Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние деятельности вегетативного размножения высших растений на их генетическую стабильность (на примере Solanum tuberosum L.)

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Влияние деятельности вегетативного размножения высших растений на их генетическую стабильность (на примере Solanum tuberosum L.)"

РГб од

2 5 ДЕК 7QH

На правах рукописи

Шарафутдинова Гузель Газнмовнэ

ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНОСТИ ВЕГЕТАТИВНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ НА ИХ ГЕНЕТИЧЕСКУЮ СТАБИЛЬНОСТЬ (НА ПРИМЕРЕ SOLANUM TUBEROSUM L.)

03. 00.05 - Ботаника

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2000

Работа выполнена в лаборатории регуляции метаболизма культивируемых клеток растений Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Мардамшин А.Г.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. Кулагин А.Ю. кандидат биологических наук Байбурина Р.К.

Ведущая организация:

Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева

Защита состоится "21 " декабря 2000 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 064.13.09 при Башкирском государственном университете по адресу: 450074, г. Уфа, ул. Фрунзе, 32, биологический факультет БГУ, ауд. 332.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного университета.

Автореферат разослан -и " ноября 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, проф.

Г.Г. Кузяхметов

о

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Известно, что вегетативное размножение, которое предполагает сохранение генетической идентичности особей, широко распространено среди многих видов высших растений. Оно осуществляется либо определенными частями вегетативных органов, либо при помощи специализированных одноклеточных образований. Способность растений к вегетативному размножению широко используется в практической деятельности человека при размножении культурных растений клубнями, усами, луковицами, корневыми отпрысками, черенками. Одной из проблем, с которой сталкиваются при вегетативном размножении растений является вырождение клонов, сортов. Естественным является вопрос, что лежит в основе данного явления. Дискуссии по этому поводу особенно бурно велись в 40-70-ые гг. Имеются две диаметрально противоположные точки зрения по данному вопросу. Одна группа исследователей [Гупало, 1975] считала, что клетки меристемы не стареют, поскольку высокая скорость пролиферации препятствует накоплению в клетках ^различного рода изменений, поэтому вырождение вегетативно размножаемых растений, по мнению этих исследователей, происходит лишь в результате поражения растений вирусными и грибными заболеваниями. Исходя из этого предположения, было предложено использовать оздоровление и последующее микроклональное размножение растений как один из способов сохранения генофонда. Согласно другим авторам [Тринклер, 1970], вырождение клона происходит за счет его старения. Эта точка зрения совпадает с теорией циклического старения и омоложения Н.ГТ. Кренке [1940, с.8], согласно которой "в каждый момент осевого нарастания побега или корня происходит частичное омоложение точки роста ... Вместе с тем, последовательно новообразующаяся точка роста и производные ее ткани и органы несут в себе признаки общей возрастности их материнских клеток, отсюда — одновременно с последовательным омоложением происходит последовательное старение конуса нарастания. Выражается это старение в прогрессивном падении степени омоложения развивающейся точки роста".

К настоящему времени ни одна из этих точек зрения не имеет достаточных экспериментальных подтверждений. Привлечение новых модельных систем и использование современных методов физико-химической

биологии и биотехиологии может позволить выявить молекулярные основы изменений растений при их длительном вегетативном размножении.

Хорошей модельной системой при исследовании данного вопроса могут служить растения безвирусного картофеля, размножаемые in vitro. Ее достоинство заключается в том, что растения выращиваются в стерильных условиях, и в течение одного года количество циклов размножения составляет, как минимум, двенадцать, что недостижимо в естественных условиях.

Исходя из вышесказанного, цель настоящей работы заключалась в анализе влияния длительного культивирования in vitro растений картофеля на их генетическую стабильность. Исходя из этой цели, были поставлены следующие задачи: .

1) анализ влияния длительности культивирования in vitro картофеля на его морфо-физиологические характеристики;

2) изучение стабильности генома растений картофеля, длительно культивируемых in vitro, методом полимеразной цепной реакции с использованием случайных праймеров (RAPD-PCR);

3) анализ стабильности митохондриального генома картофеля при длительном клональном микроразмножении.

11аучная новизна.

Показано, что при длительном клональном размножении растений безвирусного картофеля теряется их способность к росту в условиях автотрофного питания.

Впервые показано, что при длительном клональном микроразмножении картофеля происходят изменения в геноме, выявляемые методом полимеразной цепной реакции.

Впервые показапо изменение структурной организации митохондриального генома картофеля при его длительном клональном микроразмножении.

Научно-практическая значимость.

Полученные результаты имеют, прежде всего, практическое значение, расширяющее представление о клональном старении и омоложении вегетативно размножаемых растений, о молекулярных механизмах, лежащих в их основе.

Использованные в работе подходы могут быть применены при анализе генома других длительное время вегетативно размножаемых растений.

Исследованные в работе растения картофеля в дальнейшем могут быть применены для физиологических, биохимических и генетических исследований особенностей долговременно выращиваемых в асептических условиях растений. .

