisco A.C.M. Tomato transformation and transgenic plant production // Plant Cell, Tiss. and Org. Cult. 2004. V. 76. P. 269-275.

59. Caruso C., Bertini L., Tucci M. et al. Isolation and characterization of wheat cDNA clones encoding PR4 proteins // DNA Seq. 1999. V. 10. P. 301307.

60. Cassells A.C., Curry R.F. Oxidative stress and physiological, epigenetic and genetic variability in plant tissue culture: implications for micropropagators and genetic engineers // Plant Cell, Tissue and Org. Cult. 2001. V. 64. P. 145-157.

61. Chamnongpol S., Willekens H., Moeder W. et al. Defense activation and enhanced pathogen tolerance induced by H2O2 in transgenic tobacco // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. V. 95. P. 5818-5823.

62. Chan Y.L., Prasad V., Chen S.K.H. et al. Transgenic tomato plants expressing an Arabidopsis thionin (Thi2.1) driven by fruit-inactive promoter battle against phytopathogenic attack // Planta. 2005. V. 221. P. 386-393.

63. Chandel G., Katiyar S. K. Organogenesis and somatic embryogenesis in tomato (Lycopersicon esculantum Mill.) // J. Advances in Plant Sci. 2000. V. 13. P. 11-17.

64. Chandra R., Khetrapal S., Patil P. et al. In vitro regeneration of hybrid and non-hybrid tomato (Lycopersicon esculentum L.) // Indian J. Plant Physiol. 1995. V. 38. P. 139-142.

65. Chaudhry Z., Rashid H. An improved Agrobacterium mediated transformation in tomato using hygromycin as a selective agent // African J. of Biotech. 2010. V. 9. P. 1882-1891.

66. Chen H., Zhang J., Zhuang T., Zhou G. Studies on optimum hormone levels for tomato plant regeneration from hypocotyls explants cultured in vitro II Acta Agric. Shanghai. 1999. V. 15. P. 26-29.

67. Chen S.C., Liu A.R., Wang F.H., Ahammed G.J. Combined overexpression of chitinase and defensin genes in transgenic tomato enhances resistance to Botrytis cinerea II Afr. J. of Biotech. 2009. V. 8. P. 5182-5188.

68. Cherdshewasart W., Gharti-Chhertri G.B. Saul M.W. et al. Expression instability and genetic disorders in transgenic Nicotiana plumbaginifolia L. plants // Transgenic Res. 1993. V. 2. P. 307-320.

69. Compton M.E. Veilleux R.E. Shoot, root and flower morphogenesis on tomato inflorescence explants // Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1991. V. 24. P. 223231.

70. Cortina C., Culianez-Macia F.A. Tomato transformation and transgenic plant production II Plant Cell, Tiss. and Org. Cult. 2004. V. 76. P. 269-275.

71. Costa G.M., Nogueira F.T.S., Otoni W.C., Brommonschenkel S.H. In vitro regeneration of processing tomato {Lycopersicon esculentum Mill.) 'IPA-5' and 'IPA-6' // Ciencia e Agrotecnologia. 2000a. V. 24. P. 671-678.

72. Costa M.G.C., Nogueira F.T.S., Figueira M.L. et al. Influence of the antibiotic timentin on plant regeneration of tomato {Lycopersicon esculentum Mill.) cultivars II Plant Cell Rep. 2000b. V. 19. P. 327-332.

73. Craik D.J. Circling the enemy: cyclic proteins in plant defence // Trends in Plant Sci. 2009. V. 14. P. 328-335.

74. Curtis O.F., Shetty K. Growth medium effects on vitrification, total phenolics, chlorophyll, and water content of in vitro propagated oregano clones. // Acta Horticul. 1996. V. 426. P. 498-503.

75. Dai C.X., Mertz D., Lambeth V.N. Effect of seedling age, orientation and genotype of hypocotyl and cotyledon expiants of tomato on shoot and root regeneration // Genet. Manip. Crops Newslett. 1988. V. 4. P. 26-35.

76. Dan Y., Yan H., Munyikwa T. et al. MicroTom a high-throughput model transformation system for functional genomics // Plant Cell Rep. 2006. V. 25. P. 432-441.

77. Davis D.G., Breiland K.A., Frear D.S., Secor G.A. Callus initiation and regeneration of tomato (Lycopersicon esculentum) cultivars with different sensitivities to metribuzin // Plant Growth Regul. Soc. Am. Quart. 1994. V. 22. P. 65-73.

78. Davis M.E., Lineberger R.D., Miller A.R. Effect of tomato cultivar, leaf age, and bacterial strain on transformation by Agrobacterium tumefaciens II Plant Cell, Tiss. and Org. Cult. 1991a. V. 24. P. 115-121.

79. Davis M.E., Miller A.R., Lineberger R.D. Temporal competence for transformation of Lycopersicon esculentum cotyledons by Agrobacterium tumefaciens: relation to wounding-healing and soluble plant factor // J. Exp. Bot. 1991b. V. 42. P. 359-364.

80. De Bolle M.F.C., David K.M.M., Rees S.B. et al. Cloning and characterization of a cDNA encoding an antimicrobial chitin-binding protein from amaranth, Amaranthus caudatus II Plant Mol. Biol. 1993. V. 22. P. 11871190.

81. De Gara L., De Pinto M.C., Tommasi F. The antioxidant systems vis-à-vis reactive oxygen species during plant-pathogen interaction // Plant Physiol, and Biochem. 2003. V. 41. P. 863-870.

82. De Leeuw G.T.N. Deposition of lignin, suberin and callose in relation to the restriction of infection by Botrytis cinerea in ghost spots of tomato fruits // J. Phytopathology. 1985. V. 112. P. 143-152.

83. De Lorenzo G., D'Ovidio R., Cervone F. The role of polygalacturonase-inhibiting proteins (PGIPs) in defense against pathogenic fungi // Annu. Rev. Phytopathol. 2001. V. 39. P. 313-335.