Для сохранения ценных генотипов безвирусного картофеля рекомендуется депонировать их в виде микроклубней, уменьшая тем самым количество циклов микроразмножений.

Апробация работы. Полученные результаты докладывались и обсуждались на VII Международной конференции "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда" (Москва, 1997), международной конференции "Молекулярная генетика и биотехнология" (Минск, 1998), конференции биохимиков Урала и Западной Сибири "Актуальные вопросы прикладной биохимии и биотехнологии" (Уфа, 1998), международной научно-практической конференции "Сервис большого города" (Уфа, 1999), IV съезде общества физиологов растений России (Москва, 1999), международной научной конференции "Молекулярная и клеточная биология на рубеже веков" (Алматы, 1999).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 5_ глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 10_ страницах машинописного текста, содержит J таблиц и рисунков. Список литературы включает Л0$ наименований, в том числе на иностранных языках.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили пробирочные растения картофеля (Solanum tuberosum L.) сортов Невский, Ранняя роза, Луговской, Изобилие и клубневой материал, полученный из пробирочных растений.

Оздоровление картофеля и его культивирование in vitro: меристему размером 0.1-0.3 мм вычленяли под бинокулярным микроскопом МБС-2 (Россия) и помещали на питательную среду Мурасиге и Скуга [Murashige and Skoog, 1962] со следующими добавками: гибберелловая кислота (2.0 мг/л), ин-долидуксусная кислота (1.0 мг/л), кинетин (0.5 мг/л) и культивировали на све-

топлощадке при освещенности 5-8 тыс. люкс с фотопериодом 16 ч. Пробирочные растения картофеля выращивали на той же питательной среде, в качестве регуляторов роста использовали только ИУК с концентрацией 0.2 мг/л. Растения выращивали на светоплощадке с освещенностью 8 тыс. люкс. Черенкование растений проводили через 25-30 дней.

Высадка пробирочных растений в почвенные условия. Пробирочные растения, выросшие до см., высаживали в почвенную смесь (торф : почва : песок = 1:1:1) под малогабаритные пленочные укрытия. Заглубление растений проводили таким образом, чтобы на поверхности почвы оставалась три верхних листа [Производство..., 1991].

Выделение тотальной ДНК. Тотальную ДНК из листьев пробирочных и полевых растений картофеля выделяли по методу Грахема [Graham, 1978].

Выделение митохонлриальной ДНК. Митохондриальную ДНК выделяли методом фенольной депротеинизации [Synenki et al., 1978].

• Расщепление мтДНК рестрикцнонными эндонуклеазами проводили согласно прописи завода-изготовителя (MBI Fermentas, Литва).

Амплификацию ДНК проводили в объеме 30 мкл по стандартной методике [Welsh and McClelland, 1990]. Программа ПЦР включала 25 циклов.

Фракционирование ДНК в агарозном геле проводили по стандартной методике [Маниатис и др., 1984].

Твердофазный иммуноферментный анализ выполняли по прописи, описанной Веселовым С.Ю. (1998).

Конформацию низкомолекулярных митохондриальных ДНК определяли с помощью нуклеазы SI [Powling, 1981].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Морфофизиологические характеристики картофеля, длительно

культивируемого /я vitro l.l. Ростовые характеристики растений картофеля, длительно культивируемых ¡n vitro

В таблице 1 приведены усредненные данные четырех независимых экспериментов по сравнительному анализу ростовых характеристик растений картофеля сорта Невский, полученные'в 1991 году (4 года культивирования in vitro -48 циклов микроразмножений) и в 1999 году (12 лет культивирования in vitro

- 144 цикла микроразмножений). Как видно из таблицы, длительность культивирования оказала влияние на скорость роста растений, полученных из черенков 1, 3 и 5 ярусов в первые 10 дней после черенкования: она была ниже у растений. 1999 года. Данное отставание в росте коррелировало с задержкой корне-образования на черенках 1999 года (1, 3, 5 ярус) на 5-6 дней по сравнению с аналогичным материалом 1991 года. К 15-му дню выращивания растения 1999 года догоняли, а иногда и перегоняли (по высоте стебля) растения 1991 года. Высота стебля и корневая система растений 1999 года, выросших в пробирках, к моменту высадки в грунт (30 день субкультивирования) практически не отличалась от таковой у растений более раннего периода культивирования. Необходимо отметить, что растения, полученные из черенков 7 яруса (1999 год) на всем протяжении субкультивирования превосходили по высоте растения 1991 года.

Таблица 1

Высота" побегов растений, полученных из черенков картофеля различного

яруса сорта Невский, мм

ярус Год Время культивирования (в днях)

5 - 10 15 20 27 32

1 1991 1999 1.9+0.3 1.5+0.2 "6.1+0.8 3.9+0.8 12.0+1.9 19.25+5.7 80.9+3.8 80.5+4.7 120.6+4.5 120.4+5.0 130.8+4.0 130.2+13.0

3 1991 1999 '6.8+0.7 1.7+0.1 '27.0+0.2 13.6+1.8 47.4+2.8 45.5+4.6 73.9+3.3 83.9+4.8 120.8+3.3 110.9+4.7 140.1+4.3 130.2+5.3

5 1991 1999 *б.8+0.7 2.7+0.4 '26.1+2.9 10.7+1.7 45.1+4.5 37.5+3.3 69.8+6.0 61.2+4.2 88.8+5.5 91.3+3.2 108.5+5.8 104.8+2.3

7 1991 1999 2.3+0.5 Ч. 1+0.7 9.8+1.0 9.6+0.8 17.4+1.3 '23.5+1.6 58.1+2.3 63.7+4.5 70.9+3.2 75.6+2.3 80.2+3.9 82.3+2.3

Примечание. Нумерация ярусов указана начиная с верхушки растения. * различия достоверны при уровне значимости 95%

Аналогичный эксперимент был проведен с растениями сорта Ранняя роза, которые были оздоровлены в 1990 году (таблица 2).

Таблица 2

Высота побегов растений, полученных из черенков картофеля различного

яруса сорта Ранняя роза, мм

ярус Год Время культивирования (в днях)

5 10 15 20 27 32

1 1991 1999 4.6+0.4 '9.3+1.6 8.1+1.0 '44.8+3.0 25.6+3.4 '106.5+3.7 43.63+4.1 '144.4+2.9 85.4+5.7 '148.3+3.1 113.5+6.5 '152.4+5.2

3 1991 1999 4.2+0.5 3.9+0.6 16.9+1.5 '48.5+2.2 59.3+2.9 '92.3+2.4 93.2+2.7 '123.5+4.1 135.1+3.8 137.6+3.4 '152.8+3.3 138.5+1.9

5 1991 1999 '3.4+0.3 2.6+0.2 12.8+0.8 '35.4+2.5 49.9+1.9 '68.3+3.5 80.6+2.6 '99.2+2.9 116.3+3.7 125.1+4.9 141.3+3.6 129.4+3.1

7 1991 1999 6.1+0.5 5.3+0.4 13.6+1.0 "25.0+2.3 35.8+1.6 '46.4+3.0 54.6+1.5 59.8+3.7 90.5+3.3 88.5+4.1 '121.7+4.3 103.5+3.6

Примечание. Нумерация ярусов указана начиная с верхушки.растения.

* различия достоверны при уровне значимости 95%

Из этой таблицы видно, что растения сорта Ранняя роза отличались по скорости роста от растений сорта Невский при длительном культивировании in vitro. Задержка в росте по сравнению с растениями 1991 года (24 цикла микроразмножений) наблюдалась только для черенков 5 »руса на 5 день после черенкования. В последующие дни выращивания растений в асептических условиях они превосходили по высоте растения 1991 года. Данное различие можно объяснить несколькими причинами. Во-первых, в отличие от сорта Невский у черенков сорта Ранняя роза не наблюдалось задержки корнеобразования. Во-вторых, возможно, произошел спонтанный отбор растений сорта Ранняя роза,

наиболее адаптированных к условиям роста при гетеротрофном питании. В-третьих, повлиял генотип сорта.

Несмотря на наблюдаемое различие между пробирочными растениями сортов Ранняя роза и Невский, длительно культивируемыми in vitro, они имели общее свойство - была потеряна способность к росту в условиях почвы, то есть при автотрофнСм питании.

1.2. Анализ приживаемости пробирочных растений картофеля, длительно культивируемых in vitro, при переводе в условия почвы

В экспериментах 1988-1991 гг. (1-4 года культивирования in vitro) приживаемость пробирочных растений картофеля сорта Невский при высадке в почву составляла 90-95%. В 1996-1997 гг. (9-10 лет культивирования in vitro) она не превышала 20%. При этом высота стебля прижившихся растений через два месяца после высадки в открытый грунт не превышала 14 см (Рис. 1). У растений 1988-1991 гг. она составляла 48-56 см. При этом необходимо отметить, что существенного отличия в погодных условиях в эти годы не наблюдалось. Аналогичные результаты получены в экспериментах, проведенных в условиях теплицы. У некоторых из этих растений (1996-1997 гг.) к концу вегетации происходило формирование одного микроклубня массой не более 1 грамма, в то время как в 1988-1991 гг. с одного растения картофеля получали 15-20 хорошо сформированных клубней массой 30-50 грамм. Низкая приживаемость длительно культивируемых in vitro растений картофеля в условиях почвы не была связана с их плохим ростом в гетеротрофных условиях. Пробирочные растения перед высадкой в грунт имели хорошо развитую корневую систему и надземную часть. Главной причиной плохого роста при автотрофном питании в условиях почвы являлось то, что происходило ингибирование развития корневой системы, что хорошо видно на рисунке 2. Это создавало дефицит воды и элементов минерального питания у растений, что приводило к их плохой приживаемости. Из этого рисунка также следует, что у растений имеются только придаточные корни, сформированные из стебля растений, высаженных в фунт, а корни, образованные при выращивании растений в пробирках, отсутствуют. Нельзя было исключить возможность того, что при выкапывании растений произошел обрыв

Рис. 1. Растение картофеля, выросшее в пробирке, через два месяца

после высадки в почвен-

I

ную смесь.