84. Desiderio A., Aracri B., Leckie F. et al. Polygalacturonase-inhibiting proteins (PGIPs) with different specificities are expressed in Phaseolus vulgaris II Mol. Plant-Microbe Interact. 1997. V. 10. P. 852-860.

85. Devi R., Dhaliwal M.S., Kaur A., Gosal S.S. Effect of grow regulators on in vitro morphogenic response of tomato // Indian J. of Biotechnol. 2008. V. 7. P. 526-530.

86. Diez M.J., Nuez F. Tomato. Vegetable II. Handbook of Plant Breeding. 2008. V. 2. Part 3. P. 249-323.

87. Duvick J.P., Rood T., Rao A.G., Marshak D.R. Purification and characterization of a novel antimicrobial peptide from maize (Zea mays L.) kernels // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 18814-18820.

88. Duzyaman E., Tanrisever A., Gunver G. Comparative studies on regeneration of different tissues of tomato in vitro II Acta Horticult. 1994. V. 366. P. 235-242.

89. Edreva A. Pathogenesis-related protein: research progress in the last 15 years. // Gen. Appl. Plant Physiol. 2005. V. 31. P. 105-124.

90. Edwards K., Johnstone C., Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis // Nucleic Acids Research. 1991. V. 19. № 6. P. 1349.

91. Enfissi E.M.A., Fraser P.D., Lois L.M. et al. Metabolic engineering of the mevalonate and non-mevalonate isopentenyl diphosphate-forming pathways for the production of health-promoting isoprenoids // Plant Biotech J. 2005. P. 17-27.

92. Epand R.M., Vogel H.J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1462. P. 11-28.

93. Farmer E.E., Ryan C.A. Octodecanoid precursors of jasmonic acid activated the synthesis of wound-inducible proteinase inhibitors // Plant Cell. 1992. V. 4. P. 129-134.

94. Fillatti J.J., Kiser J., Rose R., Comai L: Efficient transfer of a glyphosate tolerance gene into tomato using a binary Agrobacterium tumefaciens vector // Biotech. 1987. V. 5. P. 726-730.

95. Finnegan J., McElroy D. Transgene inactivation: plants fight back! // Biotechnology. 1994. V. 12. P. 883-887.

96. Fischhoff D.A., Bowdish K.S., Perlak F.J. et al. Insect tolerant transgenic tomato plants //BioTechnol. 1987. V. 5. P. 807-813.

97. Flor H.H. Host-parasite interactions in flax rust-its genetics and other implications.// Phytopathol. 1955. V. 45. P.680-685.

98. Fraley R.T., Rogers S.G., Horsch R.B. et al. Expression of bacterial genes in plant cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. V. 80. P. 4803-4807.

99. Frary A., Earle E.D. An examination of factors affecting the efficiency of Agrobacterium mediated transformation of tomato // Plant Cell Rep. 1996. V. 16. P. 235-240.

100. Frary A., Hamilton C.M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato // Transgenic Res. 2001. V. 10. P. 121-132.

101. Fritig B., Heitz T., Legrand M. Antimicrobial proteins in induced plant defense // Curr Opin Immunol. 1998. V. 10. P. 16-22.

102. Gamborg O.L., Shyluk J.P., Brar D.S., Constabel F. Morphogenesis and plant regeneration from callus of immature embryos of sorghum // Plant Sci. Lett. 1977. V. 10. P. 67-74.

103. Ganz T., Lehrer R.I. Antibiotic peptides from higher eukaryotes: biology and applications //Mol. Med. Today. 1999. V. 5. P. 292-297.

104. Gao G.-H., Liu W., Dai J.-X. Solution Structure of PAFP-S: A new knottin-type antifungal peptide from the seeds of Phytolacca americana II Biochem. 2001. V. 40. P. 10973-10978.

105. García-Olmedo F., Molina A., Alamillo J.M., Rodríguez-Palenzuéla P. Plant defense peptides // Plant Sci. 1998a. V. 47. P. 479-491.

106. Giliberto L., Perrotta G., Pallara P. et al. Manipulation the blue light photoreceptor cryptochrome 2 in tomato affects vegetative development, flowering time and fruit nutritional quality // Plant Physiol. 2005. V. 137. P. 199-208.

107. Girhepuje P.V., Shinde G.B. Transgenic tomato plant expressing a wheat endochitinase gene demonstrated enhanced resistance to Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici 11 Plant Cell, Tiss. and Org. Cult. 2010. V. 105. P. 243-251.

108. Gleddie S., Keller W.A., Poysa V. Plant regeneration from stem cortex protoplasts of a tomato hybrid // Plant Cell Rep. 1989. V. 8. P. 21-24.

109. Goodwin S.B. The population genetics of Phytophthora// Phytopathology. 1997. V. 87. P. 462-473.

110. Grayer R.J., Kokubun T. Plant-fungal interactions: the search for phytoalexins and other antifungal compounds from higher plants // Phytochem. 2001. V. 56. P. 253-263.

111. Gubis J., Lajchova Z., Farago J., Jurekova Z. Effect of Genotype and Explant Type on Shoot Regeneration in Tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) in vitro II Czech J. Genet. Plant Breed. 2003. V. 39. P. 9-14.

112. Gubis J., Lajchova Z., Klcova L. The effect of carbon source on plant regeneration in tomato // Hort. Sci (Prague). 2005. V. 32. P. 6-8.

113. Hagen S., Stahl U. Function of Genetic Material: Progressive insight into antimicrobial peptides and their transcriptional regulation // Progress in Botany. 2007. V. 68. P. 35-56.

114. Hammerschmidt R. Phytoalexins: what have we learned after 60 years? // Annu. Rev. Phytopathol. 1999. V. 37. P. 285-306.

115. Hammond-Kosack K.E., Kim E., Jones J.D.G. Plants diseases resistance genes // Annu. Rew. Plant. Mol. Biol. 1997. V. 48. P. 575-607.