Высота растения не превышает 14 см.

Рис. 2. Растение картофеля, выращенное в пробирке, через месяц после высадки в почвенную смесь. Корневая система плохо развита.

корневой системы. Для исключения этой возможности был проведен эксперимент по переводу пробирочных растений на водную культуру, содержащую те же компоненты питательной среды, что и агаризованая среда (за исключением агара). Полученные данные свидетельствуют, что в течение 17 дней после переноса не происходило развития корневой системы, в дальнейшем корневая система загнивала. Таким образом, плохое развитие корневой системы в условиях почвы не является артефактом, и, по всей видимости, обусловлено какими-то факторами, возможно, гормональным балансом растений. В экспериментах 1999-2000 гг. (12-13 лет культивирования in vitro) 95-97% растений сорта Невский после перевода в почвенные условия погибали уже через 7-8 дней, то есть, с увеличением длительности культивирования in vitro приживаемость растений уменьшалась.

Анализ влияния длительности культивирования in vitro на приживаемость пробирочных растений при переводе в почвенные условия также проводили с использованием сортов Ранняя роза и Луговской (1999-2000 гг.). Были получены следующие результаты: приживаемость сорта Луговской составляла 25%, высота прижившихся растений через два месяца после пересадки не превышала 8 см; приживаемость сорта Ранняя роза не превышала 30%, а высота была не более 14 см. У растений этих двух сортов в условиях почвы корневая система также была слабо развита, то есть эти два сорта напоминают пробирочные растения картофеля сорта Невский опытов 1996-1997 гг. Следует отметить, что растения сортов Ранняя роза и Луговской были оздоровлены на два года позже, чем сорт Невский. Кроме того, они были депонированы в виде микроклубней в 1994-1995 годах, то есть они прошли меньшее количество циклов микроразмножений, чем сорт Невский (Ранняя роза - 72, Луговской - 92).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что одним из проявлений длительного культивирования растений картофеля in vitro является постепенное снижение и, в конечном итоге, практически полная потеря у них способности укореняться в условиях почвы. •

1.3. Влияние длительности культивирования in vitro на формирование микроклубней у пробирочных растений

Другим проявлением длительности культивирования на пробирочные растения картофеля являлось его влияние на формирование микроклубней. В экспериментах 1992 года (сорт Невский - 55 циклов микроразмножений, Ранняя роза - 30, Луговской - 30, Изобилие - 30) было показано, что микроклубни формируются только у пробирочных растений, полученных из нижних и из средних сегментов. У растений, полученных из верхушечных сегментов, образование микроклубней нами не наблюдалось.

В таблице 3 представлены результаты по анализу данного явления у растений картофеля разных сортов (эксперименты 2000! года), при этом сорт Невский прошел 151 цикл микроразмножений, Ранняя роза - 102, Луговской - 102, Изобилие-102.

Таблица 3

Частота образования микроклубней у растений картофеля, полученных из

различных ярусов стебля (%).

Ярус Сорт

Невский Изобилие Луговской Ранняя роза

Верхний (1) 0 0 7.9 47.3

Средний (3) 23.0 26.6 4.3 36.0

Нижний (5) 28.5 8.7 20.0 32.1

Как видно из таблицы, длительное культивирование in vitro повлияло на

#

процесс формирования микроклубней у пробирочных растений сортов Ранняя роза и Луговской: они образовывались и у растений, полученных из верхних черенков. Это может свидетельствовать о достаточно крупных изменениях в метаболизме растений картофеля и, в частности, изменении в градиенте гормонов по высоте растений.

1.4. Сравнительный анализ гормонального баланса растений картофеля с различной способностью к укоренению в условиях почвы

Как указывалось в предыдущих разделах, длительное культивирование растений in" vitro привело к снижению их способности адаптироваться к росту в почве. При этом наиболее заметным морфологическим признаком было плохое развитие корневой системы. Поскольку известна способность гормонов контролировать образование корней и другие процессы, обеспечивающие адаптацию растений, логично было предположить, что процесс длительного культивирования in vitro сказался на содержании гормонов.

При анализе содержания гормонов в побегах растений, как культивируемых in vitro (в экспериментах были использованы растения, 13 лет культивируемые in vitro, и вновь оздоровленные растения; схема получения последних описана в разделе 2), так и перенесенных из пробирок в почву, было выявлено крайне низкое содержание АБК, которое оказалось ниже уровня чувствительности иммуноферментной реакции. Подвядание и последующая гибель длительно культивируемых in vitro растений при переводе в условия почвы свидетельствует о том, что скорость потери воды при транспирации превышает способность корней обеспечить побег водой. Наиболее распространенная реакция на дефицит воды - это закрытие устьиц. Известно, что в этом про-цесе важная роль принадлежит АБК. Поэтому низкое содержание АБК может свидетельствовать о низкой функциональной активности устьиц, как при росте растений в пробирках, так и в условиях почвы.

Однако, низкое содержание АБК, но всей видимости, не является единственной причиной, влияющей на работу устьичного аппарата, поскольку вновь оздоровленные растения, для которых также характерна низкая концентрация АБК, отличались повышенной жизнеспособностью при переводе в почвенные условия.

На рисунке 3 представлены данные по содержанию ИУК и суммы имму-нореактивных в данной системе цитокининов длительно культивируемых in vitro растений и вновь оздоровленных растений картофеля при их росте в пробирке и в почве. Содержание ауксинов было ниже у растений, которые пересадили в почву, по сравнению с пробирочными растениями, что было наиболее заметно в случае длительно культивируемых растений (Рис. 3 А). При этом

длительно культивируемые in vitro и недавно введенные в культуру растения мало различались между собой по содержанию ИУК, в то время как у высаженных в почву растений содержание гормона было заметно ниже у длительно культивируемых растений по сравнению с недавно введенными в культуру. Длительное культивирование in vitro приводило к снижению содержания цито-кининов, что проявлялось как при культивировании растений в пробирке, так и в почве (Рис. 3 Б). Таким образом, по содержанию цитокининов особенности длительно культивируемых in vitro растений проявлялись независимо от того, в каких условиях они росли перед взятием пробы на анализ гормонов. Поскольку этот параметр не зависел от условий выращивания, вероятно, он мог быть генетически детерминирован, что может свидетельствовать о понижении способности продуцировать цитокинины в процессе длительного культивирования, в то время как появление четких различий по содержанию ауксинов было связано с условиями выращивания, то есть, является реакцией на пересадку в почву. Таким образом, уменьшение содержания цитокининов в надземной части - еще одна характерная особенность растений картофеля, длительно культивируемых in vitro.

Ауксины играют важную роль в стимуляции образования и роста боковых и придаточных корней [Blakesley et а]., 1991; Staden and Ntingane, 1996]. Известно [Казарян и др., 1989; Teplova et al., 1998], что при дефиците элементов питания и других корневых стрессах в корнях накапливаются ауксины, что обеспечивает их быструю ростовую реакцию. Поэтому уменьшение содержания ауксинов в побегах растений при их пересадке в почву вполне можно объяснить усилением их оттока в корни, где они необходимы для успешной ростовой реакции корней. Резкое снижение содержания ИУК в побегах длительно культивируемых растений может указывать на недостаточную обеспеченность растения данным гормоном. Представляет интерес» то, что in vitro недостатка ауксинов в побеге не было. По мнению D.M. Reinecke и R.S. Bandurski [1987], ростстимулирующее действие ауксинов сопряжено с их распадом. Поэтому активация роста корней, которая является неотъемлемой частью адаптации растений к росту в почве, предполагает увеличение расхода ауксинов. Именно в этих условиях более ярко может проявляться отрицательное влияние длительного культивирования на способность растений обеспечивать себя ауксинами.

Концентрация ИУК у растений картофеля

S ГГ

45 40

й 30

25

го t-

Концентрация суммарных цитокининов у растений картофеля

Рис. 3 Сравнительный анализ содержания ИУК (А) и суммарного содержания цитокининов (Б) у вновь оздоровленных растений картофеля (1,2) и длительно культивируемых in vitro (3, 4)

1.3- пробирочные растения;

2.4—растения в условиях почвы

Известно, что цитокинины способны стимулировать продукцию ауксинов [Evans, 1984]. Поэтому пониженный уровень ауксинов у длительно культивируемых in vitro растений, который проявлялся при пересадке в почву, может быть следствием невысокого уровня у них цитокининов. Не исключено поэтому, что пониженная способность длительно культивируемых растений продуцировать цитокинины может быть одной из основных причин, обуславливающих их неспособность адаптироваться к условиям роста в почве.

2. Анализ стабильности генома картофеля при длительном клоиальном

микроразмножении Для выяснения вопроса о возможности измйнений в геноме картофеля при длительном вегетативном размножении нами была разработана следующая схема эксперимента. Растения картофеля, размножаемые в системе in vitro с 1988-1989 гг. (24 цикла микроразмножения), были разделены на две группы: одну из них продолжали культивировать in vitro (А), из другой были получены клубни (Б). В дальнейшем растения группы А микрочеренковали до 2ООО года (132 цикла микроразмножений). Клубни, полученные из растений группы Б размножали традиционным способом до 2000 года (9 циклов размножения). Однако следует отметить, что данное сравнение циклов у растений, размножаемых in vitro и в полевых условиях, имеет определенную степень условности. Оно подразумевает лишь тот факт, что как при проращивании клубней, так и при клональном микроразмножении происходит активация делений меристе-матических клеток. Поэтому данная модельная система, несмотря на определенную условность, может быть использована при выяснении вопроса стабильности генома картофеля при длительном вегетативном размножении.