116. Hammond-Kosack K.E., Tang S., Harrison K., Jones, J.D.G. The tomato Cf-9 disease resistance gene functions in tobacco and potato to confer responsiveness to the fungal avirulence gene product Avr 9 // Plant Cell. 1998. V. 10. P. 1251-1266.

117. Hamza S., Chupeau Y. Re evaluation of conditions for plant regeneration and Agrobacterium-mediated transformation form tomato (Lycopersicon esculentum) //J. Exp. Bot. 1993. V. 44. P. 1837-1845.

118. Hancock R.E.W., Lehrer R.I. Cationic peptides: A new source of antibiotics // Trends Biotechnol. 1998. V. 16. P. 82-88.

119. Hancock R.E.W., Chappie D.S. Peptide antibiotic // Antimicrob. Agents and Chemotherapy. 1999. V. 43. P. 1317-1323.

120. Harish M.C., Rajeevkumar S., Sathishkumar R. Efficient in vitro callus induction and regeneration of different tomato cultivars of India // Asian J. of Biotech. 2010. V. 2. P. 178-184.

121. Harper B.K., Mabon S.A., Leffel S.M. et al. Green fluorescent protein as a marker for expression of a second gene in transgenic plants // Nat. Biotech. 1999. V. 17. P. 1125-1129.

122. He P., Warren R.F., Zhao T. et al. Overexpression of Pti5 in tomato potentiates pathogen-induced defense gene expression and enhanced diseases resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato II Mol. Plant-Microbe Interact. 2001. V. 14. P. 1453-1457.

123. Heath M.C. Hypersensitive response-related death // Plant Mol. Biol. 2000. V. 44. P. 321-334.

124. Iieitz T., Geoffroy P., Fritig B., Legrand M. Two apoplastic a-amylases are induced in tobacco by virus infection // Plant Physiol. 1991. Induced and preformed antimicrobial proteins.V. 97. P. 651-656.

125. Hejgaard J., Jacobsen S., Bjorn S.E., Kragh K.M. Antifungal activity of chitinbinding PR-4 type proteins from barley grain and stressed leaf // FEBS Lett. 1992. V. 307. P. 389-392.

126. Herrera-Estrella L., De Block M., Messens E. et al. Chimeric genes as dominant selectable markers in plant cells // EMBO J. 1983. V. 2. P. 987-995.

127. Hobbs S.L.A., Warkentin T.D., DeLong C.M.O. Transgene copy number can be positively or negatively associated with transgene expression // Plant Mol. Biol. 1993. V. 21. P. 17-26.

128. Honee G., Melchers L.S., Vleeshouwers V.G.A.A. et al. Production of the AVR9 elicitor from the fungal pathogen Cladosporium fulfum in transgenic tobacco and tomato plants // Plant Mol. Biol. 1995. V. 29. P. 909-920.

129. Horsch R.B., Fraley R.T., Rogers S.G. et al. Inheritance of functional foreign genes in plants // Science. 1984. V. 223. P. 496-498.

130. Hu W., Phillips G.C. A combination of overgrowth control antibiotics improves Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation efficiency for cultivated tomato (Lycopersicon esculentum) // In vitro Cell Dev Bio-Plant. 2001. V. 37. P. 12-18.

131. Huang H.-E., Liu C.-A., Lee M.-J. et al. Resistance enhancement of transgenic Tomato to bacterial pathogens by the heterologous expression of sweet pepper ferredoxin-I protein // Phytopathol. 2007. V. 97. P. 900-906.

132. Ichimura K., Uchiumi T., Tsuji K. et al. Shoot regeneration of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) in tissue culture using several kinds of supporting materials // Plant Sci. 1995. V. 108. P. 93-100.

133. Ichimura K., Oda M. Stimulation of phenotypically normal shoot regeneration of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) by commercial filter paper extract// J. Jap. Soc. Hort. Sci. 1998. V. 67. P. 378-380.

134. Ieamkhang S., Chatchawankanphanich O. Augmentin as an alternative antibiotic for growth suppression of Agrobacterium for tomato (Lycopersicon esculentum) transformation // Plant Cell, Tiss. and Org. Cult. 2005. V. 82. P. 213-220.

135. Inoue S., Aist J.R., Marko V. Earlier papilla formation and resistance to Barley powdery mildew induced by a papilla-regulating extract // Phys. Mol. Plant Pathol. 1994. V. 44. P. 433-440.

136. Jabeen N., Chaudhry Z., Rashid H., Mirzaa B. Effect of genotype and explants type on in vitro shoot regeneration of tomato {Lycopersicon esculantum Mill.) // Pak. J. Bot. 2005. V. 37. P. 899-903.

137. Jan P.-S., Huang H.-Y., Chen H.-M. Expression of a synthesized gene encoding cationic peptide cecropin B in transgenic tomato plants protects against bacterial diseases // Appl. and Environ. Microbial. 2010. V. 76. P. 769775.

138. Jongedijk E., Tigelaar H., Van Roekel J.S.C. et al. Synergistic activity of chitinases and p-l,3-glucanases enhances fungal resistance in transgenic tomato plants//Euphytica. 1995. V. 85. P. 173-180.

139. Jones D.A., Thomas C.M., Hammond-Kosack K.E. et al. Isolation of the tomato Cf-9 gene for resistance to Cladosporium fulvum by transposon tagging // Science. 1994. V. 266. P. 789-793.

140. Jones R.W., Ospina-Giraldo M., Clemente T. Prosystemin-antimicrobial-peptide fusion reduces tomato late blight lesion expansion // Mol. Breed. 2004. V. 14. P. 83-89.

141. Joosten M.H.A.H., Bergmans C.J.B., Meulenhoff E.J.S. et al. Purification and serological characterization of three basic 15 kDa pathogenesis-related proteins from tomato // Plant Physiol. 1990. V. 94. P. 585-591.

142. Jordra L., Conejero V., Vera P. Characterization of P69E and P69F, two differentially regulated genes encoding new members of the subtilisin-like proteinase family from tomato plants // Plant Physiol. 2000. V. 122. P. 67-73.

143. Kader J.-C. Lipid-transfer protein in plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1996. V. 47. P. 627-654.

144. Kamal G.B., Karlov G.I., Asadollah A. Effects of genotype, explant type and nutrient medium components on canola (Brassica napus L.) shoot in vitro organogenesis. // Afr. J. of Biotech. 2007. V. 6. P. 861-867.

145. Kaniewski W., Ilardi V., Tomassoli L. Extreme resistance to cucumber mosaic virus (CMV) in transgenic tomato expressing one or two viral coat proteins // Mol. Breeding. 1999. V. 5. P. 111-119.

146. Kaparakis G., Alderson P.G. Influence of high concentrations of cytokinins on the production of somatic embryos by germinating seeds of tomato, aubergine and pepper// J. Hort. Sci. Biotechnol. 2002. V. 77. P. 186-190.

147. Kaul M. Reproductive biology of tomato. In: Kalloo G (eds) Monographs on Theoretical and Applied Genetics 14, Genetic Improvement of Tomato. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. 1991. P. 39-43.

148. Kazan K., Goulter K.C., Way H.M., Manners J.M. Expression of a pathogenesis-related peroxidase of Stylosanthes humilis in transgenic tobacco and canola and its effect on disease development // Plant Sci. 1998. V. 136. P. 207-217.

149. Kerdnaimongkol K, Woodson W.R. Inhibition of catalase by antisense RNA increases susceptibility to oxidative stress and chilling injury in tomato plants//J. Amer. Society ofHorticult. Sci. 1999. V. 124. P. 330-336.

150. Khoudi H., Nouri-Khemakhem A., Gouiaa S. et al. Optimization of regeneration and transformation parameters in tomato and improvement of its salinity and drought tolerance // Afr. J. of Biotech. 2009. V. 8. P. 6068-6076.

151. Kolbe S., Fischer S., Becirevic A. et al. The StJ'eptomyces reticuli a-chitin-binding protein CHB2 and its gene//Microbiol. 1998. V. 144. 1291-1297.

152. Koo J.C., Lee S.Y., Chun H.J. et al. Two hevein homologs isolated from the seed of Pharbitis nil L. exhibit potent antifungal activity // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1382. P. 80-90.

153. Korneeval.V., Shestibratov K.A., Lavrova N.V. et al. Expression of PR-5 protein thaumatin II for improving diseases resistance and fruit quality of tomato // Acta Horticult. 2008. V. 789. P. 151-158.

154. Kors F.T.M. Antibiotics, Mode of Action, Spectrum, Resistance, Solubility, Sterilisation, Stability. 1991. Haarlem: Duchefa Biochemicals B.V.

155. Kostov K., Christova P., Slavov S., Batchvarova R. Constitutive expression of a radish gene Rs-afp2 in tomato increased the resistance to fungal pathogen // Articles Agricult. and Environ. Biotech. 2009. V. 23. P. 1121-1125.

156. Kotchoni S.O., Gachomo E.W. The reactive oxygen species network pathways: an essential prerequisite for perception of pathogen attack and the acquired disease resistance in plants // J. Biosci. 2006. V. 31. P. 389-404.

157. Lech M., Miczynski K., Pindel A. Comparison of regeneration potentials in tissue cultures of primitive and cultivated tomato species (Lycopersicon sp.) // Acta Soc. Bot. Poloniae. 1996. V. 65. P. 53-56.

158. Lee H.-I., Raikhel N.V. Prohevein is poorly processed but show enhanced resistance to a chitin-binding fungus in transgenic plants // Braz. J. of Med. and Biol. Res. 1995. V. 28. P. 743-750.

159. Lee O.S., Lee B., Park N. et al. Pn-AMPs, the hevein-like proteins from Pharbitis nil confers disease resistance against phytopathogenic fungi in tomato, Lycopersicum esculentum II Phytochem. 2003. V. 62. P. 1073-1079.

160. Lercari B., Manetti A., Bertram L. Temporal and spatial pattern of light-dependent acquisition of competence for shoot formation in tomato hypocotyl. I Light pulse conditions // Adv. Hort. Sci. 2002. V. 16. P. 17-24.

161. Li X., Xia B., Jiang Y. et al. A new pathogenesis-related protein, LrPR4, from Lycoris radiata, and its antifungal activity against Magnaporthe grisea II Mol. Biol. Rep. 2010. V. 37. P. 995-1001.

162. Lima J.E., Carvalho R.F., Neto A.T. et al. Micro-MsK: a tomato genotype with miniature size, short life cycle, and improved in vitro shoot regeneration // Plant Sci. 2004. V. 167. P. 753-757.

163. Ling H.Q., Kriseleit D., Ganal M.W. Effect of ticarcillin/potassium on callus growth and shoot regeneration in Agrobacterium-mQdmtQd transformation of tomato {Lycopersicon esculentum) II Plant Cell Rep. 1998. V. 17. P. 843-847.

164. Lipp-Joao K.H., Brown T.A. Enhanced transformation of tomato co-cultivated with Agrobacterium tumefaciens C58ClRif::pGSFRl 161 in the presence of acetosyrengone // Plant Cell Rep. 1993. V. 12. P. 422-425.

165. Liu J., Liu X., Dai L., Wang G. Recent progress in elucidating the structure, function and evolution of disease resistance genes in plants // J. Genet. Genomics. 2007. V. 34. P 765-776.

166. Locy R.D. Selection of tomato tissue cultures able to grow on ribose as the sole carbon source // Plant Cell Rep. 1995. V. 14. P. 777-780.