Для проведения анализа стабильности генома при длительном клональном микроразмножении было проведено повторное оздоровление методом апикальной меристемы растений картофеля, размножаемого традиционным способом, поскольку нельзя было исключить возможность того, что препараты тотальной ДНК, полученные из клубневого материала, могли быть загрязнены экзогенной ДИК, в.частности, ДНК грибов или вирусов. Вновь оздоровленные пробирочные растения прошли два цикла микроразмножения.

Результаты сравнительного анализа полимеразной цепной реакцией препаратов тотальной ДНК пробирочных растений картофеля, длительно культивируемых in vitro, и пробирочных растений вновь оздоровленного картофеля, представленына рисунке 4.

1 2 3

Рис. 4 Электрофорез в 1.5%-ном агарозном геле ДНК-ампликонов. Амплификацию ДНК длительно культивируемых in vitro растений картофеля (1) и вновь оздоровленного картофеля (2) проводили с использованием праймеров AACAGCTATGACCAT (А), GAGGGTGGCGGTTCT (Б). 3 - ДНК фага k+Hind III + BamHI

(размеры указаны в тли).

Стрелками указаны различия между сравниваемыми образцами

Из этого рисунка видно наличие полиморфизма по спектру ДНК-ампликонов сравниваемых образцов. Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что при длительном клоналыюм микроразмножении растений картофеля произошли существенные изменения в геноме. Эти данные, по всей видимости, являются первым экспериментальным доказательством на молекулярном уровне, свидетельствующим в пользу теории циклического старения и омоложения растений Н.П. Кренке [1940]. Исходя из полученных нами данных, можно заключить, что вырождение сортов и линий культурных и дикорастущих видов растений, главным образом, обусловлено изменениями на генном уровне, а не вирусными и грибными заболеваниями. Хотя, по всей видимости, последние могут ускорить этот процесс.

3. Анализ стабильности митохондриального генома картофеля при длительном клоналыюм микроразмножении

Принимая во внимание особенности структурной организации митохондриального генома растений, представленного гетерогенной популяцией кольцевых (или линейных) молекул ДНК, а также учитывая наличие в молекулах мтДНК рекомбинационных повторов, находящихся в прямой или обратной ориентации [Wolstenholme, 1995], нельзя было исключить возможности того, что при длительном клональном микроразмножении картофеля может произойти изменение структурно-функциональной организации данного генома. Эти изменения могли коснуться как области высокомолекулярной митохондриалыюй ДНК, так и плазмидоподобных митохондриальных ДНК. Реорганизация митохондриального генома, затронувшая область высокомолекулярной ДНК, традиционно детектируется с помощью рестрикционного анализа. Изменения же в спектре плазмидоподобных ДНК обычно исследуются с помощью электрофореза в агарозном геле.

На рисунке 5 представлены результаты электрофоретического анализа препаратов митохондриалыюй ДНК растений картофеля, длительно культивируемых in vitro, и растений картофеля, размножаемых традиционным способом (материал 1999 года). В обоих случаях кроме высокомолекулярных митохондриальных ДНК детектируются плазмидоподобные ДНК, мигрирующие в 0.8%-ном агарозном геле со скоростью линейных фрагментов ДНК размером около 14 тпн. С использованием нуклеазы S1 было показано, что эти плазмидоподобные ДНК являются кольцевыми, а две зоны, расположенные выше области высокомолекулярной митохондриалыюй ДНК, являются релаксированной и линейной формами кольцевой плазмидоподобной ДНК.

На рисунке 6 представлены результаты сравнительного рестрикционного анализа препаратов мтДНК пробирочных растений картофеля и полевого картофеля (материал 1999 года) с использованием четырех рестрикционных эпдо-нуклеаз, узнающих гексануклеотидные последовательности. Эти результаты показывают наличие полиморфизма между препаратами мтДНК сравниваемых образцов, расщепленных рестрикционной эндонуклеазой Hindlll, что может свидетельствовать о наличии структурных перестроек в митохондриальном геноме картофеля при длительном клональном .микроразмножении.

Рис. 5 Электрофорез и 0.8%-ном агарозном 23.1 геле препаратом мшохондрпальной ДНК

9 4 растений картофеля, длительно культивируе-

66

мыч in vitro (I) и растений картофеля, полу-

4.4

ченных из клубней (2). го 3 -ДНКфагаЯ. + Hindlll

(размеры указаны а тпн).. Стрелкой указано положение плазмидоподобных молекул мтДНК. 1 2 з

12345 6789

Рис. 6 Электрофоре! в 0.8%-ном агарозном геле препарат» митохондриальной ДНК растений картофеля, длительно культивируемых in vitro (2, 4, б, 8) и растений картофеля, полученных из клубней (3, 5, 7, 9). ДНК обработана ферментами BamI II (2, 3j, IxoRI (4, 5), Hindlll (6; 1), I'sil (8, 9). 1 - ДНК фага X + Ilindlll (размеры указаны » тип).