167. Lou X.-M., Yao Q.-H., Zhang Z. et al. Expression of the Human Hepatitis B Virus Large Surface Antigen Gene in Transgenic Tomato Plants // Clinical and Vaccine Immunology. 2007. V. 14. P. 464-469.

168. Lu C., Li Y., Chen A. et al. LeERFl improves tolerance to drought stress in tomato (Lycopersicon esculentum) and activates downstream stress-responsive genes // African J. of Biotech. 2010. V. 9. P. 6294-6300.

169. Ma Y., Lin S.-Q., Gao Y. et al. Expression of ORF2 partial gene of hepatitis E virus in tomatoes and immunoactivity of expression products // World J. Gastroenterol. 2003. V. 9. P. 2211-2215.

170. Malehom D.E., Borgmeyer J.R., Smith C.E., Shah D.M. Characterization and expression of an antifungal zeamatin-like protein (Zip) gene from Zea mays II Plant Physiol. 1994. V. 106. P. 1471-1481.

171. Martin G.B., Brommonschenkel S.H., Chunwongse J. et al. Map-based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistance in tomato // Science. 1993. V. 262. P. 1432-1436.

172. Matzke M.A., Neuhuber F., Park Y.-D. et al. Homology-depend gene silencing in transgenic plants: epistatic silencing loci contain multiple copies of methylated transgenes // Mol. Gen. Genet. 1994. V. 244. P. 219-229.

173. McCormac A.C., Wu H., Bao M. et al. The use of visual marker genes as cell-specific reporters of Agrobacterium-mediated T-DNA delivery' to wheat (Triticum aestivum L.) and barley (Hordeum vulgare L.) // Euphytica. 1998. V. 99. P. 17-25.

174. McCormick S., Niedermeyer J., Fry J. et al. Leaf disc transformation of cultivated tomato (Lycopersicon esculentum) using Agrobacterium tumefaciens II Plant Cell Rep. 1986. V. 5. P. 81-84.

175. McDowell J.M., Dangl J.L. Signal transduction in the plant immune response II Trends Biochem. Sci. 2000. V. 25. P. 79-82.

176. McGarvey P., Hammond J., Dienelt M. et al. Expression of the rabies virus glycoprotein in transgenic tomatoes // Biotech. 1995. V. 13. P. 1484-1487.

177. Medeghini B.P., Larenzini G., Baroni F. et al. Cytochemical detection of cell wall bound peroxidase in rust infected broad bean leaves // J. Phytopathol. 1994. V. 140. P. 319-325.

178. Mehdy M.C. Active oxygen species in plant defense against pathogens // Plant Physiol. 1994. V. 105. P. 467-472.

179. Meyer P., Heidmann I. Epigenetic variants of a transgenic petunia line show hypermethylation in transgene DNA: an inactivation for specific recognition of foreign DNA transgenic plants // Mol. Gen. Genet. 1994. V. 243. P. 390-399.

180. Mirghis E., Mirghis R., Lacatus V. Analysis of tomato cultivars and hybrids for in vitro callus formation and regeneration // Acta Horticult. 1995. V. 412. P. 111-116.

181. Moghaieb R.E.A., Saneoka H., Fujita K. Shoot regeneration from GUS-transformed tomato (Lycopersicon esculentum) hairy root // Cell, and Mol. Biol. Lett. 2004. V. 9. P. 439-449.

182. Muraki M., Morii H., Harata K. Chemically prepared hevein domains: effect of C-terminal truncation and the mutagenesis of aromatic residues on the affinity for chitin // Protein Eng. 2000. V. 13. P. 385-389.

183. Murashige T. Plant propagation through tissue culture // Annu. Rev. Plant Physiol. 1974. V. 25. P. 135-166.

184. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-497.

185. Nakata K., Tanaka H., Yano K., Takagi M. An effective transformation system for Lycopersicon peruvianum by electroporation // Japan. J. Breed. 1992. V. 42. P. 487-495.

186. Newman P.O., Krishnaraj S., Saxena P.K. Regeneration of tomato {Lycopersicon esculentum Mill.): somatic embryogenesis and shoot organogenesis from hypocotyl explants induced with 6-benzyladenine // Int. J. Plant Sci. 1996. V. 157. P. 554-560.

187. Niedz R.P., Sussman M.R., Satterlee J.S. Green fluorescent protein: an in vivo reporter of plant gene expression // Plant Cell Rep. 1995. V. 14. P. 403406.

188. Nielsen K.K., Nielsen J.E., Madrid S.M., Mikkelsen J.D. Characterization of a new antifungal chitin-binding peptide from Sugar Beet leaves // Plant Physiol. 1997. V. 113. P. 83-91.

189. Norelli J.L., Aldwinckle H.S. The role of aminoglycoside antibiotics in the regeneration and selection of neomycin phosphotransferase-transgenic apple tissue // J. Amer. Soc. Hortic. Sci. 1993. V. 118. P. 311-316.

190. Osaki T., Omotezako M., Nagayama R. et al. Horseshoe crab hemocyte-derived antimicrobial polypeptides Tachystatins, with sequence similarity to spider neurotoxins //J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 26172-26178.

191. Osman M.G., Elhadi E.A., Khalafalla M.M. Callus formation and organogenesis of tomato {Lycopersicon esculentum Mill., c.v. Omdurman) indused by thidiazuron I I Afr. J. of Biotech. 2010a. V. 9. P. 4407-4413.

192. Osman M.G., Khalafalla M.M. Promotion of in vitro shoot formation tip of tomato {Lycopersicon esculentum Mill., cv. Omdurman) by ethylene inhibitors // Internat. J. of Curr. Res. 2010b. V. 4. P. 082-086.

193. Ouyang B., Chen Y.H., Li H.X. et al. Transformation of tomatoes with osmotin and chitinase genes and their resistance to Fusarium wilt // J. of Horticult. Sci. Biotech. 2005. V. 80. P. 517-522.