Стрелкой указано различие н рестрикционных спектрах мтДНК сравниваемых образцов, обработанных (ферментом Hindlll.

Как правило, эти структурные перестройки, обусловленные как меж-, так и внутримолекулярными рекомбинациями, приводят к изменению популяцион-ного состава молекул мтДНК [Lonsdale, 1989]. Принимая во внимание особенности структурной организации митохондриального генома высших растений [Muise and Hauswirth, 1995], было высказано предположение о том, что уровень транскрипции в митохондриях растений может регулироваться путем селективной амплификации определенных групп сцепления. Поэтому нельзя исключить возможности того, что структурная реорганизация митохондриального генома картофеля при длительном вегетативном размножении привела к изменению экспрессии определенных митохондриальных генов, что, в конечном итоге, также могло быть одной из причин того, что растения потеряли способность к нормальному росту в условиях почвы.

4. Способ сохранения генофонда картофеля, (практические рекомендации) Нами предлагается достаточно простой и относительно дешевый способ, который позволит продлить период сохранения хозяйственно-важных признаков ценными линиями оздоровленного картофеля, суть которого заключается в следующем: после оздоровления и отбора соответствующих линий рекомендуется получить микроклубни из стерильных растений. Для этого необходимо использовать растения, выросшие только из черенков средних и нижних ярусов. У четырех испытанных нами сортов (Невский, Луговской, Ранняя роза, Изобилие) частота клубнеобразования в первые два года после оздоровления растений составляла 75-83%. Полученные микроклубни хранятся в стерильных пробирках без потери всхожести в течение 5-6 месяцев при комнатной температуре или 8-9 месяцев при 4"С. В дальнейшем стерильные микроклубни помещаются на поверхность питательной среды и через 28-30 дней из них образуются стерильные растения. Эти растения необходимо провести через один цикл кло-налыюго микроразмножения и из некоторых из них вновь получить стерильные микроклубпи, другая же часть материала может быть использована для тиражирования безяирусных растений картофеля для высадки в грунт. Такой способ депонирования цепных генотипов картофеля в виде микроклубней позволит.со-

кратить количество циклов микроразмножения и, тем самым, увеличить продолжительность сохранения генотипа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что способность к вегетативному размножению характерна для растений на всех уровнях организации, при этом его формы разнообразны. Оно осуществляется'либо определенными частями вегетативных органов, либо при помощи специализированных одноклеточных образований. Способность растений к вегетативному размножению широко используется в практической деятельности человека при размножении культурных растений клубнями, усами, луковицами, корневыми отпрысками, черенками.

Одной из проблем, с которой сталкиваются при вегетативном размножении растений является вырождение клонов, сортов. Первопричина данного явления до последнего времени была неизвестна и, главным образом, связывалась с заражением растений вирусами или грибами. Поэтому большое значение в сохранении генофонда растений придавалось процедуре их оздоровлен™ и дальнейшего клонального микроразмножения. Благодаря такому подходу были получены оздоровленные линии картофеля, малины, смородины, земляники и многих других плодово-йгодных и сельскохозяйственных культур. Это позволило существенно повысить урожайность этих культур. Однако, наряду с положительными эффектами, были отмечены случаи отклонения оздоровленного материала от исходных форм.

К сожалению, практически не проводились работы по анализу стабильности генома растений при длительном вегетативном размножении. По-видимому, это объясняется несколькими причинами. Во-первых, априори предполагалось, что при вегетативном размножении потомство будет генетически, идентично исходным формам. Во-вторых, это было связано с большими техническими проблемами, поскольку при размножении растений традиционным вегетативным способом требовался не один десяток лет для получения потомства, в котором можно было бы детектировать изменения на генном уровне. При этом необходимо было также сохранить исходный материал в первозданном виде, что технически было невозможно.

В определенной мере исследование вопроса о генетической стабильности при длительном вегетативном размножении растений стало возможно благодаря развитию методов молекулярной биологии и биотехнологии.