194. Paramesh H., Fakrudin B., Kuruvinashetti M.S. Genetic transformation of a local variety of tomato using gus gene: an efficient genetic transformation protocol for tomato II J. of Agricult. Technol. 2010. V. 6. P. 87-97. . '

195. Park S.H., Morris J.L., Park J.E. et al. Efficient and genotype independent Agrobacterium-mediated tomato transformation // Plant Physiol. 2003. V. 160. P. 1253-1257.

196. Park E.J., Lee S.D., Chung E.J. et al. MicroTom — a model plant system to study bacterial wilt by Ralstonia Solanacearum II Plant Pathol. J. 2007. V. 23. P. 239-244.

197. Patil R.S., Davey M.R., Power J.B., Cocking E.C. Effective protocol for Agrobacteriwn-me&\?Llc(i leaf disc transformation in tomato {Lycopersiconesculentum Mill) // Indian J. Biotechnol. 2002. V. 1. P. 339-343.

198. Peberdy J.F. Presidential address: Fungi without coatsprotoplast as tool for mycological research // Mycol. Res. 1989. V. 93. P. 1-20.

199. Pelegrini P.B., Franco O.L. Plant y-thionins: Novel insights on the mechanism of action of a multi-functional class of defense proteins // Inter. J. Biochem. and Cell Biol. 2005. V. 37. P. 2239-2253.

200. Pino L.E., Lombardi-Crestana S., Azevedo M.S. The Rgl allele as a valuable tool for genetic transformation of the tomato 'Micro-Tom' model system // Plant Methods. 2010. V. 6. P. 23.

201. Pittis I.E., Shattock R.C. Viability, germination and infection potential of oospores of Phytophthora infestans// Plant Pathol. 1994. V. 43. P. 387-396.

202. Ponappa T., Brzozowski A.E., Finer J J. Transient expression and stable transformation of soybean using jellyfish green fluorescent protein (GFP) // Plant Cell Rep. 2000. V. 19. P. 6-12.

203. Pongtongkam P., Ratisoontorn P., Suputtitada S. et al. Tomato propagation by tissue culture // Kasetsart J. 1993. V. 27. P. 269-277.

204. Ponstein A.S., Bles-Vloemans S.A., Sela-Buurlage M.B. et al. A novel pathogen-and wound-inducible tobacco protein with antifungal activity // Plant Physiol. 1994. V. 104. P. 109-118.

205. Powell A.L.T., Van Kan J., Ten Have A. Transgenic expression of pear PGIP in tomato limits fungal colonization // Mol. Plant-Microbe Interact. 2000. V. 13. P. 942-950.

206. Pozueta-Romero J., Houlne G., Cañas L. Enhanced regeneration of tomato and pepper seedling explants for Agrobacterium-mediated transformation // Plant Cell, Tiss. and Org. Cult. 2001. V. 67. P. 173-180.

207. Prasher D.C., Eckenrode V.K., Ward W.W. et al. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein // Gene. V. 11. P. 229-233.

208. Pugliesi C., Cionini G., Bertram L., Lercari B. A histological study of light-dependent shoot regeneration in hypocotyls explants of tomato cultured in vitro II Adv. Hort. Sci. 1999. V. 13. P. 168-172.

209. Punja Z.K. Genetic engineering of plants to enhanced resistance to fungal pathogens a review of progress and future prospects // Can. J. Plant Pathol. 2001. V. 23. P. 216-235.

210. Qiu D., Diretoo G., Tavarza R., Giuliano G. Improved protocol for Agrobacterium mediated transformation of tomato and production of transgenic plants containing carotenoid biosynthetic gene CsZCD II Sci. Horticult. 2007. V. 112. P. 172-175.

211. Ralley L., Enfissi E.M.A., Misawa N. et al. Metabolic engineering of ketocarotenoid formation in higher plants // Plant J. 2004. V. 39. P. 477-486.

212. Ramiah M., Rajappan K. Direct shoot regeneration from excised cotyledonary leaf of tomato // South Indian Hort. 1996. V. 44. P. 101-102.

213. Rosati C., Aquilani R., Dharmapuri S. et al. Metabolic engineering of beta-carotene and lycopene content in tomato fruit // Plant J. 2000. V. 24. P. 413419.

214. Rashid R., Bal S.S, Kaur A. et al. Effect of Growth Regulators n Direct Shoot Regeneration in Tomato // Inter. J. of Biotech, and Biochem. 2010. V. 6. P. 81-86.

215. Rashid R., Bal S.S. Effect of Hormones on Direct Shoot Regeneration in Hypocotyl Explants of Tomato //Not. Sci. Biol. 2010. V. 2. P. 70-73.

216. Reuveni R., Ferreira J.F. The relationship between peroxidase activity and the resistance of tomatoes (Lycopersicum esculentum) to Verticillium dahlia II J. Phytopathol. 1985. V. 112. P. 193-197.

217. Roy R., Purty R.S., Agrawal V., Gupta C. Transformation of tomato cultivar Pus a Ruby with bspA gene from Populus tremula for drought tolerance // Plant Cell, Tiss. and Org. Cult. 2006. V. 84. P. 55-67.

218. Ruma D., Dhaliwal M.S., Kaur A., Gosal S.S. Transformation of tomato using biolistic gun for transient expression of the p-glucuronidase gene // Indian J. of Biotech. 2009. V. 8. P. 363-369.

219. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Lab. Press. 1989. P. 475.

220. Sarowar S., Kim Y.J., Kim E.N. et al. Constitutive expression of two pathogenesis-related genes in tomato plants enhanced resistance to oomycete pathogen Phytophthora capsici II Plant Cell, Tiss. and Org. Cult. 2006. V. 86. P. 7-14.

221. Schaefer S.C., Gasic K., Cammue B. et al. Enhanced resistance to early blight in transgenic tomato lines expressing heterologous plant defense genes // Planta. 2005. V. 222. P. 858-866.

222. Schimoler-O'Rourke R., Richardson M., Selitrennikoff C. Zeamatin inhibits trypsin and a-amylase activities // Appl. and Environmental Microbiol. 2001. V. 67. P. 2365-2366.

223. Schutze R, Wieczorrek G. Investigations into tomato tissue cultures. I. Shoot regeneration in primary explants of tomato // Arch. Zuchtungsforschung. 1987. V. 17. P. 3-15.

224. Segui-Simarro J.M., Nuez F. Embryogenesis induction, callogenesis, and plant regeneration by in vitro culture of tomato isolated microspores and whole anthers // J. of Exp. Bot. 2007. V. 58. P. 1119-1132.

225. Selitrennikoff C.P. Antifungal proteins // Appl. and Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 2883-2894.

226. Shahriari F., Hashemi H., Hosseini B. Factor influencing regeneration and genetic transformation of three elite cultivars of tomato (Ly copers icon esculentum L.) // Pakistan J. of Biol. Sci. 2006. V. 9. P. 2729-2733.

227. Sharma M.K., Solanke A.U., Jani D. et al. A simple efficient Agrobacterium mediated procedure for transformation of tomato // J. Biosci. 2009. V. 34. P. 423-433.

228. Sheeja T.E., Mandal A.B. In vitro flowering and fruiting in tomato {Lycopersicon esculentum Mill.) // Asia Pacific J. of Mol. Biol, and Biotech. 2003. V. 11. P. 37-42.

229. Sheeja T.E., Mondal A.B., Rathore R.K.S. Efficient Plantlet Regeneration in Tomato {Lycopersicon esculentum Mill.) // Plant Tissue Cult. 2004. V. 14. P. 45-53.

230. Shirasu K., Schulze-Lefert P. Regulators of cell death in disease resistance // Plant Mol. Biol. 2000. V. 44. P. 371-385.

231. Shorning B.Y., Poleshchuk S.V., Gorbatenko I.Y., Vanyushin B.F. Effect of antioxidants on plant growth and development // Biol. Bull. 1999. V. 26. P. 23-29.

232. Sigareva M., Spivey R., Willits M.G. et al. An efficient mannose selection protocol for tomato that has no adverse effect on the ploidy level of transgenic plants // Plant Cell Rep. 2004. V. 23. P. 236-245.

233. Skoog F., Miller C.O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissue cultures in vitro // Symp. Soc. Exp. Biol. 1957. V. 11. P. 118131.

234. Spooner R., Yilmaz O. The Role of Reactive-Oxygen-Species in Microbial Persistence and Inflammation // Int. J. Mol. Sci. 2011. V. 12. P. 334-352.

235. Stanford A., Bevan M., Northcote D. Differential expression within a family of novel wound-induced genes in potato // Mol. Gen. Genet. 1989. V. 215. V. P. 200-208.

236. Staskawicz B.J., Ausubel F.M., Baker B.J. Molecular genetics of plants diseases resistance // Science. V. 268. P. 661-667.

237. Stec B. Plants thionins the structural perspective // Cell. Mol. Life Sci. 2006. V. 63. P. 1370-1385.

238. Stommel J.R., Wai T., Pasini R., Kaper J.M. Viral Satellite RNA Expression in Transgenic Tomato Confers Field Tolerance to Cucumber Mosaic Virus // Plant Disease. 1998. V. 82. P. 391-396.

239. Sun H.-J., Uchii S., Watanabe S., Ezira H. A highly efficient transformation protocol for Micro-Tom, a model cultivar for tomato functional genomics // Plant Cell Physiol. 2006. V. 47. P. 426-431.

240. Svensson B., Svendsen I., Hojrup P. et al. Primary structure of barwin: a barley seed protein closely related to the C-terminal domain of proteins encoded by wound-induced plant genes // Biochem. 1992. V. 31. P. 8767-8770.

241. Tabaeizadeh Z., Agharbaouri Z., Harrak H., Poysa V. Transgenic tomato plants expressing a Lycopersicon chilense chitinase gene demonstrate improved resistance to Verticillium dahliae race 2 // Plant Cell Rep. 1999. V. 19. P. 197-202.

242. Tai T.H., Dahlbeck D., Clark E.T. et al. Expression of the Bs2 pepper gene confers resistance to bacterial spot disease in tomato // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999. V. 96. P. 14153-14158.

243. Tailor R.H., Acland D.P., Attenborough S. et al. A novel family of small cysteine-rich antimicrobial peptides from seed of Impatiens balsamina is derived from a single precursor protein // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 24480-24487.

244. Theis T., Stahl U. Antifungal proteins: targets, mechanisms and prospective applications // Cell. Mol. Life Sci. 2004. V. 61. P. 437-455.

245. Thomma B.P., Cammue B.P.A., Thevissen K. Plants defensins // Planta. 2002. V. 216. 193-202.

246. Thomzik J.E., Stenzel K., Stocker R et al. Synthesis of a grapevine phytoalexin in transgenic tomatoes (Lycopersicon esculentum Mill.) conditions resistance against Phytophthora infestans II Physiol, and Mol. Plant Pathol. 1997. V. 51. P. 265-278.

247. Thrope T.A. In vitro oganogenesis and somatic embryogenesis: physiological and biochemical aspects. In: (Morphogenesis in Plants). Edited

248. By Roubelakis -Angelakis K. A. and Tran Thaan Van K., Plenum Press. 1993. New York. P. 19-38.

249. Toyoda H., Matsuda Y., Utsumi R. et al. Intranuclear microinjection for transformation of tomato callus cultures // Plant Cell Rep. 1988. V. 7. P. 293296.

250. Toyoda K., Collins N.C., Takahashi A., Shirasu K. Resistance and susceptibility of plants to fungal patogenes // Transgenic Res. 2002. V. 11. P. 567-582.

251. Trudel J., Grenier J., Potvin C., Asselin A. Several thaumatin-like proteins bind to ß-l,3-glucans//Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 1431-1438.