В результате проведенных нами исследований было показано, что растения картофеля, длительно культивируемые in vitro, фенотипически практически не отличались от растений на начальных этапах их выращивания в асептических условиях, поэтому первоначально складывалось представление о том, что оздоровление действительно может явиться одним из способов сохранения генофонда картофеля. Однако, несмотря на хорошо сформированную надземную и подземную части побега, пробирочные растения начали постепенно терять способность к росту в условиях автотрофного питания. Через 13 лет культивирования in vitro 95-97% растений картофеля сорта Невский погибали через 7-8 дней после высадки в почву, то есть налицо вырождение материала, прошедшего около 150 циклов клонального микрор.азмножения. Методом полимеразной цепной реакции с использованием случайных праймеров было показано изменение в геноме растений картофеля при длительном клональном микроразмножении. При длительном выращивании растений картофеля в асептических условиях также наблюдаются изменения структурной организации митохондриального генома. Эти результаты дают основание полагать, что нами получено одно из первых экспериментальных подтверждений на молекулярном уровне теории циклического старения и омоложения растений Н.П. Кренке, и они могут свидетельствовать о том, что в основе данного явления лежат изменения на генном уровне.

ВЫВОДЫ

1. Для растений картофеля, длительно выращиваемых in vitro, характерны хорошо развитые надземная часть и корневая система, однако они теряют способность к росту при автотрофном питании: в условиях почвы происходит ингибирование развития корневой системы.

2. Установлено, чтодлительное культивироание картофеля in vitro приводит к снижению способности растений продуцировать цитокинины при выращивании их как в пробирках, так и в почве. Вероятно, данное изменение является одной из причин неспособности растений адаптироваться к условиям почвенной среды.

3. Методом полимеразной цепной реакции с использованием двух случайных праймеров выявлены изменения в геномной ДНК при длительном клональном микроразмножении растений картофеля.

4. Обнаружен полиморфизм в рестрикционных профилях митохондриальной ДНК растений картофеля, длительно культивируемых in vitro, и растений картофеля, размножаемых клубнями, что может свидетельствовать об изменении структурной организации митохондриального генома картофеля при длительном клональном микроразмножении.

5. Полученные данные могут служить подтверждением теории Н.П. Кренке о циклическом старении и омоложении растений при длительном вегетативном размножении и показывают,.что в основе данного явления лежат изменения, на генетическом уровне.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Геращенков Г.А., Мардамшин А.Г., Шарафутдинова Г.Г. ПЦР-анализ генома картофеля, длительно культивируемого in vitro // Тезисы докладов 7-й международной конференции "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда" (25-28 ноября 1997 г., Москва, Россия).-Москва,-1997.-С.409.

2. Шарафутдинова Г.Г., Давыдова А.П., Мардамшин А.Г. Ростовые характеристики длительно культивируемого in vitro безвирусного картофеля // Материалы междунар. конференции "Молекулярная генетика и биотехноло-гия"(6-8 апреля 1998 г., Минск).-Минск.-1998.-С.284-286.

3. Шарафутдинова Г.Г., Мардамшин А.Г. Способ сохранения генофонда картофеля при культивировании in vitro // Материалы конференции биохимиков Урала и Западной Сибири "Актуальные вопросы прикладной биохимии и биотехнологии".-Уфа: РИО ГУП "Иммунопрепарат".-1998.-С.259-261.

4. Шарафутдинова Г.Г., Мардамшин А.Г. Безвирусный картофель: перспективы и проблемы // Тезисы докладов междунар. научно-практической конференции "Сервис большого города" (20-21 мая 1999 г., Уфа).-Уфа, 1999.-С.121-123.

5. Шарафутдинова Г.Г., Веселова C.B., Мардамшин А.Г. Анализ формирования микроклубней у различных сортов картофеля, длительно культивируемых in vitro П Тезисы докладов IV съезда Общества физиологов растений России (49 октября 1999 г., Москва).-Москва: 1999.-С.738.

6. Шарафутдинова Г.Г., Мардамшин А.Г О стабильности митохондриалыюго генома при длительном клональном микроразмножении картофеля // Тезисы докладов междунар. конференции "Молекулярная и клеточная биология на рубеже веков".-Алматы.-1999.-С.82.

7. Мардамшин А.Г., Шарафутдинова Г.Г. Влияние длительности культивирования картофеля in vitro на приживаемость растений при переходе от гетеротрофного питания к автотрофному // Биотехнология.-2000.-№3.-С.38-41.

8. Мардамшин А.Г., Шарафутдинова Г.Г. К вопросу о сохранении меристем-ных линий картофеля // Селекция и семеноводство. (В печати).

Шарафутдинова Гузель Газимовна

ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНОСТИ ВЕГЕТАТИВНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ НА ИХ ГЕНЕТИЧЕСКУЮ СТАБИЛЬНОСТЬ (НА ПРИМЕРЕ БОЬЛЫиМ ТУВЕКОБиМ Ь.)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Лицензия на издательскую деятельность ЛР №021319 от 05.01.99 г.

Подписано в печать 17.11.2000 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Компьютерный набор. Гарнитура Times. Отпечатано на ризографе. Усл.печ.л. 1,38. Уч.-изд.л. 1,42. Тираж 100 экз. Заказ 712.

Редащионно-издательский центр Башкирского университета. Отпечатано на множительном участке Башкирского университета. 450074. Уфа, ул.Фрунзе, 32. Тел.: (3472)236-710