252. Tyburski J., Tretyn A. Organogenetic response of photomorphogenic mutants of tomato // J. Plant Physiol. 1999. V. 155. P. 568-575.

253. Vain P., James V.A., Worland B., Snape J.W. Transgene behaviour across two generations in a large random population of transgenic rice plants produced by particle bombardment // Theor. Appl. Genet. 2002. V. 105. P. 878-889.

254. Van Eck J.M., Blowers A.D., Earle E.D. Stable transformation of tomato cell cultures after bombardment with plasmid and YAC DNA // Plant Cell Rep. 1995. V. 14. P. 299-304.

255. Van Loon L.C., Rep M., Pieterse C.M.J. Significance of Inducible Defense-related Proteins in Infected Plants. // Annu. Rev. Phytopathol. 2006. V. 44. P. 135-162.

256. Van Ooijen G., Van den Burg H.A., Cornelissen B.J. et al. Structure and function of resistance proteins in solanaceous plants // Annu. Rev. Phytopathol. 2007. V. 45. P. 43-72.

257. Van Parijs J., Broeclcaert W.F., Goldstein I.J., Peumans W. J. Hevein: an antifungal protein from rubber-tree latex //Planta. 1991. V. 183. P. 258-264.

258. Van Roekel J.S.C., Damm B., Melchers L.S., Hoekema A. Factors influencing transformation frequency of tomato (Lycopersicon esculentum) // Plant Cell Rep. 1993. V. 12. P. 644-647.

259. Vannini C., Campa M., Iriti M. Evaluation of transgenic tomato plants ectopically expressing the rice Osmyb4 gene // Plant Science. 2007. V. 173. P. 231-239.

260. Velcheva M., Faltin Z., Flaishman M. et al. A liquid culture system for Agrobacterium mediated transformation of tomato (Lycopersicon esculentum) II Plant Sei. 2005. V. 168. P. 121-130.

261. Venkatachalam P., Geetha N., Priya P. et al. High frequency plantlet regeneration from hypocotyls explants of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) via organogenesis // Plant Cell Biotechnol. Mol. Biol. 2000. V. 1. P. 95100.

262. Vidya C.S.S., Manoharan M., Kumar C.T.R. et al. Agrobacterium-mediated transformation of tomato (Lycopersicon esculentum var. Pusa Ruby) with coat-protein gene of physalis mottle tymovirus // J. Plant Physiol. 2000. V. 156. P. 106-110.

263. Walz A., Zingen-Sell I., Loeffler M., Sauer M. Expression of an oxalate oxidase gene in tomato and severity of disease caused by Botrytis cinerea and Sclerotinia sclerotiorum // Plant Pathol. 2008. V. 57. P. 453-458.

264. Wang Y., Wisniewski M., Meilan R. Transgenic tomato (Lycopersicon esculentum) overexpressing cAPX exhibits enhanced tolerance to UV-B and heat stress // J. of Appl. Horticult. 2006. V. 8. P. 87-90.

265. Whitham S.5 McCormick S., Baker B. The N gene of tobacco confers resistance to tobacco mosaic virus in transgenic tomato // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1996. V. 93. P. 8776-8781.

266. Wu G., Shortt B.J., Lawrence E.B. et al. Disease resistance conferred by expression of a gene encoding H202-generating glucose oxidase in transgenic potato plants // Plant Cell. 1995. V. 7. P 1357-1368.

267. Wu G., Shortt B.J., Lawrence E.B. et al. Activation of host defense mechanisms by elevated production of H2O2 in transgenic plants // Plant Physiol. 1997. V. 115. P. 427-435.

268. Xiong A.S., Tao H.Q., Peng R.H. et al. Different effects on ACC oxidase gene silencing triggered by RNA interference in transgenic tomato // Plant Cell Rep. 2005. V. 23. P. 639-646.

269. Ye Z.B., Li H.X., Zhou G.L. In vitro culture of tomato cotyledons and regenerated plants // J. Huazhong Agric. Uni. 1994. V. 13. P. 291-295.

270. Ye Z.B., Li H.X., Zheng Y.L., Liu H.L. Inhibition of introducing antisense ACC oxidase gene into tomato genome on expression of its endogeous gene // J. Huazhong Agric. Univ. 1996. V. 15. P. 305-309.

271. Yin Z., Plader W., Malepszy S. Transgene inheritance in plants // J. Appl. Genet. 2004. V. 45. P. 127-144.

272. Young R., Kaul V., Williams E.G. Clonal propargation in vitro from immature embryos and flower buds of Lycopersicon peruvianum and L. esculentum //Plant Sci. 1987. V. 52. P. 237-242.

273. Zainal Z., Marouf E., Ismail I., Fei C.K. Expression of the Capsicum annum (Chili) defensin gene transgenic tomatoes confers enhanced resistance to fungal pathogen 11 Americ. J. of Plant Physiol. 2009. V. 4. P. 70-79.

274. Zasloff M. Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation, characterization of two active forms, and partial cDNA sequence of a precursor // Proc. Natl. Acad. Sci. 1987. V. 84. P. 5449-5453.

275. Zelcer A., Soferman O., Izhar S. An in vitro screening for tomato genotypes exhibiting efficient shoot regeneration // J. Plant Physiol. 1984. V. 115. P. 211-215.

276. Zhang H.-X., Blumwald E. Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruit // Nat. Biotechnol. 2001. V. 19. P. 765-768.

277. Zhou F., Andersen C.H., Burhene K. et al. Proton extrusion is an essential signaling components in the HR of epidermal single cells in the barley-powdery mildew interaction // Plant J. 2000. V. 23. P.245-254.

Информация о работе

Халилуев, Марат Рушанович
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Влияние экспрессии гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов в трансгенных растениях томата (Solanum lycopersicum L.) на повышение их устойчивости к фитопатогенам - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы